CN102014913A - C-met和egfr拮抗剂的联合疗法 - Google Patents
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Abstract
本发明一般涉及分子生物学和生长因子调控的领域。更具体地,本发明涉及用于病理状况(诸如癌症)治疗的,包含c-met拮抗剂和EGFR拮抗剂的联合疗法。
Description
对相关申请的交叉引用
本申请依据35 USC§119(e)要求2008年3月6日提交的美国临时申请号61/034,446和2008年4月11日提交的美国临时申请号61/044,438的优先权,通过述及将其内容收入本文。
发明领域
本发明一般涉及分子生物学和生长因子调控的领域。更具体地,本发明涉及用于病理状况(诸如癌症)治疗的联合疗法。
发明背景
HGF是一种对多种不同细胞类型具有促有丝***,促运动和形态发生活性的间充质衍生多效因子。HGF效应是经由一种特异性酪氨酸激酶,c-met介导的,而且在多种肿瘤中频繁观察到异常HGF和c-met表达。参见例如Maulik et al.,Cytokine & Growth Factor Reviews(2002),13:41-59;Danilkovitch-Miagkova & Zbar,J.Clin.Invest.(2002),109(7):863-867。肿瘤进展和转移涉及对HGF/c-Met信号传导途径的调控。参见例如Trusolino &Comoglio,Nature Rev.(2002),2:289-300)。
HGF结合c-met受体酪氨酸激酶(RTK)的细胞外结构域并调控多种生物学过程,诸如细胞播散,增殖和存活。HGF-Met信号传导对于正常胚胎发育(尤其在肌肉祖细胞的迁移中)及肝和神经***的发育是至关重要的(Bladt et al.,Nature(1995),376,768-771.;Hamanoue et al.,Faseb J(2000),14,399-406;Maina et al.,Cell(1996),87,531-542;Schmidt et al.,Nature(1995),373,699-702;Uehara et al.,Nature(1995),373,702-705)。Met和HGF敲除小鼠的发育表型非常相似,提示HGF是Met受体的关联配体(Schmidt et al.,1995,supra;Uehara et al.,1995,supra)。HGF-Met还在肝再生、血管发生和伤口愈合中发挥作用(Bussolino et al.,J Cell Biol(1992),119,629-641;Matsumoto and Nakamura,Exs(1993),65,225-249;Nusrat et al.,J Clin Invest(1994)93,2056-2065)。前体Met受体经历蛋白水解切割,变成通过二硫键相连接的细胞外α亚基和跨膜β亚基(Tempest et al.,Br J Cancer(1988),58,3-7)。β亚基含有细胞质激酶结构域且在C端包含多底物停泊位点,衔接蛋白质在那里结合并启动信号传导(Bardelli et al.,Oncogene(1997),15,3103-3111;Nguyen et al.,J Biol Chem(1997),272,20811-20819;Pelicci et al.,Oncogene(1995),10,1631-1638;Ponzetto et al.,Cell(1994),77,261-271;Weidner et al.,Nature(1996),384,173-176)。在HGF结合后,Met的活化分别经由Gab1和Grb2/Sos介导的PI3激酶和Ras/MAPK活化而导致酪氨酸磷酸化和下游信号传导,这驱动细胞运动和增殖(Furge et al.,Oncogene(2000),19,5582-5589;Hartmann et al.,J Biol Chem(1994),269,21936-21939;Ponzetto et al.,J Biol Chem(1996),271,14119-14123;Royal and Park,J Biol Chem(1995),270,27780-27787)。
显示了Met在用致癌原处理的骨肉瘤细胞系中转化(Cooper et al.,Nature(1984),311,29-33;Park et al.,Cell(1986),45,895-904)。已经在多种人癌症中观察到Met过表达或基因扩增。例如,Met蛋白质在结肠直肠癌中过表达至少5倍,而且有报告说在肝转移中基因扩增(Di Renzo et al.,Clin Cancer Res(1995),1,147-154;Liu et al.,Oncogene(1992),7,181-185)。还有报告说Met蛋白质在口腔鳞状细胞癌,肝细胞癌,肾细胞癌,乳腺癌和肺癌中过表达(Jin et al.,Cancer(1997),79,749-760;Morello et al.,J Cell Physiol(2001),189,285-290;Natali et al.,Int J Cancer(1996),69,212-217;Olivero et al.,Br J Cancer(1996),74,1862-1868;Suzuki et al.,Br J Cancer(1996),74,1862-1868)。另外,已经在肝细胞癌,胃癌和结肠直肠癌中观察到mRNA的过表达(Boix et al.,Hepatology(1994),19,88-91;Kuniyasu et al.,Int J Cancer(1993),55,72-75;Liu et al.,Oncogene(1992),7,181-185)。
已经在肾***状癌中找到Met的激酶结构域中导致组成性受体活化的多种突变(Olivero et al.,Int J Cancer(1999),82,640-643;Schmidt et al.,Nat Genet(1997),16,68-73;Schmidt et al.,Oncogene(1999),18,2343-2350)。这些活化性突变赋予组成性Met酪氨酸磷酸化并导致MAPK活化,病灶形成和肿瘤发生(Jeffers et al.,Proc Natl Acad Sci U S A(1997),94,11445-11450)。另外,这些突变增强细胞运动和侵入(Giordano et al.,Faseb J(2000),14,399-406;Lorenzato et al.,Cancer Res(2002),62,7025-7030)。转化细胞中的HGF依赖性Met活化介导升高的运动,播散和迁移,这最终导致侵入性肿瘤生长和转移(Jeffers et al.,Mol Cell Biol(1996),16,1115-1125;Meiners et al.,Oncogene(1998),16,9-20)。
已经显示了Met与其它驱动受体活化,转化和侵入的蛋白质相互作用。在赘生性细胞中,有报告说Met与α6β4整联蛋白(细胞外基质(ECM)成分诸如层粘连蛋白的一种受体)相互作用,以促进HGF依赖性侵入性生长(Trusolino et al.,Cell(2001),107,643-654)。另外,已经显示了Met的细胞外结构域与脑信号蛋白家族的一个成员,丛蛋白B1相互作用,以增强侵入性生长(Giordano et al.,Nat Cell Biol(2002),4,720-724)。另外,还有报告说已知涉及肿瘤发生和转移的CD44v6与Met和HGF形成复合物并导致Met受体活化(Orian-Rousseau et al.,Genes Dev(2002),16,3074-3086)。
Met是包括Ron和Sea的受体酪氨酸激酶(RTK)亚家族的一个成员(Maulik et al.,Cytokine Growth Factor Rev(2002),13,41-59)。Met的细胞外结构域结构的预测提示与脑信号蛋白和丛蛋白的共享同源性。Met的N端含有大约500个氨基酸的Sema结构域,它在所有脑信号蛋白和丛蛋白中是保守的。脑信号蛋白和丛蛋白属于分泌和膜结合蛋白质的一个大家族,最初记载了它们在神经发育中的作用(Van Vactor and Lorenz,Curr Bio(1999),19,R201-204)。然而,最近已经将脑信号蛋白过表达与肿瘤侵入和转移关联起来。在丛蛋白,脑信号蛋白和整联蛋白中找到的一种富含半胱氨酸的PSI结构域(也称作Met相关序列结构域)邻近Sema结构域,接着是四个IPT重复,它们是在丛蛋白和转录因子中找到的免疫球蛋白样区。一项最近的研究提示Met Sema结构域足以实现HGF和肝素结合(Gherardi et al.,Proc Natl Acad Sci U S A(2003),100(21):12039-44)。
如上所述,Met受体酪氨酸激酶受其关联配体HGF活化,而且受体磷酸化活化下游MAPK,PI-3激酶和PLC-γ途径(L.Trusolino and P.M.Comoglio,Nat Rev Cancer 2,289(2002);C.Birchmeier et al.,Nat Rev Mol Cell Biol 4,915(2003))。激酶结构域内Y1234/Y1235的磷酸化对于Met激酶活化是至关重要的,而多底物停泊位点中的Y1349和Y1356对于src同源性-2(SH2),磷酸酪氨酸结合(PTB)和Met结合结构域(MBD)蛋白质的结合是重要的(C.Ponzetto et al.,Cell 77,261(1994);K.M.Weidner et al.,Nature 384,173(1996);G.Pelicci et al.,Oncogene 10,1631(1995)),以介导下游信号传导途径的激活。另一个近膜磷酸化位点,Y1003,已经详细表征了它对Cbl E3连接酶的酪氨酸激酶结合(TKB)结构域的结合(P.Peschard et al.,Mol Cell 8,995(2001);P.Peschard,N.Ishiyama,T.Lin,S.Lipkowitz,M.Park,J Biol Chem 279,29565(2004))。有报告说Cbl结合驱动吞蛋白介导的受体胞吞,遍在蛋白化和后续受体降解(A.Petrelli et al.,Nature 416,187(2002))。先前已经在还包含相似Cbl结合位点的EGFR家族中描述了这种受体下调机制(K.Shtiegman,Y.Yarden,Semin Cancer Biol 13,29(2003);M.D.Marmor,Y.Yarden,Oncogene 23,2057(2004);P.Peschard,M.Park,Cancer Cell 3,519(2003))。已经在多种肿瘤中报告了Met和HGF的失调。已经在数种癌症中观察到配体驱动的Met活化。在肺,乳腺癌和多发性骨髓瘤中观察到升高的血清和肿瘤内HGF(J.M.Siegfried etal.,Ann Thorac Surg 66,1915(1998);P.C.Ma et al.,Anticancer Res 23,49(2003);B.E.Elliott et al.Can J Physiol Pharmacol 80,91(2002);C.Seidel,et al,Med Oncol 15,145(1998))。已经在多种癌症中报告了Met和/或HGF的过表达,Met扩增或突变,诸如结肠直肠癌,肺癌,胃癌和肾癌,而且认为驱动不依赖配体的受体活化(C.Birchmeier et al,Nat Rev Mol Cell Biol 4,915(2003);G.Maulik et al.,Cytokine Growth Factor Rev 13,41(2002))。另外,肝小鼠模型中可诱导的Met过表达引起肝细胞癌,证明受体过表达驱动不依赖配体的肿瘤发生(R.Wang,et al,J Cell Biol 153,1023(2001))。在家族性和散发性肾***状癌(RPC)患者中报告了将Met与癌症联系起来的最有力证据。Met的激酶结构域中导致受体组成性活化的突变被鉴定为RPC中的种系和体细胞突变(L.Schmidt et al.,Nat Genet 16,68(1997))。在转基因小鼠模型中引入这些突变导致肿瘤发生和转移(M.Jeffers et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 94,11445(1997))。
涉及c-met和c-met拮抗剂的出版物包括Martens,T,et al(2006)Clin Cancer Res 12(20 Pt 1):6144;US 6,468,529;WO2006/015371;WO2007/063816;WO2006/104912;WO2006/104911;WO2006/113767;US2006-0270594;US2006-美国专利No.7,481,993;WO2009/007427;WO2005/016382;WO2009/002521;WO2007/143098;WO2007/115049;WO2007/126799。
表皮生长因子受体(EGFR)家族包含四种密切相关的受体(HER1/EGFR,HER2,HER3和HER4),其涉及细胞应答,诸如分化和增殖。EGFR激酶或其配体TGF-α的过表达常常与多种癌症有关,包括乳腺癌,肺癌,结肠直肠癌,卵巢癌,肾细胞癌,膀胱癌,头颈癌,成胶质细胞瘤和星形细胞瘤,而且认为有助于这些肿瘤的恶性生长。已经发现EGFR基因(EGFRvIII)中的一种特定删除突变提高细胞致肿瘤性。EGFR刺激的信号传导途径的活化促进多种潜在促进癌症的过程,例如增殖,血管发生,细胞运动和侵入,降低的凋亡和药物抗性的诱导。升高的HER1/EGFR表达常常与晚期疾病,转移和差的预后有联系。例如,在NSCLC和胃癌中,已经显示了升高的HER1/EGFR表达与高的转移率,差的肿瘤分化和升高的肿瘤增殖相关。
已经在NSCLC和成胶质细胞瘤观察到活化受体的内在蛋白质酪氨酸激酶活性和/或提高下游信号传导的突变。然而,突变在赋予对EGFR受体抑制剂(例如Erlotinib或Gefitinib)的敏感性中作为首要机制的作用仍然有争议。已经有报告预测全长EGF受体的突变体形式对EGF受体酪氨酸激酶抑制剂Gefitinib的响应性(Paez,J.G.et al.(2004)Science304:1497-1500;Lynch,T.J.et al.(2004)N.Engl.J.Med.350:2129-2139)。细胞培养研究显示了表达此类EGF受体突变体形式的细胞系(即H3255)对EGF受体酪氨酸激酶抑制剂Gefitinib的生长抑制作用更敏感,而且抑制表达野生型EGF受体的肿瘤细胞系需要浓度高得多的Gefitinib。这些观察结果提示EGF受体的特定突变体形式可能反映对EGF受体抑制剂的更大敏感性,但是不鉴定完全无响应的表型。
直接抑制EGFR的激酶活性的化合物,以及通过阻断EGFR活化来降低EGFR激酶活性的抗体作为抗肿瘤药的使用的开发是研究努力密集的领域(de Bono J.S.and Rowinsky,E.K.(2002)Trends in Mol.Medicine 8:S19-S26;Dancey,J.and Sausville,E.A.(2003)Nature Rev.Drug Discovery 2:92-313)。数项研究已经证明了,披露了,或提示了一些EGFR激酶抑制剂在与某些其它抗癌或化疗药剂或治疗联合使用时可能改善对肿瘤细胞或瘤的杀伤(例如Herbst,R.S.et al.(2001)Expert Opin.Biol.Ther.1:719-732;Solomon,B.et al(2003)Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.55:713-723;Krishnan,S.et al.(2003)Frontiers in Bioscience 8,e1-13;Grunwald,V.and Hidalgo,M.(2003)J.Nat.Cancer Inst.95:851-867;Seymour L.(2003)Current Opin.Investig.Drugs4(6):658-666;Khalil,M.Y.et al.(2003)Expert Rev.Anticancer Ther.3:367-380;Bulgaru,A.M.et al.(2003)Expert Rev.Anticancer Ther.3:269-279;Dancey,J.and Sausville,E.A.(2003)Nature Rev.Drug Discovery 2:92-313;Ciardiello,F.et al.(2000)Clin.Cancer Res.6:2053-2063;及专利公开文本No:US2003/0157104)。
Erlotinib(例如Erlotinib HCl,也称作或OSI-774)是EGFR激酶的一种可得口服抑制剂。在体外,已经在多种人肿瘤细胞系(包括结肠直肠和乳腺癌)中证明了Erlotinib针对EGFR激酶的实质性抑制活性(Moyer J.D.et al.(1997)Cancer Res.57:4838),而且临床前评估已经证明针对多种表达EGFR的人肿瘤异种移植物的活性(Pollack,V.A.et al(1999)J.Pharmacol.Exp.Ther.291:739)。已经在临床试验中证明了Erlotinib在多种适应证中的活性,包括头颈癌(Soulieres,D.,et al.(2004)J.Clin.Oncol.22:77),NSCLC(Perez-Soler R,et al.(2001)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.20:310a,abstract1235),CRC(Oza,M.,et al.(2003)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.22:196a,abstract785)和MBC(Winer,E.,et al.(2002)Breast Cancer Res.Treat.76:5115a,abstract445;Jones,R.J.,et al.(2003)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.22:45a,abstract 180)。在一项III期试验中,Erlotinib单一疗法在具有晚期治疗不应性NSCLC的患者中显著延长存活,延迟疾病进展和延长肺癌相关症状恶化(Shepherd,F.et al.(2004)J.Clin.Oncology,22:14S(July 15 Supplement),Abstract 7022)。在2004年11月,美国食品和药品管理局(FDA)批准了用于在至少一种在先化疗方案失败后治疗具有局部晚期或转移性非小细胞肺癌(NSCLC)的患者。
尽管癌症治疗获得了重大进展,但是仍然在寻找改良的疗法。
通过述及完整收录本文中所引用的所有参考文献,包括专利申请和出版物。
发明概述
本发明提供用于治疗病理状况(诸如癌症)的联合疗法,其中组合c-met拮抗剂与EGFR拮抗剂,由此提供显著的抗肿瘤活性。
一方面,本发明提供治疗受试者中的癌症的方法,包括对受试者施用治疗有效量的c-met拮抗剂和EGFR拮抗剂。
c-met拮抗剂的例子包括但不限于可溶性c-met受体,可溶性HGF变体,对c-met或HGF特异性的适体(apatmers)或肽体(peptibodies),c-met小分子,抗c-met抗体和抗HGF抗体。在一些实施方案中,c-met拮抗剂是抗c-met抗体。
在一个实施方案中,抗c-met抗体包含重链可变域,其包含图7中所绘CDR1-HC,CDR2-HC和CDR3-HC序列(SEQ ID NO:13-15)中的一项或多项。在一些实施方案中,所述抗体包含轻链可变域,其包含图7中所绘CDR1-LC,CDR2-LC和CDR3-LC序列(SEQ ID NO:5-7)中的一项或多项。在一些实施方案中,重链可变域包含图7中所绘FR1-HC,FR2-HC,FR3-HC和FR4-HC序列(SEQ ID NO:9-12)。在一些实施方案中,轻链可变域包含图7中所绘FR1-LC,FR2-LC,FR3-LC和FR4-LC序列(SEQ ID NO:1-4)。在一些实施方案中,抗c-met抗体是单价的且包含Fc区。在一些实施方案中,所述抗体包含图7中所绘Fc序列(SEQ ID NO:17)。
在一些实施方案中,所述抗体是单价的且包含Fc区,其中所述Fc区包含第一和第二多肽,其中所述第一多肽包含图7中所绘Fc序列(SEQ ID NO:17)且所述第二多肽包含图8中所绘Fc序列(SEQ ID NO:18)。
在一个实施方案中,抗c-met抗体包含(a)第一多肽,其包含具有下述序列的重链可变域:QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIGMIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:19),图7中所绘CH1序列(SEQID NO:16)和图7中所绘Fc序列(SEQ ID NO:17);和(b)第二多肽,其包含具有下述序列的轻链可变域:DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:20)和图7中所绘CL1序列(SEQ ID NO:8);和(c)第三多肽,其包含图8中所绘Fc序列(SEQ ID NO:18)。
一方面,抗c-met抗体包含至少一项促进抗体片段内的Fc序列异二聚化,同时将同二聚化降至最低的特征。此类特征改善免疫球蛋白群的收率和/或纯度和/或同质性。在一个实施方案中,所述抗体包含构成“结”(knobs)和“穴”(holes)的Fc突变,如WO2005/063816中所记载的。例如,穴突变(hole mutation)可以是Fc多肽中的T366A,L368A和/或Y407V中的一项或多项,而腔突变(cavity mutation)可以是T366W。
在一些实施方案中,c-met拮抗剂是SGX-523,PF-02341066,JNJ-38877605,BMS-698769,PHA-665,752,SU5416,SU 1274,XL-880,MGCD265,ARQ 197,MP-470,AMG 102,抗体223C4或人源化抗体223C4(WO2009/007427),L2G7,NK4,XL-184,MP-470,或Comp-1。
c-met拮抗剂可用于降低或抑制HGF/c-met相关效应的一个或多个方面,包括但不限于c-met活化,下游分子信号传导(例如促***原活化的蛋白质激酶(MAPK)磷酸化,AKT磷酸化,c-met磷酸化,PI3激酶介导的信号传导),细胞增殖,细胞迁移,细胞存活,细胞形态发生和血管发生。这些效应可以通过任何生物学有关机制来调控,包括破坏配体(例如HGF)对c-met的结合,c-met磷酸化和/或c-met多聚化。
EGFR拮抗剂的例子包括结合EGFR的抗体和小分子。EGFR拮抗剂还包括小分子,诸如US5616582,US5457105,US5475001,US5654307,US5679683,US6084095,US6265410,US6455534,US6521620,US6596726,US6713484,US5770599,US6140332,US5866572,US6399602,US6344459,US6602863,US6391874,WO9814451,WO9850038,WO9909016,WO9924037,WO9935146,WO0132651,US6344455,US5760041,US6002008,US5747498中记载的化合物。具体的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774,Erlotinib,OSI Pharmaceuticals);PD 183805(CI 1033,2-丙烯酰胺,N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-,二氢氯化物,Pfizer Inc.);(ZD 1839,Gefitinib,AstraZeneca);ZM 105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉,Zeneca);BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺,Boehringer Ingelheim);PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯基乙基)氨基]-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚);(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶);CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉yl]-2-丁炔酰胺);EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺);lapatinib(Tykerb,GlaxoSmithKline);ZD6474(Zactima,AstraZeneca);CUDC-101(Curis);canertinib(CI-1033);AEE788(6-[4-[(4-乙基-1-哌嗪基)甲基]苯基]-N-[(1R)-1-苯基乙基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺,WO2003013541,Novartis)和PKI166(4-[4-[[(1R)-1-苯基乙基]氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚,WO9702266 Novartis)。
在一个具体的实施方案中,EGFR拮抗剂具有依照US 5,757,498(通过述及收入本文)的通式I:
其中:
m为1,2,或3;
每个R1独立地选自下组:氢,卤素,羟基,羟基氨基,羧基,硝基,胍基,脲基,氰基,三氟甲基和-(C1-C4亚烷基亚烷基)-W-(苯基),其中W为单键,O,S或NH;
或者每个R1独立地选自R9和C1-C4烷基,其是被氰基取代的,其中R9选自下组:R5,-OR6,-NR6R6,-C(O)R7,-NHOR5,-OC(O)R6,氰基,A和-YR5;R5为C1-C4烷基;R6独立地为氢或R5;R7为R5,-OR6或-NR6R6;A选自哌啶子基,吗啉代,吡咯烷子基,4-R6-哌嗪-1-基,咪唑-1-基,4-吡啶酮-1-基,-(C1-C4亚烷基亚烷基)(CO2H),苯氧基,苯基,苯基硫基,C2-C4烯基和-(C1-C4亚烷基亚烷基)C(O)NR6R6;且Y为S,SO,或SO2;其中R5,-OR6和-NR6R6中的烷基部分任选是被1-3个卤素取代基取代的且R5,-OR6和-NR6R6中的烷基部分任选是被1或2个R9基团取代的,且其中所述任选取代基的烷基部分任选是被卤素或R9取代的,前提是没有两个杂原子连接于同一碳原子;
或者每个R1独立地选自-NHSO2R5,邻苯二甲酰亚氨基-(C1-C4)-烷基磺酰基氨基,苯甲酰氨基,苯磺酰基氨基,3-苯基脲基,2-氧代吡咯烷-1-基,2,5-二氧代吡咯烷-1-基和R10-(C2-C4)-烷酰基氨基,其中R10选自卤素,-OR6,C2-C4烷酰基氧,-C(O)R7和-NR6R6;且其中所述-NHSO2R5,邻苯二甲酰亚氨基-(C1-C4-烷基磺酰基氨基,苯甲酰氨基,苯磺酰基氨基,3-苯基脲基,2-氧代吡咯烷-1-基,2,5-二氧代吡咯烷-1-基和R10-(C2-C4)-烷酰基氨基R1基团任选是被1或2个独立地选自卤素,C1-C4烷基,氰基,甲磺酰基和C1-C4烷氧基的取代基取代的;
或者两个R1基团与它们所连接的碳一起形成5-8元环,其包括1或2个选自O,S和N的杂原子;
R2为氢或C1-C6烷基,其任选是被1-3个独立地选自卤素,C1-C4烷氧基,-NR6R6和-SO2R5的取代基取代的;
n为1或2且每个R3独立地选自氢,卤素,羟基,C1-C6烷基,-NR6R6和C1-C4烷氧基,其中所述R3基团的烷基部分任选是被1-3个独立地选自卤素,C1-C4烷氧基,-NR6R6和-SO2R的取代基取代的;且
R4为叠氮基或-(乙炔基)-R11,其中R11为氢或C1-C6烷基,其任选是被羟基,-OR6,或-NR6R6取代的。
在一个具体的实施方案中,EGFR拮抗剂是选自下组的依照式I的化合物:
(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-[3-(3′-羟基丙炔-1-基)苯基]-胺;[3-(2′-(氨基甲基)-乙炔基)苯基]-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺;(3-乙炔基苯基)-(6-硝基喹唑啉-4-基)-胺;(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(4-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-2-甲基苯基)-胺;(6-氨基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(3-乙炔基苯基)-(6-甲磺酰基氨基喹唑啉-4-基)-胺;(3-乙炔基苯基)-(6,7-亚甲二氧基喹唑啉-4-基)-胺;(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-6-甲基苯基)-胺;(3-乙炔基苯基)-(7-硝基喹唑啉-4-基)-胺;(3-乙炔基苯基)-[6-(4′-甲苯磺酰基氨基)喹唑啉-4-基]-胺;(3-乙炔基苯基)-{6-[2′-苯二酰亚氨基-乙-1′-基-磺酰基氨基]喹唑啉-4-基}-胺;(3-乙炔基苯基)-(6-胍基喹唑啉-4-基)-胺;(7-氨基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(3-乙炔基苯基)-(7-甲氧基喹唑啉-4-基)-胺;(6-甲氧羰基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(7-甲氧羰基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;[6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基)-胺;(3-叠氮基苯基)-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺;(3-叠氮基-5-氯苯基)-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺;(4-叠氮基苯基)-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺;(3-乙炔基苯基)-(6-甲磺酰基-喹唑啉-4-基)-胺;(6-乙硫基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-4-氟-苯基)-胺;(6,7-二甲氧基-喹唑啉-4-基)-[3-(丙炔-1′-基)-苯基]-胺;[6,7-双-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(5-乙炔基-2-甲基-苯基)-胺;[6,7-双-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-4-氟-苯基)-胺;[6,7-双-(2-氯-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺;[6-(2-氯-乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺;[6,7-双-(2-乙酰氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺;2-[4-(3-乙炔基-苯基氨基)-7-(2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-6-基氧基]-乙醇;[6-(2-乙酰氧基-乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺;[7-(2-氯-乙氧基)-6-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺;[7-(2-乙酰氧基-乙氧基)-6-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺;2-[4-(3-乙炔基-苯基氨基)-6-(2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基]-乙醇;2-[4-(3-乙炔基-苯基氨基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-6-基氧基]-乙醇;2-[4-(3-乙炔基-苯基氨基)-6-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基]-乙醇;[6-(2-乙酰氧基-乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺;(3-乙炔基-苯基)-{6-(2-甲氧基-乙氧基)-7-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙氧基]-喹唑啉-4-基}-胺;(3-乙炔基-苯基)-[7-(2-甲氧基-乙氧基)-6-(2-吗啉-4-基)-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-胺;(6,7-二乙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二丁氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二异丙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二乙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基-2-甲基-苯基)-胺;[6,7-双-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基-2-甲基-苯基)-胺;(3-乙炔基苯基)-[6-(2-羟基-乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-胺;[6,7-双-(2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基苯基)-胺;2-[4-(3-乙炔基-苯基氨基)-6-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基]-乙醇;(6,7-二丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-苯基)-胺;(6,7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-5-氟-苯基)-胺;(6,7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-4-氟-苯基)-胺;(6,7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(5-乙炔基-2-甲基-苯基)-胺;(6,7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-4-甲基-苯基)-胺;(6-氨基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-苯基)-胺;(6-氨基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基乙基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基甲基-7-乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基乙基-7-乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基甲基-7-异丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基甲基-7-丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基乙基-7-异丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;和(6-氨基羰基乙基-7-丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二乙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(3-乙炔基苯基)-[6-(2-羟基-乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-胺;[6,7-双-(2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基苯基)-胺;[6,7-双-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二甲氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(3-乙炔基苯基)-(6-甲磺酰基氨基-喹唑啉-1-基)-胺;和(6-氨基-喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺。
在一个具体的实施方案中,式I的EGFR拮抗剂为N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺。在一个具体的实施方案中,EGFR拮抗剂N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺为HCl盐形式。在另一个具体的实施方案中,EGFR拮抗剂N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺为基本上同质的结晶多型形式(在WO 01/34,574中描述为多型B),其展现特征性峰的X射线粉末衍射花样,该特征性峰具有以度表示大约6.26、12.48、13.39、16.96、20.20、21.10、22.98、24.46、25.14和26.91的2-theta。N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺的此类多型形式称作TarcevaTM以及OSI-774,CP-358774和Erlotinib。
EGFR拮抗剂可用于降低或抑制EGFR-EGFR配体相关效应的一个或多个方面,包括但不限于EGFR活化,下游分子信号传导,细胞增殖。这些效应可以通过任何生物学有关机制来调控,包括破坏配体对EGFR的结合和破坏EGFR磷酸化。
本发明的方法可用于改变任何合适的病理状态。例如,本发明的方法可用于治疗不同癌症,实体瘤以及软组织瘤。本发明的治疗可改善的癌症的非限制性例子包括乳腺癌,结肠直肠癌,直肠癌,非小细胞肺癌(NSCLC),非何杰金氏淋巴瘤(NHL),肾细胞癌,***癌,肝癌,胰腺癌,软组织肉瘤,卡波西氏肉瘤,类癌,头颈癌,成胶质细胞瘤,黑素瘤,卵巢癌,胃癌,间皮瘤和多发性骨髓瘤。在模型方面,所述癌症是转移性的。在其它方面,所述癌症是非转移性的。
在一个实施方案中,在癌症(诸如非小细胞肺癌)的联合疗法中使用抗c-met抗体和Erlotinib。
在某些实施方案中,所述癌症不是EGFR拮抗剂(例如Erlotinib或Gefitinib)抗性癌症。在某些实施方案中,所述癌症不是Erlotinib或Gefitinib抗性癌症。
在某些实施方案中,所述癌症不是酪氨酸激酶抑制剂抗性癌症。在某些实施方案中,所述癌症不是小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性癌症。
在某些实施方案中,所述癌症展示c-met和/或EGFR表达,扩增,或活化。在某些实施方案中,所述癌症不展示c-met和/或EGFR表达,扩增,或活化。在某些实施方案中,所述癌症展示c-met扩增。在某些实施方案中,所述癌症展示c-met扩增和EGFR扩增。
在某些实施方案中,所述癌症展示野生型EGFR基因。在某些实施方案中,所述癌症展示野生型EGFR基因和c-met扩增和/或c-met突变。
在某些实施方案中,所述癌症展示EGFR突变。突变可位于EGFR基因的任何部分或与EGFR基因有关的调节区中。例示性的EGFR突变包括例如外显子18,19,20或21中的突变,激酶结构域中的突变,G719A,L858R,E746K,L747S,E749Q,A750P,A755V,V765M,S768I,L858P,E746-R748删除,R748-P753删除,M766-A767 AI***,S768-V769 SVA***,P772-H773 NS***,2402OC,2482OA,2486T>C,2491G>C,2494OC,2510OT,2539OA,2549OT,2563OT,2819T>C,2482-2490删除,2486-2503删除,2544-2545***GCCATA,2554-2555***CCAGCGTGG,或2562-2563***AACTCC。本领域知道EGFR活化性突变的其它例子(参见例如美国专利公开文本No.2005/0272083)。在某些实施方案中,细胞或细胞系不包含EGFR基因中的T790M突变。
在某些实施方案中,所述癌症展示c-met和/或EGFR活化。在某些实施方案中,所述癌症不展示c-met和/或EGFR活化。
在某些实施方案中,所述癌症展示组成性c-met和/或EGFR活化。在一些实施方案中,所述组成性EGFR包含酪氨酸激酶结构域中的突变。在某些实施方案中,所述癌症不展示组成性c-met和/或EGFR活化。
在某些实施方案中,所述癌症展示不依赖配体的c-met和/或EGFR活化。在某些实施方案中,所述癌症不展示不依赖配体的c-met和/或EGFR活化。
c-met拮抗剂可以与EGFR拮抗剂连续或联合施用,或是在同一组合物中或是作为分开的组合物。可以同时进行c-met拮抗剂和EGFR拮抗剂的施用,例如作为单一组合物或者作为两种或更多种不同组合物,使用相同或不同施用路径。或者/另外,可以以任何次序序贯进行施用。或者/另外,可以作为序贯和同时二者任何次序的组合来实施各步骤。在某些实施方案中,两个或更多个组合物的施用之间可以存在范围为数分钟至数天,至数周至数月的间隔。例如,可以先施用EGFR拮抗剂,接着是c-met拮抗剂。然而,还涵盖同时施用或者先施用c-met拮抗剂。因而,一方面,本发明提供方法,包括施用c-met拮抗剂(诸如抗c-met抗体),接着施用EGFR拮抗剂(诸如Erlotinib)。在某些实施方案中,两个或更多个组合物的施用之间可以存在范围为数分钟至数天,至数周至数月的间隔。
一方面,本发明提供供治疗癌症中使用的组合物,其包含有效量的c-met拮抗剂和药学可接受载体,其中所述使用包括同时或序贯施用EGFR拮抗剂。在一些实施方案中,所述c-met拮抗剂是抗c-met抗体。在一些实施方案中,所述EGFR拮抗剂是Erlotinib
一方面,本发明提供供治疗癌症中使用的组合物,其包含有效量的c-met拮抗剂和药学可接受载体,其中所述使用包括同时或序贯施用EGFR拮抗剂。在一些实施方案中,所述c-met拮抗剂是抗c-met抗体。在一些实施方案中,所述EGFR拮抗剂是Erlotinib
根据要治疗的具体癌症适应证,本发明的联合疗法可以与别的治疗剂诸如化疗剂或者别的疗法诸如放疗或手术联合。许多已知的化疗剂可以在本发明的联合疗法中使用。优选地,会使用作为具体适应证标准治疗的那些化疗剂。联合中要使用的每种治疗剂的剂量或频率优选与相应药剂在没有其它药剂的情况中使用时的剂量或频率相同,或更少。
附图简述
图1A和1B:通过qRT-PCR证实NSCLC细胞系和原发性肿瘤中的EGFR和MET mRNA共表达。通过定量RT-PCR测定一组NSCLC细胞系(1A)或冷冻的原发性NSCLC肿瘤溶胞物(1B)中的EGFR和MET mRNA的表达。在细胞系(ρ=0.59,p<0.0001)和原发性NSCLC标本(ρ=0.48,p=0.0003)中EGFR和MET mRNA水平正相关。
图2:在对照培养基(Con)或含0.1ug/ml四环素类似物多西环素(Dox)的培养基中培养含有针对c-met的四环素诱导型shRNA或针对GFP的对照shRNA(shGFP2)的EBCl shMet 4.12细胞(shMet 4.12)48小时。血清饥饿2小时后,细胞不处理(-)或者用TGFα(T,20nM)或调蛋白b1(Hrg,2nM)处理20分钟。如所示地对全细胞溶胞物评估总的和磷酸-蛋白质的表达。检测β-肌动蛋白以显示各道之间的当量加载。
图3:在对照培养基或含有0.1ug/ml Dox的培养基(Dox)中培养含有针对c-met的诱导型shRNA或针对GFP的对照shRNA的NSCLC H441细胞48小时。血清饥饿2小时后,细胞不处理(-)或者用TGFα(T)或调蛋白b1(H)处理20分钟。检测β-肌动蛋白(第4道)以显示各道之间的当量加载。
图4:Erlotinib与shRNA敲低c-met在EBC-1 NSCLC异种移植物模型中的联合功效。在裸(CRL nu/nu)动物中建立EBC-1-shMet-4.5肿瘤,然后用甲基纤维素吐温(MCT)媒介加含有5%蔗糖的饮用水(Suc)(PO,QD,在箭头所指之处),MCT加在5%蔗糖中配制的含1mg/mL多西环素的饮用水(Dox)(100mg/kg;PO,QD,在箭头所指之处),Erlotinib加含有5%蔗糖的饮用水(PO,QD,在箭头所指之处),或Erlotinib加在5%蔗糖中配制的含1mg/mL多西环素的饮用水(PO,QD,箭头所指之处)处理。在箭头所指之日进行口服给药。在整个研究期间用瓶装蔗糖或Dox水,每2-3天更换。如实施例中所述计算肿瘤体积和SEM。
图5:MetMAb与Erlotinib在NCI-H596 hu-HGF-Tg-C3H-SCID异种移植物模型中的联合功效。在hu-HGF-Tg-C3H-SCID或C3H-SCID同窝幼仔对照动物中培养NCI-H596肿瘤,并用Captisol媒介(PO,QD,x2周),Erlotinib(实心圆,短虚线;150mg/kg,PO,QD,x2周),MetMAb(30mg/kg,IP,一次),或MetMAb加Erlotinib的组合以相同的剂量和日程表处理。在图的底部指示了MetMAb(空心尖头)和Erlotinib或媒介(实心箭头头)的给药。通过测径器进行肿瘤测量,每周2-3次,持续约9周或直至由于组内肿瘤尺寸大而自研究中除去。如实施例中所述计算肿瘤体积和SEM。
图6:为每个组计算肿瘤倍增时间(TTD)测量(定义为肿瘤尺寸倍增需要的时间),并用于生成Kaplan-Meier存活曲线。MetMAb加Erlotinib的组合显示出肿瘤进展的显著改善,TTD均值为49.5(±2.6)天,比较而言,MetMAb处理组为17.8(±2.2)天,Erlotinib处理组为9.5(±1.2)天,而媒介对照组为9.5(±1.2)天。媒介和Erlotinib组的曲线完美交叠。
图7:描绘抗c-met抗体的一个实施方案的框架区(FR),高变区(HVR),第一恒定域(CL或CH1)和Fc区(Fc)的氨基酸序列。所描绘的Fc序列包含突变T366S,L368A和Y407V,如WO 2005/063816在所记载的。
图8:描绘包含突变T366W的Fc多肽的序列,如WO 2005/063816中所记载的。在一个实施方案中,包含此序列的Fc多肽与包含图7之Fc序列的Fc多肽形成复合物以生成Fc区。
图9A-E:c-met活性调节EGFR配体表达。A)在HGF响应性NSCLC细胞系中HGF处理诱导EGFR配体上调。Hop92或NCI-H596细胞血清饥饿过夜,然后不处理(无HGF)或者用HGF(50ng/ml)处理6小时(HGF)。来自细胞-/+HGF处理的RNA进行微阵列分析,如实施例中所记载的。RMA=相对微阵列。B)在不依赖配体的NSCLC细胞系EBC-1中c-met敲低降低EGFR配体表达。稳定表达针对c-met的shRNA的克隆(克隆3-15和4-12)不处理(无Dox)或者用多西环素处理(Dox)24或48小时。来自细胞的RNA进行微阵列分析,如实施例中所记载的。C)在没有HGF(无HGF)或有HGF(100ng/ml)2小时的情况中稳定表达针对c-met的shRNA的EBC1shMet4-12细胞不处理(无Dox)或者用Dox处理(Dox)24小时。来自细胞的RNA进行微阵列分析,如实施例中所记载的。D)稳定表达针对c-met的shRNA的EBCshMet4-12细胞和稳定表达shGFP2的对照细胞不处理(无Dox)或者用Dox处理(Dox)24小时。来自细胞的RNA进行微阵列分析,如实施例中所记载的。E)在裸(CRL nu-nu)动物中自EBC1shMet-4.12或EBCshMet-3.15细胞建立肿瘤,并给予小鼠在5%蔗糖中含1mg/ml Dox(Dox)或单独的5%蔗糖的饮用水。3天后,通过ELISA评估肿瘤溶胞物中的TGFα水平。
图10A-C:(A)EBCshMet 4.12或EBCshGFP2细胞不处理(-)或者用Dox处理(+)24,48或72小时。通过Western印迹对蛋白质溶胞物评估c-met,pEGFR或Her3。(B)EBCshMet 4.12细胞用Dox(100ng/ml)处理48小时,并通过FACS分析细胞表面Her3。(C)具有EBCshMet 4.12肿瘤的小鼠给予在5%蔗糖中含1mg/ml Dox(Dox)或单独的5%蔗糖(蔗糖)的饮用水3天。通过Western印迹对肿瘤溶胞物评估Her3蛋白质。
图11:EBC-1 shMet细胞(3.15或4.5或4.12)不处理(-)或者用100ng/ml Dox(+)单独处理96小时,或者启动Dox处理后48小时添加HGF(5或100ng/ml)或TGFa(1或50nM)。使用Cell Titer Glo评估细胞数。
图12:在HGF存在(右边小图)或缺失(左右小图)的情况中用NCI-H596细胞实施时间过程实验。在刺激后10分钟(10’),24小时,48小时或72小时制备细胞溶胞物,并实施Western印迹以检测总c-met(顶图),磷酸-EGFR(第2图)和总EGFR(第3图)。检测β-肌动蛋白(第4图)以显示各道之间的当量加载。
图13:在存在无配体,单独的TGF-α,TGF-α+HGF或单独的HGF的情况中分配NCI-H596细胞。在刺激后10分钟和24小时制备细胞溶胞物,并实施对c-met的免疫沉淀(IP),接着是对磷酸-酪氨酸(4G10;顶图),c-met(第2图)和EGFR(第3图)的Western印迹。磷酸-酪氨酸印迹显示配体依赖性方式的EGFR(顶带)和c-met(底带)活化,24小时后削弱。c-met免疫沉淀在所有条件中下拉EGFR,不管EGFR或c-met的活化状态。
图14:用NCI-H596细胞实施存活力测定法以评估在存在TGFα和不同浓度HGF的情况中细胞对Erlotinib的响应,如所示的。在HGF水平自0.5ng/ml升高至50ng/ml时检测到对Erlotinib的相对响应的降低。
图15:在存在TGFα和HGF(50ng/ml),有或无MetMAb(1μM)和不同浓度Erlotinib的情况中用NCI-H596细胞实施存活力测定法。数据表述为相对于未处理对照的百分比。未处理对照值显示为图左上部的各点。
图16:MetMAb和Erlotinib联合处理导致更有效的对磷酸-Akt和磷酸-ERK1/2的抑制。将携带NCI-H596肿瘤的人HGF转基因SCID(hu-HGF-Tg-SCID)小鼠用媒介(MetMAb缓冲液(100μL,IP)和甲基纤维素吐温(MCT,100μL,PO),MetMAb((30mg/kg,IP,一次)和MCT),Erlotinib((100mg/kg,在MCT中,100μL,PO)和MetMAb缓冲液(100μL,IP))或MetMAb和Erlotinib(剂量给药与为每一项所述相同)处理。MetMAb(或缓冲液)在时间零(t0hr)给药,Erlotinib(或MCT)在时间18小时(t18hr)给药,在时间24小时(t24hr)对小鼠处以安乐死并收集肿瘤。通过直接Western印迹和免疫沉淀接着Western印迹对肿瘤溶胞物分析总的和磷酸-蛋白质。缩写:pTyr=磷酸-酪氨酸,EGFR=表皮生长因子受体,ERK(细胞外信号调节的激酶-1和2。检测β-肌动蛋白以显示各道之间的当量加载。
图17A和17B:示意性描绘本申请中所记载的一些结果。
发明详述
I.定义
如本文中所使用的,除非另有说明,术语“肝细胞生长因子”或“HGF”指能够在容许HGF/c-met信号途经发生的条件下激活所述过程的任何天然或变异的(或是天然的或是合成的)HGF多肽。术语“野生型HGF”一般指包含天然发生HGF蛋白质的氨基酸序列的多肽。术语“野生型HGF序列”一般指在天然发生HGF中发现的氨基酸序列。c-met是HGF的一种已知受体,HGF细胞内信号传导经由c-met在生物学上实行。
如本文中所使用的,术语“HGF变体”指在天然HGF序列中包含一处或多处氨基酸突变的HGF多肽。任选地,所述一处或多处氨基酸突变包括氨基酸替代。
“天然序列”多肽包括与衍生自自然界的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。如此,天然序列多肽可具有来自任何哺乳动物的天然存在多肽的氨基酸序列。此类天然序列多肽可以从自然界分离,或者可通过重组或合成手段生成。术语“天然序列”多肽明确涵盖该多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如胞外结构域序列)、天然存在的变异形式(例如可变剪接形式)和天然存在的等位变体。
多肽“变体”指与天然序列多肽具有至少约80%氨基酸序列同一性的生物学活性多肽。此类变体包括例如其中在多肽的N和/或C末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的多肽。通常,变体将会与天然序列多肽具有至少约80%氨基酸序列同一性,更优选至少约90%氨基酸序列同一性和甚至更优选至少约95%氨基酸序列同一性。
“EGFR”(可互换地称作“ErbB1”、“HER1”和“表皮生长因子受体”)指Ullrich et al.,Nature(1984)309:418425中记载的受体酪氨酸激酶多肽表皮生长因子受体,或者指Her-1和c-erbB基因产物,及其变体,诸如EGFRvIII。EGFR的变体还包括删除、替代和***变体,例如Lynch et al.,New England Journal of Medicine 2004,350:2129;Paez et al.,Science 2004,304:1497;Pao et al.,PNAS 2004,101:13306中所记载的那些。
“生物学样品”(可互换地称作“样品”或“组织或细胞样品”)涵盖自个体获得的且可用于诊断或监测测定法的多种样品类型。该定义涵盖血液和生物学起源的其它液体样品、固体组织样品诸如活检标本或组织培养物或自其衍生的细胞、及其后代。该定义还涵盖在获得它们后已经进行过操作的样品,诸如用试剂处理、增溶、或富集某些成分诸如蛋白质或多核苷酸、或为切片目的而埋藏在半固体或固体基质中。术语“生物学样品”涵盖临床样品,而且还包括培养中的细胞、细胞上清液、细胞溶胞物、血清、血浆、生物学流体、和组织样品。生物学样品的来源可以是实体组织,像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品;血液或任何血液组分;体液,诸如脑脊液、羊水、腹膜液、或间质液;来自受试者的妊娠或发育中任何时间的细胞。在有些实施方案中,生物学样品是自原发性或转移性肿瘤获得的。生物学样品可含有在自然界中不与该组织天然混和的化合物,诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、诸如此类。
“c-met拮抗剂”(可互换地称作“c-met抑制剂”)指干扰c-met活化或功能的药剂。c-met抑制剂的例子包括c-met抗体;HGF抗体;小分子c-met拮抗剂;c-met酪氨酸激酶抑制剂;反义和抑制性RNA(例如shRNA)分子(参见例如WO2004/87207)。优选地,c-met抑制剂是结合c-met的抗体或小分子。在一个具体的实施方案中,c-met抑制剂具有约1,000nM或更低的对c-met的结合亲和力(解离常数)。在另一个实施方案中,c-met抑制剂具有约100nM或更低的对c-met的结合亲和力。在另一个实施方案中,c-met抑制剂具有约50nM或更低的对c-met的结合亲和力。在一个具体的实施方案中,c-met抑制剂共价结合c-met。在一个具体的实施方案中,c-met抑制剂以1,000nM或更低的IC50抑制c-met信号传导。在另一个实施方案中,c-met抑制剂以500nM或更低的IC50抑制c-met信号传导。在另一个实施方案中,c-met抑制剂以50nM或更低的IC50抑制c-met信号传导。
如本文中所使用的,术语“c-met靶向药物”指结合c-met并抑制c-met活化的治疗剂。c-met靶向药物的一个例子是MetMAb(OA5D5.v2)。
“c-met活化”指c-met受体的活化或磷酸化。一般而言,c-met活化导致信号转导(例如由c-met受体的细胞内激酶结构域引起的,磷酸化c-met或底物多肽中的酪氨酸残基)。c-met活化可以由c-met配体(HGF)结合感兴趣c-met受体来介导。HGF对c-met的结合可活化c-met的激酶结构域并由此导致c-met中酪氨酸残基的磷酸化和/或别的底物多肽中酪氨酸残基的磷酸化。
“EGFR拮抗剂”(可互换地称作“EGFR抑制剂”)指干扰EGFR活化或功能的药剂。EGFR抑制剂的例子包括EGFR抗体;EGFR配体抗体;小分子EGFR拮抗剂;EGFR酪氨酸激酶抑制剂;反义和抑制性RNA(例如shRNA)分子(参见例如WO2004/87207)。优选地,EGFR抑制剂是结合EGFR的抗体或小分子。在一些实施方案中,EGFR抑制剂是EGFR靶向药物。在一个具体的实施方案中,EGFR抑剂具有约1,000nM或更低的对EGFR的结合亲和力(解离常数)。在另一个实施方案中,EGFR抑制剂具有约100nM或更低的对EGFR的结合亲和力。在另一个实施方案中,EGFR抑制剂具有约50nM或更低的对EGFR的结合亲和力。在一个具体的实施方案中,EGFR抑制剂共价结合EGFR。在一个具体的实施方案中,EGFR抑制剂以1,000nM或更低的IC50抑制EGFR信号传导。在另一个实施方案中,EGFR抑制剂以500nM或更低的IC50抑制EGFR信号传导。在另一个实施方案中,EGFR抑制剂以50nM或更低的IC50抑制EGFR信号传导。
表述“ErbB2”和“HER2”在本文中可互换使用,指例如Semba et al.,PNAS(USA)82:6497-6501(1985)和Yamamoto et al.Nature 319:230-234(1986)中记载的人HER2蛋白质(Genebank登录号X03363)。术语“erbB2”指编码人ErbB2的基因,而“neu”指编码大鼠p185neu的基因。优选的HER2是天然序列人HER2。
“ErbB3”和“HER3”指例如美国专利No.5,183,884和5,480,968以及Kraus et al.PNAS(USA)86:9193-9197(1989)中披露的受体多肽。
术语“ErbB4”和“HER4”在本文中指例如欧洲专利申请No.599,274;Plowman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:1746-1750(1993);和Plowman et al.,Nature,366:473-475(1993)中披露的受体多肽,包括其同等型(isoforms),例如1999年4月22日公布的WO99/19488中披露的。
如本文中所使用的,“ErbB”指受体多肽EGFR,HER2,HER3和HER4。
“EGFR活化”指EGFR的活化或磷酸化。一般而言,EGFR活化导致信号转导(例如由EGFR受体的细胞内激酶结构域引起的,磷酸化EGFR或底物多肽中的酪氨酸残基)。EGFR活化可以由EGFR配体结合包含EGFR的EGFR二聚体来介导。EGFR配体对EGFR二聚体的结合可活化二聚体中一个或多个EGFR的激酶结构域并由此导致一个或多个EGFR中酪氨酸残基的磷酸化和/或别的底物多肽中酪氨酸残基的磷酸化。
如本文中所使用的,术语“EGFR靶向药物”指结合EGFR并抑制EGFR活化的治疗剂。此类药剂的例子包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的例子包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506),MAb 455(ATCC CRL HB 8507),MAb 225(ATCC CRL 8508),MAb 528(ATCC CRL 8509)(参见美国专利第4,943,533号,Mendelsohn et al.)及其变体,诸如嵌合化225(C225或Cetuximab;)和重构人225(H225)(参见WO 96/40210,Imclone Systems Inc.);IMC-11F8,一种完全人的EGFR靶向抗体(Imclone);结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利No.5,212,290);结合EGFR的人源化和嵌合抗体,如美国专利No.5,891,996中所记载的;及结合EGFR的人抗体,诸如ABX-EGF(参见WO 98/50433,Abgenix);EMD 55900(Stragliotto et al.,Eur.J.Cancer 32A:636-640(1996));EMD7200(matuzumab),一种针对EGFR的人源化EGFR抗体,其与EGF和TGF-α二者竞争EGFR结合;及mAb 806或人源化mAb 806(Johns et al.,J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004))。抗EGFR抗体可偶联细胞毒剂,如此产生免疫偶联物(参见例如EP 659,439 A2,Merck Patent GmbH)。结合EGFR的小分子的例子包括ZD1839或Gefitinib(IRESSATM;Astra Zeneca);CP-358774或Erlotinib(TARCEVATM;Genentech/OSI);和AG1478、AG1571(SU 5271;Sugen);EMD-7200。
“EGFR抗性”癌症意味着癌症患者在接受EGFR拮抗剂疗法的同时有发展(即患者是“EGFR不应性”的),或者患者在完成基于EGFR拮抗剂的治疗方案后12个月内(例如1个,2个,3个,或6个月内)有发展。例如,包含T790M突变体EGFR的癌症对Erlotinib和Gefitinib疗法有抗性。
“Erlotinib或Gefitinib抗性”癌症意味着癌症患者在接受基于Erlotinib或Gefitinib的疗法的同时有发展(即患者是“Erlotinib或Gefitinib不应性”的),或者患者在完成基于Erlotinib或Gefitinib的治疗方案后12个月内(例如1个,2个,3个,或6个月内)有发展。
如本文中所使用的,如例如应用于受体信号传导活性,术语“不依赖配体的”指不依赖配体的存在的信号传导活性。例如,EGFR信号传导可源自与其它HER家族成员(诸如HER2)的二聚化。具有不依赖配体的激酶活性的受体不会必然排除配体结合该受体以产生额外的激酶活性活化。
如本文中所使用的,如例如应用于受体激酶活性,术语“组成性”指受体不依赖配体或其它活化性分子的存在的持续信号传导活性。例如,常常在多形性成胶质细胞瘤中找到的EGFR变体III(EGFRvIII)删除了它很大部分的细胞外结构域。虽然配体不能够结合EGFRvIII,但是它是持续有活性的且与异常增殖和存活有关。根据受体的性质,所有活性可以是组成性的,或者受体的活性可以通过其它分子(例如配体)的结合而进一步活化。导致受体活化的细胞事件是本领域普通技术人员公知的。例如,活化可包括寡聚化(例如二聚化,三聚化,等)成高级受体复合物。复合物可包含单一种类的蛋白质,即同聚复合物。或者,复合物可包含至少两种不同蛋白质种类,即异聚复合物。可以通过例如受体的正常或突变体形式在细胞表面上的过表达来引起复合物形成。也可以通过受体中的特定突变来引起复合物形成。
短语“基因扩增”指在特定细胞或细胞系中形成多拷贝的基因或基因片段的过程。复制区(扩增的DNA的区段)常常称作“扩增子”。通常,所产生的信使RNA(mRNA)的量,即基因表达的水平,也按由所表达特定基因形成的拷贝数的比例增加。
“酪氨酸激酶抑制剂”指一定程度抑制酪氨酸激酶(诸如c-met受体)的酪氨酸激酶活性的分子。
“展示出c-met和/或EGFR表达、扩增或活化”的癌或生物学样品指在诊断测试中表达(包括过表达)c-met和/或EGFR,具有扩增的c-met和/或EGFR基因和/或以其它方式展现出c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物学样品。
“不展示c-met和/或EGFR表达、扩增或活化”的癌或生物学样品指在诊断测试中不表达(包括过表达)c-met和/或EGFR,不具有扩增的c-met和/或EGFR基因和/或不以其它方式展现出c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物学样品。
“展示出c-met和/或EGFR活化”的癌或生物学样品指在诊断测试中展现出c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物学样品。此类活化可直接(例如通过ELISA来测量c-met和/或EGFR磷酸化)或间接测定。
“不展示c-met和/或EGFR活化”的癌或生物学样品指在诊断测试中不展现出c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物学样品。此类活化可直接(例如通过ELISA来测量c-met和/或EGFR磷酸化)或间接测定。
“展示出组成性c-met和/或EGFR活化”的癌或生物学样品指在诊断测试中展现出组成性c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物学样品。此类活化可直接(例如通过ELISA来测量c-met和/或EGFR磷酸化)或间接测定。
“不展示c-met和/或EGFR扩增”的癌或生物学样品指在诊断测试中不具有扩增的c-met和/或EGFR基因的癌或生物学样品。
“展示出c-met和/或EGFR扩增”的癌或生物学样品指在诊断测试中具有扩增的c-met和/或EGFR基因的癌或生物学样品。
“不展示组成性c-met和/或EGFR活化”的癌或生物学样品指在诊断测试中不展现组成性c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物学样品。此类活化可直接(例如通过ELISA来测量c-met和/或EGFR磷酸化)或间接测定。
“展示出不依赖配体的c-met和/或EGFR活化”的癌或生物学样品指在诊断测试中展现出不依赖配体的c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物学样品。此类活化可直接(例如通过ELISA来测量c-met和/或EGFR磷酸化)或间接测定。
“不展示不依赖配体的c-met和/或EGFR活化”的癌或生物学样品指在诊断测试中不展现不依赖配体的c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物学样品。此类活化可直接(例如通过ELISA来测量c-met和/或EGFR磷酸化)或间接测定。
“磷酸-ELISA测定法”(phosho-ELISA assay)在本文中指在酶联免疫吸附测定法(ELISA)中评估一种或多种c-met和/或EGFR的磷酸化的测定法,其中使用检测磷酸化的c-met和/或EGFR、底物或下游信号分子的试剂(通常是抗体)。优选的是,使用检测磷酸化c-met和/或EGFR的抗体。该测定法可以对细胞溶胞物,优选来自新鲜的或冷冻的生物学样品的细胞溶胞物进行。
“c-met和/或EGFR过表达或扩增”的癌细胞指与同一组织类型的非癌性细胞相比,具有显著更高水平的c-met和/或EGFR蛋白质或基因的癌细胞。此类过表达可以是由基因扩增或者转录或翻译增加引起的。可在诊断或预后测定法中通过评估细胞表面上存在的c-met和/或EGFR蛋白质水平的升高(例如通过免疫组化测定法;IHC)来测定c-met和/或EGFR过表达或扩增。或者/另外,可测量细胞中编码c-met和/或EGFR的核酸的水平,例如通过荧光原位杂交(FISH;参见1998年10月公布的WO 98/45479)、Southern印迹或聚合酶链式反应(PCR)技术,诸如定量实时PCR(qRT-PCR)。在上述测定法之外,熟练从业人员还可利用多种体内测定法。例如,可将患者身体内的细胞暴露于任选用可检测标记物例如放射性同位素标记的抗体,并且可评估该抗体对患者身体内细胞的结合,例如通过外部扫描放射性或通过分析取自事先已暴露于所述抗体的患者的活检。
“不过表达或扩增c-met和/或EGFR”的癌细胞指与同一组织类型的非癌性细胞相比,不具有高于正常的c-met和/或EGFR蛋白质或基因水平的癌细胞。
术语“突变”在用于本文时指特定蛋白质或核酸(基因,RNA)分别相对于野生型蛋白质或核酸的氨基酸或核酸序列的差异。突变的蛋白质或核酸可以由基因的一个等位基因(杂合的)或两个等位基因(纯合的)表达或者在其中找到,而且它可以是体细胞的或种系的。在本发明中,突变一般是体细胞的。突变包括序列重排,诸如***、删除、和点突变(包括单核苷酸/氨基酸多态性)。
“抑制”指与参照相比减小或降低活性、功能、和/或量。
蛋白质“表达”指基因中编码的信息转换成信使RNA(mRNA),然后转换成蛋白质。
在本文中,“表达”感兴趣蛋白质(诸如HER受体或HER配体)的样品或细胞指其中测定出存在编码该蛋白质的mRNA或蛋白质(包括其片段)的样品或细胞。
“免疫偶联物”(可互换地称作“抗体-药物偶联物”或“ADC”)指抗体偶联至一种或多种细胞毒剂,诸如化疗剂,药物,生长抑制剂,毒素(例如蛋白质毒素,细菌,真菌,植物,或动物起源的酶活性毒素,或其片段),或放射性同位素(即放射偶联物)。
如本文中所使用的,术语“Fc区”一般指包含免疫球蛋白重链C端多肽序列的二聚体复合物,其中C端多肽序列是通过木瓜蛋白酶消化完整抗体可获得的。Fc区可包含天然或变体Fc序列。虽然免疫球蛋白重链的Fc序列的边界可以有所变化,但是人IgG重链Fc序列通常定义为Fc序列自位于大约位置Cys226的氨基酸残基,或自大约位置Pro230,至羧基端的区段。免疫球蛋白的Fc序列一般包含两个恒定域,CH2域和CH3域,且任选包含CH4域。Fc区的C端赖氨酸(依照EU编号***的残基447)可以消除,例如在抗体纯化期间,或者通过对编码抗体的核酸进行重组工程改造。因而,依照本发明包含具有Fc区的抗体的组合物可包含具有K447的抗体、消除了所有K447的抗体、或有和无K447残基的抗体的混合物。
“Fc多肽”在本文中指构成Fc区的多肽之一。可以自任何合适的免疫球蛋白获得Fc多肽,诸如IgG1,IgG2,IgG3,或IgG4亚型,IgA,IgE,IgD或IgM。在一些实施方案中,Fc多肽包含部分或整个野生型铰链序列(一般位于其N端)。在一些实施方案中,Fc多肽不包含功能性或野生型铰链序列。
如本文中所使用的,“铰链区”,“铰链序列”,及其变化形式包括本领域知道的含义,其例示于例如Janeway et al.,Immuno Biology:the immune system in health and disease,(Elsevier Science Ltd.,NY)(第4版,1999);Bloom et al.,Protein Science(1997),6:407-415;Humphreys et al.,J.Immunol.Methods(1997),209:193-202。
贯穿本说明书和权利要求书,免疫球蛋白重链中的残基编号方式是如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)(通过述及明确收入本文)中的EU索引的编号方式。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号方式。
术语“抗体”以最广义使用,明确覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、及抗体片段,只要它们展现出期望的生物学活性。
“抗体片段”只包含完整抗体的一部分,其中所述部分优选保留该部分存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项、优选大多数或所有功能。在一个实施方案中,抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点,如此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中,抗体片段,例如包含Fc区的抗体片段,保留通常与Fc区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项生物学功能,诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中,抗体片段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例如,此类抗体片段可包含一个抗原结合臂且其与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列相连。在一个实施方案中,本发明的抗体是如WO2005/063816中所记载的单臂抗体。在一个实施方案中,单臂抗体包含如WO2005/063816中所记载的构成“结(knob)”和“穴(hole)”的Fc突变。例如,穴突变(hole mutation)可以是Fc多肽中的T366A、L368A和/或Y407V中的一个或多个,而腔突变(cavity mutation)可以是T366W。
“阻断性”抗体或抗体“拮抗剂”指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。优选的阻断性抗体或拮抗性抗体完全抑制抗原的生物学活性。
除非另有说明,贯穿本说明书,表述“多价抗体”用于指包含三个或更多个抗原结合位点的抗体。多价抗体优选改造成具有三个或更多个抗原结合位点,而且一般不是天然序列IgM或IgA抗体。
“Fv”片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区域由紧密结合(该结合的本质可以是共价的,例如在scFv中)的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种构造中,每个可变域的三个CDR相互作用而在VH-VL二聚体表面上限定了一个抗原结合位点。六个CDR或其子集一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而,即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力,只是通常亲和力低于完整结合位点。
在用于本文时,“抗体可变域”指抗体分子的轻链和重链中包含互补决定区(CDR;即CDR1、CDR2、和CDR3)和框架区(FR)氨基酸序列的那部分。VH指重链可变域。VL指轻链可变域。依照本发明所使用的方法,归为CDR和FR的氨基酸位置可以依照Kabat(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987和1991))来限定。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号方式也依照Kabat。
在用于本文时,术语“互补决定区(CDR;即CDR1、CDR2、和CDR3)指抗体可变域中其存在是抗原结合所必需的氨基酸残基。每个可变域通常具有三个CDR,鉴定为CDR1、CDR2和CDR3。每个互补决定区可以包含来自如Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基(即大约是轻链可变域的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变域的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))和/或来自“高变环”的残基(即大约是轻链可变域的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变域的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3);Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。在有些情况中,互补决定区可以包含来自Kabat定义的CDR和高变环二者的氨基酸。例如,抗体4D5重链的CDRH1包含氨基酸26-35。
“框架区”(以下的FR)指可变域中CDR残基以外的残基。每个可变域通常具有四个FR,鉴定为FR1、FR2、FR3和FR4。如果CDR是依照Kabat定义的,那么轻链FR残基位于大约轻链残基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)、和98-107(LCFR4),而重链FR残基位于大约重链残基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)、和103-113(HCFR4)。如果CDR包含来自高变环的氨基酸残基,那么轻链FR残基位于大约轻链残基1-25(LCFR1)、33-49(LCFR2)、53-90(LCFR3)、和97-107(LCFR4),而重链FR残基位于大约重链残基1-25(HCFR1)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)、和102-113(HCFR4)。在有些情况中,在CDR包含来自Kabat定义的CDR和高变环二者的氨基酸时,FR残基将做相应的调整。例如,当CDRH1包含氨基酸H26-H35时,重链FR1残基位于1-25位,而FR2残基位于36-49位。
“Fab”片段包含轻链的可变域和恒定域及重链的可变域和第一恒定域(CH1)。F(ab′)2抗体片段包含一对Fab片段,这对Fab片段一般通过它们之间的铰链半胱氨酸在它们羧基末端附近共价连接。本领域还知道抗体片段的其它化学偶联形式。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域,其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言,Fv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽接头,其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见Pluckthun,于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页,1994。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段,该片段在同一条多肽链(VH及VL)中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对,迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对,从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097;WO 93/11161;Hollinger等.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。
表述“线性抗体”指Zapata等.,Protein Eng.,8(10):1057-1062(1995)中所描述的抗体。简言之,这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1),该区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的,或者是单特异性的。
修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征,不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如,有待依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成,包括例如杂交瘤法(例如Kohler and Milstein.,Nature,256:495-97(1975);Hongo et al.,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988);Hammerling et al.,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004);Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893;WO 1996/34096;WO 1996/33735;WO1991/10741;Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993);Jakobovits et al.,Nature 362:255-258(1993);Bruggemann et al.,Year in Immunol.7:33(1993);美国专利No.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016;Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992);Lonberg et al.,Nature 368:856-859(1994);Morrison,Nature368:812-813(1994);Fishwild et al.,Nature Biotechnol.14:845-851(1996);Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996);Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体,其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,以及此类抗体的片段,只要它们展现出期望的生物学活性(参见例如美国专利No.4,816,567;及Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括“灵长类化”抗体,其中抗体的抗原结合区衍生自通过用感兴趣抗原免疫短尾猴(macaque monkey)而生成的抗体。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上,人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中,将人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外,人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常,人源化抗体包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变区,其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环,且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc),通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.,Nature 321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成。在一个实施方案中,人抗体是从噬菌体文库选择的,该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan et al.,Nature Biotechnology 14:309-314(1996);Sheets et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.95:6157-6162(1998);Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581(1991))。人抗体还可通过将人免疫球蛋白基因座导入内源免疫球蛋白基因已经部分或完全灭活的转基因动物(例如小鼠)来生成。在受到攻击时,观察到人抗体生成,它在所有方面与在人体中看到的极其相似,包括基因重排、装配和抗体全集。这种方法记载于例如美国专利No.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016,及以下科学出版物:Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992);Lonberg et al.,Nature 368:856-859(1994);Morrison,Nature 368:812-13(1994);Fishwild et al.,Nature Biotechnology14:845-51(1996);Neuberger,Nature Biotechnology 14:826(1996);Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。或者,人抗体可通过生成针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞的永生化来制备(此类B淋巴细胞可从个体回收,或者可在体外免疫)。参见例如Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985);Boerner et al.,J.Immunol.147(1):86-95(1991);及美国专利No.5,750,373。
“裸抗体(裸露的抗体)”指未偶联异源分子诸如细胞毒性模块或放射性标记物的抗体。
“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。优选的亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了CDR和/或框架残基的随机诱变:Barbas et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994);Schier et al.,Gene 169:147-155(1995);Yelton et al.,J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson et al.,J.Immunol.154(7):3310-9(1995);Hawkins et al.,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
具有指定抗体的“生物学特征”的抗体指拥有该指定抗体区别于其它结合相同抗原的抗体的一项或多项生物学特征的抗体。
为了筛选结合抗原上感兴趣抗体所结合的表位的抗体,可以实施常规交叉阻断测定法,诸如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中所记载的。
为了延长包含本发明氨基酸序列的抗体或多肽的半衰期,可如例如美国专利No.5,739,277中所记载的将补救受体结合表位附着于抗体(尤其是抗体片段)。例如,可以将编码补救受体结合表位的核酸分子与编码本发明多肽序列的核酸在同一读码框内相连接,使得由改造后的核酸分子编码的融合蛋白包含补救受体结合表位和本发明的多肽序列。在用于本文时,术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位(例如Ghetie et al.,Ann.Rev.Immunol.18:739-766(2000),表1)。其Fc区中有替代且血清半衰期延长的抗体还记载于WO00/42072;WO 02/060919;Shields et al.,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001);Hinton,J.Biol.Chem.279:6213-6216(2004))。在另一个实施方案中,还可以通过例如附着其它多肽序列来延长血清半衰期。例如,可以将在本发明的方法中有用的抗体或其它多肽附着于血清清蛋白或血清清蛋白中结合FcRn受体或血清清蛋白结合肽的那部分,使得血清清蛋白结合该抗体或多肽,例如此类多肽序列披露于WO01/45746。在一个优选的实施方案中,待附着的血清清蛋白肽包含氨基酸序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO:21)。在另一个实施方案中,Fab的半衰期通过这些方法得到了延长。血清清蛋白结合肽序列还可参见Dennis et al.,J.Biol.Chem.277:35035-35043(2002)。
“分离的”多肽或“分离的”抗体指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的。多肽或抗体的天然环境的污染性成分指将会干扰其诊断或治疗用途的物质,可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中,将多肽或抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定,多肽或抗体重量超过95%且最优选重量超过99%,(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度,或(3)根据使用考马斯蓝或优选的银染色的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE,达到同质。既然多肽的天然环境的至少一种成分不会存在,那么分离的多肽或抗体包括重组细胞内的原位多肽或抗体。然而,分离的多肽或抗体通常通过至少一个纯化步骤来制备。
“片段”指多肽和核酸分子的一部分,其含有参比核酸分子或多肽全长的的优选至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或更多。片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100、200、300、400、500、600、或更多个核苷酸,或者10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、190、200或更多个氨基酸。
“处理”和“治疗”(treatment)指治疗性处理和预防性措施二者。需要治疗的受试者包括那些早就患有良性、癌前、或非转移性肿瘤的以及要预防发生或复发的。
术语“治疗有效量”指在哺乳动物中治疗或预防疾病或病症的治疗剂量。在癌症的情况中,治疗有效量的治疗剂可减少癌细胞的数目;缩小原发性肿瘤的尺寸;抑制(即一定程度的减缓,优选阻止)癌细胞浸润入周围器官;抑制(即一定程度的减缓,优选阻止)肿瘤转移;一定程度的抑制肿瘤生长;和/或一定程度的减轻一种或多种与病症有关的症状。根据药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度,它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法,体内功效可以通过例如评估存活持续时间、距疾病进展的时间(TTP)、响应率(RR)、响应持续时间、和/或生活质量来测量。
术语“癌(症)”和“癌(性)的”指向或描述哺乳动物中典型的以不受调节的细胞生长为特征的生理疾患。此定义中包括良性和恶性癌症。“早期癌症”或“早期肿瘤”指非侵入性的或转移性的,或者归为0期、I期、或II期癌症的癌症。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤(包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、间皮瘤、施旺氏细胞瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌包括小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺的腺癌和肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、***、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌(包括转移性乳腺癌)、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney or renal cancer)、***癌、外阴癌、甲状腺癌、***癌、***癌、睾丸癌、食道癌、胆管肿瘤、及头和颈癌。
术语“癌前”指典型地在癌之前或发展成癌的疾患或生长。“癌前”生长会具有以异常细胞周期调节、增殖、或分化为特征的细胞,这些可通过细胞周期调节、细胞增殖、或分化的标志物来测定。
“发育异常”指组织、器官、或细胞的任何异常生长或发育。优选的是,发育异常是高级的或癌前的。
“转移”指癌自其原发部位传播至身体中的其它位置。癌细胞能脱离原发性肿瘤,渗透入淋巴和血管,经由血流而循环和在身体中其它地方的正常组织中的远端病灶(转移)中生长。转移可以是当地的或远端的。转移是一个连续过程,视肿瘤细胞自原发性肿瘤脱落、经由血流而传播、并在远端部位停止而定。在新的部位,该细胞建立血供且能生长至形成危及生命的团块。
肿瘤细胞内的刺激性和抑制性分子途径调节这种行为,而且肿瘤细胞与远端部位中的宿主细胞之间的相互作用也是重要的。
“非转移的”指良性的或保留在原发部位且尚未渗透入淋巴或血管***或渗透至原发部位以外的组织的癌症。一般而言,非转移性癌症指作为0期、I期、或II期癌症和偶尔的III期癌症的任何癌症。
“原发性肿瘤”或“原发性癌”指初始的癌症,而不是位于受试者身体中另一组织、器官、或位置中的转移病灶。
“良性肿瘤”或“良性癌”指仍然局限于起源部位且没有能力渗透、侵入、或转移至远端部位的肿瘤。
“肿瘤载荷”指身体中癌细胞的数目、肿瘤的尺寸、或癌的量。肿瘤载荷也称作肿瘤负荷。
“肿瘤数目”指肿瘤的数目。
“受试者”指哺乳动物,包括但不限于人或非人哺乳动物,诸如牛,马,犬,绵羊,或猫。优选地,受试者是人。
术语“抗癌疗法”指在治疗癌症中有用的疗法。抗癌治疗剂的例子包括但不限于例如化疗剂、生长制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它治疗癌症的药剂,抗CD20抗体、血小板衍生生长因子抑制剂(例如GleevecTM(Imatinib Mesylate))、COX-2抑制剂(例如celecoxib)、干扰素、细胞因子、结合一种或多种以下靶物的拮抗剂(例如中和性抗体)(ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体、TRAIL/Apo2)、和其它生物活性和有机化学剂,等。本发明还包括它们的组合。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90和Re186)、化疗剂、和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素或其片段。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷基化剂类(alkylating agents),诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide);磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates),诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶类(aziridines),诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa);乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines),包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine);番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan));苔藓抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物);隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成类似物,KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;海绵抑素(spongistatin);氮芥类(nitrogen mustards),诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard);亚硝脲类(nitrosoureas),诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素类,诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin),尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew(1994)Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186);蒽环类抗生素(dynemicin),包括dynemicin A;二膦酸盐类(bisphosphonates),诸如氯膦酸盐(clodronate);埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物类,诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物,诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤类似物,诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine);嘧啶类似物,诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine);雄激素类,诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone);抗肾上腺类,诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂,诸如亚叶酸(folinic acid);醋葡醛内酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid);恩尿嘧啶(eniluracil);安吖啶(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate);地磷酰胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);elfornithine;依利醋铵(elliptinium acetate);埃坡霉素(epothilone);依托格鲁(etoglucid);硝酸镓;羟脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼达明(lonidamine);美登木素生物碱类(maytansinoids),诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌达醇(mopidamol);二胺硝吖啶(nitracrine);喷司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);鬼臼酸(podophyllinic acid);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);螺旋锗(spirogermanium);细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亚胺醌(triaziquone);2,2′,2″-三氯三乙胺;单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine);达卡巴嗪(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛醇(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”);环磷酰胺(cyclophosphamide);塞替派(thiotepa);类紫杉醇类(taxoids),例如帕利他塞(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造纳米颗粒剂型帕利他塞(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)和多西他塞(doxetaxel)(-Poulenc Rorer,Antony,France);苯丁酸氮芥(chlorambucil);吉西他滨(gemcitabine);6-硫鸟嘌呤(thioguanine);巯基嘌呤(mercaptopurine);甲氨蝶呤(methotrexate);铂类似物,诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin);长春碱(vinblastine);铂(platinum);依托泊苷(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);长春新碱(vincristine);长春瑞滨(vinorelbine);能灭瘤(novantrone);替尼泊苷(teniposide);依达曲沙(edatrexate);道诺霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);希罗达(xeloda);伊本膦酸盐(ibandronate);伊立替康(irinotecan)(Camptosar,CPT-11)(包括伊立替康及5-FU和亚叶酸的治疗方案);拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);类视黄酸类(retinoids),诸如视黄酸(retinoic acid);卡培他滨(capecitabine);考布他汀(combretastatin);亚叶酸(leucovorin)(LV);奥沙利铂(oxaliplatin),包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX);PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如Erlotinib(TarcevaTM))和VEGF-A的、降低细胞增殖的抑制剂;及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物。
该定义还包括作用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂诸如抗***类和选择性***受体调控物类(SERM),包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene);抑制在肾上腺中调节***生成的芳香酶的芳香酶抑制剂,诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole)、来曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole);抗雄激素类,诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin);以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物);反义寡核苷酸,特别是抑制牵涉异常(abherant)细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸,诸如例如PKC-α、Raf和H-Ras;核酶,诸如VEGF表达抑制剂(例如核酸)和HER2表达抑制剂;疫苗,诸如基因疗法疫苗,例如疫苗、疫苗和疫苗;rIL-2;拓扑异构酶1抑制剂;rmRH;长春瑞滨(Vinorelbine)和埃斯波霉素(Esperamicins)(见美国专利No.4,675,187);及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物。
术语“前体药物”在用于本中请时指与母药(parent drug)相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的药用活性物质的前体和衍生物形式。参见例如Wilman,“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”,Biochemical Society Transactions,14,pp.375-382,615thMeeting Belfast(1986)和Stella et al.,“Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”,Directed Drug Delivery,Borchardt et al.,(ed.),pp.247-267,Humana Press(1985)。本发明的前体药物包括但不限于含磷酸盐/酯前体药物、含硫代磷酸盐/酯前体药物、含硫酸盐/酯前体药物、含肽前体药物、D-氨基酸修饰前体药物、糖基化前体药物、含β-内酰胺前体药物、含任选取代苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、可转化为更具活性而无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。
“放射疗法”或“放疗”指使用定向伽马射线或贝塔射线来诱发对细胞的足够损伤,以限制细胞正常发挥功能的能力或全然破坏细胞。应当领会,本领域知道许多方式来确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗作为一次施用来给予,而典型的剂量范围为每天10-200个单位(戈瑞(Gray))。
治疗剂
本发明特征在于c-met拮抗剂和EGFR拮抗剂在联合疗法中治疗受试者中的病理状况(诸如肿瘤)的用途。
c-met拮抗剂
在本发明的方法中有用的c-met拮抗剂包括特异性结合c-met的多肽,抗c-met抗体,c-met小分子,特异性结合c-met的受体分子和衍生物和融合蛋白。c-met拮抗剂还包括c-met多肽的拮抗性变体,针对c-met和HGF的RNA适体和肽体。在本发明的方法中有用的c-met拮抗剂还包括抗HGF抗体,抗HGF多肽,特异性结合HGF的c-met受体分子和衍生物。下文描述了这些每一项的例子。
在本发明的方法中有用的抗c-met抗体包括任何以足够亲和力和特异性结合c-met且能降低或抑制c-met活性的抗体。所选择的抗体正常情况下会具有足够强的对c-met的结合亲和力,例如抗体会以介于100nM-1pM之间的Kd值结合人c-met。抗体亲和力可通过例如基于表面等离振子共振的测定法(诸如BIAcore测定法,如PCT申请公开文本No.WO2005/012359中所记载的);酶联免疫吸附测定法(ELISA);和竞争测定法(例如RIA)来测定。优选地,本发明的抗c-met抗体能在靶向和干扰涉及c-met/HGF活性的疾病或状况中用作治疗剂。还有,可以将所述抗体提交其它生物学活性测定法,例如为了评估它作为治疗剂的效力。此类测定法是本领域已知的,而且取决于抗体的靶抗原和预定用途。
抗c-met抗体是本领域已知的(参见例如Martens,T,et al(2006)Clin Cancer Res 12(20 Pt 1):6144;US 6,468,529;WO2006/015371;WO2007/063816;US7,408,043;WO2009/007427;WO2005/016382;WO2007/126799)。在一个实施方案中,抗c-met抗体包含重链可变域,其包含图7中所绘CDR1-HC,CDR2-HC和CDR3-HC序列(SEQ ID NO:13-15)中的一项或多项。在一些实施方案中,所述抗体包含轻链可变域,其包含图7中所绘CDR1-LC,CDR2-LC和CDR3-LC序列(SEQ ID NO:5-7)中的一项或多项。在一些实施方案中,重链可变域包含图7中所绘FR1-HC,FR2-HC,FR3-HC和FR4-HC序列(SEQ ID NO:9-12)。在一些实施方案中,轻链可变域包含图7中所绘FR1-LC,FR2-LC,FR3-LC和FR4-LC序列(SEQ ID NO:1-4)。在一些实施方案中,抗c-met抗体是单价的且包含Fc区。在一些实施方案中,所述抗体包含图7中所绘Fc序列(SEQ ID NO:17)。
在一些实施方案中,所述抗体是单价的且包含Fc区,其中所述Fc区包含第一和第二多肽,其中所述第一多肽包含图7中所绘Fc序列(SEQ ID NO:17)且所述第二多肽包含图8中所绘Fc序列(SEQ ID NO:18)。
在一个实施方案中,抗c-met抗体包含(a)第一多肽,其包含具有下述序列的重链可变域:QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIGMIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:19),图7中所绘CH1序列(SEQID NO:16)和图7中所绘Fc序列(SEQ ID NO:17);和(b)第二多肽,其包含具有下述序列的轻链可变域:DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:20)和图7中所绘CL1序列(SEQ ID NO:8);和(c)第三多肽,其包含图8中所绘Fc序列(SEQ ID NO:18)。
在其它实施方案中,抗c-met抗体是由以美国典型培养物保藏中心登录号ATCC HB-11894(杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895(杂交瘤5D5.11.6)保藏的杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体。在其它实施方案中,所述抗体包含由以美国典型培养物保藏中心登录号ATCC HB-11894(杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895(杂交瘤5D5.11.6)保藏的杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体的一种或多种CDR序列。
在其它实施方案中,本发明的c-met抗体特异性结合c-met Sema结构域或其变体的至少一部分。在一个例子中,本发明的拮抗性抗体特异性结合至少一种选自下组的序列:LDAQT(SEQ ID NO:22)(例如c-met的残基269-273),LTEKRKKRS(SEQ ID NO:23)(例如c-met的残基300-308),KPDSAEPM(SEQID NO:24)(例如c-met的残基350-357)和NVRCLQHF(SEQ ID NO:25)(例如c-met的残基381-388)。在一个实施方案中,本发明的拮抗性抗体特异性结合由至少一种选自下组的序列的部分或整个形成的构象表位:LDAQT(SEQID NO:22)(例如c-met的残基269-273),LTEKRKKRS(SEQ ID NO:23)(例如c-met的残基300-308),KPDSAEPM(SEQ ID NO:24)(例如c-met的残基350-357)和NVRCLQHF(SEQ ID NO:25)(例如c-met的残基381-388)。在一个实施方案中,本发明的拮抗性抗体特异性结合与序列LDAQT(SEQ IDNO:22),LTEKRKKRS(SEQ ID NO:23),KPDSAEPM(SEQ ID NO:24)和/或NVRCLQHF(SEQ ID NO:25)具有至少50%,60%,70%,80%,90%,95%,98%序列同一性或相似性的氨基酸序列。
抗HGF抗体是本领域公知的。参见例如Kim KJ,et al.Clin Cancer Res.(2006)12(4):1292-8;WO2007/115049;WO2009/002521;WO2007/143098;WO2007/017107;WO2005/017107;L2G7;AMG-102。
特异性结合HGF的c-met受体分子或其片段能在本发明的方法中使用,例如用于结合和隔绝HGF蛋白质,由此阻止其信号传导。优选地,c-met受体分子或其HGF结合片段是可溶性形式。在一些实施方案中,所述受体的可溶性形式通过结合HGF,由此阻止它结合其在靶细胞表面上存在的天然受体而对c-met蛋白质的生物学活性发挥抑制效果。还包括c-met受体融合蛋白,下文描述了它的例子。
本发明的可溶性c-met受体蛋白质或嵌合c-met受体蛋白质包括没有经跨膜结构域固定至细胞表面的c-met受体蛋白质。因此,c-met受体的可溶性形式(包括嵌合受体蛋白质)在能够结合和灭活HGF的同时不包含跨膜结构域且如此一般不变成与表达该分子的细胞的细胞膜结合。参见例如Kong-Beltran,M et al Cancer Cell(2004)6(1):75-84。
特异性结合c-met并阻断或降低c-met活化,由此阻止它发信号的HGF分子或其片段能在本发明的方法中使用。
适体是形成特异性结合靶分子(诸如HGF多肽)的三级结构的核酸分子。适体的生成和治疗用途是本领域已完善建立的。参见例如美国专利No.5,475,096。HGF适体是PEG化的修饰的寡核苷酸,其采取使之能够结合细胞外HGF的三维构象。关于适体的别的信息可见于美国专利申请公开文本No.20060148748。
肽体是与编码免疫球蛋白分子的片段或部分的氨基酸序列相连接的肽序列。多肽可衍生自随机化序列,通过任何方法来选择特异性结合,包括但不限于噬菌体展示技术。在一个优选的实施方案中,可以将所选择的多肽连接至编码免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列。特异性结合并拮抗HGF或c-met的肽体在本发明的方法中也是有用的。
c-met拮抗剂包括小分子,诸如US 5,792,783;US 5,834,504;US5,880,141;US 6,297,238;US 6,599,902;US 6,790,852;US 2003/0125370;US 2004/0242603;US 2004/0198750;US 2004/0110758;US 2005/0009845;US 2005/0009840;US 2005/0245547;US 2005/0148574;US 2005/0101650;US 2005/0075340;US 2006/0009453;US 2006/0009493;WO 98/007695;WO 2003/000660;WO 2003/087026;WO 2003/097641;WO 2004/076412;WO 2005/004808;WO 2005/121125;WO 2005/030140;WO 2005/070891;WO 2005/080393;WO 2006/014325;WO 2006/021886;WO 2006/021881,WO 2007/103308中记载的化合物。PHA-665752是c-Met的催化活性、以及多种肿瘤细胞的生长、细胞运动、侵入和形态的一种小分子、ATP竞争性的活性位点抑制剂(Ma et al(2005)Clin.Cancer Res.11:2312-2319;Christensen et al(2003)Cancer Res.63:7345-7355)。
EGFR拮抗剂
EGFR拮抗剂包括抗体,诸如称作nimotuzumab(YM Biosciences)的人源化单克隆抗体,完全人的ABX-EGF(panitumumab,Abgenix Inc.)以及US6,235,883中记载的称作E1.1,E2.4,E2.5,E6.2,E6.4,E2.11,E6.3和E7.6.3的完全的抗体;MDX-447(Medarex Inc)。pertuzumab(2C4)是直接结合HER2但干扰HER2-EGFR二聚化,由此抑制EGFR信号传导的人源化抗体。结合EGFR的抗体的其它例子包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506),MAb 455(ATCC CRL HB8507),MAb 225(ATCC CRL 8508),MAb 528(ATCC CRL8509)(参见美国专利No.4,943,533,Mendelsohn et al.)及其变体,诸如嵌合化225(C225或Cetuximab;)和重构人225(H225)(参见WO 96/40210,Imclone Systems Inc.;IMC-11F8,一种完全人的EGFR靶向抗体(Imclone);结合II型突变EGFR的抗体(美国专利No.5,212,290);结合EGFR的人源化和嵌合抗体,如美国专利No.5,891,996中所记载的;及结合EGFR的人抗体,诸如ABX-EGF(参见sWO98/50433,Abgenix);EMD 55900(Stragliotto et al.Eur.J.Cancer 32A:636-640(1996));EMD7200(matuzumab),一种针对EGFR的人源化EGFR抗体,其与EGF和TGF-α二者竞争EGFR结合;及mAb 806或人源化mAb 806(Johns et al.,J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004))。抗EGFR抗体可偶联细胞毒剂,如此产生免疫偶联物(参见例如EP659,439A2,Merck Patent GmbH)。
在本发明的方法中有用的抗EGFR抗体包括任何以足够亲和力和特异性结合EGFR且能降低或抑制EGFR活性的抗体。所选择的抗体在正常情况下会具有足够强的对EGFR的结合亲和力,例如抗体可以以介于100nM-1pM之间的Kd值结合人c-met。抗体亲和力可通过例如基于表面等离振子共振的测定法(诸如BIAcore测定法,如PCT申请公开文本No.WO2005/012359中所记载的);酶联免疫吸附测定法(ELISA);和竞争测定法(例如RIA)来测定。优选地,本发明的抗c-met抗体能在靶向和干扰涉及EGFR/EGFR配体活性的疾病或状况中用作治疗剂。还有,可以对所述抗体进行其它生物学活性测定法,例如为了评估它作为治疗剂的效力。此类测定法是本领域已知的,而且取决于抗体的靶抗原和预定用途。
双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可结合EGFR和c-met。在另一个例子中,例示性的双特异性抗体可结合同一蛋白质(例如c-met蛋白质)的两种不同表位。或者,可以将c-met或EGFR臂与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD2或CD3),或IgG的Fc受体(FcγR),诸如FcγRI(CD64),FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合,从而将细胞防御机制聚焦于表达c-met或EGFR的细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位至表达EGFR或c-met的细胞。这些抗体拥有结合EGFR或c-met的臂和结合细胞毒剂(例如皂草毒蛋白,抗干扰素-α,长春花生物碱,蓖麻毒蛋白A链,甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
EGFR拮抗剂还包括小分子,诸如US5616582,US5457105,US5475001,US5654307,US5679683,US6084095,US6265410,US6455534,US6521620,US6596726,US6713484,US5770599,US6140332,US5866572,US6399602,US6344459,US6602863,US6391874,WO9814451,WO9850038,WO9909016,WO9924037,WO9935146,WO0132651,US6344455,US5760041,US6002008,US5747498中记载的化合物。具体的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774,Erlotinib,OSI Pharmaceuticals);PD 183805(CI 1033,N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-2-丙烯酰胺,二氢盐酸盐,Pfizer Inc.);(ZD 1839,Gefitinib,AstraZeneca);ZM 105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉,Zeneca);BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺,Boehringer Ingelheim);PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯基乙基)氨基]-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚);(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶);CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺);EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺);lapatinib(Tykerb,GlaxoSmithKline);ZD6474(Zactima,AstraZeneca);CUDC-101(Curis);canertinib(CI-1033);AEE788(6-[4-[(4-乙基-1-哌嗪基)甲基]苯基]-N-[(1R)-1-苯基乙基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺,WO2003013541,Novartis)和PKI166(4-[4-[[(1R)-1-苯基乙基]氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚,WO9702266 Novartis)。
在一个具体的实施方案中,EGFR拮抗剂具有依照US 5,757,498(通过引用并入本申请)的通式I:
其中:
m为1,2,或3;
每个R1独立地选自下组:氢,卤素,羟基,羟基氨基,羧基,硝基,胍基,脲基,氰基,三氟甲基和-(C1-C4亚烷基亚烷基)-W-(苯基),其中W为单键,O,S或NH;
或者每个R1独立地选自R9和C1-C4烷基,其是被氰基取代的,其中R9选自下组:R5,-OR6,-NR6R6,-C(O)R7,-NHOR5,-OC(O)R6,氰基,A和-YR5;R5为C1-C4烷基;R6独立地为氢或R5;R7为R5,-OR6或-NR6R6;A选自哌啶子基,吗啉代,吡咯烷子基,4-R6-哌嗪-1-基,咪唑-1-基,4-吡啶酮-1-基,-(C1-C4亚烷基亚烷基)(CO2H),苯氧基,苯基,苯基硫基,C2-C4烯基和-(C1-C4亚烷基亚烷基)C(O)NR6R6;且Y为S,SO,或SO2;其中R5,-OR6和-NR6R6中的烷基部分任选是被1-3个卤素取代基取代的且R5,-OR6和-NR6R6中的烷基部分任选是被1或2个R9基团取代的,且其中所述任选取代基的烷基部分任选是被卤素或R9取代的,前提是没有两个杂原子连接于同一碳原子;
或者每个R1独立地选自-NHSO2R5,邻苯二甲酰亚氨基-(C1-C4)-烷基磺酰基氨基,苯甲酰氨基,苯磺酰基氨基,3-苯基脲基,2-氧代吡咯烷-1-基,2,5-二氧代吡咯烷-1-基和R10-(C2-C4)-烷酰基氨基,其中R10选自卤素,-OR6,C2-C4烷酰基氧,-C(O)R7和-NR6R6;且其中所述-NHSO2R5,邻苯二甲酰亚氨基-(C1-C4-烷基磺酰基氨基,苯甲酰氨基,苯磺酰基氨基,3-苯基脲基,2-氧代吡咯烷-1-基,2,5-二氧代吡咯烷-1-基和R10-(C2-C4)-烷酰基氨基,以及R1基团任选是被1或2个独立地选自卤素,C1-C4烷基,氰基,甲磺酰基和C1-C4烷氧基的取代基取代的;
或者两个R1基团与它们所连接的碳一起形成5-8元环,其包括1或2个选自O,S和N的杂原子;
R2为氢或C1-C6烷基,其任选是被1-3个独立地选自卤素,C1-C4烷氧基,-NR6R6和-SO2R5的取代基取代的;
n为1或2且每个R3独立地选自氢,卤素,羟基,C1-C6烷基,-NR6R6和C1-C4烷氧基,其中所述R3基团的烷基部分任选是被1-3个独立地选自卤素,C1-C4烷氧基,-NR6R6和-SO2R的取代基取代的;且
R4为叠氮基或-(乙炔基)-R11,其中R11为氢或C1-C6烷基,其任选是被羟基,-OR6,或-NR6R6取代的。
在一个具体的实施方案中,所述EGFR拮抗剂为选自下组的依照式I的化合物:
(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-[3-(3′-羟基丙炔-1-基)苯基]-胺;[3-(2′-(氨基甲基)-乙炔基)苯基]-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺;(3-乙炔基苯基)-(6-硝基喹唑啉-4-基)-胺;(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(4-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-2-甲基苯基)-胺;(6-氨基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(3-乙炔基苯基)-(6-甲磺酰基氨基喹唑啉-4-基)-胺;(3-乙炔基苯基)-(6,7-亚甲二氧基喹唑啉-4-基)-胺;(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-6-甲基苯基)-胺;(3-乙炔基苯基)-(7-硝基喹唑啉-4-基)-胺;(3-乙炔基苯基)-[6-(4′-甲苯磺酰基氨基)喹唑啉-4-基]-胺;(3-乙炔基苯基)-{6-[2′-苯二酰亚氨基-乙-1′-基-磺酰基氨基]喹唑啉-4-基}-胺;(3-乙炔基苯基)-(6-胍基喹唑啉-4-基)-胺;(7-氨基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(3-乙炔基苯基)-(7-甲氧基喹唑啉-4-基)-胺;(6-甲氧羰基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(7-甲氧羰基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;[6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基)-胺;(3-叠氮基苯基)-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺;(3-叠氮基-5-氯苯基)-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺;(4-叠氮基苯基)-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺;(3-乙炔基苯基)-(6-甲磺酰基-喹唑啉-4-基)-胺;(6-乙硫基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-4-氟-苯基)-胺;(6,7-二甲氧基-喹唑啉-4-基)-[3-(丙炔-1′-基)-苯基]-胺;[6,7-双-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(5-乙炔基-2-甲基-苯基)-胺;[6,7-双-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-4-氟-苯基)-胺;[6,7-双-(2-氯-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺;[6-(2-氯-乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺;[6,7-双-(2-乙酰氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺;2-[4-(3-乙炔基-苯基氨基)-7-(2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-6-基氧基]-乙醇;[6-(2-乙酰氧基-乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺;[7-(2-氯-乙氧基)-6-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺;[7-(2-乙酰氧基-乙氧基)-6-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺;2-[4-(3-乙炔基-苯基氨基)-6-(2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基]-乙醇;2-[4-(3-乙炔基-苯基氨基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-6-基氧基]-乙醇;2-[4-(3-乙炔基-苯基氨基)-6-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基]-乙醇;[6-(2-乙酰氧基-乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺;(3-乙炔基-苯基)-{6-(2-甲氧基-乙氧基)-7-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙氧基]-喹唑啉-4-基}-胺;(3-乙炔基-苯基)-[7-(2-甲氧基-乙氧基)-6-(2-吗啉-4-基)-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-胺;(6,7-二乙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二丁氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二异丙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二乙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基-2-甲基-苯基)-胺;[6,7-双-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基-2-甲基-苯基)-胺;(3-乙炔基苯基)-[6-(2-羟基-乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-胺;[6,7-双-(2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基苯基)-胺;2-[4-(3-乙炔基-苯基氨基)-6-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基]-乙醇;(6,7-二丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-苯基)-胺;(6,7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-5-氟-苯基)-胺;(6,7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-4-氟-苯基)-胺;(6,7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(5-乙炔基-2-甲基-苯基)-胺;(6,7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-4-甲基-苯基)-胺;(6-氨基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-苯基)-胺;(6-氨基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基乙基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基甲基-7-乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基乙基-7-乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基甲基-7-异丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基甲基-7-丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基乙基-7-异丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;和(6-氨基羰基乙基-7-丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二乙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(3-乙炔基苯基)-[6-(2-羟基-乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-胺;[6,7-双-(2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基苯基)-胺;[6,7-双-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二甲氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(3-乙炔基苯基)-(6-甲磺酰基氨基-喹唑啉-1-基)-胺;和(6-氨基-喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺。
在一个具体的实施方案中,式I的EGFR拮抗剂为N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺。在一个具体的实施方案中,EGFR拮抗剂N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺为HCl盐形式。在另一个具体的实施方案中,EGFR拮抗剂N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺为基本上同质的结晶多型形式(在WO 01/34,574中描述为多型B),其展现的X射线粉末衍射图的特征峰具有大约6.26、12.48、13.39、16.96、20.20、21.10、22.98、24.46、25.14和26.91的2-theta。N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺的此类多型形式称作TarcevaTM以及OSI-774,CP-358774和Erlotinib。
可以通过任何已知适用于制备化学相关化合物的工艺来制备式I的化合物,其药学可接受盐和前体药物(下文称作活性化合物)。一般而言,可以如US 5,747,498中披露的通用方案I所示,使用适当取代的胺自适当取代的喹唑啉来制备活性化合物:
方案I
如方案I所示,使适宜的4-取代的喹唑啉2(其中X为合适的可置换的离去基团,诸如卤素,芳基氧基,烷基亚磺酰基,烷基磺酰基,诸如三氟甲磺酰基氧基,芳基亚磺酰基,芳基磺酰基,甲硅烷氧基,氰基,吡唑并(pyrazolo),***并或四唑并,优选4-氯喹唑啉)与适宜的胺或胺盐酸盐4或5反应,其中R4如上文所述且Y为Br,I,或三氟甲磺酰基氧基,其在溶剂中,诸如(C1-C6)醇,二甲基甲酰胺(DMF),N-甲基吡咯烷-2-酮,氯仿,乙腈,四氢呋喃(THF),1-4二烷,吡啶或其它非质子溶剂。该反应可以在碱的存在下进行,优选碱金属或碱土金属碳酸盐或氢氧化物或叔胺碱,诸如吡啶,2,6-卢剔啶,可力丁,N-甲基-吗啉,三乙胺,4-二甲基氨基-吡啶或N,N-二甲基苯胺。这些碱在下文中称作合适的碱。将反应混合物维持于自大约环境温度至溶剂回流温度的温度,优选大约35℃至大约回流,直至基本上检测不到剩余4-卤素喹唑啉,通常是约2至约24小时。优选地,在惰性气氛诸如干氮气下实施反应。
一般而言,反应物是按化学计量组合的。当胺碱用于那些使用胺4或5的盐(通常是HCl盐)的化合物时,那么优选使用过量的胺碱,一般是一个额外当量的胺碱。(或者,如果不使用胺碱,那么可以使用过量的胺4或5)。
对于那些使用有空间位阻的胺4(诸如2-烷基-3-乙炔基苯胺)或反应性很高的4-卤素喹唑啉的化合物,优选使用t-丁基醇或极性非质子溶剂诸如DMF或N-甲基吡咯烷-2-酮作为溶剂。
或者,在溶剂诸如四氯化碳,氯仿,二氯乙烷,四氢呋喃,乙腈或其它非质子溶剂或其混合物中使4-取代的喹唑啉2(其中X为羟基或氧代(且2-氮是氢化的)与四氯化碳和任选取代的三芳基膦(其任选在惰性聚合物(例如三苯基膦,聚合物支持的,Aldrich产品目录号36,645-5,其是2%二乙烯基苯交联的聚苯乙烯,每克树脂含有3mmol磷)上支持)反应。将反应混合物维持于自大约环境至回流的温度,优选大约35℃至回流,2-24小时。使此混合物与适宜的胺或胺盐酸盐4或5反应,或是直接地或是在除去溶剂后,例如通过真空蒸发,并添加合适的备选溶剂诸如(C1-C6)醇,DMF,N-甲基吡咯烷-2-酮,吡啶或1-4二烷。然后,将反应混合物维持于自大约环境至溶剂回流温度的温度,优选大约35℃至大约回流,直至实现产物的基本完全形成,通常是约2至约24小时。优选地,在惰性气氛诸如干氮气下实施反应。
当化合物4(其中Y为Br,I,或三氟甲磺酰基氧基)在与喹唑啉2的反应中用作起始材料时,形成式3的化合物(其中R1,R2,R3和Y如上文所述)。在溶剂诸如二乙基胺或三乙胺中在存在合适的Lewis酸(诸如氯化亚铜)和合适的炔诸如三甲基甲硅烷基乙炔,炔丙基醇或3-(N,N-二甲基氨基)-丙炔下通过与合适的钯试剂诸如四(三苯基膦)钯或双(三苯基膦)钯二氯化物反应,化合物3转变成式1的化合物(其中R4为R11乙炔基,且R11如上文定义)。通过处理化合物3用重氮化试剂诸如酸和亚硝酸盐(例如乙酸和NaNO2)处理接着用叠氮化物诸如NaN3处理所得产物,化合物3(其中Y为NH2)可以转变成化合物1(其中R4为叠氮化物)。
为了生成式I的那些化合物(其中R1为氨基或羟基氨基),采用相应式I化合物(其中R1为硝基)还原。
可以方便地通过已知用于此类转化的多种规程之任一进行还原。可以例如通过在存在合适的金属催化剂诸如钯,铂或镍下在反应惰性溶剂中氢化硝基化合物进行还原。另一种合适的还原剂是例如活化的金属,诸如活化的铁(通过用酸诸如氢氯酸的稀溶液清洗铁粉生成)。如此,例如,可以通过在合适的溶剂诸如水和醇例如甲醇或乙醇的混合物中与浓缩的氢氯酸一起加热硝基化合物和活化的金属的混合物至例如50°至150℃范围中的温度(方便地是在70℃或附近)来进行还原。另一类合适的还原剂是碱金属连二亚硫酸盐,诸如连二亚硫酸钠,其可以在(C1-C4)链烷酸,(C1-C6)链烷醇,水或其混合物中使用。
为了生成式I的那些化合物(其中R2或R3包含伯或仲氨基部分(在意图与喹唑啉反应的氨基之外)),优选在上述反应之前保护此类游离氨基,接着在与4-(取代的)喹唑啉2的上述反应之后去保护。
可以使用数种公知的氮保护基团。此类基团包括(C1-C6)烷氧基羰基,任选取代的苄基氧基羰基,芳基氧羰基,三苯甲基(trityl),乙烯基氧羰基,O-硝基苯基磺酰基,二苯基氧膦基,p-甲苯磺酰基和苄基。在氯化烃溶剂诸如二氯甲烷或1,2-二氯乙烷,或醚性溶剂诸如甘醇二甲醚,二甘醇二甲醚或THF中,在存在或缺失叔胺碱诸如三乙胺,二异丙基乙基胺或吡啶,优选三乙胺下,在约0℃至约50℃,优选大约环境温度的温度进行氮保护基团的添加。或者,方便地使用Schotten-Baumann条件连接保护基团。
在化合物2和5的上述偶联反应之后,可以通过本领域技术人员知道的去保护方法除去保护基团,诸如对于叔-丁氧羰基保护的产物,在二氯甲烷中用三氟乙酸处理。
关于保护基团及其使用的描述参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts,“Protective Groups in Organic Synthesis”第2版,John Wiley & Sons,New York,1991。
为了生成式I的化合物(其中R1或R2为羟基),优选式I化合物(其中R1或R2为(C1-C4)烷氧基)***。
可以方便地通过已知用于此类转化的多种规程之任一进行***反应。为了O-去烷基化,可以采用于150°至175℃用熔化的吡啶盐酸盐(20-30eq.)处理受保护的式I衍生物。或者,可以例如通过用碱金属(C1-C4)烷基硫化物诸如乙硫醇钠处理受保护的喹唑啉衍生物或通过用碱金属二芳基磷化物诸如二苯基磷化锂物处理来进行***反应。可以通过用硼或铝三卤化物诸如三溴化硼处理受保护的喹唑啉衍生物方便地进行***反应。优选在存在反应惰性溶剂下及在合适的温度进行此类反应。
式I的化合物(其中R1或R2为(C1-C4)烷基亚磺酰基或(C1-C4)烷基磺酰基)优选通过式I化合物(其中R1或R2为(C1-C4)烷基硫基)氧化来制备。本领域知道用于硫基氧化成亚磺酰基和/或磺酰基的合适的氧化剂,例如过氧化氢,过酸(诸如3-氯过氧苯甲酸或过氧乙酸),碱金属过氧硫酸盐(诸如过氧单硫酸钾),三氧化铬或氧气,在铂存在下。一般在尽可能温和的条件下及用化学计量量的氧化剂进行氧化以降低过度氧化的风险及减轻对其它官能团的损害。一般而言,在合适的溶剂(诸如二氯甲烷,氯仿,丙酮,四氢呋喃或叔丁基甲基醚)中及在约-25°至50℃的温度(优选在环境温度或附近,即在15°至35℃范围中)进行反应。当需要带亚磺酰基的化合物时,应使用更温和的氧化剂,例如偏高碘酸钠或钾,方便地在极性溶剂诸如乙酸或乙醇中。含有(C1-C4)烷基磺酰基的式I的化合物可以通过氧化相应(C1-C4)烷基亚磺酰基化合物以及相应(C1-C4)烷基硫基化合物来获得。
式I的化合物(其中R1为任选取代的(C2-C4)烷酰基氨基,脲基,3-苯基脲基,苯甲酰氨基或磺酰氨基)可以通过酰化或磺酰化相应化合物(其中R1为氨基)来制备。合适的酰化剂是本领域已知用于氨基酰化成酰基氨基的任何试剂,例如酰卤,例如(C2-C4)烷酰氯或溴或苯甲酰氯或溴,链烷酸酐或混合酸酐(例如乙酸酐或在存在合适的碱下通过链烷酸和(C1-C4)烷氧基羰基卤化物,例如(C1-C4)烷氧基羰基氯化物反应形成的混合酸酐。为了生成式I的那些化合物(其中R1为脲基或3-苯基脲基),一种合适的酰化剂是例如氰酸盐,例如碱金属氰酸盐诸如氰酸钠或异氰酸盐或酯诸如异氰酸苯酯。可以在存在叔胺碱下用合适的磺酰卤或磺酰酸酐进行N-磺酰化。一般而言,在反应惰性溶剂中及在约-30°至120℃范围中的温度(方便地在环境温度或附近)进行酰化或磺酰化。
式I的化合物(其中R1为(C1-C4)烷氧基或取代的(C1-C4)烷氧基或R1为(C1-C4)烷基氨基或取代的单-N-或双-N,N-(C1-C4)烷基氨基)通过相应化合物(其中R1分别为羟基或氨基)烷基化来制备,优选在存在合适的碱下。合适的烃化剂包括烷基或取代的烷基卤化物,例如任选取代的(C1-C4)烷基氯化物,溴化物或碘化物,在存在合适的碱下,在反应惰性溶剂中及约10°至140℃范围中的温度,方便地在环境温度或附近。
为了生成式I的那些化合物(其中R1为氨基-,氧-或氰基-取代的(C1-C4)烷基取代基),相应化合物(其中R1为带可被氨基-,烷氧基-,或氰基置换的基团的(C1-C4)烷基取代基)与适宜的胺,醇或氰化物反应,优选在存在合适的碱下。优选在反应惰性溶剂或稀释剂中及在约10°至100℃范围中的温度(优选在环境温度或附近)进行反应。
式I的化合物(其中R1为羧基取代基或包括羧基的取代基)通过相应化合物(其中R1为(C1-C4)烷氧基羰基取代基或包括(C1-C4)烷氧基羰基的取代基)水解来制备。水解可以方便地例如在碱性条件下实施,例如在存在碱金属氢氧化物下。
式I的化合物(其中R1为氨基,(C1-C4)烷基氨基,二-[(C1-C4)烷基]氨基,吡咯烷-1-基,哌啶子基,吗啉代,哌嗪-1-基,4-(C1-C4)烷基哌嗪-1-基或(C1-C4)烷基硫基)可以通过在存在合适的碱下相应化合物(其中R1为胺或硫醇可置换基团)与适宜的胺或硫醇反应来制备。反应优选在反应惰性溶剂或稀释剂中及在约10°至180℃范围中(方便地在100°至150℃范围中)的温度进行。
式I的化合物(其中R1为2-氧代吡咯烷-1-基或2-氧哌啶-1-基)通过在存在合适的碱下相应化合物(其中R1为卤素-(C2-C4)烷酰基氨基)环化来制备。反应优选在反应惰性溶剂或稀释剂中及在约10°至100℃范围中的温度(方便地在环境温度或附近)进行。
为了生成式I的化合物(其中R1为氨甲酰基,取代的氨甲酰基,烷酰基氧或取代的烷酰基氧),相应化合物(其中R1为羟基)氨甲酰化或环化是方便的。
本领域已知用于羟基芳基部分酰化成烷酰基氧芳基的合适的酰化剂包括例如(C2-C4)烷酰卤,(C2-C4)烷酰基酸酐和上文所述混合酸酐,而且可以采用合适的其取代的衍生物,通常在存在合适的碱下。或者,可以借助缩合剂诸如碳二亚胺使(C2-C4)链烷酸或其合适取代的衍生物与式I化合物(其中R1为羟基)偶联。为了生成式I的那些化合物(其中R1为氨甲酰基或取代的氨甲酰基),合适的氨甲酰化剂是例如氰酸盐或烷基或芳基异氰酸盐或酯,通常在存在合适的碱下。或者,可以生成式I化合物(其中R1为羟基)的合适的中间体诸如氯甲酸酯或羰基咪唑基衍生物,例如通过用光气(或光气等效物)或羰基二咪唑处理所述衍生物。然后所得中间体可以与适宜的胺或取代的胺反应以生成期望的氨甲酰基衍生物。
式I的化合物(其中R1为氨基羰基或取代的氨基羰基)可通过合适中间体(其中R1为羧基)氨解来制备。
式I化合物(其中R1为羧基)的活化和偶联可以通过本领域技术人员知道的多种方法来实施。合适的方法包括羧基活化成酰卤,叠氮化物,对称或混合的酸酐,或适宜反应性的活性酯,以与期望的胺偶联。此类中间体及其生成和在与胺偶联中的使用的例子可广泛在文献中找到;例如M.Bodansky和A.Bodansky,“The Practice of Peptide Synthesis”,Springer-Verlag,New York,1984。所得式I化合物可以通过标准方法来分离和纯化,诸如溶剂清除和再结晶或层析。
所述反应方案I的起始材料(例如胺,喹唑啉和胺保护基团)易于获得,或者本领域技术人员使用有机合成的常规方法能容易地合成。例如,2,3-二氢-1,4-苯并嗪衍生物的制备记载于R.C.Elderfield,W.H.Todd,S.Gerber,“Heterocyclic Compounds”,第6卷,第12章,R.C.Elderfield编,John Wiley and Sons,Inc.,N.Y.,1957。取代的2,3-二氢苯并噻嗪基化合物记载于R.C.Elderfield和E.E.Harris,Elderfield的书“Heterocyclic Compounds”第6卷第13章。
在另一个具体的实施方案中,EGFR拮抗剂具有如US 5,457,105(通过述及收入本文)中所记载的通式II:
其中:
m为1,2或3;且
每个R1独立地为6-羟基,7-羟基,氨基,羧基,氨甲酰基,脲基,(1-4C)烷氧基羰基,N-(1-4C)烷基氨甲酰基,N,N-二-[(1-4C)烷基]氨甲酰基,羟基氨基,(1-4C)烷氧基氨基,(2-4C)烷酰基氧氨基,三氟甲氧基,(1-4C)烷基,6-(1-4C)烷氧基,7-(1-4C)烷氧基,(1-3C)亚烷基二氧基,(1-4C)烷基氨基,二-1[(1-4C)烷基]氨基,吡咯烷-1-基,哌啶子基,吗啉代,哌嗪-1-基,4-(1-4C)烷基哌嗪-1-基,(1-4C)烷基硫基,(1-4C)烷基亚磺酰基,(1-4C)烷基磺酰基,溴甲基,二溴甲基,羟基-(1-4C)烷基,(2-4C)烷酰基氧基-(1-4C)烷基,(1-4C)烷氧基-(1-4C)烷基,羧基-(1-4C)烷基,(1-4C)烷氧基羰基-(1-4C)烷基,氨甲酰基-(1-4C)烷基,N-(1-4C)烷基氨甲酰基-(1-4C)烷基,N,N-二-[(1-4C)烷基]氨甲酰基-(1-4C)烷基,氨基-(1-4C)烷基,(1-4C)烷基氨基-(1-4C)烷基,二-[(1-4C)烷基]氨基-(1-4C)烷基,哌啶子基-(1-4C)烷基,吗啉代-(1-4C)烷基,哌嗪-1-基-(1-4C)烷基,4-(1-4C)烷基哌嗪-1-基-(1-4C)烷基,羟基-(2-4C)烷氧基-(1-4C)烷基,(1-4C)烷氧基-(2-4C)烷氧基-(1-4C)烷基,羟基-(2-4C)烷基氨基-(1-4C)烷基,(1-4C)烷氧基-(2-4C)烷基氨基-(1-4C)烷基,(1-4C)烷基硫基-(1-4C)烷基,羟基-(2-4C)烷基硫基-(1-4C)烷基,(1-4C)烷氧基-(2-4C)烷基硫基-(1-4C)烷基,苯氧基-(1-4C)烷基,苯胺基-(1-4C)烷基,苯基硫基-(1-4C)烷基,氰基-(1-4C)烷基,卤代-(2-4C)烷氧基,羟基-(2-4C)烷氧基,(2-4C)烷酰基氧基-(2-4C)烷氧基,(1-4C)烷氧基-(2-4C)烷氧基,羧基-(1-4C)烷氧基,(1-4C)烷氧基羰基-(1-4C)烷氧基,氨甲酰基-(1-4C)烷氧基,N-(1-4C)烷基氨甲酰基-(1-4C)烷氧基,N,N-二-[(1-4C)烷基]氨甲酰基-(1-4C)烷氧基,氨基-(2-4C)烷氧基,(1-4C)烷基氨基-(2-4C)烷氧基,二-[(1-4C)烷基]氨基-(2-4C)烷氧基,(2-4C)烷酰基氧,羟基-(2-4C)烷酰基氧,(1-4C)烷氧基-(2-4C)烷酰基氧,苯基-(1-4C)烷氧基,苯氧基-(2-4C)烷氧基,苯胺基-(2-4C)烷氧基,苯基硫基-(2-4C)烷氧基,哌啶子基-(2-4C)烷氧基,吗啉代-(2-4C)烷氧基,哌嗪-1-基-(2-4C)烷氧基,4-(1-4C)烷基哌嗪-1-基-(2-4C)烷氧基,卤代-(2-4C)烃基氨基,羟基-(2-4C)烃基氨基,(2-4C)烷酰基氧基-(2-4C)烃基氨基,(1-4C)烷氧基-(2-4C)烃基氨基,羧基-(1-4C)烷基氨基,(1-4C)烷氧基羰基-(1-4C)烷基氨基,氨甲酰基-(1-4C)烷基氨基,N-(1-4C)烷基氨甲酰基-(1-4C)烷基氨基,N,N-二-[(1-4C)烷基]氨甲酰基-(1-4C)烷基氨基,氨基-(2-4C)烃基氨基,(1-4C)烷基氨基-(2-4C)烃基氨基,二-1(1-4C)烷基]氨基-(2-4C)烃基氨基,苯基-(1-4C)烷基氨基,苯氧基-(2-4C)烃基氨基,苯胺基-(2-4C)烃基氨基,苯基硫基-(2-4C)烃基氨基,(2-4C)烷酰基氨基,(1-4C)烷氧基羰基氨基,(1-4C)烷基烷基磺酰基氨基,苯甲酰氨基,苯磺酰基氨基,3-苯基脲基,2-氧代吡咯烷-1-基,2,5-二氧代吡咯烷-1-基,卤代-(2-4C)烷酰基氨基,羟基-(2-4C)烷酰基氨基,(1-4C)烷氧基-(2-4C)烷酰基氨基,羧基-(2-4C)烷酰基氨基,(1-4C)烷氧基羰基-(2-4C)烷酰基氨基,氨甲酰基-(2-4C)烷酰基氨基,N-(1-4C)烷基氨甲酰基-(2-4C)烷酰基氨基,N,N-二-[(1-4C)烷基]氨甲酰基-(2-4C)烷酰基氨基,氨基-(2-4C)烷酰基氨基,(1-4C)烷基氨基-(2-4C)烷酰基氨基或二-[(1-4C)烷基]氨基-(2-4C)烷酰基氨基,且其中所述苯甲酰氨基或苯磺酰氨基取代基或R1取代基中的任何苯胺基,苯氧基或苯基可任选带一个或两个卤素,(1-4C)烷基或(1-4C)烷氧基取代基;
n为1或2;且
每个R2独立地为氢,羟基,卤素,三氟甲基,氨基,硝基,氰基,(1-4C)烷基,(1-4C)烷氧基,(1-4C)烷基氨基,二-[(1-4C)烷基]氨基,(1-4C)烷基硫基,(1-4C)烷基亚磺酰基或(1-4C)烷基磺酰基;或其药学可接受盐;除了4-(4′-羟基苯胺基)-6-甲氧基喹唑啉,4-(4,-羟基苯胺基)-6,7-亚甲二氧基喹唑啉,6-氨基-4-(4′-氨基苯胺基)喹唑啉,4-苯胺基-6-甲基喹唑啉或其盐酸盐盐和4-苯胺基-6,7-二甲氧基喹唑啉或其盐酸盐盐被排除在外。
在一个具体的实施方案中,EGFR拮抗剂为选自下组的依照式II的化合物:4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-6,7-二甲氧基喹唑啉;4-(3’,4’-二氯苯胺基)-6,7-二甲氧基喹唑啉;6,7-二甲氧基-4-(3’-硝基苯胺基)-喹唑啉;6,7-二乙氧基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉;6-甲氧基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉;4-(3’-氯苯胺基)-6-甲氧基喹唑啉;6,7-亚乙二氧基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉;6-氨基-7-甲氧基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉;4-(3’-甲基苯胺基)-6-脲基喹唑啉;6-(2-甲氧基乙氧基甲基)-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉;6,7-二-(2-甲氧基乙氧基)-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉;6-二甲基氨基-4-(3’-甲基苯胺基)喹唑啉;6-苯甲酰氨基-4-(3’-甲基苯胺基)喹唑啉;6,7-二甲氧基-4-(3’-三氟甲基苯胺基)-喹唑啉;6-羟基-7-甲氧基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉;7-羟基-6-甲氧基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉;7-氨基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉;6-氨基-4-(3’-甲基苯胺基)喹唑啉;6-氨基-4-(3’-氯苯胺基)-喹唑啉;6-乙酰氨基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉;6-(2-甲氧基乙基氨基)-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉;7-(2-甲氧基乙酰氨基)-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉;7-(2-羟基乙氧基)-6-甲氧基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉;7-(2-甲氧基乙氧基)-6-甲氧基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉;6-氨基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉。
式II的喹唑啉衍生物或其药学可接受盐可以通过已知适用于化学相关化合物的制备的任何工艺来制备。一种合适的工艺是例如US 4,322,420中所使用的所例示的。必需的起始材料可以是商品化的或通过有机化学的标准规程获得的。
(a)喹唑啉(i)(其中Z为可置换基团)与苯胺(ii)的反应,方便的是在存在合适的碱下
合适的可置换基团Z是例如卤素,烷氧基,芳基氧基或磺酰基氧基团,例如氯,溴,甲氧基,苯氧基,甲磺酰基氧或对甲苯磺酰基氧基团。
合适的碱是例如有机胺碱,诸如例如吡啶,2,6-卢剔啶,可力丁,4-二甲基氨基吡啶,三乙胺,吗啉,N-甲基吗啉或二氮双环[5.4.0]十一-7-烯,或例如碱金属或碱土金属碳酸盐或氢氧化物,例如碳酸钠,碳酸钾,碳酸钙,氢氧化钠或氢氧化钾。
优选在存在合适的惰性溶剂或稀释剂下进行反应,例如链醇或酯诸如甲醇,乙醇,异丙醇或乙酸乙酯,卤化溶剂诸如二氯甲烷,氯仿或四氯化碳,醚诸如四氢呋喃或1,4-二烷,芳香族溶剂诸如甲苯,或偶极非质子溶剂诸如N,N-二甲基甲酰胺,N,N-二甲基乙酰胺,N-甲基吡咯烷-2-酮或二甲基亚砜。方便地在例如10°至150℃范围中的,优选在20°至80℃范围中的温度进行反应。
式II的喹唑啉衍生物可以以游离碱的形式得自此工艺,或者可以用式H-Z的酸获得盐的形式,其中Z具有上文定义的含义。当希望自盐获得游离碱时,可以使用常规规程用上文定义的合适的碱处理盐。
(b)为了生成式II的那些化合物(其中R1或R2为羟基),式II的喹唑啉衍生物(其中R1或R2为(1-4C)烷氧基)***。
可以方便地通过已知用于此类转化的多种规程之任一进行***反应。可以例如通过用碱金属(1-4C)烷基硫化物诸如乙硫醇钠处理喹唑啉衍生物或例如通过用碱金属二芳基磷化物诸如二苯基磷化锂物处理来进行反应。或者,可以例如通过用硼或铝三卤化物诸如三溴化硼处理喹唑啉衍生物方便地进行***反应。优选在存在上文定义的合适的惰性溶剂或稀释剂下及在合适的温度进行此类反应。
(c)为了生成式II的那些化合物(其中R1或R2为(1-4C)烷基亚磺酰基或(1-4C)烷基磺酰基),式II的喹唑啉衍生物(其中R1或R2为(1-4C)烷基硫基团)氧化。
合适的氧化剂是例如本领域已知用于硫氧化成亚磺酰基和/或磺酰基的任何试剂,例如过氧化氢,过酸(诸如3-氯过氧苯甲酸或过氧乙酸),碱金属过氧硫酸盐(诸如过氧单硫酸钾),三氧化铬或氧气,在铂存在下。一般在尽可能温和的条件下及用所需化学计量量的氧化剂进行氧化以降低过度氧化的风险及减轻对其它官能团的损害。一般而言,在合适的溶剂或稀释剂(诸如二氯甲烷,氯仿,丙酮,四氢呋喃或叔丁基甲基醚)中及在例如-25°至50℃的温度(方便地在环境温度或附近,即在15°至35℃范围中)进行反应。当需要带亚磺酰基的化合物时,也可以使用更温和的氧化剂,例如偏高碘酸钠或钾,方便地在极性溶剂诸如乙酸或乙醇中。会领会,当需要含有(1-4C)烷基磺酰基的式II的化合物时,它可以通过氧化相应的(1-4C)烷基亚磺酰基化合物以及相应的(1-4C)烷基硫化合物来获得。
(d)为了生成式II的那些化合物(其中R1为氨基),式I的喹唑啉衍生物(其中R1为硝基)还原。
可以方便地通过已知用于此类转化的多种规程之任一进行还原。可以例如通过在存在合适的金属催化剂诸如钯或铂下在上文定义的惰性溶剂或稀释剂的溶液中氢化硝基化合物进行还原。另一种合适的还原剂是例如活化的金属,诸如活化的铁(通过用酸诸如氢氯酸的稀溶液清洗铁粉生成)。如此,例如,可以通过在合适的溶剂或稀释剂诸如水和醇例如甲醇或乙醇的混合物中加热硝基化合物和活化的金属的混合物至例如50°至150℃范围中的温度(方便地是在70℃或附近)来进行还原。
(e)为了生成式II的那些化合物(其中R1为(2-4C)烷酰基氨基或取代的(2-4C)烷酰基氨基,脲基,3-苯基脲基或苯甲酰氨基,或R2为乙酰氨基或苯甲酰氨基),式II的喹唑啉衍生物(其中R1或R2为氨基)酰化。
合适的酰化剂是例如本领域已知用于氨基酰化成酰基氨基的任何试剂,例如酰卤,例如(2-4C)烷酰氯或溴或苯甲酰氯或溴,方便地是在存在上文定义的合适的碱,链烷酸酐或混合酸酐下,例如(2-4C)链烷酸酐诸如乙酸酐或在存在上文定义的合适的碱下通过链烷酸和(1-4C)烷氧基羰基卤化物,例如(1-4C)烷氧基羰基氯化物反应形成的混合酸酐。为了生成式II的那些化合物(其中R1为脲基或3-苯基脲基),合适的酰化剂是例如氰酸盐,例如碱金属氰酸盐诸如氰酸钠或例如异氰酸盐或酯诸如异氰酸苯酯。一般而言,在上文定义的合适的惰性溶剂或稀释剂中及在例如-30°至120℃范围中的温度(方便地是在环境温度或附近)进行酰化。
(f)为了生成式II的那些化合物(其中R1为(1-4C)烷氧基或取代的(1-4C)烷氧基或R1为(1-4C)烷基氨基或取代的(1-4C)烷基氨基),式II的喹唑啉衍生物(其中R1根据需要为羟基或氨基)烃化,优选在存在上文定义的合适的碱下。
合适的烃化剂是例如本领域已知羟基烃化成烷氧基或取代的烷氧基,或氨基烃化成烃基氨基或取代的烃基氨基的任何试剂,例如烃基或取代的烃基卤化物,例如(1-4C)烷基氯化物,溴化物或碘化物或取代的(1-4C)烷基 氯化物,溴化物或碘化物,在存在上文定义的合适的碱下,在上文定义的合适的惰性溶剂或稀释剂中及在例如10°至140℃范围中的温度,方便地是在环境温度或附近。
(g)为了生成式II的那些化合物(其中R1为羧基取代基或包括羧基的取代基),式II的喹唑啉衍生物(其中R1为(1-4C)烷氧基羰基取代基或包括(1-4C)烷氧基羰基的取代基)水解。
水解可以方便地实施,例如在碱性条件下。
(h)为了生成式II的那些化合物(其中R1为氨基-,氧-,硫-或氰基-取代的(1-4C)烷基取代基),优选在存在上文定义的合适的碱下,式II的喹唑啉衍生物(其中R1为带上文定义的可置换基团的(1-4C)烷基取代基)与适宜的胺,醇,硫醇或氰化物反应。
反应优选在上文定义的合适的惰性溶剂或稀释剂中及在例如10°至100℃范围中的温度(方便地是在环境温度或附近)中进行。
当需要式II的喹唑啉衍生物的药学可接受盐时,可以例如使用常规规程通过所述化合物与例如合适的酸反应来获得。
在一个具体的实施方案中,EGFR拮抗剂为依照US 5,770,599(通过述及收入本文)中所记载的式II’的化合物:
其中:
n为1,2或3;
每个R2独立地为卤素或三氟甲基;
R3为(1-4C)烷氧基;且
R1为二-[(1-4C)烷基]氨基-(2-4C)烷氧基,吡咯烷-1-基-(2-4C)烷氧基,哌啶子基-(2-4C)烷氧基,吗啉代-(2-4C)烷氧基,哌嗪-1-基-(2-4C)烷氧基,4-(1-4C)烷基哌嗪-1-基-(2-4C)烷氧基,咪唑-1-基-(2-4C)烷氧基,二-[(1-4C)烷氧基-(2-4C)烃基]氨基-(2-4C)烷氧基,硫代吗啉代-(2-4C)烷氧基,1-氧硫代吗啉代-(2-4C)烷氧基或1,1-二氧代硫吗啉代-(2-4C)烷氧基,且其中包含不连接于N或O原子的CH2(亚甲基)基团的任何上述R1取代基任选在所述CH2基团上带羟基取代基;
或其药学可接受盐。
在一个具体的实施方案中,EGFR拮抗剂为选自下组的依照式II’的化合物:4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-喹唑啉;4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(2-吗啉代乙氧基)-喹唑啉;4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-6-(3-二乙基氨基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉;4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)-喹唑啉;4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-6-(3-二甲基氨基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉;4-(3’,4’-二氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)-喹唑啉;4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-哌啶子基丙氧基)-喹唑啉;4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)-喹唑啉;4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-6-(2-二甲基氨基乙氧基)-7-甲氧基喹唑啉;4-(2’,4’-二氟苯胺基)-6-(3-二甲基氨基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉;4-(2’,4’-二氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)-喹唑啉;4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-6-(2-咪唑-1-基乙氧基)-7-甲氧基喹唑啉;4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-6-(3-咪唑-1-基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉;4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-6-(2-二甲基氨基乙氧基)-7-甲氧基喹唑啉;4-(2’,4’-二氟苯胺基)-6-(3-二甲基氨基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉;4-(2’,4’-二氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)-喹唑啉;4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-6-(2-咪唑-1-基乙氧基)-7-甲氧基喹唑啉;和4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-6-(3-咪唑-1-基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉。
在一个具体的实施方案中,EGFR拮抗剂为依照式II’的化合物,即4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)-喹唑啉,或者称作ZD 1839,Gefitinib和
式II’的喹唑啉衍生物或其药学可接受盐可以通过已知适用于化学相关化合物的制备的任何工艺来制备。合适的工艺包括例如,US5616582,US5580870,US 5475001和US5569658中例示的那些。除非另有说明,n,R2,R3和R1具有上文为式II’的喹唑啉衍生物定义的任何含义。必需的起始材料可以是商品化的或通过有机化学的标准规程获得的。
(a)喹唑啉(iii)(其中Z为可置换基团)与苯胺(iv)的反应,方便的是在存在合适的碱下
合适的可置换基团Z是例如卤素,烷氧基,芳基氧基或磺酰基氧基团,例如氯,溴,甲氧基,苯氧基,甲磺酰基氧或甲苯-4-磺酰基氧基团。
合适的碱是例如有机胺碱,诸如例如吡啶,2,6-卢剔啶,可力丁,4-二甲基氨基吡啶,三乙胺,吗啉,N-甲基吗啉或二氮双环[5.4.0]十一-7-烯,或例如碱金属或碱土金属碳酸盐或氢氧化物,例如碳酸钠,碳酸钾,碳酸钙,氢氧化钠或氢氧化钾。或者,合适的碱是例如碱金属或碱土金属酰胺,例如氨基钠或双(三甲基甲硅烷基)氨基钠。
优选在存在合适的惰性溶剂或稀释剂下进行反应,例如链醇或酯诸如甲醇,乙醇,异丙醇或乙酸乙酯,卤化溶剂诸如二氯甲烷,氯仿或四氯化碳,醚诸如四氢呋喃或1,4-二烷,芳香族溶剂诸如甲苯,偶极非质子溶剂诸如N,N-二甲基甲酰胺,N,N-二甲基乙酰胺,N-甲基吡咯烷-2-酮或二甲基亚砜。方便地在例如10°至150℃范围中的,优选在20°至80℃范围中的温度进行反应。
式II’的喹唑啉衍生物可以以游离碱的形式得自此工艺,或者可以用式H-Z的酸获得盐的形式,其中Z具有上文定义的含义。当希望自盐获得游离碱时,可以使用常规规程用上文定义的合适的碱处理盐。
(b)为了生成式II’的那些化合物(其中R1为氨基-取代的(2-4C)烷氧基),式II’的喹唑啉衍生物(其中R1为羟基)烷基化,方便地是在存在上文定义的合适的碱下。
合适的烷基化剂是例如本领域已知用于羟基烷基化成氨基-取代的烷氧基的任何试剂,例如氨基-取代的烃基卤化物,例如氨基-取代的(2-4C)烃基氯化物,溴化物或碘化物,在存在上文定义的合适的碱下,在上文定义的合适的惰性溶剂或稀释剂中及在例如10°至140℃范围中的温度,方便地是在80℃或附近。
(c)为了生成式II’的那些化合物(其中R1为氨基取代的(2-4C)烷氧基),方便地是在存在上文定义的合适的碱的情况中,式II’的化合物(其中R1为羟基-(2-4C)烷氧基)或其反应性衍生物与适宜的胺反应。
式II’的化合物的合适的反应性衍生物(其中R1为羟基-(2-4C)烷氧基)为例如卤代或磺酰基氧基-(2-4C)烷氧基,诸如溴代或甲磺酰基氧基-(2-4C)烷氧基。
反应优选在存在上文定义的合适的惰性溶剂或稀释剂的情况中及在例如10°至150℃范围中的温度(方便地是在50℃或附近)中进行。
(d)为了生成式II’的那些化合物(其中R1为羟基-氨基-(2-4C)烷氧基),式II’的化合物(其中R1为2,3-环氧丙氧基或3,4-环氧丁氧基)与适宜的胺反应。
反应优选在存在上文定义的合适的惰性溶剂或稀释剂的情况中及在例如10°至150℃范围中的温度(方便地是在70℃或附近)中进行。
当需要式II’的喹唑啉衍生物的药学可接受盐,例如式II’的喹唑啉衍生物的单或双酸加成盐时,可以例如使用常规规程通过所述化合物与例如合适的酸反应来获得。
在一个具体的实施方案中,EGFR拮抗剂是依照如WO9935146(通过述及收入本文)中所披露的式III的化合物或其盐或溶剂化物:
III
其中
X为N或CH;
Y为CR1且V为N;
或者Y为N且V为CR1;
或者Y为CR1且V为CR2;
或者Y为CR2且V为CR1;
R1代表基团CH3SO2CH2CH2NHCH2-Ar-,其中Ar选自苯基,呋喃,噻吩,吡咯和噻唑,其中每项可以任选是被一个或两个卤素,C1-4烃基或C1-4烷氧基取代的;
R2选自包含下述各项的组:氢,卤素,羟基,C1-4烃基,C1-4烷氧基,C1-4烃基氨基和二[C1-4烃基]氨基;
U代表苯基,吡啶基,3H-咪唑基,吲哚基,异吲哚基,二氢吲哚基,异二氢吲哚基,1H-吲唑基,2,3-二氢-1H-吲唑基,1H-苯并咪唑基,2,3-二氢-1H-苯并咪唑基或1H-苯并***基,其是被R3基团取代的且任选是被至少一个独立选择的R4基团取代的;
R3选自包含下述各项的组:苄基,卤代-,二卤代-和三卤代苄基,苯甲酰基,吡啶基甲基,吡啶基甲氧基,苯氧基,苄基氧基,卤代-,二卤代-和三卤代苄基氧基和苯磺酰基;或者R3代表三卤代甲基苄基或三卤代甲基苄基氧基;
或者R3代表下式的基团
其中每个R5独立地选自卤素,C1-4烃基和C1-4烷氧基;且n为0-3;且
每个R4独立地为羟基,卤素,C1-4烃基,C2-4烯基,C2-4炔基,C1-4烷氧基,氨基,C1-4烃基氨基,二[C1-4烃基]氨基,C1-4烃基硫基,C1-4烃基亚磺酰基,C1-4烃基磺酰基,C1-4烃基羰基,羧基,氨甲酰基,C1-4烷氧基羰基,C1-4烷酰基氨基,N-(C1-4烃基)氨甲酰基,N,N-二(C1-4烃基)氨甲酰基,氰基,硝基和三氟甲基。
在一个具体的实施方案中,式III的EGFR拮抗剂排除:(1-苄基-1H-吲唑-5-基)-(6-(5-((2-甲磺酰基-乙基氨基)-甲基)-呋喃-2-基)-吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基-胺;(4-苄基氧基-苯基)-(6-(5-((2-甲磺酰基-乙基氨基)-甲基)-呋喃-2-基)-吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基-胺;(1-苄基-1H-吲唑-5-基)-(6-(5-((2-甲磺酰基-乙基氨基)-甲基)-呋喃-2-基)-喹唑啉-4-基-胺;(1-苄基 H-吲唑-5-基)-(7-(5-((2-甲磺酰基-乙基氨基)-甲基)-呋喃-2-基)-喹唑啉-4-基-胺;和(1-苄基-1H-吲唑-5-基)-(6-(5-((2-甲磺酰基-乙基氨基)-甲基)-1-甲基-吡咯-2-基)-喹唑啉-4-基-胺。
在一个具体的实施方案中,式III的EGFR拮抗剂选自下组:4-(4-氟苄基氧基)-苯基)-(6-(5-((2-甲磺酰基-乙基氨基)甲基)-呋喃-2-基)-吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基)-胺;(4-(3-氟苄基氧基)-苯基)-(6-(5-((2-甲磺酰基-乙基氨基)甲基)呋喃-2-基)-吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基)-胺;(4-苯磺酰基-苯基)-(6-(5-((2-甲磺酰基-乙基氨基)-甲基)-呋喃-2-基)-吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基)-胺;(4-苄基氧基-苯基)-(6-(3-((2-甲磺酰基-乙基氨基)-甲基)-苯基)-吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基)-胺;(4-苄基氧基-苯基)-(6-(5-((2-甲磺酰基-乙基氨基)-甲基)-呋喃-2-基)喹唑啉-4-基)-胺;(4-(3-氟苄基氧基-苯基)-(6-(4-((2-甲磺酰基-乙基氨基)-甲基)-呋喃-2-基)-吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基)-胺;(4-苄基氧基-苯基)-(6-(2-((2-甲磺酰基乙基氨基)-甲基)-噻唑-4-基)喹唑啉-4-基)-胺;N-{4-[(3-氟苄基)氧基]苯基}-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺;N-{4-[(3-氟苄基)氧基]-3-甲氧基苯基}-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺;N-[4-(苄基氧基)苯基]-7-甲氧基-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺;N-[4-(苄基氧基)苯基]-6-[4-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺;N-{4-[(3-氟苄基)氧基]-3-甲氧基苯基}-6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-1,3-噻唑-4-基]-4-喹唑啉胺;N-{4-[(3-溴苄基)氧基]苯基}-6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-1,3-噻唑-4-基]-4-喹唑啉胺;N-{4-[(3-氟苄基)氧基]苯基)-6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)1,3-噻唑-4-基]-4-喹唑啉胺;N-[4-(苄基氧基)-3-氟苯基]-6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-1,3-噻唑-4-基]-4-喹唑啉胺;N-(1-苄基-1H-吲唑-5-基)-7-甲氧基-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺;6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-2-呋喃基]-N-(4-{[3-(三氟甲基)苄基]氧)苯基)-4-喹唑啉胺;N-{3-氟-4-[(3-氟苄基)氧基]苯基}-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺;N-{4-[(3-溴苄基)氧基]苯基)-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺;N-[4-(苄基氧基)苯基]-6-[3-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺;N-[1-(3-氟苄基)-1H-吲唑-5-基]-6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-1,3-噻唑-4-基]-4-喹唑啉胺;6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-2-呋喃基]-N-[4-(苯磺酰基)苯基]-4-喹唑啉胺;6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-1,3-噻唑-4-基]-N-[4-(苯磺酰基)苯基]-4-喹唑啉胺;6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-1,3-噻唑-4-基]-N-(4-{[3-(三氟甲基)苄基]氧)苯基)-4-喹唑啉胺;N-{3-氟-4-[(3-氟苄基)氧基]苯基)-6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-1,3-噻唑-4-基]-4-喹唑啉胺;N-(1-苄基-1H-吲唑-5-基)-6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-1,3-噻唑-4-基]-4-喹唑啉胺;N-(3-氟-4-苄基氧基苯基)-6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-1,3-噻唑-4-基]-4-喹唑啉胺;N-(3-氯-4-苄基氧基苯基)-6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-1,3-噻唑-4-基]-4-喹唑啉胺;N-{3-氯-4-[(3-氟苄基)氧基]苯基}-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺;6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-2-呋喃基]-7-甲氧基-N-(4-苯磺酰基)苯基-4-喹唑啉胺;N-[4-(苄基氧基)苯基]-7-氟-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺;N-(1-苄基-1H-吲唑-5-基)-7-氟-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺;N-[4-(苯磺酰基)苯基]-7-氟-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺;N-(3-三氟甲基-4-苄基氧基苯基)-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-4-呋喃基]-4-喹唑啉胺;及其盐和溶剂化物。
在一个具体的实施方案中,EGFR拮抗剂为:N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6-[5-[[[2-(甲磺酰基)乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺二甲苯磺酸盐(lapatinib)。
在一个具体的实施方案中,EGFR拮抗剂是依照如WO0132651(通过述及收入本文)中所披露的式IV的化合物或其盐:
其中:
m为1-3的整数;
R1代表卤素或C1-3烃基;
X1代表-O-;
R2选自下述三组之一:
1)C1-5烃基R3(其中R3为哌啶-4-基,其可带有一个或两个选自羟基,卤素,C1-4烃基,C1-4羟基烃基和C1-4烷氧基的取代基;
2)C2-5烯基R3(其中R3如本文中所定义的);
3)C2-5炔基R3(其中R3如本文中所定义的),
且其中任何烃基,烯基或炔基可带有一个或多个选自羟基,卤素和氨基的取代基。
在一个具体的实施方案中,EGFR拮抗剂选自下组:4-(4-氯-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉;4-(2-氟-4-甲基苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉;4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉;-(4-氯-2,6-二氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉;4-(4-溴-2,6-二氟苯胺基)-6-甲氧基-7(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉;4-(4-氯-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉;4-(2-氟-4-甲基苯胺基)-6-甲氧基-7-(哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉;4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉;4-(4-氯-2,6-二氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉;4-(4-溴-2,6-二氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉;及其药学可接受盐和溶剂化物。
在一个具体的实施方案中,EGFR拮抗剂为4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(Zactima)及其盐。
联合疗法
本发明的特色在于c-met拮抗剂和EGFR拮抗剂的组合使用,作为旨在自这些治疗剂的组合活性提供有益效应的特定治疗方案的一部分。组合的有益效应包括但不限于源自治疗剂组合的药动学或药效学共同作用(co-action)。本发明在治疗各种阶段的、各种类型的癌症中特别有用。
术语癌症涵盖增殖性病症的集合,包括但不限于癌前生长、良性肿瘤、和恶性肿瘤。良性肿瘤仍然局限于起源部位且没有能力渗透、侵入、或转移至远端部位。恶性肿瘤会侵入并损害它们周围的其它组织。它们还能获得脱离起源部位并传播至身体其它部分(转移)(通常经由血流或在***所处位置经由淋巴***)的能力。原发性肿瘤以发生它们的组织类型来分类;转移性肿瘤以衍生癌细胞的组织类型来分类。随着时间消逝,恶性肿瘤的细胞变得越来越异常,而且表现出更不像正常细胞。癌细胞外观的这种变化称作肿瘤等级(tumor grade),而且将癌细胞描述为完全分化的(well-differentiated)(低级)、中度分化的(moderately-differentiated)、不良分化的(poorly-differentiated)、或未分化的(undifferentiated)(高级)。完全分化的细胞相当正常,表现为和类似它们起源的正常细胞。未分化的细胞指已经变得如此异常以致于不再可能确定其起源的细胞。
癌症分期***描述癌症在解剖学上已经传播了多远,而且试图将具有相似预后和处理的患者置于相同分期组中。可实施数项测试来帮助癌症分期,包括活检和某些影像检测诸如胸部x-射线、***x射线照片、骨扫描、CT扫描、和MRI扫描。验血和临床评估也用于评估患者的整体健康和检测癌症是否已经传播至某些器官。
为了对癌症分期,美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer)首先使用TNM分类***将癌症(特别是实体瘤)置于字母分类中。给癌症指派字母T(肿瘤大小)、N(可触知的结节)、和/或M(转移)。T1、T2、T3、和T4描述渐增的原发性病灶尺寸;N0、N1、N2、N3指示渐进发展中的结节累及;而M0和M1反映远端转移的存在与否。
在第二种分期方法中,也称作整体阶段分组(Overall Stage Grouping)或罗马数字分期(Roman Numeral Staging),将癌症分成0期至IV期,掺入了原发性病症的尺寸以及结节传播和远端转移的存在。在这种***中,将癌症分组成四期,以罗马数字I至IV表示,或者归类为“复发”。对于有些癌症,0期称作“原位”或“Tis”,诸如乳腺癌的原位导管癌或原位小叶癌。高级腺瘤也可归类为0期。一般而言,I期癌症是小的局限性癌症,其通常是可治愈的,而IV期通常代表不能手术治疗的或转移性的癌症。II期和III期癌症通常是局部高级的和/或展现出涉及局部***。一般而言,较高期数指示更严重的(extensive)疾病,包括更大的肿瘤尺寸和/或癌症传播至邻近原发性肿瘤的附近***和/或器官。这些阶段有精确定义,但是定义对每一种癌症是不同的,而且是熟练技术人员已知的。
许多癌症登记诸如NCI的“监视流行病学和最终结果程序”(Surveillance,Epidemiology,and End Results Program)(SEER)使用概括分期(summary staging)。这种***用于所有类型的癌症。它将癌症病历分成五大类:
“原位”指只存在于它开始的细胞层中的早期癌症。
“局限性的”指癌症限于它开始的器官,没有传播的证据。
“区域性的”指癌症已经传播超出起源(原发性)部位至附近的***或器官和组织。
“远端的”指癌症自原发性部位传播至远端器官或远端***。
“未知的”用于描述没有足够信息来指明阶段的情况。
另外,癌症在原发性肿瘤被清除后几个月或几年复现是常见的。在所有可见的肿瘤都被根除后复现的癌症称作复发性疾病。在原发性肿瘤的区域中复现的疾病是局部复发的,而作为转移复现的疾病称作远端复发。
肿瘤可以是实体瘤或者是非实体瘤或软组织肿瘤。软组织肿瘤的例子包括白血病(例如慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia)、急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia)、成人急性成淋巴细胞性白血病(adult acute lymphoblastic leukemia)、急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia)、成熟B细胞急性成淋巴细胞性白血病(mature B-cell acute lymphoblastic leukemia)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia)、多形核细胞性白血病(polymphocytic leukemia)、或毛细胞性白血病(hairy cell leukemia))或淋巴瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、或何杰金氏病(Hodgkin’s disease))。实体瘤包括血液、骨髓、或淋巴***以外的身体组织的任何癌症。实体瘤可进一步分成上皮细胞起源的那些和非上皮细胞起源的那些。上皮细胞实体瘤的例子包括胃肠道、结肠、乳腺、***、肺、肾、肝、胰腺、卵巢、头和颈、口腔、胃、十二指肠、小肠、大肠、***、胆囊、唇(labium)、鼻咽、皮肤、子宫、***官、泌尿器官、膀胱、和皮肤的肿瘤。非上皮起源的实体瘤包括肉瘤、脑瘤、和骨瘤。
在一些实施方案中,本文中的患者进行诊断测试,例如在治疗之前和/或期间和/或之后。一般而言,如果进行断测试,那么可以从需要治疗的患者获得样品。若受试者患有癌症,则样品可以是肿瘤样品或其它生物学样品,诸如生物学流体,包括但不限于血液、尿液、唾液、腹水或衍生物诸如血清和血浆等等。
本文中的生物学样品可以是固定的样品,例如***固定、石蜡包埋的(FFPE)样品,或者是冷冻的样品。
用于测定mRNA或蛋白质表达的方法有多种,包括但不限于基因表达概况分析、聚合酶链式反应(PCR)包括定量实时PCR(qRT-PCR)、微阵列分析、基因表达系列分析(serial analysis of gene expression,SAGE)、MassARRAY、通过大量平行签名测序(Massive Parallel Signiture Sequencing,MPSS)进行的基因表达分析、蛋白质组学、免疫组化(IHC)等。优选对mRNA定量。所述mRNA分析优选使用聚合酶链式反应(PCR)技术或通过微阵列分析来进行。若采用PCR,则优选的PCR形式是定量实时PCR(qRT-PCR)。在一个实施方案中,如果上文提到的一种或多种基因的表达处于中值或高于中值,例如与相同肿瘤类型的其它样品相比,那么认为是阳性表达。可以在与基因表达的测量基本上同时测定中值表达水平,或者可以事先测定。
多篇已发表的期刊论文(例如Godfrey等,J.Molec.Diagnostics 2:84-91(2000);Specht等,Am.J.Pathol.158:419-29(2001))中给出了使用固定的、石蜡包埋的组织作为RNA来源的代表性基因表达概况分析方案的步骤:包括mRNA分离、纯化、引物延伸和扩增。简单的说,一种代表性方法首先将石蜡包埋肿瘤织样品切成约10微米厚的切片。然后提取RNA并除去蛋白质和DNA。分析RNA浓度后,如果需要可以包括RNA修复和/或扩增步骤,并使用基因特异性启动子逆转录RNA,然后PCR。最后分析数据,根据所检验肿瘤样品中鉴定的特征性基因表达模式来确定患者可用的最佳治疗选项。
可以直接地或间接地测定基因或蛋白质表达的检测。
可以(直接地或间接地)测定癌症中的c-met和/或EGFR表达或扩增。多种诊断/预后测定法可用于此目的。在一个实施方案中,可通过IHC来分析c-met和/或EGFR过表达。可将来自肿瘤活检的石蜡包埋组织切片进行IHC测定法并对照如下c-met和/或EGFR蛋白质染色强度标准:
得分0:未观察到染色或者在少于10%的肿瘤细胞中观察到膜染色。
得分1+:在超过10%的肿瘤细胞中检测到微弱的/刚刚可察觉的膜染色。所述细胞只在其部分膜中有染色。
得分2+:在超过10%的肿瘤细胞中观察到微弱至中等的完全膜染色。
得分3+:在超过10%的肿瘤细胞中观察到中等至强烈的完全膜染色。
在一些实施方案中,那些c-met和/或EGFR过表达评估得分为0或1+的肿瘤可表征为c-met和/或EGFR未过表达,而那些得分为2+或3+的肿瘤可表征为c-met和/或EGFR过表达。
在一些实施方案中,c-met和/或EGFR过表达的肿瘤可根据对应于每个细胞表达的c-met和/或EGFR分子拷贝数的免疫组化得分进行定级,并且可通过生化方法测定:
0=0-10,000个拷贝/细胞,
1+=至少约200,000个拷贝/细胞,
2+=至少约500,000个拷贝/细胞,
3+=至少约2,000,000个拷贝/细胞。
或者/另外,可对***固定、石蜡包埋的肿瘤组织进行FISH测定法以测定肿瘤中c-met和/或EGFR扩增的程度(如果有的话)。
可以直接地(例如通过磷酸ELISA测试,或其它检测磷酸化受体的手段)间接地(例如通过检测活化的下游信号传导途径成分,检测受体二聚体(例如同二聚体,异二聚体),检测基因表达序型等等)测定c-met或EGFR活化。
类似地,可以直接地或间接地(例如通过检测与组成性活性有关的受体突变,检测与组成性活性有关的受体扩增等等)检测c-met或EGFR组成性活化或不依赖配体的EGFR或c-met的存在。
检测核酸突变的方法是本领域公知的。通常而非必需的是,扩增样品中的靶核酸以提供所希望的材料量,来确定是否存在突变。扩增技术是本领域公知的。例如,扩增产物可以涵盖或不涵盖所有编码感兴趣的蛋白质的核酸序列,只要该扩增产物包含怀疑突变所在的特定氨基酸/核酸序列位置。
在一个实施例中,通过将来自样品的核酸与能够与编码突变核酸的核酸特异性杂交的核酸探针接触,并检测所述杂交,由此确定突变的存在。在一个实施方案中,标记探针成可检测的,例如用放射性同位素(3H、32P、33P等)、荧光剂(若丹明、荧光素等)或发色剂标记。在有些实施方案中,探针是反义寡聚物,例如PNA、吗啉代-氨基磷酸酯、LNA或2’-烷氧基烷氧基。探针可以有约8个核苷酸至约100个核苷酸、或约10个至约75个、或约15个至约50个、或约20个至约30个。在另一个方面,本发明的核酸探针在试剂盒中提供,用以鉴定样品中的c-met突变,所述试剂盒包含特异杂交于或临近于编码c-met的核酸中的突变位点的寡核苷酸。试剂盒可进一步包括说明根据使用试剂盒的杂交测试的结果,用c-met拮抗剂治疗患包含c-met突变的肿瘤患者的说明书。
也可通过比较扩增的核酸的电泳迁移率和相应编码野生型c-met的核酸的电泳迁移率,由此来检测突变。迁移率差异表明扩增的核酸序列中存在突变。可通过任何合适的分子分离技术,例如在聚丙烯酰胺凝胶上,来确定电泳迁移率。
利用酶突变检测(EMD),也可分析核酸来检测突变(Del Tito et al.,Clinical Chemistry 44,731-739,1998)。EMD使用噬菌体解离酶T4内切核酸酶VII,其扫描双链DNA直到它检测并裂解了由碱基对错配造成的结构变形,所述错配由核酸改变诸如点突变、***和缺失造成。例如通过凝胶电泳,检测到两个由解离酶裂解形成的短片段,表明存在突变。EMD方法的益处是以单个方案直接从扩增反应中鉴定出所检验的点突变、缺失、和***,不需要纯化样品,缩短了杂交时间,并提高了信噪比。包含比正常至多过量20倍的核酸的混合样品和大小至多4kb的片段可进行测试。可是,EMD扫描不能鉴定在突变阳性样品中发生的特定碱基改变,所以如果需要,通常要额外的测序规程来鉴定特定的突变。如美国专利No.5,869,245所证实的,相似地可用CEL I酶替代解离酶T4内切核酸酶VII。
另一种用于检测突变的简单试剂盒是反向杂交测试条,其与用于检测HFE、TFR2和FPN1基因中造成血色病的多重突变的血色病StripAssayTM(Viennalabs http://www.bamburghmarrsh.com/pdf/4220.pdf)相似。这种测试基于PCR扩增后的序列特异性杂交。对于单突变测试,可使用基于微板的检测***,而对于多重突变测试,可使用测试条作为“宏阵列”。试剂盒可包括可供样品制备、扩增和突变检测即时使用的试剂。多重扩增方案提供了便利,并允许以非常有限的体积来测试样品。利用直接StripAssay形式,可以在不超过5小时内完成二十个及更多突变的测试,而无需昂贵设备。从样品中分离DNA并体外扩增靶核酸(例如通过PCR),并用生物素标记,一般可在单个(“多重”)扩增反应中进行。然后,扩增产物选择性地与固定在诸如测试条的固体支持物上的寡核苷酸探针(野生型和突变体特异的)杂交,其中探针固定为平行线或条带。利用链霉亲合素-碱性磷酸酶和有色底物,来检测结合的生物素化的扩增子。这样的测试能检测本发明的所有突变或其任意子集。对于特定的突变体探针条带,三种信号传导模式之一是有可能的:(i)仅针对野生型探针的条带,表明是正常的核酸序列,(ii)针对野生型和突变体探针的条带,表明是杂合基因型和(iii)仅针对突变体探针的条带,表明是纯合突变体基因型。因此,在一个方面,本发明提供了检测本发明突变的方法,其包括从样品中分离和/或扩增靶c-met核酸序列,使得扩增产物包含配体,使扩增产物与包含该配体的可检测结合配偶体的探针接触,而且该探针能够与本发明的突变特异性杂交,然后测所述探针与所述扩增产物的杂交。在一个实施方案中,配体是生物素,而结合配偶体包括亲合素或链霉亲合素。在一个实施方案中,结合配偶体包括链霉亲合素-碱性磷酸酶,其可用有色底物检测。在一个实施方案中,探针固定于例如测试条上,其中与不同突变互补的探针彼此分开。可选地,扩增的核酸用放射性同位素标记,在该情况中,探针不必包含可检测标记物。
野生型基因的改变涵盖所有形式的突变,诸如***、倒位、缺失、和/或点突变。在一个实施方案中,突变是体细胞的。体细胞突变是仅发生于某些组织中(例如在肿瘤组织中)且不在种系中遗传的那些。种系突变可以在任何身体组织中找到。
包含靶核酸的样品可通过本领域公知的方法获得,而且它们适于特定类型和位置的肿瘤。组织活检通常用于获得有代表性的肿瘤组织片。可选地,可以已知或认为包含感兴趣的肿瘤细胞的组织/流体的形式间接获取肿瘤细胞。例如,肺癌损伤的样品可通过切除术、支气管镜检、细针抽吸、支气管刷检、或从痰/唾液、胸膜液或血液中获得。可从肿瘤或从其它身体样品诸如尿、痰或血清中检测出突变的基因或基因产物。上述用于检测肿瘤样品中突变的靶基因或基因产物的同样技术可用于其它身体样品。癌细胞从肿瘤上脱落下来,并出现在这些身体样品中。通过筛选这些身体样品,可实现对于诸如癌的疾病的简单早期诊断。另外,通过对这些身体样品测试突变的靶基因或基因产物,可监测治疗的进程。
对组织制备物富集肿瘤细胞的手段是本领域已知的。例如,可以从石蜡或低温保存的切片中分离组织。癌细胞也可通过流式细胞术或激光捕捉显微解剖而与正常细胞分开。这些以及其它从正常细胞中分离肿瘤的技术是本领域公知的。如果肿瘤组织被正常细胞高度污染,那么检测突变可能较为困难,然而最小化污染和/或假阳/阴性结果的技术是已知的,其中一些在下文有描述。例如,也可以对样品评估生物标志物(包括突变)的存在情况,所述标志物已知与感兴趣的肿瘤细胞有关而与相应的正常细胞无关,反之亦然。
可通过用本领域公知的技术来分子克隆靶核酸并测序该核酸,由此来完成靶核酸中点突变的检测。可选地,诸如聚合酶链式反应(PCR)的扩增技术可用于直接从肿瘤组织的基因组DNA制备物中扩增出靶核酸序列。然后确定扩增序列的核酸序列并鉴定其突变。扩增技术是本领域公知的,例如描述于Saiki et al.,Science,239,487,1988;美国专利No.4,683,203和4,683,195中的聚合酶链式反应。
应当注意,设计并选择合适的引物是非常成熟的现有技术。
本领域已知的连接酶链式反应也可用于扩增靶核酸序列。参见例如Wu et al.,Genomics,4,560-569,1989。另外,称为等位基因特异性PCR的技术也可使用。参见例如Ruano和Kidd,Nucleic Acids Research,17,8392,1989。根据该技术,使用的引物在其3’端与特定靶核酸突变杂交。如果不存在特定的突变,那么不会观察到扩增产物。也可以使用耐扩增突变***(ARMS),其如欧洲专利申请公开第0332435号和Newton et al.,Nucleic Acids Research,17,7,1989所公开的。基因的***和缺失也可通过克隆、测序和扩增来检测。另外,基因或周围标志基因的限制性片段长度多态性(RFLP)探针可用于对等位基因的改变或多态性片段的***来评分。也可用单链构象多态性(SSCP)分析来检测等位基因的碱基变化变体。参见例如Orita et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,2766-2770,1989和Genomics,5,874-879,1989。也可用其它用于检测***和缺失的本领域已知技术。
根据基因野生型表达产物的改变,也可检测野生型基因的改变。这些表达产物包括mRNA以及蛋白质产物。通过扩增和测序mRNA或由mRNA分子克隆制备的cDNA,来检测点突变。利用本领域公知的DNA测序技术,来确定克隆的cDNA的序列。cDNA也可以通过聚合酶链式反应(PCR)来测序。
错配是并不100%互补的杂交核酸双链。缺乏完全的互补性可以是因为缺失、***、倒位、替代或移码突变造成的。可用错配检测来检测靶核酸中的点突变。尽管这些技术可能不如测序灵敏,然而对大量组织样品来说更容易实施。错配裂解技术的实例是RNA酶保护方法,其在Winter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,7575,1985和Meyers et al.,Science,230,1242,1985中有详细描述。例如,本发明的方法可包括使用标记的核糖核酸探针,其与人野生型靶核酸互补。衍生自组织样品的核糖核酸探针和靶核酸在一起退火(杂交),然后用RNA酶A消化,其能够检测双链RNA结构中的一些错配。如果RNA酶A检测到错配,那么它在错配位点裂解。因此,当在电泳凝胶基质上分离退火的RNA制备物时,如果RNA酶A检测到错配并裂解,那么将见到比核糖核酸探针与mRNA或DNA的全长双链RNA小的RNA产物。考虑到它涵盖了怀疑突变了的位置,核糖核酸探针不需要是全长的靶核酸mRNA或基因,但可以是靶核酸的一部分。如果核糖核酸探针仅包含靶核酸mRNA或基因的一个区段,如果希望,那么可能希望使用大量这些探针来筛选整个靶核酸序列的错配。
以相似的方式,可用DNA探针检测错配,例如通过酶或化学裂解进行。参见例如Cotton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,4397,1988;和Shenk et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,72,989,1975。可选地,通过错配双链体相对于匹配双链体的电泳迁移率变化,可检测错配。参见例如Cariello,Human Genetics,42,726,1988。用核糖核酸探针或DNA探针,可以在杂交前扩增可能包含突变的靶核酸mRNA或DNA。尤其是如果改变是总的重排,诸如缺失和***,那么利用Southern杂交也可检测靶核酸DNA中的改变。
扩增出的靶核酸DNA序列也可用等位基因特异性探针筛选。这些探针是核酸寡聚物,每一个都包含靶核酸基因中包含已知突变的区域。例如,一个寡聚物的长度可以为约30个核苷酸,对应于部分靶基因序列。通过使用一组这样的等位基因特异性探针,可筛选靶核酸扩增产物,以鉴定靶基因中以前鉴定出的突变的存在。可以例如在尼龙膜上进行扩增的靶核酸序列与等位基因特异性探针的杂交。在严格杂交条件下与特定探针的杂交表明肿瘤组织中存在与等位基因特异性探针中相同的突变。
通过筛选相应野生型蛋白的改变,可检测野生型靶基因的改变。例如,与靶基因产物有免疫反应性的单克隆抗体可用于筛选组织,例如用已知与基因产物(蛋白质)的特定突变位置结合的抗体。例如,所用的抗体可以是结合缺失的外显子(例如外显子14)的抗体或结合包含靶蛋白缺失部分的构象表位的抗体。缺少关联抗原将表示有突变。突变等位基因产物的特异性抗体也可用于检测突变基因产物。可以从噬菌体展示文库中鉴定抗体。这些免疫学测定法可以以本领域任何便利形式进行。这些包括Western印迹、免疫组织化学测定法和ELISA测定法。任何检测改变的蛋白质的方法都可用于检测野生型靶基因的改变。
利用核酸扩增技术,诸如聚合酶链式反应,引物对可用于确定靶核酸的核苷酸序列。单链DNA引物对可以与靶核酸序列之内或周围的序列退火,从而引发靶序列的扩增。也可使用等位基因特异性引物。该引物仅与特定的突变靶序列退火,因此仅在存在突变的靶序列作为模板的情况下才会扩增出产物。为了便于接下来克隆扩增的序列,引物可具有限制酶位点序列,该序列附加在这些引物的末端。这些酶和位点是本领域公知的。可以用本领域公知的技术来合成引物本身。一般而言,可用寡核苷酸合成仪制造引物,所述仪器可从商业渠道获得。设计特定引物完全在本领域技术范围内。
核酸探针可用于许多目的。它们可用于对基因组DNA的Southern杂交中,并可用于RNA酶保护方法中以检测上文已经讨论过的点突变。探针可用于检测靶核酸扩增产物。利用其它技术,它们也可用于检测野生型基因或mRNA的错配。利用酶(例如S1核酸酶)、化学药品(例如羟胺或四氧化锇和哌啶)、或错配杂交体相对于完全匹配杂交体的电泳迁移率变化,可检测错配。这些技术是本领域已知的。参见Novack et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,586,1986。一般而言,探针与激酶结构域外的序列互补。整组核酸探针可用于组成试剂盒来检测靶核酸中的突变。试剂盒容许进行对感兴趣的靶序列的大区域的杂交。探针可彼此交叠或毗邻。
如果用核糖核酸探针来检测mRNA的错配,那么它一般与靶基因的mRNA互补。因此,核糖核酸探针是反义探针,因为它不编码相应的基因产物,因为它与有义链互补。核糖核酸探针一般会用放射性、比色、或荧光材料来标记,这可以通过任何本领域已知方法来实现。如果用核糖核酸探针来检测DNA的错配,它可以是任一极性,即有义的或反义的。相似地,也可用DNA探针来检测错配。
在一些情况中,癌症过表达或不过表达c-met受体和/或EGFR。可在诊断或预后测定法中通过评估细胞表面上存在的受体蛋白质水平的升高(例如通过免疫组化测定法;IHC)来测定受体过表达。或者/另外,可测量细胞中编码受体的核酸的水平,例如通过荧光原位杂交(FISH;参见1998年10月公布的WO 98/45479)、Southern印迹或聚合酶链式反应(PCR)技术,诸如实时定量PCR(RT-PCR)。在上述测定法之外,熟练从业人员还可利用多种体内测定法。例如,可将患者身体内的细胞暴露于任选用可检测标记物例如放性位素标记的抗体,并且可评估该抗体对患者身体内细胞的结合,例如通过外部扫描放射性或通过分析取自事先已暴露于所述抗体的患者的活检。
化疗剂
本发明的联合疗法可进一步包含一种或多种化疗剂。组合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用或同时施用和任一次序的序贯施用,其中优选有一段时间所有活性剂同时发挥它们的生物学活性。
如果施用的话,由于药物的组合作用或可归于抗代谢物化疗剂施用的消极副作用,通常以关于它们已知的或任选降低的剂量施用化疗剂。可依照制造商的说明书或根据从业人员凭经验确定的那样使用此类化疗剂的制备和剂量给药日程。
上文公开了可组合的多种化疗剂。要组合的优选化疗剂选自下组:类紫杉醇(taxoid)(包括多西他塞(docctaxel)和帕利他塞(paclitaxel))、长***(vinca)(诸如长春瑞滨(vinorelbine)或长春碱(vinblastine))、铂化合物(诸如卡铂(carboplatin)或顺铂(cisplatin))、芳香酶抑制剂(诸如来曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrazole)、或依西美坦(exemestane))、抗***(例如氟维司群(fulvestrant)或他莫昔芬(tamoxifen))、依托泊苷(etoposide)、塞替哌(thiotepa)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、甲氨蝶呤(methotrexate)、脂质体多柔比星(liposomal doxorubicin)、PEG化脂质体多柔比星(pegylated liposomal doxorubicin)、卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib))、或蛋白体抑制剂(例如PS342)。
配制、剂量和施用
会以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用本发明中所使用的治疗剂。在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗具体受试者、患者个体的临床状况、病症的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排、要组合的药剂的药物-药物相互作用、和医学从业人员知道的其它因素。
使用本领域已知的标准方法通过将具有期望纯度的活性成分与任选的生理学可接受载体、赋形剂或稳定剂混合来制备治疗用配制剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences(第20版),A.Gennaro编,2000,Lippincott,Williams &Wilkins,Philadelphia,PA)。可接受的载体包括盐水,或缓冲剂,诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸;低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其它碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,诸如EDTA;糖醇,诸如甘露醇或山梨醇;成盐相反离子,诸如钠;和/或非离子表面活性剂,诸如TWEENTM、PLURONICSTM或PEG。
任选但优选的是,配制剂含有药学可接受盐,优选氯化钠,且优选大约为生理浓度。任选的是,本发明的配制剂可含有药学可接受防腐剂。在一些实施方案中,防腐剂的浓度范围为0.1-2.0%,典型的是v/v。合适的防腐剂包括药学领域已知的那些。苯甲醇、酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、和对羟基苯甲酸丙酯是优选的防腐剂。任选的是,本发明的配制剂可包括药学可接受表面活性剂,其浓度为0.005-0.02%。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物,优选活性互补且彼此没有不利影响的那些。合适的是,此类分子以对于预定目的有效的量组合。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物传递***中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences,见上文。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有本发明抗体的固体疏水性聚合物半透性基质,该基质以定型产品的形式存在,例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够持续释放分子100天以上,但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体在体内长时间保持时,它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集,导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计稳定化理性策略。例如,如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换而形成分子间S-S键,那么可通过修饰巯基残基、自酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂、和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。
依照已知方法给人类患者施用本发明的治疗剂,诸如静脉内施用(像推注或通过一段时间里的连续输注),通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面、或吸入路径。在VEGF拮抗剂的情况中,如果VEGF拮抗作用与广泛的副作用或毒性有关,那么局部施用是特别想要的。回体(ex vivo)策略也可用于治疗性应用。回体策略涉及用编码c-met或EGFR拮抗剂的多核苷酸转染或转导自受试者获得的细胞。然后将经过转染或转导的细胞返回受试者。细胞可以是极其多种类型之任一,包括但不限于造血细胞(例如,骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞、或B细胞)、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、或肌肉细胞。
例如,如果c-met或EGFR拮抗剂是抗体,那么通过任何合适手段施用抗体,包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、和鼻内,及(如果想要局部免疫抑制治疗的话)病灶内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。另外,合适的是,通过脉冲输注来施用抗体,特别是使用递减剂量的抗体。优选的是,通过注射给予剂量给药,最优选的是,通过静脉内或皮下注射给予剂量给药,这部分取决于施药是短期的还是长期的。
在另一个例子中,在病症或肿瘤位置允许时,局部施用c-met或EGFR拮抗性化合物,例如通过直接注射,而且可以周期性重复注射。也可以在手术切除肿瘤后***地/全身地将c-met或EGFR拮抗剂投递至受试者或直接投递至肿瘤细胞,例如肿瘤或肿瘤床,用以预防或降低局部复发或转移。
组合中的治疗剂的施用通常在规定的时间段里进行(通常是数分钟、数小时、数天或数周,这取决于所选择的组合)。联合疗法旨在涵盖这些治疗剂以序贯方式的施用(也就是说,其中在不同时间施用每一种治疗剂),以及这些治疗剂或治疗剂中至少两种以基本上同时的方式的施用。
可以通过相同路径或不同路径来施用治疗剂。例如,可以通过静脉内注射来施用组合中的EGFR或c-met拮抗剂,同时可以口服施用所述组合中的蛋白激酶抑制剂。或者,例如,可以口服施用这两种治疗剂,或者可以通过静脉内注射来施用这两种治疗剂,这取决于具体的治疗剂。治疗剂的施用次序也随着具体药剂而变化。
根据疾病的类型和严重程度,施用于患者的初始候选剂量是约1μg/kg至100mg/kg(例如0.1-20mg/kg)每种治疗剂,例如或是通过一次或多次分开施药或是通过连续输注。根据上文所述因素,典型日剂量的范围可以是约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于持续数天或更长的重复施药,根据状况,持续治疗直至根据上文所述方法的测量,癌症得到治疗。然而,其它剂量方案也可能是有用的。在一个例子中,如果c-met或EGFR拮抗剂是抗体,那么以范围为大约5mg/kg至大约15mg/kg的剂量每两至三周施用本发明的抗体。如果c-me或EGFR拮抗剂是口服小分子化合物,那么以范围为大约25mg/kg至大约50mg/kg的剂量每天施用药物。此外,本发明的口服化合物可以在传统的高剂量间歇方案下施用,或者使用没有安排中断的更低且更频繁的剂量(称作“节拍疗法”(metronomic therapy))来施用。在使用间歇方案时,例如,可以每天给予药物,持续2-3周,接着中断1周;或者,可以每天给予药物,持续4周,接着中断2周,这取决于日剂量和具体适应症。本发明疗法的进展易于通过常规技术和测定法来监测。
本申请涵盖通过基因疗法来施用c-met和/或EGFR拮抗剂。参见例如1996年3月14日公布的WO96/07321,其关注使用基因疗法来产生胞内抗体。
主要有两种方法使核酸(任选包含在载体中)进入患者的细胞,即体内(in vivo)和回体(ex vivo)。对于体内投递,通常在需要抗体的部位将核酸直接注射入患者。对于回体治疗,采集患者的细胞,将核酸导入这些分离的细胞,并将经过修饰的细胞直接施用于患者,或是例如装入多孔膜再植入患者(参见例如美国专利No.4,892,538和5,283,187)。有多种技术可用于将核酸导入活细胞。这些技术根据是将核酸转移至目的宿主的体外培养的细胞还是体内细胞而有所变化。适于在体外将核酸转移入哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的***(例如,可用于脂质介导的基因转移的脂质有DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行转染。在有些情况中希望与靶向靶细胞的药剂一起提供核酸来源,诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异性的抗体、针对靶细胞上受体的配体等。若采用脂质体,则可以使用与胞吞作用有关的细胞表面膜蛋白结合的蛋白质靶向和/或促进摄取,例如对特定细胞类型有向性的衣壳蛋白或其片段、针对在循环中经历内在化的蛋白质的抗体、和靶向胞内定位并延长胞内半衰期的蛋白质。受体介导的胞吞作用的术记载于例如Wu et al.,J.Biol.Chem.,262:4429-4432(1987)和Wagner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:3410-3414(1990)。关于当前已知的基因标记和基因治疗方案的综述参见Anderson et al.,Science,256:808-813(1992)。还可参见WO93/25673及其中引用的参考文献。
下面是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解,鉴于上文提供的一般描述,可以实施各种其它实施方案。
实施例
实施例1:对NSCLC细胞系和肿瘤样品中c-met和EGFR表达的分析。
材料和方法
微阵列研究。在Affymetrix(Santa Clara,CA)微阵列平台(HGU133Plus_2.0 chips)上使用自亚汇合的细胞培养物或冷冻的肿瘤溶胞物提取的RNA进行了NSCLC细胞系和原发性肿瘤的基础基因表达分析。互补RNA制备,阵列杂交和后续数据分析是使用制造商的方案进行的,基本上如Hoffman EP et al.,Nat Rev Genet 5:229-37(2004)中所记载的。
为了评估c-met表达与NSCLC标本中表达的其它受体酪氨酸激酶(RTK)的关联,使用变异滤器来排除在所分析的样品间具有最小变异的基因。具有最小表达的基因(那些样品间绝对变异(最大-最小)小于1000的)被排除在进一步的分析之外。另外,选择单一探针来代表基因。针对MET mRNA(探针ID,203510_at)或c-met蛋白质(IHC)为每种基因测定Spearman秩相关系数(ρ)。
定量PCR。使用标准Taqman技术通过定量RT-PCR评估了EGFR和MET mRNA表达水平。将转录物水平相对于持家基因核糖体蛋白L19(RPL19)标准化,并将结果表述成标准化表达值(=2-ΔCt)或相对于合并组织来源的标准化表达(=2-ΔΔCt)。利用了下列引物/探针集:
RPL19:正向引物,5’-ACCCCAATGAGACCAATGAAATC-3’(SEQ IDNO:26),
反向引物,5’-ATCTTTGATGAGCTTCCGGATCT-3’(SEQ ID NO:27),
探针,5’(VIC)-AATGCCAACTCCCGTCAG-(MGBNFQ)-3’(SEQ IDNO:28);
MET:正向引物,5’-CATTAAAGGAGACCTCACCATAGCTAAT-3’(SEQID NO:29),
反向引物,5’-CCTGATCGAGAAACCACAACCT-3’(SEQ ID NO:30),
探针,5’(FAM)-CATGAAGCGACCCTCTGATGTCCCA-(BHQ-1)-3’(SEQID NO:31)。EGFR的引物/探针集购自Applied Biosystems(产品目录号4331182,Hs00193306;Foster City,CA)。
免疫组织化学(IHC)。将***固定石蜡包埋的标本以5微米厚度切片到载玻片上。脱石蜡和再水合后,为了c-Met和EGFR IHC分析加工切片。用EGFR pharmDxTM试剂盒(Dako,Glostrup,Denmark)依照制造商的说明书实施EGFR IHC。为了c-met免疫组织化学(IHC),使用预加热的靶物修复缓冲液(Dako,Glostrup,Denmark)于99℃实施抗原修复40分钟,这是为了c-met IHC。用KPL封闭液(KPL,Gaithersburg,MD)于室温淬灭内源过氧化物酶活性4分钟。用Vector亲合素生物素封闭试剂盒(Vector Laboratories,Burlingame,CA)封闭内源亲合素/生物素。随后,将切片与10μg/ml小鼠抗c-met(克隆DL-21)单克隆抗体(Upstate Biotechnology Inc.Lake Placid,NY)一起在封闭血清中于室温温育60分钟,接着与生物素化马抗小鼠二抗一起温育30分钟。Vectastain ABC Elite试剂(Vector Laboratory,Burlingame,CA)及金属增强DAB(Pierce Biotechnology,Inc.Rockford,IL)来对载玻片显影。表达水平定义为阴性(-),弱(+),中等(++)或强(+++)。所含肿瘤细胞超过10%具有弱,中等,或强染色的细胞系或肿瘤标本视为阳性。
细胞培养和肿瘤样品。细胞系得自美国典型培养物保藏中心,NCI癌症治疗和诊断部门和日本健康科学资源保藏处,如表1所示。所有细胞系在补充有10%FBS(Sigma,St.Louis,MO)和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640中维持。肿瘤样品得自密歇根大学,Cybrdio,人类组织协作网络和整合实验室服务。
表1:实施例中所使用的细胞系
*美国典型培养物保藏中心
**日本健康科学资源
***国家癌症研究院癌症治疗和诊断部门
结果
在NSCLC细胞系中MET mRNA表达与EGFR mRNA表达相关。
为了评估在NSCLC细胞系中c-met表达是否与EGFR和其它受体酪氨酸激酶(RTK)的表达相关,自基于微阵列自表1所示50种NSCLC细胞系生成的基因表达数据确定Spearman秩相关系数。在细胞系(ρ=0.54,p<0.0001)中EGFR和MET mRNA水平正相关,而且EGFR表达与MET表达高度相关(表2)。
表2:NSCLC细胞系中RTK mRNA表达与MET mRNA表达的关联。
基因 | Spearman ρ | p-值(双尾) |
EPHA2 | 0.5516 | P<0.0001 |
EGFR | 0.5412 | P<0.0001 |
EPHB2 | 0.5169 | 0.0001 |
ROR1 | 0.5115 | 0.0001 |
MST1R | 0.4719 | 0.0005 |
EPHA1 | 0.4219 | 0.0023 |
EPHA4 | 0.4217 | 0.0023 |
ERBB3 | 0.3736 | 0.0075 |
DDR1 | 0.2985 | 0.0352 |
EPHB4 | 0.2751 | 0.0532 |
ERBB2 | 0.2533 | 0.0759 |
AXL | 0.2396 | 0.0938 |
STYK1 | 0.1389 | 0.336 |
EPHB6 | 0.1219 | 0.3989 |
KIT | 0.08365 | 0.5636 |
PDGFRB | 0.0557 | 0.7008 |
TEK | -0.009277 | 0.949 |
PDGFRA | -0.03757 | 0.7956 |
EPHA3 | -0.04528 | 0.7548 |
TYRO3 | -0.05786 | 0.6898 |
MERTK | -0.07213 | 0.6187 |
INSR | -0.1031 | 0.476 |
FGFR4 | -0.1037 | 0.4737 |
RYK | -0.1587 | 0.271 |
FGFR2 | -0.1653 | 0.2513 |
PTK7 | -0.1683 | 0.2427 |
EPHA5 | -0.1693 | 0.2399 |
EPHA7 | -0.1712 | 0.2346 |
IGF1R | -0.1782 | 0.2157 |
DDR2 | -0.2249 | 0.1164 |
FGFR3 | -0.2382 | 0.0957 |
FGFR1 | -0.4131 | 0.0029 |
在NSCLC细胞系中cMET蛋白质表达与EGFR mRNA表达相关
为了评估NSCLC细胞系中通过免疫组织化学(IHC)测定的c-met蛋白质表达是否与EGFR和其它受体酪氨酸激酶(RTK)的表达相关,自基于微阵列自表1所示50种NSCLC细胞系生成的基因表达数据确定Spearman秩相关系数。在细胞系(ρ=0.50,p=0.002)中EGFR mRNA和c-met蛋白质水平正相关,而且EGFR表达与c-met蛋白质表达高度相关(表3)。
表3:NSCLC细胞系中RTK mRNA表达与c-MET蛋白质表达(IHC)的关联。
在NSCLC肿瘤样品中MET mRNA表达与EGFR mRNA表达相关。
为了评估在表1所示NSCLC细胞系中c-met mRNA表达是否与EGFR和其它受体酪氨酸激酶(RTK)的表达相关,自基于微阵列自78份NSCLC肿瘤生成的基因表达数据确定Spearman秩相关系数。在NSCLC肿瘤中EGFR mRNA和MET mRNA的表达正相关(ρ=0.26,p=0.02)(表4)。
表4:NSCLC肿瘤中RTK mRNA表达与MET mRNA表达的关联。
NSCLC细胞系和原发性肿瘤中的EGFR和MET共表达。
为了评估c-met和EGFR是否在NSCLC细胞系和原发性肿瘤样品中共表达,在一组NSCLC细胞系(如表1所示)或冷冻的原发性NSCLC肿瘤溶胞物中通过定量RT-PCR测定EGFR和MET mRNA表达。EGFR和MET mRNA水平在细胞系(ρ=0.59,p<0.0001)(图1,左边小图)和原发性NSCLC标本(ρ=0.48,p=0.0003)(图1,右边小图)中正相关。这些数据证明NSCLC细胞系和原发性肿瘤样品中的MET和EGFR表达中有交叠。
通过IHC证实NSCLC细胞系和原发性肿瘤中的EGFR和MET共表达。
通过IHC对47种非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系(如表1所示)和138份原发性NSCLC样品(Genentech收集)检查它们的c-met和EGFR IHC表达。对表达水平打分为阴性(-),弱(+),中等(++)或强(+++),并对所含肿瘤细胞超过10%具有弱,中等,或强染色的细胞系或肿瘤标本打分为阳性。
79%(37/47)的细胞系和68%(94/138)的NSCLC肿瘤EGFR染色呈阳性(表5)。基于它们的c-met表达水平,对EGFR阳性样品(79%的细胞系和68%的原发性肿瘤)进一步归类(表5)。EGFR阳性细胞系展现出弱(22%),中等(57%)和强(19%)c-met表达,而EGFR阳性原发性肿瘤样品只有弱或中等阳性。腺癌亚型比鳞状细胞亚型更常见c-met染色阳性(70%比40%),有更多例中等染色(30%比7%)。这些数据证明在NSCLC细胞系和肿瘤样品中的c-met和EGFR表达之间有显著交叠,特别是在腺癌肿瘤亚型中。
表5:NSCLC细胞系和原发性肿瘤中的EGFR和MET蛋白质共表达。
*79%(37/47)NSCLC细胞系EGFR染色呈阳性
**68%(94/138)NSCLC肿瘤EGFR染色呈阳性
实施例2:在NSCLC细胞中c-met蛋白质表达降低提高配体诱导的EGFR,Her2和Her3活化。
材料和方法
逆转录病毒shRNA构建物。将编码针对c-met的shRNA序列的寡核苷酸(5’-GATCCCCTTCAAGAG TTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO:32)(shMet 3)和5’GATCCCCTTCAAGAGA TTTTTTGGAAA(SEQ ID NO:33)(shMet 4))克隆入pShuttle-H1载体中H1启动子下游的BglII/HindIII位点(David Davis,GNE)。粗体正文表示靶杂交序列。使用Clonase II酶(Invitrogen)将这些构建物与逆转录病毒pHUSH-GW载体(Gray D et al BMCB Biotechnology.2007;7:61)重组,生成shRNA表达在诱导型启动子控制下的构建物。四环素类似物多西环素处理导致shRNA表达。含有针对GFP的shRNA的shGFP2对照逆转录病毒构建物(Hoeflich et al.Cancer Res.(2006)66(2):999-1006)由Genentech,Inc.的David Davis提供。shGFP2含有下述寡核苷酸:
(EGFP)shRNA
( 有 义 )5’-GATCCCCAGATCCGCCACAACATCGATTCAAGAGATCGATGTTGTGGCGGATCTTGTTTTTTGGAAA-3(SEQ ID NO:34)。
细胞培养。在补充有10%无Tet的FBS(Clontech),2mM L-谷氨酰胺(GNE)和100U/ml青霉素和100U/ml链霉素(Gibco)的HGDMEM(GNE)中维持GP-293包装细胞(Clontech)。在补充有10%无Tet的FBS(Clontech),2mM L-谷氨酰胺(GNE)和100U/ml青霉素和100U/ml链霉素(Gibco)的50∶50培养基(DMEM:F12,MediaTech)中维持H441细胞(ATCC No.HTB-174)。在补充有10%无Tet的FBS(Clontech),2mM L-谷氨酰胺(GNE)和100U/ml青霉素和100U/ml链霉素(Gibco)的RPMI 1640(GNE)中维持EBC-1细胞(Japanese Health Sciences Resources;参见Cancer Res.(2005)65(16):7276-82)。于37℃,5%CO2维持细胞。
重组逆转录病毒和稳定细胞系的开发。使用FuGene 6(Roche)和CalPhos哺乳动物转染试剂盒(Clontech)用pVSV-G(Clontech)和上述重组逆转录病毒构建物共转染GP-293包装细胞。然后向EBC-1和H441细胞添加含有重组病毒的培养基,并在嘌呤霉素(Clontech)中选择细胞。然后经FACS将稳定表达逆转录病毒构建物的细胞自动克隆入96孔板。
Western印迹。为了解析蛋白质,用MOPS缓冲液(Invitrogen)在4-12%Bis-Tris NuPAGE凝胶上运行20μg全细胞溶胞物。将凝胶在含抗氧化剂缓冲剂的2X NUPAGE转移缓冲液中平衡,然后通过iBlot转移至0.2um PVDF膜。将膜在含有5%BSA的TBST(10mM TRIS,pH 8.0,150mM NaCl,0.1%Tween20)中于室温封闭1小时,然后在用封闭缓冲液稀释的一抗中于4℃温育过夜。用TBST清洗膜,然后与HRP偶联的二抗(GE Healthcare)一起在含5%脱脂奶的TBST中于室温温育1小时。通过化学发光(GE Healthcare,ECL Plus)来检测抗体。
稳定细胞系筛选。在适当的培养基+/-1μg/ml多西环素(Clontech)中培养用逆转录病毒构建物稳定转导的克隆以诱导shRNA表达,并使用抗c-metC-12抗体(Santa Cruz Biotech)经Western印迹筛选c-met敲低。使用抗磷酸-c-met Y1003(Biosource)和抗磷酸-c-met Y1234/1234(Cell Signaling)抗体对磷酸-c-met印迹。作为对照,使用抗肌动蛋白I-19抗体(Santa Cruz Biotech)对肌动蛋白印迹。EBC克隆3.15和EBC克隆4.12显示出met表达和磷酸c-met水平的强烈降低,H441克隆3.11和H441克隆3.1显示出c-met表达和磷酸-met表达的中等降低,而EBC克隆4.5显示出c-met和磷酸-c-met表达的更小降低。
细胞系EBC克隆4.5,EBC克隆4.12含有构建物shMet4,而细胞系H441克隆3.1,H441克隆3.11和EBC克隆3.15含有构建物shMet3。
配体应答实验。在有/无多西环素的情况中传代48小时(EBC shMet)或6天(H441 shMet)的细胞在有/无Dox(0.1ug/ml)的情况中在10%FBS-RPMI中以1×106细胞/孔分配入6孔盘,然后于37℃温育过夜。用PBS漂洗细胞,并将培养基更换成0.5%BSA-RPMI(有/无多西环素)以于37℃血清饥饿细胞2小时。向孔添加含有配体(20nM TGFa或2nM HRG)的培养基,并于37℃温育20分钟。将孔用冷的TBS漂洗,然后用TBS,1%NP-40,完全蛋白酶抑制剂混合液(Roche)和磷酸酶抑制剂混合液1和2(Sigma)溶胞。自孔刮取单层和上清液并转移至微量离心管,其中将溶胞物在冰上温育10-30分钟。通过离心来沉淀细胞残骸,并将上清液转移至新管。通过BCA测定法(Pierce)对蛋白质浓度定量,并将溶胞物保存于-20℃,直至为电泳而融化。在凝胶上运行20ug(EBC1)或15ug(H441)全细胞溶胞物,并如上所述为磷酸-c-met(YY1234/35,3126,来自Cell Signaling Technology),总c-met(C12,sc-10,来自San Cruz Biotechnology),b-肌动蛋白(I-19,sc-1616,来自Santa Cruz Biotechnology),磷酸-EGFR(Y1173,04-341,来自Upstate),总EGFR(MI-12-1,来自MBL),磷酸-Her2(YY1121/22,2243,来自Cell Signaling Technology),总Her3(C18,sc-284,来自San Cruz Biotechnology),磷酸-Her3(Y1289,4791,来自Cell Signaling Technology),或总Her3(C17,sc-285,来自Santa Cruz Biotechnology)印迹。
结果
使用携带靶向c-met的四环素诱导型短发夹RNA(shRNA)的逆转录病毒来生成能被诱导来表达shRNA以敲低c-met表达的稳定NSCLC细胞系克隆。为了在NSCLC细胞系EBC1中检查c-met敲低对EGFR家族成员表达和磷酸化的影响,在对照培养基或含有0.1ug/ml Dox的培养基中培养含有针对met的诱导型shRNA或针对GFP的对照shRNA的EBC1 shMet 4.12细胞48小时。血清饥饿2小时后,细胞不处理或者用TGFα或调蛋白b1处理20分钟。如所示地对全细胞溶胞物评估总的和磷酸-蛋白质的表达。
使用shRNA敲低了c-met蛋白质表达的用Dox处理的EBC1细胞(图2;EBCshMet 4.12,Dox,左边小图)响应TGFa处理显示出升高的pEGFR和pHer2且响应调蛋白处理显示出升高的pHer3,以及在TGFa或调蛋白处理任一情况中显示出升高的pAKT,但是用Dox处理的对照EBC1细胞不然(图2;shGFP2,右边小图)。用Dox处理的EBC shMet 4.12细胞(无配体刺激)显示出升高的总Her2和总Her3,及降低的pEGFR和pHer3。EBC1细胞没有显示响应TGFa或调蛋白处理对pEGFR,pHer2,pHer3,或pAKT的强力诱导。
为了在另一种NSCLC细胞系中检查c-met敲低对EGFR家族成员表达和磷酸化的影响,在对照培养基或含有0.1ug/ml Dox的培养基中培养含有针对met的诱导型shRNA或针对GFP的对照shRNA的NSCLC H441细胞48小时。血清饥饿2小时后,细胞不处理或者用TGFα或调蛋白b1处理20分钟。如所示地对全细胞溶胞物评估总的和磷酸-蛋白质的表达。
使用shRNA敲低了c-met的H441细胞(图3;用Dox处理的shMet 3.1,左边小图和用Dox处理的shMet 3.11,中间小图)响应调蛋白处理显示出增强的pHer2和pHer3,但是用Dox处理的对照H441细胞不然(图3;shGFP1,右边小图)。用Dox处理的shMet 3.1和shMet 3.11细胞还显示升高的总Her3和降低的pEGFR。与EBC1细胞不同,在没有c-met敲低的情况中,H441细胞对TGFα(pEGFR)和调蛋白(pHer2和pHer3)具有轻微响应。EBC1细胞具有比H441细胞更高的c-met水平。
这些实验证明了在NSCLC细胞系中c-met表达的降低导致基础EGFR活化(pEGFR)降低和配体诱导的Her2和Her3活化升高,提示Met抑制提高对EGF家族配体的敏感性。
实施例3:在异种移植物模型中met敲低和EGFR抑制剂Erlotinib处理的组合显著抑制肿瘤生长。
为了测试在c-met功能受到部分抑制的细胞中EGFR是否在维持肿瘤存活中发挥作用,用Erlotinib(TarcevaTM)和Dox的组合处理携带EBC-1shMet-4.5肿瘤的动物。
材料和方法
测试材料。Erlotinib(TarcevaTM)由OSI Pharmaceuticals提供给Genentech的配制剂部门,并与足够量的媒介(甲基纤维素吐温(MCT))一起称出。材料保存在电冰箱中,其设置成维持温度范围4℃至8℃。抗c-met单价单克隆抗体MetMAb(rhuOA5D5v2)(WO2007/063816)由Genentech,Inc.的抗体工程部门提供,清澈的液体形式。EBC-1细胞系得自日本研究生物资源保藏中心(JCRB)。
物种。40只裸鼠(nu/nu)得自Charles River Laboratories(CRL),而且在开始研究之前适应至少1周。在带有过滤器供应高效颗粒物空气(HEPA)的房间中在通风笼养***中饲养动物。只有看上去健康且没有明显异常的动物用于研究。
研究设计。在由RPMI 1640培养基(Invitrogen),2mM L-谷氨酰胺和10%胎牛血清组成的生长培养基中培养EBC-1细胞。为了制备接种入小鼠的细胞,将细胞用胰蛋白酶处理,用10ml无菌1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗。通过台盼蓝排斥对细胞子集计数,并将剩余细胞在100μl无菌1X PBS中重悬浮至浓度5×107个细胞每毫升。小鼠在右肩胛下区域中皮下接种5×105个EBC-1细胞。监测肿瘤,直至它们达到体积均值300mm3。
将植入有肿瘤细胞的小鼠随机化成四个组,每组10只小鼠,启动处理(汇总于表6)。第1组(对照组)中的小鼠每天(QD),经口腔强饲法(PO),用100μL媒介对照甲基纤维素吐温(MCT)处理,并转换成含有5%蔗糖的饮用水。第2组(c-met敲低组)中的小鼠QD,PO,用100μL MCT处理,但转换成在5%蔗糖中含有0.5mg/mL多西环素(Dox)的饮用水。第3组(Erlotinib处理组)中的小鼠QD,PO,以在MCT中配制的100μL体积用100mg/kg Erlotinib处理,并转换成含有5%蔗糖的饮用水。第4组(c-met敲低加Erlotinib处理组)中的小鼠QD,PO,以在MCT中配制的100μL体积用100mg/kg Erlotinib处理,并转换成在5%蔗糖中含有1mg/mL多西环素(Dox)的饮用水。每2-3天更换Dox和蔗糖水。Erlotinib和MCT给药14天,停止6天,然后研究的剩余时间恢复(20天)。如果肿瘤达到大于1000mm3或者肿瘤显示出坏死损害的体征,那么动物退出研究。如果来自任何给定组的超过3只动物不得不退出研究,那么暂停该组的处理,而且所有动物退出研究。所有小鼠操作和研究均遵守科研动物护理和使用委员会(IACUC)指导方针。
表6
研究设计
*在美国专利申请No.61/034,446中,Dox剂量不正确地叙述为1mg/ml。正确的剂量为0.5mg/ml,如上所示。
肿瘤和体重测量。使用UltraCal-IV测径器(54-10-111型,Fred V.Fowler Company,Inc.;Newton,MA)以二维(长和宽)测量肿瘤体积。用Excel v11.2(Microsoft Corporation;Redmond,WA)使用下式来计算肿瘤体积:
肿瘤体积(mm3)=(长·宽2)·0.5
功效数据分析。使用KaleidaGraph 3.6(Synergy Software;Reading,PA)对肿瘤抑制绘图。第17天的百分比生长抑制(%Inh)如下计算:
%Ihn=100X[肿瘤尺寸(媒介)-{肿瘤尺寸(MetMAb)/肿瘤尺寸(媒介)}]
肿瘤发生率(TI)是通过第17天每个组中可测量肿瘤的数目确定的。部分消退(PR)定义为研究期间任一天肿瘤消退>50%但<100%起始肿瘤体积。完全消退(CR)定义为研究期间任一天肿瘤相对于最初的起始肿瘤体积消退100%。
肿瘤体积均值和均值的标准误差(SEM)是使用JMP软件5.1.2版(SASInstitute;Cary,NC)计算的。数据分析和使用Student氏t检验或Dunnett氏t检验的p值生成也是使用JMP软件5.1.2版进行的。
结果
在异种移植物模型中c-met敲低和Erlotinib处理的组合显著抑制肿瘤生长。
为了调查在EBC-1模型中c-met在驱动肿瘤生长中的作用,使用携带靶向c-met的四环素诱导型短发夹RNA(shRNA)的逆转录病毒生成了能被诱导来表达shRNA以敲低c-met表达的稳定EBC-1克隆。EBC-1非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系高度扩增c-met且表达大量的c-met受体,其以不依赖配体的方式起驱动细胞和肿瘤生长的作用。EBC-1细胞系中的EGFR基因是野生型的。
用四环素类似物多西环素(doxyclcline)诱导shRNA表达后,克隆EBC-1shMet-3.15显示出有效的、很大程度上完全的c-met表达敲低。对shRNA的诱导还阻断这些细胞的增殖,如Cell Titer Glo或Alamar Blue细胞存活力测定法中所分析的。shRNA诱导后24-72小时在EBC1 shMet3.15细胞中观察到生长阻滞,接着是凋亡。基本上如上所述将该细胞系克隆植入动物模型(但是动物未用Erlotinib处理)并容许形成肿瘤。在体内这些动物中肿瘤形成后对shRNA表达的诱导导致肿瘤消退。这些结果证明了在体外和在体内c-met表达对于EBC-1细胞的生长和存活是至关重要的。
用Dox诱导shRNA表达后EBC-1 shMet-4.5克隆展示出c-met表达的部分敲低。在此克隆中对c-met表达的诱导还导致对细胞生长和存活的影响:在体外细胞存活力测定法中测定时对shRNA表达的诱导降低细胞数,而且在异种移植物模型中肿瘤形成后对shRNA表达的诱导抑制肿瘤生长但不引起肿瘤消退。
选择克隆shMet-4.5用于如下所述评估组合c-met表达敲低与Erlotinib处理的效果的实验。
将EBC-1 shMet-4.5 NSCLC细胞系接种入裸鼠,然后对动物监测肿瘤生长,直至移入的细胞形成约300mm3的肿瘤。然后将小鼠分组成四个处理组;第1组:媒介,第2组:多西环素(Dox),第3组:Erlotinib(100mg/kg)和第4组:Erlotinib+Dox(见表6)。
用Erlotinib处理小鼠对肿瘤生长没有影响(-6%肿瘤抑制;图4),而Dox处理(抑制met表达)导致第19天与媒介对照相比肿瘤生长降低38%(图4;Student氏t检验,p=0.084),刚好落在统计学显著性之外。然而,当与单独的Erlotinib组相比时肿瘤生长的降低是统计学显著的(Student氏t检验,p=0.004;图4)。Erlotinib和Dox的组合导致显著的功效改善,导致第19天与媒介对照相比肿瘤生长降低68%(Student氏t检验,p=0.001;图4)。当与单独的Dox处理(Student氏t检验,p=0.03)或单独的Erlotinib处理(Student氏t检验,p<0.0001)相比时,Erlotinib和Dox联合处理也导致统计学显著的肿瘤生长降低。
Dox和Erlotinib处理导致更大数目的部分响应(PR;定义为研究期间任一天肿瘤消退>50%但<100%起始肿瘤体积)和完全响应(CR;定义为研究期间任一天肿瘤相对于最初的起始肿瘤体积消退100%)。具体而言,Erlotinib加Dox的组合导致1例PR和3例CR,而Erlotinib处理导致无PR或CR,而Dox处理(c-Met敲低)导致2例PR和1例CR。这些数据证明met抑制(Dox处理)和EGFR抑制(Erlotinib处理)的组合比单独地抑制c-met或EGFR更有可能诱导完全肿瘤消退,尽管对个别动物肿瘤数据的分析揭示了并非所有肿瘤都对c-met抑制和Erlotinib的组合有强响应。
这些结果显示在EBC-1 shMet-4.5异种移植物模型中抑制c-met和EGFR导致肿瘤生长显著降低。如此,c-met表达和活性受到部分抑制的肿瘤利用EGFR途径来确保肿瘤生长和存活。这指示在c-met受到抑制的肿瘤中EGFR在肿瘤存活和生长中发挥作用。
实施例4:与单独的抗c-met抗体或Erlotinib处理相比,抗c-met抗体和EGFR抑制剂Erlotinib处理显示出显著的功效改善。
材料和方法
测试材料。抗c-met单价单克隆抗体MetMAb(rhuOA5D5v2)由Genentech,Inc.的抗体工程部分提供,清澈的液体形式,10.6mg/ml。媒介是10mM琥珀酸组氨酸,4%海藻糖二水合物,0.02%聚山梨酯20,pH 5.7。Erlotinib(TARCEVATM)由OSI Pharmaceuticals提供给Genentech的制药学部门,并与足够量的媒介(甲基纤维素吐温(MCT))一起称出。所有材料自Genentech,Inc.船运至Van Andel Research Institute(VARI;Grand Rapids,MI),并在动物处理前进行配制。材料保存在电冰箱中,其设置成维持温度范围4℃至8℃。NCI-H596细胞系得自美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)。
物种。40只人HGF转基因C3H-SCID小鼠(hu-HGF-Tg-C3H-SCID)得自Van Andel Research Institute(VARI;Grand Rapids,MI)的内部。5只C3H-SCID小鼠得自Jackson Laboratories。动物为4-6周龄,而且每只重21-22克。接种肿瘤细胞之前让小鼠适应研究条件至少3天。在带淋浴的栅栏设备中饲养小鼠。在带有过滤器供应高效颗粒物空气(HEPA)的房间中在通风笼养***中饲养动物。只有看上去健康且没有明显异常的动物用于研究。
研究设计。由于大多数HGF响应性肿瘤是以旁分泌方式驱动的,因此选择模拟旁分泌驱动生长的异种移植物模型。小鼠HGF是人c-met的弱配体,导致表达人c-met的细胞系对小鼠HGF的低生物学应答(Bhargava,M.,et al.,1992;Rong,S.,et al.,1992)。因此,为了模拟旁分泌HGF驱动的人肿瘤,生成了以遍在方式自金属硫蛋白启动子表达人HGF的转基因小鼠(hu-HGF-Tg-SCID)(Zhang,Y.,et al.,2005)。hu-HGF-Tg-SCID小鼠中的血清HGF水平比生理水平高约5-10倍(1-5ng/mL比0.2-0.5ng/mL),而且在体外通过增殖来响应HGF的细胞系在hu-HGF-Tg-SCID小鼠中作为异种移植肿瘤生长时显示有力的肿瘤生长增强。
选择NCI-H596非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系用于在hu-HGF-Tg-SCID小鼠中进行的体内功效研究,因为该细胞系是高度HGF响应性的,而且在体外抗c-met抗体MetMAb阻断此细胞系的HGF驱动增殖(Kong-Beltran,M.,et al.,2006)。NCI-H596细胞系携带突变形式的c-met基因,缺乏编码E3遍在蛋白连接酶Cbl结合位点的外显子14(Kong-Beltran,M.,2006)。Cbl结合位点在HGF结合后在酪氨酸1003(Y1003)处磷酸化,容许Cbl结合和遍在化c-met,如此将其靶向蛋白体降解(Peschard,P.,et al.,2001)。在体内也能看到NCI-H596的响应性,即该细胞系在IIGF-Tg-SCID小鼠(表达人HGF,如上所述)中容易形成肿瘤,但是在缺乏人HGF的免疫受损小鼠(nu/nu裸鼠或SCID小鼠)中不会形成肿瘤。考虑用NCI-H596细胞来形成c-met驱动的肿瘤。NCI-H596细胞拥有野生型EGFR基因,而且在存在TGFα的情况中培养时对EGFR抑制剂Erlotinib(TARCEVATM)敏感,如在存在Erlotinib和TGFα的情况中培养时细胞存活力降低所证明的。
在由RPMI 1640培养基(Invitrogen),2mM L-谷氨酰胺和10%胎牛血清组成的生长培养基中培养NCI-H596细胞。为了制备接种入小鼠的细胞,将细胞用胰蛋白酶处理,用10ml无菌1X磷酸盐缓冲液盐水(PBS)清洗。通过台盼蓝排斥对细胞子集计数,并将剩余细胞在100μl无菌1X PBS中重悬浮,浓度为5×106个细胞每毫升。
通过用剪刀剪掉背部区域的毛,使小鼠准备好接种。次日,每只小鼠在右肩胛下区域中皮下接种5×105个NCI-H596细胞。监测肿瘤,直至它们达到体积均值100mm3。
将HGF-Tg-C3H-SCID小鼠随机化成两个组,每组11只小鼠,并给予腹膜内注射测试材料,每周两次,持续四周。第1组中的动物给予100μl媒介,而第2组中的动物给予30mg/kg抗c-met单价单克隆抗体MetMAb。研究设计呈现于表7。测量肿瘤,每周三次,持续五周,在处理那天开始。5周后对小鼠处以安乐死,但是有些小鼠由于肿瘤体积大(>1500mm3)而更早就处以安乐死了。对照C3H-SCID小鼠也接种,以充当肿瘤生长的阴性对照,并监测肿瘤生长五周。
所有小鼠操作和研究均遵守科研动物护理和使用委员会(IACUC)指导方针。
表7
研究设计
肿瘤和体重测量。使用UltraCal-IV测径器(54-10-111型,Fred V.Fowler Company,Inc.;Newton,MA)以二维(长和宽)测量肿瘤体积。用Excel v11.2(Microsoft Corporation;Redmond,WA)使用下式来计算肿瘤体积:
肿瘤体积(mm3)=(长·宽2)·0.5
功效数据分析。使用KaleidaGraph 3.6(Synergy Software;Reading,PA)对肿瘤抑制绘图。第17天的百分比生长抑制(%Inh)如下计算:
%Ihn=100X[肿瘤尺寸(媒介)-{肿瘤尺寸(MetMAb)/肿瘤尺寸(媒介)}]
肿瘤发生率(TI)是通过第17天每个组中可测量肿瘤的数目确定的。部分消退(PR)定义为研究期间任一天肿瘤消退>50%但<100%起始肿瘤体积。完全消退(CR)定义为研究期间任一天肿瘤相对于最初的起始肿瘤体积消退100%。
肿瘤体积均值和均值的标准误差(SEM)是使用JMP软件5.1.2版(SASInstitute;Cary,NC)计算的。数据分析和使用Student氏t检验或Dunnett氏t检验的p值生成是使用JMP软件5.1.2版实施的。
为每个组绘制肿瘤倍增时间的Kaplan-Meier存活曲线评估。在各组之间进行成对比较。用log-秩检验进行统计学比较。数据分析是使用JMP软件实施的。
结果
将NCI-H596 NSCLC细胞系接种入hu-HGF-Tg-C3H-SCID动物,并对动物监测肿瘤生长,直至移入的细胞形成约100mm3的肿瘤。然后将小鼠分成四个处理组;第1组:媒介,第2组:Erlotinib,第3组:MetMAb和第4组:Erlotinib+MetMAb(见表7)。用MetMAb处理的组只给药一次,而用Erlotinib处理的组每天给药,持续2周,然后停止处理,并监测肿瘤生长,每周2-3次。C3H-SCID对照小鼠也接种,并监测未暴露于人HGF的NCI-H596肿瘤的生长。
与C3H-SCID对照小鼠相比,在hu-HGF-Tg-C3H-SCID小鼠的背景中,NCI-H596肿瘤的生长得到巨大改善(图5;比较媒介对照组与C3H-SCID)。第20天,与媒介对照相比,用抗c-met单价单克隆抗体MetMAb处理小鼠导致肿瘤生长降低67%(图5;Student氏t检验,p=0.0044),与先前在NCI-H596模型中进行的MetMAb研究一致。第20天,与媒介对照相比,用Erlotinib处理携带NCI-H596肿瘤的小鼠导致统计学不显著的肿瘤生长降低(图5;Student氏t检验,p=0.165)。MetMAb和Erlotinib联合处理显示出显著的功效改善,导致第20天,与媒介对照相比,肿瘤生长降低89%(图5;Student氏t检验,p=0.0035)。
第20天,与媒介对照相比,用MetMAb处理小鼠导致肿瘤生长降低67%(图5;Student氏t检验,p=0.0044),与先前在NCI-H596模型中进行的MetMAb研究一致。第20天,与媒介对照相比,用Erlotinib处理携带NCI-H596肿瘤的小鼠导致统计学不显著的肿瘤生长降低(图5;Student氏t检验,p=0.165)。MetMAb和Erlotinib组合处理显示出比单独的任一药剂显著改善的功效,导致第20天,与媒介对照相比,肿瘤生长降低89%(图5;Student氏t检验;MetMAb+Erlotinib对媒介,第20天-p=0.0035;MetMAb+Erlotinib对单独的Erlotinib,第26天-p=0.0009;MetMAb+Erlotinib对单独的MetMAb,第48天p=0.0149)。
给药结束后收集肿瘤体积数据9周以解决MetMAb加Erlotinib的组合是否导致肿瘤发展前时间(time to tumor progression)的改善。为了解决这个问题,为每个组计算肿瘤倍增时间(TTD)测量(定义为肿瘤尺寸倍增需要的时间),并用于生成Kaplan-Meier存活曲线。MetMAb加Erlotinib的组合显示出肿瘤发展前时间的显著改善,TTD均值为49.5(±2.6)天,比较而言,MetMAb处理组为17.8(±2.2)天,Erlotinib处理组为9.5(±1.2)天,而媒介对照组为9.5(±1.2)天(图6)。这些数据显示了与单独的任一试剂相比,MetMAb加Erlotinib的组合显著改善肿瘤发展前时间(Log-秩检验;媒介对MetMAb -p<0.0001;媒介对MetMAb+Erlotinib -p<0.0001;Erlotinib对MetMAb+Erlotinib p<0.0001及MetMAb对MetMAb+Erlotinib-p=0.0009)。
这些数据证明了MetMAb和Erlotinib联合处理相对于单独的MetMAb或Erlotinib处理导致高度显著的肿瘤生长抑制和对肿瘤发展(tumor progression)的改善。
实施例5:c-met信号传导调节EGFR信号传导。
材料和方法
微阵列分析:使用Affymetrix IIGU133 Plus 2.0阵列实施了三项微阵列实验。在每种情况中,互补RNA制备,阵列杂交和后续数据分析是使用制造商的方案进行的,基本上如Hoffman EP et al.,Nat Rev Genet 5:229-37(2004)中所集中的。使用RMA标准化方法(Irizarry,Biostatistics,2003,PubMed ID12925520)如Partek GS 6.3b软件包(Partek,Saint Louis,MO)中所执行的,对Affymetrix CEL文件形式的原始表达数据标准化作为一组数据以消除各样品的数据之间非生物学来源的变化。如下分析所得标准化log2刻度表达值,并为了绘图目的转换成线性刻度。
在第一项实验中,配体响应性NSCLC HOP92和H596细胞不处理或用50ng/ml HGF刺激6小时,之后进行mRNA表达序型分析。简言之,将细胞以大约5×105细胞/孔分配入6孔板。一天后,清洗细胞,然后转移至RPMI培养基+0.1%BSA。第3天,将细胞用RPMI培养基+0.1%BSA中的50ng/ml HGF刺激6小时。将细胞用冷的PBS清洗一次,用RNAeasy溶胞缓冲液溶胞,并依照制造商的方案制备RNA。使用t检验分开分析HOP92和H596样品以测量有HGF和无HGF条件中每种基因的表达水平的差异的显著性(P值)。通过使用Benjamini和Hochberg方法(Benjamini and Hochberg,1995)校正多重检验,将这些P值转换成Q值。然后将基因按照每种细胞系中表达水平差异的统计学显著性(Q值)排秩序。
在第二项实验中,在有或无50ng/ml多西环素的情况中温育24和48小时后测定克隆EBCshMet3-15和EBCshMet4-12的mRNA表达水平。使用评估克隆(3-15或4-12),处理(对照或多西环素)和时间点(24或48小时)的影响以及时间点和处理效果的相互作用的线性统计模型(ANOVA)分析每种Affymetrix探针集(基因)的表达样式。ANOVA规程产生了这四项影响每一项的显著性(P值)的度量。通过使用Benjamini和Hochberg方法校正多重检验,将这些P值转换成Q值。然后将基因按照多西环素和对照样品之间表达水平差异的统计学显著性(Q值)排秩序。
在第三项实验中,将EBCMet shRNA 4-12细胞或对照EBCGFP shRNA细胞在单独的培养基或含50ng/ml多西环素的培养基中温育24小时。进一步处理(+/-HGF 100ng/ml 2小时)后,通过微阵列测定mRNA表达。使用评估shRNA靶物(Met或GFP),shRNA诱导(多西环素或对照)和HGF处理的影响以及这些变量的相互作用的线性统计模型(ANOVA)分析每种Affymetrix探针集(基因)的表达样式。然后将这些P值转换成经多西环素处理的EBCMetshRNA4-12样品中加HGF和减HGF条件之间表达水平差异的Q值。使用Q值截留0.05(5%假发现率(False Discovery Rate))和2倍表达变化来比较+/-HGF组,选出188种探针集。
TGFα ELISA:基本上如实施例3中所述生成EBC-1-shMet异种移植肿瘤并给药Dox,只是在5%蔗糖中以1mg/ml使用Dox且在启动处理前容许肿瘤生长至300-400mm3。给动物服药三天,然后处死。将速冻的EBC-1-shMet-4.12异种移植肿瘤样品放入2ml冷的溶胞缓冲液(PBS+1%TritonX-100+磷酸酶混合液2(Sigma产品目录号P5726))和完全迷你无EDTA蛋白酶抑制剂(Roche#11 836 170 001)(1片每10ml溶液)。将肿瘤用手持式匀浆器匀浆,并将溶胞物在冰上温育1小时,偶尔漩涡。将溶胞物于4℃以10000xG离心10分钟,转移至新管,并使用BCA测定法(Pierce产品目录号23225)对Her 3蛋白质定量。
将抗TGF-α多克隆抗体(R&D Systems,Minneapolis,MN)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释至1μg/ml,并在4℃过夜温育期间包被到ELISA板上(25μL/孔,具有MaxiSorp表面的384孔板,Nunc,Neptune,NJ)。用清洗缓冲液(PBS/0.05%Tween-20)清洗6次后,将板用PBS/0.5%牛血清清蛋白(BSA)温育1-2小时。这次和所有后续温育均于室温在定轨摇床上实施。使用样品缓冲液(PBS/0.5%BSA/0.5%Tween-20/0.2%牛γ球蛋白/0.25%CHAPS/5mMEDTA/10ppm Proclin)稀释样品。使用相同的缓冲液制备重组人TGF-α(R&DSystems)的连续稀释,标准曲线范围400-12.5pg/ml。融化为了在标准曲线的高、中、和低区定量而预稀释的冷冻对照样品。将板清洗6次,并添加样品,标准品和对照(25μL/孔),温育2小时。将板清洗12次后,添加(25μL/孔)在样品缓冲液中稀释至1μg/ml的生物素化山羊抗TGFα多克隆抗体(R&DSystems)。温育1小时后,将板清洗12次。然后添加(25μL/孔)在样品缓冲液中1/4,000稀释的链霉亲合素-马辣根过氧化物酶(GE Healthcare,Piscataway,NJ)。30分钟的最后一次温育后,将板清洗12次,并添加四甲基联苯胺(TMB,Kirkegaard & Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)。容许于室温显色6-8分钟,并通过添加1M磷酸来停止反应。使用微量板读数仪(450nm,620参照)获得吸光度值,并自标准曲线的4参数拟合计算样品浓度。
结果
在配体响应性NSCLC细胞系Hop-92和NCI-H596中HGF处理对c-met的活化提高EGFR配体(HB-EGF,表皮调节素(Epiregulin),双调蛋白,TGFα)的mRNA表达(图9A)。相反,在不依赖配体的NSCLC细胞系EBC1细胞中使用shRNA抑制c-met表达降低那些EGFR配体的mRNA表达(图9B)。用HGF处理经dox处理的EBC1shMet细胞系4-12恢复EGFR配体的表达(图9C)。表达针对GFP的siRNA的对照EBC-1细胞中没有发生EGFR配体的降低(图9D)。EBC-1-shMet异种移植肿瘤中c-met表达的降低导致处理后第3天时的肿瘤TGFα蛋白质水平降低(图9E)。
这些数据证明了在c-met扩增的不依赖HGF的细胞(EBC1)以及HGF依赖性细胞系(Hop92和NCI-H596)中c-met活性能调节EGFR信号传导。更具体地,c-met信号传导提高并维持EGFR配体家族的表达,然后这能以自分泌方式刺激它们自己的EGFR受体家族。相反,对c-met信号传导的抑制导致EGFR配体的表达降低。干扰此自分泌环可能是c-met敲低后在EBC1细胞中观察到的pEGFR降低(图10)和实施例2中所述c-met敲低后对配体诱导的EGFR活化的敏感性升高的一项起因。这些结果提示EGFR活性能补偿依赖HGF的和不依赖HGF的肿瘤中c-met信号传导活性的损失,而且与用EGFR和c-met抑制剂组合处理肿瘤时观察到的显著升高的异种移植肿瘤功效一致(实施例4)。
实施例6:c-met活性调节HER3表达。
材料和方法
pEGFR和Her3蛋白质的Western印迹分析:以1×106的密度分配细胞并在含10%Tet核定过的FBS的RPMI 1640中于37℃温育18小时。次日,除去培养基并更换新鲜的普通培养基,含有或不含0.1ug/ml Dox。更换培养基后24,48和72小时,用冷的TBS漂洗后用1%NP-40/TBS/Roche的完全蛋白酶抑制剂混合液/Sigma的磷酸酶抑制剂混合液1和2提取蛋白质。用MOPS缓冲液将15ug总蛋白质加载到Invitrogen的4-12%Bis-Tris NUPADE凝胶上,并用Invitrogen的iBlot转移至PVDF。将膜对磷酸化蛋白质(pEGFR(Y1173)Upstate04-341,在5%BSA/TBST中1∶1000稀释)进行免疫印迹,用Pierce的修复剥离缓冲液剥离,然后再探查总蛋白质(c-met:SCBT sc-10,1∶10,000稀释;Her3:SCBT sc-285,1∶2000稀释,在5%脱脂奶粉和TBST中稀释)。使用Amersham的ECL Plus化学发光试剂盒依照制造商的说明书用Amersham的HRP偶联的二抗(Amersham抗家兔-HRP,#NA934V;Amersham抗小鼠-HRP)检测蛋白质。
Her3 FACS:在RPMI 1640中以106个细胞每个10cm板接种EBC-1 shMet4-12细胞(如上所述),并将板温育过夜。向板添加Dox至终浓度100ng/ml。将板温育48小时。温育后,将细胞用胰蛋白酶处理,离心,然后在冷的200μLPBS+2%FBS(FACS缓冲液)中重悬浮并转移至96孔板。将细胞离心下来并在FACS缓冲液加10μg/ml来自Genentech的Her3:1638(3E9.2G6)抗体中重悬浮。将细胞在冰上温育1小时,然后用冷的FACS缓冲液清洗,并在FACS缓冲液+1∶200RPE偶联的F(ab’)2山羊抗小鼠IgG+IgM(H+L)(Jackson Immuno产品目录号115-116-068)中重悬浮。将细胞在冰上温育30分钟,然后用冷的FACS缓冲液清洗一次,并在FACS缓冲液加7AAD(BD Pharmingen产品目录号559925)中重悬浮。依照制造商的说明书实施FACS分析。
肿瘤溶胞物:基本上如实施例3中所述生成EBC-1-shMet异种移植肿瘤并给药Dox,只是在5%蔗糖中以1mg/ml使用Dox且在启动处理前容许肿瘤生长至300-400mm3。给动物服药三天,然后处死。将速冻的EBC-1-shMet-4.12异种移植肿瘤样品放入2ml冷的溶胞缓冲液(PBS+1%TritonX-100+(3X)磷酸酶混合液2(Sigma产品目录号P5726))和完全迷你无EDTA蛋白酶抑制剂(Roche#11 836 170 001)。将肿瘤用手持式匀浆器匀浆,并将溶胞物在冰上温育1小时,偶尔漩涡。将溶胞物于4℃以10000xG离心10分钟,转移至新管,并使用BCA测定法(Pierce产品目录号23225)对Her 3蛋白质定量。
结果
shRNA介导的c-met表达敲低降低pEGFR水平且显著提高HER3蛋白质水平(图10A)。FACS分析揭示了c-met敲低后升高的表面HER3水平(图10B)。EBC-1shMet-4.12异种移植肿瘤中的c-met敲低导致HER3蛋白质水平升高(图10C)。
这些数据证明了c-met活性能调节HER3表达水平。具体而言,c-met抑制导致升高的HER3蛋白质水平和降低的pEGFR水平。c-met抑制后pEGFR的降低可能是由于因EGFR配体降低的自分泌信号传导(见图9),而且升高的HER3水平可能提高Erlotinib敏感性,如其他人已经证明的(例如Yauch et al.Clin Cancer Res(2005)11:8686-98)。这些结果提示HER3活性(例如经由HER2的信号传导)可以在c-met信号传导抑制后升高,而且进一步支持c-met和HER3抑制剂联合疗法用于治疗癌症的用途。
实施例7:EGFR途径活化能恢复c-met活性受到抑制的细胞的细胞增殖和存活。
材料和方法
在黑壁96孔板中在RPMI 1640培养基(含有10%Tet-Free FBS,Clontech产品目录号631107)中以5000/孔接种EBC-1 shMet细胞,并将板温育过夜。用新鲜培养基+/-100ng/ml dox更换培养基,并将板温育48小时。然后添加EGFR配体至下文所述终浓度,并将板再温育48小时,然后使用Cell TiterGlo(Promega#G7570)如本文所述测定细胞数:Dox+100ng/ml HGF;Dox+50nMTGFα;Dox+5ng/ml HGF;和Dox+1nM TGFα。
结果
shRNA对c-met表达的敲低导致细胞数显著减少,暗示细胞存活和增殖的降低。EGFR配体HGF和TGFα能够以剂量依赖性方式挽救细胞数,尽管HGF表现出挽救细胞数比TGFα更好一些。这些结果证明了在c-met信号传导活性受到抑制的细胞中EGFR途径活化能恢复细胞增殖和细胞存活力。如此,EGFR(和/或其它HER家族成员)信号传导补偿了c-met信号传导活性的损失。这些结果支持c-met和EGFR抑制剂联合疗法的使用,而且与用EGFR和c-met抑制剂组合处理肿瘤时观察到的显著升高的异种移植肿瘤功效一致(实施例4)。
实施例8:c-met活化导致EGFR活化,c-met与EGFR相互作用,不依赖c-met或EGFR途径活化,及c-met活化削弱对EGFR抑制剂的响应。
材料和方法
细胞:NCI-H596细胞得自美国典型培养物保藏中心(ATCC),而且在补充有10%胎牛血清(FBS;Sigma,St.Louis,MO)和2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640中维持。根据实验,如下所述更换细胞测定培养基。
治疗剂和生长因子:如上所述,Erltonib和MetMAb来自Genentech,Inc.。HGF和TGFα是在Genentech制备的。
免疫沉淀和免疫印迹:使细胞在0.1%BSA/RPMI中饥饿过夜,之后如正文中下所述用配体刺激和/或给药化合物。HGF和TGF-α配体是内部制备的。在收获时,立即将细胞在冰冷的PBS中清洗一次,接着在补充有1mM下述每一项的溶胞缓冲液(CST#9803)中溶胞:蛋白酶抑制剂(Sigma产品目录号P3840),磷酸酶抑制剂(Sigma产品目录号P2850和P3726),NaF,Na3VO4和PMSF。将样品于4℃放置在180°旋转仪上,接着于4℃以14,000rpm澄清20分钟。使用Bradford测定法评估蛋白质浓度。
将细胞溶胞物直接加载到凝胶上(图12,当量溶胞物浓度40μg/道)或免疫沉淀(图13,当量溶胞物浓度1.6mg/样品)。免疫沉淀是用每一种下述抗体实施的:琼脂糖偶联的cMET(Santa Cruz Biotechnology产品目录号SC-161AC),EGFR(Neomarkers MS-609-P)+蛋白A Sepharose Fast Flow珠。将样品于4℃在180°旋转仪上放置过夜,接着用溶胞缓冲液清洗3次,随后在含有β-巯基乙醇的SDS样品缓冲液中变性。将样品于95℃加热5分钟,接着加载到4-12%梯度凝胶上并使用标准Western印迹规程转移到硝酸纤维素膜上。将膜在5%奶/TBST中于RT封闭1小时,然后用下述磷酸-抗体于4℃探查过夜,如正文中所指示的:p-c-met:pTyr 4G10(Upstate产品目录号05-777);pEGFR(Cell Signaling Technologies产品目录号2264)。将膜用修复剥离缓冲液(Pierce产品目录号21059)剥离并用针对总蛋白质的抗体再探查:cMET DL-21(Upstate Biotech产品目录号05-238);EGFR(MBL产品目录号MI-12-1);β-肌动蛋白(Santa Cruz Biotechnologies产品目录号SC-1616)。二抗得自Jackson Laboratories。使用ECL方法依照制造商的推荐检测免疫印迹。
细胞存活力测定法:为了细胞存活力测定法,将细胞在含有0.5%FBS的RPMI中(测定培养基)一式四份以1×103个细胞每孔分配入384孔板过夜,之后用含有3nM TGF-a+/-HGF的测定培养基刺激。以多种浓度添加Erlotinib,并在72小时后使用Celltiter-Glo发光细胞存活力测定法(Promega,Madison,WI)测量细胞存活力。
结果
用HGF活化c-met导致EGFR活化。
既然在NCI-H596细胞c-met活化导致多种EGFR配体上调,那么我们假设c-met活化导致EGFR途径反式激活。为了测试这种假设,在体外用或不用HGF处理NCI-H596 NSCLC细胞,并在10分钟,24,48和72小时时分析细胞溶胞物以检查EGFR途径活化。c-met信号传导活化导致EGFR信号传导活化(图12)。早在HGF刺激后10分钟就观察到pEGFR水平的诱导,提示c-met活化直接反式激活EGFR信号传导(图12)。在更迟的时间点(HGF刺激后24,48和72小时)观察到升高的pEGFR水平(图12)。延迟的pEGFR活化动力学与显示c-met活性导致EGFR配体表达升高的数据一致,这可能是延迟(超过24小时)EGFR途径活化的原因。在这种模型中,预测EGFR活化在更迟的时间点升高并保持相对较高,与本文中显示的数据一致
c-met与EGFR相互作用,不依赖c-met或EGFR途径活化状态。
实施了免疫共沉淀实验(co-IP)来确定c-met和/或EGFR活性是否可能导致c-met与EGFR物理结合。用无配体,单独的TGFα,单独的HGF,或TGF-a加HGF处理NCI-H596细胞10分钟或24小时。此处理后,免疫沉淀c-met,接着是磷酸-酪氨酸(4G10),EGFR或c-met的Western印迹。
在缺乏任一配体的情况中及在pc-met和pEGFR水平已经下降的更迟的时间点,c-met免疫沉淀下拉EGFR,指示c-met与EGFR相互作用,不管c-met或EGFR途径活化状态(图13)。针对磷酸-酪氨酸印迹的c-met IP揭示了EGFR和c-met活化依赖配体,而且在24小时后削弱。HGF对c-met的活化导致pEGFR的免疫共沉淀;然而,pEGFR水平比用单独的TGFα或联合HGF刺激细胞时观察到的pEGFR水平低得多。它们各自配体对c-met或EGFR的活化显示了每种途径可以彼此独立地被活化。
c-met活化削弱NCI-H596细胞对EGFR抑制剂的响应,而且抗c-met抗体MetMAb处理挽救对EGFR抑制剂的响应。
当在存在TGFα的情况中培养时,NCI-H596细胞对EGFR抑制剂Erlotinib(TARCEVATM)敏感,如在存在Erlotinib和TGFα的情况中培养时细胞存活力降低所证明的。为了确定c-met途径活化是否能改变NCI-N596细胞对Erlotinib的响应,将细胞用TGFα刺激,用Erlotinib和/或HGF处理,然后测定细胞存活力。
对于细胞对Erlotinib的敏感性,低水平的HGF显示出适度的影响;然而,对Erlotinib的敏感性随着HGF浓度升高以剂量依赖性方式显著降低(图14),如这些条件下细胞存活力升高所揭示的。这些数据指示Met途径的HGF活化足以削弱NCI-H596细胞对Erlotinib的响应。
为了确定c-met抑制剂和EGFR抑制剂的组合是否降低被HGF和TGFα共活化的细胞系的细胞存活力,在存在HGF,TGFα和不同剂量Erlotinib和/或c-met拮抗剂抗体MetMAb(1uM)的情况中实施NCI-H596细胞存活力测定法。
HGF的存在削弱NCI-H596细胞对Erlotinib的响应(图15)。MetMAb对c-met途径的抑制显著恢复Erlotinib敏感性(图15),如此提示在NCI-H596细胞系中c-met和EGFR抑制剂处理能具有影响细胞存活力的联合效应。
总之,这些研究支持下述假说,即c-met途径活化直接活化EGFR途径,这经由对EGFR配体表达的诱导以及c-met和EGFR之间的直接相互作用二者。这些结果与用EGFR和c-met抑制剂组合处理肿瘤时观察到的显著升高的对异种移植肿瘤的功效一致(实施例4)。
实施例9:c-met拮抗剂和EGFR拮抗剂的联合治疗导致更好的对NCI-H596异种移植肿瘤中增殖和存活信号传导途径的抑制。
材料和方法
NCI-H596 hu-HGF-Tg-SCID异种移植肿瘤:如实施例4中所述在hu-HGF-Tg-SCID小鼠中建立NCI-H596异种移植物。在治疗之前容许肿瘤生长至200-300mm3。如表8中所述实施剂量给药。简言之,在时间零小时(0hr)给药MetMAb(30mg/kg)或MetMAb缓冲液,并在时间18小时(18hr)给药甲基纤维素吐温媒介(MCT)或Erlotinib(150mg/kg)。在时间24小时(24hr)对小鼠处以安乐死并收集肿瘤和血浆。将肿瘤在液氮中骤冻,然后保存于-70℃,直至为了免疫沉淀和免疫印迹而加工它们。
表8
研究设计
免疫沉淀和免疫印迹:为了为蛋白质分析加工肿瘤,首先使用玻璃杜恩斯匀浆器用补充有1mM PMSF,额外的蛋白酶抑制剂混合液和磷酸酶抑制剂混合液I和II(Sigma,Inc.,St.Louis,MO)的溶胞缓冲液(Cell Signaling Technology,Inc.,Danvers,MA)将肿瘤匀浆。将溶胞物在冰上温育1小时,然后以14,000xg离心5分钟,并收集上清液。使用BCATM蛋白质测定试剂盒(Pierce,Inc.,Rockford,IL)测定蛋白质浓度,并将样品免疫印迹。为了免疫沉淀,使用1.5mg肿瘤溶胞物来下拉Met或EGFR,Met使用C-28抗人c-Met多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA)偶联的琼脂糖珠,EGFR使用MI-12-1抗体(MBL,Inc.,Woburn,MA),即在旋转中于4℃过夜。将珠于4℃用溶胞缓冲液清洗3次,接着在含有2.5%(w/v)β-巯基乙醇的1XNovex Tris-甘氨酸SDS运行缓冲液(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)中重悬浮。为了直接Western印迹,每道加载50μg肿瘤溶胞物。然后通过SDS-PAGE和免疫印迹来分析样品。所使用的抗体包括小鼠抗人c-Met DL-21,小鼠抗磷酸酪氨酸mAb 4G10(均来自Upstate Biotechnology/Millepore,Inc.,Charlottesville,VA),抗Akt,抗p44/42 MAP激酶(ERK-1/2),抗磷酸-Akt(Ser473),抗磷酸-p44/42 MAP激酶(ERK-1/2)(Thr202/Tyr204),都依照制造商的推荐使用(均来自Cell Signaling Technology,Inc.(Danvers,MA))。使用山羊抗小鼠IRdye800(Rockland Immunochemicals,Inc.,Gilbertsville,PA)和山羊抗家兔AlexaFluor680(Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR)作为二抗。使用Odyssey成像仪(LI-COR Biosciences,Lincoln,NE)对免疫印迹成像,并对磷酸蛋白质水平定量,相对于总蛋白质水平标准化(例如pEGFR相对于总EGFR)。
结果
在NCI-H596 hu-HGF-Tg-SCID小鼠异种移植物模型中生成的并用EGFR抑制剂,c-met抑制剂和EGFR加c-met抑制剂组合处理的异种移植肿瘤中检查了c-met和EGFR途径活化。如先前所述,给20只hu-HGF-Tg-SCID小鼠接种NCI-H596细胞并建立肿瘤。一旦肿瘤达到介于200-300mm3之间的尺寸,就基于肿瘤体积将小鼠均匀地分成四组,并开始剂量给药(表8)。在肿瘤收获之前24小时给药MetMAb,而在收获之前6小时给药Erlotinib。给药时间是基于每种治疗剂的相对半衰期而选择的。在24小时时,对小鼠处以安乐死并收集肿瘤,为了针对磷酸化的和总的Met,EGFR,Akt和ERK-1/2的免疫沉淀(IP)和/或免疫印迹而加工肿瘤。
单独的MetMAb处理导致将c-met磷酸化抑制至媒介对照的12%(+/-3.6%)(图16),而MetMAb和Erlotinib联合处理导致将c-met磷酸化抑制至媒介对照的6%(+/-3.5%)(图16)(p=0.039)。单独的Erlotinib处理(图16)不降低c-met磷酸化。单独的Erlotinib处理将EGFR磷酸化抑制至媒介对照的16%(+/-7.9%),而Erlotinib和MetMAb联合处理将EGFR磷酸化抑制至媒介对照的19%(+/-15%)(图16)。单独的MetMAb处理也适度地将pEGFR抑制至媒介对照的62%(+/-21.6%)(p=0.006)。
这些结果证明了在NCI-H596 hu-HGF-Tg-SCID模型中MetMAb和Erlotinib每一种都有效抑制它们各自靶物的活化,而且阻断c-met能抑制pEGFR应答。
MetMAb和Erlotinib联合处理还导致更有效的对PI-3K/Akt和Ras-RAF-MEK-ERK1/2途径的抑制,它们是活化的Met和EGFR下游活化的,其中这些途径分别起活化肿瘤细胞存活和增殖的作用,并帮助驱动肿瘤发生。在来自用MetMAb、Erlotinib或MetMAb加Erlotinib处理的动物的异种移植肿瘤中检查了磷酸-Akt和磷酸-ERK-1/2。
单独的MetMAb处理导致将pAkt抑制至媒介对照的72%(+/-27.9%)及将pERK-1/2抑制至媒介对照的72%(+/-40.3%)(图15,表9)。Erlotinib处理导致更强有力的抑制,分别将pAkt和ERK-1/2抑制至媒介对照的45%(+/-25.7%)和39%(+/-8.9%)(图16,表9)。MetMAb和Erlotinib联合处理显示出改善的抑制,分别将pAkt和pERK-1/2抑制至媒介对照的24%(+/-13.8%)和媒介对照的29%(+/-2.9%)(图15,表9)。这些结果证明了MetMAb和Erlotinib联合处理比单独的MetMAb或Erlotinib处理更有效地抑制下游信号传导途径。
表9。用MetMAb、Erlotinib或MetMAb和Erlotinib的组合处理携带NCI-H596肿瘤的小鼠后,作为媒介对照的百分比,磷酸-蛋白质*的量化水平的汇总。磷酸-蛋白质水平是通过Li-Cor量化带的信号强度,然后相对于总蛋白质水平(减去背景)标准化而测定的。数据表示为相对于媒介对照的百分比(数值代表来自5只接受处理的不同动物的肿瘤的平均值,图16中显示了每一个)。
图17A和17B图示汇总了本文中公开的一些发现,如下:
(1)c-met和EGFR在NSCLC细胞系和肿瘤中共表达;
(2)c-met活性正调节EGFR配体和pEGFR的表达;
(3)c-met活性负控制HER3的表达;
(4)TGFα处理挽救不依赖配体的c-met活化细胞免于由c-met抑制剂介导的存活力损失;及
(5)c-met活化在体外和在体内降低对Erlotinib的响应。
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虽然为了清楚理解的目的已经经由说明和实施例较为详细地描述了上述发明,但是说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围。
Claims (17)
1.一种治疗受试者中的癌症的方法,包括对受试者施用治疗有效量的c-met拮抗剂和EGFR拮抗剂。
2.权利要求1的方法,其中所述EGFR拮抗剂具有依照US 5,757,498(通过引用并入本申请)的通式I:
其中:
m为1,2,或3;
每个R1独立地选自下组:氢,卤素,羟基,羟基氨基,羧基,硝基,胍基,脲基,氰基,三氟甲基和-(C1-C4亚烷基亚烷基)-W-(苯基),其中W为单键,O,S或NH;
或者每个R1独立地选自R9和C1-C4烷基,其是被氰基取代的,其中R9选自下组:R5,-OR6,-NR6R6,-C(O)R7,-NHOR5,-OC(O)R6,氰基,A和-YR5;R5为C1-C4烷基;R6独立地为氢或R5;R7为R5,-OR6或-NR6R6;A选自哌啶子基,吗啉代,吡咯烷子基,4-R6-哌嗪-1-基,咪唑-1-基,4-吡啶酮-1-基,-(C1-C4亚烷基亚烷基)(CO2H),苯氧基,苯基,苯基硫基,C2-C4烯基和-(C1-C4亚烷基亚烷基)C(O)NR6R6;且Y为S,SO,或SO2;其中R5,-OR6和-NR6R6中的烷基部分任选是被1-3个卤素取代基取代的且R5,-OR6和-NR6R6中的烷基部分任选是被1或2个R9基团取代的,且其中所述任选取代基的烷基部分任选是被卤素或R9取代的,前提是没有两个杂原子连接于同一碳原子;
或者每个R1独立地选自-NHSO2R5,邻苯二甲酰亚氨基-(C1-C4)-烷基磺酰基氨基,苯甲酰氨基,苯磺酰基氨基,3-苯基脲基,2-氧代吡咯烷-1-基,2,5-二氧代吡咯烷-1-基和R10-(C2-C4)-烷酰基氨基,其中R10选自卤素,-OR6,C2-C4烷酰基氧,-C(O)R7和-NR6R6;且其中作为R1基团的所述-NHSO2R5,邻苯二甲酰亚氨基-(C1-C4)-烷基磺酰基氨基,苯甲酰氨基,苯磺酰基氨基,3-苯基脲基,2-氧代吡咯烷-1-基,2,5-二氧代吡咯烷-1-基和R10-(C2-C4)-烷酰基氨基任选是被1或2个独立地选自卤素,C1-C4烷基,氰基,甲基磺酰基和C1-C4烷氧基的取代基取代的;
或者两个R1基团与它们所连接的碳一起形成5-8元环,其包括1或2个选自O,S和N的杂原子;
R2为氢或C1-C6烷基,其任选是被1-3个独立地选自卤素,C1-C4烷氧基,-NR6R6和-SO2R5的取代基取代的;
n为1或2且每个R3独立地选自氢,卤素,羟基,C1-C6烷基,-NR6R6和C1-C4烷氧基,其中所述R3基团的烷基部分任选是被1-3个独立地选自卤素,
C1-C4烷氧基,-NR6R6和-SO2R的取代基取代的;且
R4为叠氮基或-(乙炔基)-R11,其中R11为氢或C1-C6烷基,所述C1-C6烷基任选是被羟基,-OR6,或-NR6R6取代的。
3.权利要求2的方法,其中所述EGFR拮抗剂为选自下组的依照式I的化合物:
(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-[3-(3′-羟基丙炔-1-基)苯基]-胺;[3-(2′-(氨基甲基)-乙炔基)苯基]-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺;(3-乙炔基苯基)-(6-硝基喹唑啉-4-基)-胺;(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(4-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-2-甲基苯基)-胺;(6-氨基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(3-乙炔基苯基)-(6-甲磺酰基氨基喹唑啉-4-基)-胺;(3-乙炔基苯基)-(6,7-亚甲二氧基喹唑啉-4-基)-胺;(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-6-甲基苯基)-胺;(3-乙炔基苯基)-(7-硝基喹唑啉-4-基)-胺;(3-乙炔基苯基)-[6-(4′-甲苯磺酰基氨基)喹唑啉-4-基]-胺;(3-乙炔基苯基)-{6-[2′-苯二酰亚氨基-乙-1′-基-磺酰基氨基]喹唑啉-4-基}-胺;(3-乙炔基苯基)-(6-胍基喹唑啉-4-基)-胺;(7-氨基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(3-乙炔基苯基)-(7-甲氧基喹唑啉-4-基)-胺;(6-甲氧羰基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(7-甲氧羰基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;[6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基)-胺;(3-叠氮基苯基)-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺;(3-叠氮基-5-氯苯基)-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺;(4-叠氮基苯基)-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺;(3-乙炔基苯基)-(6-甲磺酰基-喹唑啉-4-基)-胺;(6-乙硫基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-4-氟-苯基)-胺;(6,7-二甲氧基-喹唑啉-4-基)-[3-(丙炔-1′-基)-苯基]-胺;[6,7-双-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(5-乙炔基-2-甲基-苯基)-胺;[6,7-双-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-4-氟-苯基)-胺;[6,7-双-(2-氯-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺;[6-(2-氯-乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺;[6,7-双-(2-乙酰氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺;2-[4-(3-乙炔基-苯基氨基)-7-(2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-6-基氧基]-乙醇;[6-(2-乙酰氧基-乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺;[7-(2-氯-乙氧基)-6-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺;[7-(2-乙酰氧基-乙氧基)-6-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺;2-[4-(3-乙炔基-苯基氨基)-6-(2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基]-乙醇;2-[4-(3-乙炔基-苯基氨基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-6-基氧基]-乙醇;2-[4-(3-乙炔基-苯基氨基)-6-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基]-乙醇;[6-(2-乙酰氧基-乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺;(3-乙炔基-苯基)-{6-(2-甲氧基-乙氧基)-7-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙氧基]-喹唑啉-4-基}-胺;(3-乙炔基-苯基)-[7-(2-甲氧基-乙氧基)-6-(2-吗啉-4-基)-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-胺;(6,7-二乙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二丁氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二异丙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二乙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基-2-甲基-苯基)-胺;[6,7-双-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基-2-甲基-苯基)-胺;(3-乙炔基苯基)-[6-(2-羟基-乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-胺;[6,7-双-(2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基苯基)-胺;2-[4-(3-乙炔基-苯基氨基)-6-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基]-乙醇;(6,7-二丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-苯基)-胺;(6,7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-5-氟-苯基)-胺;(6,7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-4-氟-苯基)-胺;(6,7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(5-乙炔基-2-甲基-苯基)-胺;(6,7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-4-甲基-苯基)-胺;(6-氨基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-苯基)-胺;(6-氨基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基乙基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基甲基-7-乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基乙基-7-乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基甲基-7-异丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基甲基-7-丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基乙基-7-异丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6-氨基羰基乙基-7-丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二乙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(3-乙炔基苯基)-[6-(2-羟基-乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-胺;[6,7-双-(2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基苯基)-胺;[6,7-双-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基苯基)-胺;(6,7-二甲氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺;(3-乙炔基苯基)-(6-甲磺酰基氨基-喹唑啉-1-基)-胺;和(6-氨基-喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺。
4.权利要求2的方法,其中所述式I的EGFR拮抗剂为N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺。
5.权利要求4的方法,其中所述EGFR拮抗剂N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺为HCl盐形式。
6.权利要求4的方法,其中所述EGFR拮抗剂N-(3-乙炔基苯基)-6,7-(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺为基本上同质的结晶多型形式,其展现的X射线粉末衍射图所具有的特征峰如下表示:大约6.26、12.48、13.39、16.96、20.20、21.10、22.98、24.46、25.14和26.91的2-theta。
7.权利要求1的方法,其中所述c-met拮抗剂为抗体。
8.权利要求7的方法,其中所述抗体为单价抗体。
9.权利要求7的方法,其中所述抗体为单价且包含Fc区,其中所述Fc区包含第一和第二多肽,其中所述第一多肽包含图7中所绘Fc序列(SEQ IDNO:17)且所述第二多肽包含图8中所绘序列(SEQ ID NO:18)。
10.权利要求7的方法,其中所述抗体包含(a)第一多肽,其包含具有下述序列的重链可变域:
QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIGMIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:19),图7中所绘CH1序列(SEQ ID NO:16)和图7中所绘Fc序列(SEQ ID NO:17);和(b)第二多肽,其包含具有下述序列的轻链可变域:
DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:20)和图7中所绘CL1序列(SEQID NO:8);和(c)第三多肽,其包含图8中所绘Fc序列(SEQ ID NO:18)。
11.权利要求1的方法,其中所述癌症选自下组:乳腺癌,结肠直肠癌,直肠癌,非小细胞肺癌,非何杰金氏淋巴瘤,肾细胞癌,***癌,肝癌,胰腺癌,软组织肉瘤,卡波西氏肉瘤,类癌,头颈癌,胃癌,黑素瘤,卵巢癌,间皮瘤和多发性骨髓瘤。
12.权利要求11的方法,其中所述癌症为非小细胞肺癌。
13.权利要求1的方法,其中所述癌症不是EGFR拮抗剂抗性癌症。
14.权利要求1,进一步包括对受试者施用化疗剂。
15.权利要求1的方法,其中所述EGFR拮抗剂为4-(3′-氯-4′-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉。
16.权利要求1的方法,其中所述EGFR拮抗剂为N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6-[5-[[[2-(甲磺酰基)乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺。
17.权利要求1的方法,其中所述EGFR拮抗剂为4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉。
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