ES2586387T3 - Péptidos alfa helicoidales adecuados para activar o inhibir la muerte celular - Google Patents

Péptidos alfa helicoidales adecuados para activar o inhibir la muerte celular Download PDF

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Abstract

Un polipéptido α-helicoidal adecuado para activar o inhibir la muerte celular de fórmula (I): **Fórmula** en la que: cada R1 y R2 son independientemente H, alquilo C1-C20, alquenilo C2-C20, alquinilo C2-C20, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilalquilo o heterociclilalquilo; R3 es un reticulante que es alquilo C1-C20, alquenilo C2-C20 ó alquinilo C2-C20; donde R3 está sustituido con de 0 a 6 R5; R5 es halógeno, alquilo, OR6, N(R6)2, SR6, SOR6, SO2R6, CO2R6, R6, un epóxido, un resto fluorescente o un radioisótopo; R6 es H, alquilo o un agente terapéutico; x es un número entero seleccionado de 2, 3 ó 6; cada y es independientemente un número entero de 0 a 100; z es un número entero de 1 a 10; y cada Xaa es independientemente un alfa-aminoácido; y en donde el polipéptido es transportado o es transportado activamente a través de la membrana celular, según se determina en un ensayo que comprende preparar un polipéptido marcado con fluorescencia, aplicar el polipéptido marcado con fluorescencia a una célula intacta y someter a ensayo la célula en cuanto a fluorescencia celular por microscopía o detección de fluorescencia celular de alto rendimiento.

Description

Péptidos alfa helicoidales adecuados para activar o inhibir la muerte celular
Antecedentes
La apoptosis, o muerte celular programada, ejerce un papel crítico en el desarrollo y el mantenimiento de la homeostasis en todos los organismos pluricelulares. La sensibilidad a la apoptosis varía notablemente entre las células y está influenciada por episodios celulares tanto internos como externos. Se han definido proteínas reguladoras positivas y negativas que actúan como mediadoras del destino celular, y la desregulación de estas redes de señalización de proteínas se ha documentado en la patogenia de un amplio espectro de enfermedades humanas, incluyendo una variedad de cánceres. La BCL-2 es el miembro fundador de esta familia de proteínas apoptósicas y se identificó por primera vez en el punto de ruptura cromosómica de linfomas t (14; 18) (q32; q21) (Bakhashi et al. 1985. Cell 41:899; Cleary et al. 1985. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7439).
La reconfiguración génica coloca a BCL-2 bajo el control de la transcripción del locus de cadena pesada de inmunoglobulina, generando inadecuadamente altas concentraciones de BCL-2 y la supervivencia celular patológica resultante. Dichas aberraciones en la apoptosis se han identificado en las leucemias linfocítica y mielógena y en muchos otros tumores malignos, y se han relacionado con la evolución tumoral y la resistencia adquirida a la apoptosis provocada por la quimioterapia. La familia BCL-2 de proteínas se ha ampliado considerablemente y comprende tanto moléculas pro-como anti-apoptósicas que proporcionan los controles y equilibrios que rigen la sensibilidad a la muerte celular (FIG. 1). No es sorprendente que las proteínas apoptósicas se han convertido en objetivos clave para el desarrollo de productos terapéuticos tanto para prevenir la muerte celular precipitada en las enfermedades de pérdida de células como para activar vías de muerte celular en tumores malignos.
La familia BCL-2 está definida por la presencia de hasta cuatro dominios conservados (BH) "homología BCL-2" denominados BH1, BH2, BH3 y BH4, todos los cuales comprenden segmentos α helicoidales (Chittenden et al. 1995 EMBO 14:5589;. Wang et al. 1996 Genes Dev. 10:2859). Las proteínas antiapoptósicas, tales como BCL-2 y BCL-XL, presentan conservación de secuencias en todos los dominios BH. Las proteínas proapoptósicas se dividen en miembros "multidominio" (por ejemplo, BAK, BAX), que poseen homología en los dominios BH1, BH2 y BH3, y los miembros del "dominio BH3 sólo" (por ejemplo, BID, BAD, BIM, BIK, NOXA, PUMA), que contienen homología de secuencias exclusivamente en el segmento α-helicoidal anfipático de BH3. Los miembros de la familia BCL-2 tienen capacidad para formar homo-y heterodímeros, lo que sugiere que la unión competitiva y la relación entre las concentraciones de proteínas pro-y antiapoptósicas fijan la sensibilidad a los estímulos de muerte. Las proteínas antiapoptósicas funcionan para proteger a las células del exceso proapoptósico, es decir, de excesiva muerte celular programada. Las medidas de "seguridad" adicionales comprenden la regulación de la transcripción de proteínas proapoptósicas y su mantenimiento como confórmeros inactivos, que requiere la activación proteolítica, desfosforilación o cambio de configuración inducido por el ligando para activar las funciones que favorecen la mortalidad. En determinados tipos de células, las señales de muerte recibidas en la membrana plasmática desencadenan apoptosis por una vía mitocondrial (figura 2). Las mitocondrias pueden servir como guardián de la muerte celular al secuestrar el citocromo c, un componente crítico de un complejo citosólico que activa la caspasa 9, lo que conduce a actividades proteolíticas mortales aguas abajo. Las proteínas multidominio tales como BCL-2/BCL-XL y BAK/BAX representan papeles de duelo de guardián y verdugo en la membrana mitocondrial, con sus actividades reguladas además por los miembros de sólo BH3 aguas arriba de la familia BCL-2. Por ejemplo, BID es un miembro del subconjunto "sólo dominio BH3" de proteínas proapoptósicas, y transmite las señales de muerte recibidas en la membrana plasmática a las proteínas proapoptósicas efectoras en la membrana mitocondrial. BID tiene la capacidad exclusiva de interactuar tanto con proteínas proapoptósicas como antiapoptósicas y tras la activación por la caspasa 8, desencadena la liberación del citocromo c y la apoptosis mitocondrial. Los estudios de eliminación y mutagenia determinaron que el segmento BH3 α-helicoidal anfipático de miembros proapoptósicos de la familia funciona como un dominio de muerte y por lo tanto representa un motivo estructural fundamental para la interacción con las proteínas multidominio apoptósicas. Estudios estructurales han demostrado que la hélice BH3 interactúa con proteínas antiapoptósicas mediante la inserción en una ranura hidrófoba formada por la interfaz de los dominios BH1, 2 y 3. Las proteínas antiapoptósicas (por ejemplo, BCL-2 y BCL-XL) pueden estar asociadas y ser secuestradas por BID activado y éste puede desencadenar la activación de las proteínas proapoptósicas BAX y BAK, lo que conduce a la liberación de citocromo c y un programa de apoptosis mitocondrial.
BAD es también un miembro de la familia proapoptósica "sólo dominio BH3" cuya expresión igualmente desencadena la activación de BAX/BAK. A diferencia de BID, sin embargo, BAD presenta unión preferente a los miembros antiapoptósicos, BCL-2 y BCL-XL. Mientras que el dominio BH3 de BAD presenta una alta afinidad de unión a BCL-2, péptido BH3 de BAD es incapaz de activar la liberación del citocromo c de las mitocondrias in vitro, lo que sugiere que BAD no es un activador directo de BAX/BAK. Las mitocondrias que sobreexpresan BCL-2 son resistentes a la liberación de citocromo c provocada por BID, pero el tratamiento conjunto con BAD puede restablecer la sensibilidad de BID. La provocación de la apoptosis mitocondrial por BAD parece ser el resultado de:
(1) el desplazamiento de los activadores BAX/BAK, tales como las proteínas BID y similares a BID, del punto de unión de BCL-2/BCL-XL, o (2) la ocupación selectiva del punto de unión de BCL-2/BCL-XL por BAD para evitar el secuestro de proteínas similares a BID por proteínas antiapoptósicas. Por lo tanto, dos clases de proteínas "sólo dominio BH3" han surgido, las proteínas similares a BID que activan directamente la apoptosis mitocondrial y proteínas similares a BAD, que tienen capacidad de sensibilizar las mitocondrias a las proteínas proapoptósicas ocupando los puntos de unión de proteínas de multidominio antiapoptósicas.
El objetivo de la identificación o la generación de pequeñas moléculas para probar las funciones de las proteínas apoptósicas in vitro y manipular específicamente las vías apoptósicas in vivo ha sido un desafío. La detección 5 sistemática de alto rendimiento ha identificado varias moléculas que inhiben la interacción del dominio BH3 de BAK con BCL-XL a afinidades micromolares. Además del potencial inconveniente de la identificación de compuestos de baja afinidad, la técnica está limitada en su capacidad de generar grupos de compuestos adaptados a sutiles especificidades de unión de cada uno de los miembros de las familias de proteínas. Las estrategias alternativas a la manipulación de las vías de apoptosis proceden de la ingeniería de péptidos, técnica que utiliza la secuencia de
10 péptidos no específica para generar compuestos con estructuras tridimensionales deseadas. Una aplicación de esta técnica implicó la generación de hélices α "proapoptósicas" compuestas por la secuencia de péptidos no específica utilizado para provocar la muerte celular hélices por rotura de las membranas mitocondriales.
La hélice alfa es uno de los principales componentes estructurales de las proteínas y a menudo se encuentra en la interfaz de contactos de proteínas, que participan en una amplia variedad de actividades biológicas intermoleculares 15 de reconocimiento. Teóricamente, péptidos helicoidales, tales como la hélice de BH3, podrían utilizarse para interferir selectivamente con las interacciones proteína-proteína o estabilizarlas, y de ese modo manipular procesos fisiológicos. Sin embargo, los motivos helicoidales biológicamente activos dentro de las proteínas suelen tener poca estructura cuando se consideran fuera del contexto de las proteínas completas y se coloca en solución. Por lo tanto, la eficacia de los fragmentos peptídicos de las proteínas como en los reactivos in vivo se ha visto afectada por la 20 pérdida de la estructura secundaria helicoidal, la sensibilidad a la degradación proteolítica y la incapacidad para penetrar en las células intactas. Considerando que se han descrito varias estrategias para la estabilización de hélices covalentes, la mayoría de las metodologías implican reticulaciones polares y/o lábiles (Phelan et al. 1997. J. Am. Chem. Soc. 119:455; Leuc et al. 2003 Proc Nat'l. Acad. Sci. USA 100:11273; Bracken et al., 1994. J. Am. Chem. Soc. 116:6432; Yan et al. 2004. Bioorg. Med. Chem. 14:1403). Posteriormente, Verdine y colegas desarrollaron una
25 estrategia basada en la metátesis alternativa, que emplea aminoácidos sintéticos α,α-disustituidos que contienen fijaciones a alquilo (Schafineister et al., 2000. J. Am. Chem. Soc.122:5891; Blackwell et al. 1994 Angew Chem. Int. Ed. 37:3281). En Genes Dev, 14, 2000, páginas 2060-2071, describe que tBID libera citocromo c.
Sumario
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que reticulando de forma estable un polipéptido
30 que tiene por lo menos dos aminoácidos modificados (proceso denominado "grapado de hidrocarburos") pueden ayudar a conferir desde el punto de vista de la configuración la estructura secundaria natural de este polipéptido. Por ejemplo, la reticulación de un polipéptido predispuesto a tener una estructura secundaria en hélice alfa puede limitar el polipéptido a su configuración alfa helicoidal natural. La estructura secundaria limitada puede aumentar la resistencia del polipéptido a la escisión proteolítica y también aumentar la hidrofobia. Inesperadamente, en algunos
35 casos, los polipéptidos pueden penetrar la membrana celular (por ejemplo, mediante un mecanismo de transporte dependiente de la energía, por ejemplo, pinocitosis). Por consiguiente, los polipéptidos reticulados descritos en la presente memoria pueden tener una actividad biológica mejorada con relación a un polipéptido correspondiente no reticulado. Por ejemplo el polipéptido reticulado puede incluir un dominio de hélice alfa de un polipéptido miembro de la familia BCL-2 (por ejemplo, dominio BID-BH3), que puede unirse a BAK/BAX y/o BCL-2/BCL-XL para estimular la
40 apoptosis en un individuo. En algunos casos, el polipéptido reticulado se puede utilizar para inhibir la apoptosis. Los polipéptidos reticulados descritos en la presente memoria pueden utilizarse terapéuticamente, por ejemplo, para tratar el cáncer en un individuo.
En un aspecto, la invención presenta polipéptidos de fórmula (I),
en la que;
cada R1 y R2 son independientemente H o un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilalquilo o heterociclilalquilo C1 a C10;
R3 es alquilo, alquenilo, alquinilo; [R4-K-R4 ]n ; cada uno de los cuales está sustituido con 0 a 6 R5; R4 es alquilo, alquenilo, o alquinilo; R5 es halógeno, alquilo, OR6, N(R6)2, SR6, SOR6, SO2R6, CO2R6, R6, un resto fluorescente o un radioisótopo;
K es O, S, SO, SO2, CO, CO2, CONR6, o R6 es H, alquilo, o un agente terapéutico; n es un número entero de 1 a 4; x es un número entero de 2 a 10; cada y es independientemente un número entero de 0 a 100; z es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10); y cada Xaa es independientemente un aminoácido; y donde el polipéptido es transportado o transportado activamente a través de la membrana celular, según se
determina en un ensayo que comprende preparar un polipéptido marcado con fluorescecia, aplicando el polipéptido
marcado con fluorescencia a una célula intacta, y sometiendo a ensayo a la célula en cuanto a fluorescencia celular
por microscopía o detección de fluorescencia celular de alto rendimiento.
En algunos casos, el polipéptido se une a una proteína de la familia BCL-2. El polipéptido puede unirse a una proteína antiapoptósica. El polipéptido puede unirse a una proteína proapoptósica. El polipéptido puede unirse y activar BAX y BAK. En algunos casos, el polipéptido se une a un dominio BH1, BH2 y/o BH3.
En algunos casos, el polipéptido activa la muerte celular, por ejemplo el polipéptido puede desencadenar la
liberación del citocromo c y activar la muerte celular mitocondrial.
En otros casos, el polipéptido puede inhibir la muerte celular.
En algunos casos, el polipéptido comprende un dominio BH3.
En algunos casos, x es 2, 3 o 6.
En algunos casos, cada y es independientemente un número entero entre 3 y 15.
En algunos casos cada y es independientemente un número entero entre 1 y 15.
En algunos casos, R1 y R2 son cada uno independientemente H o alquilo C1-C6.
En algunos casos, R1 y R2 son cada uno independientemente alquilo C1-C3.
En algunos casos, por lo menos uno de R1 y R2 es metilo. Por ejemplo, R1 y R2 son ambos metilo.
En algunos casos R3 es alquilo (por ejemplo, alquilo C8) y x es 3 En algunos casos, R3 es alquilo C11 y x es 6.
En algunos casos, R3 es alquenilo (por ejemplo, alquenilo C8) y x es 3.
En algunos casos, x es 6 y R3 es alquenilo C11.
En algunos casos, R3 es un alquilo, alquenilo o alquinilo de cadena lineal.
En algunos casos, R3 es -CH2-CH2-CH2-CH═CH-CH2-CH2-CH2-. En determinadas realizaciones los dos estereocentros alfa, alfa disustituido están ambos en la configuración R o en la configuración S (por ejemplo, reticulación i, i+4), o una estereocentro es R y el otro es S (por ejemplo, reticulación i, i+7). Por lo tanto, donde la fórmula I se representa como
los estereocentros C' y C" disustituidos pueden estar ambos en la configuración R o ambos pueden estar en la configuración S, por ejemplo cuando X es 3. Cuando x es 6, el estereocentro C' disustituido está en la configuración R y el estereocentro C" disustituido está en la configuración S. El doble enlace en R3 puede estar en la configuración
5 estereoquímica E o Z.
En algunos casos R3 es [R4-K-R4]n; y R4 es un alquilo, alquenilo, o alquinilo de cadena lineal.
En algunos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 60% (70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) idéntica a la secuencia de aminoácidos de EDIIRNI*RHL*QVGDSNLDRSIW (SEC. ID. nº: 112), en la que * es un aminoácido fijado. Por ejemplo, pueden
10 producirse 1, 2, 3, 4, 5 o más cambios de aminoácidos, por ejemplo, cambios conservadores.
La fijación puede incluir un grupo alquilo, alquenilo, o alquinilo (por ejemplo, alquilo C5, C8 o C11 o un alquenilo C5, C8 o C11 o alquinilo C5, C8 o C11). El aminoácido fijado puede ser alfa disustituido (por ejemplo, C1-C3 o metilo). En algunos casos, el polipéptido puede incluir una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 60% (70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) idéntica a la secuencia de aminoácidos de
15 EDIIRNIARHLA*VGD*NLDRSIW (SEC. ID. nº: 110), en la que * es un aminoácido fijado. Por ejemplo, pueden producirse 1, 2, 3, 4, 5 o más cambios de aminoácidos, por ejemplo, cambios conservadores. En algunos casos, el polipéptido es transportado a través de la membrana de la célula (por ejemplo, mediante un mecanismo de transporte activo o endocitósico o por transporte pasivo). En determinadas realizaciones el polipéptido no comprende Cys o Met.
20 En algunas realizaciones, el polipéptido comprende, por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 50, o más aminoácidos contiguos de un dominio BCL-2 o similar a BCL-2, por ejemplo, un dominio BH3 o un dominio similar a BH3 por ejemplo, un polipéptido representado en cualquiera de las figuras 5a, 5b, y 28a-28h . Cada [Xaa]y es un péptido que puede comprender independientemente por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 o más aminoácidos contiguos de un dominio BCL-2 o similar a BCL-2, por ejemplo, un
25 dominio BH3 o similar a BH3, por ejemplo, un polipéptido representado en cualquiera de las figuras 5a, 5b, y 28a 28h. [Xaa]x es un péptido que puede comprender 3 o 6 aminoácidos contiguos de ácidos de un dominio BCL-2 o similar a BCL-2, por ejemplo, de un dominio BH3 o similar a BH3, por ejemplo, un polipéptido representado en cualquiera de las figuras 5a, 5b y 28a 28h.
El polipéptido puede comprender 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 aminoácidos
30 contiguos de ácidos de un dominio BCL-2 o similar a BCL-2, por ejemplo, un dominio BH3 o similar a BH3, por ejemplo, un polipéptido representado en cualquiera de las FIG. 5a, 5b, y 28a-28h (SEC. ID. nº: ) en las que dos aminoácidos que están separadas por tres aminoácidos (o seis aminoácidos) se sustituyen por sustitutos de aminoácidos que están unidos por R3. Por lo tanto, por lo menos dos aminoácidos pueden estar sustituidos por aminoácidos fijados o sustitutos de aminoácidos fijados. Por lo tanto, en donde la fórmula I se representa como
[Xaa]y' y [Xaa]y'' puede comprender, cada uno secuencias de polipéptidos contiguos de los mismos o diferentes dominios BCL-2 o similares a BCL-2.
La invención presenta polipéptidos reticulados principalmente 10 (11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más) aminoácidos contiguos de un dominio BCL-2 o similar a BCL-2 , por ejemplo, un
40 dominio BH3 o similar a BH3, por ejemplo, un polipéptido representado en cualquiera de las FIG. 5a, 5b (SEC. ID. nº: 84-114), y 28a-28h (SEC. ID. nº: 1-83) en las que los carbonos alfa de dos aminoácidos que están separadas por tres aminoácidos (o seis aminoácidos) están unidos por R3, uno de los dos carbonos alfa está sustituido por R1 y el otro está sustituido por R2 y cada uno está unido por enlaces peptídicos a aminoácidos adicionales.
En algunas realizaciones el polipéptido tiene actividad apoptósica.
En algunos casos, el polipéptido también comprende un resto fluorescente o un radioisótopo.
En algunos casos, el polipéptido comprende 23 aminoácidos; R1 y R2 son metilo; R3 es alquilo C8, alquilo C11, alquenilo C8, alquenilo C11, alquinilo C8 o alquinilo C11 y x es 2, 3, o 6.
5 En algunos casos, el polipéptido comprende un marcador de afinidad, un resto de selección de diana (targeting moiety) y/o un resto de biotina.
En algunos casos, el polipéptido es un polipéptido seleccionado del grupo que consta de los polipéptidos representados en las FIG. 28a-h y 5a-b (SEC. ID. nº: 1-83) y 5a-b (SEC. ID. nº: 84-114). En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento de preparación de un polipéptido de fórmula (III), principalmente proporcionar
10 un polipéptido de fórmula (II); y
tratar el compuesto de fórmula (II) con un catalizador para favorecer una metátesis de cierre de anillo, proporcionando de este modo un compuesto de fórmula (III)
15 en la que
cada R1 y R2 son independientemente H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo; heteroarilalquilo o heterociclilalquilo; cada n es independientemente un número entero de 1 al 15; x es 2, 3 o 6
20 cada y es independientemente un número entero de 0 a 100; z es un número entero de 1-10 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10); y cada Xaa es independientemente un aminoácido. En algunos casos, el polipéptido se une a una proteína miembro de la familia BCL-2. En algunos casos, el catalizador es un catalizador de rutenio.
25 En algunos casos, el método también incluye proporcionar un agente reductor u oxidante con posterioridad a la metátesis de cierre del anillo.
En algunos casos, el agente reductor es H2 o el agente oxidante es tetróxido de osmio.
En algunos casos, la invención presenta un procedimiento de tratamiento de un sujeto que comprende la administración al sujeto de cualquiera de los compuestos descritos en la presente memoria. En algunos casos, el procedimiento también comprende la administración de un agente terapéutico adicional.
En algunos casos, la invención presenta un procedimiento de tratamiento de cáncer en un sujeto que comprende la 5 administración al sujeto de cualquiera de los compuestos descritos en la presente memoria. En algunos casos, el procedimiento también comprende la administración de un agente terapéutico adicional.
En algunos casos, la invención presenta una librería de los compuestos descritos en la presente memoria. En algunos casos, la invención presenta un procedimiento de identificación de un compuesto experimental para la estimulación de la apoptosis, que incluye:
10 proporcionar mitocondrias; poner en contacto las mitocondrias con cualquiera de los compuestos descritos en la presente memoria; determinar la liberación del citocromo c; y comparar la liberación de citocromo c en presencia del compuesto con la liberación de citocromo c en
ausencia del compuesto, en el que un aumento en la liberación de citocromo c en presencia del compuesto 15 de fórmula 1 identifica el compuesto como un compuesto candidato para la estimulación de la la apoptosis. En algunos casos, la invención presenta un polipéptido de la fórmula (IV),
en la que; cada R1 y R2 son independientemente H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilalquilo o 20 heterociclilalquilo;
R3 es alquilo, alquenilo, alquinilo; [R4-K-R4]n o una cadena lateral de aminoácidos de origen natural; cada uno de los cuales está sustituido con 0 a 6 R5; R4 es alquilo, alquenilo o alquinilo; R5 es halógeno, alquilo, OR6, N(R6)2, SR6, SOR6, SO2R6, CO2R6, R6, un resto fluorescente, o un radioisótopo;
25 K es O, S, SO, SO2, CO, CO2, CONR6, o R6 es H, alquilo o un agente terapéutico; R7 es alquilo, alquenilo, alquinilo; [R4-K-R4]n o una cadena lateral de aminoácidos de origen natural; cada uno de los
cuales está sustituido con 0 a 6 R5; n es un número entero de 1 a 4;
30 x es un número entero de 2 a 10; cada y es independientemente un número entero de 0 a 100; z es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10); y cada Xaa es independientemente un aminoácido; En algunos casos, la invención presenta un polipéptido de fórmula (I) en la que;
cada R1 y R2 son independientemente H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilalquilo o heterociclilalquilo; R3 es alquilo, alquenilo, alquinilo; [R4-K-R4]n; cada uno de los cuales está sustituido con 0 a 6 R5; R4 es alquilo, alquinilo, o alquinilo; R5 es halógeno, alquilo, OR6, N(R6)2, SR6, SOR6, SO2R6, CO2R6, R6, un resto fluorescente, o un radioisótopo;
K es O, S, SO, SO2, CO, CO2, CONR6, o
R6 es H, alquilo, o un agente terapéutico; 10 n es un número entero de 1 a 4;
x es un número entero de 2 a 10;
cada y es independientemente un número entero de 0 a 100;
z es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10); y 15 cada Xaa es independientemente un aminoácido;
en el que el polipéptido tiene por lo menos 5% de helicidad alfa en solución acuosa determinada por dicroísmo circular. En algunos casos, el polipéptido tiene por lo menos 15%, por lo menos 35%, por lo menos 50%, por lo menos 60%,
por lo menos 70%, por lo menos 80% o por lo menos 90% de helicidad alfa determinada por dicroísmo circular. 20 En algunos casos, la invención presenta un polipéptido de fórmula (I),
en la que; cada R1 y R2 son independientemente H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilalquilo o heterociclilalquilo;
25 R3 es alquilo, alquenilo, alquinilo; [R4-K-R4]n; cada uno de los cuales está sustituido con 0 a 6 R5;
R4 es alquilo, alquinilo o alquinilo;
R5 es halógeno, alquilo, OR6, N(R6)2, SR6, SOR6, SO2R6, CO2R6, R6, un resto fluorescente, o un radioisótopo;
K es O, S, SO, SO2, CO, CO2, CONR6, o R6 es H, alquilo, o un agente terapéutico; n es un número entero de 1 a 4; x es un número entero de 2 a 10; cada y es independientemente un número entero de 0 a 100; z es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10); y cada Xaa es independientemente un aminoácido; en la que el polipéptido tiene por lo menos un aumento de 1,25 veces en helicidad alfa determinado por dicroísmo
circular en comparación con el polipéptido de fórmula (IV)
en la que R1, R2, Xaa, x, y, y z son todos como se han definido para la fórmula (I) anterior.
En algunos casos, el polipéptido tiene por lo menos 1,5 veces, por lo menos 1,75 veces, por lo menos 2,0 veces, por lo menos 2,5 veces, por lo menos 3 veces, o por lo menos 4 veces de aumento en helicidad alfa determinada por
15 dicroísmo circular en comparación con el polipéptido de fórmula (IV).
En algunos casos, la invención presenta un método para identificar un compuesto candidato para la inhibición de la apoptosis, que incluye;
proporcionar mitocondrias;
poner en contacto las mitocondrias con un compuesto descrito en la presente memoria;
20 determinar la liberación de citocromo c; y
comparar la liberación del citocromo c en presencia del compuesto descrito en la presente memoria con la liberación de citocromo c en ausencia del compuesto descrito en la presente memoria, en la que una disminución en la liberación de citocromo c en presencia del compuesto descrito en la presente memoria identifica el compuesto descrito en la presente memoria como un compuesto candidato para la inhibición de
25 la apoptosis.
Las combinaciones de sustituyentes y variables previstas por la presente invención son sólo las que dan como resultado la formación de compuestos estables. El término "estable", como se emplea en la presente memoria, se refiere a los compuestos que poseen estabilidad suficiente para permitir la preparación del compuesto y que mantiene la integridad del mismo durante un periodo suficiente para ser útil en el contexto de la presente memoria
30 (por ejemplo, la administración terapéutica a un sujeto o la generación de reactivos para estudiar o descubrir una vía biológica ya sea in vitro o in vivo).
Los compuestos de la presente invención pueden contener uno o más centros asimétricos y por lo tanto presentarse como racematos y mezclas racémicas, enantiómeros individuales, diastereómeros individuales y mezclas diastereoméricas. Todas estas formas isoméricas de estos compuestos se incluyen expresamente en la presente 35 invención. Los compuestos de esta invención también pueden estar representados en múltiples formas tautoméricas, en tales casos, la invención incluye expresamente todas las formas tautoméricas de los compuestos descritos en la presente memoria (por ejemplo, la alquilación de un sistema de anillo puede dar lugar a alquilación en múltiples sitios, la invención comprende expresamente todos estos productos de reacción). Todas estas formas isoméricas de dichos compuestos se incluyen expresamente en la presente invención. Todas las formas cristalinas
40 de los compuestos descritos en la presente memoria se incluyen expresamente en la presente invención.
El término "aminoácido" se refiere a una molécula que contiene tanto un grupo amino como un grupo carboxilo. Los aminoácidos adecuados comprenden, sin limitación, tanto los isómeros D como L de los aminoácidos de origen natural 20 comunes que se encuentran en péptidos (por ejemplo, A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V (como se conocen por las abreviaturas de una letra)), así como los aminoácidos de origen natural y sintético preparados por síntesis orgánica o por otras vías metabólicas.
Un resto de aminoácido "no esencial" es un resto que puede alterarse a partir de la secuencia natural de un polipéptido (por ejemplo, un dominio BH3) sin suprimir o alterando sustancialmente su actividad. Un resto de aminoácido "esencial" es un resto que, cuando se altera en la secuencia natural del polipéptido, ocasiona la supresión o sustancialmente la supresión de la actividad del polipéptido.
Una "sustitución conservadora de aminoácido" es en la que el resto de aminoácido se sustituye con un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias comprenden aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales apolares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, un resto de aminoácido no esencial predicho en un polipéptido BH3, por ejemplo, se reemplaza preferentemente con otro resto de aminoácido de la misma familia de cadena lateral.
El símbolo cuando se utiliza como parte de una estructura molecular se refiere a un enlace sencillo o a un doble enlace trans o cis.
La expresión "cadena lateral de aminoácido" se refiere a un resto unido al carbono α en un aminoácido. Por ejemplo, la cadena lateral de aminoácido de alanina es metilo, la cadena lateral de aminoácido de fenilalanina es fenilmetilo, la cadena lateral de aminoácido de cisteína es tiometilo, la cadena lateral de aminoácido de aspartato es carboximetilo, la cadena lateral de aminoácido de tirosina es 4-hidroxifenilmetilo, etc. Están incluidas también otras cadenas laterales de aminoácidos sintéticos, por ejemplo, las naturales (por ejemplo, un metabolito de aminoácido) o los que se preparan por síntesis (por ejemplo, un aminoácido disustituido en alfa).
El término polipéptido comprende dos o más aminoácidos de origen natural o sintético unidos por un enlace covalente (por ejemplo, un enlace amida). Los polipéptidos tal como se describe en la presente memoria comprenden proteínas completas (por ejemplo, proteínas completamente elaboradas), así como secuencias más cortas de aminoácidos (por ejemplo, fragmentos de proteínas de origen natural o fragmentos de polipéptidos sintéticos).
El término "halógeno" se refiere a cualquier radical de flúor, cloro, bromo o yodo. El término "alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo que puede ser una cadena lineal o ramificada, que contiene el número indicado de átomos de carbono. Por ejemplo, C1-C10 indica que el grupo puede tener de 1 a 10 (inclusive) átomos de carbono en ella. En ausencia de designación numérica, "alquilo" es una cadena (lineal o ramificada) que tiene de 1 a 20 (inclusive) átomos de carbono en la misma. El término "alquileno" se refiere a un alquilo divalente (es decir,-R-).
El término "alquenilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo que puede ser una cadena lineal o una cadena ramificada que tiene uno o más dobles enlaces carbono-carbono. El resto alquenilo contiene el número indicado de átomos de carbono. Por ejemplo, C2-C10 indica que el grupo puede tener de 2 a 10 (inclusive) átomos de carbono en el mismo. La expresión "alquenilo inferior" se refiere a una cadena de alquenilo C2-C8. En ausencia de designación numérica, "alquenilo" es una cadena (lineal o ramificada) que tiene de 2 a 20 (inclusive) átomos de carbono en la misma.
El término "alquinilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo que puede ser una cadena lineal o una cadena ramificada que tiene uno o más enlaces triples carbono-carbono. El resto alquinilo contiene el número indicado de átomos de carbono. Por ejemplo, C2-C10 indica que el grupo puede tener de 2 a 10 (inclusive) átomos de carbono en el mismo. El término "alquinilo inferior" se refiere a una cadena de alquiniloC2-C8. En ausencia de designación numérica, "alquinilo" es una cadena (lineal o ramificada) que tiene de 2 a 20 (inclusive) átomos de carbono en la misma.
El término "arilo" se refiere a un sistema de anillo aromático monocíclico de 6 carbonos o bicíclico de 10 carbonos en el que 0, 1, 2, 3, o 4 átomos de cada anillo puede estar sustituido por un sustituyente. Los ejemplos de grupos arilo comprenden fenilo, naftilo y similares. El término "arilalquilo" o el término "aralquilo" se refiere a alquilo sustituido con un arilo. El término "arilalcoxi" se refiere a un grupo alcoxi sustituido con arilo.
El término "cicloalquilo" como se emplea en la presente memoria comprende grupos de hidrocarburos cíclicos saturados y parcialmente insaturados que tienen 3 a 12 átomos de carbono, preferentemente 3 a 8 carbonos, y más preferentemente de 3 a 6 carbonos, en los que el grupo cicloalquilo además puede estar opcionalmente sustituido. Los grupos cicloalquilo preferidos comprenden, sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo y ciclooctilo.
El término "heteroarilo" se refiere a un sistema de anillo aromático monocíclico de 5 a 8 eslabones, bicíclico de 8 a 12 eslabones, o tricíclico de 11 a 14 eslabones que tiene 1 a 3 heteroátomos si es monocíclico, 1 a 6 heteroátomos si es bicíclico o 1 a 9 heteroátomos si es tricíclico, seleccionados dichos heteroátomos de entre O, N, o S (por ejemplo, átomos de carbono y 1 a 3, 1 a 6 o 1 a 9 heteroátomos de N, O o S si es monocíclico, bicíclico, o tricíclico, respectivamente), en los que 0, 1, 2, 3, o 4 átomos de cada anillo puede ser sustituido por un sustituyente. Los ejemplos de grupos heteroarilo comprenden piridilo, furilo o furanilo, imidazolilo, bencimidazolilo, pirimidinilo, tiofenilo
o tienilo, quinolinilo, indolilo, tiazolilo y similares. El término "heteroarilalquilo" del término "heteroaralquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido con un heteroarilo. El término "heteroarilalcoxi" se refiere a un grupo alcoxi sustituido con heteroarilo.
El término "heterociclilo" se refiere a un sistema de anillo no aromático monocíclico de 5 a 8 eslabones, bicíclico de 8 a 12 eslabones, o tricíclico de 11 a 14 eslabones que tiene 1 a 3 heteroátomos si es monocíclico, 1 a 6 heteroátomos si es bicíclico o 1 a 9 heteroátomos si es tricíclico, seleccionados dichos heteroátomos de entre O, N, o S (por ejemplo, átomos de carbono y 1 a 3, 1 a 6, o 1 a 9 heteroátomos de N, O, o S si es monocíclico, bicíclico, o tricíclico, respectivamente), en los que 0, 1, 2 o 3 átomos de cada anillo pueden estar sustituidos por un sustituyente. Los ejemplos de grupos heterociclilos comprenden piperazinilo, pirrolidinilo, dioxanilo, morfolinilo, tetrahidrofuranilo y similares.
El término "sustituyentes" se refiere a un grupo "sustituido" en un grupo alquilo, cicloalquilo, arilo, heterociclilo, heteroarilo o en cualquier átomo de ese grupo. Los sustituyentes adecuados comprenden, sin limitación, grupos halógeno, hidroxi, mercapto, oxo, nitro, haloalquilo, alquilo, alcarilo, arilo, aralquilo, alcoxi, tioalcoxi, ariloxi, amino, alquiloxicarbonilo, amido, carboxi, alcanosulfonilo, alquilcarbonilo y ciano.
Los detalles de una o más realizaciones de la invención en la presente memoria se indican en los dibujos adjuntos y la descripción a continuación. Otras características, objetos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y las reivindicaciones.
Descripción de los dibujos
La figura 1 representa miembros de la familia BCL-2 que tienen uno o más dominios de homología BCL-2 (BH) conservados.
La figura 2 representa un modelo de apoptosis mitocondrial en el que interviene como mediador BID. FNT-RI/Fas provoca la escisión de BID, que se desplaza a las mitocondrias y activa la apoptosis.
La figura 3 representa una estrategia de síntesis para la generación de aminoácidos sintéticos α,α-disustituidos quirales que contienen cadenas laterales olefínicas.
La figura 4a representa las estructuras químicas de determinados aminoácidos sintéticos.
La figura 4b representa la reticulación de los aminoácidos sintéticos en las posiciones i e i+4 e i e i+7 por metátesis de olefinas.
La figura 5a representa compuestos SAHB3 generados por sustitución de aminoácidos sintéticos y metátesis de olefinas (SEC. ID. nº 84 a nº108, respectivamente).
La figura 5b representa determinados péptidos reticulados utilizados en los estudios descritos en la presente memoria (SEC. ID. nº 109 a nº 114, respectivamente).
La figura 6 representa los resultados de un estudio que muestra el grado de helicidad α de los dominios BH3 de los miembros de la familia BCL-2 seleccionados.
La figura 7 representa los resultados de un estudio que muestra que la reticulación química mejora la helicidad alfa de los compuestos SAHB3BID en comparación con el péptido BID BH3 no modificado.
La figura 8 representa los resultados de un estudio que muestra que un mutante gly → glu del polipéptido SAHB3BID A muestra similar contacto helicoidal que el correspondiente polipéptido que contiene gly.
La figura 9 representa los resultados de un estudio que muestra que el truncamiento del polímero de 23 eslabones SABH3BIDB ("SAHB3b") a un polímero de 16 eslabones ocasiona la pérdida de helicidad α.
La figura 10a representa los resultados de un estudio que muestra que la cinética de proteolisis de tripsina in vitro se retarda 3,5 veces por la reticulación de SABH3BIDA.
La figura 10b representa los resultados de un estudio de estabilidad en suero ex vivo de péptidos, que demuestra un aumento de 10 veces en la vida media del péptido reticulado en comparación con el péptido no modificado.
La figura 10c representa los resultados de un estudio in vivo que demuestra que SAHB3BIDA se mantiene a concentraciones séricas más elevadas con el tiempo en comparación con el péptido BID BH3.
La figura 11a representa los resultados de un estudio que demuestra que los péptidos SAHB3BID muestran gran afinidad de unión a GST-BCL2 en un ensayo de unión competitiva de polarización con fluorescencia.
La figura 11b representa los resultados de un estudio que demuestra que los mutantes del punto Gly a Glu de referencia negativa de SAHB3BIDA y B son aglutinantes relativamente mediocres.
La figura 11c representa los resultados de un estudio que demuestra que el truncamiento de SAHB3BIDB desde un polímero de 23 eslabones hasta un polímero de 16 eslabones da como resultado una caída de más de 6 veces en Ki, coincidente con una disminución significativa en el porcentaje de helicidad del compuesto truncado.
La figura 11d representa los resultados de un ensayo de unión directa de polarización con fluorescencia de BCL-2 que demuestran una mejora de más de 6 veces en la afinidad de unión de SAHB3BIDA comparado con BID BH3 no modificado.
La figura 11e representa los resultados de un ensayo de unión directa de polarización con fluorescencia de BAX que demuestran que la incorporación de una reticulación produce la unión mensurable de SAHB3BIDA y SAHB3BID(G→E)A a un miembro proapoptósico de la familia BCL-2 de multidominio. El péptido BID BH3 no modificado no presenta ningún enlace.
La figura 11f representa los espectros de HSQC que demuestran un cambio de configuración en BCL-XL marcado con 15N tras la unión a SAHB3BIDA, que es similar a la observada tras la unión a BID BH3, lo que confirma que SAHB3BIDA se une al punto hidrófobo definido de BCL-XL.
Las figuras 12a y 12b representan los resultados de los estudios que muestran el porcentaje de citocromo c liberado por los compuestos SAHB3BID de mitocondrias de hígado de ratón purificados.
Las figuras 13a y 13b representan los resultados de un estudio que demuestra que la liberación de citocromo c provocada por SAHB3BIDA y SAHB3BIDB es más rápida y más potente que la del péptido no modificado.
La figura 14 representa los resultados de un estudio que demuestra que la mutación Gly a Glu de SAHB3BIDA elimina selectivamente la liberación de citocromo dependiente de Bak, lo que pone de relieve la especificidad de acción de la liberación S de citocromo c provocada por SAHB3BIDA mostrada en la figura 13.
La figura 15 representa los resultados de un estudio que demuestra que las células Jurkat de leucemia de linfocitos T, tras la exposición a FITC-BID BH3 y hélice 6 de FITC-BID, carecen de marcaje fluorescente mientras que las células de leucemia linfocitos T de Jurkat, tras la exposición a FITC-SAHB3BID demuestran una señal positiva de FITC, y que estos resultados no se alteran significativamente por tratamiento con tripsina de las células.
La figura 16a representa los resultados de un estudio que demuestra que los linfocitos T de Jurkat expuestos a péptidos reticulados con FITC-SAHB3BIDA y SAHB3BID(G→E)A demostraron marcaje fluorescente, mientras que los linfocitos T de Jurkat expuestos a péptidos FITC-BID y FITC-BID(G → S) de BH3 no modificado no lo hicieron.
La figura 16b representa los resultados de un estudio que demuestra que la importación celular de FITC-SAHB3BIDA depende del tiempo a 37°C, según se evaluó por anál isis FACS.
Las figuras 17a y 17b representan los resultados de un estudio que muestra linfocitos T Jurkat tratados con FITCpéptidos a 4°C y 37°C. La figura 17a muestra que FI TC-BID BH3 no marca las células, ni a una ni a otra temperatura, y FITC-SAHB3BIDA marcó las células a 37°C, pero no a 4°C. La figura 17b muestra que la hélice 6 de FITC-BID marca pero también permeabiliza las células independientemente de la temperatura. Sin embargo, por el contrario, FITC-SAHB3BIDA sólo marca las células a 37ºC y lo hace sin permeabilización celular, en consonancia con el transporte activo de SAHB3BIDA por vía endocítica.
La figura 17c representa los resultados de un estudio que demuestra que las linfocitos T Jurkat, cuando se preincubaban con o sin azida de sodio y 2-desoxiglucosa seguido de tratamiento con FITC-péptidos, no mostraban ningún marcaje ni para una ni para otra de estas condiciones con el polipéptido FITC-BID BH3. Las células mostraron una reducción de marcaje para FITC-SAHB3BIDA bajo azida de sodio y las condiciones de 2-deoxiglucosa, y mostraron marcaje con la hélice 6 de FITC-BID en ambas condiciones. Estos resultados están en consonancia con una absorción celular dependiente de ATP (por ejemplo, vía endocitosis) para importación de SAHB3BID.
La figura 18 representa los resultados de un estudio que demuestra que la absorción de FITC-SAHB3BIDA no se inhibe por tratamiento celular con el glicosaminoglicano heparina, lo que indica que hay distinciones entre el mecanismo de unión y absorción de FITC-SAHB3BIDA comparado con otros péptidos de penetrción celular (PPC), tales como TAT de VIH y péptidos de Antennapedia.
La figura 19 representa los resultados de un estudio que demuestra que los compuestos FITC-SAHB3BIDA presentan marcaje citoplásmico con una distribución vesicular en linfocitos T Jurkat, mientras que en la membrana plasmática la fluorescencia no es evidente. Por otra parte, FITC-BID BH3 no presenta marcaje celular de las células y la hélice 6 de FITC-BID 6 marca las células difusamente y produce destrucción estructural significativa.
La figura 20 representa los resultados de un estudio que demuestra que FITC-SAHB3BIDA se localiza junto con un marcador de membrana mitocondrial en linfocitos T Jurkat.
La figura 21a y la figura 21b representa los resultados de un estudio que demuestra que FITC-SAHB3BIDA localiza en vivo junto con linfocitos T Jurkat que sobreexpresan BCL-2 con endosomas marcados con dextrano pero no endosomas de transferencia marcados, lo que indica que FITC-SAHB3BIDA es importado en las células por pinocitosis en fase líquida.
La figura 21c representa los resultados de un estudio que demuestra que 24 horas después del tratamiento, FITC-SAHB3BIDA se localiza en las células vivas junto con mitocondrias marcados por MitoTracker.
Las figuras 22a, 22b y 22c representan los resultados de un estudio que demuestra que FITC-SAHB3BIDA desencadena la interrupción metabólica de manera sensible a la dosis en las estirpes celulares de leucemia ensayadas, mientras que BID BH3 y SAHB3BID (G→E)A no tenían esencialmente ningún efecto en este intervalo de dosis.
La figura 23 representa los resultados de un estudio que demuestra que SAHB3BIDA y SAHB3BIDB provocaban apoptosis hasta en el 50% de las células Jurkat intactas a 10 µM, un efecto inhibido específicamente por la sobreexpresión de BCL-2 (barras negras). El péptido BH3 BID no modificado y los mutantes gly a glu no tuvieron ningún efecto en comparación con el control sin tratamiento.
La figura 24 representa los resultados de un estudio que muestra la respuesta de dosis de células Jurkat que sobreexpresan BCL-2 tratadas con SAHB3BIDA, SAHB3BID(G→E) y SAHB3BID(G → S)A. Mientras SAHB3BIDA y SAHB3BID(G→E)A puede superar la inhibición con BCL-2 de la apoptosis en este intervalo de dosis, el mutante puntual gly a glu no tiene efecto.
La figura 25 representa los resultados de un estudio que demuestra que SAHB3BIDA trató estirpes celulares REH, MV4 de leucemia; 11, y SEMK2 se sometió a provocación de apoptosis específica, mientras que el mutante puntual SAHB3BID(G→E)A gly a glu no tuvo ningún efecto sobre las células.
Las figuras 26a y 26b representan los resultados de un estudio que demuestra que tanto SAHB3BIDA y SAHB3BID(G→E)A suprimieron el crecimiento de leucemia de SEMK2 en ratones NOD-SCID, con SAHB3BID(G→E)A lo que demuestra una potencia mayor que SAHB3BIDA.
La figura 27a y la figura 27b representan los resultados de un estudio que demuestra que SAHB3BIDA mitiga la evolución de la leucemia de SEMK2 respecto al vehículo en ratones NOD-SCID. Un efecto sensible a la dosis se observa en la FIG. 27a.
Las figuras 27c, 27d y 27e ilustran los resultados de un estudio en animales que demuestra que SAHB3BIDA inhibe el crecimiento de RS4; la leucemia 11 respecto al vehículo en ratones SCID de color beige, con una prolongación estadísticamente significativa de la supervivencia en ratones tratados con SAHB3BIDA en comparación con las referencias del vehículo.
La figura 27f representa los resultados de un nuevo estudio en animales que demuestra que SAHB3BIDA produce remisión de RS4; leucemia 11 en ratones SCID de color beige, a diferencia de los ratones tratados SAHB3BID(G→E)A y con el vehículo que demuestran evolución de la leucemia.
Las figuras 28a-28h representan ejemplos de varios dominios alfa helicoidales de proteínas miembros de la familia BCL-2 (SEC. ID. nº 1 a nº 83, respectivamente) sensibles a la reticulación.
Descripción detallada
La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que polipéptidos con dominio helicoidal alfa reticulados de proteínas de la familia BCL-2 han mejorado las propiedades farmacológicas sobre sus equivalentes no reticulados (por ejemplo, aumento de la hidrofobicidad, resistencia a la escisión proteolítica, afinidad de unión, actividad biológica in vitro e in vivo). Por otra parte, se ha descubierto inesperadamente que los polipéptidos reticulados pueden penetrar la membrana celular mediante un mecanismo de transporte dependiente de la temperatura y la energía (por ejemplo, endocitosis, específicamente pinocitosis en fase líquida). Los polipéptidos comprenden una fijación entre dos aminoácidos sintéticos, fijación que mejora significativamente la estructura secundaria alfa helicoidal del polipéptido. En general, la fijación se extiende a través de la longitud de una o dos espiras helicoidales (es decir, aproximadamente 3, 4 o aproximadamente 7 aminoácidos). Por consiguiente, los aminoácidos situados en i e i+3; i e i+4; o i e i+7 son candidatos ideales para la modificación química y la reticulación. Así, por ejemplo, donde un péptido tiene la secuencia ... Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9..., las reticulaciones entre Xaa1 y Xaa4, o entre Xaa1 y Xaa5, o entre Xaa1 y Xaa8 son útiles como lo son las reticulaciones entre Xaa2 y Xaa5, o entre Xaa2 y Xaa6, o entre Xaa2 y Xaa9, etc. Además, se preparó un modelo de polipéptido que incorpora dos conjuntos de reticulaciones con uno situado entre Xaa1 y Xaa5 y otro entre Xaa9 y Xaa13. La doble reticulación se consiguió mediante control cuidadoso de la estereoquímica de las reacciones de metátesis de dobles enlaces. Por lo tanto, la invención comprende la incorporación de más de una reticulación dentro de la secuencia del polipéptido para estabilizar aún más la secuencia o facilitar la estabilización de los tramos de polipéptidos más largos. Si los polipéptidos son demasiado largos para ser fácilmente sintetizados en una parte, péptidos reticulados sintetizados de forma independiente pueden combinarse por una técnica denominada ligadura química natural (Bang, et al., J. Am. Chem. Soc. 126:1377).
Los nuevos polipéptidos reticulados son útiles, por ejemplo, para imitar o estudiar proteínas o polipéptidos que tienen uno o más dominios alfa-helicoidales. Una familia de proteínas, donde los miembros de la familia tienen por lo menos un dominio alfa helicoidal es la familia BCL-2 de proteínas. Estas proteínas están implicadas en las rutas apoptósicas celulares. Algunos miembros de la familia BCL-2 tienen una función proapoptósica, otros tienen una función antiapoptósica, y aún otros cambian las funciones con un cambio en las condiciones celulares. Por consiguiente, es deseable preparar polipéptidos estabilizados que imiten uno o más motivos de los miembros de la familia BCL-2, modulando de este modo una variedad de actividades relacionadas con BCL-2.
Síntesis química de un grupo de compuestos SAHB3BID
Se sintetizaron cadenas laterales olefínicas de longitud variable que contienen aminoácidos sintéticos α,αdisustituidos según el esquema en la FIG. 3 (Williams et al. 1991. J. Am. Chem. Soc. 113:9276; Schafmeister et al. 2000 J. Am. Chem. Soc. 122:5891). Se diseñaron péptidos BID BH3 químicamente reticulados sustituyendo dos o cuatro aminoácidos de origen natural por los aminoácidos sintéticos correspondientes (FIG. 4a). Las sustituciones se hacen en posiciones discretas, es decir, las "posiciones i e i+4" o las "i e i+7 posiciones", que facilitan la química de reticulación colocando restos de reactivos en la misma cara de la hélice α (figura 4b). Aminoácidos muy conservados entre las proteínas apoptósicas, además de las secuencias que resultan ser importantes en las interacciones proteína-proteína basadas en estudios cristalográficos de rayos X y de RMN (Muchmore et al. 1996. Nature 381:335; Sattler et al. 1997 Science 275:983), no se sustituyeron específicamente en determinadas circunstancias, los aminoácidos conservados podrían sustituirse por otros aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos sintéticos de origen artificial) para mejorar la actividad (este efecto se puede observar en los mutantes de SAHB3BID descritos en la presente memoria). Se generaron compuestos SAHB3BID por síntesis de péptidos en fase sólida seguido de reticulación de los aminoácidos sintéticos basada en metátesis de olefinas mediante sus cadenas laterales que contienen olefinas. Las variaciones de los compuestos SAHBBID generados se ilustran en la FIG. 5a. Las variantes de SAHB3BID (SAHBA) que incorporan mutaciones específicas conocidas por alterar la función de BID (Wang et al. 1996 Genes Dev. 10:2859) también se construyeron para servir como referencias negativas en los experimentos biológicos (FIG. 5a). Los terminales amino de los compuestos seleccionados se modificaron además con isotiocianato de fluoresceína (FITC) o lisina conjugada con biotina para generar compuestos SAHB3BID marcados para estudios de permeabilidad celular y ensayos bioquímicos, respectivamente (figura 5a). En varias síntesis, se añadió triptófano en el terminal C a la secuencia para servir como un marcador de UV para purificación y determinación de la concentración; el ácido glutámico del terminal N se eliminó en varios péptidos para aumentar el pI total del compuesto para facilitar potencialmente la penetración celular (ver a continuación). El método de metátesis se aplicó fácilmente a la generación de SAHB3 alternativos, incluyendo SAHB3BAD y SAHB3BIM (figura 5a).
Los aminoácidos sintéticos (enantiómeros R y S del aminoácido olefínico en el carbono 5 y el enantiómero S del aminoácido olefínico en el carbono 8) se caracterizaron por resonancia magnética nuclear (RMN) (Varian Mercury 400) y espectrometría de masas (Micromass LCT). La síntesis de péptidos se llevó a cabo en manual o en un sintetizador automático de péptidos (Applied Biosystems, modelo 433A), utilizando condiciones en fase sólida, resina AM de amida de Rink (Novabiochem) y química del grupo protector Fmoc de la cadena principal. Para el acoplamiento de aminoácidos naturales protegidos con Fmoc (Novabiochem), se emplearon 10 equivalentes de aminoácido y una relación molar de 1:1:2 de reactivos de acoplamiento HBTU/HOBt (Novabiochem)/DIEA. Los aminoácidos artificiales (4 equiv.) se acoplaron con una relación molar 1:1:2 de HATU (Applied Biosystems)/HOBt/DIEA. Se llevó a cabo la metátesis de olefinas en la fase sólida utilizando catalizador de Grubbs 10 mM (Blackewell et al. 1994 mencionado anteriormente) (Strem Chemicals) disuelto en diclorometano desgasificado y se hizo reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. Los terminales amino de los compuestos seleccionados se modificaron además con b-alanina e isotiocianato de fluoresceína (FITC [Sigma]/DMF/DIEA) para generar compuestos marcados con fluorescencia. Se incorporó un triptófano en el terminal C para servir como marcador de UV para la purificación y determinación de la concentración; se sintetizaron también compuestos SAHBA sin el triptófano en el terminal C y ácido glutámico en el terminal N, la última modificación se realizó para aumentar el pI total de las moléculas. El aislamiento de compuestos metatesizados se consiguió por desprotección en la que interviene como mediador el ácido trifluoroacético y escisión, precipitación en éter para dar el producto en bruto, y cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) (Varian ProStar) en una columna C18 de fase inversa (Varian) para proporcionar los compuestos puros. La composición química de los productos puros se confirmó por espectrometría de masas LC/MS (Micromass LCT interconectado con el sistema Agilent 1100 HPLC) y análisis de aminoácidos (Applied Biosystems, modelo 420A).
La figura 5b representa esquemáticamente un subconjunto de los péptidos en la figura 5a, incluyendo la estereoquímica de los aminoácidos olefínicos (enantiómeros R y S del aminoácido olefínico en el carbono 5 y el enantiómero S del aminoácido olefínico en el carbono 8).
Los compuestos SAHB3BID presentan aumento de helicidad α
Se examinó el porcentaje de helicidad de los dominios BH3 proapoptósicos, y se encontró que estos péptidos no modificados eran predominantemente espirales al azar en solución, con un contenido de helicoidal α total inferior al 25% (figura 6). En resumen, se disolvieron los compuestos en solución acuosa 50 mM de fosfato de potasio de pH 7 a concentraciones de 25-50 mM. Se obtuvieron espectros CD en un espectropolarímetro Jasco J-710 a 20ºC utilizando los siguientes parámetros estándar de medición: longitud de onda, 190-260 nm; resolución de la etapa, 0,5 nM; velocidad, 20 nm/seg; acumulaciones, 10; respuesta, 1 s; ancho de banda, 1 nm; longitud de la trayectoria, 0,1 cm. El contenido en α-helicoidal de cada péptido se calculó dividiendo la elipticidad media de resto [φ]222obs por el [φ] 222obs descrito para un modelo decapéptido helicoidal (Yang et al. 1986 Methods Enzymol. 130:208)).
En cada caso, la reticulación química o las reticulaciones químicas aumentaron el porcentaje de α-helicidad del dominio BH3 de BID, con SAHB3BIDA y B que consiguen aumento de más de 5 veces (FIG. 7). SAHB3BID(G→E)A, mutante de SAHB3BIDA en el punto Gly a Glu de referencia negativa, presenta contenido helicoidal similar a SAHB3BIDA (figura 8). Así pues, la reticulación de todos los hidrocarburos puede transformar un péptido apoptósico que es esencialmente una espiral aleatoria en solución acuosa en uno que es predominantemente de estructura αhelicoidal. Curiosamente, la importancia de la cuarta espira de la hélice en la estabilización de péptidos BID BH3 se pone de relieve por la disminución de la helicidad observada cuando el polímero de 23 eslabones SAHB3BIDB se trunca en el polímero de 16 eslabones, SAHB3BID(tr)B (figura 9).
La reticulación de todos los hidrocarburos aumenta resistencia a la proteasa de los compuestos SAHB3BID
El enlace amídico del eje central del péptido es sensible a la hidrólisis por las proteasas, lo que hace vulnerable a los compuestos peptídicos a una rápida degradación in vivo. La formación de la hélice peptídica, sin embargo, entierra el eje central amídico y por lo tanto le protege de la escisión proteolítica. SAHB3BIDA se sometió a proteólisis in vitro con tripsina para evaluar cualquier cambio en la velocidad de degradación en comparación con el péptido BID BH3 no modificado. SAHB3BIDA y el péptido no modificado se incubaron con tripsina agarosa y las reacciones se inactivaron en varios puntos de tiempo por centrifugación y posterior inyección en HPLC para cuantificar el sustrato residual por absorción ultravioleta a 280 nm. En resumen, los compuestos BID BH3 y SAHB3BIDA (5 mcg) se incubaron con tripsina agarosa (Pierce) (S/E ~ 125) para 0, 10, 20, 90 y 180 minutos. Las reacciones se inactivaron en centrifugadora de sobremesa a alta velocidad; el sustrato restante en el sobrenadante aislado se analizó cuantitativamente por detección del pico en HPLC a 220 nm. La reacción proteolítica presentaba cinética de primer orden y la constante de velocidad, k, se determinó en una gráfica de ln [S] en función del tiempo (k = -1 × pendiente) (FIG. 10a). El experimento, realizado por triplicado, demostró un aumento de 3,5 veces en la resistencia de la tripsina de SAHB3BIDA en comparación con el péptido no modificado. Por lo tanto, una mayor protección de enlaces amida sensibles a la tripsina al enterrarles en el núcleo de la hélice α proporciona un compuesto peptídico más estable, y por lo tanto puede hacer que dichos compuestos sean particularmente estables en el suero.
Para los estudios de estabilidad en suero ex vivo, los péptidos BID BH3 y SAHB3BIDA (2,5 mcg) conjugados con FITC se incubaron con suero fresco de ratón (20 ml) a 37ºC durante 0, 1, 2, 4, 8, y 24 horas. La concentración de compuesto FITC intacto se determinó por congelación ultrarrápida de las muestras de suero en nitrógeno líquido, liofilización, extracción en acetonitrilo/agua que contiene ácido trifluoroacético al 0,1% 50:50, seguida de análisis cuantitativo por HPLC utilizando detección de fluorescencia en los ajustes de excitación/emisión de 495/530 nm. Los resultados de este análisis se muestran en la figura 10b.
Para investigar la estabilidad in vivo de SAHB3BIDA, se inyectaron 10 mg/kg de péptido BH3 de BID conjugado con FITC y SAHB3BIDA en ratones NOD-SCID y muestras de sangre extraídas a las 0, 1, 4 y 22 horas tras la inyección. A continuación, se determinaron las concentraciones de compuesto FITC intacto en 25 µl de suero fresco. Los resultados de este análisis, representados en la figura 10c, demuestran que SAHB3BIDA era fácilmente detectable durante un período de 22 horas, con el 13% del aporte todavía cuantificable a las 22 horas. Por el contrario, sólo el 12% de BID BH3 era detectable una hora después de la inyección.
Los compuestos SAHB3BID mantienen una alta afinidad de unión antiapoptósica
Las reticulaciones de todos los hidrocarburos se colocaron selectivamente en la cara cargada de la hélice anfipática de BID BH3 para evitar interferencias con las interacciones críticas entre el punto de unión de proteínas multidominio apoptósicas y los restos hidrófobos de la hélice de BID BH3. Se realizaron experimentos de unión competitiva de polarización con fluorescencia para evaluar la eficacia de los compuestos SAHB3BID en competencia con el péptido BID BH3 sin modificar marcado con FITC para la unión de GST-BCL-2. Todos los compuestos SAHB3BID demuestran alta afinidad de unión a GST-BCL2, con SAHB3BIDA y B, los dos compuestos con el mayor porcentaje de helicidad, presentando asimismo la más alta afinidad de unión (FIG. 11a). A destacar, la mutación Gly a Glu de SAHB3BIDA y B elimina el enlace de alta afinidad, como se predijo a partir de los estudios anteriores (figura 11b). Se determinó además que la mutación Gly a Ser de SAHB3BIDA suprime el enlace a BCL-2 en este ensayo (datos no representados). El truncamiento del polímero de 23 eslabones SAHB3BIDB a un polímero de 16 eslabones da como resultado la pérdida de afinidad de unión a BCL-2, coincidente con la disminución en helicidad α descrita anteriormente (figura 11c).
El péptido BID BH3 marcado con FITC se une a BCL-2 con una KD de 220 nM, y una vez unido, se produce el desplazamiento de esta interacción por BID BH3 no marcado con una CI50 de 838 nM. Esto apoya un modelo mediante el cual la unión de BH3 a BCL-2 desencadena un cambio de configuración general que favorece la interacción, dando como resultado la necesidad de cantidades en exceso de péptido no marcado para desplazar el FITC-BID BH3 marcado con FITC preunido. Además se ha demostrado que BAD del dominio BH3 tiene una KD aumentada de 41 nM para la unión a BCL-2, y que se puede desplazar FITC-BID BH3 preunido con una CI50 de 173 nM. En un experimento similar, se descubrió que SAHB3BIDA desplaza a FITC-BID BH3 de BCL-2 con una CI50 de 62 nM, lo que refleja un aumento de más de 13 veces en la potencia de desplazamiento en comparación con el péptido BID BH3 sin modificar. Estos datos confirman que SAHB3BIDA se une con mayor afinidad a BCL-2 en comparación con péptidos BH3 no modificados, y sugieren que la preorganización de la estructura α-helicoidal por reticulación química proporciona una ventaja cinética para la unión a la diana.
Los ensayos de unión directa por polarización de fluorescencia demostraron que la incorporación de la reticulación en péptido BID BH3 dio como resultado una mayor afinidad de unión de SAHB3BIDA tanto para BCL-2, proteína multidominio antiapoptósica, como para BAX, proteína multidominio proapoptósica, en comparación con péptido BID BH3 sin modificar (figuras 11d y 11e). Un ensayo de unión por polarización de fluorescencia de BCL-2 directa demostró un aumento de 6 veces en la afinidad de unión a BCL-2 de SAHB3BIDA (KD, 38,8 nm) en comparación con el péptido BID BH3 sin modificar (KD, 269 nM) (figura 11d). Una mutación Gly a Glu, SAHBA(G→E) (KD, 483 nM), elimina la alta afinidad de unión y sirve como referencia útil (figura 11d). En resumen, BL21 de Escherichia coli (DE3) que contiene el plásmido que codifica GST-BCL-2 suprimida del terminal C se cultivaron en caldo de cultivo Luria que contiene ampicilina y se provocaron con IPTG 0,1 mM. Los sedimentos bacterianos se volvieron a poner en suspensión en tampón de lisis (1 mg/ml de lisozima, 1% de Triton X-100, 0,1 mg/ml de PMSF, 2 µg/ml de aprotinina, 2 µg/ml de leupeptina, 1 µg/ml de pepstatina A en PBS) y se expusieron a ultrasonidos. Tras la centrifugación a
20.000 × g durante 20 min., el sobrenadante se aplicó a una columna de perlas de glutatión-agarosa (Sigma). Las perlas se lavaron con PBS y se trataron con glutatión 50 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) para eluir la proteína, que a continuación se dializó frente a tampón de ensayo de unión (NaCl 140 mM, Tris-HCl 50 [pH 7,4]). Los compuestos con fluorescencia (25 nM) se incubaron con GST-BCL2 (25 nM-1000 nM) en tampón de unión a temperatura ambiente. Se midió la actividad de unión por polarización de fluorescencia en un espectrofotómetro de luminiscencia LS50B de Perkin-Elmer. Los valores de KD se determinaron por análisis de regresión no lineal utilizando el programa informático Prism (GraphPad). Se preparó la proteína BAX completa como se ha descrito anteriormente (Suzuki et al., Cell, 103:645) y el ensayo de polarización de fluorescencia se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente.
SAHB3BIDA se une a BCL-XL
Para determinar si SAHB3BIDA interactúa específicamente con la ranura de unión definida de una proteína multidominio antiapoptósica, se registró un espectro de BCL-XL marcada con 15N con correlación de un solo cuanto heteronuclear 15N/1H de dos dimensiones (HSQC) antes y después de la adición de SAHB3BIDA y se comparó con el espectro de BID BH3/15N-BCL-XL correspondiente. En resumen, BL21 de Escherichia coli (DE3) que contiene el plásmido que codifica BCL-XL suprimido del terminal C se cultivaron en medio mínimo M9 que contenía 15NH4Cl (Cambridge Isotope Laboratories) para generar la proteína marcada con 15N de manera uniforme. Las proteínas recombinantes se aislaron de las bacterias. Se generaron y se purificaron los péptidos SAHB3BIDA y BID BH3 como se describió anteriormente. Se prepararon los complejos siguientes 1:1 a 0,1 mM en fosfato de potasio 50 mM (pH 7), cloruro de sodio 50 mM, 5% de DMSO en D2O o H2O/D2O (95:5):15N-BCL-XL/BID BH3 sin marcar, 15N-BCL-XL/SAHB3BIDA sin marcar. Se registraron espectros mono cuánticos heteronucleares 15N/1H en dos dimensiones para los dos complejos y se analizaron los cambios en la resonancia tras la unión del ligando.
La similitud general de los espectros de HSQC indica que los cambios estructurales que se producen en BCL-XL después de la adición de SAHB3BIDA son casi idénticos a los observados con el péptido BID BH3 (FIG. 11f).
Los compuestos SAHB3BID desencadenan una liberación rápida y específica de citocromo c mitocondrial
Para evaluar la actividad biológica de los compuestos SAHB3BID in vitro, se realizaron ensayos de liberación de citocromo c utilizando mitocondrias de hígado de ratón purificados. Se incubaron mitocondrias (0,5 mg/ml) durante 40 minutos con 1 µM y 100 nM de compuestos SAHB3BID y a continuación los sobrenadantes y fracciones mitocondriales se aislaron y se sometieron a ensayo ELISA de citocromo c. La liberación del citocromo c de fondo (10-15%) se sustrajo de liberación total para cada muestra, y se determinó el porcentaje real de liberación de citocromo c (figura 12). El experimento idéntico se llevó a cabo simultáneamente en mitocondrias de hígado de ratón aislados de ratones Bak-/ -, que no liberan citocromo c mitocondrial en respuesta a la activación de BID-BH3; los datos de las mitocondrias BAK-/-por lo tanto, sirven como referencia negativa para la liberación del citocromo c en la que interviene como mediador BAK en respuesta a tratamientos con SAHB3BID. En cada caso, excepto para el SAHB3BIDE doble reticulado (que puede carecer de aminoácidos críticos para la actividad biológica o, en este caso, estar excesivamente limitado por las dobles reticulaciones), existe aproximadamente una duplicación de la liberación del citocromo c en respuesta a compuestos SAHB3BID 1 µM en comparación con el péptido sin modificar (figura 12a). A esta dosis se observa liberación de citocromo c independiente de BAK con SAHB3BIDA, B, y, en particular, D. Considerando que esta liberación de citocromo c puede representar un efecto no específico de las hélices α perturbador de la membrana, la función de un componente de liberación de citocromo c, independiente de BAK, provocado por SAHB3BID, es digna de una exploración más profunda. Curiosamente, el compuesto SAHB3BID que provoca el nivel más significativo de liberación del citocromo c independiente de BAK, SAHB3BIDD, es también el más hidrófobo de los compuestos SAHB3BID; SAHB3BIDD eluye de la columna C18 de fase inversa a 95% de acetonitrilo/5% de agua, en comparación con otros compuestos de SAHB3BID que eluyen en acetonitrilo 50-75%. Los mutantes de BID con dominios BH3 defectuosos pueden activar la movilización del citocromo c independiente de BAK (Scorrano et al., Dev. Cell, 2:55), y la hélice 6 de BID muy hidrófoba se ha implicado en esta actividad (L. Scorrano, S.J. Korsmeyer, resultados no publicados). Es plausible que SAHB3BIDD muestre liberación del citocromo c tanto dependiente como independiente de BAK al imitar las características de las hélices 3 y 6 de BID. A la dosificación diez veces menor SAHB3BID A y B mantienen la actividad selectiva de liberación de citocromo c dependiente de BAK (FIG. 12b). La potencia de SAHB3BIDB, en particular, se compara favorablemente con la proteína BID miristolada activada al máximo, que libera aproximadamente el 65% del citocromo c en estas condiciones a dosis de 30 nM.
Los compuestos SAHB3BID más activos, A y B, se sometieron a estudios cinéticos adicionales para determinar si la organización helicoidal previa puede desencadenar la liberación más rápida del citocromo c en comparación con el péptido no modificado. Al igual que en el experimento anterior, las mitocondrias de hígado de ratón de ratones naturales y Bak-/-se expusieron a los compuestos a diferentes concentraciones y se ensayó la liberación del citocromo c a intervalos de 10 y 40 minutos. Mientras que a los 10 minutos el péptido no modificado da lugar a la liberación de menos de 10% en la dosis más alta probada (1 µM), SAHB3BIDB tiene una CE50 para la liberación en este punto de tiempo de poco menos de 400 nM, con la liberación de citocromo casi máxima a 1 µM (figura 13a). Del mismo modo, SAHB3BIDA desencadena una liberación significativa de citocromo c en el intervalo de tiempo de 10 minutos. La EC50 para la liberación de citocromo c en 40 minutos es 2,9 µM para el péptido no modificado y 310 y 110 nM para SAHB3BIDA y B, respectivamente (figura 13b). Por lo tanto, SAHB3BIDA y B presentan una mejora de 10 a 25 veces en la actividad de liberación de citocromo c en el punto de tiempo de 40 minutos. Mientras que la liberación de citocromo c dependiente de BAK aumenta con el tiempo, la liberación independiente de BAK no cambia entre los puntos de tiempo de 10 y 40 minutos, lo que sugiere que esta liberación distinta ocurre temprano y se alcanza el máximo en 10 minutos. A destacar que el mutante del punto Gly a Glu de referencia negativa de SAHB3BIDA, SAHB3BID(G→E)A, sólo genera liberación de citocromo c independiente de Bak, lo que confirma que SAHB3BIDA funciona por la vía de la apoptosis mitocondrial dependiente de Bak (figura 14). Considerados en conjunto, estos datos de liberación de citocromo c indican que SAHB3BIDA y B son capaces de inducir específicamente la liberación de citocromo c dependiente de BAK con potencia y cinética notablemente mayores en comparación con el péptido no modificado.
Los compuestos SAHB3BID penetran en las células intactas
Unos compuestos SAHB3BID modificados con fluoresceína, péptidos BID BH3, y un péptido de la hélice 6 de BID se incubaron con células Jurkat de leucemia de linfocitos T en cultivo durante 4 a 24 horas y posteriormente se clasificaron por FACS para determinar el porcentaje de marcador de las células de leucemia. A fin de evitar confundir los resultados de los compuestos unidos a la superficie celular, las células Jurkat se lavaron a fondo y se sometieron a sobredigestión con tripsina, de acuerdo con informes recientes. Para cada compuesto probado, no hubo ningún cambio significativo en el perfil de la señal con FITC después de la digestión con tripsina, lo que sugiere que en el caso de estos péptidos, pocos o ningún compuesto marcado con FITC se une a la superficie (figura 15). Mientras que las células tratadas con BH3 BID fueron negativas a FITC, tanto las células tratadas con FITC-SAHB3BIDA como con FITC-SAHB3BID(G→E)A resultaron positivas a FITC, como se indica por un desplazamiento hacia la derecha de la señal de FITC (figura 16a). El perfil similar de FITC-SAHB3BIDA y FITC-SAHB3BID(G→E)A en estos estudios de permeabilidad celular es particularmente importante, dada la utilización del compuesto mutante puntual como referencia negativa en experimentos biológicos. La hélice 6 de BID, péptido que perturba la membrana permeable de las células, se utilizó como referencia positiva para el marcaje con FITC en este experimento.
Inesperadamente, se descubrió que con FITC-SAHB3BIDA parece entrar en la célula por endocitosis, una vía de transporte dependiente de la temperatura y la energía. La importación celular de FITC-SAHB3BIDA se produjo en función del tiempo (figura 16b). Cuando la endocitosis celular se inhibió al realizar el experimento a 4ºC (figuras 17a, 17b) o por tratamiento con los venenos energéticos azida de sodio y 2-desoxiglucosa (figuras 17c), el marcaje de células se inhibió o disminuyó notablemente, respectivamente. A destacar que las células Jurkat marcadas por FITC-SAHB3BIDA a 37ºC son negativas a yoduro de propidio (PI), lo que confirma que el péptido reticulado no funciona meramente como un agente de permeabilización (figura 17b); por el contrario, la hélice 6 de FITC-BID penetra fácilmente a ambas temperaturas, permeabilizando eficazmente las células, como se prueba por el grado de positividad PI (figura 17b). Estos datos apoyan un mecanismo endocítico de entrada para los compuestos SAHB3BID, de acuerdo con informes recientes citando la adherencia de la superficie celular seguida de endocitosis como mecanismo de entrada para otros péptidos de penetración celular (PPC), tales como el transactivador de la transcripción del VIH (TAT). Mientras que los PPC muy básicos, tales como TAT y Antennapedia, se cree que se concentran en la superficie celular por la adherencia a glucosaminoglicanos cargados negativamente la heparina no inhibió la importación de SAHB3BIDA de una manera sensible a la dosis (figura 18). Las propiedades biofísicas de la hélice α anfipática de SAHB3BID pueden facilitar distintos contactos celulares por interacciones electrostáticas y/o de la membrana lipídica.
Se emplearon experimentos de microscopia confocal a fin de determinar la localización intracelular de SAHB3BIDA. Se incubaron células Jurkat de leucemia de linfocitos T con compuestos marcados con FITC como se describió anteriormente o con reposición de suero a las 4 horas seguido de otras 16 horas de incubación a 37°C, y después de lavar dos veces con PBS, se centrifugaron a 600 rpm durante 5 minutos en portaobjetos de vidrio Superfrost Plus (Fisher). Las células se fijaron en paraformaldehído al 4%, se lavaron con PBS, se incubaron con yoduro de TO-PRO-3 (100 nM) (Molecular Probes) para teñir por contraste los núcleos, se trataron con medio de montaje Vectashield (Vector) y a continuación se tomaron imágenes por microscopia confocal (BioRad 1024). Para los experimentos de doble marcaje, las células fijadas se incubaron además con anticuerpos primarios contra Tom20, y anticuerpos secundarios conjugados con rodamina antes de la tinción de contraste con TO-PRO-3. Para la microscopia confocal en vivo, se realizó doble marcaje de las células Jurkat con FITC-SAHBA (10 µM) y MitoTracker (100 nM, Molecular Probes), isotiocianato de tetrametil-rodamina (TRITC)-dextrano 4,4 kD o 70 kD (25 mcg/ml, Molecular Probes), o Alexa Fluor 594-transferrina (25 mcg/ml, Molecular Probes) durante 4 horas (dextrano y transferrina) o 24 horas (MitoTracker). Debido a las limitaciones del fotoblanqueamiento, se utilizaron células Jurkat que sobreexpresan BCL-2 para microscopia confocal en vivo a fin de optimizar la formación de imágenes con FITC. El marcaje con FITC-SAHBA de las mitocondrias era más brillante en las células Jurkat que sobreexpresan BCL-2 (de acuerdo con el mecanismo para la actividad de SAHB), y por lo tanto la captura de imágenes se facilitó utilizando estas células. Las células Jurkat tratadas se lavaron dos veces y a continuación se volvieron a poner en suspensión en PBS y preparaciones montadas en húmedo se analizaron con BioRad 1024 (Beth Israel/Deaconess Center for Advanced Microscoy) o Zeiss LSM510 microscopio confocal de barrido con láser (del Children's Hospital Boston Imaging Center).
En las secciones fijadas, los compuestos SAHB3BIDA localizados en el borde citoplásmico de las células leucémicas, sin membrana plasmática o fluorescencia en la superficie evidente; el patrón vesicular de fluorescencia sugirió una localización específica de orgánulo (figuras 19a y 19b). En consonancia con los datos de FACS, las células Jurkat tratadas con FITC-BID BH3 no mostraron marcaje fluorescente (figura 19c). Mientras que las células tratadas con FITC-SAHB3BIDA presentan fluorescencia intracelular selectiva y mantienen su estructura celular (figura 19a), las células tratadas con la hélice 6 de FITC-BID se marcan de manera difusa y muestran morfología celular alterada (figura 19d). Los estudios de localización conjunta con FITC-SAHB3BIDA y un anticuerpo contra la proteína Tom20 de la membrana mitocondrial, muestran una amplia superposición de fluorescencia de SAHB3BIDA con mitocondrias, el sitio previsto de dianas moleculares de SAHB3BID (figura 20).
La toma de imágenes de células vivas realizada 4 horas después del tratamiento con SAHB demostró una localización conjunta inicial de FITC-SAHBA con endosomas marcados con dextrano (4,4 kD y 70 kD) (figura 21a), pero no con endosomas marcados con transferrina (figura 21b), en consonancia con la absorción celular por pinocitosis en fase líquida (ref. 27 de manuscrito), la vía endocítica determinada para los péptidos TAT y Antp (ref. 28 de manuscrito). En un punto de tiempo de 24 horas, FITC SAHBA intracelular presentaba mayor localización conjunta con mitocondrias marcados con MitoTracke en las células vivas (figura 21c) en consonancia con la localización mitocondrial conjunta observada en células fijadas utilizando un anticuerpo contra Tom20, proteína de la membrana externa mitocondrial (figura 20).Considerados en conjunto, los datos de FACS y de formación de imágenes confocal demuestran que la reticulación de todos los hidrocarburos permite a los compuestos SAHB3BIDA ser importados por células intactas (por ejemplo, mediante un mecanismo de endocitosis).
Los compuestos SAHB3BID desencadenan apoptosis de linfocitos B, linfocitos T y células de leucemia de linaje mixto (MLL)
A fin de evaluar si los compuestos SAHB3BID podrían detener el crecimiento de las células de leucemia proliferantes en el cultivo se realizaron ensayos con MTT, bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio, utilizando diluciones en serie de SAHB3BIDA en linfocitos T (Jurkat), linfocitos B (REH) y células (MV4; 11, SEMK2, RS4; 11) de leucemia de linaje mixto (MLL) en cultivo. SAHB3BIDA inhibió las células leucémicas a IC50 de 2,2 (Jurkat), 10,2 (REH), 4,7 (MV4; 11), 1,6 (SEMK2) y 2,7 (RS4, 11) µM (FIG. 22a ). Ni el péptido BID BH3 ni el mutante puntual SAHBA(G→E) tuvieron efecto en este intervalo de dosis (FIG. 22b, 22c).
Para evaluar si esta interrupción metabólica representaba provocación de apoptosis, las células Jurkat de leucemia se trataron con SAHB3BIDA y B, SAHB3BID(G→E) A y B, y péptido BID BH3 sin modificar 10 µM, en medio libre de suero durante 4 horas seguido de 16 horas de incubación en medio que contiene suero (es decir, concentraciones finales de péptido de 5 µM), y a continuación se ensayó la apoptosis por detección por citometría de flujo de las células tratadas con anexina V. SAHB3BIDA y B mostraron entre 40 y 60% de positividad a anexina V 20 horas después del tratamiento, mientras que el péptido no modificado y los mutantes puntuales de SAHB3BID no tuvieron ningún efecto (figuras 23a y 23 b). Unos estudios comparables que utilizan péptidos BH3 no modificados con reactivos portadores o hélices manipuladas con efectos perturbadores mitocondriales no específicos, necesitaron dosis de 20 a 300 µM para activar la apoptosis. Un experimento de control adicional que utiliza células Jurkat manipuladas para sobreexpresan BCL-2 se llevó a cabo posteriormente para evaluar si la apoptosis provocada por SAHB3BID podría reducirse por exceso de BCL-2, lo que sugiere que los compuestos funcionan específicamente dentro de las células a través de la vía de apoptosis mitocondrial. De hecho, el efecto proapoptósico de SAHB3BIDA y B 10 µM en células Jurkats "naturales" se suprimió en las células que sobreexpresan BCL-2. Este efecto protector, sin embargo, puede ser superado mediante escalada de dosis de SAHB3BIDA, pero no de SAHB3BID(G→E)A (FIG. 24); además, un mutante puntual Gly a Ser de SAHB3BIDA (SAHB3BID(G→S)A), que no presenta afinidad de unión a BCL-2 (ver anteriormente), es igualmente eficaz como proapoptósico en las células Jurkat que sobreexpresan las "naturales" y BCL-2 (figura 24). Se realizaron además ensayos de provocación de apoptosis que utilizan SAHB3BIDA y SAHB3BID(G→E)A en las estirpes celulares REH, MV4; 11 y SEMK2 con resultados similares (figura 25). Considerados en conjunto, estos datos indican que los compuestos SAHB3BID pueden penetrar y destruir las células proliferantes de leucemia. Los efectos proapoptósicos observados se suprimieron selectivamente por la mutación Gly a Glu de SAHB3BIDA y la sobreexpresión celular de BCL-2, resultados que ponen de relieve que los compuestos SAHB3BID funcionan por la vía de la apoptosis mitocondrial definida.
SAHB3BIDA y SAHB3BIDG→SA muestran supresión leucémica in vivo
Se sometieron ratones NOD-SCID a irradiación total del cuerpo de 300 cGy seguida de una inyección intravenosa de 4×106 células de leucemia SEMK2-M1 que presentan expresión estable de luciferasa. En los ratones se controló semanalmente el injerto de leucemia mediante el sistema de diagnóstico por la imagen in vivo (IVIS, Xenogen), que cuantifica la luminiscencia corporal total tras la inyección intraperitoneal de D-luciferina. El día 0, los ratones leucémicos se diagnosticaron por la imagen y después se trataron por vía intravenosa con 10 mg/kg de SAHB3BIDA,
SAHB3BIDG→SA, o sin inyección los días 1, 2, 3, 5, 6. La luminiscencia corporal total se midió los días 4 y 7. Haciendo referencia a la figura 26a, el análisis de la carga tumoral entre los grupos muestra supresión leucémica por SAHB3BIDA y SAHB3BID(G→S)A, en comparación con los ratones de referencia no tratados. Haciendo referencia a la figura 26b, las imágenes de luminiscencia corporal total muestran la leucemia más avanzada en el grupo sin tratar el día 7 (la densidad del color rojo, que representa alto nivel de leucemia, que se apreciar en todo el sistema esquelético) en comparación con los ratones tratados con SAHB3BIDA, lo que demuestra un nivel inferior y una enfermedad más localizada. Curiosamente, el mutante G→S, que no puede ser secuestrado por BCL-2 parece ser más potente que el compuesto original, SAHB3BIDA, en la supresión del crecimiento leucémico.
En otros experimentos con animales, los ratones leucémicos (generados como anteriormente) se diagnosticaron por imagen el día 0 y a continuación se trataron por vía intravenosa con 10 mg/kg de SAHB3BIDA, 5 mg/kg de SAHB3BIDA, o vehículo de referencia (5% de DMSO en D5W) los días 1, 2, 3, 6 y 7. La luminiscencia corporal total se midió los días 4 y 8. Haciendo referencia a la figura 27a, el análisis de la carga tumoral entre los grupos demuestra la supresión leucémica por SAHB3BIDA en función de la dosis en comparación con los ratones de referencia no tratados. Haciendo referencia a la figura 27b, las imágenes de luminiscencia corporal total muestran leucemia más avanzada en el grupo no tratado el día 8 (la densidad del color rojo representa alto nivel de leucemia) en comparación con el ratones tratados con SAHB3BIDA, cuya evolución leucémica está notablemente mitigada.
En experimentos adicionales con animales que mejor emplearon ratones SCID de color beige y células de leucemia RS4;11, el tratamiento con SAHB3BIDA suprimió sistemáticamente el crecimiento de la leucemia in vivo. Para el diagnóstico por la imagen in vivo de la leucemia, los ratones se anestesiaron con isoflurano inhalado (Abbott Laboratories) y se trató simultáneamente con inyección intraperitoneal de D-luciferina (60 mg/kg) (Promega). La emisión fotónica se fotografó (2 minutos de exposición) mediante el sistema de diagnóstico por la imagen in vivo (Xenogen) y bioluminiscencia corporal total cuantificado por integración del flujo fotónico (fotones/segundo) (Living Imagen Software, Xenogen). A partir del primer día del experimento, los ratones recibieron una inyección diaria en la vena caudal de SAHB3BIDA (10 mg/kg) o vehículo (DMSO al 5% en D5W) durante siete días. Los ratones fueron diagnosticados por la imagen los días 1, 3 y 5 y se controló la supervivencia diariamente durante todo el experimento. Las distribuciones de supervivencia de los ratones tratados con SAHB3BIDA y vehículo se determinaron utilizando el método de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba del orden logarítmico. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para comparar la proporción de ratones en los que había fallado el tratamiento entre los días 3 y 5, en la que el fallo del tratamiento se definió como empeoramiento o muerte, y éxito como enfermedad estable o remisión. Los ratones muertos se sometieron a necropsia (Rodent Histopahtology Core, DF/HCC).
Los ratones de referencia demostraron aceleración progresiva de crecimiento leucémico analizada cuantitativamente por el aumento de flujo bioluminiscente a partir de los días 1 a 5 (FIG. 27c). El tratamiento con SAHB3BIDA suprimió la expansión leucémica después del día 3, observándose remisión tumoral el día 5. Las imágenes representativas del ratón demuestran la infiltración leucémica progresiva del bazo y el hígado en ratones, pero remisión de la enfermedad en estos puntos anatómicos en ratones tratados con SAHBA el día 5 de tratamiento (figura 27d). La mediana del tiempo hasta la muerte en esta cohorte fue de 5 días para los animales de referencia, mientras que ninguno de los animales tratados con SAHBA muere durante el período de tratamiento de siete días, y en su lugar sobrevivieron durante una mediana de 11 días (figura 27e). El examen histológico de ratones tratados con SAHBA no mostró ninguna toxicidad obvia del compuesto en el tejido normal. En un estudio adicional comparando ratones tratados con SAHB3BIDA y SAHB3BID(G→E)A, los animales que recibieron el mutante puntual SAHB no presentaban remisión tumoral (figura 27f), destacando la especificidad in vivo de la actividad antileucémica de SAHB3BIDA.
Polipéptidos
En algunos casos, las fijaciones de hidrocarburos (es decir, reticulaciones) descritas en la presente memoria pueden manipularse más. En un caso, un doble enlace de una fijación de alquenilo hidrocarbonado, (por ejemplo, sintetizado utilizando una metátesis de cierre de anillo catalizada por rutenio (MCR)) puede oxidarse (por ejemplo, por epoxidación o dihidroxilación) para proporcionar uno de los compuestos siguientes.
Bien el resto epóxido o uno de los restos hidroxilo libres pueden funcionalizarse más. Por ejemplo, el epóxido se
10 puede tratar con un nucleófilo, que proporciona funcionalidad adicional que se puede utilizar, por ejemplo, para fijar una etiqueta (por ejemplo, un radioisótopo o etiqueta fluorescente). La etiqueta puede utilizarse para ayudar a dirigir el compuesto a un lugar deseado en el cuerpo (por ejemplo, dirigir el compuesto a la tiroides cuando se utiliza una etiqueta de yodo) o hacer seguimiento de la localización del compuesto en el cuerpo. Alternativamente, un agente terapéutico adicional se puede unir químicamente a la fijación funcionalizada (por ejemplo, un agente anticanceroso,
15 tales como rapamicina, vinblastina, taxol, etc.). Dicha modificación se puede conseguir alternativamente por manipulación sintética del terminal amino o carboxi del polipéptido o de la cadena lateral de aminoácido.
Aunque se han descrito fijaciones de hidrocarburos, también se prevén otras fijaciones. Por ejemplo, la fijación puede incluir uno o más de entre un resto de éter, tioéter, éster, amina o amida. En algunos casos, una cadena lateral de aminoácido de origen natural puede incorporarse a la fijación. Por ejemplo, una fijación puede acoplarse a
20 un grupo funcional tal como el hidroxilo en la serina, el tiol en la cisteína, la amina primaria en la lisina, el ácido en el aspartato o el glutamato, o la amida en la asparagina o la glutamina. Por consiguiente, es posible crear una fijación utilizando aminoácidos de origen natural en lugar de utilizar una fijación que se hace acoplando dos aminoácidos artificiales. También es posible utilizar un único aminoácido artificial junto con un aminoácido de origen natural.
Se prevé además que la longitud de la fijación pueda variarse. Por ejemplo, se puede utilizar una longitud más corta
25 de la fijación cuando se desee proporcionar un grado relativamente alto de fuerza sobre la estructura alfa-helicoidal secundaria, mientras que, en algunos casos, es deseable proporcionar menos fuerza en la estructura secundaria alfa-helicoidal en hélice alfa, y por lo tanto puede ser deseable una fijación más larga.
Además, aunque los ejemplos de fijaciones que comprenden desde los aminoácidos i a i+3, i a i+4 e i a i+7 se han descrito para proporcionar una fijación que está principalmente en una sola cara de la hélice alfa, pueden
30 sintetizarse fijaciones que comprendan cualquier combinación de números de aminoácidos.
En algunos casos, aminoácidos disustituidos en alfa se utilizan en el polipéptido para mejorar la estabilidad de la estructura secundaria alfa helicoidal. Sin embargo, no se requieren aminoácidos disustituidos en alfa, y también se contemplan casos que utilizan monosustituyentes en alfa (por ejemplo, en los aminoácidos fijados).
Como puede apreciarse por expertos en la materia, los procedimientos de síntesis de los compuestos descritos en la
35 presente memoria serán evidentes para cualquier experto en la materia. Además, varias etapas de síntesis se pueden realizar en una secuencia u orden alternativo para proporcionar los compuestos deseados. Las transformaciones químicas sintéticas y las metodologías de grupos protectores (protección y desprotección) útiles en la síntesis de los compuestos descritos en la presente memoria son conocidos en la técnica e comprenden, por ejemplo, los descritos en R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene
40 y P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2ª. Ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser y M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); y L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995), y las ediciones posteriores de la misma.
Los péptidos de la presente invención se pueden preparar por procedimientos de síntesis química, que son bien conocidos para cualquier experto en la materia. Véase, por ejemplo, Fields et al., capítulo 3 en Synthetic Peptides: A
45 User's, ed. Grant, W.H. Freeman & Co., Nueva York, N.Y., 1992, pág. 77. Por lo tanto, los péptidos pueden sintetizarse utilizando las técnicas automatizadas de Merrifield de síntesis en fase sólida con el α-NH2 protegido por la química de t-Boc o F-moc utilizando protegidos por la cadena lateral en, por ejemplo, un sintetizador de péptidos modelo 430A o 431 de Applied Biosystems.
Una manera de preparar los péptidos descritos en la presente memoria es utilizar la síntesis de péptidos en fase 50 sólida (SPPS).El terminal C del aminoácido se une a una resina de poliestireno reticulado por un enlace lábil ácido con una molécula enlazadora. Esta resina es insoluble en los disolventes utilizados para la síntesis, haciendo que sea relativamente fácil y rápido lavar el exceso de reactivos y subproductos. El terminal N está protegido con el grupo Fmoc, que es estable en ácidos, pero extraíble por bases. Cualquiera de los grupos funcionales de la cadena lateral están protegidos con grupos básicos estables, ácidos lábiles.
5 Pueden prepararse péptidos más largos por conjunción de péptidos sintéticos individuales mediante ligadura química nativa. Alternativamente, pueden sintetizarse péptidos sintéticos más largos por técnicas de ADN recombinante bien conocidas. Dichas técnicas se proporcionan en manuales estándares bien conocidos con protocolos detallados. Para construir un gen que codifica un péptido de la presente invención, la secuencia de aminoácidos se traduce al revés para obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos, preferentemente con codones que son óptimos para el organismo en el que el gen se va a expresar. A continuación, se prepara un gen sintético, por lo general sintetizando oligonucleótidos que codifican el péptido y algunos elementos reguladores, si es necesario. El gen sintético se inserta en un vector de clonación adecuado y se transfecta en una célula hospedadora. El péptido se expresa después en condiciones adecuadas apropiadas para el sistema de expresión seleccionado y el hospedador. El péptido se purifica y caracteriza por métodos estándar.
15 Los péptidos se pueden preparar de manera combinatoria, con alto rendimiento, por ejemplo, utilizando un sintetizador policanal combinatorio de alto rendimiento disponible de Advanced Chemtech.
Las figuras 28a -28f representan diversos péptidos que comprenden dominios que son útiles para crear péptidos reticulados.
Procedimientos de tratamiento
En la presente invención se describen procedimientos tanto profilácticos como terapéuticos para tratar a un paciente en riesgo de (o sensible a) un trastorno o que tiene un trastorno asociado con la expresión o actividad (por ejemplo, anomalías de la vía apoptósica extrínseca o intrínseca) aberrante (por ejemplo, insuficiente o excesiva) de miembros de la familia BCL-2. En el contexto de la presente memoria, el término "tratamiento" se define como la aplicación o administración de un agente terapéutico a un paciente, o la aplicación o administración de un agente terapéutico a
25 un tejido aislado o estirpe celular de un paciente, que tiene una enfermedad, un síntoma de enfermedad o una predisposición hacia una enfermedad, con el propósito de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, corregir, mejorar o afectar la enfermedad, los síntomas de la enfermedad o la predisposición a la enfermedad. Un agente terapéutico comprende, pero no se limita a, moléculas pequeñas, péptidos, anticuerpos, ribozimas y oligonucleótidos complementarios.
Es posible que algunos trastornos de tipo BCL-2 pueden producirse, por lo menos en parte, por un nivel anormal de uno o más miembros de la familia BCL-2 (por ejemplo, sobre o bajo la expresión), o por la presencia de uno o más miembros de la familia BCL -2 que presenta actividad anormal. Como tal, la reducción del nivel y/o actividad del miembro de la familia BCL-2 o la mejora del nivel y/o actividad del miembro de la familia BCL-2, que produciría la mejora de los síntomas del trastorno.
35 Los polipéptidos de la invención pueden utilizarse para tratar, prevenir y/o diagnosticar cánceres y enfermedades neoplásicas. Como se utiliza en la presente memoria, los términos "cáncer", "hiperproliferante" y "neoplásico" se refieren a células que tienen la capacidad para crecimiento autónomo, es decir, un estado o afección anormal caracterizado por proliferar rápidamente el crecimiento celular. Las enfermedades hiperproliferantes y neoplásicas pueden clasificarse como patológicas, es decir, que caracterizan o constituyen un estado de enfermedad, o pueden clasificarse como no patológicas, es decir, una desviación del estado normal pero no asociada a un estado de enfermedad. Por el término se entiende principalmente todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastáticos o células, tejidos, u órganos malignamente transformados, independientemente del tipo histopatológico o la etapa de invasividad. Células "hiperproliferantes patológicas" se producen en enfermedades caracterizadas por el crecimiento del tumor maligno. Los ejemplos de células hiperproliferantes no
45 patológicas comprenden la proliferación de células asociadas a la reparación de heridas.
Los ejemplos de trastornos celulares proliferantes y/o diferenciadores comprenden cáncer, por ejemplo, carcinoma, sarcoma, o trastornos metastásicos. Los compuestos (es decir, los polipéptidos) pueden actuar como agentes terapéuticos novedosos para controlar el cáncer de mama, el cáncer de ovario, el cáncer de colon, el cáncer de pulmón, la metástasis de dichos cánceres y similares. Un tumor metastásico puede surgir de una multitud de tipos de tumor primario, incluyendo pero sin limitarse a los de origen de mama, pulmón, hígado, colon y ovario.
Los ejemplos de cánceres o enfermedades neoplásicas comprenden de manera no limitativa fibrosarcoma, miosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteógeno, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer rectal, cáncer de páncreático, cáncer de ovario, 55 cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer cerebral, carcinoma de células escamosas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistoadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncógeno, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer de cuello
uterino, cáncer testicular, carcinoma pulmonar microcítico, carcinoma pulmonar amicrocítico, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma , meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma o sarcoma de Kaposi.
Los ejemplos de trastornos proliferantes comprenden trastornos neoplásicos hematopoyéticos. Como se emplea en la presente memoria, la expresión "trastornos neoplásicos hematopoyéticos" comprende enfermedades que implican células hiperplásicas/neoplásicas de origen hematopoyético, por ejemplo, derivados de linajes mieloides, linfoides o eritroides, o células precursoras de los mismos. Preferentemente, las enfermedades surgen de las leucemias agudas poco diferenciadas, por ejemplo, la leucemia eritroblástica y la leucemia megacarioblástica aguda. Los trastornos mieloides ejemplificativos adicionales comprenden de manera no limitativa leucemia promieloide aguda (APML), leucemia mielógena aguda (AML) y leucemia mielógena crónica (LMC) (reseñado en Vaickus, L. (1991) Crit. Rev. in Oncol./Hemotol. 11:267-97), las neoplasias linfoides comprenden de manera no limitativa la leucemia linfoblástica aguda (LLA), principalmente LLA de linaje B y LLA de linaje T, leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia prolinfocítica (LPL), leucemia de tricoleucocitos (HLL) y macroglobulinemia de Waldenstrom (MW). Las formas adicionales de linfomas malignos comprenden de manera no limitativa linfoma no hodgkiniano y variantes del mismo, linfomas de linfocitos T periféricos, células (ATL), leucemia/linfoma de linfocitos T del adulto, linfoma cutáneo de linfocitos T (CTCL), leucemia linfocítica de células grandes granulares (LGF), enfermedad de Hodgkin y enfermedad de Reed-Sternberg.
Los ejemplos de trastornos de proliferación y/o diferenciación celular de la mama comprenden de manera no limitativa mastopatía proliferante, como por ejemplo, hiperplasia epitelial, adenosis esclerosante y papiloma de los conductos pequeños; tumores, por ejemplo, tumores de estroma tales como fibroadenomas, tumor filoides y sarcomas, y tumores epiteliales tales como papiloma de los conductos grandes; carcinoma de la mama especialmente el carcinoma in situ (no invasivo) principalmente el carcinoma canalicular in situ (incluyendo la enfermedad de Paget) y el carcinoma lobulillar in situ, y el carcinoma invasivo (infiltrante) principalmente, pero no limitado a, carcinoma canalicular invasivo, carcinoma lobulillar invasivo, carcinoma medular, mixoma (mucinoso), carcinoma tubular y carcinoma papilar invasivo, y diversas neoplasias malignas. Los trastornos en la mama masculina comprenden de manera no limitativa ginecomastia y carcinoma.
Los ejemplos de trastornos pulmonares de proliferación y/o diferenciación celulares comprenden de manera no limitativa carcinoma broncógeno, principalmente síndromes paraneoplásicos, carcinoma bronquioloalveolar, tumores neuroendocrinos, tales como carcinoide bronquial, tumores diversos, y tumores metastásicos; patologías de la pleura, principalmente los derrames pleurales inflamatorios, derrames pleurales no inflamatorios, neumotórax y tumores pleurales, principalmente los tumores fibrosos solitarios (fibroma pleural) y el mesotelioma maligno.
Los ejemplos de trastornos celulares de proliferación y/o diferenciación del colon comprenden de manera no limitativa pólipos no neoplásicos, adenomas, síndromes familiares, carcinogenia colorrectal, carcinoma colorrectal y tumores carcinoides.
Los ejemplos de trastornos celulares de proliferación y/o diferenciación del hígado comprenden de manera no limitativa hiperplasias nodulares, adenomas y tumores malignos, principalmente carcinoma primario del hígado y tumores metastásicos.
Los ejemplos de trastornos celulares de proliferación y/o diferenciación del ovario comprenden de manera no limitativa los tumores de ovario tales como, tumores de epitelio celómico, tumores serosos, tumores mucinosos, tumores endometroides, mesonefroma, cistadenofibroma, tumor de Brenner, tumores del epitelio superficial, tumores de las células reproductoras como teratomas maduros (benignos), teratomas monodérmicos, teratomas inmaduros malignos, disgerminoma, tumor del seno endodérmico, coriocarcinoma; tumores de los cordones sexuales y del estroma tales como, los tumores de células de la granulosa y de la teca, tecoma-fibromas, androblastomas, tumores de células hill, y gonadoblastoma; y tumores metastáticos tales como tumores de Krukenberg.
Los polipéptidos descritos en la presente memoria también pueden utilizarse para tratar, prevenir o diagnosticar enfermedades caracterizadas por la muerte celular hiperactiva o la muerte celular debido a lesión fisiológica etc. Algunos ejemplos de enfermedades caracterizadas por la muerte celular prematura o no deseada o la proliferación celular excesiva o, alternativamente, no deseada comprenden de manera no limitativa las enfermedades hipocelulares/hipoplásicas, acelulares/aplásicas o hipercelulares/hiperplásicas. Algunos ejemplos comprenden trastornos hematológicos principalmente, pero no limitados a, anemia de Fanconi, anemia aplásica, talasemia, neutropenia congénita y mielodisplasia.
Los polipéptidos de la invención que actúan para disminuir la apoptosis se pueden utilizar para tratar trastornos asociados con un nivel indeseable de muerte celular. Por lo tanto, los péptidos antiapoptósicos de la invención pueden utilizarse para tratar trastornos tales como las que conducen a la muerte celular asociada a la infección vírica, por ejemplo, infección asociada a la infección con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Una amplia variedad de enfermedades neurológicas se caracteriza por la pérdida gradual de conjuntos específicos de neuronas, y los péptidos antiapoptósicos de la infección se pueden utilizar en el tratamiento de estos trastornos. Dichos trastornos comprenden la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica (ALS), la retinitis pigmentosa, la atrofia muscular espinal, y diversas formas de degeneración cerebelosa. La pérdida de células en estas enfermedades no provoca una respuesta inflamatoria, y la apoptosis parece ser el mecanismo de la muerte celular. Además, numerosas enfermedades hematológicas están asociadas a una disminución de la producción de células sanguíneas. Estos trastornos comprenden la anemia asociada a la enfermedad crónica, la anemia aplásica, la neutropenia crónica y los síndromes mielodisplásicos. Los trastornos de la producción de células sanguíneas, tales como el síndrome mielodisplásico y algunas formas de anemia aplásica, están asociados a un aumento de la muerte celular apoptósica en la médula ósea. Estos trastornos podrían provenir de la activación de genes que favorecen la apoptosis, las insuficiencias adquiridas en las células del estroma o factores de supervivencia hematopoyéticos, o los efectos directos de toxinas y mediadores de respuestas inmunitarias. Dos trastornos comunes asociados a la muerte celular son infartos de miocardio y el accidente cerebrovascular. En ambos trastornos, las células dentro de la zona central de la isquemia, que se produce en el caso de pérdida aguda de circulación sanguínea, parecen morir rápidamente como resultado de la necrosis. Sin embargo, fuera de la zona isquémica central, las células mueren durante un período de tiempo más prolongado y morfológicamente parecen morir por apoptosis. Los péptidos antiapoptósicos de la invención pueden utilizarse para tratar todos estos trastornos asociados con la muerte celular indeseable.
Algunos ejemplos de trastornos inmunológicos que pueden tratarse con los polipéptidos descritos en la presente memoria comprenden de manera no limitativa el rechazo del trasplante de órganos, la artritis, el lupus, EII, la enfermedad de Crone, el asma, la esclerosis múltiple, la diabetes, etc.
Algunos ejemplos de trastornos neurológicos que se pueden tratar con los polipéptidos descritos en la presente memoria comprenden de manera no limitativa la enfermedad de Alzheimer, el síndrome de Down, la hemorragia cerebral con amiloidosis hereditaria, tipo holandés, amiloidosis reactiva, nefropatía amiloide familiar con urticaria y sordera, síndrome de Muckle-Wells síndrome, mieloma idiopático; mieloma asociado a macroglobulinemia, polineuropatía amiloide familiar, miocardiopatía amiloide familiar, amiloidosis cardíaca aislada, amiloidosis senil generalizada, diabetes al comienzo de la edad adulta, insulinoma, amiloidosis auricular aislada, Carcinoma medular de la tiroides, amiloidosis familiar, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis, polineuropatía amiloidósica familiar, encefalopatía espongiforme ovina, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de Gerstmann Straussler-Scheinker, encefalitis espongiforme bovina, enfermedades por priones, y la enfermedad de Huntington.
Algunos ejemplos de trastornos endocrinológicos que pueden tratarse con los polipéptidos descritos en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a la diabetes, hipotiroidismo, hipopituitarismo, hipoparatiroidismo, hipogonadismo, etc.
Los ejemplos de trastornos cardiovasculares (por ejemplo, trastornos inflamatorios) que se pueden tratar o prevenir con los compuestos y procedimientos de la invención comprenden de manera no limitativa aterosclerosis, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, trombosis, aneurisma, insuficiencia cardíaca, cardiopatía isquémica, angina de pecho, muerte cardíaca súbita, cardiopatía hipertensiva; angiopatía no coronaria, tales como la arteriosclerosis, microangiopatía, nefropatía, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, xantomatosis, asma, hipertensión, enfisema y neumopatía crónica; o una enfermedad cardiovascular asociada con los procedimientos de intervención ("trauma vascular por intervención quirúrgica"), tales como la restenosis tras la angioplastia, la colocación de una derivación, endoprótesis vascular, injertos de escisión sintéticos o naturales, sonda permanente, válvula u otros dispositivos implantables. Los trastornos cardiovasculares preferidos comprenden aterosclerosis, infarto de miocardio, aneurisma, y el accidente cerebrovascular.
Composiciones farmacéuticas y vías de administración
Los compuestos de esta invención, tal como se usan aquí, incluyendo los compuestos de las fórmulas descritas en la presente memoria, se definen de manera que incluyen derivados o profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos. Un "derivado o profármaco farmacéuticamente aceptable" hace referencia a cualquier sal, éster, sal de un éster u otro derivado farmacéuticamente aceptable de un compuesto de la presente invención que, tras la administración a un receptor, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto de la presente invención. Los derivados y profármacos particularmente favorecidos son los que aumentan la biodisponibilidad de los compuestos de la presente invención cuando dichos compuestos se administran a un mamífero (por ejemplo, permitiendo que un compuesto administrado oralmente se absorba más fácilmente en la sangre) o que mejoran la administración del compuesto original a un compartimento biológico (por ejemplo, el cerebro o el sistema linfático) con respecto a la especie original. Los profármacos preferidos comprenden derivados en los que un grupo que mejora la solubilidad acuosa o el transporte activo a través de la membrana intestinal se agrega a la estructura de las fórmulas descritas en la presente memoria.
Los compuestos de esta invención pueden modificarse añadiendo funcionalidades apropiadas para mejorar las propiedades biológicas selectivas. Dichas modificaciones son conocidas en la técnica y comprenden las que aumentan la penetración biológica en un compartimento biológico dado (por ejemplo, sangre, sistema linfático, sistema nervioso central), aumentan la disponibilidad oral, aumentan la solubilidad para permitir la administración por inyectables, alteran el metabolismo y alteran la tasa de la excreción.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la presente invención comprenden los derivados de ácidos y bases inorgánicos y orgánicos farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de sales de ácidos adecuados comprenden acetato, adipato, benzoato, bencensulfonato, butirato, citrato, digluconato, dodecilsulfato, formiato, fumarato, glicolato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, lactato, maleato, malonato, metansulfonato, 2-naftalensulfonato, nicotinato, nitrato, palmoato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, salicilato, succinato, sulfato, tartrato, tosilato y undecanoato. Las sales derivadas de bases apropiadas comprenden sales de metales alcalinos (por ejemplo, sodio), de metales alcalinotérreos (por ejemplo, magnesio), de amonio y N(alquil)4+. La presente invención también prevé la cuaternización de cualesquiera de los grupos que contienen nitrógeno básico de los compuestos expuestos en la presente memoria. Pueden obtenerse agua o productos solubles o dispersables en aceite por dicha cuaternización.
Los compuestos de las fórmulas descritas en la presente memoria pueden administrarse, por ejemplo, por inyección, por vía intravenosa, intraarterial, por vía subdérmica, intraperitoneal, intramuscular, o subcutánea, o por vía oral, bucal, nasal, a través de las mucosas, o vía tópica, en un preparado oftálmico, o por inhalación, con una dosis que oscila entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, o según los requisitos del fármaco concreto. Los procedimientos en la presente memoria contemplan la administración de una cantidad eficaz de compuesto o composición del compuesto para conseguir el efecto deseado o indicado. Por lo general, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se administrarán desde aproximadamente 1 a aproximadamente 6 veces al día o alternativamente, como infusión continua. Dicha administración se puede utilizar como terapia crónica o aguda. La cantidad de principio activo que puede combinarse con los materiales portadores para producir una sola forma farmacéutica variará en función del hospedador tratado y del modo concreto de administración. Un preparado típico contendrá desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 95% de compuesto activo (p/p). Alternativamente, tales preparaciones contienen desde aproximadamente 20% hasta aproximadamente 80% de compuesto activo.
Pueden ser necesarias dosis inferiores o superiores a las citadas anteriormente. La dosis y los regímenes de tratamiento específicos para cualquier paciente concreto dependerán de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos , la gravedad y evolución de la enfermedad, afección o síntomas, la disposición del paciente a la enfermedad, afección o síntomas, y el criterio del médico de familia.
Tras la mejora de una enfermedad de un paciente, se puede administrar, si es necesario, una dosis de mantenimiento de un compuesto, composición o combinación de la presente invención. Posteriormente, la dosis o frecuencia de administración, o ambas, pueden reducirse, en función de los síntomas, a un nivel en el que se mantiene mejorada la enfermedad. Los pacientes pueden, sin embargo, necesitar un tratamiento intermitente de larga duración tras cualquier recaída de los síntomas de la enfermedad.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención comprenden un compuesto de las fórmulas descritas en la presente memoria o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; un agente adicional como, por ejemplo, la morfina o la codeína; y cualquier portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones alternativas de la presente invención comprenden un compuesto de las fórmulas descritas en la presente memoria o una sal farmacéuticamente aceptables del mismo, y un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones definidas en la presente memoria comprenden los compuestos de las fórmulas definidas en la presente memoria, así como agentes terapéuticos adicionales si están presentes, en cantidades eficaces para conseguir una modulación de la enfermedad o síntomas de la enfermedad, principalmente trastornos en los que intervienen como mediadores miembros de la familia BCL-2 o síntomas de los mismos.
La expresión "portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador o adyuvante que puede administrarse a un paciente, junto con un compuesto de esta invención, y que no destruye la actividad farmacológica del mismo y no es tóxico cuando se administra en dosis suficientes para administrar una cantidad terapéutica del compuesto.
Los portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden utilizarse en las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden, pero no se limitan a, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, sistemas de administración de fármacos autoemulsionantes (SEDDS) tales como succinato de d-α-tocoferol y polietilenglicol 1000, tensioactivos utilizados en presentaciones farmacéuticas tales como Tweens u otras matrices de administración polimérica similares, proteínas séricas, tales como albúmina de suero humano, sustancias tampón, tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, fosfato ácido disódico, fosfato ácido de potasio, cloruro de sodio, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polividona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros del bloque polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana. Las ciclodextrinas tales como α-, β-, y γ-ciclodextrina, puede también utilizarse provechosamente para mejorar la administración de los compuestos de las fórmulas descritas en la presente memoria.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar por vía oral, parenteral, por pulverización para inhalación, por vía tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o mediante un depósito implantado, preferentemente por administración oral o administración por inyección. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden contener cualquiera de los portadores, adyuvantes o vehículos inocuos convencionales farmacéuticamente aceptables. En algunos casos, el pH de la formulación puede ser ajustado con ácidos, bases o tampones farmacéuticamente aceptables para mejorar la estabilidad del compuesto formulado o su forma de administración. El término parenteral, como se emplea en la presente memoria comprende técnicas de inyección o infusión subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional e intracraneal.
Las composiciones farmacéuticas pueden encontrarse en forma de un preparado inyectable estéril, por ejemplo, en forma de una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión puede formularse según procedimientos conocidos en la técnica utilizando agentes dispersantes o humectantes (tales como, por ejemplo, Tween 80) y agentes de suspensión adecuados. El preparado inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente inocuo, parenteralmente aceptable, por ejemplo, en forma de solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran manitol, agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico. Además, se emplean convencionalmente aceites fijos estériles como un medio disolvente o de suspensión. Con esta finalidad, se puede emplear cualquier aceite fijo blando principalmente mono-o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como el ácido oleico y sus derivados de glicéridos son útiles en la preparación de inyectables, dado que son aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como el aceite de oliva o el aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones de aceite también pueden contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga, o carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares que se utilizan comúnmente en la formulación de presentaciones farmacéuticamente aceptables tales como emulsiones y/o suspensiones. Otros tensioactivos frecuentemente utilizados, tales como Tweens o Spans y/u otros agentes emulsionantes o potenciadores de biodisponibilidad similares que se utilizan frecuentemente en la preparación de formulaciones sólidas, líquidas o de otro tipo farmacéuticamente aceptables también pueden utilizarse para su formulación.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar por vía oral en cualquier presentación aceptable por vía oral entre ellas, pero no limitadas a, cápsulas, comprimidos, emulsiones, suspensiones, dispersiones y soluciones acuosas. En el caso de comprimidos para uso oral, los portadores que se utilizan normalmente contienen lactosa y almidón de maíz. También se suelen añadir agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio. Para administración oral en forma de cápsulas, los diluyentes útiles contienen lactosa y almidón de maíz anhidro. Cuando las suspensiones y/o emulsiones acuosas se administran por vía oral, el principio activo puede estar en suspensión o disuelto en una fase oleosa combinado con agentes emulsionantes y/o agentes de suspensión. Si se desea, pueden añadirse determinados agentes edulcorantes y/o saborizantes y/o agentes colorantes.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención también se pueden administrar en forma de supositorios para administración rectal. Estas composiciones se pueden preparar mezclando un compuesto de la presente invención con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperatura ambiente pero líquido a la temperatura rectal y por lo tanto se fundirá en el recto para liberar los componentes activos. Dichos materiales comprenden de manera no limitativa manteca de cacao, cera de abejas y polietilenglicoles.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar por aerosol nasal o inhalación. Dichas composiciones se preparan según procedimientos bien conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica y pueden prepararse como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, activadores de absorción para potenciar la biodisponibilidad, fluorocarbonos, y/u otros agentes disolventes o dispersantes conocidos en la técnica.
Cuando las composiciones de esta invención comprenden una combinación de un compuesto de las fórmulas descritas en la presente memoria y uno o más agentes terapéuticos o profilácticos adicionales, tanto el compuesto como el agente adicional deben estar presentes en niveles de dosificación de entre aproximadamente 1 a 100%, y más preferentemente entre aproximadamente 5 a 95% de la dosis administrada normalmente en un régimen de monoterapia. Pueden administrarse otros agentes aparte, como parte de un régimen de politerapia, a partir de los compuestos de la presente invención. Alternativamente, esos agentes pueden formar parte de una presentación única, mezclados junto con los compuestos de la presente invención en una única composición.
Ensayos de detección
La invención proporciona métodos (también denominados en la presente memoria "ensayos de selección") para la identificación de polipéptidos que modulan la actividad de una o más de proteínas de la familia BCL-2 o que se unen a uno o más proteínas de la familia BCL-2 (por ejemplo, un polipéptido que tiene por lo menos un dominio de homología BH).
La afinidad de unión de los polipéptidos descritos en la presente memoria se puede determinar utilizando, por ejemplo, un ensayo de valoración de enlaces. Un polipéptido de la familia BCL-2 o polipéptido que comprende un dominio BH (por ejemplo, BID, BAK, BAX, etc.) puede exponerse a concentraciones variables de un compuesto candidato (es decir, un polipéptido) (por ejemplo, 1 nM, 10 nM, 100 nM , 1 µM, 10 µM, 100 µM , 1 mM y 10 mM) en presencia de un sustrato tal como un BH3 marcado con fluorescencia que contiene polipéptido o un fragmento del mismo (por ejemplo, BID, BAD, BAK, BAX, etc.). El efecto de cada concentración de compuesto candidato se
5 analiza a continuación para determinar el efecto del compuesto candidato sobre la actividad de unión de la familia BCL-2 a concentraciones variables, que puede utilizarse para calcular la Ki del compuesto candidato. El compuesto candidato puede modular la actividad de tipo BCL-2 de manera competitiva o no competitiva. También pueden realizarse ensayos de enlace directo entre proteínas de la familia BCL-2 y los compuestos candidatos marcados con fluorescencia para determinar la Kd para la interacción de enlace. Los compuestos candidatos también pueden ser detectados para la actividad biológica in vitro, por ejemplo, mediante la determinación de su eficacia sensible a la dosis en la activación del citocromo c de mitocondrias purificadas. También están previstos ensayos de detección de permeabilidad celular, en los que los compuestos candidatos marcados con fluorescencia se aplican a las células intactas, que se analizan a continuación para detectar la fluorescencia celular por microscopia de fluorescencia celular o la detección de alta resolución.
15 Los ensayos descritos en la presente memoria pueden realizarse con compuestos candidatos individuales o pueden realizarse con un gran número de compuestos candidatos. Cuando los ensayos se realizan con un gran número de compuestos candidatos, los ensayos se pueden realizar utilizando mezclas de compuestos candidatos o se pueden ejecutar en reacciones paralelas con cada uno de las reacciones que tiene un solo compuesto candidato. Los compuestos o agentes de ensayo se pueden obtener utilizando cualquiera de las numerosas propuestas en procedimientos de bibliotecas combinatorias conocidos en la técnica.
En una realización, un ensayo es un ensayo en células en el que una célula que expresa una proteína de la familia BCL-2 o una parte biológicamente activa de la misma se pone en contacto con un polipéptido candidato, y se determina la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de tipo BCL-2 (por ejemplo, en algunos casos aumentan la apoptosis y en otros casos disminuyen la apoptosis, por vías de muerte celular intrínsecas o
25 extrínsecas). La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de tipo BCL-2 dentro de las células puede llevarse a cabo controlando, por ejemplo, la liberación de citocromo c de las mitocondrias u otras lecturas fisiológicas relevante (por ejemplo, tinción con anexina V, ensayo con MTT, el ensayo de actividad de la caspasa, ensayo TUNEL).
En una realización, un ensayo es un ensayo bioquímico, mediante el cual polipéptidos reticulados se pueden vincular a la resina de afinidad para purificar o identificar nuevas o conocidas parejas interactivas en la vía apoptósica.
Todas las referencias citadas en esta memoria, ya sean impresas, electrónicas, medios de almacenamiento legibles mediante ordenador u otras formas, se incorporan expresamente por referencia en su totalidad, incluyendo pero no limitándose a resúmenes, artículos, revistas, publicaciones, textos, tratados, sitios web de internet, bases de datos,
35 patentes y publicaciones de patente.
Otras aplicaciones
Las aplicaciones biológicamente relevantes para los péptidos descritos en la presente memoria son numerosas y evidentes, como se indica por los siguientes ejemplos basados en el compartimento celular:
(1) Superficie celular -Péptidos naturales que representan regiones helicoidales clave de la proteína gp41 del VIH-1 (por ejemplo, péptido C, péptido T-20) se ha mostrado que impiden la fusión vírica, y por lo tanto, la infectividad del VIH. Los péptidos helicoidales participan en los mecanismos de fusión esenciales para muchos paradigmas de infección de células hospedadoras por virus (por ejemplo, Dengue, hepatitis C, gripe), y por lo tanto, los análogos grapados a hidrocarburos de estas regiones helicoidales críticas pueden funcionar como antibióticos eficaces inhibiendo la fusión vírica. En general, los ligandos que interactúan con
45 los receptores de la superficie celular utilizando conexiones helicoidales para activar o inhibir las vías de señalización, representan aplicaciones adicionales para los polipéptidos descritos en la presente memoria.
(2) En el interior de la membrana – La dimerización y oligomerización de los receptores son características fundamentales de la activación y la señalización del receptor provocadas por ligandos. Los dominios helicoidales transmembranarios participan ampliamente en este tipo de reacciones de oligomerización esenciales (por ejemplo, la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico [EGFR]) y secuencias de péptidos específicas se han definido que facilitan estos asociados helicoidales intramembranarios ajustados. La activación aberrante de dichos receptores a través de oligomerización está implicada en la patogenia de la enfermedad (por ejemplo, erbB y el cáncer). Por lo tanto, en la configuración adecuada, la activación o inhibición de interacciones a través de la membrana entre las hélices tendrían beneficio
55 terapéutico.
(3) Citosólico – Los objetivos citosólicos comprenden objetivos de proteínas solubles y los asociados con orgánulos intracitosólicos específicos, incluyendo las mitocondrias, el retículo endoplásmico, el aparato de Golgi, los lisosomas y los peroxisomas. Dentro del campo de la apoptosis, hay múltiples objetivos de proteínas apoptósicas citosólicas y mitocondriales para los dominios de la familia BCL-2 grapados a hidrocarburos. Dentro del subgrupo sólo BH3 de proteínas proapoptósicas, se han identificado dos subconjuntos principales de los dominios BH3: (1) Los BH3 similares a BID (por ejemplo, BIM) que son
“activadores” de la apoptosis, que provocan oligomerización de BAK y liberación del citocromo c en el mitocondria y (2) Los BH3 similares a BAD que son “sensibilizadores” de la apoptosis que se dirigen
selectivamente a proteínas multidominio antiapoptósicas, lo que permite niveles subliminales de dominios de activación sean eficaces al máximo. Además de la unión distinta de las proteínas BH3-sólo a miembros de la familia con multidominio pro-frente a anti-apoptósico, los dominios BH3 presentan unión diferenciada entre las proteínas antiapoptósicas. Por ejemplo, se ha demostrado que BAD se une preferentemente a la BCL-2 antiapoptósica, mientras que el BIM se dirige a la MCL-1 antiapoptósica. La identificación y la exploración de estas interacciones selectivas son de importancia crítica porque diferentes miembros de la familia BCL-2 están implicados en diferentes tipos de cáncer. Por ejemplo, la sobreexpresión de BCL-2 es la responsable del desarrollo de linfoma folicular y la resistencia a la quimioterapia en general, mientras que MCL-1 se cree que desempeña una función importante en la patogenia del mieloma múltiple. La capacidad de transformar los muchos dominios BH3 en reactivos estructuralmente estables y permeables a las células proporcionaría una oportunidad importante de explorar y manipular de forma diferenciada las vías de apoptósicas en las células cancerosas. Está previsto focalizar más interacciones dependientes de la hélice en el citosol o en orgánulos citosólicos.
(4) Nuclear – Los factores de transcripción nuclear y sus proteínas moduladoras conducen una gran cantidad de procesos fisiológicos basados en interacciones de péptidos helicoidales con proteínas nucleares y ácidos nucleicos. La viabilidad de generar péptidos grapados a hidrocarburos para participar en interacciones nucleares recientemente se ha demostrado por la síntesis de la presente invención de un grupo de péptidos p53 grapados a hidrocarburos, que interactúan con MDM2 en afinidades picomolares. Además de modular las interacciones proteína-proteína en el núcleo, las interacciones proteína-ácido nucleico también son objetivos evidentes. Varias familias de factores de transcripción, tales como homeodominio, hélice-bucle-hélice básica, receptor nuclear, y proteínas que contienen dedos de cinc, interactúan directamente con ADN a través de sus hélices peptídicas para activar o inhibir la transcripción génica. Como ejemplo, las proteínas de homeodominio son una familia de factores de transcripción esenciales que regulan los programas genéticos de crecimiento y diferenciación en todos los organismos pluricelulares. Estas proteínas comparten un motivo de unión al ADN conservado, denominado el homeodominio, que contiene un péptido de 60 aminoácidos de longitud que forma tres hélices α, la tercera parte de las cuales hace contacto directo con el surco mayor del ADN. Al igual que el dominio BH3 de las proteínas apoptósicas, el homeodominio es un motivo efector crítico con la suficiente variación entre homólogos para facilitar especificidades de unión y actividades fisiológicas diferenciadas. Las interacciones proteína-ADN pueden ser complejas y extensas, y presentar de este modo un desafío para el desarrollo de pequeñas moléculas con el fin de estudiar y modular selectivamente episodios de transcripción. En organismos superiores, proteínas del homeodominio se expresan mucho durante el desarrollo, especificando el plan corporal e imponiendo la diferenciación del tejido. La sobreexpresión de homeoproteínas específicos (por ejemplo, CDX4) puede activar programas de diferenciación específicos del tejido que dan como resultado, por ejemplo, formación de la sangre a partir de células madre embrionarias de ratón. La desregulación de la expresión de genes homeóticos, tales como la regulación positiva aberrante por incremento de las proteínas del homeodominio normalmente expresadas en células no diferenciadas o la regulación por disminución inadecuada de dichas proteínas normalmente expresadas en células diferenciadas, puede contribuir al desarrollo y mantenimiento de cáncer. Por ejemplo, en el rabdomiosarcoma alveolar pediátrico, la fusión del dominio de unión a ADN PAX3 o PAX 7 para el dominio transactivador de Fork-Head ha estado implicada en la transformación celular; los desplazamientos que afectan a los dominios de unión al ADN de varios genes HOX se han relacionado con la patogenia de la leucemia. Por lo tanto, la capacidad de estabilizar químicamente hélices del factor de transcripción, tales como los péptidos del homeodominio, para administración celular tiene potencial para producir una caja de herramientas química para la investigación y la modulación de diversos programas de transcripción responsables de una multitud de procesos biológicos en la salud y la enfermedad.
Se han descrito varias realizaciones de la invención. Sin embargo, se entiende que se pueden hacer distintas modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Por lo tanto, hay otras realizaciones dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
Párrafos Relevantes
1. Un polipéptido de fórmula (I), en la que;
cada R1 y R2 son independientemente H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilalquil o heterociclilalquilo; R3 es alquilo, alquenilo, alquinilo; [R4-K-R4]n; cada uno de los cuales está sustituido con de 0 a 6
R5; R4 es alquilo, alquenilo o alquinilo; R5 es halógeno, alquilo, OR6, N(R6)2, SR6, SOR6, SO2R6, CO2R6, R6, un resto fluorescente o un
radioisótopo;
K es O, S, SO, SO2, CO, CO2, CONR6 o R6 es H, alquilo o un agente terapéutico; n es un número entero de 1 a 4; x es un número entero de 2 a 10; cada y es independientemente un número entero de 0 a 100; z es un número entero de 1 a 10; y cada Xaa es independientemente un aminoácido; donde el polipéptido tiene una estructura secundaria que es sustancialmente una hélice alfa en
disolución acuousa.
2.
El polipéptido del párrafo 1, en el que el polipéptido se une a un polipéptido de la familia BCL-2.
3.
El polipéptido del párrafo 1, en el que el polipéptido se une a un polipéptido anti-apoptósico.
4.
El polipéptido del párrafo 1, en el que el polipéptido se une a un dominio BH1, BH2 o BH3.
5.
El polipéptido del párrafo 1, en el que el polipéptido activa la muerte celular mitocondrial.
6.
El polipéptido del párrafo 1, en el que el polipéptido activa la muerte celular.
7.
El polipéptido del párrafo 1, en el que el polipéptido inhibe la muerte celular.
8.
El polipéptido del párrafo 1, en el que el polipéptido comprende un dominio BH3.
9.
El polipéptido del párrafo 1, en el que x es 2, 3 ó 6.
10.
El polipéptido del párrafo 1, en el que cada y es independientemente un número entero entre 3 y 15.
11.
El polipéptido del párrafo 1, en el que R1 y R2 son cada uno independientemente H o alquilo C1-C6.
12.
El polipéptido del párrafo 1, en el que R1 y R2 son cada uno independientemente alquilo C1-C3.
13.
El polipéptido del párrafo 11, en el que al menos uno de R1 y R2 es metilo.
14.
El polipéptido del párrafo 12, en el que R1 y R2 son metilo.
15.
El polipéptido del párrafo 1, en el que R3 es alquilo.
16.
El polipéptido del párrafo 14, en el que x es 3.
17.
El polipéptido del párrafo 15, en el que R3 es alquilo C8.
18.
El polipéptido del párrafo 14, en el que x es 6.
19.
El polipéptido del párrafo 17, en el que R3 es alquilo C11.
20.
El polipéptido del párrafo 1, en el que R3 es alquenilo.
21.
El polipéptido del párrafo 18, en el que x es 3.
22.
El polipéptido del párrafo 20, en el que R3 es alquenilo C8.
23.
El polipéptido del párrafo 19, en el que x es 6.
24.
El polipéptido del párrafo 19, en el que R3 es alquenilo C11.
25.
El polipéptido del párrafo 1, en el que R3 es una cadena lineal de alquilo, alquenilo o alquinilo.
26.
El polipéptido del párrafo 1, en el que R3 es [R4-K-R4] y R4 es una cadena lineal de alquilo, alquenilo o alquinilo.
27.
El polipéptido del párrafo 1, comprendiendo el polipéptido una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 60% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 1.
28.
El polipéptido del párrafo 15, en el que R3 es alquilo o alquenilo.
29.
El polipéptido del párrafo 15, en el que al menos uno de R1 o R2 es alquilo.
30.
El polipéptido del párrafo 11, en el que cada R1 y R2 es independientemente H o alquilo C1-C3.
31.
El polipéptido del párrafo 1, en el que R1 y R2 son metilo.
32.
El polipéptido del párrafo 1, en el que x es 3 ó 7 y z es 0.
33.
El polipéptido del párrafo 1, en el que R3 es alquilo o alquenilo C8 o C11.
34.
El polipéptido del párrafo 1, comprendiendo el polipéptido una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2.
35.
El polipéptido del párrafo 1, en el que el polipéptido es transportado a través de la membrana celular.
36.
El polipéptido del párrafo 1, en el que el polipéptido es transportado activamente a través de la membrana celular.
37.
El polipéptido del párrafo 1, que además comprende un resto fluorescente o radioisótopo.
38. El polipéptido del párrafo 1, en el que el polipéptido comprende 23 aminoácidos; R1 y R2 son metilo; R3 es alquilo C8, alquilo C11, alquenilo C8 o alquenilo C11; y x es 2,3 ó 6.
39.
El polipéptido del párrafo 1, que además comprende un marcador de afinidad.
40.
El polipéptido del párrafo 1, que además comprende un resto de selección de diana.
41.
El polipéptido del párrafo 1, que además comprende un resto de biotina.
42.
El polipéptido del párrafo 1, donde el polipéptido es un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en los polipéptidos representados en la figura 5.
43.
Un método para preparar un polipéptido de fórmula (III), que comprende proporcionar un polipéptido de fórmula (II); y
tratar el compuesto de fórmula (II) con un catalizador para promover una metátesis de cierre de anillo, proporcionando un compuesto de fórmula (III)
en la que
cada R1 y R2 son independientemente H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo; heteroarilalquilo o heterociclilalquilo; cada n es independientemente un número entero de 1a 15;
10 x es 2, 3ó6;
cada y es independientemente un número entero de 0 a 100;
z es un número entero de 1 a 3; y
cada Xaa es independientemente un aminoácido; y
donde el polipéptido comprende una estructura de hélice alfa en disolución acuosa. 15 44. El método del párrafo 43, en el que el polipéptido se une a un polipéptido miembro de la familia BCL-2.
45.
El método del párrafo 43, en el que el catalizador es un catalizador de rutenio.
46.
El método del párrafo 43, que además comprende proporcionar un agente reductor u oxidante después de la metátesis de cierre de anillo.
47. El método del párrafo 46, en el que el agente reductor es H2 o el agente oxidante es tetróxido de osmio. 20 48. Un método para tratar a un sujeto que comprende administrar al sujeto un compuesto del párrafo 1.
49.
El método del párrafo 48, que además comprende administrar un agente terapéutico adicional.
50.
Un método para tratar el cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto un compuesto del párrafo
1.
51. El método del párrafo 45, que además comprende administrar un agente terapéutico adicional. 25 52. Una librería de compuestos del párrafo 1, fórmula (I).
53. Un método para identificar un compuesto candidato para promover la apoptosis, que comprende; proporcionar una mitocondria; poner en contacto la mitocondria con un compuesto del párrafo 1; medir la liberación de citocromo c; y
comparar la liberación de citocromo c en presencia del compuesto del párrafo 1 con la liberación de citocromo c en ausencia del compuesto del párrafo 1, de manera que un aumento en la liberación de citocromo c en presencia del compuesto del párrafo 1 identifica al compuesto del párrafo 1 como compuesto candidato para promover la apoptosis.
5 54. Un polipéptido de fórmula (IV),
en la que;
cada R1 y R2 son independientemente H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilalquilo o heterociclilalquilo; R3 es alquilo, alquenilo, alquinilo; [R4-K-R4]n o una cadena lateral de un aminoácido natural; cada
uno de los cuales está sustituido con de 0 a 6 R5; R4 es alquilo, alquinilo o alquinilo; R5 es halógeno, alquilo, OR6, N(R6)2, SR6, SOR6, SO2R6, CO2R6, R6, un resto fluorescente o un
radioisótopo;
15 K es O, S, SO, SO2, CO, CO2, CONR6 ó
R6 es H, alquilo o un agente terapéutico;
R7 es alquilo, alquenilo, alquinilo; [R4-K-R4]n ó una cadena lateral de un aminoácido natural; cada
uno de los cuales está sustituido con de 0 a 6 R5;
n es un número entero de 1 a 4; 20 x es un número entero de 2 a 10;
cada y es independientemente un número entero de 0 a 100;
z es un número entero de 1 a 3; y
cada Xaa es independientemente un aminoácido; y
en donde el polipéptido tiene sustancialmente una estructura secundaria alfa helicoidal en
25 disolución acuosa.
55. Un polipéptido de fórmula (I),
en la que;
cada R1 y R2 son independientemente H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilalquilo o heterociclilalquilo;
R3 es alquilo, alquenilo, alquinilo; [R4-K-R4]n; cada uno de los cuales está sustituido con de 0 a 6 R5;
R4 es alquilo, alquinilo o alquinilo;
R5 es halógeno, alquilo, OR6, N(R6)2, SR6, SOR6, SO2R6, CO2R6, R6, un resto fluorescente o un radioisótopo;
K es O, S, SO, SO2, CO, CO2, CONR6 ó R6 es H, alquilo o un agente terapéutico; n es un número entero de 1 a 4; x es un número entero de 2 a 10;
10 cada y es independientemente un número entero de 0 a 100; z es un número entero de 1 a 3; y cada Xaa es independientemente un aminoácido; donde el polipéptido tiene al menos un 5% de alfa-helicidad en disolución acuosa según se
determina por dicroísmo circular. 15 56. El polipéptido del párrafo 55, donde el polipéptido tiene al menos un 35% de alfa-helicidad en disolución acuosa según se determina por dicroísmo circular.
57. El polipéptido del párrafo 55, donde el polipéptido tiene al menos un 50% de alfa-helicidad en disolución acuosa según se determina por dicroísmo circular.
58. El polipéptido del párrafo 55, donde el polipéptido tiene al menos un 60% de alfa-helicidad en disolución 20 acuosa según se determina por dicroísmo circular.
59.
El polipéptido del párrafo 55, donde el polipéptido tiene al menos un 70% de alfa-helicidad en disolución acuosa según se determina por dicroísmo circular.
60.
El polipéptido del párrafo 55, donde el polipéptido tiene al menos un 80% de alfa-helicidad en disolución acuosa según se determina por dicroísmo circular.
25 61. El polipéptido del párrafo 55, donde el polipéptido tiene al menos un 90% de alfa-helicidad en disolución acuosa según se determina por dicroísmo circular.
62. Un polipéptido de fórmula (I), K es O, S, SO, SO2, CO, CO2, CONR6 ó
en la que;
30
cada R1 y R2 son independientemente H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilalquilo o heterociclilalquilo;
R3 es alquilo, alquenilo, alquinilo; [R4-K-R4]n; cada uno de los cuales está sustituido con de 0 a 6 R5;
R4 es alquilo, alquinilo o alquinilo;
35
32 R5 es halógeno, alquilo, OR6, N(R6)2, SR6, SOR6, SO2R6, CO2R6, R6, un resto fluorescente o un radioisótopo;
R6 es H, alquilo o un agente terapéutico;
n es un entero de1 a 4;
5
x es un número entero de 2 a 10;
cada y es independientemente un número entero de 0 a 100;
z es un número entero de 1 a 3; y
cada Xaa es independientemente un aminoácido;
donde el polipéptido tiene al
menos un aumento de 1,25 veces en alfa helicidad según se
10
determina por dicroísmo circular comparado con el polipéptido de fórmula (IV)
en la que R1, R2, Xaa, x, y, y z son todos según se definieron antes para la fórmula (I).
63. El polipéptido del párrafo 62, formula (I), donde el polipéptido tiene al menos un aumento de 1,5 veces en alfa helicidad según se determina por dicroísmo circular comparado con el polipéptido de fórmula (IV).
15 64. El polipéptido del párrafo 62, formula (I), donde el polipéptido tiene al menos un aumento de 1,75 veces en alfa helicidad según se determina por dicroísmo circular comparado con el polipéptido de fórmula (IV).
65. El polipéptido del párrafo 62, formula (I), donde el polipéptido tiene al menos un aumento de 2,0 veces en alfa helicidad según se determina por dicroísmo circular comparado con el polipéptido de fórmula (IV).
66.
El polipéptido del párrafo 65, formula (I), donde el polipéptido tiene al menos un aumento de 2,5 veces en 20 alfa helicidad según se determina por dicroísmo circular comparado con el polipéptido de fórmula (IV).
67. El polipéptido del párrafo 65 formula (I), donde el polipéptido tiene al menos un aumento de 3 veces en alfa helicidad según se determina por dicroísmo circular comparado con el polipéptido de fórmula (IV).
68.
El polipéptido del párrafo 65, formula (I), donde el polipéptido tiene al menos un aumento de 4 veces en alfa helicidad según se determina por dicroísmo circular comparado con el polipéptido de fórmula (IV). 25 69. Un método para identificar un compuesto candidato para inhibir la apoptosis, que comprende; proporcionar una mitocondria; poner en contacto la mitocondria con un compuesto del párrafo 1; medir la liberación de citocromo c; y comparar la liberación de citocromo c en presencia del compuesto del párrafo 1 con la liberación de
30 citocromo c en ausencia del compuesto del párrafo 1, de manera que una disminución en la liberación de citocromo c en presencia del compuesto del párrafo 1 identifica al compuesto del párrafo 1 como compuesto candidato para inhibir la apoptosis.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> DANA-FARBER CANCER INSTITUTE, INC. 5 <120> Péptidos alfa helicoidales estabilizados y utilizaciones de los mismos
<130> 116-038
<140> EP 04 811 198.3 10 <141>
<150> PCT/US2004/038403
<151>
15 <150> US 60/517,848
<151>
<150> US 60/591,548
<151>
20
<160> 117
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0 25 <210> 1
<211> 193
<212> PRT
<213> Homo sapiens 30 <400> 1
<210> 2
<211>
193 35 <212> PRT
<213> Mus munculus
<400> 2
<210> 3
<211>
20 5 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural 10
<400> 3
<210> 4 15 <211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220> 20 <223> Péptido natural
<210> 5
<211> 20
<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 5
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 6
15 <210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 7
<210> 8
<211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<210> 9
<211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
45 <400> 9
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<210> 11
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
15 <400> 11
<210> 12
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 12
<210> 13
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220> 35 <223> Péptido natural
<400> 13
<210> 14
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
45 <220>
<223> Péptido natural
<400> 14
<210> 15
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 15
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 17
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 19
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 26
<210> 27
<211> 351
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27 5 <210> 28
<211> 352
<212> PRT
<213> Mus musculus
10 <400> 28 5 <210> 29
<211> 329
<212> PRT
<213> Homo sapiens
10 <220>
<221> VARIANTE
<222> (1)...(329)
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
15 <400> 29 5 <210> 30
<211> 364
<212> PRT
<213> Homo sapiens
10 <400> 30
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
10
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
15
<400> 32
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 34
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
<210> 40
<211> 213
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<210> 41
<211> 211 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
<210> 42
<211> 192
<212> PRT
<213> Bos taurus
<210> 43
<211> 192
<212> PRT 15 <213> Rattus norvegicus
<400> 43
20 <210> 44
<211> 194
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 45
<211> 200 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
<210> 46
<211> 231
<212> PRT
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 46
5 10
<210> 47 <211> 270 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Secuencia de consenso
15
<221> VARIANTE <222> 77, 114, 123, 16B, 221 <223> Xaa = cualquier aminoácido
<400> 47
<210> 48
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 48
<210> 49
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 49
<210> 50
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 50
<210> 51
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 51
<210> 52
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 52
<210> 53
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 53
<210> 54
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 54
<210> 55
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 55
<210> 56
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 56
<210> 57
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 57
<210> 58
5 <211> 14 <212>. PRT
<213> Secuencia Artificial
<220> 10 <223> Péptido natural
<400> 58
15 <210> 59
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
20 <220>
<223> Péptido natural
<400> 59
25
<210> 60
<211> 184
<212> PRT
<213> Homo sapiens
30
<400> 60
35 <210> 61
<211> 185
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 61
<210> 62
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 62
<210> 63
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 63
<210> .64
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 64
<210> 65
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 65
<210> 66
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 66
<210> 67
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 67
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 68
<210> 69
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 69
<210> 70
<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 70
<210> 71
<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 71
15 <210> 72
<211> 24
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 72
<210> 73
<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<210> 74
<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
45 <400> 74
<210> 75
<211> 25
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 75
<210> 76
<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 76
<210> 77
<211> 23
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220> 25 <223> Péptido natural
<400> 77
<210> 78
<211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
35 <220>
<223> Péptido natural
<400> 78
<210> 79
<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 79
<210> 80
<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 80
<210> 81
<211> 22 15 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 81
<210> 82 25 <211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 82
35 <210> 83
<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 83
<210> 84
<211> 19
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 84
<210> 85
<211> 19
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 85
15 <210> 86
<211> 23
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 86
<210> 87
<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<210> 88
<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
45 <400> 88
<210> 89
<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<400> 89
<210> 90
<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
<210> 91
<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido natural
25 <400> 91
<210> 92
<211> 23
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223>
Péptido generado por un aminoácido no natural 35 <221> VARIANTE
<222> 13, 17
<223> Xaa = un aminoácido fijado
<221> VARIANTE
<222> 18
<223> Xaa = L-asparigina
<221> VARIANTE
<222> (L)...(23)
<223>
Xaa = Cualquier aminoácido 45
<400> 92
<210> 93
<211> 21
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
55 <223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE
<222> 12, 16
<223> Xaa = un aminoácido fijado
<221> VARIANTE
<222> 17
<223> Xaa = L-asparagina
<400> 93
<210> 94
<211> 23
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial 15
<220>
<223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE
<222> 13, 17
<223> Xaa = un aminoácido fijado
<221> VARIANTE
<222> 18
<223> Xaa = L-asparagina 25
<400> 94
<210> 95
<211> 21
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220> 35 <223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE
<222> 12, 16
<223> Xaa = un aminoácido fijado
<221> VARIANTE
<222> 17
<223> Xaa = L-asparagina
<210> 96
<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE 55 <222> 12, 16
<223> Xaa = un aminoácido fijado
<221> VARIANTE
<222> 17
<223> Xaa = L-asparagina
<400> 96
<210> 97
<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural 15 <221> VARIANTE
<222> 12, 16
<223> Xaa = un aminoácido fijado
<221> VARIANTE
<222> 17
<223> Xaa = L-asparagina
<400> 97
<210> 98
<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE
<222>.12, 16 35 <223> Xaa = un aminoácido fijado
<221> VARIANTE
<222> 17
<223> Xaa = L-asparagina
<400> 98
<210> 99 45 <211> 23
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE
<222> 8, 12
<223> Xaa = un aminoácido fijado
55 <221> VARIANTE
<222> 18
<223> Xaa = L-asparagina
<400> 99
<210> 100
<211> 21
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE
<222> 7, 11
<223> Xaa = un aminoácido fijado
<221> VARIANTE
<222> 17
<223> Xaa = L-asparagina
<400> 100
<210> 101
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE
<222> 4, 8
<223> Xaa = un aminoácido fijado
<400> 101
<210> 102
<211> 23
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE
<222> 8, 12
<223> Xaa = un aminoácido fijado
<221> VARIANTE
<222> 18
<223> Xaa = L-asparagina
<400> 102
<210> 103
<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
5 <220>
<223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE
<222> 7, 11
<223> Xaa = un aminoácido fijado
<221> VARIANTE
<222> 17
<223> Xaa = L-asparagina
15 <400> 103
<210> 104
<211> 21
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural 25 <221> VARIANTE
<222> 7, 11
<223> Xaa = un aminoácido fijado
<221> VARIANTE
<222> 17
<223> Xaa = L-asparagina
<400> 104
<210> 105
<211> 23
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE
<222> 9, 13 45 <223> Xaa = un aminoácido fijado
<221> VARIANTE
<222> 18
<223> Xaa = L-asparagina
<400> 105
<210> 106
<211>
23 55 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE
<222> 10, 17
<223> Xaa = un aminoácido fijado
<221> VARIANTE
<222> 18
<223> xaa = L-asparagina
<400> 106
<210> 107
<211>
23 15 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE
<222> 5, 9, 13, 17
<223> Xaa = un aminoácido fijado
<221> VARIANTE 25 <222> 18
<223> Xaa = L-asparagina
<400> 107
<210> 108
<211> 25 35 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE
<222> 14, 18
<223> Xaa = un aminoácido fijado
<221> VARIANTE 45 <222> 15
<223> Xaa = L-asparagina
<400> 108
<210> 109
<211> 21
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE
<222> 12, 16
<223> Xaa = un aminoácido fijado
<221> VARIANTE
<222> 17
<223> Xaa = L-asparagina
<400> 109
<210> 110
<211> 21
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial 15
<220>
<223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE
<222> 12, 16
<223> Xaa = un aminoácido fijado
<221> VARIANTE
<222> 17
<223> Xaa = L-asparagina 25
<400> 110
<210> 111
<211> 21
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220> 35 <223> Péptido generado por un aminoácido no natural
<221> VARIANTE
<222> 9, 13
<223> Xaa = un aminoácido fijado
<400> 111
<210> 112
<211>
23 45 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE
<222> 17
<223> Xaa = L-asparagina
<400> 112
<210> 113
<211>
23 5 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE
<222> 13, 17
<223> Xaa = enantiómero S del aminoácido olefínico en el carbono 5
<221> VARIANTE 15 <222> 18
<223> Xaa = L-asparagina
<400> 113
<210> 114
<211> 23
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial 25
<220>
<223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE
<222> 13, 17
<223> Xaa = Enantiómero S del aminoácido olefínico en el carbono 5
<221> VARIANTE
<222> 18
<223> Xaa = L-asparagina 35
<400> 114
<210> 115
<211> 23
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220> 45 <223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE
<222> 8, 12
<223> Xaa = Enantiómero S del aminoácido olefínico en el carbono 5
<221> VARIANTE
<222> 18
<223> Xaa = L-asparagina
<210> 116
<211> 23
<212> PRT 5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE 10 <222> 9, 13
<223> Xaa = Enantiómero S del aminoácido olefínico en el carbono 5
<221> VARIANTE
<222> 18 15 <223> Xaa = L-asparagina
<400> 116
20 <210> 117
<211> 23
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
25 <220>
<223> Péptido generado por la sustitución de un aminoácido no natural
<221> VARIANTE
<222> 10 30 <223> Xaa = enantiómero R del aminoácido olefínico en el carbono 5
<221> VARIANTE
<222> 17
<223> Xaa = enantiómero S del aminoácido olefínico en el carbono 8 35
<221> VARIANTE
<222> 18
<223> Xaa = L-asparagina
40 <400> 117

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un polipéptido α-helicoidal adecuado para activar o inhibir la muerte celular de fórmula (I):
    en la que:
    5 cada R1 y R2 son independientemente H, alquilo C1-C20, alquenilo C2-C20, alquinilo C2-C20, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilalquilo o heterociclilalquilo; R3 es un reticulante que es alquilo C1-C20, alquenilo C2-C20 ó alquinilo C2-C20; donde R3 está sustituido con
    de 0 a 6 R5; R5 es halógeno, alquilo, OR6, N(R6)2, SR6, SOR6, SO2R6, CO2R6, R6, un epóxido, un resto fluorescente o un
    10 radioisótopo; R6 es H, alquilo o un agente terapéutico; x es un número entero seleccionado de 2, 3 ó 6; cada y es independientemente un número entero de 0 a 100; z es un número entero de 1 a 10; y
    15 cada Xaa es independientemente un alfa-aminoácido; y en donde el polipéptido es transportado o es transportado activamente a través de la membrana celular, según se determina en un ensayo que comprende preparar un polipéptido marcado con fluorescencia, aplicar el polipéptido marcado con fluorescencia a una célula intacta y someter a ensayo la célula en cuanto a fluorescencia celular por microscopía o detección de fluorescencia celular de alto rendimiento.
    20 2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que R1 y R2 son H o alquilo C1-6.
  2. 3.
    El polipéptido de la reivindicación 1, en el que R3 es un alquilo, alquenilo o alquinilo de cadena lineal.
  3. 4.
    El polipéptido de la reivindicación 1, en el que R3 es alquilo.
  4. 5.
    El polipéptido de la reivindicación 1, en el que R3 es alquenilo.
  5. 6.
    El polipéptido de la reivindicación 1, en el que z es 1.
    25 7. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que R1 y R2 son cada uno metilo.
  6. 8.
    El polipéptido de la reivindicación 7, en el que x es 3 ó 6.
  7. 9.
    El polipéptido de la reivindicación 1, en el que R3 es alquilo C8 ó alquenilo C8 y x es 3.
  8. 10.
    El polipéptido de la reivindicación 1, en el que R3 es alquilo C11 o alquenilo C11 y x es 6.
  9. 11. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que R3 es -CH2-CH2-CH2-CH=CH-CH2-CH2-CH2-. 30 12. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido se une a un polipéptido de la familia BCL-2.
  10. 13.
    El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido comprende un dominio de homología BCL-2 o un dominio BH3.
  11. 14.
    El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido se une a un dominio BH1, BH2 o BH3.
  12. 15.
    El polipéptido de la reivindicación 4 o de la reivindicación 5, en el que R3 es alquilo C8 o alquilo C11.
  13. 16.
    Una composición farmacéutica que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, y un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.
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