JP2017530940A - Prmt5阻害剤およびその使用 - Google Patents
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Abstract
1つまたは複数のPRMT5阻害剤を用いて、例えば式(1〜5)または(A〜F)の1つまたは複数の化合物、その薬学的に許容できる塩、および/またはその医薬組成物を用いて癌を治療する方法が本明細書に記載される。1つまたは複数のPRMT5阻害剤を用いて、例えば式(1〜5)または(A〜F)の1つまたは複数の化合物、その薬学的に許容できる塩、および/またはその医薬組成物を用いて癌を治療する方法が本明細書に記載される。
Description
関連出願
本出願は、2015年7月20日に出願された「PRMT5 Inhibitors and Uses Thereof」という名称の米国仮特許出願第62/194,459号明細書、2015年4月16日に出願された「PRMT5 Inhibitors and Uses Thereof」という名称の米国仮特許出願第62/148,713号明細書、および2014年8月4日に出願された「PRMT5 Inhibitors and Uses Thereof」という名称の米国仮特許出願第62/033,095号明細書の、米国特許法第119条(e)の下での利益を主張するものであり、これらのそれぞれの全内容が参照により本明細書に援用される。
本出願は、2015年7月20日に出願された「PRMT5 Inhibitors and Uses Thereof」という名称の米国仮特許出願第62/194,459号明細書、2015年4月16日に出願された「PRMT5 Inhibitors and Uses Thereof」という名称の米国仮特許出願第62/148,713号明細書、および2014年8月4日に出願された「PRMT5 Inhibitors and Uses Thereof」という名称の米国仮特許出願第62/033,095号明細書の、米国特許法第119条(e)の下での利益を主張するものであり、これらのそれぞれの全内容が参照により本明細書に援用される。
遺伝子発現のエピジェネティック制御は、タンパク質産生および細胞分化の重要な生物学的決定因子であり、多くのヒトの疾患においてかなりの病因的役割を担う。
エピジェネティック制御は、そのヌクレオチド配列を変化させずに、遺伝物質の遺伝的修飾に関与する。典型的に、エピジェネティック制御は、クロマチンの転写的に活性な状態と不活性な状態との間で立体配座転移を制御するDNAおよびタンパク質(例えば、ヒストン)の選択的かつ可逆的な修飾(例えば、メチル化)によって媒介される。これらの共有結合修飾は、メチルトランスフェラーゼ(例えば、PRMT5)などの酵素によって制御することができ、それらの多くは、ヒトの疾患を引き起こし得る特異的な遺伝子変異と関連している。
本開示の態様は、1つまたは複数のPRMT5阻害剤を用いて、癌を治療する方法に関する。疾病に関連するクロマチン修飾酵素(例えば、PRMT5)は、癌を含む増殖性疾患などの疾病において役割を果たす。
ある実施形態において、本開示の態様は、癌に罹患している被験体にPRMT5阻害剤(例えば、PRMT5阻害剤を含む組成物)を投与することにより、癌を治療するための方法を提供する。ある実施形態において、癌はリンパ腫(例えば、マントル細胞リンパ腫)である。ある実施形態において、癌は乳癌(例えば、トリプルネガティブ乳癌)である。ある実施形態において、癌は膵臓癌である。ある実施形態において、癌は多発性骨髄腫(MM)である。ある実施形態において、癌は急性骨髄性リンパ腫(AML)である。ある実施形態において、癌は結腸癌である。ある実施形態において、癌は、p53欠損によって特徴付けられない(例えば、癌はp53陽性癌である)。
本明細書に記載されるように有用であるPRMT5阻害剤の非限定的な例としては、後述される式A〜Fの化合物が挙げられる。
ある実施形態において、本開示は、式A:
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Aのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Aの安息香酸塩を提供する。
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Aのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Aの安息香酸塩を提供する。
ある実施形態において、本開示は、式B:
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Bのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Bの安息香酸塩を提供する。
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Bのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Bの安息香酸塩を提供する。
ある実施形態において、本開示は、式C:
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Cのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Cの安息香酸塩を提供する。
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Cのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Cの安息香酸塩を提供する。
ある実施形態において、本開示は、式D:
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Dのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Dの安息香酸塩を提供する。
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Dのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Dの安息香酸塩を提供する。
ある実施形態において、本開示は、式E:
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Eのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Eの安息香酸塩を提供する。
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Eのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Eの安息香酸塩を提供する。
ある実施形態において、本開示は、式F:
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Fのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Fの安息香酸塩を提供する。
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Fのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Fの安息香酸塩を提供する。
PRMT5阻害剤の他の非限定的な例が、以下の公開特許出願国際公開第2011/079236号パンフレット、国際公開第2014/100695号パンフレット、国際公開第2014/100716号パンフレット、国際公開第2014/100719号パンフレット、国際公開第2014/100730号パンフレット、国際公開第2014/100764号パンフレット、および国際公開第2014/100734号パンフレット、ならびに米国仮特許出願第62/017,097号明細書および同第62/017,055号明細書に開示され、それぞれの開示内容が参照により本明細書に援用される(例えば、これらの特許出願に記載される一般的および具体的な化合物が参照により本明細書に援用され、本明細書に記載されるように癌を治療するのに使用され得る)。ある実施形態において、PRMT5阻害剤は、核酸(例えば、siRNA)である。PRMT5に対するsiRNAが、例えばMol Cancer Res.2009 Apr;7(4):557−69、およびBiochem J.2012 Sep 1;446(2):235−41に記載されている。
ある実施形態において、被験体の癌を治療する方法は、PRMT5阻害剤を含む組成物を被験体に投与する工程を含み、ここで、PRMT5阻害剤による治療が、約25%超、約50%超、約75%超、約90%超(例えば、25%〜50%、50%〜75%、75%〜90%、または90%〜100%)だけ癌の腫瘍増殖を阻害する。ある実施形態において、PRMT5阻害剤は、約50%以上だけ癌の腫瘍増殖を阻害するのに十分な量で投与される。
ある実施形態において、被験体の癌を治療する方法は、PRMT5阻害剤を含む組成物を被験体に投与する工程を含み、ここで、癌のメチルマークが、約50%超、約75%超、約80%超(例えば、50%〜75%、50%〜80%、80%〜90%、80%〜100%、または90%〜100%)減少される。ある実施形態において、PRMT5阻害剤は、癌のメチルマークを約80%以上だけ減少させるのに十分な量で投与される。
ある実施形態において、被験体の癌を治療する方法は、PRMT5阻害剤を含む組成物を被験体に投与する工程を含み、ここで、被験体の体重減少が、約20%未満、約15%未満、約10%未満、約8%未満、または約5%未満(例えば、20%〜10%、10%〜5%、約8%、約6%、約5%、約4%、または5%〜0%)である。したがって、ある実施形態において、被験体の癌を治療する方法は、被験体の体重減少が約8%以下である量で、PRMT5阻害剤を含む組成物を被験体に投与する工程を含む。ある実施形態において、被験体の癌を治療する方法は、被験体の体重減少が約6%以下である量で、PRMT5阻害剤を含む組成物を被験体に投与する工程を含む。ある実施形態において、被験体の癌を治療する方法は、被験体の体重減少が約4%以下である量で、PRMT5阻害剤を含む組成物を被験体に投与する工程を含む。
ある態様において、本開示は、PRMT5阻害剤による治療に感受性の癌に罹患している被験体を特定する方法であって、被験体から生体試料を取得する工程と;p53の存在または非存在を検出する工程(例えば、p53の存在または非存在を検出するアッセイを行う工程)と;p53が試料中に存在する(例えば、通常のレベルで存在する)場合、PRMT5阻害剤による治療に感受性の癌に罹患している被験体を特定する工程とを含む方法に関する。ある実施形態において、本方法は、PRMT5阻害剤を含む組成物を被験体に投与する工程をさらに含む。
ある態様において、本開示は、PRMT5阻害剤による治療に感受性でない癌に罹患している被験体を特定する方法であって、被験体から生体試料を取得する工程と;p53の存在または非存在を検出する工程(例えば、p53の存在または非存在を検出するアッセイを行う工程)と;p53が試料に存在しない場合、PRMT5阻害剤による治療に感受性でない癌に罹患している被験体を特定する工程とを含む方法に関する。ある実施形態において、本方法は、PRMT5阻害剤を含まない治療計画を被験体に対して実施する工程をさらに含む。
ある実施形態において、組成物は、下式:式A、式B、式C、式D、式E、または式Fのうちの1つを有するPRMT5阻害剤を含む。
ある実施形態において、2つ以上のPRMT5阻害剤が被験体に投与される。
ある実施形態において、被験体はまた、さらなる治療剤で治療されている。
ある実施形態において、被験体は、治療の開始前に癌に罹患していると診断されている。ある実施形態において、被験体は以前に癌の治療をされている。
本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
本開示の態様は、1つまたは複数のPRMT5阻害剤を用いて癌を治療するための方法を提供する。ある実施形態において、1つまたは複数のPRMT5阻害剤が、癌に罹患している被験体に投与される。ある実施形態において、被験体は、PRMT5阻害剤での治療前に癌に罹患していると診断されている。ある実施形態において、被験体は、リンパ腫、乳癌、または膵臓癌に罹患している。ある実施形態において、被験体は、PRMT5阻害剤での治療前にリンパ腫、乳癌、または膵臓癌に罹患していると診断されている。しかしながら、1つまたは複数の他の癌に罹患している(例えば、罹患していると診断されている)被験体もPRMT5阻害剤で治療し得ることを理解されたい。
ある実施形態において、1つまたは複数のPRMT5阻害剤が、癌を治療または予防するために(例えば、癌の再発のリスクを防止または軽減するために)単独で投与される。ある実施形態において、1つまたは複数のさらなる治療剤(例えば、化学療法剤および/またはホルモン療法剤)および/またはさらなる治療処置(例えば、放射線および/または外科手術)に加えて、1つまたは複数のPRMT5阻害剤が提供される。
PRMT5阻害剤が、1つまたは複数の薬学的に許容できる溶媒および/または緩衝液および/または塩とともに医薬組成物中に提供され得ることを理解されたい。ある実施形態において、PRMT5阻害剤が、乾燥形態(例えば、粉末、固体、または結晶形態)で提供される。ある実施形態において、PRMT5阻害剤が、液体形態(例えば、溶液または懸濁液)で提供される。しかしながら、PRMT5阻害剤が、本明細書に記載される他の形態で提供され得ることを理解されたい。
タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ5(PRMT5)が、アルギニンの2個のω−グアニジノ窒素原子に対する2つのメチル基の付加を触媒して、標的タンパク質のアルギニン(sDMA)のω−NG、N’G対称性ジメチル化をもたらす。PRMT5は、核ならびに細胞質において機能し、その基質は、ヒストン、スプライソソームタンパク質、転写因子を含む(例えば、Sun et al.,2011,PNAS 108:20538−20543を参照)。PRMT5は、一般に、タンパク質複合体の一部として機能する。PRMT5のタンパク質複合体が、様々な成分を有し得る一方、それらは、一般に、タンパク質MEP50(メチロソームタンパク質50)を含む。さらに、PRMT5は、補因子SAM(S−アデノシルメチオニン)とともに作用する。
PRMT5は、多様な生物学的過程の調節におけるその役割を考えると、修飾の魅力的な標的である。本明細書に記載されるように、PRMT5は、癌細胞増殖に関連する過程に関与し、PRMT5の阻害は、癌細胞増殖を遅らせるかまたは停止させ、および/または癌細胞死、例えば、アポトーシスを引き起こすことができる。本明細書に記載される化合物、ならびにその薬学的に許容できる塩および組成物が、癌を治療するのに有用なPRMT5の有効な阻害剤であることが分かった。
本明細書に記載されるように有用なPRMT5阻害剤の非限定的な例としては、後述されるように式1〜5およびA〜Fの化合物が挙げられる。
一般に上述されるように、PRMT5阻害剤として有用な化合物が本明細書に提供される。ある実施形態において、本開示は、式(1):
(式中:
が、単結合または二重結合を表し;
R12が、水素、ハロゲン、または任意選択的に置換されるC1〜3アルキルであり;
R13が、水素、ハロゲン、任意選択的に置換されるC1〜3アルキル、−NRA1RA2、または−OR1であり;
RA1およびRA2がそれぞれ、独立して、水素、任意選択的に置換されるC1〜3アルキル、任意選択的に置換されるアシル、または窒素保護基であり、またはRA1およびRA2が、介在する窒素原子と一緒になって、任意選択的に置換される3〜6員複素環を形成し;
R1が、水素、Rz、または−C(O)Rzであり、ここで、Rzが、任意選択的に置換されるC1〜6アルキルであり;
Lが、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−N(R)C(O)N(R)−,−N(R)C(O)O−、または−OC(O)N(R)−であり;
各Rが、独立して、水素または任意選択的に置換されるC1〜6脂肪族であり;
Arが、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される0〜4個のヘテロ原子を有する単環式または二環式芳香環であり、ここで、Arが、原子価が許容する場合、0、1、2、3、4、または5つのRy基で置換され;または
Arが、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される1〜4個のヘテロ原子を有する単環式または二環式複素環であり、ここで、Arが、原子価が許容する場合、0、1、2、3、4、または5つのRy基で置換され;
各Ryが、独立して、ハロ、−CN、−NO2、任意選択的に置換される脂肪族、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるアリール、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるヘテロアリール、−ORA、−N(RB)2、−SRA、−C(=O)RA、−C(O)ORA、−C(O)SRA、−C(O)N(RB)2、−C(O)N(RB)N(RB)2、−OC(O)RA、−OC(O)N(RB)2、−NRBC(O)RA、−NRBC(O)N(RB)2、−NRBC(O)N(RB)N(RB)2、−NRBC(O)ORA、−SC(O)RA、−C(=NRB)RA、−C(=NNRB)RA、−C(=NORA)RA、−C(=NRB)N(RB)2、−NRBC(=NRB)RB、−C(=S)RA、−C(=S)N(RB)2、−NRBC(=S)RA、−S(O)RA、−OS(O)2RA、−SO2RA、−NRBSO2RA、または−SO2N(RB)2からなる群から選択され;
各RAが、独立して、水素、任意選択的に置換される脂肪族、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、および任意選択的に置換されるヘテロアリールからなる群から選択され;
各RBが、独立して、水素、任意選択的に置換される脂肪族、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、および任意選択的に置換されるヘテロアリールからなる群から選択され、または2つのRB基が、それらの介在原子と一緒になって、任意選択的に置換される複素環を形成し;
R5、R6、R7、およびR8がそれぞれ、独立して、水素、ハロ、または任意選択的に置換される脂肪族であり;
各Rxが、独立して、ハロ、−CN、任意選択的に置換される脂肪族、−OR’、および−N(R’’)2からなる群から選択され;
R’が、水素または任意選択的に置換される脂肪族であり;
各R’’が、独立して、水素または任意選択的に置換される脂肪族であり、または2つのR’’基が、それらの介在原子と一緒になって、複素環を形成し;および
nが、原子価が許容する場合、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である)
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。
(式中:
が、単結合または二重結合を表し;
R12が、水素、ハロゲン、または任意選択的に置換されるC1〜3アルキルであり;
R13が、水素、ハロゲン、任意選択的に置換されるC1〜3アルキル、−NRA1RA2、または−OR1であり;
RA1およびRA2がそれぞれ、独立して、水素、任意選択的に置換されるC1〜3アルキル、任意選択的に置換されるアシル、または窒素保護基であり、またはRA1およびRA2が、介在する窒素原子と一緒になって、任意選択的に置換される3〜6員複素環を形成し;
R1が、水素、Rz、または−C(O)Rzであり、ここで、Rzが、任意選択的に置換されるC1〜6アルキルであり;
Lが、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−N(R)C(O)N(R)−,−N(R)C(O)O−、または−OC(O)N(R)−であり;
各Rが、独立して、水素または任意選択的に置換されるC1〜6脂肪族であり;
Arが、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される0〜4個のヘテロ原子を有する単環式または二環式芳香環であり、ここで、Arが、原子価が許容する場合、0、1、2、3、4、または5つのRy基で置換され;または
Arが、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される1〜4個のヘテロ原子を有する単環式または二環式複素環であり、ここで、Arが、原子価が許容する場合、0、1、2、3、4、または5つのRy基で置換され;
各Ryが、独立して、ハロ、−CN、−NO2、任意選択的に置換される脂肪族、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるアリール、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるヘテロアリール、−ORA、−N(RB)2、−SRA、−C(=O)RA、−C(O)ORA、−C(O)SRA、−C(O)N(RB)2、−C(O)N(RB)N(RB)2、−OC(O)RA、−OC(O)N(RB)2、−NRBC(O)RA、−NRBC(O)N(RB)2、−NRBC(O)N(RB)N(RB)2、−NRBC(O)ORA、−SC(O)RA、−C(=NRB)RA、−C(=NNRB)RA、−C(=NORA)RA、−C(=NRB)N(RB)2、−NRBC(=NRB)RB、−C(=S)RA、−C(=S)N(RB)2、−NRBC(=S)RA、−S(O)RA、−OS(O)2RA、−SO2RA、−NRBSO2RA、または−SO2N(RB)2からなる群から選択され;
各RAが、独立して、水素、任意選択的に置換される脂肪族、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、および任意選択的に置換されるヘテロアリールからなる群から選択され;
各RBが、独立して、水素、任意選択的に置換される脂肪族、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、および任意選択的に置換されるヘテロアリールからなる群から選択され、または2つのRB基が、それらの介在原子と一緒になって、任意選択的に置換される複素環を形成し;
R5、R6、R7、およびR8がそれぞれ、独立して、水素、ハロ、または任意選択的に置換される脂肪族であり;
各Rxが、独立して、ハロ、−CN、任意選択的に置換される脂肪族、−OR’、および−N(R’’)2からなる群から選択され;
R’が、水素または任意選択的に置換される脂肪族であり;
各R’’が、独立して、水素または任意選択的に置換される脂肪族であり、または2つのR’’基が、それらの介在原子と一緒になって、複素環を形成し;および
nが、原子価が許容する場合、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である)
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。
特定の実施形態において、式(2):
(式中、Xが、−C(RXC)2−、−O−、−S−、または−NRXN−であり、ここで、RXCの各例が、独立して、水素、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールであり;RXNが、独立して、水素、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、任意選択的に置換されるヘテロアリール、−C(=O)RXA、または窒素保護基であり;RXAが、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールである)
の化合物またはその薬学的に許容できる塩が提供される。
(式中、Xが、−C(RXC)2−、−O−、−S−、または−NRXN−であり、ここで、RXCの各例が、独立して、水素、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールであり;RXNが、独立して、水素、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、任意選択的に置換されるヘテロアリール、−C(=O)RXA、または窒素保護基であり;RXAが、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールである)
の化合物またはその薬学的に許容できる塩が提供される。
特定の実施形態において、式(3):
(式中、RXNが、独立して、水素、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、任意選択的に置換されるヘテロアリール、−C(=O)RXA、または窒素保護基であり;RXAが、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールである)
の化合物またはその薬学的に許容できる塩が提供される。
(式中、RXNが、独立して、水素、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、任意選択的に置換されるヘテロアリール、−C(=O)RXA、または窒素保護基であり;RXAが、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールである)
の化合物またはその薬学的に許容できる塩が提供される。
特定の実施形態において、式(4):
(式中、Xが、−C(RXC)2−、−O−、−S−、または−NRXN−であり、ここで、RXCの各例が、独立して、水素、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールであり;RXNが、独立して、水素、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、任意選択的に置換されるヘテロアリール、−C(=O)RXA、または窒素保護基であり;RXAが、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールである)
の化合物またはその薬学的に許容できる塩が提供される。
(式中、Xが、−C(RXC)2−、−O−、−S−、または−NRXN−であり、ここで、RXCの各例が、独立して、水素、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールであり;RXNが、独立して、水素、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、任意選択的に置換されるヘテロアリール、−C(=O)RXA、または窒素保護基であり;RXAが、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールである)
の化合物またはその薬学的に許容できる塩が提供される。
特定の実施形態において、式(5):
(式中、aおよびbの各例が、独立して、1または2であり、かつXが、−C(RXC)2−、−O−、−S−、または−NRXN−であり、ここで、RXCの各例が、独立して、水素、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールであり;RXNが、独立して、水素、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、任意選択的に置換されるヘテロアリール、−C(=O)RXA、または窒素保護基であり;RXAが、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールである)
の化合物またはその薬学的に許容できる塩が提供される。
(式中、aおよびbの各例が、独立して、1または2であり、かつXが、−C(RXC)2−、−O−、−S−、または−NRXN−であり、ここで、RXCの各例が、独立して、水素、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールであり;RXNが、独立して、水素、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、任意選択的に置換されるヘテロアリール、−C(=O)RXA、または窒素保護基であり;RXAが、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールである)
の化合物またはその薬学的に許容できる塩が提供される。
ある実施形態において、本開示は、式A:
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Aのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Aの安息香酸塩を提供する。
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Aのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Aの安息香酸塩を提供する。
ある実施形態において、本開示は、式B:
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Bのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Bの安息香酸塩を提供する。
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Bのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Bの安息香酸塩を提供する。
ある実施形態において、本開示は、式C:
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Cのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Cの安息香酸塩を提供する。
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Cのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Cの安息香酸塩を提供する。
ある実施形態において、本開示は、式D:
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Dのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Dの安息香酸塩を提供する。
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Dのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Dの安息香酸塩を提供する。
ある実施形態において、本開示は、式E:
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Eのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Eの安息香酸塩を提供する。
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Eのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Eの安息香酸塩を提供する。
ある実施形態において、本開示は、式F:
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Fのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Fの安息香酸塩を提供する。
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Fのコハク酸塩を提供する。ある実施形態において、本開示は、式Fの安息香酸塩を提供する。
PRMT5阻害剤の他の非限定的な例が、以下の公開特許出願国際公開第2011/079236号パンフレット、国際公開第2014/100695号パンフレット、国際公開第2014/100716号パンフレット、国際公開第2014/100719号パンフレット、国際公開第2014/100730号パンフレット、国際公開第2014/100764号パンフレット、および国際公開第2014/100734号パンフレット、ならびに米国仮特許出願第62/017,097号明細書および同第62/017,055号明細書に開示され、それぞれの開示内容が参照により本明細書に援用される(例えば、これらの特許出願に記載される一般的および具体的な化合物が参照により本明細書に援用され、本明細書に記載されるように癌を治療するのに使用され得る)。ある実施形態において、PRMT5阻害剤は、核酸(例えば、siRNA)である。PRMT5に対するsiRNAが、例えばMol Cancer Res.2009 Apr;7(4):557−69、およびBiochem J.2012 Sep 1;446(2):235−41に記載されている。
ある実施形態において、癌(例えば、リンパ腫、例えばマントル細胞リンパ腫、乳癌、例えばトリプルネガティブ乳癌、または膵臓癌)などの増殖性疾患を治療する方法であって、癌に罹患している被験体に有効量の、本明細書に記載されるPRMT5阻害剤化合物(例えば、式(1〜5)または(A〜F)の化合物)、またはその薬学的に許容できる塩、またはその医薬組成物を投与する工程を含む方法が提供される。特定の実施形態において、本明細書に記載される1つまたは複数の化合物は、リンパ腫を治療するのに有用である。ある実施形態において、リンパ腫はマントル細胞リンパ腫(MCL)である。ある実施形態において、リンパ腫は急性骨髄性リンパ腫(AML)である。ある実施形態において、本明細書に記載される1つまたは複数の化合物は、膵臓癌を治療するのに有用である。ある実施形態において、本明細書に記載される1つまたは複数の化合物は、乳癌を治療するのに有用である。ある実施形態において、乳癌はエストロゲン受容体陰性(ER−)である。ある実施形態において、乳癌はプロゲステロン受容体陰性(PR−)である。ある実施形態において、乳癌はHER2陰性である。ある実施形態において、乳癌はER−およびPR−である。ある実施形態において、乳癌はER−およびHER2陰性である。ある実施形態において、乳癌はPR−およびHER2陰性である。ある実施形態において、乳癌は、エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびHER2陰性である(本明細書において「トリプルネガティブ乳癌」とも呼ばれる)。ある実施形態において、乳癌は、HER2陽性、エストロゲン受容体陽性、および/またはプロゲステロン受容体陽性である。例えば、ある実施形態において、乳癌はHER2およびエストロゲン受容体陽性である。ある実施形態において、乳癌はHER2およびプロゲステロン受容体陽性である。ある実施形態において、乳癌はエストロゲンおよびプロゲステロン受容体陽性である。ある実施形態において、乳癌は、非浸潤性小葉癌(LCIS)、非浸潤性乳管癌(DCIS)、浸潤性乳管癌(IDC)、炎症性乳癌、乳頭パジェット病、葉状腫瘍、血管肉腫、腺様嚢胞癌、低悪性腺扁平上皮癌、髄様癌、粘液癌、乳頭癌、管状腺癌、化生癌、微小乳頭癌、混合癌、または別の乳癌タイプであり得る。ある実施形態において、本明細書に記載される1つまたは複数の化合物は、多発性骨髄腫(MM)を治療するのに有用である。ある実施形態において、本明細書に記載される1つまたは複数の化合物は、p53欠損によって特徴付けられない癌を治療するのに有用である(例えば、癌は、p53陽性癌である)。
投与が想定される「被験体」としては、以下に限定はされないが、ヒト(例えば、任意の年齢層の男性または女性、例えば、小児の被験体(例えば、乳児、幼児、青年)または成人の被験体(例えば、若年成人、中高年))および/または他の非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物(例えば、霊長類(例えば、カニクイザル、アカゲザル);ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、および/またはイヌなどの商業に関連する哺乳動物)、鳥類(例えば、ニワトリ、カモ、ガチョウ、および/またはシチメンチョウなどの商業に関連する鳥類)、げっ歯類(例えば、ラットおよび/またはマウス)、は虫類、両生類、および魚類が挙げられる。特定の実施形態において、非ヒト動物は、哺乳動物である。非ヒト動物は、任意の発育段階の雄または雌であり得る。非ヒト動物は、トランスジェニック動物であり得る。
「病態」、「疾患」、および「障害」は、本明細書において同義的に使用される。
「治療する」、「治療すること」および「治療」は、病態の重症度を軽減し、または病態の進行を遅延させまたは遅らせる、被験体が病態に罹患している間に行われる行動(「治療的処置」)を包含する。「治療する」、「治療すること」および「治療」は、病態の重症度を抑制または軽減する、被験体が病態に罹患し始める前に行われる行動(「予防的処置」)も包含する。
化合物の「有効量」は、所望の生体反応を引き起こす、例えば、病態を治療するのに十分な量を指す。当業者によって理解されるように、本明細書に記載される化合物の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、化合物の薬物動態、治療される病態、投与方法、ならびに被験体の年齢および健康などの要因に応じて変化し得る。有効量は、治療処置および予防処置のための治療的に有効な量および予防的に有効な量を包含する。
化合物の「治療的に有効な量」は、病態の処置に有効な治療を提供するか、または病態に関連する1つまたは複数の症状を遅延させるかまたは最小限に抑えるのに十分な量である。化合物の治療的に有効な量は、単独でまたは他の治療と組み合わせて、病態の処置に有効な治療を提供する、治療剤の量を意味する。「治療的に有効な量」という用語は、全体的な治療を改善し、症状または病態の原因を軽減または回避し、または別の治療剤の治療効果を促進する量を包含し得る。
化合物の「予防的に有効な量」は、病態、または病態に関連する1つまたは複数の症状を予防するかまたはその再発を予防するのに十分な量である。化合物の予防的に有効な量は、単独でまたは他の剤と組み合わせて、病態の予防における予防効果を提供する、治療剤の量を意味する。「予防的に有効な量」という用語は、全体的な予防を改善し、または別の予防薬の予防効果を促進する量を包含し得る。
本明細書において使用される際、「メチルトランスフェラーゼ」という用語は、供与体分子から受容体分子、例えば、タンパク質のアミノ酸残基またはDNA分子の核酸塩基へとメチル基を転移することができるトランスフェラーゼクラス酵素を表す。メチルトランスフェラーゼは、典型的に、メチル供与体としてのS−アデノシルメチオニン(SAM)中の硫黄に結合された反応性メチル基を使用する。ある実施形態において、本明細書に記載されるメチルトランスフェラーゼは、タンパク質メチルトランスフェラーゼである。ある実施形態において、本明細書に記載されるメチルトランスフェラーゼは、ヒストンメチルトランスフェラーゼである。ヒストンメチルトランスフェラーゼ(HMT)は、ヒストンタンパク質のリジンおよびアルギニン残基への1つまたは複数のメチル基の転移を触媒する、ヒストン修飾酵素(ヒストン−リジンN−メチルトランスフェラーゼおよびヒストン−アルギニンN−メチルトランスフェラーゼを含む)である。特定の実施形態において、本明細書に記載されるメチルトランスフェラーゼは、ヒストン−アルギニンN−メチルトランスフェラーゼである。
特定の実施形態において、提供される化合物は、PRMT5を阻害する。特定の実施形態において、提供される化合物は、野生型PRMT5を阻害する。特定の実施形態において、提供される化合物は、突然変異体PRMT5を阻害する。特定の実施形態において、提供される化合物は、例えば、本明細書に記載されるアッセイにおいて測定した際に、PRMT5を阻害する。特定の実施形態において、PRMT5は、ヒトに由来する。特定の実施形態において、提供される化合物は、10μM以下のIC50でPRMT5を阻害する。特定の実施形態において、提供される化合物は、1μM以下のIC50でPRMT5を阻害する。特定の実施形態において、提供される化合物は、0.1μM以下のIC50でPRMT5を阻害する。特定の実施形態において、提供される化合物は、10μM以下のEC50で細胞中のPRMT5を阻害する。特定の実施形態において、提供される化合物は、1μM以下のEC50で細胞中のPRMT5を阻害する。特定の実施形態において、提供される化合物は、0.1μM以下のEC50で細胞中のPRMT5を阻害する。特定の実施形態において、提供される化合物は、10μM以下のEC50で細胞増殖を阻害する。特定の実施形態において、提供される化合物は、1μM以下のEC50で細胞増殖を阻害する。特定の実施形態において、提供される化合物は、0.1μM以下のEC50で細胞増殖を阻害する。ある実施形態において、提供される化合物は、他のメチルトランスフェラーゼよりPRMT5に対して選択的である。特定の実施形態において、提供される化合物は、1つまたは複数の他のメチルトランスフェラーゼと比べて、PRMT5に対して、少なくとも約10倍選択的であり、少なくとも約20倍選択的であり、少なくとも約30倍選択的であり、少なくとも約40倍選択的であり、少なくとも約50倍選択的であり、少なくとも約60倍選択的であり、少なくとも約70倍選択的であり、少なくとも約80倍選択的であり、少なくとも約90倍選択的であり、または少なくとも約100倍選択的である。
本開示は、本明細書に記載される化合物、例えば、本明細書に記載される式(1〜5)または(A〜F)の化合物、またはその薬学的に許容できる塩と、任意選択的に薬学的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。本明細書に記載される化合物、またはその塩が、水和物、溶媒和物、または多形体などの様々な形態で存在し得ることが当業者によって理解されよう。特定の実施形態において、提供される組成物は、本明細書に記載される2つ以上の化合物を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載される化合物、またはその薬学的に許容できる塩は、医薬組成物中に有効量で提供される。特定の実施形態において、有効量は、治療的に有効な量である。特定の実施形態において、有効量は、PRMT5を阻害するのに有効な量である。特定の実施形態において、有効量は、PRMT5媒介性疾患(例えば、PRMT−5媒介性癌)を治療するのに有効な量である。特定の実施形態において、有効量は、予防的に有効な量である。特定の実施形態において、有効量は、PRMT5媒介性疾患を予防するのに有効な量である。特定の実施形態において、有効量は、PRMT5媒介性疾患(例えば、PRMT−5媒介性癌)を予防するのに有効な量である。特定の実施形態において、有効量は、癌(例えば、リンパ腫、例えばマントル細胞リンパ腫、乳癌、例えばトリプルネガティブ乳癌、または膵臓癌)を治療するのに十分な量である。
薬学的に許容できる賦形剤は、所望の特定の剤形に適するように、あらゆる溶媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散体、懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存料、固体結合剤、潤滑剤などを含む。医薬組成物の薬剤の製剤化および/または製造における一般的な考慮事項が、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,Sixteenth Edition,E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1980)、およびRemington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition(Lippincott Williams&Wilkins,2005)に見ることができる。
「薬学的に許容できる塩」は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを伴わずにヒトおよび他の動物の組織と接触した状態で使用するのに好適であり、かつ妥当なベネフィット/リスク比に見合う塩を指す。薬学的に許容できる塩は、当該技術分野において周知である。例えば、Bergeらが、J.Pharmaceutical Sciences(1977)66:1−19において詳細に薬学的に許容できる塩を説明している。本明細書に記載される化合物の薬学的に許容できる塩は、好適な無機および有機酸および塩基から誘導されるものを含む。薬学的に許容できる非毒性酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および過塩素酸などの無機酸とともに、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、またはマロン酸などの有機酸とともに、あるいはイオン交換などの当該技術分野において使用される他の方法を用いることによって形成されるアミノ基の塩である。他の薬学的に許容できる塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素、2−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩(pectinate)、過硫酸塩、3−フェニルプロピオネート、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。適切な塩基から誘導される塩としては、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムおよびN+(C1〜4アルキル)4塩が挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。さらなる薬学的に許容できる塩としては、適切な場合、第四級塩が挙げられる。
本明細書に記載される医薬組成物は、薬理学の技術分野において公知の任意の方法によって調製され得る。一般に、このような調製方法は、本明細書に記載される化合物(「活性成分」)を、担体および/または1つまたは複数の他の補助的な成分と合わせる工程と、次に、必要であるかおよび/または望ましい場合、生成物を、所望の単回または複数回用量単位へと成形および/または包装する工程とを含む。
医薬組成物は、単回単位用量として、および/または複数の単回単位用量として、大量に調製、包装、および/または販売され得る。本明細書において使用される際、「単位用量」は、所定の量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は、一般に、被験体に投与され得る活性成分の投与量および/または例えば、このような投与量の2分の1または3分の1などの、このような投与量の好都合な割合に等しい。
本開示の医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容できる賦形剤、および/または任意のさらなる成分の相対量は、治療される被験体の属性、サイズ、および/または病態に応じて、さらに組成物が投与される経路に応じて変化することになる。例として、組成物は、0.1%〜100%(w/w)の活性成分を含み得る。
提供される医薬組成物の製造に使用される薬学的に許容できる賦形剤としては、不活性希釈剤、分散剤および/または造粒剤、表面活性剤および/または乳化剤、崩壊剤、結合剤、保存料、緩衝剤、平滑剤、および/または油が挙げられる。カカオ脂および坐薬ワックスなどの賦形剤、着色剤、コーティング剤、甘味料、香味料、および芳香剤も、組成物中に存在し得る。
例示的な希釈剤としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥でんぷん、トウモロコシでんぷん、粉砂糖、およびそれらの混合物が挙げられる。
例示的な造粒剤および/または分散剤としては、ジャガイモでんぷん、トウモロコシでんぷん、タピオカでんぷん、でんぷんグリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、柑橘類の絞りかす、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木材製品、天然海綿、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、シリケート、炭酸ナトリウム、架橋ポリ(ビニル−ピロリドン)(クロスポビドン)、ナトリウムカルボキシメチルでんぷん(でんぷんグリコール酸ナトリウム)、カルボキシメチルセルロース、架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース(クロスカルメロース)、メチルセルロース、アルファでんぷん(スターチ1500)、微結晶性でんぷん、水不溶性でんぷん、カルシウムカルボキシメチルセルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム(Veegum)、ラウリル硫酸ナトリウム、第四級アンモニウム化合物、およびそれらの混合物が挙げられる。
例示的な表面活性剤および/または乳化剤としては、天然乳化剤(例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス(chondrux)、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン)、コロイド粘土(例えば、ベントナイト(ケイ酸アルミニウム)およびVeegum(ケイ酸アルミニウムマグネシウム))、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール(例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、トリアセチンモノステアレート、エチレングリコールジステアレート、モノステアリン酸グリセリル、およびプロピレングリコールモノステアレート、ポリビニルアルコール)、カルボマー(carbomer)(例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー)、カラギーナン、セルロース誘導体(例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース)、ソルビタン脂肪酸エステル(例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(Tween20)、ポリオキシエチレンソルビタン(Tween60)、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween80)、ソルビタンモノパルミテート(Span 40)、ソルビタンモノステアレート(Span 60)、ソルビタントリステアレート(Span 65)、グリセリルモノオレエート、ソルビタンモノオレエート(Span 80))、ポリオキシエチレンエステル(例えば、ポリオキシエチレンモノステアレート(Myrj 45)、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシ化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアレート、およびSolutol)、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル(例えば、Cremophor(商標))、ポリオキシエチレンエーテル、(例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル(Brij 30))、ポリ(ビニル−ピロリドン)、ジエチレングリコールモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、Pluronic F68、ポロキサマー188、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクサートナトリウム、および/またはそれらの混合物が挙げられる。
例示的な結合剤としては、でんぷん(例えば、トウモロコシでんぷんおよびでんぷん糊)、ゼラチン、糖類(例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトールなど)、天然および合成ゴム(例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスの抽出物、パンワーガム(panwar gum)、ガティガム(ghatti gum)、イサポール皮の粘液(mucilage of isapol husk)、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、酢酸セルロース、ポリ(ビニル−ピロリドン)、ケイ酸アルミニウムマグネシウム(Veegum)、およびカラマツアラビノガラクタン)、アルギネート、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、無機カルシウム塩、ケイ酸、ポリメタクリレート、ワックス、水、アルコール、および/またはそれらの混合物が挙げられる。
例示的な保存料としては、酸化防止剤、キレート剤、抗菌性保存料、抗真菌性保存料、アルコール保存料、酸性保存料、および他の保存料が挙げられる。
例示的な酸化防止剤としては、αトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および亜硫酸ナトリウムが挙げられる。
例示的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)ならびにその塩および水和物(例えば、エデト酸ナトリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸二カリウムなど)、クエン酸ならびにその塩および水和物(例えば、クエン酸一水和物)、フマル酸ならびにその塩および水和物、リンゴ酸ならびにその塩および水和物、リン酸ならびにその塩および水和物、ならびに酒石酸ならびにその塩および水和物が挙げられる。例示的な抗菌性保存料としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、およびチメロサールが挙げられる。
例示的な抗真菌性保存料としては、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、およびソルビン酸が挙げられる。
例示的なアルコール保存料としては、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾエート、およびフェニルエチルアルコールが挙げられる。
例示的な酸性保存料としては、ビタミンA、ビタミンC、ビタミンE、β−カロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、およびフィチン酸が挙げられる。
他の保存料としては、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム(deteroxime mesylate)、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム(SLS)、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム(SLES)、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、Glydant Plus、Phenonip、メチルパラベン、Germall 115、Germaben II、Neolone、Kathon、およびEuxylが挙げられる。特定の実施形態において、保存料は、酸化防止剤である。他の実施形態において、保存料は、キレート剤である。
例示的な緩衝剤としては、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルコヘプトン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、D−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、水酸化カルシウムリン酸塩、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、第二リン酸カリウム、第一リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱性物質除去水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、およびそれらの混合物が挙げられる。
例示的な平滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル、水添植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物が挙げられる。
例示的な天然油としては、アーモンド油、キョウニン油、アボカド油、ババス油、ベルガモット油、カシス種子油、ボラジ油、カデ油、カミツレ油、キャノーラ油、カラウェー油、カルナバ油、ヒマシ油、ケイ皮油、カカオ脂、ヤシ油、タラ肝油、コーヒー油、トウモロコシ油、綿実油、エミュー油、ユーカリ油、月見草油、魚油、アマニ油、ゲラニオール、ヒョウタン(gourd)油、ブドウ種油、ヘーゼルナッツ油、ヒソップ油、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ油、ククイナッツ油、ラバンジン油、ラベンダー油、レモン油、アオモジ(litsea cubeba)油、マカデミアナッツ油、ゼニアオイ油、マンゴー種子油、メドウフォーム種子油、ミンク油、ニクズク油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラフィー油、パーム油、パーム核油、トウニン油、ピーナッツ油、ケシ油、カボチャ種子油、菜種油、ぬか油、ローズマリー油、ベニバナ油、ビャクダン油、サザンカ(sasquana)油、セイバリー油、シーバックソーン油、ゴマ油、シアバター、シリコーン油、ダイズ油、ヒマワリ油、ティーツリー油、アザミ油、椿油、ベチバー油、クルミ油、および小麦胚芽油が挙げられる。例示的な合成油としては、以下に限定はされないが、ステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン360、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、およびそれらの混合物が挙げられる。
経口および非経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容できる乳剤、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒などの当該技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤、可溶化剤およびエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(例えば、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルなどの乳化剤、およびそれらの混合物を含み得る。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味料、香味料、および芳香剤などの補助剤を含み得る。非経口投与の特定の実施形態において、本明細書に記載される化合物は、Cremophor(商標)、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、およびそれらの混合物などの可溶化剤と混合される。
注射用製剤、例えば、滅菌した注射用水性または油性懸濁液が、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて、公知の技術にしたがって製剤化され得る。滅菌した注射用製剤が、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒中で、例えば、1,3−ブタンジオール中の溶液としての、滅菌した注射用溶液、懸濁液または乳剤であり得る。用いられ得る許容できるビヒクルおよび溶媒は、中でも特に、水、リンゲル液、米国薬局方(U.S.P.)グレードおよび等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌固定油は、溶媒または懸濁媒体として好都合に用いられる。このために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激固定油が用いられ得る。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が、注射用製剤に使用される。
注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルタを介したろ過によって、または使用前に、滅菌水または他の滅菌した注射用媒体に溶解または分散され得る滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって滅菌され得る。
薬剤の効果を延長するために、皮下または筋肉内注射からの薬剤の吸収を遅らせるのが望ましいことが多い。これは、難水溶性の結晶性または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成され得る。次に、薬剤の吸収速度は、その溶解速度に応じて決まり、溶解速度は、今度は、結晶サイズおよび結晶形態に応じて決まり得る。あるいは、非経口投与される薬剤形態の遅延吸収は、薬剤を油ビヒクルに溶解または懸濁させることによって行われる。
直腸または膣内投与用の組成物は、典型的に、本明細書に記載される化合物を、周囲温度で固体であるが体温で液体であり、したがって、直腸または膣腔内で溶融し、活性成分を放出する、カカオ脂、ポリエチレングリコールまたは坐薬ワックスなどの好適な非刺激性賦形剤または担体と混合することによって調製され得る坐薬である。
経口投与用の固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、丸薬、粉剤、および顆粒が挙げられる。このような固体剤形において、活性成分は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの少なくとも1つの不活性な薬学的に許容できる賦形剤または担体および/またはa)でんぷん、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸などの充填剤または増量剤、b)例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシアなどの結合剤、c)グリセロールなどの保湿剤、d)寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカでんぷん、アルギン酸、特定のシリケート、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、e)パラフィンなどの溶解遅延剤(solution retarding agent)、f)第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、g)例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなどの湿潤剤、h)カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤、およびi)タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物などの潤滑剤と混合される。カプセル剤、錠剤および丸薬の場合、剤形は、緩衝剤を含み得る。
同様のタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いて、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル剤中の充填剤として用いられ得る。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸薬、および顆粒の固体剤形は、腸溶コーティングおよび医薬品製剤化の技術分野において周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製され得る。それらは、乳白剤を任意選択的に含んでいてもよく、腸管の特定の部分のみでまたはそこで優先的に、任意選択的に、遅延させるように、活性成分を放出する組成物でできていてもよい。使用され得る埋め込み型組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。同様のタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いて、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル剤中の充填剤として用いられ得る。
活性成分は、上述される1つまたは複数の賦形剤を含むマイクロカプセル化形態であり得る。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸薬、および顆粒の固体剤形は、腸溶コーティング、放出制御コーティングおよび医薬品製剤化の技術分野において周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製され得る。このような固体剤形において、活性成分は、スクロース、ラクトース、またはでんぷんなどの少なくとも1つの不活性希釈剤と混合され得る。このような剤形は、通常の慣行どおりに、不活性希釈剤以外のさらなる物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロースなどの、錠剤化潤滑剤および他の錠剤化助剤を含み得る。カプセル剤、錠剤、および丸薬の場合、剤形は、緩衝剤を含み得る。それらは、乳白剤を任意選択的に含んでいてもよく、腸管の特定の部分のみでまたはそこで優先的に、任意選択的に、遅延させるように、活性成分を放出する組成物でできていてもよい。使用され得る埋め込み型組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。
提供される化合物の局所および/または経皮投与用の剤形は、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ジェル、粉剤、液剤、噴霧剤、吸入剤および/または貼付剤を含み得る。一般に、活性成分は、薬学的に許容できる担体および/または必要とされ得る際に任意の所望の保存料および/または緩衝液と、滅菌条件下で混合される。さらに、本開示は、経皮パッチの使用を包含し、経皮パッチは、身体への活性成分の制御された送達を提供する追加の利点を有することが多い。このような剤形は、例えば、活性成分を適切な媒体中に溶解および/または分散させることによって調製され得る。その代わりにまたはそれに加えて、速度が、速度制御膜を提供することによって、および/または活性成分をポリマーマトリックスおよび/またはゲル中に分散させることによって制御され得る。
本明細書に記載される皮内用医薬組成物を送達するのに使用するための好適なデバイスは、米国特許第4,886,499号明細書;同第5,190,521号明細書;同第5,328,483号明細書;同第5,527,288号明細書;同第4,270,537号明細書;同第5,015,235号明細書;同第5,141,496号明細書;および同第5,417,662号明細書に記載されるものなどの短い針状のデバイスを含む。皮内用組成物は、PCT公報の国際公開第99/34850号パンフレットに記載されるものおよびその機能的均等物などの、皮膚への針の有効貫通長さを限定するデバイスによって投与され得る。液体ジェット式注射器によって、および/または角質層を貫通し、真皮に達するジェットをもたらす針によって、液体ワクチンを真皮に送達するジェット式注射デバイスが好適である。ジェット式注射デバイスは、例えば、米国特許第5,480,381号明細書;同第5,599,302号明細書;同第5,334,144号明細書;同第5,993,412号明細書;同第5,649,912号明細書;同第5,569,189号明細書;同第5,704,911号明細書;同第5,383,851号明細書;同第5,893,397号明細書;同第5,466,220号明細書;同第5,339,163号明細書;同第5,312,335号明細書;同第5,503,627号明細書;同第5,064,413号明細書;同第5,520,639号明細書;同第4,596,556号明細書;同第4,790,824号明細書;同第4,941,880号明細書;同第4,940,460号明細書;およびPCT公報の国際公開第97/37705号パンフレットおよび国際公開第97/13537号パンフレットに記載される。圧縮ガスを使用して、粉末形態のワクチンを、皮膚の外層を通して真皮へと加速させる発射式の(ballistic)粉末/粒子送達デバイスが好適である。その代わりにまたはそれに加えて、従来の注射器が、皮内投与の従来のマントー法(mantoux method)に使用され得る。
局所投与に適した製剤としては、以下に限定はされないが、塗布剤、ローション、クリーム、軟膏および/またはペーストなどの水中油型および/または油中水型乳剤、および/または液剤および/または懸濁液などの、液体および/または半液体製剤が挙げられる。局所投与可能な製剤は、例えば、約1%〜約10%(w/w)の活性成分を含み得るが、活性成分の濃度は、溶媒中の活性成分の溶解限度程度の高さであり得る。局所投与用の製剤は、本明細書に記載されるさらなる成分の1つまたは複数をさらに含み得る。
提供される医薬組成物は、口腔を介して経肺投与に適した製剤中で調製、包装、および/または販売され得る。このような製剤は、活性成分を含み、かつ約0.5〜約7ナノメートルまたは約1〜約6ナノメートルの範囲の直径を有する乾燥粒子を含み得る。このような組成物は、噴射剤の流れを、粉末を分散させるように導くことができる乾燥粉末リザーバを含むデバイスを用いた、および/または密閉容器中の低沸点の噴射剤に溶解および/または懸濁された活性成分を含むデバイスなどの自己推進型の(self propelling)溶媒/粉末分注容器を用いた投与のために、乾燥粉末の形態であるのが好都合である。このような粉末は、重量で粒子の少なくとも98%が0.5ナノメートル超の直径を有し、数で粒子の少なくとも95%が7ナノメートル未満の直径を有する粒子を含む。あるいは、重量で粒子の少なくとも95%が1ナノメートル超の直径を有し、数で粒子の少なくとも90%が6ナノメートル未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、糖などの固体微粉末希釈剤を含んでいてもよく、単位用量形態で提供されるのが好都合である。
低沸点の噴射剤は、一般に、大気圧で65°F未満の沸点を有する液体噴射剤を含む。一般に、噴射剤は、組成物の50〜99.9%(w/w)を占めてもよく、活性成分は、組成物の0.1〜20%(w/w)を占め得る。噴射剤は、液体非イオン性および/または固体アニオン性界面活性剤および/または固体希釈剤(これは、活性成分を含む粒子と同程度の粒度を有し得る)などのさらなる成分をさらに含み得る。
肺送達用に製剤化された医薬組成物は、液剤および/または懸濁液の液滴の形態で活性成分を提供し得る。このような製剤は、活性成分を含む、任意選択的に滅菌した水性および/または希アルコール液剤および/または懸濁液として調製、包装、および/または販売され得、任意の噴霧および/または霧化デバイスを用いて好都合に投与され得る。このような製剤は、以下に限定はされないが、サッカリンナトリウムなどの着香料、揮発性油、緩衝剤、表面活性剤、および/またはヒドロキシ安息香酸メチルなどの保存料を含む1つまたは複数のさらなる成分をさらに含み得る。この投与経路によって提供される液滴は、約0.1〜約200ナノメートルの範囲の平均直径を有し得る。
肺送達に有用であると本明細書に記載される製剤は、医薬組成物の鼻腔内送達に有用である。鼻腔内投与に適した別の製剤は、活性成分を含み、約0.2〜500マイクロメートルの平均粒子を有する粗粉末である。このような製剤は、鼻孔に近接して保持された粉末の容器から鼻道を通して急速吸入によって投与される。
経鼻投与用の製剤は、例えば、約0.1%(w/w)程度から100%(w/w)もの活性成分を含んでいてもよく、本明細書に記載されるさらなる成分の1つまたは複数を含み得る。提供される医薬組成物は、口腔投与用の製剤中で、調製、包装、および/または販売され得る。このような製剤は、例えば、従来の方法を用いて作製される錠剤および/または舐剤の形態であってもよく、例えば、0.1〜20%(w/w)の活性成分、口腔で溶解可能および/または分解可能な組成物を含む残りの部分および、任意選択的に、本明細書に記載されるさらなる成分の1つまたは複数を含有し得る。代わりに、口腔投与用の製剤は、活性成分を含む、粉剤および/またはエアロゾル化および/または霧化された液剤および/または懸濁液を含み得る。このような粉末化、エアロゾル化、および/または霧化された製剤は、分散された場合、約0.1〜約200ナノメートルの範囲の平均粒度および/または液滴径を有していてもよく、本明細書に記載されるさらなる成分の1つまたは複数をさらに含み得る。
提供される医薬組成物は、眼内投与用の製剤中で、調製、包装、および/または販売され得る。このような製剤は、例えば、水性または油性液体担体中に、液剤および/または懸濁液の例えば0.1/1.0%(w/w)の活性成分を含む点眼剤の形態であり得る。このような液滴は、緩衝剤、塩、および/または1つまたは複数の他の本明細書に記載されるさらなる成分をさらに含み得る。有用な他の眼内投与可能な製剤としては、微結晶形態および/またはリポソーム製剤で活性成分を含むものが挙げられる。点耳剤および/または点眼剤は、本開示の範囲内であると考えられる。
本明細書に提供される医薬組成物の説明は、主に、ヒトへの投与に適した医薬組成物に関するが、このような組成物が、一般に、あらゆる種類の動物への投与に適していることが当業者によって理解されよう。組成物を様々な動物への投与に適するようにするための、ヒトへの投与に適した医薬組成物の改変は、よく理解されており、通常の技能を有する獣医学的薬理学者は、通常の実験によりこのような改変を設計および/または実行することができる。
本明細書に提供される化合物は、典型的に、投与の容易さおよび投薬の均一性のために、投薬単位形態で製剤化される。しかしながら、提供される組成物の一日の総使用量が、妥当な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されることが理解されよう。任意の特定の被験体または生物の特定の治療的に有効な用量レベルは、治療される疾患、障害、または病態および障害の重症度;用いられる特定の活性成分の活性;用いられる特定の組成物;被験体の年齢、体重、全体的な健康、性別および食事;投与の時間、投与経路、および用いられる特定の活性成分の排出速度;治療の持続時間;用いられる特定の活性成分と組み合わせてまたは同時に使用される薬剤;および医学技術分野で周知の類似の要因を含む、様々な要因に応じて決まる。
本明細書に提供される化合物および組成物は、腸内(例えば、経口)、非経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、皮下、脳室内、経皮、皮内、経直腸、膣内、腹腔内、局所(粉剤、軟膏、クリーム、および/または点滴剤などによる)、経粘膜、経鼻、口腔、舌下;気管内注入、気管支内注入、および/または吸入による;および/または経口噴霧、経鼻噴霧、および/またはエアゾールとしてなどを含む任意の経路によって投与され得る。特に考えられる経路は、経口投与、静脈内投与(例えば、全身性静脈注射)、血液および/またはリンパ液供給による局所的な投与、および/または患部への直接投与である。一般に、最も適切な投与経路は、薬剤の性質(例えば、胃腸管の環境内でのその安定性)、および/または被験体の病態(例えば、被験体が経口投与に耐えられるかどうか)を含む様々な要因に応じて決まる。
有効量を達成するのに必要とされる化合物の正確な量は、例えば、被験体の種、年齢、および全身状態、副作用または障害の重症度、特定の化合物の属性、投与方法などに応じて、被験体ごとに変化することになる。所望の投薬量は、1日に3回、1日に2回、1日に1回、2日に1回、3日に1回、週に1回、2週間に1回、3週間に1回、または4週間に1回送達され得る。特定の実施形態において、所望の投薬量は、複数回投与(例えば、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回、またはそれを超える回数の投与)を用いて送達され得る。
特定の実施形態において、70kgの成人への1日に1回または複数回の投与のための化合物の有効量は、単位剤形当たり約0.0001mg〜約3000mg、約0.0001mg〜約2000mg、約0.0001mg〜約1000mg、約0.001mg〜約1000mg、約0.01mg〜約1000mg、約0.1mg〜約1000mg、約1mg〜約1000mg、約1mg〜約100mg、約10mg〜約1000mg、または約100mg〜約1000mgの化合物を含み得る。
特定の実施形態において、所望の治療効果を得るために、本明細書に記載される化合物は、1日に1回または複数回、1日当たり被験体体重の、約0.001mg/kg〜約1000mg/kg、約0.01mg/kg〜約mg/kg、約0.1mg/kg〜約40mg/kg、約0.5mg/kg〜約30mg/kg、約0.01mg/kg〜約10mg/kg、約0.1mg/kg〜約10mg/kg、または約1mg/kg〜約25mg/kgを送達するのに十分な投薬レベルで投与され得る。
ある実施形態において、本明細書に記載される化合物は、1日に1回または複数回、複数日にわたって投与される。ある実施形態において、投与計画は、数日間、数週間、数ヶ月間、または数年間にわたって継続される。
本明細書に記載される用量範囲が、提供される医薬組成物の成人への投与のための指針を提供することが理解されよう。例えば、子供または青年に投与される量は、医師または当業者が決定することができ、成人に投与される量より少ないかまたは同じであり得る。
本明細書に記載される化合物または組成物が、1つまたは複数のさらなる治療効果のある薬剤と組み合わせて投与され得ることも理解されよう。特定の実施形態において、本明細書に提供される化合物または組成物は、その生物学的利用能を改善し、その代謝を軽減および/または改変し、その排出を阻害し、および/または身体内でのその分布を改変する1つまたは複数のさらなる治療効果のある薬剤と組み合わせて投与される。用いられる治療法は、同じ障害に対する所望の効果を達成することができ、および/またはそれは、異なる効果を達成し得ることも理解されよう。
ある実施形態において、本明細書に記載される2つ以上のPRMT5阻害剤(例えば、式(1〜5)または(A〜F))の2つ以上の化合物が、被験体を治療するのに使用され得る。例えば、第1のPRMT5阻害剤化合物または組成物が、1つまたは複数のさらなるPRMT5阻害剤化合物または組成物と同時に、その前に、またはその後に投与され得る。ある実施形態において、組成物は、本明細書に記載される2つ以上のPRMT5阻害剤の混合物を含む。
特定の実施形態において、本明細書に記載される1つまたは複数のPRMT5阻害剤化合物または組成物が、1つまたは複数のさらなる治療効果のある薬剤(例えば、式(1〜5)または(A〜F)の化合物でない治療効果のある薬剤、またはPRMT5阻害剤でない治療効果のある薬剤と同時に、その前に、またはその後に投与され得る。
一般に、各PRMT5阻害剤および/または他の薬剤は、その薬剤のために決定された用量および/またはタイムスケジュールで投与される。この組合せに用いられるさらなる治療効果のある薬剤が、単一の組成物中で一緒に投与されるかまたは異なる組成物中で別個に投与され得ることがさらに理解されよう。投与計画において用いるための特定の組合せは、提供される化合物と、さらなる治療効果のある薬剤との適合性および/または達成される所望の治療効果を考慮に入れることになる。一般に、併用されるさらなる治療効果のある薬剤が、それらが個別に用いられるレベルを超えないレベルで用いられることが予測される。ある実施形態において、併用されるレベルは、個別の用いられるレベルより低くなる。
例示的なさらなる治療効果のある薬剤としては、以下に限定はされないが、薬剤化合物(例えば、連邦規制基準(the Code of Federal Regulations(CFR))によって示されるように、米国食品医薬品局(U.S.Food and Drug Administration)によって承認される化合物)などの有機小分子、ペプチド、タンパク質、炭水化物、単糖類、オリゴ糖、多糖類、核タンパク質、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成ポリペプチドまたはタンパク質、タンパク質に結合される小分子、糖タンパク質、ステロイド、核酸、DNA、RNA、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、脂質、ホルモン、ビタミン、および細胞が挙げられる。
例えば、本明細書に記載される治療方法は、化学療法、放射線治療、および/または細胞増殖抑制剤と併用して実施され得る。本明細書に記載される治療方法は、抗VEGFまたは抗血管新生因子、および/またはp53再活性化剤と併用して実施される。癌化学療法剤の例としては、限定はされないが、イリノテカン(CPT−11);エルロチニブ;ゲフィチニブ(Iressa(登録商標));メシル酸イマチニブ(Gleevec(登録商標));オキサリプラチン;アントラサイクリン−イダルビシンおよびダウノルビシン;ドキソルビシン;メルファランおよびクロラムブシルなどのアルキル化剤;シス−白金、メトトレキサート、ならびにビンデシンおよびビンブラスチンなどのアルカロイドが挙げられる。細胞増殖抑制剤は、細胞の成長および増殖を阻害または抑制することができる任意の薬剤である。癌の治療に使用される細胞増殖抑制剤の例は、パクリタキセル、5−フルオロウラシル、5−フルオロウリジン、マイトマイシン−C、ドキソルビシン、およびゾタロリムスである。他の癌治療薬としては、マリマスタットなどの、マトリックスメタロプロテアーゼの阻害剤、増殖因子アンタゴニスト、シグナル伝達阻害剤およびプロテインキナーゼC阻害剤が挙げられる。
別の実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、抗VEGF剤と併用して投与される。抗VEGF剤のいくつかの例としては、ベバシズマブ(Avastin(登録商標))、VEGF Trap、CP−547,632、AG13736、AG28262、SU5416、SU11248、SU6668、ZD−6474、ZD4190、CEP−7055、PKC 412、AEE788、AZD−2171、ソラフェニブ、バタラニブ、ペガプタニブ八ナトリウム、IM862、DC101、アンジオザイム、Sirna−027、カプロスタチン、ネオバスタット、ラニビズマブ、サリドマイド、およびAGA−1470、フマギリンの合成類似体(代替名:アメバシリン、フギリン、フマジルB、フマジル)(A.G.Scientific、カタログ番号F1028)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigates)から分泌されるアンジオ阻害(angio−inhibitory)化合物が挙げられる。
本明細書において使用される際、「抗VEGF剤」という用語は、VEGF受容体タンパク質の機能を阻害することを含む、VEGFタンパク質の機能を阻害することによって、細胞の成長、増殖および生存を促進するシグナル伝達経路に直接の影響を生じる任意の化合物または薬剤を指す。本明細書において使用される際の「薬剤」または「化合物」という用語は、アンチセンス核酸などの修飾および非修飾核酸、siRNAまたはshRNAなどのRNAi剤、ペプチド、ペプチド模倣薬、受容体、リガンド、および抗体を含む、任意の有機または無機分子を意味する。好ましいVEGF阻害剤としては、例えば、AVASTIN(登録商標)(ベバシズマブ)、Genentech,Inc.(South San Francisco,CA)の抗VEGFモノクローナル抗体、VEGF Trap(Regeneron/Aventis)が挙げられる。さらなるVEGF阻害剤としては、CP−547,632(3−(4−ブロモ−2,6−ジフルオロ−ベンジルオキシ)−5−[3−(4−ピロリジン1−イル−ブチル)−ウレイド]−イソチアゾール−4−カルボン酸アミド塩酸塩;Pfizer Inc.,NY)、AG13736、AG28262(Pfizer Inc.)、SU5416、SU11248、&SU6668(旧Sugen Inc.、現Pfizer(New York,New York))、ZD−6474(AstraZeneca)、VEGF−R2および−R1を阻害するZD4190(AstraZeneca)、CEP−7055(Cephalon Inc.,Frazer,PA)、PKC 412(Novartis)、AEE788(Novartis)、AZD−2171)、NEXAVAR(登録商標)(BAY 43−9006、ソラフェニブ;Bayer PharmaceuticalsおよびOnyx Pharmaceuticals)、バタラニブ(PTK−787、ZK−222584としても知られている:Novartis&Schering:AG)、MACUGEN(登録商標)(ペガプタニブ八ナトリウム、NX−1838、EYE−001、Pfizer Inc./Gilead/Eyetech)、IM862(グルファニド二ナトリウム、Cytran Inc.(Kirkland,Washington,USA))、VEGFR2選択的モノクローナル抗体DC101(ImClone Systems,Inc.)、アンジオザイム、Ribozyme(Boulder,Colorado)およびChiron(Emeryville,California)製の合成リボザイム、Sirna−027(siRNAベースのVEGFR1阻害剤、Sirna Therapeutics,San Francisco,CA)カプロスタチン、VEGF受容体の可溶性細胞外ドメイン、ネオバスタット(Aeterna Zentaris Inc;Quebec City,CA)およびそれらの組合せが挙げられる。
ある実施形態において、本明細書に記載される1つまたは複数のPRMT5阻害剤化合物または組成物は、乳癌を治療するのに有効な1つまたは複数のさらなる治療効果のある薬剤(例えば、式(1〜5)または(A〜F)の化合物でない治療効果のある薬剤、またはPRMT5阻害剤でない治療効果のある薬剤)と同時に、その前に、またはその後に投与され得る。例示的な化合物としては、限定はされないが:Abitrexate(メトトレキサート)、Abraxane(登録商標)(パクリタキセルアルブミン安定化小粒子製剤)、Ado−トラスツズマブエムタンシン、アドリアマイシンPFS(登録商標)(ドキソルビシン塩酸塩)、アドリアマイシンRDF(登録商標)(ドキソルビシン塩酸塩)、Adrucil(登録商標)(フルオロウラシル)、Afinitor(登録商標)(エベロリムス)、アナストロゾール、Aredia(登録商標)(パミドロン酸二ナトリウム)、Arimidex(登録商標)(アナストロゾール)、Aromasin(エキセメスタン)、カペシタビン、Clafen(登録商標)(シクロホスファミド)、シクロホスファミド、Cytoxan(登録商標)(シクロホスファミド)、ドセタキセル、ドキソルビシン塩酸塩、Efudex(登録商標)(フルオロウラシル)、Ellence(登録商標)(エピルビシン塩酸塩)、エピルビシン塩酸塩、エベロリムス、エキセメスタン、Fareston(登録商標)(トレミフェン)、Faslodex(登録商標)(フルベストラント)、Femara(登録商標)(レトロゾール)、Fluoroplex(登録商標)(フルオロウラシル)、フルオロウラシル、Folex(登録商標)(メトトレキサート)、Folex PFS(登録商標)(メトトレキサート)、フルベストラント、ゲムシタビン塩酸塩、Gemzar(登録商標)(ゲムシタビン塩酸塩)、ゴセレリン酢酸塩、Herceptin(登録商標)(トラスツズマブ)、イキサベピロン、Ixempra(登録商標)(イキサベピロン)、Kadcyla(登録商標)(Ado−トラスツズマブエムタンシン)、ラパチニブジトシラート、レトロゾール、Megace(登録商標)(酢酸メゲストロール)、酢酸メゲストロール、メトトレキサート、メトトレキサートLPF(登録商標)(メトトレキサート)、Mexate(登録商標)(メトトレキサート)、Mexate−AQ(登録商標)(メトトレキサート)、Neosar(登録商標)(シクロホスファミド)、Nolvadex(登録商標)(タモキシフェンクエン酸塩)、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン安定化小粒子製剤、パミドロン酸二ナトリウム、Perjeta(登録商標)(パーツズマブ)、パーツズマブ、タモキシフェンクエン酸塩、Taxol(登録商標)(パクリタキセル)、Taxotere(登録商標)(ドセタキセル)、トラスツズマブ、トレミフェン、Tykerb(登録商標)(ラパチニブジトシラート)、ゼローダ(登録商標)(カペシタビン)、およびZoladex(登録商標)(ゴセレリン酢酸塩)が挙げられる。
ある実施形態において、本明細書に記載される1つまたは複数のPRMT5阻害剤化合物または組成物は、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫および/またはマントル細胞リンパ腫を治療するのに有効な1つまたは複数のさらなる治療効果のある薬剤(例えば、式(1〜5)または(A〜F)の化合物でない治療効果のある薬剤、またはPRMT5阻害剤でない治療効果のある薬剤)と同時に、その前に、またはその後に投与され得る。例示的な化合物としては、限定はされないが:Abitrexate(登録商標)(メトトレキサート)、Adcetris(登録商標)(ブレンツキシマブベドチン)、アドリアマイシンPFS(登録商標)(ドキソルビシン塩酸塩)、アドリアマイシンRDF(登録商標)(ドキソルビシン塩酸塩)、Ambochlorin(登録商標)(クロラムブシル)、Amboclorin(登録商標)(クロラムブシル)、Arranon(登録商標)(ネララビン)、Becenum(登録商標)(カルムスチン)、Beleodaq(登録商標)(ベリノスタット)、ベリノスタット、ベンダムスチン塩酸塩、Bexxar(登録商標)(トシツモマブおよびヨウ素I 131トシツモマブ)、BiCNU(登録商標)(カルムスチン)、Blenoxane(登録商標)(ブレオマイシン)、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブレンツキシマブベドチン、Carmubris(登録商標)(カルムスチン)、カルムスチン、クロラムブシル、Clafen(登録商標)(シクロホスファミド)、シクロホスファミド、Cytoxan(登録商標)(シクロホスファミド)、デニロイキンディフチトクス、DepoCyt(登録商標)(リポソームシタラビン)、ドキソルビシン塩酸塩、DTIC−Dome(登録商標)(ダカルバジン)、Folex(登録商標)(メトトレキサート)、Folex PFS(登録商標)(メトトレキサート)、Folotyn(登録商標)(プララトレキサート)、イブリツモマブチウキセタン、イブルチニブ、Imbruvica(登録商標)(イブルチニブ)、Intron A(登録商標)(組み換えインターフェロンα−2b)、Istodax(登録商標)(ロミデプシン)、レナリドミド、Leukeran(登録商標)(クロラムブシル)、Linfolizin(登録商標)(クロラムブシル)、リポソームシタラビン、Matulane(登録商標)(プロカルバジン塩酸塩)、メクロレタミン塩酸塩、メトトレキサート、メトトレキサートLPF(登録商標)(メトトレキサート)、Mexate(登録商標)(メトトレキサート)、Mexate−AQ(登録商標)(メトトレキサート)、Mozobil(登録商標)(プレリキサフォル)、Mustargen(登録商標)(メクロレタミン塩酸塩)、ネララビン、Neosar(登録商標)(シクロホスファミド)、Ontak(登録商標)(デニロイキンディフチトクス)、プレリキサフォル、プララトレキサート、組み換えインターフェロンα−2b、Revlimid(登録商標)(レナリドミド)、Rituxan(登録商標)(リツキシマブ)、リツキシマブ、ロミデプシン、トシツモマブおよびヨウ素I 131トシツモマブ、Treand(登録商標)(ベンダムスチン塩酸塩)、Velban(登録商標)(ビンブラスチン硫酸塩)、Velcade(登録商標)(ボルテゾミブ)、Velsar(登録商標)(ビンブラスチン硫酸塩)、ビンブラスチン硫酸塩、Vincasar PFS(登録商標)(ビンクリスチン硫酸塩)、ビンクリスチン硫酸塩、ボリノスタット、Zevalin(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン)、およびZolinza(登録商標)(ボリノスタット)が挙げられる。
ある実施形態において、本明細書に記載される1つまたは複数のPRMT5阻害剤化合物または組成物は、膵臓癌を治療するのに有効な1つまたは複数のさらなる治療効果のある薬剤(例えば、式(1〜5)または(A〜F)の化合物でない治療効果のある薬剤、またはPRMT5阻害剤でない治療効果のある薬剤)と同時に、その前に、またはその後に投与され得る。例示的な化合物としては、限定はされないが:Abraxane(登録商標)(パクリタキセルアルブミン安定化小粒子製剤)、Adrucil(登録商標)(フルオロウラシル)、Afinitor(登録商標)(エベロリムス)、Efudex(登録商標)(フルオロウラシル)、エルロチニブ塩酸塩、エベロリムス、Fluoroplex(登録商標)(フルオロウラシル)、フルオロウラシル、ゲムシタビン塩酸塩、Gemzar(登録商標)(ゲムシタビン塩酸塩)、マイトマイシンC、Mitozytrex(登録商標)(マイトマイシンC)、Mutamycin(登録商標)(マイトマイシンC)、パクリタキセルアルブミン安定化小粒子製剤、スニチニブリンゴ酸塩、Sutent(登録商標)(スニチニブリンゴ酸塩)、およびTarceva(登録商標)(エルロチニブ塩酸塩)が挙げられる。
キット(例えば、医薬品包装(pharmaceutical pack))も本開示によって包含される。提供されるキットは、提供される医薬組成物または化合物および容器(例えば、バイアル、アンプル、瓶、注射器、および/またはディスペンサーパッケージ、または他の好適な容器)を含み得る。ある実施形態において、提供されるキットは、任意選択的に、提供される医薬組成物または化合物の希釈または懸濁のための医薬品用賦形剤を含む第2の容器をさらに含み得る。ある実施形態において、容器および第2の容器中に提供される、提供される医薬組成物または化合物は、組み合わされて、1つの単位剤形が形成される。ある実施形態において、提供されるキットは、使用説明書をさらに含む。
本明細書に記載される化合物および組成物は、一般に、PRMT5の阻害に有用である。ある実施形態において、被験体のPRMT5媒介性疾患を治療する方法であって、有効量の本明細書に記載される化合物(例えば、式(1〜5)または(A〜F)の化合物)、またはその薬学的に許容できる塩)を、治療を必要とする被験体に投与する工程を含む方法が提供される。特定の実施形態において、有効量は、治療的に有効な量である。特定の実施形態において、有効量は、予防的に有効な量である。特定の実施形態において、被験体は、PRMT5媒介性疾患(例えば、癌、例えばリンパ腫、乳癌、または膵臓癌)に罹患している。特定の実施形態において、被験体は、PRMT5媒介性疾患(例えば、癌、例えばリンパ腫、乳癌、または膵臓癌)に罹患しやすい。
本明細書において使用される際、「PRMT5媒介性疾患」という用語は、PRMT5が関与することが知られている任意の疾患、障害、または他の病態を意味する。したがって、ある実施形態において、本開示は、PRMT5が関与することが知られている1つまたは複数の疾患を治療し、またはその重症度を軽減することに関する。
ある実施形態において、それを必要とする被験体のPRMT5活性を阻害する方法であって、有効量の本明細書に記載される化合物(例えば、式(1〜5)または(A〜F)の化合物)、またはその薬学的に許容できる塩、またはその医薬組成物を被験体に投与する工程を含む方法が提供される。
ある実施形態において、提供される化合物は、癌などの増殖性疾患を治療するのに有用である。特定の実施形態において、本明細書に記載される抗癌化合物は、リンパ腫を治療するのに有用である。ある実施形態において、リンパ腫はマントル細胞リンパ腫(MCL)である。ある実施形態において、リンパ腫は急性骨髄性リンパ腫(AML)である。ある実施形態において、本明細書に記載される抗癌化合物は、膵臓癌を治療するのに有用である。ある実施形態において、本明細書に記載される抗癌化合物は、多発性骨髄腫(MM)を治療するのに有用である。ある実施形態において、本明細書に記載される抗癌化合物は、乳癌を治療するのに有用である。ある実施形態において、乳癌はエストロゲン受容体陰性(ER−)である。ある実施形態において、乳癌はプロゲステロン受容体陰性(PR−)である。ある実施形態において、乳癌はHER2陰性である。ある実施形態において、乳癌は、エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびHER2陰性である(本明細書において「トリプルネガティブ乳癌」とも呼ばれる)。
ある実施形態において、本明細書に記載される1つまたは複数の化合物は、乳癌を治療するのに有用である。ある実施形態において、乳癌はエストロゲン受容体陰性(ER−)である。ある実施形態において、乳癌はプロゲステロン受容体陰性(PR−)である。ある実施形態において、乳癌はHER2陰性である。ある実施形態において、乳癌は、エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびHER2陰性である(本明細書において「トリプルネガティブ乳癌」とも呼ばれる)。ある実施形態において、乳癌は、非浸潤性小葉癌(LCIS)、非浸潤性乳管癌(DCIS)、浸潤性乳管癌(IDC)、炎症性乳癌、乳頭パジェット病、葉状腫瘍、血管肉腫、腺様嚢胞癌、低悪性腺扁平上皮癌、髄様癌、粘液癌、乳頭癌、管状腺癌、化生癌、微小乳頭癌、混合癌、またはトリプルネガティブ、HER陽性、エストロゲン受容体陽性、プロゲステロン受容体陽性、HERおよびエストロゲン受容体陽性、HERおよびプロゲステロン受容体陽性、エストロゲンおよびプロゲステロン受容体陽性、ならびにHERおよびエストロゲンおよびプロゲステロン受容体陽性を含むがこれらに限定されない別の乳癌であり得る。
したがって、ある実施形態において、被験体の癌を治療する方法は、PRMT5阻害剤を含む組成物を被験体に投与する工程を含む。ある実施形態において、癌はリンパ腫である。ある実施形態において、リンパ腫はマントル細胞リンパ腫である。ある実施形態において、癌は乳癌である。ある実施形態において、乳癌はトリプルネガティブ乳癌である。ある実施形態において、癌は膵臓癌である。
ある実施形態において、本明細書に記載される1つまたは複数の化合物は、任意のPRMT5媒介性またはPRMT5応答性増殖細胞疾患、例えばPRMT5応答性の癌を治療するのに有用である。
ある実施形態において、p53が欠損した癌(例えば、p53ヌル癌)は、p53陽性の癌よりPRMT5阻害に対する感受性が低い。したがって、PRMT5応答性の癌はp53陽性癌であり得る。「p53陽性」という用語は、p53発現および/または活性のない癌を指す。ある実施形態において、本明細書に記載される1つまたは複数の化合物は、p53陽性癌を治療するのに有用である。ある実施形態において、より多い量の本明細書に記載される1つまたは複数の化合物が、p53陽性癌よりp53陰性癌(例えば、p53ヌル癌)を治療するのに必要とされ得る。
ある実施形態において、本開示は、PRMT5阻害剤による治療に感受性の癌に罹患している被験体を特定するための方法を提供する。ある実施形態において、本方法は、被験体から試料を取得する工程と;p53の存在または非存在を検出する工程と;p53が試料中に存在する場合、PRMT5阻害剤による治療に感受性の癌に罹患している被験体を特定する工程とを含む。したがって、ある実施形態において、p53陽性癌に罹患している被験体が、PRMT5阻害剤による治療のための被験体として特定される。ある実施形態において、本方法は、PRMT5阻害剤を含む組成物を被験体に投与する工程をさらに含む。
ある実施形態において、本開示の態様は、PRMT5阻害剤による治療に感受性でない癌(または低い感受性を有する癌)に罹患している被験体を特定するための方法に関する。ある実施形態において、本方法は、被験体から試料を取得する工程と;p53の存在または非存在を検出する工程と;p53が試料に存在しない場合(例えば、癌がp53ヌル癌である場合)PRMT5阻害剤による治療に感受性でない癌(例えば、p53陽性癌より感受性が低い癌)に罹患している被験体を特定する工程とを含む。ある実施形態において、p53陰性癌(例えば、p53ヌル癌)が、PRMT5阻害剤で治療されるが、より多い量のPRMT5阻害剤が、p53陽性癌よりp53陰性癌を治療するのに必要とされ得る。しかしながら、ある実施形態において、p53陰性癌(例えば、p53ヌル癌)に罹患している被験体が、PRMT5阻害剤でない治療剤で治療される。
「試料」とは、被験体に由来する任意の生体試料を意味し、限定はされないが、細胞、組織試料、体液(限定はされないが、粘液、血液、血漿、血清、尿、唾液、および***を含む)、癌細胞、および癌組織を含む。試料中のp53の存在または非存在の検出は、p53核酸またはタンパク質を検出するための任意の好適な方法、例えば、核酸シークエンシング(例えば、DNAまたはRNAシークエンシング)、定量PCR、ウエスタンブロット法など、またはそれらの任意の組合せによって行われ得る。
ある実施形態において、本明細書に記載される化合物の1つまたは複数が、聴神経腫、腺癌、副腎癌、肛門癌、血管肉腫(例えば、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、血管内皮腫)、虫垂癌、良性単クローン性免疫グロブリン血症、胆道癌(例えば、胆管癌)、膀胱癌、脳腫瘍(例えば、髄膜腫;神経膠腫、例えば、星細胞腫、乏突起膠腫;髄芽腫)、気管支癌、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌(例えば、子宮頚部腺癌)、絨毛腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、結腸直腸癌(例えば、結腸癌、直腸癌、結腸直腸腺癌)、上皮癌、上衣腫、内皮肉腫(例えば、カポジ肉腫、多発性特発性出血性肉腫)、子宮内膜癌(例えば、子宮癌、子宮肉腫)、食道癌(例えば、食道の腺癌、バレット腺癌)、ユーイング肉腫、眼癌(例えば、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫)、家族性過好酸球増加症、胆嚢癌、胃癌(例えば、胃腺癌)、消化管間質性腫瘍(GIST)、頭頸部癌(例えば、頭頸部扁平上皮細胞癌、口腔癌(例えば、口腔扁平上皮細胞癌(OSCC)、喉の癌(例えば、喉頭癌、咽頭癌、上咽頭癌、口咽頭癌))、造血器癌(例えば、急性リンパ性白血病(ALL)(例えば、B細胞ALL、T細胞ALL)、急性骨髄性白血病(AML)(例えば、B細胞AML、T細胞AML)、慢性骨髄性白血病(CML)(例えば、B細胞CML、T細胞CML)、および慢性リンパ性白血病(CLL)(例えば、B細胞CLL、T細胞CLL)などの白血病;濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫(CLL/SLL)、辺縁帯B細胞リンパ腫(例えば、粘膜関連リンパ系組織(MALT)リンパ腫、節性辺縁帯B細胞リンパ腫、脾性辺縁帯B細胞リンパ腫)、縦隔原発B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫(例えば、「ワルデンストレームマクログロブリン血症」)、有毛細胞白血病(HCL)、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Bリンパ芽球性リンパ腫および原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫;および前駆Tリンパ芽球性リンパ腫/白血病、末梢性T細胞リンパ腫(PTCL)(例えば、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)(例えば、菌状息肉腫、セザリー症候群)、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラーT細胞リンパ腫、腸症型T細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様T細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫)などのT細胞NHL;上述される1つまたは複数の白血病/リンパ腫の混合;および多発性骨髄腫(MM))、重鎖病(例えば、α鎖病、γ鎖病、μ鎖病)、血管芽腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、免疫細胞性アミロイドーシス、腎臓癌(例えば、腎芽腫(別名、ウィルムス腫瘍)、腎細胞癌)、肝臓癌(例えば、肝細胞癌(HCC)、悪性肝細胞癌)、肺癌(例えば、気管支原性癌、小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌)、平滑筋肉腫(LMS)、肥満細胞症(例えば、全身性肥満細胞症)、骨髄異形成症候群(MDS)、中皮腫、骨髄増殖性疾患(MPD)(例えば、真性赤血球増加症(PV)、本態性血小板血症(ET)、特発性骨髄化生(AMM)(別名、骨髄線維症(MF))、慢性特発性骨髄線維症、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性好中球性白血病(CNL)、特発性好酸球増加症候群(HES))、神経芽細胞腫、神経繊維腫(例えば、神経線維腫症(NF)I型またはII型、シュワン細胞腫)、神経内分泌癌(例えば、胃腸膵管系神経内分泌腫瘍(GEP−NET)、カルチノイド腫瘍)、骨肉腫、卵巣癌(例えば、嚢胞腺癌、卵巣胎児性癌、卵巣腺癌)、乳頭腺癌、陰茎癌(例えば、***外ページェット病)、松果体腫、原始神経外胚葉性腫瘍(PNT)、前立腺癌(例えば、前立腺腺癌)、直腸癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮膚癌(例えば、扁平上皮細胞癌(SCC)、角化棘細胞腫(KA)、黒色腫、基底細胞癌(BCC))、小腸癌(例えば、虫垂癌)、軟組織肉腫(例えば、悪性線維性組織球腫(MFH)、脂肪肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)、軟骨肉腫、線維肉腫、粘液肉腫)、脂腺癌、汗腺癌、滑膜腫、精巣癌(例えば、精上皮腫、精巣胎児性癌)、甲状腺癌(例えば、甲状腺乳頭癌、甲状腺乳頭癌(PTC)、甲状腺髄様癌)、尿道癌、膣癌、および外陰癌(例えば、外陰ページェット病)を含むがこれらに限定されない他のタイプの癌を治療するのに有用であり得ることを理解されたい。
ある実施形態において、被験体の癌を治療する方法は、PRMT5阻害剤を含む組成物を被験体に投与する工程を含み、ここで、PRMT5阻害剤による治療が、約25%超、約50%超、約75%超、約90%超(例えば、25%〜50%、50%〜75%、75%〜90%、または90%〜100%)だけ癌の腫瘍増殖を阻害する。ある実施形態において、被験体の癌を治療する方法は、PRMT5阻害剤を含む組成物を被験体に投与する工程を含み、ここで、癌のメチルマークが、約50%超、約75%超、約80%超(例えば、50%〜75%、50%〜80%、80%〜90%、80%〜100%、または90%〜100%)だけ減少される。メチルマークは、タンパク質メチル化、例えばヒストンメチル化(例えば、ヒストンタンパク質の1つまたは複数のリジンおよび/またはアルギニンのメチル化)、またはDNAメチル化(例えば、エピジェネティックなDNAメチル化、例えばメチル化CpG部位)を指す。ある実施形態において、細胞のメチルマークレベルは、ヒストンが細胞中でメチル化される程度の尺度である(例えば、1つまたは複数の特定のリジンおよび/またはアルギニン位置において)。
ある実施形態において、被験体の癌を治療する方法は、PRMT5阻害剤を含む組成物を被験体に投与する工程を含み、ここで、被験体の体重減少が、約20%未満、約15%未満、約10%未満、約8%未満、または約5%未満(例えば、20%〜10%、10%〜5%、約8%、約6%、約5%、約4%、または5%〜0%)である。したがって、ある実施形態において、被験体の癌を治療する方法は、PRMT5阻害剤を含む組成物を被験体に投与する工程を含み、ここで、被験体の体重減少が約8%以下である。ある実施形態において、被験体の癌を治療する方法は、PRMT5阻害剤を含む組成物を被験体に投与する工程を含み、ここで、被験体の体重減少が約6%以下である。ある実施形態において、被験体の癌を治療する方法は、PRMT5阻害剤を含む組成物を被験体に投与する工程を含み、ここで、被験体の体重減少が約4%以下である。
ある態様において、本開示は、MDM4(MDMXとしても知られている)過剰発現が、被験体におけるPRMT5阻害剤の活性を弱め得るという意外な発見に関する。例えば、MDM4過剰発現は、癌細胞(例えば、リンパ腫細胞)中のPRMT5阻害剤によって誘発される増殖/死の表現型を部分的に救うことができる。したがって、ある実施形態において、癌を治療する方法は、被験体へのPRMT5阻害剤を含む組成物の投与と同時に(例えば、その前に、またはそれと同時に、および/またはその後に)MDM4活性またはMDM4発現を阻害する工程を含む。MDM4活性は、(例えば、MDM4阻害剤の投与によって)直接または間接的に(例えば、MDM4発現のサイレンシング)阻害され得る。MDM4阻害剤の例としては、SJ−172550およびNSC−207895が挙げられる。ある実施形態において、MDM4発現のサイレンシングは、転写後遺伝子サイレンシング(例えば、RNA干渉)によって、またはMDM4遺伝子プロモータ(例えば、PPAR−α、MZF−1、NRF−2、c−Ets−1、TPB、Elk−1、HEN1)におけるMDM4転写因子結合部位との干渉によって行われる。
何らかの理論に制約されることを望むものではないが、MDM4活性またはMDM4発現を阻害することにより、腫瘍抑制タンパク質、p53が活性化されるものと考えられる。ある態様において、p53はまた、MDM2活性またはMDM2発現を阻害することによって活性化され得る。したがって、ある実施形態において、癌を治療する方法は、被験体へのPRMT5阻害剤を含む組成物の投与と同時に(例えば、その前に、またはそれと同時に、および/またはその後に)MDM2活性またはMDM2発現を阻害する工程を含む。MDM2活性は、(例えば、MDM2阻害剤の投与によって)直接または間接的に(例えば、MDM2発現のサイレンシング)阻害され得る。MDM2阻害剤の例としては、Nutlin−3a、NSC−66811、NSC−652287、およびSP−141が挙げられる。ある実施形態において、MDM2発現のサイレンシングが、転写後遺伝子サイレンシング(例えば、RNA干渉)によって、またはMDM2遺伝子プロモータ(例えば、AP−1)におけるMDM2転写因子結合部位との干渉によって行われる。
本明細書に記載される本発明が、より十分に理解され得るために、以下の実施例が記載される。これらの実施例は、あくまでも例示のためのものであり、決して本明細書を限定するものと解釈されるべきではないことを理解されたい。
実施例1:材料および方法
Z−138メチル化アッセイ
Z−138懸濁細胞を、ATCC(米国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection,Manassas,VA)から購入した。RPMI/Glutamax培地、ペニシリン−ストレプトマイシン、熱失活したウシ胎児血清、およびD−PBSを、Life Technologies(Grand Island,NY,USA)から購入した。Odysseyブロッキング緩衝液、800CWヤギ抗ウサギIgG(H+L)抗体、およびLicor Odyssey赤外線スキャナを、Licor Biosciences(Lincoln,NE,USA)から購入した。対称性ジメチルアルギニン抗体を、EMD Millipore(Billerica,MA,USA)から購入した。16%のパラホルムアルデヒドを、Electron Microscopy Sciences(Hatfield,PA,USA)から購入した。
Z−138メチル化アッセイ
Z−138懸濁細胞を、ATCC(米国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection,Manassas,VA)から購入した。RPMI/Glutamax培地、ペニシリン−ストレプトマイシン、熱失活したウシ胎児血清、およびD−PBSを、Life Technologies(Grand Island,NY,USA)から購入した。Odysseyブロッキング緩衝液、800CWヤギ抗ウサギIgG(H+L)抗体、およびLicor Odyssey赤外線スキャナを、Licor Biosciences(Lincoln,NE,USA)から購入した。対称性ジメチルアルギニン抗体を、EMD Millipore(Billerica,MA,USA)から購入した。16%のパラホルムアルデヒドを、Electron Microscopy Sciences(Hatfield,PA,USA)から購入した。
Z−138懸濁細胞を、増殖培地(10% v/vの熱失活したウシ胎児血清および100単位/mLのペニシリン−ストレプトマイシンが補充されたRPMI 1640)において維持し、5%のCO2下で、37℃で培養した。
対称性ジメチルアルギニンおよびDNA含量の検出のための細胞処理、In Cell Western(ICW)
Z−138細胞を、1ウェル当たり50μLで、384ウェル細胞培養プレートに、50,000個の細胞/mLの濃度のアッセイ培地中で播種した。384ウェルソースプレートからの化合物(100nL)を、384ウェル細胞プレートに直接加えた。プレートを、37℃、5%のCO2で96時間インキュベートした。4日間のインキュベーションの後、インキュベートされたプレートからの40μLの細胞を、ポリ−d−リジンで被覆された384ウェル培養プレート(BD Biosciences 356697)に加えた。プレートを、室温で30分間インキュベートし、次に、37℃、5%のCO2で5時間インキュベートした。インキュベーションの後、1ウェル当たり40μLの、PBS中8%のパラホルムアルデヒド(16%のパラホルムアルデヒドをPBS中8%まで希釈した)を、各プレートに加え、30分間インキュベートした。プレートを、Biotek 405プレート洗浄装置に移し、1ウェル当たり100μLの洗浄緩衝液(0.1%のTriton X−100(v/v)を含む1×PBS)で5回洗浄した。次に、1ウェル当たり30μLのOdysseyブロッキング緩衝液を、各プレートに加え、室温で1時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去し、1ウェル当たり20μLの一次抗体(0.1%のTween20(v/v)を含むOdyssey緩衝液中で1:100に希釈された対称性ジメチルアルギニン)を加え、プレートを、4℃で一晩(16時間)インキュベートした。プレートを、1ウェル当たり100μLの洗浄緩衝液で5回洗浄した。次に、1ウェル当たり20μLの二次抗体(1:200の800CWヤギ抗ウサギIgG(H+L)抗体、0.1%のTween20(v/v)を含むOdyssey緩衝液中の1:1000のDRAQ5(Biostatus limited))を加え、室温で1時間インキュベートした。プレートを、1ウェル当たり100μLの洗浄緩衝液で5回、次に、1ウェル当たり100μLの水で1回洗浄した。プレートを、室温で乾燥させ、次に、700nmおよび800nmの波長で積分強度を測定するLicor Odyssey機械においてイメージングした。700および800チャネルの両方を走査した。
Z−138細胞を、1ウェル当たり50μLで、384ウェル細胞培養プレートに、50,000個の細胞/mLの濃度のアッセイ培地中で播種した。384ウェルソースプレートからの化合物(100nL)を、384ウェル細胞プレートに直接加えた。プレートを、37℃、5%のCO2で96時間インキュベートした。4日間のインキュベーションの後、インキュベートされたプレートからの40μLの細胞を、ポリ−d−リジンで被覆された384ウェル培養プレート(BD Biosciences 356697)に加えた。プレートを、室温で30分間インキュベートし、次に、37℃、5%のCO2で5時間インキュベートした。インキュベーションの後、1ウェル当たり40μLの、PBS中8%のパラホルムアルデヒド(16%のパラホルムアルデヒドをPBS中8%まで希釈した)を、各プレートに加え、30分間インキュベートした。プレートを、Biotek 405プレート洗浄装置に移し、1ウェル当たり100μLの洗浄緩衝液(0.1%のTriton X−100(v/v)を含む1×PBS)で5回洗浄した。次に、1ウェル当たり30μLのOdysseyブロッキング緩衝液を、各プレートに加え、室温で1時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去し、1ウェル当たり20μLの一次抗体(0.1%のTween20(v/v)を含むOdyssey緩衝液中で1:100に希釈された対称性ジメチルアルギニン)を加え、プレートを、4℃で一晩(16時間)インキュベートした。プレートを、1ウェル当たり100μLの洗浄緩衝液で5回洗浄した。次に、1ウェル当たり20μLの二次抗体(1:200の800CWヤギ抗ウサギIgG(H+L)抗体、0.1%のTween20(v/v)を含むOdyssey緩衝液中の1:1000のDRAQ5(Biostatus limited))を加え、室温で1時間インキュベートした。プレートを、1ウェル当たり100μLの洗浄緩衝液で5回、次に、1ウェル当たり100μLの水で1回洗浄した。プレートを、室温で乾燥させ、次に、700nmおよび800nmの波長で積分強度を測定するLicor Odyssey機械においてイメージングした。700および800チャネルの両方を走査した。
各プレートは、DMSOのみの処理(最小阻害)の14の対照ウェルならびに3μMの対照化合物で処理された最大阻害の14の対照ウェル(バックグラウンドウェル)を含んでいた。各対照タイプの比率値の平均を計算し、それを用いて、プレート中の各試験ウェルについての阻害パーセントを求めた。対照化合物を、3μMから開始して全部で9つの試験濃度に対してDMSO中で3倍に連続希釈した。阻害パーセントを求め、IC50曲線を、化合物の濃度につき3組のウェルを用いて作成した。
Z−138増殖アッセイ
Z−138懸濁細胞を、ATCC(米国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection,Manassas,VA)から購入した。RPMI/Glutamax培地、ペニシリン−ストレプトマイシン、熱失活したウシ胎児血清を、Life Technologies(Grand Island,NY,USA)から購入した。V底ポリプロピレン384ウェルプレートを、Greiner Bio−One(Monroe,NC,USA)から購入した。細胞培養384ウェル乳白色プレートを、Perkin Elmer(Waltham,MA,USA)から購入した。Cell−Titer Glo(登録商標)を、Promega Corporation(Madison,WI,USA)から購入した。SpectraMax M5プレートリーダーを、Molecular Devices LLC(Sunnyvale,CA,USA)から購入した。
Z−138懸濁細胞を、ATCC(米国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection,Manassas,VA)から購入した。RPMI/Glutamax培地、ペニシリン−ストレプトマイシン、熱失活したウシ胎児血清を、Life Technologies(Grand Island,NY,USA)から購入した。V底ポリプロピレン384ウェルプレートを、Greiner Bio−One(Monroe,NC,USA)から購入した。細胞培養384ウェル乳白色プレートを、Perkin Elmer(Waltham,MA,USA)から購入した。Cell−Titer Glo(登録商標)を、Promega Corporation(Madison,WI,USA)から購入した。SpectraMax M5プレートリーダーを、Molecular Devices LLC(Sunnyvale,CA,USA)から購入した。
Z−138懸濁細胞を、増殖培地(10% v/vの熱失活したウシ胎児血清が補充されたRPMI 1640中で維持し、5%のCO2下で、37℃で培養した。アッセイ条件下で、細胞を、5%のCO2下で、37℃で、アッセイ培地(10% v/vの熱失活したウシ胎児血清および100単位/mLのペニシリン−ストレプトマイシンが補充されたRPMI 1640)中でインキュベートした。
Z−138細胞株の増殖に対する化合物の効果の評価のために、指数関数的に増殖している細胞を、最終容量50μlのアッセイ培地中で、10,000個の細胞/mlの密度で、384ウェル乳白色プレート中で平板培養した。化合物ソースプレートを、10mMから開始して、DMSO中での3組の9点の3倍の連続希釈を行うことによって調製した(アッセイ中の化合物の最終的な最高濃度は20μMであり、DMSOは0.2%であった)。化合物ストックプレートからの100nLのアリコートを、細胞プレート中のそれぞれのウェルに加えた。100%阻害対照は、200nMの最終濃度のスタウロスポリンで処理した細胞からなり、0%阻害対照は、DMSO処理細胞からなっていた。化合物の添加の後、アッセイプレートを、37℃、5%のCO2、相対湿度>90%で5日間インキュベートした。細胞プレートに35μlのCell Titer Glo(登録商標)試薬を加えながら、細胞培養物中に存在するATPの定量化によって細胞生存を測定した。ルミネセンスを、SpectraMax M5マイクロプレートリーダーにおいて読み取った。細胞生存を50%阻害する化合物の濃度を、正規化された用量反応曲線の4パラメータフィットを用いて求めた。
実施例2:MCL細胞株のパネルにおけるsDMAメチル化の阻害に対する式Bの効力
式Bで処理されたMCL細胞株(Z−138、Maver−1、Mino、Granta−519、およびJeko−1)を、4日目に採取し、全細胞溶解液を、Pan−ジ−メチル対称性アルギニン抗体、対称性ジメチルアルギニン(sDMA)を用いて、ウエスタンブロットによって評価した。10kDaバンドの測定を用いて、メチル化IC50値を計算した。RNAiデータ(ELN entry 142〜39)は、この10kDaバンドが、ジ−メチル対称性SmD3であることを示唆するが、この10kDaバンドについてのタンパク質ID研究は行われておらず、結果として、それは、その分子量によってウエスタンブロットにおいて標識されるであろう。Z−138およびMaver−1細胞株について示される代表的なウエスタンブロット(図1)を用いて試験される全ての細胞株において、10kDaバンドの濃度依存性の減少が4日目に観察された。ウエスタンブロットからの10kDaバンドのレベルを、濃度測定によって定量化し、全SmD3に対する10kDaバンドの比率(SmD3me2sであると仮定される)を計算して、IC50を求めた(表2、全ての試料についてn=1)。メチル化IC50値を、表3に示されるように、MCL細胞株中の式Aについても取得した。
式Bで処理されたMCL細胞株(Z−138、Maver−1、Mino、Granta−519、およびJeko−1)を、4日目に採取し、全細胞溶解液を、Pan−ジ−メチル対称性アルギニン抗体、対称性ジメチルアルギニン(sDMA)を用いて、ウエスタンブロットによって評価した。10kDaバンドの測定を用いて、メチル化IC50値を計算した。RNAiデータ(ELN entry 142〜39)は、この10kDaバンドが、ジ−メチル対称性SmD3であることを示唆するが、この10kDaバンドについてのタンパク質ID研究は行われておらず、結果として、それは、その分子量によってウエスタンブロットにおいて標識されるであろう。Z−138およびMaver−1細胞株について示される代表的なウエスタンブロット(図1)を用いて試験される全ての細胞株において、10kDaバンドの濃度依存性の減少が4日目に観察された。ウエスタンブロットからの10kDaバンドのレベルを、濃度測定によって定量化し、全SmD3に対する10kDaバンドの比率(SmD3me2sであると仮定される)を計算して、IC50を求めた(表2、全ての試料についてn=1)。メチル化IC50値を、表3に示されるように、MCL細胞株中の式Aについても取得した。
実施例3:式Bで処理されたZ−138およびMaver−1細胞についてのICW結果
SYM11抗体を用いて細胞メチル化のIC50を測定するために、Z−138細胞を用いたICWアッセイにおいて式Bを試験した。0.64nMのIC50が、化合物による処理の4日後に得られた(図2、n=1)。
SYM11抗体を用いて細胞メチル化のIC50を測定するために、Z−138細胞を用いたICWアッセイにおいて式Bを試験した。0.64nMのIC50が、化合物による処理の4日後に得られた(図2、n=1)。
SYM11抗体を用いて細胞メチル化のIC50を測定するために、Maver−1細胞を用いたICWアッセイにおいて式Bを試験した。1.9nMのIC50が、化合物による処理の4日後に得られた(図3、n=1)。
実施例4:アポトーシス応答に関与する所定数の遺伝子に対する式Bの転写効果
式Bと同じ細胞能力を有するツール化合物(tool compound)を用いたMCL細胞株中の前のRNA Seq試験により、アポトーシス応答に関与するいくつかの遺伝子における発現の変化が特定された(公表されていない結果)。これらの遺伝子は、アポトーシス応答のよく特徴付けられたドライバである、Bcl−2ファミリーメンバーPUMAおよびBAXを含んでいた。アポトーシス応答に関与する他の遺伝子も特定され、PHLDA3、TP53I3、p21、APOBEC3H、TRIM22、およびFASを含む。化合物で処理されたZ−138細胞が、DMSOにわたって4倍〜25倍の範囲の試験される全ての遺伝子(TP53I3を除いて)の用量依存的な増加を示した。Maver−1細胞はまた、DMSOにわたって発現の2倍〜20倍の増加の範囲の試験されるいくつかの遺伝子の遺伝子発現変化を示した。Granta−519は、遺伝子PHLDA3における10倍までの増加を示したが、p21、TRIM22、およびFASの遺伝子発現のわずかな増加が観察されたに過ぎなかった。化合物で処理されたJeko−1およびMino細胞は、試験される遺伝子のいずれにおいても有意な影響を示さなかった(表4および図6)。
式Bと同じ細胞能力を有するツール化合物(tool compound)を用いたMCL細胞株中の前のRNA Seq試験により、アポトーシス応答に関与するいくつかの遺伝子における発現の変化が特定された(公表されていない結果)。これらの遺伝子は、アポトーシス応答のよく特徴付けられたドライバである、Bcl−2ファミリーメンバーPUMAおよびBAXを含んでいた。アポトーシス応答に関与する他の遺伝子も特定され、PHLDA3、TP53I3、p21、APOBEC3H、TRIM22、およびFASを含む。化合物で処理されたZ−138細胞が、DMSOにわたって4倍〜25倍の範囲の試験される全ての遺伝子(TP53I3を除いて)の用量依存的な増加を示した。Maver−1細胞はまた、DMSOにわたって発現の2倍〜20倍の増加の範囲の試験されるいくつかの遺伝子の遺伝子発現変化を示した。Granta−519は、遺伝子PHLDA3における10倍までの増加を示したが、p21、TRIM22、およびFASの遺伝子発現のわずかな増加が観察されたに過ぎなかった。化合物で処理されたJeko−1およびMino細胞は、試験される遺伝子のいずれにおいても有意な影響を示さなかった(表4および図6)。
実施例5:Z−138およびMaver−1アポトーシスに対する式Bの影響
細胞死滅の機構を、MCL細胞株、Z−138およびMaver−1において評価した。細胞を、様々な時点で2nM、20nM、および200nMの式Bで処理した。アポトーシスを、アネキシン−V陽性細胞のパーセンテージを測定することによって評価し、アッセイをトリプリケートで行った。アネキシン−V陽性細胞の12%および40%の増加が、Z−138細胞中で4日後および6日後(図7)に200nMの式Aの処理で観察された。よりわずかな増加が、Maver−1細胞において観察された。8%の細胞が、式Aによる処理の4日後にアネキシン−Vに対して陽性に染色された。アネキシン陰性細胞の対応する減少が、両方の細胞株においてそれらの時点で観察された。
細胞死滅の機構を、MCL細胞株、Z−138およびMaver−1において評価した。細胞を、様々な時点で2nM、20nM、および200nMの式Bで処理した。アポトーシスを、アネキシン−V陽性細胞のパーセンテージを測定することによって評価し、アッセイをトリプリケートで行った。アネキシン−V陽性細胞の12%および40%の増加が、Z−138細胞中で4日後および6日後(図7)に200nMの式Aの処理で観察された。よりわずかな増加が、Maver−1細胞において観察された。8%の細胞が、式Aによる処理の4日後にアネキシン−Vに対して陽性に染色された。アネキシン陰性細胞の対応する減少が、両方の細胞株においてそれらの時点で観察された。
実施例6:21日のマントル細胞リンパ腫異種移植片試験のPK/PD/腫瘍増殖阻害(TGI)分析
この実施例で示されるデータを、マントル細胞リンパ腫腫瘍の21日の試料の分析後に測定した。Cmin PK試料を、21日目の最後の投与の前に取った。腫瘍を切除し、秤量し、メチルマークのために処理した。メチルマーク減少を、腫瘍試料において測定し、ビヒクル対照(POC)に対するパーセントとして示す。SYM11およびsDMA Elisaの両方を用いてメチルマークを測定し、示されるデータは、10匹の動物の平均である。POCに対するパーセントとして表される21日目における腫瘍体積減少を用いて、腫瘍増殖阻害を測定した。インビボ阻害曲線も生成し、IC50値を測定した。各群からの血漿中濃度は、5匹の動物の平均である。Z−138細胞中の式Bの有効性が、図8に示される。試験された全ての用量は、50%以上のTGIをもたらし、50%を超えるTGIを有する腫瘍は、80%を超えるメチルマーク減少を示した。全ての群中の平均体重減少(BWL)は6%未満であった。Maver−1細胞中の式Bの有効性が、図9に示される。試験された全ての用量は、50%を超えるTGIを示す。50%を超えるTGIを有する全ての腫瘍が、80%を超えるメチルマーク減少を示した。全ての群中の平均BWLは、4%未満であった。Z−138細胞中の式Aの有効性が、図10に示される。全ての群中の平均BWLは、100mg/kgの投与群において4匹の動物が15%のBWLを超えたことを除いて、8%未満であった。50%を超えるTGIを有する、式Aで処理された動物に由来する腫瘍は、80%を超えるメチルマーク減少を示した。Maver−1細胞中の式Aの有効性が、図11に示される。試験される全ての群は、有意なメチルマーク減少(>80%)および50%を超えるTGIを示した。
この実施例で示されるデータを、マントル細胞リンパ腫腫瘍の21日の試料の分析後に測定した。Cmin PK試料を、21日目の最後の投与の前に取った。腫瘍を切除し、秤量し、メチルマークのために処理した。メチルマーク減少を、腫瘍試料において測定し、ビヒクル対照(POC)に対するパーセントとして示す。SYM11およびsDMA Elisaの両方を用いてメチルマークを測定し、示されるデータは、10匹の動物の平均である。POCに対するパーセントとして表される21日目における腫瘍体積減少を用いて、腫瘍増殖阻害を測定した。インビボ阻害曲線も生成し、IC50値を測定した。各群からの血漿中濃度は、5匹の動物の平均である。Z−138細胞中の式Bの有効性が、図8に示される。試験された全ての用量は、50%以上のTGIをもたらし、50%を超えるTGIを有する腫瘍は、80%を超えるメチルマーク減少を示した。全ての群中の平均体重減少(BWL)は6%未満であった。Maver−1細胞中の式Bの有効性が、図9に示される。試験された全ての用量は、50%を超えるTGIを示す。50%を超えるTGIを有する全ての腫瘍が、80%を超えるメチルマーク減少を示した。全ての群中の平均BWLは、4%未満であった。Z−138細胞中の式Aの有効性が、図10に示される。全ての群中の平均BWLは、100mg/kgの投与群において4匹の動物が15%のBWLを超えたことを除いて、8%未満であった。50%を超えるTGIを有する、式Aで処理された動物に由来する腫瘍は、80%を超えるメチルマーク減少を示した。Maver−1細胞中の式Aの有効性が、図11に示される。試験される全ての群は、有意なメチルマーク減少(>80%)および50%を超えるTGIを示した。
この試験で示されるデータ(図12)はまた、代用組織におけるインビボメチルマーク阻害の最初のエビデンスを表す。図12は、式Bを用いたZ−138有効性試験からの骨髄試料のsDMAウエスタンブロット結果を示す。骨髄試料を試験の最後の21日目に採取し、溶解液を、腫瘍に使用されたのと同じ方法を用いて調製した。メチルマークが試験される全ての投与群において完全に除去された腫瘍と比較して、sDMAメチル化のレベルにおけるより一層の用量依存的反応が、骨髄において観察された。
実施例7:乳癌データ
この実施例において、正味の細胞死アッセイを用いて、乳癌細胞株に対するPRMT5阻害剤の有効性を実証した。PMRT5阻害剤式A、式Bおよび式Cを用いて、3つの異なる乳癌細胞株(SKBR−3、ZR−75−1およびMDA−MB−468)を処理した。SKBR−3は、HER2陽性乳癌細胞株である。ZR−75−1は、エストロゲン受容体/プロゲステロン受容体(ER/PR)陽性乳癌細胞株である。MDA−MB−468は、トリプルネガティブ(ER−/PG−/HER2−)乳癌細胞株である。マントル細胞リンパ腫細胞株(Z−138)を、陽性対照として使用した。アッセイの結果が、図13に示される。
この実施例において、正味の細胞死アッセイを用いて、乳癌細胞株に対するPRMT5阻害剤の有効性を実証した。PMRT5阻害剤式A、式Bおよび式Cを用いて、3つの異なる乳癌細胞株(SKBR−3、ZR−75−1およびMDA−MB−468)を処理した。SKBR−3は、HER2陽性乳癌細胞株である。ZR−75−1は、エストロゲン受容体/プロゲステロン受容体(ER/PR)陽性乳癌細胞株である。MDA−MB−468は、トリプルネガティブ(ER−/PG−/HER2−)乳癌細胞株である。マントル細胞リンパ腫細胞株(Z−138)を、陽性対照として使用した。アッセイの結果が、図13に示される。
腫瘍増殖阻害(TGI)も、MDA−MB−468異種移植片モデルにおいて化合物の2つ、式Aおよび式Bについてのいくつかの投与計画について測定した。TGIアッセイの結果が、図14に示される。
式Aおよび式Bの薬力学メチルマーク抑制応答も、MDA−MB−468細胞異種移植片モデルにおいて測定した。応答が、図15に示される。
実施例8:膵臓癌データ
この実施例において、膵臓癌を治療する際のPRMT5阻害剤の有効性が実証される。図16は、式CおよびDで処理された2つの膵臓癌細胞株(Miapaca−2およびPanc−1)のウエスタンブロット分析の結果を示す。
この実施例において、膵臓癌を治療する際のPRMT5阻害剤の有効性が実証される。図16は、式CおよびDで処理された2つの膵臓癌細胞株(Miapaca−2およびPanc−1)のウエスタンブロット分析の結果を示す。
図17は、式Cおよび式Dで処理されたMiapaca−2細胞において行われたヒストンH4(H4R3me2s)試験のアルギニン−3における対称性ジメチル化の結果を示す。
膵臓癌細胞形態に対する式Dによる処理の影響も試験した。各化合物による処理は、図18に示されるように、Miapaca−2およびPanc−1細胞株の両方における癌細胞増殖の阻害をもたらす。
また、2D−増殖アッセイを、式Dで処理された膵臓細胞株において行った。式DによるMiapaca−2およびPanc−1細胞の両方の処理が、図19に示されるように、細胞増殖の減少をもたらす。MiaPaca−2細胞中の計算された発育阻止濃度(gIC50)は、4日目に349nMであり、6日目に269nMであり、13日目に929nMであった。Panc−1細胞中の計算された発育阻止濃度(gIC50)は、4日目に1990nMであり、6日目に1243nMであり、13日目に3904nMであった。
実施例9:ヘム癌データ
ヘム癌細胞を、PRMT5阻害剤で処理し、Cell Titer−Glo増殖/死アッセイを行った。図20に示されるように、式CのPRMT阻害剤による処理が、マントル細胞リンパ腫(MCL)、急性骨髄性リンパ腫(AML)細胞株および多発性骨髄腫(MM)、およびリンパ腫細胞株を含むいくつかのヘム癌細胞株において増殖を阻害する。
ヘム癌細胞を、PRMT5阻害剤で処理し、Cell Titer−Glo増殖/死アッセイを行った。図20に示されるように、式CのPRMT阻害剤による処理が、マントル細胞リンパ腫(MCL)、急性骨髄性リンパ腫(AML)細胞株および多発性骨髄腫(MM)、およびリンパ腫細胞株を含むいくつかのヘム癌細胞株において増殖を阻害する。
実施例10:p53陽性癌データ
非ヒストン基質(E2F1およびp53など)のPRMT5メチル化も、癌細胞増殖および死に寄与する。ウエスタンブロットおよびPCR実験の結果は、PRMT5阻害が、遺伝子発現およびスプライシング変化につながり、最終的に癌細胞中のp53の誘導を引き起こすことを示す。式CのPRMT5阻害剤を用いて、図21および図22中のデータを生成した。図21に示されるように、Z138マントル細胞リンパ腫細胞中のPRMT5阻害は、MDM4スプライシングを軽減し、p53発現を増加させる。また、p53が欠損した細胞(例えば、SW48結腸癌細胞)(すなわち、SW48−/−)は、例えばEC50、gIC50、またはgIC90(図22)に基づいて、それらの野生型対応物(すなわち、SW48)と比較して、PRMT5阻害に対する感受性が低かった。
非ヒストン基質(E2F1およびp53など)のPRMT5メチル化も、癌細胞増殖および死に寄与する。ウエスタンブロットおよびPCR実験の結果は、PRMT5阻害が、遺伝子発現およびスプライシング変化につながり、最終的に癌細胞中のp53の誘導を引き起こすことを示す。式CのPRMT5阻害剤を用いて、図21および図22中のデータを生成した。図21に示されるように、Z138マントル細胞リンパ腫細胞中のPRMT5阻害は、MDM4スプライシングを軽減し、p53発現を増加させる。また、p53が欠損した細胞(例えば、SW48結腸癌細胞)(すなわち、SW48−/−)は、例えばEC50、gIC50、またはgIC90(図22)に基づいて、それらの野生型対応物(すなわち、SW48)と比較して、PRMT5阻害に対する感受性が低かった。
実施例11:PRMT5阻害剤式Cで処理されたマントル細胞リンパ腫株、Z−138の細胞周期分析(ヨウ化プロピジウム染色、3日目)(左側のパネル)およびウェスタン分析(1μMのPRMT5阻害剤)(右側のパネル)
図23に示されるように、PRMT5阻害は、マントル細胞リンパ腫株、Z138におけるG1期停止(10nMにおける棒グラフ)および細胞死(200nMにおける棒グラフ)をもたらす。ウェスタン分析は、PRMT5(sDMA、対称性ジメチルアルギニン)の時間依存性の阻害およびPRMT5阻害剤処理に応答した細胞死経路(切断されたカスパーゼ−3および切断されたPARP)の誘導を実証している。
図23に示されるように、PRMT5阻害は、マントル細胞リンパ腫株、Z138におけるG1期停止(10nMにおける棒グラフ)および細胞死(200nMにおける棒グラフ)をもたらす。ウェスタン分析は、PRMT5(sDMA、対称性ジメチルアルギニン)の時間依存性の阻害およびPRMT5阻害剤処理に応答した細胞死経路(切断されたカスパーゼ−3および切断されたPARP)の誘導を実証している。
細胞周期分析
3mLのIMDM+10%のウマ血清(形質導入された細胞株のために0.5μg/mLのピューロマイシンが補充された)の体積中で、6ウェル組織培養皿に細胞を播種した。細胞を、3日間にわたって、DMSO、10nMの式C、または200nMの式Cで処理した。5分間にわたって2,000RPMで遠心分離し、PBSで洗浄し、クエン酸緩衝液で洗浄し、次に、過剰のクエン酸緩衝液を吸引して、ペレットの上に約50μLを残すことによって、細胞を採取した。ペレットを、処理の準備ができるまで−80℃で凍結させた。
3mLのIMDM+10%のウマ血清(形質導入された細胞株のために0.5μg/mLのピューロマイシンが補充された)の体積中で、6ウェル組織培養皿に細胞を播種した。細胞を、3日間にわたって、DMSO、10nMの式C、または200nMの式Cで処理した。5分間にわたって2,000RPMで遠心分離し、PBSで洗浄し、クエン酸緩衝液で洗浄し、次に、過剰のクエン酸緩衝液を吸引して、ペレットの上に約50μLを残すことによって、細胞を採取した。ペレットを、処理の準備ができるまで−80℃で凍結させた。
Becton Dickinson CycleTEST PLUSキット(カタログ番号340242)を用いて、ペレットをFACSのためにヨウ化プロピジウムで染色した。キットの溶液A、B、およびCを解凍し、次に、氷上で保持した。細胞ペレットを37℃で迅速に解凍し、ピペットで吸ったり出したりして、50μLのクエン酸緩衝液中で再懸濁させた。
細胞ペレット体積の約4分の1を、新しいエッペンドルフチューブに移した。250μLの溶液Aを各試料に加え、次に、7〜10回反転させた。試料を、室温で10分間にわたって150RPMで振とう機に入れた。振とうしない場合、試料を氷上に置いた。250μLの溶液Bおよび250μLの溶液Cを、同じように各試料に加えた。ヨウ化プロピジウムを溶液Cに加えた後、光への暴露を最小限に抑えるために、試料を箔で覆った。試料をFACSチューブ(ポリスチレン、Falcon 352058)に移し、染色された試験片の分析を、染色の3時間以内に完了した。
試料を、Becton Dickinson FACSCalibur機械においてFACSによって処理した。各細胞周期段階における細胞のパーセンテージを、FlowJo V10ソフトウェアを用いて、ゲートされた単一細胞集団についての細胞周期関数を用いて測定した。
ウェスタン分析
IMDM+10%のウマ血清培地中で、約6ウェル組織培養皿に、Z138細胞を播種した。細胞を、1、2、3、4、または5日間にわたって1μMの化合物で処理した。5分間にわたって500×gで遠心分離し、PBSで1回洗浄し、処理の準備ができるまで−80℃で凍結させることによって、細胞ペレットを収集した。
IMDM+10%のウマ血清培地中で、約6ウェル組織培養皿に、Z138細胞を播種した。細胞を、1、2、3、4、または5日間にわたって1μMの化合物で処理した。5分間にわたって500×gで遠心分離し、PBSで1回洗浄し、処理の準備ができるまで−80℃で凍結させることによって、細胞ペレットを収集した。
プロテアーゼ阻害剤(細胞ペレットの体積の約5倍、またはおよそ250μL)を含有するRIPA緩衝液(Sigma R0278)を各細胞ペレットに加え、ピペット操作により再懸濁させることによって、タンパク質溶解液を調製した。試料を10×1秒のパルスで、超音波で分解し、次に、6分間にわたって最高速度(13,300RPM)で遠心分離した。上清(200μL)を、新しいエッペンドルフチューブに移し、ペレットを廃棄した。Pierce BCA Protein Assayキットを用いてタンパク質濃度を測定した。
20μgの溶解液を、適切な体積のLife Technologies NuPage Sample Reducting Agent、LDS Sample Buffer、およびRIPA緩衝液と組み合わせることによって、タンパク質ゲル試料を調製した。ゲル試料を、加熱ブロック中100℃で5〜10分間加熱した。15ウェルのInvitrogen 4〜12%のBis−Tris NuPAGE−SDSゲルを1ウェル当たり19μLの体積で充填し、約1時間にわたってまたはバンドの最大分離が達成されるまで150VでMES SDS緩衝液中で流した。
Invitrogen iBlotシステムを用いて、ゲルをニトロセルロース膜上に移した。ブロットを、室温に固定しながら、30分間にわたってLiCOR Odyssey緩衝液(カタログ番号927−40000)でブロックした。一次抗体を、Licor Odysseyブロッキングバッファー(0.1%のTWEEN−20を加えた)で希釈し、4℃に固定しながら、一晩適用した。次に、ブロットをPBST中で3×15分間洗浄し、室温に固定しながら1時間にわたって蛍光二次抗体(0.1%のTween−20/Odysseyブロッキング試薬で1:10,000に希釈された)で処理し、PBST中で3×15分間にわたって再度洗浄し、次に、LiCOR Odysseyスキャナを用いて撮像した。
実施例12:PRMT5阻害が、MDM4スプライシングを軽減し、p53発現を増加させる。
形質導入されたZ138細胞株の生成
1ウェル当たり3mLのIMDM+10%のウマ血清の体積で、6ウェル組織培養皿中に、1×106個のZ138細胞を播種した。レンチウイルス(pLEXベクター中のMDM4またはEGFP)を、既に記載されているように調製するか、またはSanta Cruz Biotechnologyから購入した(p53 shRNAまたはスクランブルshRNAレンチウイルスについてのカタログ番号sc−29435−Vおよびsc−108080)。レンチウイルス粒子を、MOT=20で播種された細胞に加え、8μg/mLのポリブレンを補充した。6ウェルプレートをパラフィルム(Parafilm)で封止し、レンチウイルス治療のために37℃で90分間にわたって1000×gで回転させた。次に、各ウェルの内容物を、別個の15mLの円錐管中に収集し、5分間にわたって1000×gで回転させた。上清(レンチウイルスおよびポリブレンを含有する)を廃棄し、細胞ペレットを、3mLのIMDM+10%のウマ血清中で再懸濁させた。細胞を、新しい6ウェル組織培養皿で再播種し、48時間にわたって37℃および5%のCO2でインキュベートした。
形質導入されたZ138細胞株の生成
1ウェル当たり3mLのIMDM+10%のウマ血清の体積で、6ウェル組織培養皿中に、1×106個のZ138細胞を播種した。レンチウイルス(pLEXベクター中のMDM4またはEGFP)を、既に記載されているように調製するか、またはSanta Cruz Biotechnologyから購入した(p53 shRNAまたはスクランブルshRNAレンチウイルスについてのカタログ番号sc−29435−Vおよびsc−108080)。レンチウイルス粒子を、MOT=20で播種された細胞に加え、8μg/mLのポリブレンを補充した。6ウェルプレートをパラフィルム(Parafilm)で封止し、レンチウイルス治療のために37℃で90分間にわたって1000×gで回転させた。次に、各ウェルの内容物を、別個の15mLの円錐管中に収集し、5分間にわたって1000×gで回転させた。上清(レンチウイルスおよびポリブレンを含有する)を廃棄し、細胞ペレットを、3mLのIMDM+10%のウマ血清中で再懸濁させた。細胞を、新しい6ウェル組織培養皿で再播種し、48時間にわたって37℃および5%のCO2でインキュベートした。
形質導入効率を、蛍光顕微鏡法を用いてEGFP−形質導入された細胞について評価した。EGFP発現が観察された場合、形質導入は成功しており、ピューロマイシンを0.5μg/mLの濃度で加えて、形質導入された細胞を選択した。実験用に播種するのに十分な細胞が存在するまで(ピューロマイシンによる連続培養で)形質導入された集団を拡大した。
MDM4スプライシング分析(PCR)
10mLのIMDM+10%のウマ血清培地の体積で、1皿当たり約3×106個の細胞の密度で、Z138細胞を、10cmの組織培養皿に播種した。細胞を、1、2、または3日間にわたって0.5%のDMSOで、200nMまたは1μMの化合物で処理した。PBSで1回洗浄し、37℃で5分間トリプシン処理し、5分間にわたって1000×gで遠心分離し、次に、処理の準備ができるまで−80℃で貯蔵することによって、細胞ペレットを採取した。
10mLのIMDM+10%のウマ血清培地の体積で、1皿当たり約3×106個の細胞の密度で、Z138細胞を、10cmの組織培養皿に播種した。細胞を、1、2、または3日間にわたって0.5%のDMSOで、200nMまたは1μMの化合物で処理した。PBSで1回洗浄し、37℃で5分間トリプシン処理し、5分間にわたって1000×gで遠心分離し、次に、処理の準備ができるまで−80℃で貯蔵することによって、細胞ペレットを採取した。
RNAを細胞ペレットから抽出した。まず、ペレットを氷上で解凍し、次に、500μLのTrizol試薬中で迅速に再懸濁させた。次に、試料を室温で2〜3分間インキュベートし、30秒間ボルテックスして、溶解液を完全に均質化した。50μLの水および50μLのクロロホルムを、各Trizol−細胞混合物に加え、次に、各試料を30秒間ボルテックスして、完全に混合した。試料を、MaXtract High Densityチューブに充填し、5分間にわたって14,000RPMで回転させた。各チューブからの透明な上清(水相)を、新しい2mLのチューブに移し、2倍の体積の新しく調製された70%のエタノールを各試料に加えた。試料をRNeasy spinカラム(Qiagen RNeasy Miniキットの一部)に充填した。カラムを15秒間にわたって9000×gで遠心分離し、フロースルー(flow−through)を廃棄した。350μLのBuffer RW1を各カラムに加え、試料を15秒間にわたって約9000×gで遠心分離し、フロースルーを廃棄した。各試料について10μLのDNase Iを70μLのBuffer RDDと混合することによって、DNase I混合物(Qiagen)を調製し、次に、80μLのDNase I混合物を各試料に加え、室温で15分間インキュベートした。350μLのBuffer RW1を各カラムに加え、試料を15秒間にわたって約9000×gで遠心分離し、フロースルーを廃棄した。次に、カラムを500μLの調製されたBuffer RPEで2回洗浄し、試料を、15秒間にわたって9000×gで遠心分離し、フロースルーを廃棄した。RNeasyカラムを、新しい2mLの収集管に入れ、1分間にわたって14000RPMで回転させて、カラムを乾燥させた。次に、RNeasyカラムを1.5mLの収集管に移し、30μLのRNaseフリー水を各カラムに加えた。カラムを室温で1分間インキュベートし、次に、1分間にわたって14000RPMで回転させた。次に、60μLの総体積になるようにさらなる30μLのRNaseフリー水を加えながら、この溶出工程を繰り返した。RNA濃度をNanodropにおいて分析した。
次に、RNAを逆転写して、cDNAを生成した。96ウェルPCRプレートにおいて、1μgのRNAを、滅菌したヌクレアーゼフリー水で、25μLの最終体積になるまで希釈した。High Capacity Reverse Transcription Reagents(ABI #4274966)を用いてマスターミックスを調製した。25μLのマスターミックスを、50μLの最終的な反応物体積になるようにRNAを含む各ウェルに加えた。反応物を、以下のようにプログラムされたサーマルサイクラー中でインキュベートした:25℃で10分間、37℃で2時間、および85℃で5分間。cDNAを、96ウェルポリプロピレンプレート中で、25μLの逆転写反応生成物を、200μLのヌクレアーゼフリー水と組み合わせることによって希釈した。
短い長さおよび完全長HDMXスプライス変異を、希釈されたcDNAからPCR増幅した。まず、Thermo DreamTaq Green PCR Master Mix(2X)(カタログ番号K1082)、HDMX フォワードプライマー(1μMの最終濃度、Biosearch Technologies SS294168−01、TGTGGTGGAGATCTTTTGGG(配列番号1))、およびHDMXリバースプライマー(1μMの最終濃度、Biosearch Technologies、SS294169−01、GCAGTGTGGGGATATCGT(配列番号2))を組み合わせることによって、PCRマスターミックスを調製した。96ウェルPCRプレートにおいて、10μLの希釈されたcDNAおよび40μLのPCRマスターミックスを組み合わせて、50μLの反応物を生成した。PCR反応をサーマルサイクラー中で行った:95℃で5分間の1サイクル;95℃で40秒間、58℃で30秒間、および72℃で40秒間の26サイクル;次に、72℃で4分間の1サイクル。
2%のアガロース臭化エチジウムゲル上で1レーン当たり15μLを流し、BioRad VersaDocシステムで撮像することによって、PCR産物を視覚化した。
p53およびp21発現分析(ウェスタン)
10mLのIMDM+10%のウマ血清培地の体積中で、10cmの組織培養皿に、Z138細胞を、約3×106個の細胞/皿で播種した。細胞を、1、2、3、4、または5日間にわたって1μMの式Cで処理した。5分間にわたって500×gで遠心分離し、PBSで1回洗浄し、処理の準備ができるまで−80℃で凍結させることによって、細胞ペレットを収集した。
10mLのIMDM+10%のウマ血清培地の体積中で、10cmの組織培養皿に、Z138細胞を、約3×106個の細胞/皿で播種した。細胞を、1、2、3、4、または5日間にわたって1μMの式Cで処理した。5分間にわたって500×gで遠心分離し、PBSで1回洗浄し、処理の準備ができるまで−80℃で凍結させることによって、細胞ペレットを収集した。
プロテアーゼ阻害剤(細胞ペレットの体積の約5倍、またはおよそ250μL)を含有するRIPA緩衝液(Sigma R0278)を各細胞ペレットに加え、ピペット操作により再懸濁させることによって、タンパク質溶解液を調製した。試料を、10×1秒のパルスで、超音波で分解し、次に、6分間にわたって最高速度(13,300RPM)で遠心分離した。200μLの上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、ペレットを廃棄した。Pierce BCA Protein Assayキットを用いてタンパク質濃度を測定した。
20μgの溶解液を、適切な体積のLife Technologies NuPage Sample Reducting Agent、LDS Sample Buffer、およびRIPA緩衝液と組み合わせることによって、タンパク質ゲル試料を調製した。ゲル試料を、加熱ブロック中100℃で5〜10分間加熱した。15ウェルのInvitrogen 4〜12%のBis−Tris NuPAGE−SDSゲルを1ウェル当たり19μLの体積で充填し、約1時間にわたってまたはバンドの最大分離が達成されるまで150VでMES SDS緩衝液中で流した。
Invitrogen iBlotシステムを用いて、ゲルをニトロセルロース膜上に移した。ブロットを、室温に固定しながら、30分間にわたってLiCOR Odyssey緩衝液(カタログ番号927−40000)でブロックした。一次抗体(1:200で、p53、Santa Cruz Biotech sc−126;1:1,000で、p21、Cell Signaling #2946;1:5,000で、チューブリン、Sigma T9026)を、Licor Odysseyブロッキングバッファー(0.1%のTWEEN−20を加えた)で希釈し、4℃に固定しながら、一晩適用した。次に、ブロットをPBST中で3×15分間洗浄し、室温に固定しながら1時間にわたって蛍光二次抗体(0.1%のTween−20/Odysseyブロッキング試薬で1:10,000に希釈された)で処理し、PBST中で3×15分間にわたって再度洗浄し、次に、LiCOR Odysseyスキャナを用いて撮像した。
図24中の実験結果は、PRMT5阻害が、MDM4スプライシングを軽減し、Z138細胞中のp53発現を増加させることを示す。
実施例13:完全長(FL)MDM4を過剰発現するZ−138細胞は、PRMT5阻害に対する感受性が低い
形質導入されたZ138細胞株の生成
形質導入されたZ138細胞株を、上述されるように調製した。
形質導入されたZ138細胞株の生成
形質導入されたZ138細胞株を、上述されるように調製した。
細胞周期分析
3mLのIMDM+10%のウマ血清(形質導入された細胞株のために0.5μg/mLのピューロマイシンが補充された)の体積中で、6ウェル組織培養皿に、細胞を、250,000個の細胞/ウェルで播種した。細胞を、2、3、または4日間にわたって、DMSO、50nMの式C、または500nMの式Cで処理した。5分間にわたって2,000RPMで遠心分離し、PBSで洗浄し、クエン酸緩衝液で洗浄し、次に、過剰のクエン酸緩衝液を吸引して、ペレットの上に約50μLを残すことによって、細胞を採取した。ペレットを、処理の準備ができるまで−80℃で凍結させた。
3mLのIMDM+10%のウマ血清(形質導入された細胞株のために0.5μg/mLのピューロマイシンが補充された)の体積中で、6ウェル組織培養皿に、細胞を、250,000個の細胞/ウェルで播種した。細胞を、2、3、または4日間にわたって、DMSO、50nMの式C、または500nMの式Cで処理した。5分間にわたって2,000RPMで遠心分離し、PBSで洗浄し、クエン酸緩衝液で洗浄し、次に、過剰のクエン酸緩衝液を吸引して、ペレットの上に約50μLを残すことによって、細胞を採取した。ペレットを、処理の準備ができるまで−80℃で凍結させた。
Becton Dickinson CycleTEST PLUSキット(カタログ番号340242)を用いて、ペレットをFACSのためにヨウ化プロピジウムで染色した。キットの溶液A、B、およびCを解凍し、次に、氷上で保持した。細胞ペレットを37℃で迅速に解凍し、ピペットで吸ったり出したりして、50μLのクエン酸緩衝液中で再懸濁させた。
細胞ペレット体積の約4分の1を、新しいエッペンドルフチューブに移した。250μLの溶液Aを各試料に加え、次に、7〜10回反転させた。試料を、室温で10分間にわたって150RPMで振とう機に入れた。振とうしない場合、試料を氷上に置いた。250μLの溶液Bおよび250μLの溶液Cを、同じように各試料に加えた。ヨウ化プロピジウムを溶液Cに加えた後、光への暴露を最小限に抑えるために、試料を箔で覆った。試料をFACSチューブ(ポリスチレン、Falcon 352058)に移し、染色された試験片の分析を、染色の3時間以内に完了した。
試料を、Becton Dickinson FACSCalibur機械においてFACSによって処理した。各細胞周期段階における細胞のパーセンテージを、FlowJo V10ソフトウェアを用いて、ゲートされた単一細胞集団についての細胞周期関数を用いて測定した。
図25中の実験結果は、完全長(FL)MDM4を過剰発現するZ−138細胞が、PRMT5阻害に対する感受性が低いことを示す。
他の実施形態
上記は、本発明の特定の非限定的な実施形態の説明であった。当業者は、本明細書に対する様々な変形形態および変更形態が、以下の特許請求の範囲に規定されるような本発明の趣旨または範囲から逸脱せずに行われ得ることを理解するであろう。
上記は、本発明の特定の非限定的な実施形態の説明であった。当業者は、本明細書に対する様々な変形形態および変更形態が、以下の特許請求の範囲に規定されるような本発明の趣旨または範囲から逸脱せずに行われ得ることを理解するであろう。
Claims (29)
- 癌を治療する方法であって、癌に罹患している被験体にPRMT5阻害剤を投与する工程を含む方法。
- 前記癌がリンパ腫である、請求項1に記載の方法。
- 前記リンパ腫が、マントル細胞リンパ腫である、請求項2に記載の方法。
- 前記癌が乳癌である、請求項1に記載の方法。
- 前記乳癌が、トリプルネガティブ乳癌である、請求項4に記載の方法。
- 前記癌が膵臓癌である、請求項1に記載の方法。
- 前記癌が急性骨髄性リンパ腫(AML)である、請求項2に記載の方法。
- 前記癌が多発性骨髄腫(MM)である、請求項1に記載の方法。
- 前記癌が結腸癌である、請求項1に記載の方法。
- 前記癌がp53陽性である、請求項1に記載の方法。
- 前記癌の腫瘍増殖が約50%超阻害される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌のメチルマークが約80%超減少される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PMRT5阻害剤が、式2:
(式中、Xが、−C(RXC)2−、−O−、−S−、または−NRXN−であり、ここで、RXCの各例が、独立して、水素、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールであり;RXNが、独立して、水素、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、任意選択的に置換されるヘテロアリール、−C(=O)RXA、または窒素保護基であり;RXAが、任意選択的に置換されるアルキル、任意選択的に置換されるカルボシクリル、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールである)
の化合物またはその薬学的に許容できる塩である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。 - 前記PMRT5阻害剤が、式4:
の化合物またはその薬学的に許容できる塩である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。 - 前記PMRT5阻害剤が、式5:
の化合物またはその薬学的に許容できる塩である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。 - 2つ以上のPRMT5阻害剤が前記被験体に投与される、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被験体がまた、さらなる治療剤で治療されている、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被験体が癌に罹患していると診断する工程をさらに含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被験体が以前に癌の治療をされている、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PRMT5阻害剤が、1つまたは複数のさらなる薬剤を含む医薬組成物中にある、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- PRMT5阻害剤による治療に感受性の癌に罹患している被験体を特定するための方法であって、
(a)被験体から取得された生体試料中のp53の存在または非存在を検出する工程と;
(b)p53が前記試料中に存在する場合、PRMT5阻害剤による治療に感受性の癌に罹患している前記被験体を特定する工程と
を含む方法。 - PRMT5阻害剤を含む組成物を前記被験体に投与する工程をさらに含む、請求項27に記載の方法。
- PRMT5阻害剤による治療に感受性でない癌に罹患している被験体を特定するための方法であって、
(a)被験体から取得された生体試料中のp53の存在または非存在を検出する工程と;
(b)p53が前記試料に存在しない場合、PRMT5阻害剤による治療に感受性でない癌に罹患している前記被験体を特定する工程と
を含む方法。
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