JP2017514456A - インスリン様成長因子１受容体特異的抗体及びそれらの使用 - Google Patents

インスリン様成長因子１受容体特異的抗体及びそれらの使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2017514456A
JP2017514456A JP2016555653A JP2016555653A JP2017514456A JP 2017514456 A JP2017514456 A JP 2017514456A JP 2016555653 A JP2016555653 A JP 2016555653A JP 2016555653 A JP2016555653 A JP 2016555653A JP 2017514456 A JP2017514456 A JP 2017514456A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
fragment
igf1r
antibody
isolated
bbb
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2016555653A
Other languages
English (en)
Other versions
JP6541235B2 (ja
Inventor
ダニカ スタニミロヴィッチ，
ダニカ スタニミロヴィッチ，
クリスティン ケメリック，
クリスティン ケメリック，
アルサラーン エス． ハッカニ，
アルサラーン エス． ハッカニ，
トライアン スレア，
トライアン スレア，
マハディ アルバビ‐ガロディ，
マハディ アルバビ‐ガロディ，
ベルナール マッシー，
ベルナール マッシー，
レナルド ギルバート，
レナルド ギルバート，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Research Council of Canada
Original Assignee
National Research Council of Canada
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Research Council of Canada filed Critical National Research Council of Canada
Publication of JP2017514456A publication Critical patent/JP2017514456A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6541235B2 publication Critical patent/JP6541235B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones

Abstract

血液脳関門（ＢＢＢ）は、５００ダルトンを超える分子が血液から脳に輸送されるのを妨げる。受容体媒介性トランスサイトーシス（ＲＭＴ）は、ＢＢＢを形成する脳内皮細胞上の受容体に結合する特定の分子が、ＢＢＢを通過して輸送されるのを促進する。インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦＩＲ）結合抗体又はその断片が、ＲＭＴによりＢＢＢを通過するものとして同定されている。この抗体又は断片は、ＢＢＢを通過させてカーゴ分子を送達するために使用され、ここでカーゴ分子は治療剤又は検出可能な試剤である。この抗体は、９３３アミノ酸のＩＧＦＩＲポリペプチドでラマを免疫することによって調製されるラクダ科動物ＶＨＨである。このラクダ科動物ＶＨＨのヒト化形態も作製される。【選択図】 図９Ａ

Description

発明の分野
本発明は、インスリン様成長因子１受容体特異的抗体、それらの断片、及びそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、血液脳関門を通過するインスリン様成長因子１受容体特異的抗体及びそれらの断片、並びにそれらの使用に関する。
発明の背景
神経変性疾患、たとえばアルツハイマー病及びパーキンソン病は、我々の高齢化社会において大きな負担となってきている。なぜなら、現在のところ、これらの障害に対して有効な治療法がないからである。脳に生じるこれら及び他の疾患の治療は、早期診断とともに、困難なものであり続けている。なぜなら、好適な治療用分子及び診断剤の大半が、密着し高度に制約的な血液脳関門（ＢＢＢ）を透過できないからである（Ａｂｂｏｔｔ、２０１３）。ＢＢＢは、血管を裏打ちし、密着結合を介して互いに結合する脳内皮細胞（ＢＥＣ）により形成される物理的障壁を構成する（Ａｂｂｏｔｔ、２０１３）。ＢＥＣ間に形成される密着結合は、ＢＢＢの完全性に必須であり、５００ドルトン（Ｄａ）より大きな分子の傍細胞輸送を妨げる。脳内皮細胞は、非常に低い飲作用速度を示す（Ａｂｂｏｔｔ、２０１３）ので、より大きな分子の経細胞輸送は、高度に特異的な受容体媒介性トランスサイトーシス（ＲＭＴ）経路、及び受動性の、電荷に基づく吸着媒介性トランスサイトーシスに限定される（Ａｂｂｏｔｔ、２０１３；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、２００２）。加えて、排出ポンプ、たとえばＰ−糖タンパク質又は多剤耐性タンパク質−１（ＭＤＲ−１）の高密度に存在することは、脳からの望ましくない物質の除去に貢献する（Ａｂｂｏｔｔ、２０１３）。
すべてのこれらの特性が、病原体及び毒素から脳を保護する一方で、同程度に、ほとんどの治療剤の侵入を妨げる。実際に、薬理学的に適切な（すなわち、中枢神経系（ＣＮＳ）標的に関与し、薬理学的／治療的反応を誘発するのに十分な）濃度でＢＢＢを通過できるのは、特異的に「フェリー（ｆｅｒｒｉｅｄ）」されない限り、すなわち、輸送体分子とカップリングされない限り、小分子治療剤の５％未満であり、より大きな治療剤は事実上一切通過できない。ＢＢＢを通過させて分子を輸送する有効な「担体」の欠如により、神経変性疾患に対する数多くの薬物は、さらなる開発が「棚上げ」にされるか、又は中止されてきた。なぜならそれらの薬物は、十分な量で脳に送達されえないからである。
より大きな分子を脳内に送達する異なるアプローチが探究されてきた。たとえば、ＢＢＢの完全性を破壊し、漏出性ＢＢＢ（ｌｅａｋｙ ＢＢＢ）をもたらすことができ、ひいては、脳内へのより大きな分子の非制約的な傍細胞侵入を可能にする。密着結合は、様々なアプローチで、うまくゆるめたり破壊したりできる。たとえば、浸透圧衝撃を誘導する物質（たとえば、マンニトール、高張液）の血流内への注入は、細胞収縮を引き起こし、密着結合の破壊をもたらし、したがってＢＢＢを激しく損なう（Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ、２０１０）。他の密着結合のモジュレーターには、アルキルグリセロール、ブラジキニン及びそのいくつかのアナログが、密着結合の維持に関与するタンパク質の発現を調節するウイルスとともに含まれる（Ｅｒｄｌｅｎｂｒｕｃｈら、２００３；Ｐｒｅｓｔｏｎら、２００８；Ｇａｎら、２０１３）。ＢＢＢのより限局的な破壊が、超音波の適用によって可能である（Ｎｈａｎら、２０１３）。しかしながら、ＢＢＢが破壊されている期間は、脳恒常性を変化させ、有害な化学物質、毒素及び病原体の脳への侵入を可能にするのに十分であり、これは、深刻な副作用、たとえば発作並びに脳腫脹、感染症及び場合によって恒久的な神経病理学的変化をもたらしうる。当業者には明らかであろうとおり、複数の脳領域に発症する慢性及びびまん性脳疾患に対するこれら技術による反復治療は、実際的ではない。これらの治療のほとんどが高コストであり、入院を必要とし、いくつかのアプローチは麻酔を必要とする。
ＢＢＢを回避するための別のアプローチは、脳脊髄液（ＣＳＦ）、実質空間（ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｐａｃｅ）、又は脳の他の部分内への治療用分子の直接注射である。注入又は対流増強拡散（ＣＥＤ：ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）ポンプを介した大脳内（実質内）、脳室内、及び髄腔内送達を含む、複数の送達方法が開発されてきた。しかしながら、どのタイプの脳内への直接注射又は大脳内移植片も、侵襲性で高コストの処置である。なぜならそれは、入院、麻酔、及び多くの場合に手術を必要とするからである。さらに、治療剤、特に大きな生物製剤の脳実質内での乏しい拡散率は、治療剤の透過を、注射／移植の部位を囲むきわめて小さな領域に制限する。注射、カテーテル、及び移植片の正確な配置は、困難であるが、脳の標的領域への薬物の拡散を達成するのに決定的に重要である。加えて、カテーテル及び移植片は、部位に感染症及び／又は異物に対する免疫反応をもたらす。
ＢＢＢを通過する送達を増加させる別の試みにおいて、ＣＮＳ薬は、それらの脳への取込みが増加するよう改変されてきた。かかる改変には、それらの表面電荷の変化、分子サイズの低減、及び薬物の親油性（ｌｉｐｏｈｉｌｉｃｉｔｙ）の変化が含まれうる。しかしながら、脳透過性を増加させるどのような改変もまた、薬物の薬理全体、たとえばその所望の活性及び／又は特異性を変化させる可能性が高い。加えて、親油性分子は、Ｐ−糖タンパク質排出ポンプによって脳から排出される傾向にある。
最後に、ＢＢＢを通過する内因性輸送機序が利用されてきた。ＢＢＢを通過するより大きな分子の輸送を可能にする生理機序は、高度に特異的な受容体媒介性トランスサイトーシス（ＲＭＴ）経路と非特異的な電荷ベースの吸着媒介性エンドサイトーシス経路とに分けられる。エンドサイトーシスはそれぞれ、その受容体に対する特異的リガンドの結合に際して、又はカチオン性リガンド若しくは薬物と脳内皮細胞表面（管腔側）上のアニオン性官能基との間の静電相互作用に際して誘発される。続いて、新しく形成されたエンドソームが細胞を通過して反管腔側へとトランスサイトーシスされ、そのカーゴを放出する。
吸着媒介性トランスサイトーシスは非特異的な電荷媒介性相互作用であるので、すべての血管床及び器官で生じ、脳送達のための薬物の利用可能性を制限する。したがって、ＲＭＴ経路を利用することは、唯一の、生理的で非侵襲的だが高度に受容体特異的な脳送達方法である。
ごく少数の受容体が、ＢＢＢでＲＭＴを生じ、それらの天然リガンドを、ＢＢＢを通過させて「フェリー」すると、現在のところ知られている。これらは、よく研究されているトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体（ＩＲ）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１及び２（ＬＲＰ−１及び−２）、ジフテリア毒素受容体、及びＴＭＥＭ３０Ａである。これらの受容体と結合し、内因性ＲＭＴ経路を利用する薬物の脳への輸送体として機能するペプチド、天然リガンド、及び抗体又は抗体断片が開発されてきた（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、１９９１；Ｙｕら、２０１１；Ｍｕｒｕｇａｎａｎｄａｍら、２００１；Ａｂｕｌｒｏｂら、２００５；Ｄｅｍｅｕｌｅ、２００８；Ｓｕｍｂｒｉａら、２０１３）。しかしながら、これまで、第Ｉ相臨床研究で解析されたのはたった１つのペプチド（Ａｎｇｉｏｐｅｐ ＡＮＧ１００５、ＬＲＰ−１を標的とする）のみで、他の候補は実験室環境で研究されている。ＲＭＴ経路は、脳への薬物輸送のための最も有望な経路であるようであるが、現在のアプローチには、ＢＢＢにおける標的受容体の非選択的発現、受容体に対する担体と天然リガンドとの間の競合、受容体の無効なトランスサイトーシス及びエンドサイトーシスされた担体のリソソーム分解を含む制約がある（Ｘｉａｏ及びＧｕｎ、２０１３）。
高性能及び高選択性ＢＢＢ担体の欠如は、脳腫瘍及び神経変性疾患を含む脳に起因する疾患のための新しい治療剤及び診断剤の開発を遅滞させる。ＢＢＢの生理及び恒常性を破壊することなしに、小さい及び大きい治療及び診断分子を、薬理学的に有用な用量で脳内に送達する非侵襲的方法が明らかに必要とされている。
本発明は、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）特異的抗体及びそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、血液脳関門を通過するインスリン様成長因子１受容体特異的抗体及びそれらの断片、並びにそれらの使用に関する。
本発明は、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）エピトープに特異的に結合する単離又は精製抗体又はその断片を提供し、抗体又はその断片は血液脳関門を通過し、エピトープは、配列番号５の抗体により特異的に結合される。ＩＧＦ１Ｒエピトープは、ＩＧＦ１Ｒ細胞外ドメイン内にありうる。
本発明は、
ＥＹＰＳＮＦＹＡの相補性決定領域（ＣＤＲ）１配列（配列番号１）、
ＶＳＲＤＧＬＴＴのＣＤＲ２配列（配列番号２）、及び
ＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹのＣＤＲ３配列（配列番号３）
を含み、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）に特異的に結合する単離又は精製抗体又はその断片を提供する。
たとえば、いかなる形で限定することも望まないが、ＩＧＦ１Ｒに特異的な単離又は精製抗体又はその断片は、
Ｘ１ＶＸ２ＬＸ３ＥＳＧＧＧＬＶＱＸ４ＧＧＳＬＲＬＳＣＸ５ＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＸ６ＲＱＡＰＧＫＸ７Ｘ８ＥＸ９ＶＸ１０ＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＸ１１ＳＲＤＮＸ１２ＫＮＴＸ１３Ｘ１４ＬＱＭＮＳＸ１５Ｘ１６ＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＸ１７ＶＴＶＳＳ（配列番号４）（式中、Ｘ１はＥ又はＱであり、Ｘ２はＫ又はＱであり、Ｘ３はＶ又はＥであり、Ｘ４はＡ又はＰであり、Ｘ５はＶ又はＡであり、Ｘ６はＦ又はＶであり、Ｘ７はＥ又はＧであり、Ｘ８はＲ又はＬであり、Ｘ９はＦ又はＷであり、Ｘ１０はＡ又はＳであり、Ｘ１１はＭ又はＩであり、Ｘ１２はＡ又はＳであり、Ｘ１３はＶ又はＬであり、Ｘ１４はＤ又はＹであり、Ｘ１５はＶ又はＬであり、Ｘ１６はＫ又はＲであり、Ｘ１７はＱ又はＬである）、
又はそれと実質的に同一の配列でありうる。より具体的で非限定的な例において、単離又は精製抗体は、
本明細書においてＩＧＦ１Ｒ−３と呼ばれる、
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＶＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号５）、
本明細書においてＩＧＦ１Ｒ−３＿Ｈ１と呼ばれる、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （配列番号６）、
本明細書においてＩＧＦ１Ｒ−３＿Ｈ２と呼ばれる、ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （配列番号７）、
本明細書においてＩＧＦ１Ｒ−３＿Ｈ３と呼ばれる、ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＡＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （配列番号８）、
本明細書においてＩＧＦ１Ｒ−３＿Ｈ４と呼ばれる、ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （配列番号９）、及び
本明細書においてＩＧＦ１Ｒ−３＿Ｈ５と呼ばれる、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （配列番号１０）、
又はそれと実質的に同一の配列からなる群から選択される配列を含みうる。
上述の単離又は精製抗体又はその断片は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）でありえ、ｓｄＡｂは、ラクダ科動物由来でありうる。
本発明の単離又は精製抗体又はその断片は、多価ディスプレイ形式（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｄｉｓｐｌａｙ ｆｏｒｍａｔ）で提示されうる。多価ディスプレイ形式において、抗体又はその断片は、Ｆｃ断片に連結されることがあり、Ｆｃ断片は、マウスＦｃ２ｂ又はヒトＦｃ１である。たとえば、いかなる形で限定することも望まないが、多価ディスプレイにおいて単離又は精製抗体又はその断片は、配列番号１１の配列（本明細書において、ＩＧＦ１Ｒ−３コンセンサス−Ｆｃ融合物と呼ばれる）、配列番号４１（本明細書において、Ｆｃ−ＩＧＦ１Ｒ−３コンセンサス融合物と呼ばれる）、又は１２（本明細書において、ＩＧＦ１Ｒ−３−Ｆｃ融合物と呼ばれる）を含みうる。
本明細書に記載の単離又は精製抗体又はその断片は、血液脳関門を通過できる。
本発明はまた、本明細書に記載の単離又は精製抗体又はその断片をコードする核酸分子を提供する。前述の核酸分子を含むベクターもまた提供される。
本明細書に記載の単離又は精製抗体又はその断片は、表面に固定化できる。
本発明は、カーゴ分子に連結された本明細書に記載の単離又は精製抗体又はその断片をさらに提供し、カーゴ分子は、約１ｋＤ〜約２００ｋＤａの範囲の分子量を有しうる。抗体又はその断片に連結されたカーゴ分子は、検出可能な試剤、治療剤、薬物、ペプチド、成長因子、サイトカイン、受容体トラップ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒａｐ）、化合物、炭水化物部分、酵素、抗体若しくはその断片、ＤＮＡベース分子、ウイルスベクター、若しくは細胞毒性剤；検出可能な試剤、治療剤、薬物、ペプチド、酵素、抗体若しくはその断片、ＤＮＡベース分子、ウイルスベクター、若しくは細胞毒性剤が充填された１つ若しくは複数のリポソーム若しくはナノ担体；又は１つ若しくは複数のナノ粒子、ナノワイヤ、ナノチューブ、若しくは量子ドットでありうる。
加えて、本発明は、本明細書に記載の１つ又は複数の単離又は精製抗体又はその断片及び薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む組成物を提供する。
ＩＧＦ１Ｒを検出するインビトロ方法もまた提供され、この方法は、
ａ）組織試料を、検出可能な試剤に連結された本明細書に記載の１つ又は複数の単離又は精製抗体又はその断片と接触させるステップ、及び
ｂ）組織試料において、ＩＧＦ１Ｒに結合した抗体又はその断片に連結された検出可能な試剤を検出するステップ
を含む。
上述の方法において、試料は、ヒト又は動物対象からの血清試料、血管組織試料、腫瘍組織試料、又は脳組織試料でありうる。上述の方法において、検出するステップ（ステップｂ））は、光学イメージング、免疫組織化学、分子画像診断、ＥＬＩＳＡ、イメージング質量分析、又は他の好適な方法を使用して実施できる。
さらに提供されるのは、対象におけるＩＧＦ１Ｒ発現を検出するインビボ方法であり、この方法は、
ａ）検出可能な試剤に連結された本明細書に記載の１つ又は複数の単離又は精製抗体又はその断片を、対象に投与するステップ、及び
ｂ）ＩＧＦ１Ｒに結合した抗体又はその断片に連結された検出可能な試剤を検出するステップ
を含む。
上述の方法において、検出するステップ（ステップｂ））は、ＰＥＴ（ポジトロン放出断層撮影）、ＳＰＥＣＴ（単光子放出コンピュータ断層撮影）、蛍光イメージング、又は任意の他の好適な方法を使用して実施できる。
本発明が提供するのは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過させて目的の分子を輸送する方法であり、この方法は、
ａ）血液脳関門を通過する、目的の分子に連結された本明細書に記載の１つ又は複数の単離又は精製抗体又はその断片を、対象に投与するステップ
を含み、
１つ又は複数の抗体又はその断片は、ＢＢＢを通過させて目的の分子をフェリーする。前述の方法において、目的の分子は、約１ｋＤ〜約２００ｋＤａの範囲の分子量を有することがあり、目的の分子は、検出可能な試剤、治療剤、薬物、ペプチド、成長因子、サイトカイン、受容体トラップ、化合物、炭水化物部分、酵素、抗体若しくはその断片、ＤＮＡベース分子、ウイルスベクター、若しくは細胞毒性剤；検出可能な試剤、治療剤、薬物、ペプチド、酵素、抗体若しくはその断片、若しくは細胞毒性剤が充填された１つ若しくは複数のリポソーム若しくはナノ担体；又は１つ若しくは複数のナノ粒子、ナノワイヤ、ナノチューブ、若しくは量子ドットでありうる。上述の方法において、投与は、静脈内（ｉｖ）、皮下（ｓｃ）、又は筋肉内（ｉｍ）でありうる。
本発明はまた、対象のＢＢＢを通過して送達されたカーゴ分子の量を定量する方法を包含し、カーゴ分子は、本明細書に記載の１つ又は複数の単離又は精製抗体又はその断片に連結され、この方法は、
ａ）対象から脳脊髄液（ＣＳＦ）を回収するステップ、及び
ｂ）標的化プロテオミクス方法を使用して、ＣＳＦにおける１つ又は複数の単離又は精製抗体又は断片に連結されたカーゴ分子の量を定量するステップ
を含む。
カーゴ分子は前述のカーゴ分子を含む任意の所望の分子でありえ、抗体又はその断片はＢＢＢを通過し、前述のとおり、分子は抗体又はその断片に「連結」できる。上の方法において、ＣＳＦは、当技術分野において知られている任意の好適な方法を使用して対象から回収される。ステップｂ）における標的化プロテオミクス方法に必要なＣＳＦの量は、約１〜１０μｌの間でありうる。カーゴ分子に連結された１つ又は複数の抗体又はその断片の量を定量するのに使用される標的化プロテオミクス方法は、当技術分野において知られている任意の好適な方法でありうる。たとえば、限定することは望まないが、標的化プロテオミクス方法は、質量分析法、たとえば多重反応モニタリング−同位体標識化内部標準（ＭＲＭ−ＩＬＩＳ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ−ｉｓｏｔｙｐｅ ｌａｂｅｌｅｄ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄｓ）でありうる。
密着し高度に選択的なＢＢＢを通過する診断剤又は薬物の送達が不十分なことは、脳疾患、たとえば、これに限定されないが、脳腫瘍及び神経変性疾患の治療法の開発の障害となる。ＢＢＢを通過する分子を輸送する担体の欠如は、かかる疾患のための新しい治療剤及び診断剤の開発を遅滞させる。本明細書に記載のとおり、ＢＢＢを通過した脳内の標的への、抗体にコンジュゲートされた薬物の送達のための、効果的な輸送プラットフォームをもたらす、ＩＧＦ１Ｒ結合性ＶＨＨが製造された。本明細書に記載の抗体は、ＢＢＢ形成脳内皮細胞の管腔側から反管腔側へのＩＧＦ１Ｒの天然ＲＭＴ経路を利用する。ＩＧＦ１Ｒへの抗体の結合後、ＲＭＴが開始され、抗体は、コンジュゲートされた分子（カーゴ）とともに、細胞を通過して反管腔側へとトランスサイトーシスされ、そこでそれらは両方とも脳微小環境内へと放出される。ＩＧＦ１Ｒ ＶＨＨが、ＩＧＦ１Ｒに結合し（図３Ｃ）、ＢＢＢ細胞内に内部移行し（図４）、インビトロＢＢＢモデルの反管腔側へと横断する（図６Ｂ）ことを確認した。薬物の脳内送達のインビボ研究もまた、ＩＧＦ１Ｒ ＶＨＨが、コンジュゲートされたペプチド（ガラニン、約３ｋＤａ）を、大きなタンパク質融合物（約８０ｋＤａ）とともに、ＢＢＢを通過させて「運搬」することを示した（図９Ａ及び図９Ｂ、図６Ｄ）。
結果はまた、抗ＩＧＦ１Ｒ ＶＨＨが、Ｆｃ（結晶性断片）断片と融合して発現し、循環半減期を約７５倍（ＶＨＨ単体の約２０分と比較して約２５時間）に延長できることを示す。この高分子量融合コンストラクト（約８０ｋＤａ）もまた、ＢＢＢを通過して効率的に輸送される。長い血漿内半減期は、ＩＧＦ１Ｒ ＶＨＨ−ｍＦｃ（ｍＦｃ＝マウスＦｃ）コンジュゲートのＣＳＦ曝露を、ＶＨＨ単体と比較して有意に増加させ、ＣＮＳに標的を有する慢性疾患の治療のためのＢＢＢ送達担体として有用である。コンジュゲートは、免疫蛍光検出を使用して、脳実質において容易に検出される。結果は、ＩＧＦ１Ｒ ＶＨＨ担体が、大きな分子（サイズにおいて、抗体、酵素、成長因子、ペプチド、サイトカイン、受容体トラップと同等）を、ＢＢＢを通過させて「フェリー」できることを示す。
したがって、抗体送達は、短期治療（たとえば、てんかん発作）に有用でありうるだけでなく、中期（たとえば、癌）及び長期（たとえば、アルツハイマー病又はパーキンソン病）治療にも有用でありうる。
本発明の追加の態様及び利点は、以下の説明により明らかになる。詳細な説明及び実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、例示のためにのみ記載される。なぜなら、本発明の範囲内の様々な変更及び修正が、本発明の教示に照らして当業者に明らかになると考えられるからである。
ここで、本発明のこれら及び他の特徴が、添付の図面を参照しながら例として説明される。
インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）の概略図である。ＩＧＦ１Ｒは、細胞表面に見出され、２つのサブユニット、アルファサブユニット及びベータサブユニットを含む。アルファサブユニット（インスリン様成長因子１結合部位を有する細胞外部分を含む）は、ジスルフィド結合によりベータサブユニット（小さな細胞外ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内部分を含む）と接続される。ＩＧＦ１受容体は、ダイマーを形成しうる。灰色のボックス内に示されるアルファサブユニット及びベータサブユニットの細胞外部分を含む９３３アミノ酸長断片（Ｍ１−Ｆ９３３、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８０６９、図２を参照のこと）が、組換えにより製造され、ラマの免疫化のために使用された。 ＩＧＦ１Ｒの配列（免疫化及びパニングのために使用されたＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８０６９ ９３３アミノ酸長タンパク質断片を太字で示す、全外部ドメインは２アミノ酸長い）を示す図である。アルファ及びベータサブユニットを隔てるフューリン切断部位を、イタリックの小文字で示す。シグナルペプチドを太字のイタリックで示す。 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムを通したＩＧＦ１Ｒ結合性ＶＨＨ ＩＧＦ１Ｒ−３及びそのヒト化変異体（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ４、Ｈ５）のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。プロファイルは、これらのＶＨＨがモノマー性であり、非凝集性であることを示す。 ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ及びそのヒト化変異体（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５）について、円偏光二色性（ＣＤ）により決定される融解温度（Ｔｍ）を示す図である。タンパク質を９０℃超まで加熱し、測定値をＣＤで取り、融解曲線及びＴｍを決定した。続いて、ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨを室温まで冷却し、再度加熱し、ＣＤにより解析した（下側の曲線）。これは、リフォールドしたタンパク質の割合の決定を可能にした。これは、ヒト化バージョンについては実施されなかった。 ０．１〜１０ｎＭのＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ及びそのヒト化変異体（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ４、Ｈ５）の、ヒトＩＧＦ１Ｒ断片の組換え細胞外部分への結合について、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）の重ね合わせを示す図である。データは、１：１モデルによくフィットする。 ＩＧＦ１の存在下でのヒトＩＧＦ１Ｒ断片の組換え細胞外部分に対するＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ結合のＳＰＲセンサーグラムを示す図である。１００倍の過量のＩＧＦ１は、ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ結合に影響を及ぼさなかったことから、両者が受容体上の異なるエピトープに結合することが示される。実験を２度反復した。 ＩＧＦ１Ｒ−４ ＶＨＨが、ＳＰＲ表面に固定化されたヒトインスリン受容体（ＩＲ）の組換え細胞外部分に結合しなかった一方で、ヒトＩＧＦ１Ｒの対照表面（＊アスタリスクで示されるＩＧＦ１Ｒ表面）に結合したことを示す図である。対照として、２つの受容体の天然リガンドであるＩＧＦ１及びインスリンが、表面上に流され、予測どおり結合が検出された。ＩＧＦ−１は両方の受容体に結合する一方で、インスリン結合は、インスリン受容体についてしか観察できなかった。 Ｃｙ−５．５標識化ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ及び対照ＶＨＨの細胞取込みの画像結果を示す図である。Ｃｙ５．５標識化ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ（又は陽性対照としてのＦＣ５ ＶＨＨ；Ｍｕｒｕｇａｎａｎｄａｍら、２００２；Ｈａｑｑａｎｉら、２０１２）を、ＳＶ４０不死化ラット脳内皮細胞（ｓｖＡＲＢＥＣ）と４℃（上パネル）又は３７℃（下パネル）でインキュベートし、ＩＧＦ１Ｒ−３が受動的に（４℃）、又は能動的機序、たとえば受容体媒介性エンドサイトーシスをによって（３７℃）内部移行したかどうかを評価した。コムギ胚芽凝集素及びＤＡＰＩでの共染色を実施し、細胞表面及び核をそれぞれ視覚化した。上パネル：４℃でインキュベートされたとき、ＩＧＦ１Ｒ−３及びＦＣ５ ＶＨＨは、細胞の外部に（矢頭印）、細胞膜に結合して見出された（コムギ胚芽凝集素と共局在化）。下パネル：３７℃で、ＦＣ５及びＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨの両方が、エンドソームである可能性が高い小胞様構造で細胞の内部に蓄積した（矢頭印）ことから、能動輸送機序による内部移行が示唆される。 マウスＦｃ断片とのＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨのＣ末端融合物の配列を示す図である。 構築された融合タンパク質の概略図である。ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨを黒色、マウスＦｃ（ＣＨ２及びＣＨ３）を灰色で示す。 様々なＶＨＨについてＢＢＢを横断する能力を評価するための、インビトロＢＢＢモデルの使用を要約する流れ図である。等モル量（５．６μＭ）の正（ＦＣ５）及び負（Ａ２０．１、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ結合性ＶＨＨ、及びＥＧＦＲ結合性ＶＨＨであるＥＧ２）の対照のＶＨＨ及びＩＧＦ１Ｒ−３を、ラットインビトロＢＢＢモデルを横断するそれらの能力について同時に試験した。成体ラットからのＳＶ４０不死化脳内皮細胞（ｓｖＡＲＢＥＣ）を、下のチャンバーではラット星状膠細胞馴化培地、上のチャンバーでは標準培地の存在下で、インサートの膜上で単層で培養した。ＢＢＢモデルの管腔側への、等モル量の様々なＶＨＨの同時添加後に、試料を１５、３０、及び６０分後に下のチャンバーから採取した。次に、これらの試料において各ＶＨＨの濃度を、質量分析（多重反応モニタリング−同位体標識化内部標準、ＭＲＭ−ＩＬＩＳ）により定量した。Ｐａｐｐ値［Ｑｒ／ｄｔ＝レシーバーコンパートメントにおける累積量対時間、Ａ＝細胞単層の面積、Ｃ０＝投与溶液の初期濃度］が、分子についてＢＢＢを横断する能力を決定するために一般に使用される。 ４つの同時投与されたＶＨＨのＰａｐｐ値を示す図である。ＩＧＦ１Ｒ−３は、ＦＣ５よりも有意に高いＰａｐｐ値を有する一方で、陰性対照は両方とも、非常に低いＰａｐｐ値を有し、対照ＶＨＨの非常に低い非特異的輸送又は傍細胞輸送と比較して、ＦＣ５及びＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨの促進輸送を示す。結果は、５〜６つの独立実験において得られた平均Ｐａｐｐ値である。 対照として同じウェルにおいて試験されたＡ２０．１ ＶＨＨ（灰色バー）（平均Ａ２０．１値を灰色の点線で示す）と比較した、ヒト化ＩＧＦ１Ｒ−３単一ドメイン抗体（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５）（黒色バー）のＰａｐｐ値を示す図である。 同じウェルにおいて対照として試験されたＦＣ５ ＶＨＨ及びＡ２０．１ ＶＨＨとともに、ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ及びＩＧＦ１Ｒ−３−ｍＦｃ（黒色バー）のＰａｐｐ値を示す図である。 ５ｍｇ／ｋｇの全身（尾静脈）投与後のＩＧＦ１Ｒ−３−ｍＦｃの血漿及びＣＳＦ薬物動態を示す図である。連続的ＣＳＦ回収（１〜４８時間）のため、大槽にカニューレ挿入した。ＩＧＦ１Ｒ−３ｍＦｃの血漿及びＣＳＦレベルを、特定のタンパク質ペプチドサインを「追跡」して定量するＭＲＭ−ＩＬＩＳ法を使用して決定した。ＣＳＦにおけるアルブミンレベルを、ＭＲＭにより同時に決定した。１５００よりも低い血漿／ＣＳＦ比を有するすべてのＣＳＦ試料を、潜在的に血液汚染されているものとして除外した。血漿／ＣＳＦ比は、融合タンパク質の全身注射２４時間後のＩＧＦ１Ｒ−３−ｍＦｃについて、０．５％だった。以前の実験で測定された、同じ用量（５ｍｇ／ｋｇ）で投与されたＡ２０．１ｍＦｃのＣＳＦ／血漿比（２４時間で０．０４％）を、比較のため薄灰色で示す。 ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ−ガラニンコンジュゲートの化学合成のためのスキームを示す図である。まず、ＩＧＦ１Ｒ−３を、スルホ−ＳＭＣＣクロスリンカーのＮＨＳ基にコンジュゲートし（１）、次に、マレイミド活性化ＩＧＦ１Ｒ−３−スルホ−ＳＭＣＣを、ガラニンの還元型システインにコンジュゲートした（２）。 ＩＧＦ１Ｒ−３（レーン２）、ＩＧＦ１Ｒ３−ＳＭＣＣ（レーン３）、及びＩＧＦ１Ｒ−３−ガラニンコンジュゲート（レーン４）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。「バンド形成」パターンは、１つのＩＧＦ１Ｒ−３当たり１〜２個のガラニン分子の結合を示す。 化学的にコンジュゲートされたペプチドガラニンのＩＧＦ１Ｒ−３媒介性脳送達を示す図である。図９Ａは、ハーグリーヴズ疼痛モデル（Ｈａｒｇｒａｅｖｅｓ ｐａｉｎ ｍｏｄｅｌ）を使用して、ＩＧＦ１Ｒ−３について、薬理学的に有効な用量の鎮痛性ペプチドガラニン（３．２ｋＤ）を脳内に送達する能力を示すグラフである。このモデルにおいて、雄ウィスターラット（４〜６週齢）において、１００μｌの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を左足底表面に注射し、数時間以内に局所炎症を引き起こすことにより、局所的な慢性的疼痛が誘導される。ＢＢＢ担体ＶＨＨ−薬物コンジュゲート又はガラニン単体の尾静脈注射後に、ガラス表面上にセットされたプレキシグラスの囲いの中にラットを入れる。温度的刺激を、角度を付けた鏡を介して炎症性又は対側の足に集中させた。刺激の適用と足の退避（足をなめるか、又は動かすこと）との間の潜時は、鎮痛性効果（温熱性痛覚の阻害）の尺度として解釈される。１ｍｇ／ｋｇガラニンの全身（尾静脈）注射後の鎮痛効果の欠如により実証されるとおり、ペプチドガラニン単体はＢＢＢを通過できない（黒い三角）。ＩＧＦ１Ｒ−３−ガラニンコンジュゲート（５．８５ｍｇ／ｋｇ）の全身注射は、３時間にわたって用量依存性鎮痛効果を誘導し、６ｍｇ／ｋｇ用量のＦＣ５−ガラニンコンジュゲートで観察されたものよりも顕著だった。 化学的にコンジュゲートされたペプチドガラニンのＩＧＦ１Ｒ−３媒介性脳送達を示す図である。図９Ｂは、これらの結果を、最大可能効果（ＭＰＥ、対照足）と比較した薬力学反応の曲線下面積（ＡＵＣ）として示す。５．８５ｍｇ／ｋｇのＩＧＦ１Ｒ−３−ガラニンは、ＭＰＥの６５％を３時間にわたって誘導し、全身注射後のガラニン単体（ＭＰＥの＜５％）と比較して、コンジュゲートの有意な脳透過性を実証した。 化学的にコンジュゲートされたペプチドガラニンのＩＧＦ１Ｒ−３媒介性脳送達を示す図である。図９Ｃは、３ｍｇ／ｋｇのＩＧＦ１Ｒ−３−ガラニンコンジュゲートの全身注射後に誘導され、注射３時間後に消失した一過性の鎮痛効果を示す。１時間後の同じ用量の２回目の注射は、同様のほんの少しだけ弱まった鎮痛反応をもたらした。 ６ｍｇ／ｋｇの用量の尾静脈投与２４時間後の脳切片におけるＩＧＦ１Ｒ−３ｍＦｃの免疫検出を示す図である。ＰＢＳでの屠殺灌流がラットにおいて実施され、ビブラトームを使用して脳切片（１２μｍ）が得られた。ＩＧＦ１Ｒ−３ｍＦｃを、抗マウスＦｃ抗体を使用して免疫検出した（赤色、赤色チャンネルはインサートにのみ示す）。脳切片（尾状核被殻、図１０Ａ；頭頂葉皮質、図１０Ｂ）における血管を、レクチンＲＣＡ１を使用して検出した（緑色）。ＩＧＦ１Ｒ−３ｍＦｃを、矢頭印により示すとおり、血管及び血管外（すなわち、脳実質中であり、ＢＢＢを通過している）の両方において検出できた。 ＩＧＦ１Ｒ−３が、インスリン受容体又はＩＧＦ１Ｒを介したインスリン又はＩＧＦ−１シグナル伝達を妨げないことを示す図である。図１１Ａは、ＩＧＦ１Ｒ−３又は試験された任意の他の抗ＩＧＦ１Ｒ ＶＨＨ（ＩＧＦ１Ｒ−１、−４、−５又は−６）のいずれも、単体では下流Ａｋｔリン酸化を１００ｎＭの濃度で誘導しないことを示す、代表的なウエスタンブロットである。１００ｎＭのＩＧＦ１Ｒ−３又は任意の他の抗ＩＧＦ１Ｒ ＶＨＨのいずれの存在も、１０μｇ／ｍｌのインスリンにより誘導されるＡｋｔリン酸化を阻害しない。３つの独立実験からのウエスタンブロットバンド密度の定量を、ゲル画像の下の棒グラフ（平均＋／−ＳＤ）で示す。 ＩＧＦ１Ｒ−３が、インスリン受容体又はＩＧＦ１Ｒを介したインスリン又はＩＧＦ−１シグナル伝達を妨げないことを示す図である。図１１Ｂは、１００ｎＭのＩＧＦ１Ｒ−３又は試験された任意の他の抗ＩＧＦ１Ｒ ＶＨＨ（ＩＧＦ１Ｒ−４、−５又は−６）のいずれも、それら自体ではＡｋｔのリン酸化を誘導しなかったこと、及び２００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１での刺激の際に誘導されるＩＧＦ−１誘導性Ａｋｔリン酸化（すなわちシグナル伝達）を阻害しなかったを示す、代表的なウエスタンブロットである。３つの独立実験からのウエスタンブロットバンド密度の定量を、ゲル画像の下の棒グラフ（平均＋／−ＳＤ）で示す。 ＩＧＦ１Ｒ−３が、インスリン受容体又はＩＧＦ１Ｒを介したインスリン又はＩＧＦ−１シグナル伝達を妨げないことを示す図である。図１１Ｃは、リン酸化ＩＧＦ１Ｒについてプローブされたウエスタンブロットを示す。細胞を、Ｃ末端でマウスＦｃ単体と融合された（たとえばＩＧＦ１Ｒ−３−ｍＦｃ）１００ｎＭ又は５００ｎＭのいずれかのＩＧＦ１Ｒ−１又は任意の他の抗ＩＧＦ１Ｒ ＶＨＨ（ＩＧＦ１Ｒ−１、−４又は−５）とインキュベートしたか、又はそれぞれのＩＧＦ１Ｒ ＶＨＨ−ｍＦｃ融合タンパク質の存在下で２００ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−１で刺激した。ウエスタンブロットは、融合コンストラクトのいずれもＩＧＦ１ＲのＩＧＦ−１誘導性リン酸化を阻害せず、それら自体では受容体リン酸化も誘導しなかったことを示す。
発明の詳細な説明
本発明は、インスリン様成長因子１受容体特異的抗体、それらの断片、及びそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、血液脳関門を通過するインスリン様成長因子１受容体特異的抗体又はそれらの断片、及びそれらの使用に関する。
本発明は、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）エピトープに特異的に結合する単離又は精製抗体又はその断片を提供し、抗体又はその断片は血液脳関門を通過し、エピトープは、配列番号５の抗体により特異的に結合される。ＩＧＦ１Ｒエピトープは、ＩＧＦ１Ｒ細胞外ドメイン内にありうる。
本発明は、
ＥＹＰＳＮＦＹＡの相補性決定領域（ＣＤＲ）１配列（配列番号１）、
ＶＳＲＤＧＬＴＴのＣＤＲ２配列（配列番号２）、及び
ＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹのＣＤＲ３配列（配列番号３）
を含み、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）に特異的に結合する単離又は精製抗体又はその断片を提供する。
本明細書において使用される「抗体」という用語は、当技術分野において「免疫グロブリン」（Ｉｇ）とも呼ばれ、対となるポリペプチド重鎖及び軽鎖から構築されるタンパク質を指し、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭを含む様々なＩｇアイソタイプが存在する。抗体が正確にフォールドされるとき、各鎖は、より直鎖状のポリペプチド配列により連結された数多くの別個の球状ドメインへとフォールドする。たとえば、免疫グロブリン軽鎖は、可変（ＶＬ）及び定常（ＣＬ）ドメインへとフォールドする一方で、重鎖は、可変（ＶＨ）及び３つの定常（ＣＨ、ＣＨ２、ＣＨ３）ドメインへとフォールドする。重鎖及び軽鎖可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）の相互作用は、抗原結合領域（Ｆｖ）の形成をもたらす。各ドメインは、当業者が精通するよく確立された構造を有する。
軽鎖及び重鎖可変領域は、標的抗原との結合を担い、したがって、抗体間での顕著な配列多様性を示しうる。定常領域は、比較的低い配列多様性を示し、重要な生化学的事象を誘発するための数多くの天然タンパク質との結合を担う。抗体の可変領域は、分子の抗原結合決定基を含有し、したがって、抗体のその標的抗原に対する特異性を決定する。配列変異性の大多数は６つの超可変領域において生じ、これらは可変重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）にそれぞれ３つずつある。超可変領域は組み合わさって抗原結合部位を形成し、抗原決定基との結合及びその認識に寄与する。抗体のその抗原に対する特異性及び親和性は、超可変領域の構造とともに、それらのサイズ、形状、及びそれらが抗原に対して提示する表面の化学的性質により決定される。超可変性の領域の同定のための様々なスキームが存在し、最も一般的な２つは、Ｋａｂａｔのもの並びにＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋのものである。Ｋａｂａｔら（１９９１）は、ＶＨ及びＶＬドメイン抗原結合領域配列変異性に基づいて「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を定義する。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（１９８７）は、ＶＨ及びＶＬドメインにおける構造的ループ領域の位置に基づいて「超可変ループ」（Ｈ又はＬ）を定義する。これらの個別のスキームは、隣接又はオーバーラップするＣＤＲ及び超可変ループ領域を定義するので、抗体技術分野の当業者は、「ＣＤＲ」及び「超可変ループ」という用語を多くの場合互換的に用い、本明細書においてもそのように使用できる。ＣＤＲ／ループは、可変ドメインの比較を容易にするために開発された、より最近のＩＭＧＴナンバリングシステム（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ら、２００３）に従って、本明細書において参照される。このシステムにおいて、保存アミノ酸（たとえばＣｙｓ２３、Ｔｒｐ４１、Ｃｙｓ１０４、Ｐｈｅ／Ｔｒｐ１１８、及び位置８９の疎水性残基）は常に同じ位置を占める。加えて、フレームワーク領域（ＦＲ１：位置１〜２６；ＦＲ２：３９〜５５；ＦＲ３：６６〜１０４；及びＦＲ４：１１８〜１２９）及びＣＤＲ（ＣＤＲ１：２７〜３８、ＣＤＲ２：５６〜６５；及びＣＤＲ３：１０５〜１１７）の標準化された境界設定が提供される。
本明細書において称される「抗体断片」は、当技術分野において知られている任意の好適な抗原結合抗体断片を含みうる。抗体断片は、天然抗体断片でもよく、又は天然抗体の操作若しくは組換え方法の使用により得られてもよい。たとえば、抗体断片には、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ、ペプチドリンカーで接続されたＶＬ及びＶＨからなる分子）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、単一ＶＬ又はＶＨからなる断片）、及びこれらのうちの任意のものの多価提示が含まれうるが、これに限定されない。抗体断片、たとえばすぐ上で述べられたものは、断片の異なる部分を連結するためのリンカー配列、ジスルフィド結合、又は他のタイプの共有結合を必要とすることがあり、当業者は、異なるタイプの断片の要件及びそれらの構築のための様々なアプローチに精通していると考えられる。
非限定的な一例において、抗体断片は、天然ソースに由来するｓｄＡｂでありうる。ラクダ科動物由来の重鎖抗体（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、１９９３）は軽鎖を欠き、したがって、それらの抗原結合部位は、ＶＨＨと呼ばれる１つのドメインからなる。ｓｄＡｂはまた、サメにおいても観察されており、ＶＮＡＲと呼ばれる（Ｎｕｔｔａｌｌら、２００３）。他のｓｄＡｂが、ヒトＩｇ重鎖及び軽鎖配列に基づいて設計されうる（Ｊｅｓｐｅｒｓら、２００４；Ｔｏら、２００５）。本明細書において使用される「ｓｄＡｂ」という用語には、任意の由来のＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ又はＶＮＡＲリザーバーから、ファージディスプレイ又は他の技術によって直接単離されるｓｄＡｂ、前述のｓｄＡｂに由来するｓｄＡｂ、組換え産生ｓｄＡｂが、ヒト化、親和性成熟、安定化、可溶化、ラクダ化、又は抗体工学の他の方法によるかかるｓｄＡｂのさらなる改変によって作製されるｓｄＡｂとともに含まれる。本発明には、ｓｄＡｂの抗原結合機能及び特異性を保持するホモログ、誘導体、又は断片も包含される。
ｓｄＡｂは、抗体分子の所望の特性、たとえば高い熱安定性、高い耐洗剤性、相対的に高いプロテアーゼ耐性（Ｄｕｍｏｕｌｉｎら、２００２）及び高い生産収率（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、１９９７）を有し、また、免疫ライブラリーからの単離（Ｌｉら、２００９）、又はインビトロ親和性成熟（Ｄａｖｉｅｓ＆Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ、１９９６）により、非常に高い親和性を有するよう設計できる。安定性を高めるためのさらなる改変、たとえば非カノニカルなジスルフィド結合の導入（Ｈｕｓｓａｃｋら、２０１１；Ｋｉｍら、２０１２）もまた、ｓｄＡｂにもたらされうる。
当業者は、単一ドメイン抗体の構造によく精通していると考えられる（たとえば、タンパク質構造データバンクの３ＤＷＴ、２Ｐ４２を参照のこと）。ｓｄＡｂは、免疫グロブリンフォールドを保持する単一の免疫グロブリンドメインを含み、とりわけ、３つのＣＤＲ／超可変ループのみが抗原結合部位を形成する。しかしながら、当業者に理解されていると考えられるとおり、すべてのＣＤＲが抗原の結合に必要とされるわけではない。たとえば、限定することは望まないが、１つ、２つ又は３つのＣＤＲが、本発明のｓｄＡｂによる抗原との結合及びその認識に寄与しうる。ｓｄＡｂ又は可変ドメインのＣＤＲは、本明細書において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれ、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ら（２００３）による定義どおりナンバリングされる。
本発明の抗体又はその断片は、細胞表面に見出される受容体である、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）に特異的である。ＩＧＦ１Ｒは、インスリン様成長因子１結合部位を有する細胞外部分を含むアルファサブユニットを含み、これは、ジスルフィド結合により、小さな細胞外ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内部分を含むベータサブユニットと接続される。ＩＧＦ１受容体は、ホモダイマーへと構築されるか、又はインスリン受容体とのヘテロダイマーを形成しうる。ＩＧＦ１Ｒの配列は、図２に示すもの（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８０６９、配列番号１３）、又はそれと実質的に同一の配列でありうるが、これに限定されない。
本明細書に記載の抗体又はその断片は、インスリン受容体（ＩＲ）又はＩＧＦ１Ｒを介したシグナル伝達を妨げないはずである。具体的には、本明細書に記載の抗体又はそれらの断片は、インスリンにより誘導されるＡＫＴリン酸化を阻害しないはずであり、又は、それら自体でＩＲのリン酸化を誘導したり、インスリン誘導性シグナル伝達を阻害したりしないはずである。加えて、本明細書に記載の抗体又はそれらの断片は、ＩＧＦ１ＲのＩＧＦ−１誘導性リン酸化を阻害しないはずである。さらに、それらは、インスリン受容体に結合しないはずである。
前述のとおり、抗体又はその断片は、ｓｄＡｂでありうる。ｓｄＡｂは、ラクダ科動物由来又はラクダ科動物ＶＨＨ由来でありえ、したがってラクダ科動物フレームワーク領域に基づきうる。代わりに、上述のＣＤＲは、ＶＮＡＲ、ＶＨＨ、ＶＨ又はＶＬフレームワーク領域上にグラフトされうる。また別の選択肢において、上述の超可変ループは、任意のソース（たとえば、マウス）の他のタイプの抗体断片（Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）のフレームワーク領域又はＣＤＲをグラフトできる類似のサイズ及び性質のタンパク質上にグラフトされうる（たとえば、Ｎｉｃａｉｓｅら、２００４を参照のこと）。
本発明は、当技術分野において知られている任意の好適な方法、たとえばこれに限定されないが、ＣＤＲグラフティング及びベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）を使用して「ヒト化」された抗体又は断片をさらに包含する。抗体又は抗体断片のヒト化は、抗原結合能又は特異性を失うことなしに、配列中のアミノ酸を、ヒトコンセンサス配列に見出されるそのヒト対応物と置き換えることを含む。このアプローチは、ヒト対象に導入されたときに、抗体又はその断片の免疫原性を低減する。ＣＤＲグラフティングのプロセスにおいて、本明細書において定義される１つ又は複数のＣＤＲが、ヒト可変領域（ＶＨ、又はＶＬ）、他のヒト抗体（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）、他のヒト抗体断片フレームワーク領域（Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）又はＣＤＲがグラフトされうる類似のサイズ及び性質の他のタンパク質に、融合又はグラフトされうる（Ｎｉｃａｉｓｅら、２００４）。かかる場合において、前記１つ又は複数の超可変ループのコンフォメーションは、保存されている可能性が高く、ｓｄＡｂのその標的（すなわち、ＩＧＦ１Ｒ）に対する親和性及び特異性は、最小限の影響しか受けない可能性が高い。ＣＤＲグラフティングは、当技術分野において知られており、少なくとも以下に記載されている。すなわち、米国特許第６１８０３７０号、米国特許第５６９３７６１号、米国特許第６０５４２９７号、米国特許第５８５９２０５号、及び欧州特許第６２６３９０号。当技術分野において「可変領域リサーフェイシング（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」とも呼ばれるベニアリングは、抗体又は断片の溶媒に露出した位置をヒト化することを伴う。したがって、ＣＤＲコンフォメーションにとって重要でありうる埋没した非ヒト化残基は保存される一方で、溶媒に露出した領域に対する免疫反応の可能性は最小化される。ベニアリングは、当技術分野において知られており、少なくとも以下に記載されている。すなわち、米国特許第５８６９６１９号、米国特許第５７６６８８６号、米国特許第５８２１１２３号、及び欧州特許第５１９５９６号。当業者はまた、かかるヒト化抗体断片を調製し、アミノ酸位置をヒト化する方法にも十分に精通していると考えられる。
たとえば、いかなる形で限定することも望まないが、ＩＧＦ１Ｒに特異的な単離又は精製抗体又はその断片は、
Ｘ１ＶＸ２ＬＸ３ＥＳＧＧＧＬＶＱＸ４ＧＧＳＬＲＬＳＣＸ５ＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＸ６ＲＱＡＰＧＫＸ７Ｘ８ＥＸ９ＶＸ１０ＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＸ１１ＳＲＤＮＸ１２ＫＮＴＸ１３Ｘ１４ＬＱＭＮＳＸ１５Ｘ１６ＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＸ１７ＶＴＶＳＳ（配列番号４）（式中、Ｘ１はＥ又はＱであり、Ｘ２はＫ又はＱであり、Ｘ３はＶ又はＥであり、Ｘ４はＡ又はＰであり、Ｘ５はＶ又はＡであり、Ｘ６はＦ又はＶであり、Ｘ７はＥ又はＧであり、Ｘ８はＲ又はＬであり、Ｘ９はＦ又はＷであり、Ｘ１０はＡ又はＳであり、Ｘ１１はＭ又はＩであり、Ｘ１２はＡ又はＳであり、Ｘ１３はＶ又はＬであり、Ｘ１４はＤ又はＹであり、Ｘ１５はＶ又はＬであり、Ｘ１６はＫ又はＲであり、Ｘ１７はＱ又はＬである）、
又はそれと実質的に同一の配列でありうる。代わりに、単離又は精製抗体は、
本明細書においてＩＧＦ１Ｒ−３と呼ばれる、ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＶＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ （配列番号５）、
本明細書においてＩＧＦ１Ｒ−３＿Ｈ１と呼ばれる、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （配列番号６）、
本明細書においてＩＧＦ１Ｒ−３＿Ｈ２と呼ばれる、ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （配列番号７）、
本明細書においてＩＧＦ１Ｒ−３＿Ｈ３と呼ばれる、ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＡＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （配列番号８）、
本明細書においてＩＧＦ１Ｒ−３＿Ｈ４と呼ばれる、ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （配列番号９）、及び
本明細書においてＩＧＦ１Ｒ−３＿Ｈ５と呼ばれる、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （配列番号１０）、
又はそれと実質的に同一の配列からなる群から選択される配列を含みうる。
実質的に同一の配列は、１つ又は複数の保存的アミノ酸変異を含みうる。基準配列に対する１つ又は複数の保存的アミノ酸変異は、基準配列と比較して、生理的、化学的、物理化学的又は機能的特性において実質的変化のない変異体ペプチドをもたらしうることが当技術分野において知られており、かかる場合に、基準配列及び変異体配列は「実質的に同一」のポリペプチドと考えられる。保存アミノ酸置換は、アミノ酸残基の、類似の化学的特性（たとえば、サイズ、電荷、又は極性）を有する別のアミノ酸残基との置換として本明細書に定義される。これらの保存的アミノ酸変異は、ｓｄＡｂのフレームワーク領域に生じうる一方で、上に挙げたＣＤＲ配列及び抗体又は断片のＣＤＲの全体構造を維持する。したがって、抗体の特異性及び結合は維持される。
非限定的な一例において、保存的変異は、アミノ酸置換でありうる。かかる保存アミノ酸置換は、塩基性、中性、疎水性、又は酸性アミノ酸を、同じ群の別のものに置換しうる。「塩基性アミノ酸」という用語により、７を超える側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸が意図され、これは生理的ｐＨで正の電荷を典型的には有する。塩基性アミノ酸には、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、及びリシン（Ｌｙｓ又はＫ）が含まれる。「中性アミノ酸」（「極性アミノ酸」とも呼ばれる）という用語により、生理的ｐＨで無電荷であるが、２つの原子により共有される電子対がそれら原子の一方によってより近接して保持される少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸が意図される。極性アミノ酸には、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、及びグルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）が含まれる。「疎水性アミノ酸」（「非極性アミノ酸」とも呼ばれる）という用語は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（１９８４）の標準化された合意されている疎水性スケールに従って、ゼロを超える疎水性を示すアミノ酸を含むことが意図される。疎水性アミノ酸には、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、及びグリシン（Ｇｌｙ又はＧ）が含まれる。「酸性アミノ酸」は、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指し、これは、生理的ｐＨで負の電荷を典型的には有する。酸性アミノ酸には、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、及びアスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）が含まれる。
配列同一性が、２つの配列の類似性を評価するために使用される。それは、残基位置間が最大限対応するよう２つの配列をアラインしたときに同一である残基のパーセントを計算することにより決定される。配列同一性を計算するために、任意の既知の方法を使用でき、たとえば、配列同一性を計算するのにコンピュータソフトウェアを利用可能である。限定することは望まないが、配列同一性は、ソフトウェア、たとえばＳｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓにより維持されている（そして、ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｂｌａｓｔ／で見られる）ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ２サービス、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、Ｂｌａｓｔ−Ｎ、若しくはＦＡＳＴＡ−Ｎ、又は当技術分野において知られている任意の他の適切なソフトウェアにより計算できる。
本発明の実質的に同一の配列は、少なくとも９０％同一でありうる。別の一例において、実質的に同一の配列は、アミノ酸レベルで本明細書に記載の配列に対し、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％、又はこれらの間の任意のパーセンテージで同一である。重要なことだが、実質的に同一の配列は、基準配列の活性及び特異性を保持する。非限定的一実施形態において、配列同一性の差は、保存的アミノ酸変異（複数可）によるものでありうる。非限定的な一例において、本発明は、本明細書に記載の抗体の配列と少なくとも９５％、９８％、又は９９％同一の配列を含む抗体又はその断片に関するものでありうる。
本発明の抗体又はその断片はまた、組換え抗体又はその断片の発現、検出又は精製を補助する追加の配列を含みうる。当業者に知られている任意のかかる配列又はタグを使用できる。たとえば、限定することは望まないが、抗体又はその断片は、標的化又はシグナル配列（たとえば、これに限定されないが、ｏｍｐＡ）、検出／精製タグ（たとえば、これに限定されないが、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈｉｓ５、又はＨｉｓ６）、又はそれらの組合せを含みうる。別の一例において、追加の配列は、ビオチン認識部位、たとえばＣｒｏｎａｎらにより国際公開第９５／０４０６９号に記載されたもの又はＶｏｇｅｓらにより国際公開第２００４／０７６６７０号に記載されたものでありうる。やはり当業者に知られているとおり、リンカー配列を、追加の配列又はタグと併せて使用でき、又は検出／精製タグとして役立ちうる。
本発明の抗体又はその断片は、本明細書において多価提示とも呼ばれる、多価ディスプレイ形式でもありうる。多量体化は、当技術分野において知られている任意の好適な方法により達成できる。たとえば、いかなる形で限定することも望まないが、多量体化は、自己組織化分子、たとえばＺｈａｎｇら（２００４ａ、２００４ｂ）及び国際公開第２００３／０４６５６０号に記載のものを使用して達成できる。これらの文献では、本発明の抗体又はその断片及びＡＢ５毒素ファミリーのＢ−サブユニットの五量体化ドメイン（Ｍｅｒｒｉｔｔ＆Ｈｏｌ、１９９５）を含む融合タンパク質を発現させることによりペンタボディ（ｐｅｎｔａｂｏｄｉｅｓ）が製造された。Ｚｈｕら（２０１０）により記述された多量体化ドメインを使用しても、多量体を形成できる。本明細書において「コンボディ（ｃｏｍｂｏｄｙ）」形態と呼ばれるこの形態は、本発明の抗体又は断片と多量体分子をもたらすコイルドコイルペプチドとの融合物である（Ｚｈｕら、２０１０）。多価ディスプレイの他の形態もまた、本発明に包含される。たとえば、限定することは望まないが、抗体又はその断片が、ダイマー、トリマー、又は任意の他の好適なオリゴマーとして提示されうる。これは、当技術分野において知られている方法、たとえば直接連結接続（Ｎｉｅｌｓｏｎら、２０００）、ｃ−ｊｕｎ／Ｆｏｓ相互作用（ｄｅ Ｋｒｕｉｆ＆Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇ、１９９６）、「ノブ・イントゥー・ホールズ（Ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）」相互作用により達成できる（Ｒｉｄｇｗａｙら、１９９６）。
多量体化のための当技術分野において知られている別の方法は、Ｆｃドメイン、たとえば、これに限定されないが、ヒトＦｃドメインを使用して、抗体又はその断片をダイマー化するものである。Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＭを含むが、これに限定されない様々なクラス、又は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２等を含むが、これに限定されない様々なサブクラスから選択できる。このアプローチにおいて、Ｆｃ遺伝子が、ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質を作製するために、ｓｄＡｂ遺伝子とともにベクター内に挿入される（Ｂｅｌｌら、２０１０；Ｉｑｂａｌら、２０１０）。融合タンパク質が組換え発現させられ、次に精製される。たとえば、いかなる形で限定することも望まないが、多価ディスプレイ形式は、Ｆｃドメインに連結された抗ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨのキメラ又はヒト化形式、又は２つ若しくは３つの抗ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ認識特異エピトープとの二重若しくは三重特異性抗体融合物を包含しうる。かかる抗体は、設計及び製造が容易であり、ｓｄＡｂの血清中半減期を大きく延長させることができ、優れた腫瘍画像化試薬でありうる（Ｂｅｌｌら、２０１０）。
すぐ上で述べた多量体複合体におけるＦｃドメインは、当技術分野において知られている任意の好適なＦｃ断片でありうる。Ｆｃ断片は、任意の好適なソースに由来しうる。たとえば、Ｆｃは、マウス又はヒト由来でありうる。具体的で非限定的な一例において、Ｆｃは、マウスＦｃ２ｂ断片又はヒトＦｃ１断片でありうる（Ｂｅｌｌら、２０１０；Ｉｑｂａｌら、２０１０）。Ｆｃ断片は、本発明の抗ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ又はヒト化バージョンのＮ末端又はＣ末端と融合できる。具体的で非限定的な一例において、すぐ上で述べた多量体化単離又は精製抗体又は断片は、配列番号１１、４１、又は１２の配列を含みうる。
上述の多量体の各サブユニットは、同じ又は異なる本発明の抗体又はそれらの断片を含むことができ、これは、同じ又は異なる特異性を有しうる。加えて、多量体化ドメインを、必要に応じてリンカーを使用して抗体又は抗体断片に連結できる。かかるリンカーは、２つの分子の柔軟な結合を提供するのに十分な長さ及び適切な組成を有するはずであるが、抗体の抗原結合特性を妨げないはずである。
本明細書に記載の抗体又はその断片は、血液脳関門を通過できる。脳は、血液脳関門（ＢＢＢ）として知られている特化した内皮組織により身体の他の部分から分離される。ＢＢＢの内皮細胞は、密着結合により接続され、多くの治療化合物が脳に侵入するのを効率的に妨げる。低効率の小胞輸送に加えて、ＢＢＢの具体的な特徴の１つは、酵素障壁（複数可）の存在及びＢＢＢの反管腔（脳）側でのＡＴＰ依存性輸送体、たとえばＰ−糖タンパク質（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎら、１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅ、１９９５）の高レベル（複数可）の発現であり、これは、様々な分子を脳から血流内へと能動輸送する（Ｓａｍｕｅｌｓ、１９９３）。小さく（＜５００ダルトン）疎水性（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、１９９５）の分子だけが、より容易にＢＢＢを横断できる。したがって、上述の抗体又はその断片が、表面受容体に特異的に結合し、脳内皮細胞内に内部移行し、リソソーム分解を回避することによりＢＢＢを通過するトランスサイトーシスを受ける能力は、神経学分野において有用である。
本発明はまた、本明細書に記載の分子をコードする核酸配列を包含する。遺伝コードの縮重を鑑みると、当業者により容易に理解されると考えられるとおり、数多くの核酸配列が、ポリペプチドをコードする効果を有すると考えられる。核酸配列は、様々な微生物における発現のためにコドン最適化できる。本発明はまた、すぐ上で述べた核酸を含むベクターを包含する。さらに、本発明は、上述の核酸及び／又はベクターを含む細胞を包含する。
本発明は、様々な方法を使用して表面に固定化された単離又は精製抗体又はその断片をさらに包含する。たとえば、限定することは望まないが、抗体又は断片は、Ｈｉｓ−タグカップリング、ビオチン結合、共有結合、吸着等を介して表面に連結又はカップリングできる。本発明の抗体又はその断片の固定化は、タンパク質を捕捉、精製又は単離するための様々な用途において有用でありうる。固体表面は、任意の好適な表面、たとえば、これに限定されないが、マイクロタイタープレートのウェル表面、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーチップのチャンネル、膜、ビーズ（たとえば磁気ベース又はセファロースベースビーズ又は他のクロマトグラフィー樹脂）、ガラス、プラスチック、ステンレス鋼、薄膜、又は任意の他の有用な表面、たとえばナノ粒子、ナノワイヤ及びカンチレバー表面でありうる。
本発明はまた、カーゴ分子に連結された上述の抗体又はその断片を包含する。カーゴ分子は、任意の好適な分子でありえ、抗体又はその断片によりＢＢＢを通過して送達される。カーゴ分子は、約１ｋＤ〜約２００ｋＤａの範囲の分子量を有しうる。たとえば、カーゴ分子は、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、若しくは２００ｋＤａの分子量、又はこれらの間の任意の分子量、又は任意の２つの前述の分子量により定義される任意の範囲の分子量を有しうる。具体的で非限定的な例において、カーゴ分子は、１ｋＤａ（たとえば、これに限定されないが、小分子、たとえばＣｙ５．５）、１〜１０ｋＤａ（たとえば、これに限定されないが、ペプチド、たとえばガラニン、３ｋＤａ）、約８０ｋＤａ（たとえば、これに限定されないが、Ｆｃ断片、酵素、タンパク質、抗体等）、又は約２００ｋＤａ（たとえば、これに限定されないが、モノクローナル抗体）の分子量を有しうる。
たとえば、いかなる形で限定することも望まないが、カーゴ分子は、検出可能な試剤、治療剤、薬物、ペプチド、酵素、成長因子、サイトカイン、受容体トラップ、抗体若しくはその断片（たとえば、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＶＨＨ、ＶＨ、ＶＬ等）、化合物、炭水化物部分、ＤＮＡベース分子（アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、プラズミド）、細胞毒性剤、ウイルスベクター（アデノ−、レンチ−、レトロ）、任意の前述のタイプのカーゴ分子が充填された１つ若しくは複数のリポソーム若しくはナノ担体、又は１つ若しくは複数のナノ粒子、ナノワイヤ、ナノチューブ、若しくは量子ドットでありうる。上述のカーゴ分子は、検出可能な試剤でありうる。たとえば、ＩＧＦ１Ｒ特異的抗体又はその断片を、放射性同位体、常磁性標識、フルオロフォア、蛍光剤、近赤外（ＮＩＲ、たとえばＣｙ５．５）蛍光色素若しくは染料、エコー源性マイクロバブル、親和性標識、検出可能なタンパク質ベース分子、ヌクレオチド、量子ドット、ナノ粒子、ナノワイヤ、又はナノチューブ又は画像化方法により検出できる任意の他の好適な試剤に連結できる。抗体又はその断片は、当技術分野において知られている任意の方法（組換え技術、化学的コンジュゲーション等）を使用してカーゴ分子に連結できる。
本明細書に記載のカーゴ分子を、当技術分野において知られている任意の好適な方法により抗体又はその断片に連結でき、本明細書においては「コンジュゲート」できるとも言う。たとえば、限定することは望まないが、カーゴ分子は、共有結合又はイオン性相互作用によりペプチドに連結できる。連結は、化学的架橋反応、又は組換えＤＮＡ法を任意のペプチド発現系、たとえば細菌、酵母又は哺乳動物細胞ベースの系と組み合わせて使用した融合によって達成できる。カーゴ分子を抗体又はその断片にコンジュゲートするとき、好適なリンカーを使用できる。抗体又はその断片をカーゴ分子、たとえば治療剤又は検出可能な試剤に連結するための方法は、当業者によく知られていると考えられる。
非限定的な一例において、カーゴ分子は、検出可能な標識、放射性同位体、常磁性標識、たとえばガドリニウム若しくは酸化鉄、フルオロフォア、近赤外（ＮＩＲ）蛍光色素若しくは染料、エコー源性マイクロバブル、親和性標識（たとえばビオチン、アビジン等）、酵素、又は画像診断法により検出できる任意の他の好適な試剤でありうる。具体的で非限定的な一例において、抗ＩＧＦ１Ｒ−３又はその断片は、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）画像化染料、たとえば、これに限定することを望まないが、Ｃｙ５．５、Ａｌｅｘａ６８０、Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０、又はＤｙｌｉｇｈｔ８００に連結できる。
したがって、本発明は、組織試料を、検出可能な試剤に連結された本発明の１つ又は複数の単離又は精製抗体又はその断片と接触させるステップを含む、ＩＧＦ１Ｒを検出するインビトロ方法をさらに提供する。次に、当技術分野において知られている検出及び／又は画像化技術を使用して、ＩＧＦ１Ｒ抗体複合体を検出できる。すぐ上で述べた方法における組織試料は、任意の好適な組織試料、たとえば、これに限定されないが、血清試料、血管組織試料、腫瘍組織試料、又は脳組織試料でありえ、組織試料は、ヒト又は動物対象からのものでありうる。接触させるステップは、当業者に知られている、抗体又はその断片とＩＧＦ１Ｒとの間の複合体の形成に好適な条件下でなされる。検出するステップは、当技術分野において知られている任意の好適な方法、たとえば、これに限定されないが、光学イメージング、免疫組織化学、分子画像診断、ＥＬＩＳＡ、イメージング質量分析、又は他の好適な方法により達成できる。たとえば、いかなる形で限定することも望まないが、検出可能な試剤に連結された単離又は精製抗体又はその断片は、イムノアッセイ（ＩＡ）、たとえば、これに限定されないが、酵素ＩＡ（ＥＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、「迅速抗原捕捉」、「迅速クロマトグラフィーＩＡ」、及び「迅速ＥＩＡ」において使用できる。（たとえば、Ｐｌａｎｃｈｅら、２００８；Ｓｌｏａｎら、２００８；Ｒｕｓｓｍａｎｎら、２００７；Ｍｕｓｈｅｒら、２００７；Ｔｕｒｇｅｏｎら、２００３；Ｆｅｎｎｅｒら、２００８を参照のこと）。
本発明はまた、対象におけるＩＧＦ１Ｒ発現を検出するインビボ方法を提供する。この方法は、検出可能な試剤に連結された本明細書に記載の１つ又は複数の単離又は精製抗体又はその断片を、対象に投与するステップ、及びそれに続く、ＩＧＦ１Ｒに結合した標識化抗体又はその断片を検出するステップを含む。検出するステップは、当技術分野において知られている任意の好適な方法、たとえば、これに限定されないが、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、又は蛍光イメージング、又は任意の他の好適な方法を含みうる。すぐ上で述べた方法は、血管又は組織、たとえば、これに限定されないが、腫瘍組織におけるＩＦＧ１Ｒ発現の検出において有用でありうる。
上述の方法におけるインビボ検出ステップは、診断目的の全身イメージング又は特定の部位、たとえば、これに限定されないが、脳血管又は脳腫瘍血管の、疾患の進行又は治療計画に対する宿主反応を評価するための定量的方法での局所イメージングでありうる。上述の方法における検出ステップは、免疫組織化学、又は以下を含むが、これに限定されない非侵襲的（分子的）画像診断技術でありうる。すなわち、
光学イメージング；
ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、検出可能な試剤は、同位体、たとえば１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１２４Ｉ、７６Ｂｒ、８２Ｒｂ及び６８Ｇａであり、１８Ｆが最も臨床的に利用されている；
単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、検出可能な試剤は、放射性トレーサー、たとえば、具体的な用途に応じて、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、２０１Ｔｌ、１３３Ｘｅである。
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、検出可能な試剤は、たとえば、これに限定されないが、ガドリニウム、酸化鉄ナノ粒子及び炭素被覆鉄コバルトナノ粒子でありえ、そのことにより、プラークの検出についてＭＲＩの感度を高める。
造影超音波検査（ＣＥＵＳ：Ｃｏｎｔｒａｓｔ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｕｌｔｒａｓｏｎｏｇｒａｐｈｙ）又は超音波、検出可能な試剤は、少なくとも１つの音響的に活性で気体が充満したマイクロバブルである。超音波は、ヒト疾患のスクリーニング及び早期検出のために広範に用いられている技術である。それは、ＭＲＩ又はシンチグラフィーよりも安価であり、放射線を伴わないので、分子的画像診断法、たとえば放射性核種イメージングよりも安全である。
本発明は、血液脳関門を通過させて目的の分子を輸送する方法をさらに提供する。この方法は、本明細書に記載の抗体又はその断片と連結された分子を対象に投与するステップを含み、抗体又はその断片は血液脳関門を通過する。分子は、前述のカーゴ分子を含む任意の所望の分子でありえ、分子は、融合タンパク質におけるコンジュゲーション又は発現を含むが、これに限定されない任意の好適な方法を使用して、抗体又はその断片に「連結」できる。投与は、任意の好適な方法、たとえば、静脈内（ｉｖ）、皮下（ｓｃ）、及び筋肉内（ｉｍ）投与を含むが、これに限定されない非経口投与によるものでありうる。この方法において、本発明の抗体又はその断片は、ＢＢＢを通過させて目的の分子をその脳標的へと「フェリー」する。
本発明はまた、本明細書に記載の１つ又は複数の単離又は精製抗体又はその断片を含む組成物を包含する。組成物は、上述の単一の抗体若しくは断片を含みうるか、又は抗体若しくは断片の混合物でありうる。さらに、本発明の抗体又は断片の混合物を含む組成物において、抗体は、同じ特異性を有しうるか、又はそれらの特異性において異なりうる。たとえば、いかなる形で限定することも望まないが、組成物は、ＩＧＦ１Ｒ（同じ又は異なるエピトープ）に特異的な抗体又はそれらの断片を含みうる。
組成物はまた、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体を含みうる。希釈剤、賦形剤、又は担体は、当技術分野において知られている任意の好適な希釈剤、賦形剤、又は担体でありえ、組成物中の他の成分、組成物の送達方法と適合性でなければならず、組成物のレシピエントにとって有害ではない。組成物は、任意の好適な形態でありうる。たとえば、組成物は、懸濁液形態、粉末形態（たとえば、これに限定されないが、凍結乾燥又はカプセル化されて）、カプセル又は錠剤形態で提供できる。たとえば、限定することは望まないが、組成物が懸濁液形態で提供されるとき、担体は、水、生理食塩水、好適な緩衝液、又は溶解性及び／又は安定性を改善するための添加剤を含みうる。懸濁液をもたらすための再構成は、抗体又はその断片の生存性を保証するのに好適なｐＨの緩衝液中で実行される。乾燥粉末もまた、安定性を改善する添加剤及び／又はバルク／体積を増加させる担体を含みうる。たとえば、限定することは望まないが、乾燥粉末組成物は、スクロース又はトレハロースを含みうる。具体的で非限定的な一例において、組成物は、抗体又はその断片を対象の胃腸管に送達するように配合されうる。したがって、組成物は、カプセル化、持続放出、又は抗体又はその断片の送達のための他の好適な技術を含みうる。本発明の化合物を含む好適な組成物を調製することは、当業者の能力の範囲内であると考えられる。
本発明はまた、対象のＢＢＢを通過して送達されたカーゴ分子の量を定量する方法を包含し、カーゴ分子は、本明細書に記載の１つ又は複数の単離又は精製抗体又はその断片に連結され、この方法は、
ｃ）対象から脳脊髄液（ＣＳＦ）を回収するステップ、及び
ｄ）標的化プロテオミクス方法を使用して、ＣＳＦにおける１つ又は複数の抗体又はその断片に連結されたカーゴ分子の量を定量するステップ
を含む。
カーゴ分子は、前述のカーゴ分子を含む任意の所望の分子でありうる。単離又は精製抗体又はその断片は、血液脳関門を通過する。分子は、前述のとおり、融合タンパク質におけるコンジュゲーション又は発現を含むが、これに限定されない任意の好適な方法を使用して、前述の抗体又はその断片に「連結」できる。上の方法において、ＣＳＦは、当技術分野において知られている任意の好適な方法を使用して対象から回収される。ステップｂ）における標的化プロテオミクス方法に必要とされるＣＳＦの量は、約１〜１０μｌの間でありうる。たとえば、必要とされるＣＳＦの量は、約１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０μｌ、又はそれらの間の任意の量、又はすぐ上で述べた量により定義される任意の範囲でありうる。カーゴ分子に連結された抗体又は断片は、ＣＳＦの回収前に対象に投与されえただろう。投与から、カーゴ分子に連結された抗体又は断片がＢＢＢを通過して送達されるまでの間の好適な遅延が必要とされうる。遅延は、カーゴ分子に連結された抗体又は断片の投与後少なくとも３０分でありうる。たとえば、いかなる形で限定することも望まないが、遅延は、少なくとも３０分、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、又は５時間でありうる。カーゴ分子に連結された１つ又は複数の抗体又はその断片の量を定量するのに使用される標的化プロテオミクス方法は、当技術分野において知られている任意の好適な方法でありうる。たとえば、限定することは望まないが、標的化プロテオミクス方法は、質量分析法、たとえば、これに限定されないが、同位体標識化内部標準を使用した多重反応モニタリング（ＭＲＭ−ＩＬＩＳ、たとえばＨａｑｑａｎｉら、２０１３を参照のこと）でありうる。ＭＲＭは、生物学的試料中の未標識標的解析物（たとえば、本明細書に記載の抗体又はその断片）の迅速で、感度が高く、特異的な定量を可能にする点で有利である。アッセイのマルチプレクシング能が、抗体又はその断片とカーゴ分子との両方の定量を可能にしうる。
本発明を、以下の実施例においてさらに例証する。しかしながら、これらの実施例は、例示のみを目的としており、いかなる形でも本発明の範囲を限定するのに使用すべきでないことが理解されるべきである。
実施例１：ＩＧＦ１Ｒ組換え断片の精製
ＩＧＦ１Ｒの細胞外ドメインの９３３アミノ酸長の組換え断片（図１に灰色のボックスで示す、配列番号１３のアミノ酸１〜９３３もまた参照のこと）を調製した。断片は、Ｎ末端３０アミノ酸シグナルペプチド、全長アルファサブユニット、フューリン切断部位（ＲＫＲＲ、配列番号１４、アルファ及びベータサブユニットを分離）を、ベータサブユニットの細胞外部分の大部分とともに含んでいた（図１及び図２）。
クローニング。目的のＩＧＦ１Ｒ外部ドメインの配列を、以下のプライマー
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＧＡＧ−３’（フォワード、配列番号１５）
５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＡＡＧＴＴＴＴＣＡＴＡＴＣＣＴＧＴＴＴＴＧＧ−３’（リバース、配列番号１６）
を使用してＰＣＲにより増幅し、Ｐｕｃ１９のＳｍａＩ部位内にサブクローニングした。次に、ＩＧＦ１Ｒ９３３配列を、ｐＣＤＮ４／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にサブクローニングしｐＩＧＦ１Ｒ９３３−Ｈｉｓを作製したが、これは、以前に記述されたとおり、Ｈｉｓ−タグ化外部ドメインの発現を可能にする（Ｓａｍａｎｉら２００４）。
一過性トランスフェクション。ＩＧＦ１Ｒ９３３−Ｈｉｓを発現するレンチウイルス粒子を、以前に詳述されたとおり、パッケージング細胞株２９３ＳＦ−ＰａｃＬＶにおいて生成した（Ｂｒｏｕｓｓａｕら、２００８）。簡潔に述べると、細胞に、ポリエチレンイミンを使用してベクターをトランスフェクトした。１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン及び１０μｇ／ｍｌのｃｕｍａｔｅを含有する新鮮な培地（ＬＣ−ＳＦＭ）を、トランスフェクションの５時間後に細胞に添加し、ＬＶ粒子を含有する上清を、４８〜７２時間後に回収し、１００，０００×ｇ、２時間、４℃、２０％スクロースクッション上での超遠心により濃縮し（Ｇａｉｌｌｅｔ Ｂら ２００７）、１％ ＦＢＳを添加したＬＣ−ＳＦＭ培地中に再懸濁させ、使用まで−７０℃で保存した。
安定発現。安定細胞株２９３ＳＦ−ｃｕｍ２−ＣＲ５−ＩＧＦ１Ｒ−Ｈｉｓを、以前に記述されたプロトコルを使用して、２９３ＳＦ−Ｃｕｍ２細胞株にそれぞれのレンチウイルス粒子を形質導入することにより作製した（Ｇａｉｌｌｅｔ Ｂら ２０１０）。簡潔に述べると、０．５〜１．０×１０５個の２９３ＳＦ−Ｃｕｍ２細胞を、２４ウェルプレートにおいて硫酸デキストランなしの２００μｌのＬＣ−ＳＦＭ培地中に播種した。２００〜５００μＬのＬＶを、８μｇ／ｍｌのポリブレンと混合することにより、ＬＶ懸濁液を調製し、それを３０分間、３７℃でインキュベートした。調製したばかりのＬＶ懸濁液を、播種４時間後の細胞に添加した。２４時間後、硫酸デキストランを添加した５００μＬの培地を細胞に添加した。発現のレベルを高めるため、細胞回復の３〜４日後に、同じプロトコルを使用して６回まで細胞に再形質導入した。最後に、６ウェルプレート及び振盪フラスコにおいて細胞を増殖させた。
大規模タンパク質製造及び精製。最高産生株として同定されたクローンを、振盪又は撹拌フラスコ内で増殖させた。新鮮な培地に１μｇ／ｍｌのｃｕｍａｔｅを添加することにより、タンパク質製造を開始し、その後、３７℃で２４時間、３０℃で４〜８日間インキュベートした。遠心により細胞を除去し、Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過カセット、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、上清を濾過及び濃縮（１０×）した。
ＨｉｓＰｒｅｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造者の指示に従い使用して、ＩＧＦ１Ｒ９３３−Ｈｉｓを精製した。簡潔に述べると、濃縮試料を、Ｈｉｓ−ｐｒｅｐ ＦＦ（１６／１０）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｃａｒｅ）に適用し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール ｐＨ７．５で平衡化及び洗浄し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール ｐＨ７．５で溶出した。０．１Ｍクエン酸ナトリウム ｐＨ４．５〜ｐＨ２．５での段階溶出を、タンパク質を溶出するために使用し、ピーク画分をプールした。５０ｋＤａカットオフ膜又は脱塩カラムを５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−８０、ｐＨ７．２を含む緩衝液とともに使用して、限外濾過により緩衝液交換を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより両方のタンパク質の純度を検証し、それらを使用（以下の実施例を参照のこと）まで−８０℃で保存した（この後に続く実施例を参照のこと）。
実施例２：ラマ免疫化及び血清反応
ＩＧＦ１Ｒの細胞外ドメインを標的とするＶＨＨを単離するため、ラマを、実施例１で得られた組換えＩＧＦ１Ｒ９３３−Ｈｉｓ断片で免疫化した。
１頭の雄ラマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ）を、ＩＧＦ１Ｒ９３３−Ｈｉｓ組換え抗原（実施例１）の皮下腰部注射により免疫化した。第１日に、ＰＢＳ中１ｍｌまで希釈された２００μｇの抗原を、１ｍｌのフロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）とともに注射した。１００μｇのＩＧＦ１Ｒ９３３−Ｈｉｓ抗原プラスフロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）の３回のさらなる注射を第２２、３６、及び５０日に実施した。アジュバントなしの１００μｇの抗原の最終注射を、第７７日に実施した。第１日の最初の注射前に、免疫前の血液を採血し、陰性対照として役立てた。血液（１０〜１５ｍｌ）を、第２９、４３、５７及び８４日に回収した。第８４日の血液を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するようすぐに処理した。血液を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１：１希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ Ｔｕｂｅ（Ａｘｉｓ Ｓｈｉｅｌｄ）を使用して血液からＰＢＭＣを精製した。細胞を計数し、約１×１０７個の細胞のアリコートとして、−８０℃で今後の使用のために保存した。
免疫前及び免疫後の全血清を、ＩＧＦ１Ｒ９３３−Ｈｉｓ抗原に対する特異的反応について、ＥＬＩＳＡにより第５７日に解析した。第８４日のラマ血清を、以前に記述されたとおり分画した（Ｄｏｙｌｅら、２００８）。得られた画分、Ａ１（ＨＣＡｂ）、Ａ２（ＨＣＡｂ）、Ｇ１（ＨＣＡｂ）及びＧ２（ｃＩｇＧ）を、ＩＧＦ１Ｒ９３３−Ｈｉｓ抗原との特異的結合について、ＥＬＩＳＡにより解析した。簡潔に述べると、ＰＢＳ中に希釈された５μｇのＩＧＦ１Ｒ９３３−Ｈｉｓ組換え抗原を、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｎｕｎｃ）において一晩インキュベート（１００μｌ／ウェル、１８時間、４℃）し、プレートをコーティングした。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でプレートをブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄し、免疫前全血清、免疫後全血清（第５７日）、分画血清（第８４日）の連続希釈を適用した。室温での１．５時間のインキュベーション後、ＰＢＳ−Ｔでプレートを洗浄し、その後、ヤギ抗ラマＩｇＧ（ＰＢＳ中１：１，０００）を添加し、プレートを１時間、３７℃でインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔでの洗浄後、ブタ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（ＰＢＳ中１：３，０００）を添加し、プレートを１時間、３７℃でインキュベートした。最終ＰＢＳ−Ｔ洗浄を実施し、その後、１００μ／ウェルＴＭＢ基質（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を添加し、基質を１０分間インキュベートした。１００μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ３ＰＯ４で反応を停止した。吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
実施例３：ライブラリー構築及びＩＧＦ１Ｒ結合性Ｖ Ｈ Ｈの選択
実施例２においてＰＢＭＣから単離されたＲＮＡに基づいて、過免疫化ラマＶＨＨライブラリーを構築した。
基本的に以前に記述されたとおり、ライブラリー構築及びパニングを実施した（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９ａ、２００９ｂ；Ｔａｎｈａら、２００３）。全ＲＮＡを、ＱＩＡａｍｐ ＲＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、免疫化後第８４日に回収されたおよそ１０７個のＰＢＭＣ（実施例２）から単離した。約５μｇの全ＲＮＡを、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したオリゴｄＴプライマーでの第１鎖ｃＤＮＡ合成の鋳型として使用した。以下の３つの可変領域特異的センスプライマー、
ＭＪ１：５’−ＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＳＭＫＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＫＴＣＴＧＧＧＧＧＡ−３’（配列番号１７）
ＭＪ２：５’−ＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡ−３’（配列番号１８）
ＭＪ３：５’−ＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴ−３’（配列番号１９）、
及び２つのアンチセンスＣＨ２特異的プライマー、
ＣＨ２：５’−ＣＧＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＡＣＣＡＧＴＴＧＡ−３’（配列番号２０）
ＣＨ２ｂ３：５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＧＴＣＡＴＣＣＡＣＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＡ−３’（配列番号２１）
の等モルミックスによりｃＤＮＡを増幅した。
簡潔に述べると、ＰＣＲ反応混合物を、以下の成分で５０μｌの総量で準備した。すなわち、１〜３μｌ ｃＤＮＡ、５ｐｍｏｌのＭＪ１〜３プライマー混合物、５ｐｍｏｌのＣＨ２又はＣＨ２ｂ３プライマー、５μｌの１０×反応緩衝液、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）。ＰＣＲプロトコルは、（ｉ）３分間９４℃での初期ステップ、（ｉｉ）続いて１分間９４℃、３０秒間５５℃、３０秒間７２℃の３０サイクル、及び（ｉｉｉ）７分間７２℃の最終伸長ステップからなる。増幅ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルに走らせ、２つの主要なバンドが観察された。すなわち、従来のＩｇＧに対応する約８５０ｂｐのバンド、及びラクダ科動物重鎖抗体のＶＨＨ−ＣＨ２領域に対応するおよそ６００ｂｐの第２のバンドである。より小さなバンドを切断し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、１μｌ（３０ｎｇ）のＤＮＡ鋳型、５ｐｍｏｌのＭＪ７プライマー（５’−ＣＡＴＧＴＧＴＡＧＡＣＴＣＧＣＧ ＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣ−３’ 配列番号２２）及びＭＪ８プライマー（５’−ＣＡＴＧＴＧＴＡＧＡＴＴＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧ−３’ 配列番号２３）の各プライマー、５μｌの１０×反応緩衝液、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、５０μｌの総量で第２のＰＣＲで再増幅した。ＰＣＲプロトコルは、（ｉ）３分間９４℃での初期ステップ、（ｉｉ）続いて３０秒間９４℃、３０秒間５７℃及び１分間７２℃の３０サイクル、並びに（ｉｉｉ）７分間７２℃の最終伸長ステップからなる。３４０ｂｐ〜４２０ｂｐの間の範囲で重鎖抗体のＶＨＨ断片に相当する増幅されたＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、ＳｆｉＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で消化し、同じキットを使用して再精製した。
８０μｇのｐＭＥＤ１ファージミドベクター（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９ｂ）を、ＳｆｉＩで一晩５０℃で消化した。自己連結を最小化するため、２０単位のＸｈｏＩ及びＰｓｔＩ制限酵素を添加して切除断片を切断し、消化反応物をさらに２時間、３７℃でインキュベートした。６０μｇの消化ファージミドＤＮＡを、６μｇの消化（５時間、５０℃でＳｆｉＩ）ＶＨＨ断片（モル比１：１）と、３時間室温で、ＬｉｇａＦａｓｔ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の指示に従い使用して連結した。連結されたプラズミドを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、１００μｌの最終体積で溶出し、以前記述されたとおり、エレクトロコンピテントＴＧ１ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内に、１形質転換反応当たり５μｌの連結ＤＮＡアリコートを使用して形質転換した（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９ｂ）。ライブラリーのサイズを、（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９ｂ）に記載のとおり、５×１０７個と決定した。２０個のクローンをシークエンシングし、すべてのユニークＶＨＨ配列を含んでいた。ライブラリーを含有するＥ．ｃｏｌｉを、２〜３時間、３７℃、２５０ｒｐｍ、２％（ｗ／ｖ）グルコースの存在下で成長させた。次に、細菌を沈殿させ、３５％（ｖ／ｖ）グリセロールを有する２×ＹＴ／Ａｍｐ／Ｇｌｕ（１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び２％（ｗ／ｖ）グルコースを有する２×ＹＴ培地）中に再懸濁させ、−８０℃で小さなアリコートで保存した。
パニング実験を、基本的に（Ａｒｂａｂｉら、１９９７）に記載のとおり実施した。２ミリリットルのライブラリー（２．０×１０１０個の細菌）を氷上で解凍し、２×ＹＴ／Ａｍｐ／Ｇｌｕ中、約２時間、３７℃で成長させた（Ａ６００＝０．４〜０．５）。続いて、Ｅ．ｃｏｌｉを、２０×過量Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に１時間、３７℃で感染させた。次に、培養物を４℃で遠心し、感染細菌沈殿物を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを有する２００ｍｌの２×ＹＴ／Ａｍｐ中に再懸濁させ、３７℃及び２５０ｒｐｍでインキュベートした。培養上清中のファージ粒子を、１／５体積の２０％ ＰＥＧ ８０００／２．５Ｍ ＮａＣｌとともに、氷上で１時間インキュベートし、１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心した。ファージ沈殿物を１．５ｍｌの無菌ＰＢＳ中に再懸濁させ、滴定し、パニングのためのインプットファージとして使用した。パニングラウンド１のために、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートを、１ウェル当たり１０μｇの組換えＩＧＦ１Ｒ９３３−Ｈｉｓで、１００μｌ ＰＢＳ中一晩４℃でコーティングした。ウェルをＰＢＳですすぎ、ＰＢＳプラス１％（ｗ／ｖ）カゼインで２時間、３７℃でブロッキングした。およそ１０１２個のファージを、ブロッキングされたウェルに添加し、２時間、３７℃でインキュベートした。ＰＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０で１０×洗浄後、結合ファージを、０．１Ｍトリエチルアミンで溶出し、中和（５０μｌの１Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）し、指数関数的に成長するＴＧ１ Ｅ．ｃｏｌｉと混合した。溶出ファージの滴定を実施し、感染細菌をＭ１３Ｋ０７で重感染させ、一晩３７℃で成長させた。一晩の培養物からの精製ファージを、パニングの次のラウンドのインプットとして使用した。さらに３ラウンド、パニングを継続した。プレートをコーティングするために使用した組換え抗原の量を、第２、第３及び第４ラウンドのパニングについてそれぞれ７μｇ、５μｇ及び５μｇに減らしたことを除いて、上述と同じプロトコルを使用した。
ラウンド４のパニング後に得られた個々のＴＧ１コロニーは、マイクロタイタープレートをコーティングするのに５μｇ／ｍｌのＩＧＦ１Ｒ９３３−Ｈｉｓ組換え抗原を使用したことを除いて、基本的に別の文献に記載のとおり（Ｄｏｙｌｅら、２００８）、ファージＥＬＩＳＡスクリーニングにかけた。すべての陽性クローンを、ＤＮＡシークエンシングに送った。高いファージＥＬＩＳＡシグナルを与えたユニーククローンを、既知の方法を使用した大規模発現及び精製のために選択した（実施例４を参照のこと）。ＩＧＦ１Ｒ−３と呼ばれるクローンをさらなる研究のため同定した。その配列を下に示す。
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＶＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ （配列番号３）
実施例４：ＩＧＦ１Ｒ−３のヒト化
治療剤のためのＢＢＢ担体として適用されたときのラマ由来ＩＧＦ１Ｒ−３の潜在的免疫原性を回避するため、ラクダ科動物由来ｓｄＡｂを、ＶＨＨにおける「ラクダ科動物」残基の変異により「ヒト化」した。ヒト化のため、ＣＤＲ残基の同定にＫａｂａｔナンバリング（Ｋａｂａｔら、１９９１）を使用したことに留意すべきである。
ラクダ科動物ＶＨＨの３Ｄ構造モデリング。タンパク質構造データバンク（ＰＤＢ）に対するＢＬＡＳＴ検索を使用して、ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨと類似した鋳型構造を同定した。４ＦＨＢ｜Ｄからの追加情報とともに、主要な鋳型として４ＫＲＰ｜Ｂ（ＰＤＢコード｜Ｃｈａｉｎ ＩＤ）に基づき相同性モデリングを使用して、おおよそのＩＧＦ１Ｒ−３の３Ｄ構造を得た。次に、主要な鋳型の構造をＩＧＦ１Ｒ−３配列に変異させることにより、ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ構造を構築した。これは、様々な位置に３５の変異を含んでいた。次に、ＡＭＢＥＲ力場でのエネルギー最小化、及び、最初に緩和されたＣＤＲループから、最終段階になって初めて完全に緩和されたフレームワーク領域の主鎖重原子までの範囲の段階的な拘束の緩和により、ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨモデルを洗練させた。次に、ＶＨＨモデルのＣＤＲ−Ｈ３ループを、ＣＤＲ−Ｈ３領域の二面角をサンプリングした後にエネルギー最小化するモンテカルロ最小化（ＭＣＭ）コンフォメーションサンプリングにより洗練させた。
ラクダ科動物ＣＤＲのためのヒト重鎖フレームワークの選択。ヒト重鎖フレームワークは、ヒト生殖細胞系列データベース（ＶＢＡＳＥ）、他の配列データベース（Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）、及びヒトフレームワークコンセンサス配列に対する標準的な配列相同性比較により選択される。フレームワーク領域のみにおいて（すなわち、ＣＤＲを除いて）最高の相同性を有する一方で、ＣＤＲの長さと一致する配列一致を検索するため、ＢＬＡＳＴ検索を実行した。ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨについて同定された最も近いヒトフレームワークは、ヒトＶＨ−３サブグループに相当した。ヒトＶＨ−３コンセンサス配列に加えて、ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨに最も類似する複数のヒト生殖細胞系列ＶＨ−３フレームワーク配列もまた保持された。ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨフレームワーク配列は、１００％フレームワークヒト化のためコンセンサスヒトＶＨ−３配列に到達するために、１８の変異を必要とした。
復帰変異のためのフレームワーク残基の同定。ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨモデル及びその完全ヒト化対応物を、ヒト度指数（ｈｕｍａｎｎｅｓｓ ｉｎｄｅｘ）、抗原接触傾向指数を推定し、ＣＤＲ、カノニカルな残基、異常なフレームワーク残基、潜在的グリコシル化部位、埋没残基、Ｖｅｒｎｉｅｒゾーン残基（Ｖｅｒｎｉｅｒ ｚｏｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ）、及びＣＤＲとの近接性を推定するために特徴づけた。これらのデータの解析は、抗ＩＧＦ１Ｒ ＶＨＨの複数のヒト化変異体のデザインを示唆し、各変異体は、様々な位置に親ラクダ科動物残基への様々な数の復帰変異を有する。５つのヒト化変異体を、ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ（ＩＧＦ１Ｒ−３＿Ｈ１からＩＧＦ１Ｒ−３＿Ｈ５）についてデザインし、変異体は１０までの復帰変異を含有していた。これらのラクダ科動物復帰変異残基のいくつかは、ＶＨＨドメインコア内に埋没しており、それゆえ免疫反応を誘導しないと予測される。
実施例５：選択されたＶ Ｈ Ｈコンストラクトの発現及び精製
実施例３において同定されたＩＧＦ１Ｒ−３及び実施例４において構築されたヒト化バージョン（合わせて本明細書において「ＶＨＨコンストラクト」と呼ばれる）を、タンパク質発現及び精製のための発現プラズミド内にサブクローニングした。
ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨコンストラクトのＤＮＡを含有するｐファージミドベクターを、ＭｉｎｉＰｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。ＩＧＦ１Ｒ結合性ＶＨＨ ＩＧＦ１Ｒ−３を、ｐＭＥＤ１ファージミドベクターからＰＣＲ増幅し、Ｎ末端ＢｂｓＩ切断部位及びＣ末端にＢａｍＨＩ切断部位を、以下のプライマーを使用して付加した。すなわち、
５’−ＴＡＴＧＡＡＧＡＣＡＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＣＴ−３’（フォワード、配列番号２４）
５’−ＴＴＧＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧ−３’（リバース、配列番号２５）
ＰＣＲ断片及びｐＳＪＦ２Ｈ発現ベクターを、ＢｂｓＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素（ＮＥＢ）で、製造者の指示に従い消化した。消化後、各消化ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ断片を、消化ｐＳＪＦ２Ｈ発現ベクター内に、Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら（２００９ｂ）に記載のものと同様の方法を使用して連結した。次に連結産物を、エレクトロコンピテントＴＧ１ Ｅ．ｃｏｌｉ内に形質転換した。ＬＢアガープレート＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン上でクローンを選択し、ＤＮＡシークエンシングにより検証した。
ヒト化クローンを合成し、上述したのと同様にｐＳＪＦ２Ｈ内に直接クローニングし、続いてＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１内に形質転換し、上述のとおり選択した。
タンパク質発現。すべてのＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨを、ＴＧ１ Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。ＬＢ／ａｍｐ／ｇｌｕ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び１％グルコースを添加したＬＢ培地）中の一晩の培養物を、１：１００希釈で１ＬのＬＢ／ａｍｐ／ｇｌｕ中で継代培養した。０．２ｍＭの最終濃度までのＩＰＴＧの添加により、０．８〜０．９のＯＤ６００でタンパク質発現を誘導した。２２０ｒｐｍで一晩、３７℃で培養物を成長させた。６０００ｒｐｍでの１２分間の遠心により細菌を沈殿させた。沈殿物を３５ｍｌの冷たいＴＥＳ緩衝液（０．２Ｍトリス−Ｃｌ ｐＨ８．０、２０％スクロース、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁させた懸濁液を、氷上でインキュベートし、１０分ごとに１時間、ボルテックスにかけた。次に、４５ｍｌの冷たいＴＥＳ（総体積の１／８体積）を添加し、すぐに１分間及び１５秒間、その後１０分間ごとに１時間、ボルテックスにかけ、周辺質からタンパク質を抽出した。ＶＨＨを含有する得られた上清を、０．２２μｍ膜を通して濾過し、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）緩衝液Ａ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ）中に一晩透析した。ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰ ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を以前に記述されたとおり使用してタンパク質を精製した（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ ２００９ｂ）。溶出タンパク質画分を、以前に記述されたとおり、ＰＢＳに対して透析する前にＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより解析した（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ ２００９ｂ）。精製タンパク質画分をプールし、ＰＢＳ＋３ｍＭ ＥＤＴＡに対して透析し、タンパク質濃度を決定した。
実施例６：抗ＩＧＦ１Ｒ Ｖ Ｈ Ｈ ＩＧＦ１Ｒ−３の生物物理学的特徴づけ
実施例４において発現させ精製した抗ＩＧＦ１Ｒ ＶＨＨ ＩＧＦ１Ｒ−３コンストラクトを、サイズ排除クロマトグラフィー、融解温度解析、及び表面プラズモン共鳴解析を使用して特徴づけた。
サイズ排除クロマトグラフィー：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーを、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析前に任意の生じうる凝集物を除去するために使用した。使用したランニング緩衝液は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．００５％ Ｐ２０を含有する１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４だった。ＳＰＲ解析のために使用した画分の濃度を、２８０ｎｍ波長で吸光度を測定することにより決定した。ＳＥＣ解析は、標準と比較した溶出体積に基づいて、ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ及びそのヒト化変異体Ｈ１、Ｈ２、Ｈ４及びＨ５がモノマー性であることを示唆した（図３Ａ）。
融解温度：ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ及びヒト化コンストラクトの熱安定性を、ＣＤスペクトル測定による融解温度（Ｔｍ）測定を使用して評価した。Ｐｅｌｔｉｅｒ熱電性型温度制御システムを備えるＪａｓｃｏ Ｊ−８１５分光偏光計（Ｊａｓｃｏ、Ｅａｓｔｏｎ、ＭＤ、ＵＳＡ）を、実験を実施するために使用した。１ｍｍのパス長を有するＣＤキュベットを使用した。１８０〜２６０ｎｍの波長にわたって、５０ｎｍ／ｍｉｎの走査速度、４秒のデジタル積分時間（ＤＩＴ）、１ｎｍのバンド長、１ｎｍのデータピッチ、及び１秒の積分時間でスペクトルを記録した。融解温度又はＴｍを測定するため（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、２００６ａ；２００６ｂ）、３０℃から９６℃の温度範囲にわたってＣＤスペクトルを記録した。すべてのＣＤスペクトルを、緩衝液スペクトルに相当するブランクから減算した。測定は、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４中５０μｇ／ｍＬ ＶＨＨの濃度で実施した。熱誘導タンパク質変性を、２１０ｎｍですべての変異体についてモニタリングした。フォールド率（ｆｆ：ｆｒａｃｔｉｏｎ ｆｏｌｄｅｄ）は、以前に記述された以下の式により得られた（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、２００６ａ；２００６ｂ）。
ｆｆ＝（［θ］Ｔ−［θ］Ｕ）／（［θ］Ｆ−［θ］Ｕ）……式Ｉ
式中、［θ］Ｔは、任意の温度のモル楕円率であり、［θ］Ｆは、３０℃で完全にフォールドしたタンパク質のモル楕円率であり、［θ］Ｕは、９０℃での未フォールドタンパク質のモル楕円率である。融解温度（Ｔｍ）は、グラフソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｗｉｎｄｏｗｓ用バージョン４．０２）を使用して、非線形回帰曲線フィッティング（ボルツマンシグモイド方程式（Ｂｏｌｔｚｍａｎ ｓｉｇｍｏｉｄａｌ ｅｑｕａｔｉｏｎ））により、アンフォールディング曲線（フォールド率（ｆｆ）対温度）の中点として得られた。ＶＨＨの融解温度（Ｔｍ）を、変性への急激な遷移に相当する観察された変性曲線と一致する二状態系を仮定して楕円率データに基づいて決定した。Ｔｍ値は、フォールド率（ｆｆ）対温度のシグモイド変性曲線の中点でとった。結果を図３Ｂに示す。ほとんどのヒト化ＶＨＨの融解温度が、ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨと比較して改善していた（より高かった）ことから、生物物理学的特性が改善されたことが示唆される。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）：固定化組換えヒトＩＧＦ１Ｒ（実施例１）に対するモノマー性ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨコンストラクトの結合を、ＢＩＡＣＯＲＥ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＳＰＲにより決定した。およそ３０００共鳴単位（ＲＵ）の組換えヒトＩＧＦ１Ｒを、センサーチップＣＭ５上に固定化した。固定化は、製造者により供給されたアミンカップリングキットを使用して、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸塩中１０μｇ／ｍｌの濃度で実施した。残りの結合部位を、１ＭエタノールアミンｐＨ８．５でブロッキングした。エタノールアミンでブロッキングした表面を、基準表面として使用した。結合研究のため、２５℃で、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．００５％ 界面活性剤Ｐ２０（ポリオキシエチレンソルビタン、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有する１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中で解析を実施した。様々な濃度のＩＧＦ１Ｒ−４ ＶＨＨを、２０μｌ／ｍｉｎの流量で固定化ヒトＩＧＦ１Ｒ又はインスリン受容体（ＩＲ）及び基準表面上に注入した。表面を、１０ｍＭグリシンｐＨ２．０で、２４秒の接触時間で再生した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でデータを解析した。図３Ｃのセンサーグラムは、データが１；１モデルによく適合し、表１に示すＫＤ及び「オフレート」を与えることを示す。これは、ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ及びヒト化変異体が、ヒト及びラットＩＧＦ１Ｒの細胞外ドメインに結合する高親和性単一ドメイン抗体であることを示す。
Figure 2017514456
ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨが、天然リガンドＩＧＦ−１と同じ受容体上のエピトープに結合しないことを実証するために、ＳＰＲ解析をさらに使用した（図３Ｄ）。上述のとおり、実験を準備し、実施し、解析した。新たに固定化されたヒトＩＧＦ１Ｒ表面に対する結合を、２５×ＫＤの濃度のヒトＩＧＦ１の注入と、続く両方が２５×ＫＤの濃度でのＩＧＦ１Ｒ−３の同時注入により、２０μｌ／ｍｉｎの流量、５分の注入時間で研究した。表面を、ランニング緩衝液での洗浄により再生した。データを上述のとおり解析した。天然リガンドＩＧＦ−１は、７０ＲＵに及ぶ飽和度で受容体に結合した。ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨは、ＩＧＦ１Ｒ−ＩＧＦ−１複合体に、予測された約２６５ＲＵ（相対的単位、結合飽和）で結合した。受容体に対するＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ及びＩＧＦ−１の両方の同時結合は、両方が異なるエピトープに結合することを実証する。
ヒトインスリン受容体に結合するＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨの結合交差反応性もまた、ＳＰＲを使用して評価した。上述のとおり、実験を準備し、実施し、解析した。簡潔に述べると、ヒトＩＧＦ１Ｒに加えて、およそ４０００共鳴単位（ＲＵ）の組換えヒトインスリン受容体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を、センサーチップＣＭ５上の分離細胞上に固定化した。新たに固定化されたヒトインスリン受容体及びＩＧＦ１Ｒに対する結合を、ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ（１ｎＭ）、インスリン（１００ｎＭ）及びヒトＩＧＦ１（１００ｎＭ）を、２０μｌ／ｍｉｎの流量及び１分の注入時間で注入することにより解析した。表面を、ランニング緩衝液での洗浄により再生した。ＩＧＦ１Ｒに結合することが観察できた（アスタリスク＊でマークした図３Ｅ）一方で、インスリン受容体表面への結合は観察されず、これは、ＩＧＦ１Ｒ−３がインスリン受容体に結合できないことを示唆する。対照として、２つの受容体の天然リガンドであるＩＧＦ１及びインスリンが、表面上に流され、予測どおり結合が検出された。ＩＧＦ−１は両方の受容体に結合する一方で、インスリン結合は、インスリン受容体についてしか観察できなかった。
実施例７：脳内皮細胞によるＩＧＦ１Ｒ−３の内部移行
ＩＧＦ１Ｒ−３が細胞内に内部移行するかどうかを決定するため、ｓｖＡＲＢＥＣ細胞をＣｙ５−５標識化ＩＧＦ１Ｒ−３とインキュベートした。
ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨをＮＨＳ−Ｃｙ５．５で標識化した。（タンパク質のＮ末端及び／又はリジン側鎖の）一級アミンとＮＨＳエステルとの間の安定アミン結合によって標識化を行った。典型的には、１０％ｖ／ｖの１Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（７５９ｍＭ重炭酸塩、２５８ｍＭ炭酸塩）ｐＨ９．３を、ＰＢＳ（１．０６ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、５．６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４）ｐＨ７．４中に調製された４ｍｇのＶＨＨに添加し、４ｍｇ／ｍＬの最終濃度に調整した。１０ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯ中に溶解されたＮＨＳ−Ｃｙ５．５を、染料のタンパク質に対する２×モル比で添加した。混合物を、１．５ｍＬ微量遠心管中で何度か反転させながら室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、未結合染料及び反応副産物を、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ、７Ｋ ＭＷＣＯ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して濾過し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ５３０分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して測定した。Ｃｙ５．５標識化ＩＧＦ１Ｒ−３又は陽性対照としてのＦＣ５（１ｍｇ／ｍｌ）を、ＳＶ４０不死化ラット脳内皮細胞（ｓｖＡＲＢＥＣ）と４℃（図４、上パネル）で、したがって受動的で非特異的な輸送機序のみが生じることを可能にして、又は３７℃（図４、下パネル）で、能動的機序、たとえば受容体媒介性エンドサイトーシスが生じることを可能にして、インキュベートした。コムギ胚芽凝集素及びＤＡＰＩでの共染色を実施し、細胞表面及び核をそれぞれ視覚化した。蛍光顕微鏡下で細胞を観察し、画像をキャプチャーした。
４℃でインキュベートされた場合、ＩＧＦ１Ｒ−３は、細胞の外部に、コムギ胚芽凝集素で染色された細胞膜と共局在して見出された。対照的に、３７℃でインキュベートされたとき、ＩＧＦ１Ｒ−３は、細胞内部の小胞、おそらくはエンドソームに蓄積し、抗体が能動輸送機序によって細胞内に内部移行したことを示唆する。同様の振舞いが、クラスリン被覆小胞を介したエネルギー依存性エンドサイトーシスにより細胞に侵入することが以前に示されているＦＣ５について観察された（Ａｂｕｌｒｏｂら２００５）。
実施例８：ＩＧＦ１Ｒ−３−ｍＦｃコンストラクトの製造
マウス抗体結晶性断片（Ｆｃ、ｍＦｃ２ｂ）と融合したＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨを含むコンストラクトを調製し、発現させ、単離した。Ｃ末端ＩＧＦ１Ｒ−３−ｍＦｃコンストラクトの配列を図５Ａに示し、分子の概略図を図５Ｂに示す。融合タンパク質（約８０ｋＤａ）はまた、図５Ａの配列に示されていないＮ末端シグナルペプチド（ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣ、配列番号４０）を含んでいた。
ＩＧＦ１Ｒ−３ ｃＤＮＡを、マウスＦｃ２ｂ断片を含有する哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ、２００２）内にクローニングした。得られたベクターのポリプレックスを、１８７．５μｇのｐＴＴ５−ＩＲ５ｍＦｃ２ｂ、５６．２５μｇのｐＴＴ−ＡＫＴｄｄ（プロテインキナーゼＢの活性化変異体）、１８．７５μｇのｐＴＴｏ−ＧＦＰ（トランスフェクション効率をモニタリングするため）、及び１１２．５μｇのサケ精巣ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する２５ｍｌのプラズミドＤＮＡ溶液、並びに、１．１２５ｍｇのＰＥＩｐｒｏ（商標）（ＰｏｌｙＰｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を含有する２５ｍｌのＰＥＩ溶液を混合することにより事前に形成した。両方の溶液が、Ｆ１７培地中で作られた。混合物を、細胞培地への添加の１０分前にインキュベートした。短縮ＥＢＮＡ１タンパク質を安定的に発現するＣＨＯ細胞の４５０ｍｌ培養物（ＣＨＯ−３Ｅ７）をＦ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で成長させ、５０ｍｌのポリプレックスをトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、培養物に１２．５ｍｌの４０％（ｗ／ｖ）トリプトンＮ１（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ）溶液及び１．２５ｍｌの２００ｍＭバルプロ酸溶液を加えた。トランスフェクション８日後に培養物を回収し、遠心により清澄化した。清澄化培地を、５ｍｌのプロテインＡ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填したカラムへのその適用前に、０．２２μｍ膜に通して濾過した。ローディング後、５容量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．１でカラムを洗浄し、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．０で抗体を溶出した。溶出抗体を含有する画分をプールし、ＰＢＳ中で平衡化した脱塩Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃカラム（ＢｉｏＲａｄ）上にローディングすることにより緩衝液交換を実施した。次に、Ｍｉｌｌｅｘ ＧＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターユニット（０．２２μｍ）を通過させることにより、脱塩抗体を無菌濾過し、アリコートにした。
実施例９：インビトロ血液脳関門モデルを通過するＩＧＦ１Ｒ−３及びＩＧＦ１Ｒ−３ｍＦｃの輸送
実施例８のＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ及びコンストラクトが血液脳関門を通過するかどうかを評価するため、下に述べるインビトロアッセイを使用した。実験を要約するフローチャートを図６Ａに示す。
ＳＶ４０不死化成体ラット脳内皮細胞（Ｓｖ−ＡＲＢＥＣ）を、以前に記述されたとおりインビトロ血液脳関門（ＢＢＢ）モデルを作製するために使用した（Ｇａｒｂｅｒｇら、２００５；Ｈａｑｑａｎｉら、２０１２）。Ｓｖ−ＡＲＢＥＣ（細胞８０，０００個／膜）を、１ｍｌの成長培地中の０．１ｍｇ／ｍＬラット尾コラーゲンＩ型被覆組織培養物インサート（細孔サイズ−１μｍ、表面積０．９ｃｍ２、Ｆａｌｃｏｎ）上に播種した。インサートアセンブリの下のチャンバーは、不死化新生仔ラット星状細胞馴化培地を１：１（ｖ／ｖ）比で添加した２ｍｌの成長培地を含有していた。等モル量（５．６μＭ）の正（ＦＣ５）又は負（Ａ２０．１、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ結合性ＶＨＨ、及びＥＧＦＲ結合性ＶＨＨであるＥＧ２）の対照及びＩＧＦ１Ｒ−３を、このラットインビトロＢＢＢモデルを横断するそれらの能力について試験した。ＢＢＢの管腔側への等モル量のｓｄＡｂの曝露後に、試料を１５、３０、及び６０分後に反管腔側から採取した。次に、各試料のｓｄＡｂ含有量を、Ｈａｑｑａｎｉら（２０１２）により記述されたとおり、質量分析（多重反応モニタリング−同位体標識化内部標準、ＭＲＭ−ＩＬＩＳ）により定量した（下の方法の説明を参照のこと）。
見かけ透過係数の決定：定量値を直接プロットでき、又はＰａｐｐ（見かけ透過係数）値を所定の式で決定し（図６Ａ）、プロットできる。Ｐａｐｐ値が、分子についてＢＢＢを横断する能力を決定するために一般に使用される。［Ｑｒ／ｄｔ＝レシーバーコンパートメントにおける累積量対時間、Ａ＝細胞単層の面積、Ｃ０＝投与溶液の初期濃度］。Ｐａｐｐ値は、脳内皮単層を通過する化合物の特異的透過性の尺度である。
結果を図６Ｂ〜図６Ｄに示す。得られた結果は、複数の独立実験から得られた平均Ｐａｐｐ値である。両方の陰性対照が、非常に低いＰａｐｐ値を有し、ＢＢＢモデルを通過するこれらのＶＨＨの非特異的輸送又は傍細胞輸送が最小限であることを示す。ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨは、高いＰａｐｐ値を有し、インビトロＢＢＢモデルを通過する高い輸送率を示す。ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨのＰａｐｐは、陽性対照、すなわちＢＢＢ透過性ＶＨＨ ＦＣ５（国際公開第０２／０５７４４５号）のものよりもおよそ３倍高い。結果は、ＩＧＦ１Ｒ−３がインビトロで脳内皮細胞を通過する促進された細胞間輸送を受け、インビボで類似の特性を有しうることの強い示唆を与える。ヒト化ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ変異体Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３及びＨ４は、ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨと比較して２０〜３０％低減したＰａｐｐ値を有していた一方で、変異体Ｈ５は、ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨと類似のＰａｐｐ値を示した（図６Ｃ）。
ＩＧＦ１Ｒ−３ｍＦｃのＰａｐｐ値（図６Ｄ）は、ＩＧＦ１Ｒ ＶＨＨと比較して有意に低減したが、しかしながら、依然として陽性対照の抗体、ＦＣ５のＰａｐｐ値よりも２．５倍高かった（図６Ｄ）。データは、ＩＧＦ１Ｒ−３のＦｃに対する連結配位又は二価形式が、そのＢＢＢ通過能力をモノマー性ＩＧＦ１Ｒ−３と比較して低減することを示唆する。カーゴ分子に連結されたＩＧＦ１Ｒ−５又はヒト化バージョンを含むコンストラクト（ＭＷ 約１１０ｋＤａ又は１８０ｋＤａ）もまた、ＢＢＢを通過してフェリーされると示されたことに留意する価値はある（データは示さず）。
ＭＲＭ−ＩＬＩＳ法を使用したＶＨＨの絶対量測定。本方法は、すべてＨａｑｑａｎｉら（２０１２）に記載されたとおりである。簡潔に述べると、ＶＨＨについてＳＲＭ（選択反応モニタリング、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）としても知られている）アッセイを開発するため、各ＶＨＨをまず、データ依存性取得を使用してナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより解析し、すべてのイオン性ペプチドを同定した。各ペプチドについて、３〜５個の最も強力な断片イオンを選択した。これらの断片を消化物のアトモル量（約１００〜３００ａｍｏｌ）でモニタリングするための初期ＳＲＭアッセイを開発した。低い量での再現性のある強度比を示した（すなわち、より高い量と比較してピアソンｒ２≧０．９５を有していた）断片を、安定的であると考え、最終ＳＲＭアッセイのために選択した。アッセイのさらなる最適化のため、近接したｍ／ｚ（質量対電荷比）及び溶出時間を有するペプチドを選択しないよう注意しながら、各ペプチドの溶出時間もまた含めた。
細胞培地又は体液（血清又は脳脊髄液（ＣＳＦ））におけるＶＨＨの典型的なマルチプレックスＳＲＭ解析は、既知の量のＩＬＩＳ（０．１〜１０ｎＭ）を添加し、その後、１００〜４００ｎｇのＣＳＦ又は培養された培地タンパク質（０．３〜１μｌ）又は約５０〜１００ｎｇの血清タンパク質（１〜３ナノリットル）をナノＬＣ−ＭＳシステム内に注入することを伴った。各標的ペプチドイオンの前駆ｍ／ｚが、標的のための特定の溶出時間においてイオントラップ内で選択され（残りの無関係なイオンは破棄された）、衝突誘起解離（ＣＩＤ）フラグメンテーション、及び検出器によるモニタリングのためのイオントラップ内の所望の断片イオンのみの選択が続いた。定量解析のため、ＬＴＱ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により生成された生ファイルを、標準質量分析データ形式ｍｚＸＭＬに変換し、ＭａｔｃｈＲｘソフトウェアの修正バージョンである、Ｑ−ＭＲＭ（定量的−ＭＲＭ、Ｈａｑｑａｎｉら ２０１２を参照のこと）と呼ばれるインハウスのソフトウェアを使用して強度を抽出した。各ＶＨＨについて、抽出イオンクロマトグラフを、全溶出時間にわたる０．２５Ｄａ以内の断片ｍ／ｚの合計強度からなるその断片イオンのそれぞれについて得た。各断片について最終強度値を得るため、０．５分以内の予測保持時間のすべての強度を合計した。ＶＨＨを、そのペプチドのうちの少なくとも１つの断片が予測強度比を示す、すなわち、最終強度値がその対応する純ＶＨＨの最終強度値と比較して強いピアソン相関ｒ≧０．９５及びｐ＜０．０５を示す場合に、試料において検出可能なものとして定義した。
ＶＨＨの混合物を含有する試料（培地、血清、ＣＳＦ）を、以前に記述されたとおり、還元し、アルキル化し、トリプシン消化した。（Ｈａｑｑａｎｉら、２０１２；Ｇｅｒｇｏｖら、２００３）消化物（トリプシンペプチド）を酢酸で酸性化させ（５％最終濃度）、ＬＴＱ ＸＬ ＥＴＤ又はＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＥＴＤ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）と組み合わせた逆相ナノＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）上で解析した。試料の所望のアリコートを注入して３００μｍ Ｉ．Ｄ．×０．５ｍｍ ３μｍ ＰｅｐＭａｐｓ Ｃ１８トラップ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）上に充填し、次に１００μｍ Ｉ．Ｄ．×１０ｃｍ １．７μｍ ＢＥＨ１３０Ｃ１８ ナノＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ）上に、１分間で０％〜２０％、１６分間で２０％〜４６％、１分間で４６％〜９５％アセトニトリル（０．１％ギ酸中）の勾配を使用して、４００ｎＬ／ｍｉｎの流量で溶出した。溶出ペプチドを、ペプチドイオンのフラグメンテーションのためのＣＩＤを使用したＭＳ／ＭＳ及びＳＲＭ解析のため、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）により質量分析計内へとイオン化した。ヘリウムを衝突ガスとして、３５％の標準化衝突エネルギー及び３０ｍｓの活性化時間でＣＩＤを実施した。線形イオントラップ内へのイオン注入時間を、６×１０３の自動利得制御（ＡＧＣ）標的値及び２００ｍｓの最大蓄積時間を使用して機器により調整した。
マルチプレックスアッセイにおいて各ＶＨＨの検出及び定量のために使用されたＶＨＨ特異的ペプチドを表２に示す。
Figure 2017514456
実施例１０：ＣＳＦ及び血漿におけるＩＧＦ１Ｒ−３−ｍＦｃレベル
ＩＧＦ１Ｒ−３−ｍＦｃ（実施例８）が脳内へと、具体的には脳脊髄液（ＣＳＦ）中へと透過可能かどうかを決定するとともに、ＣＳＦ及び血漿におけるその存在を定量するために、インビボアッセイを実施した。
動物をポリプロピレンケージに単独で入れ、餌及び水を自由に与えた。１２時間の明／暗サイクル、２４℃の温度及び５０±５％の相対湿度で実験を行った。すべての動物処置が、ＮＲＣ動物ケア委員会（ＮＲＣ’ｓ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により認可され、カナダ動物ケア評議会（ｔｈｅ Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）ガイドラインを順守していた。
８〜１０週齢の雄ウィスターラット（体重範囲、２３０〜２５０ｇ）を使用した。ＣＳＦ試料採取のため、動物の頸部及び頭部領域の毛を剃り、次に動物をプレキシグラスチャンバー内に入れ、３％イソフルランで適度に麻酔した。基本的にＮｉｒｏｇｉら（２００９）に記載されたとおり、ＣＳＦを回収した。麻酔ラットを、金属枠器具（Ｖｉｎｉｃｉｏ Ｇｒａｎａｄｏｓ−Ｓｏｔｏ博士により寛大にも提供された；ＣＩＮＶＥＳＴＡＶ、Ｍｅｘｉｃｏ）に入れ、イヤーバーを使用して固定した。動物の頭部の位置を、およそ４５°下向きに維持した。後頭***と脊椎の環椎との間に菱脳が現れる押圧可能な表面を、エタノール（７５％）を浸した綿でこすることにより視覚可能にした。切開を伴わないＣＳＦ回収のため、１００ｃｃインスリンシリンジと接続された長さ１０ｃｍのＰＥ−１０チュービングで覆われた２７Ｇニードル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）を、水平に大槽の中心に挿入した。皮膚の断裂及び環椎後頭膜の断裂ゆえに、ニードルパスに沿った２つの抵抗点（クリック）を容易に感じることができる。ニードルが第２の抵抗点を通過したとき、ＣＳＦ（４０〜１００μＬ）を、インスリンシリンジの穏やかな吸引を適用することによりニードルを通じて回収した。ＣＳＦ試料採取後に、後開胸の心穿刺により対応する血液を回収し、バキュテナーチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）内に凝固活性化剤及びゲルとともに入れ、次に３，０００×ｇで１５分間遠心した。マイクロピペットを使用して血清を除去し、さらなる解析まで−８０℃で急速冷凍した。
６ｍｇ／ｋｇのＩＧＦ１Ｒ−３ｍＦｃ又はＡ２０．１ｍＦｃの静脈内注射２４時間後に、血清及びＣＳＦを回収した。血清及びＣＳＦ試料を、実施例７に記載のとおり、質量分析及びナノＬＣ−ＳＲＭベース定量により解析した。
ＣＳＦ回収は繊細な処置であり、その間、ＣＳＦは容易に血液で汚染されうる。ＶＨＨの量は、血中よりもＣＳＦにおいてはるかに小さい（＜０．１％）と予測されるので、血液でのわずかな汚染でさえも、個別のＣＳＦ試料の値を深刻に損ないうる。したがって、血液汚染ＣＳＦ試料のためのストリンジェントな除外基準を開発することが必要だった。血液−ＣＳＦアルブミン比を評価するため、血漿及びＣＳＦ中のアルブミンレベルを定量するためのナノＬＣ−ＳＲＭ法を開発した。アルブミンペプチドＡＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＡＡＲ（配列番号３８）を、マルチプレックスアッセイにおいて他のペプチドピークへの干渉を最小にするため、その固有の保持時間及びｍ／ｚ値に基づいて選択した（Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ）。ＳＲＭを上述のとおり使用して、ＣＳＦ及び血漿試料の両方において、ペプチドの強度を定量した。アルブミン比を以下のとおり各ラットについて算出した。
アルブミン比＝１ｎＬの解析された血漿当たりの強度／１ｎＬの解析されたＣＳＦ当たりの強度
１５００以下の比が、血液汚染と考えられた。
結果を図７に示す。図は、ＩＧＦ１Ｒ−３ＦｃのＣＳＦレベルが、対照抗体Ａ２０．１Ｆｃの０．０４％と比較して、血清レベルの０．５％であることを示す。陰性対照Ａ２０．１Ｆｃ（７５ｋＤ）は、類似のサイズの分子について文献に記載のものと類似した２４時間での血清／ＣＳＦ比を示す。安定状態でのアルブミン（６０ｋＤ）について典型的な血清／ＣＳＦ（腰部）比が０．１％である一方で、ＩｇＧについて血清／ＣＳＦ比は、０．０７である（Ｓｈｅｎら、２００４；Ｌｉｎ、２００８）。２４時間でのＩＧＦ１Ｒ３−Ｆｃ血清／ＣＳＦ比は、Ａ２０．１ｍＦｃのそれよりも１１倍高い。
約１１０ｋＤａの追加のコンストラクトもまた、ＢＢＢを通過してＩＧＦ１Ｒ−３又はヒト化バージョンによりフェリーされると示された（データは示さず）。
実施例１１：ガラニンへのＩＧＦ１Ｒ−３のコンジュゲーション
ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨがインビボで血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し、それ自体ではＢＢＢを通過できない分子を、ＢＢＢを通過させて「フェリー」できるかどうかを決定するため、神経ペプチドガラニンを、ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨに化学的にコンジュゲートし、全身投与した。ガラニンは、脳組織において発現するＧａｌＲ１及びＧａｌＲ２に結合することにより鎮痛をもたらす向神経活性ペプチドである。末梢的に与えられた場合、ガラニンは鎮痛効果を有さない。なぜなら、それ自体はＢＢＢを通過できないからである（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、２０１１）。
ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨを、システアミド修飾Ｃ末端を有するラットガラニン（Ｇａｌ）断片（Ｂｉｏｍａｔｉｃ）（ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＨＡＩＤＮＨＲＳＦＳＤＫＨＧＬＴ−システアミド、配列番号３９）にコンジュゲートした。コンジュゲーションのスキームを図８Ａに示す。
簡潔に述べると、０．５×ＰＢＳ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ中の［２ｍｇ／ｍｌ］での５ｍｇのＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ（実施例４）を、４３６．４μｌの２．５ｍｇ／ｍｌスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）（７．５×過剰モル比）と混合した。次に、窒素ガスで混合物を洗い流し、３０分間室温（ＲＴ）でインキュベートし、スルホ−ＳＭＣＣのＮＨＳエステルアームをＶＨＨ上のアミンと反応させた。続いて、１０ｍｌの７Ｋ Ｚｅｂａカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、未反応スルホ−ＳＭＣＣをマレイミド−活性化ＩＧＦ１Ｒ−５ ＶＨＨから除去した。試料ローディングの前に、カラムを５ｍｌ ＰＢＳで３回洗浄し、１０００×ｇで２分間回転させた。試料ローディング後に、カラムに２００μｌのＰＢＳを補給し、２分間、１０００×ｇで回転させた。ＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃコンストラクトについて、５ｍｇを約６８μｌのスルホ−ＳＭＣＣ（６．５×過剰モル比）と、上述と同様に反応させた。
別々に並行して、システアミド修飾Ｃ末端ガラニン（Ｇａｌ−ｃｙａ）を、１０ｍｇの凍結乾燥粉末を１０ｍｌのエンドトキシンフリー水中に溶解させることにより調製し、１ｍｇ／ｍｌストックを作った（ガラニン−ｃｙａ粉末は、精製中のジスルフィド架橋形成を防止するため、少量のＤＴＴを有する）。最後に、１００μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加した（５ｍＭ最終濃度）。
精製マレイミド活性化ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ（２．６ｍｌ）を、０．５×ＰＢＳ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡで５ｍｌまで希釈し、次に、ボルテックスにかけながら５ｍｌのＧａｌ−ｃｙａを添加した。試料を窒素で洗い流し、密封し、一晩４℃でインキュベートした。翌日、Ａｍｉｃｏｎ−１５ １０Ｋ及び３０Ｋカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をそれぞれ使用して、未反応のＧａｌ−ｃｙａを除去した。試料をカラムに添加し、４０００×ｇで７分間、体積が５ｍｌに減少するまで回転させた。５ｍｌの０．５×ＰＢＳ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡを、カラムのインサート中の残りの５ｍｌ試料に添加し、試料が４ｍｌに減少するまで再び回転させた。次に、コンジュゲートされた試料を、１０ｍｌ ７Ｋ Ｚｅｂａカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）に添加し、上述のとおり調製し、次に２分間、１０００ｘｇで回転させた。
次に、コンジュゲートされたＩＧＦ１Ｒ−３−Ｇａｌ試料を、１６％又は１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ非還元ゲル上に走らせ、銀染色し、コンジュゲーション後の分子量サイズの変化を確認した。１つのＶＨＨ当たり約１〜２個のガラニン分子を達成するため、反応を滴定した。結果は、ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ上へのガラニンのロードを確認する（図８Ｂを参照のこと）。
エンドトキシン除去及びエンドトキシンレベルの決定：Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）セルロース膜スピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、エンドトキシンを除去した。第１に、１５ｍｌのＶＨＨ調製物を、４０００×ｇでの１０分間の遠心によりＡｍｉｃｏｎ−１５〜５０Ｋ ＭＷＣＯカラムを通過させた。溶出物を回収した。次に、この溶出物を、Ａｍｉｃｏｎ−１５〜１０Ｋ ＭＷＣＯカラムに添加し、４０００×ｇで７〜１０分間回転させ、１５ｍｌから７．５ｍｌへの上清体積の低減をもたらした。カラム内の上清体積を、ＰＢＳを添加することにより１５ｍｌに戻すよう調整した。カラムを上述のとおり再び回転させた。上清を回収し、１０〜０．１ＥＵ／ｍｌの感度範囲を有するカートリッジを使用したＥｎｄｏＳａｆｅ−ＰＴＳシステム（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）でエンドトキシンレベルを測定した。２５μｌの試料を、カートリッジ上の４つのウェルのそれぞれにロードし、必要に応じて希釈した。１ｍｇ当たりＥＵ＜１を有する試料のみを、動物研究に使用した。
実施例１２：ハーグリーヴズモデルを使用したＩＧＦ１Ｒ−３−Ｇａｌの輸送
ＩＧＦ１Ｒ−３−Ｇａｌ（実施例１１）が血液脳関門を通過するかどうかを評価するため、インビボアッセイを、国際特許公開第２０１１／１２７５８０号に以前に記載のとおり利用した。
Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら（１９８８）に記載のものと類似した炎症性痛覚過敏のラットモデルを使用した。動物をポリプロピレンケージ１つ当たり３匹の群で入れ（ハーグリーヴズモデル）、餌及び水を自由に与えた。１２時間の明／暗サイクル、２４℃の温度及び５０±５％の相対湿度で実験を行った。すべての動物処置が、ＮＲＣ動物ケア委員会により認可され、カナダ動物ケア評議会ガイドラインを順守していた。
このモデルにおいて、６〜８週齢の雄ウィスターラット（体重範囲２３０〜２５０ｇ）に、低体積（３０ゲージニードルで１００μｌ）の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、油：生理食塩水１：１エマルション中に懸濁された熱殺傷Ｍ．チュバーキュローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｓｉｇｍａ））を、右後足に短いイソフルラン麻酔（３％）下で注射した。ＣＦＡは、侵害受容体を活性化し、慢性的疼痛状態及び痛覚過敏（有害な熱に対する高められた感受性）を創出する炎症促進性物質の放出を誘導する。足退避潜時を、足刺激に対する足底無痛測定器具（ＩＩＴＣ Ｍｏｄｅｌ ＃ ３３６ＴＧ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）を使用した、両後足（炎症性及び非炎症性対照足）の足底表面における放射刺激の適用により測定した。動物がその足をなめるか又は動かすことにより反応するのにかかった時間を、陽性反応として解釈した（足退避潜時）。ＣＦＡ投与前に、光強度灯を、ベースライン足退避潜時を１７〜２０秒の間で両後足に誘発するよう調整した。２０秒以内に退避応答が生じない場合、光線を自動的に消灯して組織損傷を回避し、その足には最大スコアが割り当てられる。
ＣＦＡ注射の２日後、化合物の投与前に、動物を操作し、ストレスを低減し、偽陽性反応を防止する目的で、少なくとも６０分間無痛測定器具に順化させた。疼痛の発症（熱痛覚過敏）を検証するため、両足でベースラインを測定した。非炎症性の足を、注射された足に対する対照として使用した。「炎症性の足」について６秒超及び「正常な足」について１７秒未満の足退避潜時を有する動物を、実験から除外した。
ＩＦＧ１Ｒ−３−Ｇａｌが血液脳関門を通過して送達され、脳実質において標的受容体（ＧａｌＲ１及び２）に結合できるかどうかを決定するため、ラットに、ＩＧＦ１Ｒ−３−ガラニン（２．９３ｍｇ／ｋｇ又は５．８５ｍｇ／ｋｇ、エンドトキシンＥＵ＜１）又は対照化合物の１回の尾静脈注射をＣＦＡ注射３日後に投与した。各後足（炎症性及び非炎症性）について、１５分ごとに３時間、足退避潜時（ＰＷＬ）を試験した。足退避潜時の増加は、鎮痛の誘導の成功を示し、これは、ＩＧＦ１Ｒ−３による脳実質内へのガラニンの送達の成功によってしか得られない。ガラニンが鎮痛を誘導できるのは、脳実質内に存在するときだけであり、それ自体では無傷ＢＢＢを通過できない（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、２０１１）。
足退避潜時（ＰＷＬ、秒）対時間（分又は時間）の時間経過として結果を解析した（図９Ａ）。図９Ｂは、同じ結果を曲線下面積（ＡＵＣ）として示し、それを最大可能効果の％（％ＭＰＥ）と比較する。図９Ｃは、同じ用量のＩＧＦ１Ｒ３−ガラニンの反復注射が、第１の注射からの鎮痛反応が終わった１時間後に、第１の注射と同様の鎮痛反応をもたらすことを示す。
結果は、静脈内投与されたガラニンが、ＰＢＳと比較して疼痛を低減しないことを示す。対照的に、ＦＣ５−Ｇａｌ又はＩＧＦ１Ｒ３−Ｇａｌの単回注射は、測定可能な鎮痛効果をもたらし、このＶＨＨが、ＢＢＢを通過させてガラニンを「フェリー」し、脳実質においてＧａｌＲ１及び／又は２に結合することで鎮痛効果をもたらすことを示唆する。ＩＧＦ１Ｒ−３−Ｇａｌ効果は用量依存的であり、ＦＣ５−Ｇａｌにより誘導されるものよりも有意に顕著であり、ＩＧＦ１Ｒ受容体が、推定されるＦＣ５受容体よりも高いＢＢＢ輸送率を有することを示唆する。反復投薬は、類似の鎮痛反応をもたらし、担体受容体ＩＧＦ１Ｒの迅速な「回転」（能力）を示唆する。結果は、ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨが、受容体媒介性トランスサイトーシス経路を使用し、少なくとも３０００Ｄａの分子を、ＢＢＢを通過させて「フェリー」できることを実証する（抗体−ペプチドコンジュゲートの合計ＭＷは、約１８ｋＤａである）。能動的な受容体媒介性輸送が必要とされる。なぜなら、ＢＢＢは、０．５ｋＤａを超えるすべての親水性分子の通過を妨げると知られているからである。
実施例１３：ＩＧＦ１Ｒ−３−ｍＦｃの免疫検出
末梢投与後にＣＳＦにおいて検出された高レベルのＩＧＦ１Ｒ−３Ｆｃが、少なくとも部分的に実質細胞外空間に由来すること、言い換えれば、無傷コンストラクトがＢＢＢを横断したことを確認するため、ラット脳におけるＩＧＦ１Ｒ−３−ｍＦｃの免疫検出を実施した。
簡潔に述べると、ＩＧＦ１Ｒ−３−ｍＦｃ又はＡ２０．１ｍＦｃのいずれかの６ｍｇ／ｋｇ尾静脈注射２４時間後のＰＢＳでの動物還流直後に、動物の脳を回収した。脳を凍結し、ｃｒｙｏｔｏｍｅ上で１２μｍ切片に切断した。１０分間、ＲＴ、１００％メタノール中で切片を固定し、ＰＢＳ中で３×洗浄し、１時間、１×ＰＢＳ中の０．３％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）中でインキュベートした。１×ＰＢＳ中の０．３％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する５％ＮＧＳ中のヤギ抗ｍ−ＩｇＧ Ｆｃｙ−ｃｙ３（Ｃａｔ＃１１５−１６５−０７１、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅａｓｅａｒｃｈ、ロット＃１０６３６０）１：２００を、一晩４℃で適用した。切片を１×ＰＢＳで３回洗浄し、次に、１×ＰＢＳ中の脈管構造染色レクチンＲＣＡＩ（Ｃａｔ＃ ＦＬ−１０８１、Ｖｅｃｔｏｒ）１：５００を１０分間添加した。１×ＰＢＳで３回洗浄後、切片をＤａｋｏ蛍光封入剤（Ｃａｔ＃Ｓ３０２３、Ｄａｋｏ）中においてカバースリップで被覆し、２μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ（Ｃａｔ＃Ｈ３５７０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、核を染色した。１０×及び６０×対物レンズ及び表３に示すチャンネルを使用して、Ｏｌｙｍｐｕｓ １×８１蛍光顕微鏡で画像をキャプチャーした。
Figure 2017514456
結果を図１０に示す。マウスＦｃの免疫検出は、異なる脳領域に渡る脳血管の強力な染色を、血管周囲の脳実質の染色とともに示したが、これは、ＩＧＦ１Ｒ−３Ｆｃが脳血管に蓄積し、脳実質の周囲へとＢＢＢを通過していることを示す。対照的に、ｍＦｃ特異的染色は、Ａ２０．１ｍＦｃ注射動物において検出できなかった。結果は、ＩＧＦ１Ｒ−３ＦｃのＣＳＦレベルの増加は、コンストラクトのＢＢＢ通過の指標であるという主張を支持する。これは、ＩＧＦ１Ｒ−３に連結されたガラニンが実質ＧａｌＲ１及びＧａｌＲ２受容体上の薬理学的反応（鎮痛）を誘導したという観察によりさらに強力に支持される。合わせて、インビトロＢＢＢ通過結果、インビボ薬物動態学的（血清／ＣＳＦレベル）及び薬力学的（ハーグリーヴズモデル）結果は、ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨが、そのＩＧＦ１Ｒエピトープへの結合により誘発される能動的受容体媒介性トランスサイトーシスを介して、他のＶＨＨよりもかなり高い割合で無傷ＢＢＢを通過すること、及び、それがさもなければ血液脳関門非透過性である一定範囲（１〜８０ｋＤ）の分子を「フェリー」できることを実証する。
実施例１４：ＩＧＦ１Ｒの「生理」機能に対するＩＧＦ１Ｒ−３効果
安全性の観点から、本発明の抗体が、受容体媒介性トランスサイトーシスを介した薬物の送達のために受容体に結合するときに、その受容体の生理機能、すなわち、その天然リガンドであるＩＧＦ−１により誘導されるシグナル伝達を妨げないと示すことが重要である。この観点から、ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ又はＩＧＦ１Ｒ−３−ｍＦｃが、ＩＧＦ１Ｒ又は関連インスリン受容体（ＩＲ）を介してそれらの天然リガンドにより誘導される生理的シグナル伝達を妨げないと実証することが重要である。
ＩＧＦ１Ｒ−３が、ＩＧＦ１Ｒ又はＩＲのみを介してシグナル伝達を誘導するかどうか、又は受容体の天然リガンドであるＩＧＦ−１又はインスリンにより刺激されるシグナル伝達を妨げるかどうかを決定するため、それらが受容体自体又は受容体に刺激される下流キナーゼであるＡｋｔのリン酸化に与える効果を、ＳＶ−ＡＲＢＥＣ細胞において決定した。
当技術分野において知られている方法に従い、ＳＶ−ＡＲＢＥＣを、ペプトン、Ｄ−グルコース、ＢＭＥアミノ酸、ＢＭＥビタミン、抗生／抗真菌性溶液及び胎仔ウシ血清を添加したＭ１９９基本培地中でコンフルエンスまで成長させた。細胞を、処置１８時間前に無血清培地へと切り替えた。ＩＧＦ１Ｒ−３ ＶＨＨ又はＩＧＦ１Ｒ−３−Ｆｃ融合物（１００ｎＭ又は５００ｎＭ）を、２００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１、１０μｇ／ｍｌのインスリン又はビヒクルのいずれかの添加の１時間前に細胞に添加した。細胞を、リガンド又はビヒクルと２０分間インキュベートし、次に、ハンクス平衡塩類溶液中で２回洗浄した。続いて、１％ Ｔｒｉｔｏｎ−ｘ １００及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を添加した１×ＲＩＰＡ緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して細胞を溶解させた。細胞に、水浴超音波処理器において２×２０秒バーストを与え、１４，０００ｒｐｍでの１０分間の遠心により溶解物を清澄化した。ＤＣタンパク質アッセイシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用してタンパク質濃度を決定した。等μｇのタンパク質試料を、１２５Ｖで４〜２０％勾配ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に拡散させ、ＰＶＤＦ膜に転写した。ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ ４７３）を、この標的に対する一次抗体の１：１０００希釈液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中での一晩のインキュベーションにより検出し、その後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体とともに１時間インキュベートし、次に、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ試薬と反応させ、オートラジオグラフィーフィルム上に視覚化した。Ｕｎ−Ｓｃａｎ−Ｉｔソフトウェア（Ｓｉｌｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用して、デンシトメトリー値を決定した。
結果を図１１に示す。Ａｋｔリン酸化のウエスタンブロット解析は、ＩＧＦ１Ｒ−３が、１０μｇ／ｍｌのインスリン又は２００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１により誘導されるＡｋｔリン酸化を、１００ｎＭのＩＧＦ１Ｒ−３若しくはＩＧＦ１Ｒ−３−ｍＦｃ又は５００ｎＭのＩＧＦ１Ｒ−３−ｍＦｃと同時適用されたときに阻害しなかったことを示した。また、ＶＨＨ又はＦｃ融合物のいずれも、Ａｋｔシグナル伝達をそれ自体では誘導しなかった（図１１Ａ、図１１Ｂ及び図１１Ｃ、「−５」と表示）。結果は、Ｆｃ融合形式での二価ディスプレイにおいてさえも、ＩＧＦ１Ｒ−３が、受容体二量体化及び下流シグナル伝達を誘発せず、したがって、天然リガンドの存在下での受容体機能を妨げないことを実証する。ＩＧＦ１Ｒ−３のこの特徴（「サイレントバインダー」）は、治療剤のＢＢＢ担体としてのその適用にとって重要である。なぜなら、それは好ましい安全性プロファイルを付与するからである。
本明細書に記載の実施形態及び実施例は例示的であり、特許請求の範囲に記載の発明の範囲を限定することを意図していない。代替物、改変物及び均等物を含む上述の実施形態の変形形態が、特許請求の範囲により包含されると本発明者らにより意図されている。さらに、論じられた特徴の組合せが、本発明の解決策に必要であるとは限らない。
参考文献
本明細書において、また本願全体を通じて参照されたすべての特許、特許出願及び公開が、ここに参照により組み込まれる。
All patents, patent applications andpublications referred to herein and throughout the application are herebyincorporated by reference.
Abbott NJ (2013) Blood-brain barrierstructure and function and the challenges for CNS drug delivery. J InheritMetab Dis. 36(3):437-49.
Abulrob A, Sprong H, Van Bergen enHenegouwen P, Stanimirovic D (2005) The blood-brain barrier transmigratingsingle domain antibody: mechanisms of transport and antigenic epitopes in humanbrain endothelial cells. J Neurochem. 2005 Nov;95(4):1201-14.
Arbabi-Ghahroudi, M. Desmyter A,Wyns L, Hamers R., and Muyldermans S (1997) Selection and identificationof single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies, FEBSLett 414, 521-526
Arbabi-Ghahroudi, M., To, R.,Gaudette, N., Hirama, T., Ding, W., MacKenzie, R., and Tanha, J. (2009a)Protein Eng. Des. Sel. 22, 59-66.
Arbabi-Ghahroudi, M., MacKenzie, R.,and Tanha, J. (2009b) Methods Mol. Biol. 525, 187-216.
Bell, A., Wang, Z.J.,Arbabi-Ghahroudi, M., Chang, T.A., Durocher, Y., Trojahn, U., Baardsnes, J.,Jaramillo, M.L., Li, S., Baral, T.N., O'Connor-McCourt, M., Mackenzie, R., andZhang, J. (2010) Cancer Lett. 289, 81-90.
Broussau, s., Jabbour, N., Lachapelle,G., Durocher, Y., Tom, R., Transfiguracion, J., Gilbert, R. and Massie, B.(2008) Mol Ther 16, 500-507.
Chothia, C., and Lesk, A.M. (1987) J.Mol. Biol. 196, 901-917.
Davies J., and L. Riechmann, Affinityimprovement of single antibody VH domains: residues in all three hypervariableregions affect antigen binding. Immunotechnology 2 (1996) 169-179
De Kruif, J., and Logtenberg, T.(1996) J. Biol. Chem. 271, 7630-7634.
Demeule, M.; Currie, J. C.; Bertrand,Y.; Che, C.; Nguyen, T.; Regina, A.; Gabathuler, R.; Castaigne, J. P.;Beliveau, R. Involvement of the low-density lipoprotein receptor-relatedprotein in the transcytosis of the brain delivery vector angiopep-2, J.Neurochem. 2008, 106, 1534-1544.
Dumoulin, M., Conrath, K., VanMeirhaighe, A., Meersman, F., Heremans, K., Frenken, L.G., Muyldermans, S.,Wyns, L., and Matagne, A. (2002) Protein Sci 11, 500-515.
Durocher, Y., S. Perret, et al. (2002). "High-leveland high-throughput recombinant protein production by transient transfection ofsuspension-growing human 293-EBNA1 cells." Nucleic Acids Res 30(2): E9.
Doyle, P.J., Arbabi-Ghahroudi, M., Gaudette,N., Furzer, G., Savard, M.E., Gleddie, S., McLean, M.D., MacKenzie, C.R., andHall, J.C. (2008) Mol. Immunol. 45, 3703-3713.
Eisenberg, D., Schwarz, E., Komaromy,M., and Wall, R. (1984) J. Mol. Biol. 179, 125-142
Erdlenbruch B, Alipour M, Fricker G,Miller DS, Kugler W, Eibl H, Lakomek M (2003) Alkylglycerol opening of theblood-brain barrier to small and large fluorescence markers in normal and C6glioma-bearing rats and isolated rat brain capillaries. Br J Pharmacol.140(7):1201-10.
Fenner, L., Widmer, A.F., Goy, G.,Rudin, S., and Frei, R. (2008) J. Clin. Microbiol. 46, 328-330.
Gaillet, B., Gilbert, R., Broussau,S., Pilotte, A., Malenfant, F., Mullick, A., Garnier, A., and Massie, B. (2010)Biotechnol Bioeng 106, 203-215.
Gan Y, Jing Z, Stetler RA, Cao G(2013) Gene delivery with viral vectors for cerebrovascular diseases. FrontBiosci (Elite Ed). 5:188-203. Review.
Garberg, P.; Ball, M.; Borg, N.;Cecchelli, R.; Fenart, L.; Hurst, R. D.; Lindmark, T.; Mabondzo, A.; Nilsson,J. E.; Raub, T. J.; Stanimirovic, D.; Terasaki, T.; Oberg, J. O.; Osterberg, T.In vitro models for the blood-brain barrier, Toxicol. In Vitro 2005, 19,299-334.
Gergov, M.; Ojanpera, I.; Vuori, E.Simultaneous screening for 238 drugs in blood by liquid chromatography-ion spraytandem mass spectrometry with multiple-reaction monitoring, J. Chromatogr. BAnalyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2003, 795, 41-53.
GailletB, Gilbert R, Amziani R, Guilbault C, Gadoury C,Caron AW, Mullick A, Garnier A, Massie B (2007) High-level recombinant proteinproduction in CHO cells using an adenoviral vector and the cumate gene-switch.Biotechnol Prog. Jan-23(1):200-9Gottesman et al., Ann. Rev. Biochem.,62, 385-427 (1993)
Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T.,Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, E.B., Bendahman, N., andHamers, R. (1993) Nature 363, 446-448.
Haqqani AS, Caram-Salas N, Ding W,Brunette E, Delaney CE, Baumann E, Boileau E, Stanimirovic D (2012) Multiplexedevaluation of serum and CSF pharmacokinetics of brain-targeting single-domainantibodies using a NanoLC-SRM-ILIS method. Mol Pharm. 2013 May 6;10(5):1542-56.
Hargreaves KM, Troullos ES, Dionne RA, Schmidt EA,Schafer SC, Joris JL (1988) Bradykinin is increased during acute and chronicinflammation: therapeutic implications. Clin Pharmacol Ther.44(6):613-21.
Huang YL, Saljo A, Suneson A,Hansson HA (1995) A new approach for multiple sampling of cisternalcerebrospinal fluid in rodents with minimal trauma and inflammation. JNeurosci Methods. 63(1-2):13-22.
Hussack, G., Hirama, T., Ding, W.,MacKenzie, R., and Tanha, J. (2011) PLoS ONE 6, e28218.
Hussack G, Arbabi-Ghahroudi M, vanFaassen H, Songer JG, Ng KK, MacKenzie R, Tanha J (2011b) Neutralization ofClostridium difficile toxin A with single-domain antibodies targeting the cellreceptor binding domain. J Biol Chem. 286(11): 8961-76.
Iqbal, U., Trojahn, U., Albaghdadi,H., Zhang, J., O’Connor, M., Stanimirovic, D., Tomanek, B., Sutherland, G., andAbulrob, A. (2010) Br. J. Pharmacol. 160, 1016-1028.
Jespers, L., Schon, O., Famm, K., andWinter, G. (2004) Nat. Biotechnol. 22, 1161-1165.
Kabat EA, Wu TT. Identical V regionamino acid sequences and segments of sequences in antibodies of differentspecificities. Relative contributions of VH and VL genes, minigenes, and complementarity-determiningregions to binding of antibody-combining sites. J Immunol.1991;147:1709-19.
Kim, D.Y., Kandalaft, H., Ding, W.,Ryan, S., van Fassen, H., Hirama, T., Foote, S.J., MacKenzie, R., and Tanha, J. (2012)PEDS advance access August 30, 2012, 1-9.
Kornhuber ME, KornhuberJ, Cimniak U (1986) A method for repeated CSF sampling in the freely movingrat. J Neurosci Methods. 17(1):63-8.
Lefranc, M.-P. et al.,(2003) Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77.
Li S, Zheng W, Kuolee R, Hirama T,Henry M, Makvandi-Nejad S, Fjallman T, Chen W, Zhang J. Pentabody-mediatedantigen delivery induces antigen-specific mucosal immune response. Mol Immunol2009;46:1718-26.
Lin, J. H. CSF as a surrogate forassessing CNS exposure: an industrial perspective, Curr. Drug Metab 2008, 9,46-59.
Merritt, E.A., and Hol, W.G. (1995)Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 165-171.
Muruganandam A, Tanha J, Narang S,Stanimirovic D (2001) Selection of phage-displayed llama single-domainantibodies that transmigrate across human blood-brain barrier endothelium.FASEB J. 2002 Feb;16(2):240-2.
Musher, D.M., Manhas, A., Jain, P.,Nuila, F., Waqar, A., Logan, N., Marino, B., Graviss, E.A. (2007) J. Clin.Microbiol. 45, 2737-2739.
Nhan T, Burgess A, Cho EE, StefanovicB, Lilge L, Hynynen K.(2013) Drug delivery to the brain by focused ultrasoundinduced blood-brain barrier disruption: Quantitative evaluation of enhancedpermeability of cerebral vasculature using two-photon microscopy. J ControlRelease.172(1):274-280.
Nicaise M, Valeio-Lepiniec M, MinardP, Desmadril M. (2004) Affinity transfer by CDR grafting on a nonimmunoglobulinscaffold. Protein Sci. 13(7): 1882-1891.
Nielsen, U.B., Adams, G.P., Weiner,L.M., and Marks, J.D. (2000) Cancer Res. 60, 6434-6440.
Nirogi, R.; Kandikere, V.; Mudigonda, K.;Bhyrapuneni, G.; Muddana, N.; Saralaya, R.; Benade, V. (2009) A simple andrapid method to collect the cerebrospinal fluid of rats and its application forthe assessment of drug penetration into the central nervous system, J.Neurosci. Methods, 178, 116-119.
Nuttall, S.D., Krishnan, U.V.,Doughty, L., Pearson, K., Ryan, M.T., Hoogenraad, N.J., Hattarki, M.,Carmichael, J.A., Irving, R.A., and Hudson, P.J. (2003) Eur. J. Biochem. 270,3543-3554.
Pardridge, W. M.; Buciak, J. L.;Friden, P. M. Selective transport of an anti-transferrin receptor antibodythrough the blood-brain barrier in vivo, J. Pharmacol. Exp. Ther. 1991, 259,66-70.
Pardridge, W.M., Adv. Drug DeliveryReviews, 15, 5-36 (1995)
Pardridge, W. M. Drug and genedelivery to the brain: the vascular route, Neuron. 2002, 36, 555-558.
Planche, T., Aghaizu, A., Holliman,R., Riley, P., Poloniecki, J., Breathnach, A., and Krishna, S. (2008) LancetInfect. Dis. 8, 777-784.
Preston E, Slinn J, Vinokourov I,Stanimirovic D. (2008) Graded reversible opening of the rat blood-brain barrierby intracarotid infusion of sodium caprate. J Neurosci Methods. 168(2):443-9.
Ridgway, J.B., Presta, L.G., andCarter, P. (1996) Protein Eng. 9, 617-621.
Robertson CR, Flynn SP, White HS,Bulaj G (2011) Anticonvulsant neuropeptides as drug leads for neurologicaldiseases. Nat Prod Rep. 28(4):741-62.
Russmann, H., Panthel, K., Bader,R.C., Schmitt, C., and Schaumann, R. (2007) Eur. J. Clin. Microbiol. Infect.Dis. 26, 115-119.
Samani, A.A., Chevet, E.,Fallavollita, L., Galipeau, J., and Brodt, P. (2004) Cancer Research 64,3380-3385.
Samuels B.L., J. Clin. Pharmacol. Ther., 54,421-429 (1993)
Shen, D. D.; Artru, A. A.; Adkison, K.K. Principles and applicability of CSF sampling for the assessment of CNS drugdelivery and pharmacodynamics, Adv. Drug Deliv. Rev. 2004, 56, 1825-1857.
Sloan, L.M., Duresko, B.J., Gustafson,D.R., and Rosenblatt, J.E. (2008) J. Clin. Microbiol. 46, 1996-2001.
Sumbria RK, Zhou QH, Hui EK, Lu JZ,Boado RJ, Pardridge WM.(2013) Pharmacokinetics and brain uptake of an IgG-TNFdecoy receptor fusion protein following intravenous, intraperitoneal, andsubcutaneous administration in mice. Mol Pharm. 10(4):1425-31.
Tanha, J., Muruganandam, A., andStanimirovic, D. (2003) Methods Mol. Med. 89, 435-449.
To, R., Hirama, T., Arbabi-Ghahroudi,M., MacKenzie, R., Wang, P., Xu, P., Ni, F., and Tanha, J. (2005) J. Biol.Chem. 280, 41395-41403.
Turgeon, D.K., Novicki, T.J., Quick,J., Carlson, L., Miller, P., Ulness, B., Cent, A., Ashley, R., Larson, A.,Coyle, M., Limaye, A.P., Cookson, B.T., and Fritsche, T.R. (2003) J. Clin.Microbiol. 41, 667-670.
Watanabe, T., Acta Oncol., 34, 235-241(1995)
Xiao G, Gan LS.(2013)Receptor-mediated endocytosis and brain delivery of therapeutic biologics. IntJ Cell Biol. doi: 10.1155/2013/703545. Epub 2013 Jun 11.Yaksh TL, Rudy TA(1976) Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space. PhysiolBehav.17(6):1031-6.
Yu, Y. J.; Zhang, Y.; Kenrick, M.;Hoyte, K.; Luk, W.; Lu, Y.; Atwal, J.; Elliott, J. M.; Prabhu, S.; Watts, R.J.; Dennis, M. S. Boosting brain uptake of a therapeutic antibody by reducingits affinity for a transcytosis target, Sci. Transl. Med. 2011, 3, 84ra44.
Zhang, J., Li, Q., Nguyen, T.-D.,Tremblay, T.-L., Stone, E., To, R., Kelly, J., and MacKenzie, C.R. (2004a) J.Mol. Biol. 341, 161-169.
Zhang, J., Tanha, J., Hirama, T.,Khiew, N.H., To, R., Tong-Sevinc, H., Stone, E., Brisson, J.R., and MacKenzie,C.R. (2004b) J. Mol. Biol. 335, 49-56.
Zhu et al., Immunology and CellBiology (2010) 88:667-675.
European Patent No. 519596
European Patent No. 626390
US Patent No. 5693761
US Patent No. 5766886
US Patent No. 5821123
US Patent No. 5859205
US Patent No. 5869619
US Patent No. 6054297
US Patent No. 6180370
WO 02/057445
WO 2011/127580
WO 95/04069
WO/2004/076670
WO2003/046560

Claims (28)

  1. インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）エピトープに特異的に結合する単離又は精製抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片が血液脳関門を通過し、前記エピトープが、配列番号５の抗体により特異的に結合される、抗体又はその断片。
  2. ＥＹＰＳＮＦＹＡの相補性決定領域（ＣＤＲ）１配列（配列番号１）、
    ＶＳＲＤＧＬＴＴのＣＤＲ２配列（配列番号２）、及び
    ＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹのＣＤＲ３配列（配列番号３）
    を含み、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）に特異的である単離又は精製抗体又はその断片。
  3. 配列
    Ｘ１ＶＸ２ＬＸ３ＥＳＧＧＧＬＶＱＸ４ＧＧＳＬＲＬＳＣＸ５ＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＸ６ＲＱＡＰＧＫＸ７Ｘ８ＥＸ９ＶＸ１０ＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＸ１１ＳＲＤＮＸ１２ＫＮＴＸ１３Ｘ１４ＬＱＭＮＳＸ１５Ｘ１６ＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＸ１７ＶＴＶＳＳ（配列番号４）（式中、Ｘ１はＥ又はＱであり、Ｘ２はＫ又はＱであり、Ｘ３はＶ又はＥであり、Ｘ４はＡ又はＰであり、Ｘ５はＶ又はＡであり、Ｘ６はＦ又はＶであり、Ｘ７はＥ又はＧであり、Ｘ８はＲ又はＬであり、Ｘ９はＦ又はＷであり、Ｘ１０はＡ又はＳであり、Ｘ１１はＭ又はＩであり、Ｘ１２はＡ又はＳであり、Ｘ１３はＶ又はＬであり、Ｘ１４はＤ又はＹであり、Ｘ１５はＶ又はＬであり、Ｘ１６はＫ又はＲであり、Ｘ１７はＱ又はＬである）、
    又はそれと実質的に同一の配列を含む、請求項１又は２に記載の単離又は精製抗体又はその断片。
  4. ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＶＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ （配列番号５）；
    ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （配列番号６）；
    ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （配列番号７）；
    ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＡＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （配列番号８）；
    ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （配列番号９）；及び
    ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＹＰＳＮＦＹＡＭＳＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧＶＳＲＤＧＬＴＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （配列番号１０）、
    又はそれと実質的に同一の配列からなる群から選択される配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離又は精製抗体又はその断片。
  5. 前記抗体が単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離又は精製抗体又はその断片。
  6. 前記ｓｄＡｂがラクダ科動物由来である、請求項５に記載の単離又は精製抗体又はその断片。
  7. 多価ディスプレイ形式である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離又は精製抗体又はその断片。
  8. Ｆｃ断片に連結されている、請求項７に記載の単離又は精製抗体又はその断片。
  9. 前記Ｆｃ断片が、マウスＦｃ２ｂ又はヒトＦｃ１である、請求項８に記載の単離又は精製抗体又はその断片。
  10. 配列番号１１、４１、又は１２の配列を含む、請求項９に記載の単離又は精製抗体又はその断片。
  11. 血液脳関門を通過する、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の単離又は精製抗体又はその断片。
  12. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離又は精製抗体又はその断片をコードする核酸分子。
  13. 請求項１２に記載の核酸分子を含むベクター。
  14. 表面に固定化されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離又は精製抗体又はその断片。
  15. カーゴ分子に連結されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離又は精製抗体又はその断片。
  16. 前記カーゴ分子が、約１ｋＤ〜約２００ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項１５に記載の単離又は精製抗体又はその断片。
  17. 前記カーゴ分子が、検出可能な試剤、治療剤、薬物、ペプチド、成長因子、サイトカイン、受容体トラップ、化合物、炭水化物部分、酵素、抗体若しくはその断片、ＤＮＡベース分子、ウイルスベクター、若しくは細胞毒性剤；検出可能な試剤、治療剤、薬物、ペプチド、酵素、抗体若しくはその断片、ＤＮＡベース分子、ウイルスベクター、若しくは細胞毒性剤が充填された１つ若しくは複数のリポソーム若しくはナノ担体；又は１つ若しくは複数のナノ粒子、ナノワイヤ、ナノチューブ、若しくは量子ドットである、請求項１５又は１６に記載の単離又は精製抗体又はその断片。
  18. １つ又は複数の、請求項１〜１１及び１４〜１７のいずれか一項に記載の単離又は精製抗体又はその断片及び薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む組成物。
  19. ａ）組織試料を、検出可能な試剤に連結された１つ又は複数の、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離又は精製抗体又はその断片と接触させるステップ、及び
    ｂ）前記組織試料において、ＩＧＦ１Ｒに結合した前記抗体又はその断片に連結された前記検出可能な試剤を検出するステップ
    を含む、ＩＧＦ１Ｒを検出するインビトロ方法。
  20. 前記試料が、ヒト又は動物対象からの血清試料、血管組織試料、腫瘍組織試料、又は脳組織試料である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記検出するステップ（ステップｂ））が、光学イメージング、免疫組織化学、分子画像診断、ＥＬＩＳＡ、イメージング質量分析、又は他の好適な方法を使用して実施される、請求項１９又は２０に記載の方法。
  22. 対象におけるＩＧＦ１Ｒ発現を検出するインビボ方法であって、
    ａ）検出可能な試剤に連結された１つ又は複数の、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離又は精製抗体又はその断片を、対象に投与するステップ、及び
    ｂ）ＩＧＦ１Ｒに結合した抗体又はその断片に連結された前記検出可能な試剤を検出するステップ
    を含むインビボ方法。
  23. 前記検出するステップ（ステップｂ））が、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、蛍光イメージング、又は任意の他の好適な方法を使用して実施される、請求項２２に記載の方法。
  24. 血液脳関門（ＢＢＢ）を通過させてカーゴ分子を輸送する方法であって、
    ａ）カーゴ分子に連結された１つ又は複数の、請求項１１に記載の単離又は精製抗体又はその断片を、対象に投与するステップ、
    を含み、
    前記１つ又は複数の抗体又はその断片が、ＢＢＢを通過させて前記カーゴ分子をフェリーする、方法。
  25. 前記カーゴ分子が、約１ｋＤ〜約２００ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項２４に記載の単離又は精製抗体又はその断片。
  26. 前記カーゴ分子が、検出可能な試剤、治療剤、薬物、ペプチド、成長因子、サイトカイン、受容体トラップ、化合物、炭水化物部分、酵素、抗体若しくはその断片、ＤＮＡベース分子、ウイルスベクター、若しくは細胞毒性剤；検出可能な試剤、治療剤、薬物、ペプチド、酵素、抗体若しくはその断片、ＤＮＡベース分子、ウイルスベクター、若しくは細胞毒性剤が充填された１つ若しくは複数のリポソーム若しくはナノ担体；又は１つ若しくは複数のナノ粒子、ナノワイヤ、ナノチューブ、若しくは量子ドットである、請求項２４又は２５に記載の方法。
  27. 前記投与が、静脈内（ｉｖ）、皮下（ｓｃ）、又は筋肉内（ｉｍ）である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 対象のＢＢＢを通過して送達されたカーゴ分子の量を定量する方法であって、
    カーゴ分子が、１つ又は複数の、請求項１１に記載の単離又は精製抗体又はその断片に連結され、
    ａ）対象から脳脊髄液（ＣＳＦ）を回収するステップ、及び
    ｂ）標的化プロテオミクス方法を使用して、前記ＣＳＦにおける前記１つ又は複数の単離又は精製抗体又はその断片に連結された前記カーゴ分子の量を定量するステップ
    を含む方法。
JP2016555653A 2014-03-06 2014-12-04 インスリン様成長因子１受容体特異的抗体及びそれらの使用 Active JP6541235B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461948808P 2014-03-06 2014-03-06
US61/948,808 2014-03-06
PCT/CA2014/000860 WO2015131256A1 (en) 2014-03-06 2014-12-04 Insulin-like growth factor 1 receptor -specific antibodies and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2017514456A true JP2017514456A (ja) 2017-06-08
JP6541235B2 JP6541235B2 (ja) 2019-07-10

Family

ID=54054286

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016555653A Active JP6541235B2 (ja) 2014-03-06 2014-12-04 インスリン様成長因子１受容体特異的抗体及びそれらの使用

Country Status (17)

Country Link
US (1) US10106614B2 (ja)
EP (1) EP3114142B1 (ja)
JP (1) JP6541235B2 (ja)
KR (1) KR102355308B1 (ja)
CN (1) CN106459194B (ja)
AU (1) AU2014385799B2 (ja)
CA (1) CA2942152C (ja)
CL (1) CL2016002247A1 (ja)
DK (1) DK3114142T3 (ja)
EA (1) EA035472B1 (ja)
IL (1) IL247605B (ja)
MX (1) MX2016011560A (ja)
NZ (1) NZ724866A (ja)
PE (1) PE20170088A1 (ja)
UA (1) UA120048C2 (ja)
WO (1) WO2015131256A1 (ja)
ZA (1) ZA201606210B (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020529473A (ja) * 2017-08-02 2020-10-08 ストレスマーク・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッドＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ． 活性型α−シヌクレインに結合する抗体
JP2021506770A (ja) * 2017-12-14 2021-02-22 エービーエル バイオ インコーポレイテッド ａ−ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその用途
JP2021512159A (ja) * 2017-01-30 2021-05-13 ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ 血液脳関門移動化合物及びその使用
JP2022537279A (ja) * 2019-06-14 2022-08-25 エービーエル バイオ インコーポレイテッド α－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその用途

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6541236B2 (ja) 2014-03-06 2019-07-10 ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ インスリン様成長因子１受容体特異的抗体及びそれらの使用
KR102355310B1 (ko) 2014-03-06 2022-01-24 내셔날 리서치 카운실 오브 캐나다 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체-특이적 항체 및 그의 용도
CA3098162A1 (en) * 2018-04-24 2019-10-31 National Research Council Of Canada Blood-brain barrier transmigrating therapeutic compounds and uses thereof
WO2020185069A1 (en) * 2019-03-08 2020-09-17 Linxis B.V. Internalizing binding molecules targeting receptors involved in cell proliferation or cell differentiation
JP2023508596A (ja) 2020-01-02 2023-03-02 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 脳内の治療用抗体の量を決定するための方法
EP4214235A1 (en) * 2020-09-16 2023-07-26 LinXis B.V. Internalizing binding molecules
WO2024030341A1 (en) 2022-07-30 2024-02-08 Pinetree Therapeutics, Inc. Compositions for targeted lysosomal degradaton and methods of use thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050085419A1 (en) * 1999-07-23 2005-04-21 The Regents Of The University Of California Anti-growth factor receptor avidin fusion proteins as universal vectors for drug delivery
JP2006511516A (ja) * 2002-11-27 2006-04-06 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア ヒトインスリン受容体を介する医薬品の送達
JP2009511032A (ja) * 2005-10-11 2009-03-19 アブリンクス エン．ヴェー． Ｅｇｆｒおよびｉｇｆ−ｉｒに対するナノボディおよびポリペプチド
JP2013534811A (ja) * 2010-05-27 2013-09-09 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド インスリン様成長因子１受容体結合ペプチド

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
ES2202310T3 (es) 1991-12-13 2004-04-01 Xoma Corporation Metodos y materiales para la preparacion de dominios variables de anticuerpos modificados y sus usos terapeuticos.
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
EP0711303B2 (en) 1993-07-30 2009-06-10 Affymax, Inc. Biotinylation of proteins
US20030190598A1 (en) * 2000-05-26 2003-10-09 Jasmid Tanha Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
CA2441903C (en) 2000-05-26 2012-07-31 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
BR0214621A (pt) 2001-11-30 2004-10-13 Ca Nat Research Council Moléculas de automontagem
US20050142141A1 (en) * 2002-11-27 2005-06-30 Pardridge William M. Delivery of enzymes to the brain
EP1452601A1 (en) 2003-02-28 2004-09-01 Roche Diagnostics GmbH Enhanced expression of fusion polypeptides with a biotinylation tag
WO2007000328A1 (en) * 2005-06-27 2007-01-04 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Antibodies that bind to an epitope on insulin-like growth factor 1 receptor and uses thereof
EP1943341A4 (en) 2005-09-27 2010-07-07 Ca Nat Research Council HEMATOENCEPHALIC BARRIER EPITOPES AND USES THEREOF
US20090252681A1 (en) * 2005-10-11 2009-10-08 Ablynx N.V. Nanobodies and Polypeptides Against EGFR and IGF-IR
US7981417B2 (en) 2006-06-07 2011-07-19 Wisconsin Alumni Research Foundation Blood-brain barrier targeting anti-bodies
EP2029621A2 (en) 2006-06-07 2009-03-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Blood-brain barrier targeting antibodies
CA2661042C (en) 2006-08-18 2012-12-11 Armagen Technologies, Inc. Agents for blood-brain barrier delivery
KR20100052545A (ko) 2007-08-28 2010-05-19 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｉｇｆ―１ｒ의 다중 에피토프에 결합하는 조성물
US8444976B2 (en) * 2008-07-02 2013-05-21 Argen-X B.V. Antigen binding polypeptides
WO2011044542A1 (en) * 2009-10-09 2011-04-14 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing iduronate 2-sulfatase activity in the cns
US8444982B2 (en) 2009-12-04 2013-05-21 The University Of Hong Kong Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
CA2796215C (en) 2010-04-14 2021-05-18 National Research Council Of Canada Compositions and methods for brain delivery of analgesic peptides
KR102099462B1 (ko) 2010-11-30 2020-04-10 제넨테크, 인크. 저친화도 혈액-뇌 장벽 수용체 항체 및 그의 용도
PL2802606T3 (pl) * 2012-01-10 2018-09-28 Biogen Ma Inc. Udoskonalenie transportu cząsteczek terapeutycznych przez barierę krew-mózg
KR102355310B1 (ko) * 2014-03-06 2022-01-24 내셔날 리서치 카운실 오브 캐나다 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체-특이적 항체 및 그의 용도
JP6541236B2 (ja) * 2014-03-06 2019-07-10 ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ インスリン様成長因子１受容体特異的抗体及びそれらの使用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050085419A1 (en) * 1999-07-23 2005-04-21 The Regents Of The University Of California Anti-growth factor receptor avidin fusion proteins as universal vectors for drug delivery
JP2006511516A (ja) * 2002-11-27 2006-04-06 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア ヒトインスリン受容体を介する医薬品の送達
JP2009511032A (ja) * 2005-10-11 2009-03-19 アブリンクス エン．ヴェー． Ｅｇｆｒおよびｉｇｆ−ｉｒに対するナノボディおよびポリペプチド
JP2013534811A (ja) * 2010-05-27 2013-09-09 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド インスリン様成長因子１受容体結合ペプチド

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOTECHNOL BIOENG, vol. 110, no. 5, JPN6018037224, 2013, pages 1456 - 1465, ISSN: 0003885003 *
NEURON, vol. 81, JPN6018037225, 8 January 2014 (2014-01-08), pages 49 - 60, ISSN: 0003885004 *
PLOS ONE, vol. Vol.7, No.8, e44235, JPN6018037222, 2012, pages 1 - 14, ISSN: 0003885002 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021512159A (ja) * 2017-01-30 2021-05-13 ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ 血液脳関門移動化合物及びその使用
US11702466B2 (en) 2017-01-30 2023-07-18 National Research Council Of Canada Fusion protein comprising a blood-brain barrier (BBB)-crossing single domain antibody Fc5, an immunoglobulin Fc fragment and a beta-amyloid binding polypeptide (ABP)
JP2020529473A (ja) * 2017-08-02 2020-10-08 ストレスマーク・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッドＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ． 活性型α−シヌクレインに結合する抗体
JP7204235B2 (ja) 2017-08-02 2023-01-16 ストレスマーク・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド 活性型α－シヌクレインに結合する抗体
JP2021506770A (ja) * 2017-12-14 2021-02-22 エービーエル バイオ インコーポレイテッド ａ−ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその用途
JP2022104966A (ja) * 2017-12-14 2022-07-12 エービーエル バイオ インコーポレイテッド ａ－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその用途
JP7212391B2 (ja) 2017-12-14 2023-01-25 エービーエル バイオ インコーポレイテッド ａ－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその用途
JP2022537279A (ja) * 2019-06-14 2022-08-25 エービーエル バイオ インコーポレイテッド α－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその用途
JP7348676B2 (ja) 2019-06-14 2023-09-21 エービーエル バイオ インコーポレイテッド α－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその用途

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160127815A (ko) 2016-11-04
MX2016011560A (es) 2017-04-13
EP3114142B1 (en) 2019-06-05
AU2014385799B2 (en) 2020-10-22
EA035472B1 (ru) 2020-06-22
ZA201606210B (en) 2019-01-30
EP3114142A1 (en) 2017-01-11
US20170015749A1 (en) 2017-01-19
AU2014385799A1 (en) 2016-10-20
DK3114142T3 (da) 2019-09-16
JP6541235B2 (ja) 2019-07-10
IL247605B (en) 2019-08-29
PE20170088A1 (es) 2017-03-09
CN106459194B (zh) 2019-10-18
KR102355308B1 (ko) 2022-01-24
US10106614B2 (en) 2018-10-23
CN106459194A (zh) 2017-02-22
CL2016002247A1 (es) 2017-03-24
CA2942152A1 (en) 2015-09-11
IL247605A0 (en) 2016-11-30
NZ724866A (en) 2022-04-29
BR112016020613A2 (pt) 2018-01-23
UA120048C2 (uk) 2019-09-25
EP3114142A4 (en) 2017-09-13
WO2015131256A1 (en) 2015-09-11
EA201691779A1 (ru) 2017-01-30
CA2942152C (en) 2023-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6541237B2 (ja) インスリン様成長因子１受容体特異的抗体及びそれらの使用
JP6541235B2 (ja) インスリン様成長因子１受容体特異的抗体及びそれらの使用
JP6541236B2 (ja) インスリン様成長因子１受容体特異的抗体及びそれらの使用
EP3481870A1 (en) Humanized antibodies transmigrating the blood-brain barrier and uses thereof
BR112016020613B1 (pt) Anticorpos específicos para receptor de fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 e uso dos mesmos
BR112016020628B1 (pt) Anticorpos específicos para receptor de fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 e uso dos mesmos
STANIMIROVIC et al. Patent 2942152 Summary

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20171121

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20180919

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20180925

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20181225

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20190514

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20190607

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6541235

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250