JP2017140043A - Str遺伝子座の迅速な多重増幅のための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】核酸を含有するサンプルと、アメロゲニン、TPOX、CSF1PO、Penta D、THO1、vWA、FGA及びSE33等の7つ以上のSTR遺伝子座について異なる蛍光色素で標識された7つ以上の異なるプライマー対を溶液中で接触させ、1つの反応チャンバーでポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって同時に増幅して、7つ以上の増幅された核酸生成物を生成し、核酸生成物をレーザー励起蛍光法によって検出する方法。得られたSTR多重が、3.2以上の多重密度を有するSTR多重増幅方法。得られたSTRプロフィールは、法の執行、自国防衛、軍事、諜報および親子鑑定適用での人物同定のために有用である。
【選択図】なし
Description
本願は、次の出願全体を参照により援用している:「Ruggedized Apparatus for Analysis of Nucleic Acid and Proteins」と題する米国特許出願第11/132,712号;「Methods for Rapid Multiplexed Amplification of Target Nucleic Acids」と題する米国特許出願第12/080,746号;「Plastic Microfluidic Separation and Detection Platforms」と題する米国特許出願第12/080,745号;「Integrated Nucleic Acid Analysis」と題する米国特許出願第12/080,751号;および「Unitary Biochips」と題する米国特許出願第13/044,485号。
本発明は、米国国土安全保障省(Department of Homeland Security)からのSBIR助成金、番号N10PC2010S、のもと政府支援を受けて行ったものである。米国政府は、本発明にある種の権利を有し得る。
STR遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta B、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、D8S1179、FGA、ならびにSE33およびアメロゲニン遺伝子座の5色増幅および分離および検出システムでの同時多重増幅の蛍光検出。
この多重設計の第一の工程は、遺伝子座選択を必要とする。幾つかの基準を用いて何十万もの利用可能な多型遺伝子座から選択したが、主要識別因子は、各遺伝子座の多型度であった。より類似した頻度を呈示するより多くのアレルを有する遺伝子座は、より高いヘテロ接合性
25-STR遺伝子座多重。
実施例2は、25の異なるヒトSTR遺伝子座に加えてアメロゲニン遺伝子座の共増幅、ならびに同じ色素で標識した隣接アレルとのオーバーラップのない異なるアレルサイズ範囲へのそれらの共増幅生成物の分離および検出を表示するものである。この遺伝子座セットは、完全13 CODIS遺伝子座、8つのさらなる欧州、オーストリアおよびドイツ標準または提案標準遺伝子座、4つのPenta遺伝子座、および性別識別を可能にするためのアメロゲニンを含んだ。このアプローチは、法医学的型判定方法の統一、ならびに米国と世界中の多くの国々および機構との間でのより多くの有用なデータの共有を可能にする。この多重を使用してDNAサンプルを分析することができ、すると欧州における、米国における、および世界中のデータベースでの検索を支援することができ、その結果、これらの行為地のすべてにおいて法の執行、テロ対策および自国防衛努力を支援することができる。
35-STR遺伝子座多重設計
遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta B、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、アメロゲニン、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、D8S1179、FGA、SE33、D17S974、D9S1122、D14S1434、D4S2408、D9S2157、D20S1082、D6S1043、D1SGATA113、D10S1435およびD11S4463の8色増幅および分離および検出システムでの同時多重増幅の蛍光検出。この35プレックス設計は、実施例1および2の25のSTR遺伝子座およびアメロゲニン遺伝子座とさらなる9つのSTR遺伝子座を含む。
遺伝子座D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta B、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、アメロゲニン、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、D8S1179、FGA、SE33、DYS391、D6S1043、DYS439、DYS389II、DYS19、DYS392、DYS393、DYS389I、DYS390、DYS385a、DYS385b、DYS437およびDYS438の8色増幅、分離および検出システムでの同時多重増幅の蛍光検出。
この38-プレックス設計は、実施例1および2の25STR遺伝子座およびアメロゲニン遺伝子座、実施例3のD6S1043遺伝子座、ならびにさらなる11のY染色体STR遺伝子座を含む。
遺伝子座選択および多重設計。
STR遺伝子座を、米国および欧州データベースでのそれらの使用是認に主として基づき、27遺伝子座多重アッセイへの組み入れに選択した。これらの遺伝子座は、表5に収載されており、13 CODISコアSTR遺伝子座(Budowleら Population Data on the Thirteen CODIS Core Short Tandem Repeat Loci in African-Americans, US Caucasians, Hispanics, Bahamians, Jamaicans, and Trinidadians. J Forensic Sci. 1999;44:1277-86)、欧州標準12 STR遺伝子座(これらのうちの7つは、CODIS遺伝子座と重複している)、オーストリアデータベースで使用されているアメロゲニン遺伝子座、D2S1138およびD19S433遺伝子座、ならびにドイツデータベースで使用されているSE33遺伝子座(Parsonら Efficient DNA database laboratory strategy for high through-put STR typing of reference samples. Forensic Sci Int. 2001;122(1):1-6;Schneider. Expansion of the European Standard Set of DNA Database Loci−the Current Situation. Profiles in DNA. 2009;12(1):6-7)を含む。加えて、拡張CODISコアSTRセットへの組み入れが最近提案されたPenta D、Penta EおよびDYS391遺伝子座(Hares. Expanding the CODIS core loci in the United States. Forensic Sci Int Genet. 2012;6(1):e52-4)、中国で一般的に使用されているD6S1043遺伝子座を組み入れ、およびその大きいリピート長のためさらなるペンタヌクレオチド遺伝子座、Penta Cも組み入れた。
5、6および8色光学検出および電気泳動器具。
NetBioのGenebench-FX(商標)を使用して、実施例1の増幅生成物を分離し、検出した。この計器は、STR分析、DNAシークエンシングおよびSNP型判定のために開発および最適化されたものであり、研究室および先行予測型医療利用のために堅牢化されている。それは、Gieseら (2009). "Fast multiplexed polymerase chain reaction for conventional and microfluidic short tandem repeat analysis." J Forensic Sci 54(6): 1287-96、ならびに「Ruggedized Apparatus for Analysis of Nucleic Acids and Proteins」と題する米国特許出願第11/132,712号、「Plastic Microfluidic Separation and Detection Platforms」と題する米国特許出願第12/080,745号、「Integrated Nucleic Acid Analysis」と題する米国特許出願第 12/080,751号、および「Unitary Biochips」と題する米国特許出願第13/044,485号に記載されており、前記文献のすべてが参照により本明細書に援用されている。2.7μLの各増幅生成物に、9.87μLのホルムアミドおよび1.02μLのCC5-ILS(内部レーン標準、Promega Corporation、カタログ#DG1521)を添加した。サンプルを分離バイオチップに負荷し、350V/cmの電場を90秒間印加することによって分離チャネルに電気泳動で移動させた。この後、150V/cmの電場をその分離チャネルに沿って印加して、DNA断片を分離した。すべての分離を50℃で行った。分離された生成物に付いている色素を固体(488nm)レーザーで励起させ、蛍光をダイクロイックフィルターおよびバンドパスフィルターによって波長分離し、1セット5本の光電子倍増管によって検出した。得られたプロフィールをデータ処理および色分離ソフトウェアに付して、それらの個々の色素中の代表される断片を表示した。
−収差補正凹面ホログラフィック回折格子。この回折格子設計が、単一光学素子を備えた分光器を可能にする。
−固定回折格子マウント。この回折格子を分光器内にしっかりと取り付け、適所にロックする。波長較正のために、回折格子マウント上の止めねじをはずし、回折格子を回転させることによって回折格子配向の調整を行う。回折格子をしっかりと取り付けることが分光器の丈夫さを増す。
−焦点距離。必要分解能(1〜5nm)と同時に最小フットプリントの維持、双方を満たすために100mm焦点距離を選択する。
−ピンホール。分光器の入口の1.0mmピンホールが、最大集光および背景光低減を可能にする。
−出力窓。32mm×10mmの出力窓が、波長分離光によるリニアアレイ検出器への画像形成を可能にする。
−検出器取り付け。リニアアレイ検出器を取り付けるための四条ねじ穴が分光器の出力窓辺りにある。
−結像面の平坦領域。これらの回折格子は、リニアアレイ検出器への直接画像形成のために、平面上の入口スリットからの光を平行にし、再集束させる(図8B)。
−サイズ。42.4×42.4mmの回折格子は、最大集光を可能にする。
−溝密度。1200溝/mmの回折格子により、必要波長範囲および必要分解能を満たすことができる。
−ブレーズ波長。ほぼ可視範囲に中心があるピーク回折格子効率を達成するために、450nmのブレーズ角を選択する。
−分散。溝密度によって規定される、7nm/mmの分散を達成する。これは、出力時に32mmの結像面全域での224nmの波長範囲の画像形成を可能にする。
−波長範囲 − 350〜850nmの波長範囲は、可視色素の発光スペクトル(520〜700nmの範囲)の分離、および波長較正のためのレーザー発光(488および514nm)の検出を可能にする。
色素選択。
6色素多重開発に蛍光色素を選択する場合、作業用5色素セットを作り、新たな色素候補をこのコレクションとの互換性について評価した。表6の上方部分にFAM、JOE、TMR、CXRおよびCC5の5色素セットと共に、各色素についての励起および発光波長最大値をリストする。
8色色素検出および分離。
8つの蛍光色素で標識したSTR生成物を同時に検出するための前記改良光学システムの有用性を評価した。選択した8つの色素は、実施例7で言及したものと、590nmの発光波長最大値を有するリサミン−ローダミン色素および627nmの発光波長最大値を有するATTO 594であった。この形式を試験するために、各プライマー対が、それぞれ、1つの未標識プライマーと8つの異なる蛍光式のうちの1つから選択される標識を有する1つの標識プライマーとよりなる8つの独立したプライマー対ごとに明確なサイズの増幅生成物を生成した。顕色させ、色補正行列を適用してオーバーラッピング・スペクトル・シグナルを分解した後、利用した色素の各々についてのクリーンシグナルを得た(図10)。
モノプレックスおよびミニプレックス試験
多重構築を多数の段階で行い、一般的には、モノプレックスから遺伝子座の幾つかのコアセットを作る戦略、すなわち、本発明者らの以前の研究(Krenkeら Validation of a 16-locus fluorescent multiplex system. J Forensic Sci. 2002;47(4):773-85;Linsら Development and population study of an eight-locus short tandem repeat (STR) multiplex system. J Forensic Sci. 1998;43(6):1168-80;Linsら Multiplex Sets for the Amplification of Polymorphic Short Tandem Repeat Loci--Silver Stain and Fluorescence Detection. BioTechniques. 1996;20(5):882-9)において説明したようなセットに基づく戦略に従った。先ず最初に、個々の遺伝子座各々のモノプレックス増幅のためのプライマー対を「材料および方法」に記載されているように設計した。各対の一方のプライマーがFAM、JOE、CXRおよびROXの色素セットから選択された蛍光色素で標識されている、0.5μMの順方向プライマーおよび0.5μMの逆方向プライマーを使用して、モノプレックス性能を試験した。
アーティファクト削減または除去:iNTA。
STR遺伝子座増幅は、スタッターアーティファクトを示することが多い。これらのアーティファクトは、常にではないが一般的に、真正のアレルより1リピート長短い(Klintscharら Polymerase slippage in relation to the uniformity of tetrameric repeat stretches. Forensic Sci Int. 2003;135(2):163-6;Shindeら Taq DNA polymerase slippage mutation rates measured by PCR and quasi‐likelihood analysis:(CA/GT) n and (A/T) n microsatellites. Nucleic Acids Res. 2003;31(3):974-80)。国家および国際データベースに選択されている、およびしたがって本研究のための選択した遺伝子座が、標準コピー数評価のもとでの単一源サンプルのDNAプロファイリングにおいて真のアレルと区別することができるスタッター量を有することは公知である。
多重増幅生成物からのアーティファクトの除去。
増幅アーティファクトは、少なくとも一方が標識されている2つのプライマーと、関与するプライマーの少なくとも一方についてそのプライマー設計における意図されたハイブリダイゼーション標的ではないゲノム配列との意図されない相互作用から生ずる。アーティファクト発生に関与するプライマーを最初に同定することにより、かかるアーティファクトを除去することができる。これは、1つのプライマーまたはプライマー対を同時にフル多重から除去して、特定のプライマーの除去と特定のアーティファクトの除去とを関連づけることによって果たすことができる。アーティファクト発生についての候補プライマーを同定したら、2つの候補プライマーを使用して、他のプライマーの不在下でサンプルを増幅して、アーティファクト発生におけるそれらの役割を確認する。一方または双方のプライマーの再設計、その後の再試験により、多くの場合、すべての多重遺伝子座の増幅を確保しつつアーティファクト(単数または複数)が除去される。多重プライマーセットへの再設計プライマーの組み入れ後に多重内の多数の遺伝子座の表象のバランスをとり直す努力が、多くの場合、必要とされる。
増幅生成物強度を向上させるための色素選択
幾つかの異なる方法を用いて、多重増幅に関連して個々の遺伝子座からの増幅生成物の強度を増加させることを試みることができる。例えば、新たなゲノム配列に結合するようなまたはより安定したハイブリダイゼーションをもたらすようなプライマー再設計を用いることができる。あるいは、ある遺伝子座のためのプライマーのプライマー濃度を増加または減少させることで、他の遺伝子座に相対して生成物の強度を変化させることができる。時として、他の遺伝子座のためのプライマーのプライマー濃度または全混合プライマー濃度の修飾は、増幅生成物強度を改変し得る。より低いアニーリング温度またはより多くの増幅サイクルを含めたプロトコルの修正もまた、相対増幅生成物表象を変化させる。材料およびプロセスのこれらの変更は、実施例1において説明したおよび図1に表示した26遺伝子座多重セットでのSE33増幅生成物の量を向上させなかった。実施例7における色素調査は、ATTO488色素の使用が、FAM色素の使用より増幅生成物の相対的に強い表象を生じさせることを本発明者らに示した。本発明者らは、標識SE33プライマーをFAMの代わりにATTO488で標識し直し、その多重において他の遺伝子座に相対して望ましい強い増幅生成物表象を観察した。
多重開発戦略としてのミニプレックスの構築および併用
各々が個々の遺伝子座各々についての増幅生成物を首尾よく表示し、かつ非特異的生成物または他のプライマー配列関連アーティファクトのない幾つかのミニプレックスセットを併用して、19遺伝子座多重を生成した。3つのさらなる遺伝子座を別のミニプレックスから付加させて22遺伝子座バージョンを生成し、その後、残りのプライマー対を個々に付加させた。各中間多重を試験してプライマー関連アーティファクトを同定し、遺伝子座間のバランスを評価し、隣接遺伝子座の増幅生成物がオーバーラップしていないことを確認した。特定のアーティファクトの存在および不在と完全プライマーセットからの一方のプライマーの存在または不在と相関させることにより、多くのプライマー関連アーティファクトの各々へのプライマーの寄与を同定した。問題のあるプライマーを再設計し、再試験して、これらの後期開発段階での殆どの問題点を解決した。再試験は、同じ色の隣接遺伝子座のアレルがオーバーラップしなかったことを保証するための、理論的結果ではなく経験的結果の注意深いアンプリコン範囲サイズ分析を含んだ。一方または双方のプライマーの5’末端への配列付加でのサイズ変更を一般的に用いて、遺伝子座・オーバーラップ・ケースを解決した。次の3つの異なるアプローチを用いて遺伝子座間のバランスを調整した:a)入力プライマー濃度の調整、b)PCR増幅反応のアニーリング温度の調整、およびc)プライマー再設計。これらの調整に従って、図14Aは、遺伝子座のバランスをとった27遺伝子座多重セットを用いる2.8ngの男性DNAサンプルの19.5分増幅を表示する。図14Bは、女性DNAサンプルの6色27遺伝子座増幅を示す。8色光学システムを使用して、これらの増幅生成物を分離し、検出した。
より多くの色素を組み込むことで、より小さい増幅生成物が可能になる。
5色検出に対する改善案としての6色検出または8色検出は、人物同定のための多重システムの改善された設計を可能にする。ヒトに関する作業の難しさの1つは残存し、例えば、いくらかのサンプルが分解DNAを含有することである。ここに、より大きいアンプリコンの増幅がより困難になる、または不可能になることさえある。6、7、8、9、10、11、12、14、16以上の色素の存在は、より小さい増幅生成物を生じさせるための多重STR増幅セットの再設計を可能にする。そしてまた、これは、より高いサンプル増幅成功率を可能にする。
24遺伝子座23-STRフォーマル・遺伝子座・多重
増加した多重密度を有する多重設計は、より高い多重増幅アッセイ効率をもたらす。このアプローチは、より小さいサイズ範囲の多型遺伝子座のより多くの代替形態の評価を可能にする。そしてまた、これにより、得られる情報の増加が可能になり、得た情報からより強い推定を行うことが可能になる。
23遺伝子座22-STRフォーマル・遺伝子座・多重
増加した多重密度を有する多重設計は、より高い多重増幅アッセイ効率をもたらす。このアプローチは、より小さいサイズ範囲の多型遺伝子座のより多くの代替形態の評価を可能にする。そしてまた、これにより、得られる情報の増加が可能になり、得た情報からより強い推定を行うことが可能になる。
22遺伝子座21-STRフォーマル・遺伝子座・多重
増加した多重密度を有する多重設計は、より高い多重増幅アッセイ効率をもたらす。このアプローチは、より小さいサイズ範囲の多型遺伝子座のより多くの代替形態の評価を可能にする。そしてまた、これにより、得られる情報の増加が可能になり、得た情報からより強い推定を行うことが可能になる。
21遺伝子座20-STRフォーマル・遺伝子座・多重
増加した多重密度を有する多重設計は、より高い多重増幅アッセイ効率をもたらす。このアプローチは、より小さいサイズ範囲の多型遺伝子座のより多くの代替形態の評価を可能にする。そしてまた、これにより、得られる情報の増加が可能になり、得た情報からより強い推定を行うことが可能になる。
6色SNPアッセイ
6、7、8、9、10、11、12、14、16または24より多くの色の検出に関する検出は、とりわけ、人物同定および獣医学的同定、臨床および獣医学的診断、生物脅威検出、食品安全性、ならびに工業的試験目的での多重システムの向上された設計を可能にすることにより、SNP試験などの非STR評価も向上させる。詳細には、STR多重アッセイについて上で論証したように、より小さい生成物をより多くの色素で区別する。あるいは、より多くの色素を使用することで、同じサイズ範囲制約内でより多くの遺伝子座を試験することができる。一般的に、色素の数が多いほど、多くの情報を単一サンプルおよび単一検出レーンから得ることができる。
STR分析と併用されるSNP分析のための6色アッセイ
実施例2、実施例3、実施例5、実施例15、実施例16、実施例17および実施例18は、漸増数の常染色体STR遺伝子座の同時増幅および分析、より大きい遺伝子座サイズ範囲合計分析、ならびに増加した多重を可能にするための6以上の色素の使用を説明するものである。実施例4は、Y STR遺伝子座と組み合わせた漸増数の常染色体STR遺伝子座の同時増幅および分析を可能にするための6以上の色素の使用を説明するものである。実施例19は、漸増数のSNP遺伝子座の同時増幅および分析を可能にするためのまたはSNP遺伝子座分析における多重サイズ範囲要求に対する6以上の色素の使用を説明するものである。
二重配列分析
DNA配列分析を行って、ヒトゲノムを構成する染色体中の4つの異なるヌクレオチドの順序を決定する。多数の配列分析方法を利用できるが、旧来の評判のよい方法は、サンガーらによって開発された方法(1977, DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. PNAS 74: 5463-5467)であり、この方法は、未標識デオキシ−ヌクレオチド三リン酸と蛍光標識ジデオキシ−ヌクレオチド三リン酸の混合物の存在下でのプライマー伸長を用いる。4つの差次的に蛍光標識されたジデオキシ−ヌクレオチド三リン酸が、それぞれの塩基各々について、および位置またはそれぞれの塩基を示す様々な長さで、鎖延長を停止させる。
Claims (29)
- 核酸を含有するサンプルからのSTR遺伝子座の多重増幅方法であって、
(a)前記サンプルとSTR遺伝子座のための少なくとも6つの異なるプライマー対とを溶解状態で接触させ、ここに、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーを蛍光色素で標識し、および得られたSTR多重は3.20以上の多重密度を有し;
(b)前記少なくとも6つのプライマー対を用いて1つの反応チャンバーでポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって同時に増幅して、増幅された核酸生成物を生成し;次いで
(c)前記核酸生成物をレーザー励起蛍光法によって検出する
ことを含むことを特徴とする前記方法。 - 核酸を含有するサンプルからのSTR遺伝子座の多重増幅方法であって、
(a)前記サンプルとSTR遺伝子座のための少なくとも6つの異なるプライマー対とを1つの溶液中で接触させ、ここに、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーを蛍光色素で標識し、および少なくとも6つの異なる蛍光色素標識を用い、および得られたSTR多重は2.0以上の多重密度を有し;
(b)前記少なくとも6つのプライマー対を用いて1つの反応チャンバーでポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって同時に増幅して、増幅された核酸生成物を生成し;次いで
(c)前記核酸生成物をレーザー励起蛍光法によって検出する
ことを含むことを特徴とする前記方法。 - 前記得られたSTR多重が、3.2以上の多重密度を有することを特徴とする請求項2記載の方法。
- 核酸を含有するサンプルからのSTR遺伝子座の多重増幅方法であって、
(a)前記サンプルとSTR遺伝子座のための少なくとも6つの異なるプライマー対とを溶解状態で接触させ、ここに、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーを蛍光色素で標識し、および少なくとも6つの異なる蛍光色素標識を用い、および得られたSTR多重は1044より大きいSTR遺伝子座サイズ範囲合計を有し;
(b)前記少なくとも6つのプライマー対を用いて1つの反応チャンバーでポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって同時に増幅して、増幅された核酸生成物を生成し;次いで
(c)前記核酸生成物をレーザー励起蛍光法によって検出する
ことを含むことを特徴とする前記方法。 - 核酸を含有するサンプルからのSTR遺伝子座の多重増幅方法であって、
(a)前記サンプルとSTR遺伝子座のための少なくとも16の異なるプライマー対とを溶解状態で接触させ、ここに、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーを蛍光色素で標識し、および少なくとも6つの異なる蛍光色素標識を用い;
(b)1つの反応チャンバーでのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって前記少なくとも16の遺伝子座を同時に増幅して、少なくとも16の増幅された核酸生成物を生成し;次いで
(c)前記核酸生成物をレーザー励起蛍光法によって検出する
ことを含むことを特徴とする前記方法。 - 性別識別のためのマーカーをさらに含むことを特徴とする請求項5記載の方法。
- 前記STRプロフィールが、約2時間未満で生成されることを特徴とする請求項5記載の方法。
- 前記STRプロフィールが、マイクロ流体バイオチップで生成されることを特徴とする請求項5記載の方法。
- 前記STRプロフィールが、完全集積型マイクロ流体バイオチップで生成されることを特徴とする請求項5記載の方法。
- 前記検出方法が、質量分光光度計によるものであることを特徴とする請求項5記載の方法。
- 複数の遺伝子座を含むDNA分子の多重増幅方法であって、
a)少なくとも21のSTR遺伝子座を提供し;
b)前記遺伝子座を単一増幅反応で増幅する
ことを含み、
前記STR遺伝子座が、D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta B、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、アメロゲニン、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、D8S1179、FGA、SE33、DYS391、D6S1043、DYS439、DYS389II、DYS19、DYS392、DYS393、DYS389I、DYS390、DYS385a、DYS385b、DYS437およびDYS438よりなる群からのものであり、ならびに7以上の異なる標識が、前記遺伝子座の各々についての各プライマー対の一方のメンバーを標識するために使用されることを特徴とする前記方法。 - 複数の遺伝子座を含むDNA分子の多重増幅方法であって、
a)少なくとも16の遺伝子座を提供し;
b)前記遺伝子座を単一増幅反応で増幅する
ことを含み、
ここに、前記STR遺伝子座のうちの15が、D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D22S1045、FGA、D8S1179よりなる群からのものであり、
および前記複数のうちの少なくとも1つのSTR遺伝子座が、SE33、Penta C、Penta D、Penta E、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、DYS391およびD6S1043よりなる群から選択され、ならびに6以上の異なる標識が、前記遺伝子座の各々のための各プライマー対の一方のメンバーを標識するために使用されることを特徴とする前記方法。 - 複数の遺伝子座を含むDNA分子の多重増幅方法であって、
a)少なくとも16の遺伝子座を提供し;
b)前記遺伝子座を単一増幅反応で増幅する
ことを含み、
ここに、前記STR遺伝子座のうちの15が、D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D22S1045、FGA、D8S1179よりなる群からのものであり、
および少なくとも1つのさらなるSTR遺伝子座、前記遺伝子座の各々のための各プライマー対の一方のメンバーを標識するために6以上の異なる標識が使用されることを特徴とする前記方法。 - 複数の遺伝子座を含むDNA分子の多重増幅方法であって、
a)少なくとも18の遺伝子座を提供し;
b)前記遺伝子座を単一増幅反応で増幅する
ことを含み、
ここに、前記STRのうちの5つが、D3S1358、D8S1179、D18S51、D21S11およびFGAであり、
および前記複数のうちの少なくとも13のSTR遺伝子座が、D19S433、D2S1338、D16S539、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、SE33、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D12S391、D22S1045、DYS391、D6S1043、TH01およびvWAよりなる群から選択され、ならびに6以上の異なる標識が、前記遺伝子座の各々のための各プライマー対の一方のメンバーを標識するために使用されることを特徴とする前記方法。 - 複数の遺伝子座を含むDNA分子の多重増幅方法であって、
a)少なくとも15の遺伝子座を提供し;
b)前記遺伝子座を単一増幅反応で増幅する
ことを含み、
ここに、前記STRのうちの5つが、D3S1358、D8S1179、D18S51、D21S11およびFGAであり、
および前記複数のうちの少なくとも10のSTR遺伝子座が、D19S433、D2S1338、D16S539、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、SE33、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D12S391、D22S1045、DYS391、D6S1043、TH01およびvWAよりなる群から選択され、ならびに6以上の異なる標識が、前記遺伝子座の各々のための各プライマー対の一方のメンバーを標識するために使用されることを特徴とする前記方法。 - 複数の遺伝子座を含むDNA分子の多重増幅方法であって、
a)少なくとも21の遺伝子座を提供し;
b)前記遺伝子座を単一増幅反応で増幅する
ことを含み、
ここに、前記STRのうちの5つが、D3S1358、D8S1179、D18S51、D21S11およびFGAであり、
および前記複数のうちの少なくとも16のSTR遺伝子座が、D19S433、D2S1338、D16S539、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、SE33、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D12S391、D22S1045、DYS391、D6S1043、TH01およびvWAよりなる群から選択され、ならびに6以上の異なる標識が、前記遺伝子座の各々のための各プライマー対の一方のメンバーを標識するために使用されることを特徴とする前記方法。 - 複数の遺伝子座を含むDNA分子の多重増幅方法であって、
a)少なくとも23の遺伝子座を提供し;
b)前記遺伝子座を単一増幅反応で増幅する
ことを含み、
ここに、前記STRのうちの5つが、D3S1358、D8S1179、D18S51、D21S11およびFGAであり、
および前記複数のうちの少なくとも18のSTR遺伝子座が、D19S433、D2S1338、D16S539、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、SE33、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D12S391、D22S1045、DYS391、D6S1043、TH01およびvWAよりなる群から選択され、ならびに6以上の異なる標識が、前記遺伝子座の各々のための各プライマー対の一方のメンバーを標識するために使用されることを特徴とする前記方法。 - 複数の遺伝子座を含むDNA分子の多重増幅方法であって、
a)少なくとも18の遺伝子座を提供し;
b)前記遺伝子座を単一増幅反応で増幅する
ことを含み、
ここに、前記STR遺伝子座のうちの少なくとも1つが、DYS19、DYS378I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385a/b、DYS437、DYS438、DYS439、DYS472、DYS476、DYS480、DYS481、DYS485、DYS487、DYS488、DYS490、DYS491、DYS492、DYS494、DYS495、DYS497、DYS505、DYS508、DYS511、DYS522、DYS525、DYS530、DYS531、DYS533、DYS537、DYS540、DYS549、DYS554、DYS556、DYS565、DYS567、DYS568、DYS569、DYS570、DYS572、DYS573、DYS575、DYS576、DYS578、DYS579、DYS580、DYS583、DYS589、DYS590、DYS594、DYS617、DYS618、DYS636、DYS640、DYS641およびDYS643よりなる群からのものであり、
および6以上の異なる標識が前記増幅遺伝子座を標識するために使用されることを特徴とする前記方法。 - 常染色体STR、ミニSTR、Y-STRおよびX-STRよりなる群から選択される少なくとも1つのさらなるSTRマーカーをさらに含む、請求項12、14、16、18、24または29のいずれか1記載の方法。
- STR遺伝子座の多重増幅のためのシステムであって、
(a)STR遺伝子座のための少なくとも6つの異なるプライマー対と共にサンプルを少なくとも1つの溶液中に含むバイオチップ、ここに、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーは蛍光色素で標識され、および得られたSTR多重は3.20以上の多重密度を有する;および
(b)前記少なくとも6つのプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって同時に増幅するための増幅システム;および
(c)前記少なくとも6つの異なる蛍光標識を検出することができるレーザーを含む検出システム
を含む前記システム。 - 核酸遺伝子座の多重増幅のためのシステムであって、
(a)STR遺伝子座のための少なくとも6つの異なるプライマー対と共にサンプルを少なくとも1つの溶液中に含むバイオチップ、ここに、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーは蛍光色素で標識され、および少なくとも6つの異なる蛍光色素標識が用いられ、および得られたSTR多重は1044より大きいSTR遺伝子座サイズ範囲合計を有する;および
(b)前記少なくとも6つのプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって同時に増幅するための増幅システム;および
(c)前記少なくとも6つの異なる蛍光標識を検出することができるレーザーを含む検出システム
を含む前記システム。 - STR遺伝子座の多重増幅のためのシステムであって、
(a)STR遺伝子座のための少なくとも16の異なるプライマー対と共にサンプルを少なくとも1つの溶液中に含むバイオチップ、ここに、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーは蛍光色素で標識され、および少なくとも6つの異なる蛍光色素標識が用いられる;および
(b)前記少なくとも16のプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって同時に増幅するための増幅システム;および
(c)前記少なくとも6つの異なる蛍光標識を検出することができるレーザーを含む検出システム
を含む前記システム。 - 複数の遺伝子座を含むDNA分子の多重増幅方法であって、
a)少なくとも35の遺伝子座を提供し;
b)前記遺伝子座を単一増幅反応で増幅する
ことを含み、
ここに、少なくとも1つのSTR遺伝子座が、D3S1358、D8S1179、D18S51、D21S11、FGA、TH01、vWA、D19S433、D2S1338、D16S539、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、SE33、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D12S391、D22S1045、DYS391およびD6S1043よりなる群から選択され、および6以上の異なる標識が、前記遺伝子座の各々のための各プライマー対の一方のメンバーを標識するために用いられることを特徴とする前記方法。 - 少なくとも1つの核酸を含有するサンプルにおける少なくとも3つのSNP多型の存在を検出する方法であって、
(a)前記サンプルと少なくとも3つの異なるオリゴヌクレオチドとを溶解状態で接触させ、
(b)少なくとも6つの蛍光標識を用いて、少なくとも6つの異なる蛍光シグナルを生じさせ、次いで
(c)標識された生成物をサイズ、配列または他の特徴によって分離し、次いで
個々の蛍光シグナルを含有する生成物をレーザー励起蛍光法によって検出する
ことを含むことを特徴とする前記方法。 - 核酸を含有するサンプルからのSTR遺伝子座の多重増幅方法であって、
(a)前記サンプルとSTR遺伝子座のための少なくとも18の異なるプライマー対とを溶解状態で接触させ、ここに、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーを蛍光色素で標識し、および少なくとも6つの異なる蛍光色素標識を用い;
(b)1つの反応チャンバーでのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって少なくとも16の遺伝子座を同時に増幅して、少なくとも16の増幅核酸された生成物を生成し;次いで
(c)前記核酸生成物をレーザー励起蛍光法によって検出する
ことを含むことを特徴とする前記方法。 - 核酸を含有するサンプルからのSTR遺伝子座の多重増幅方法であって、
(a)前記サンプルとSTR遺伝子座のための少なくとも21の異なるプライマー対とを溶解状態で接触させ、ここに、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーを蛍光色素で標識し、および少なくとも6つの異なる蛍光色素標識を用い;
(b)1つの反応チャンバーでのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって前記少なくとも16の遺伝子座を同時に増幅して、少なくとも16の増幅された核酸生成物を生成し;次いで
(c)前記核酸生成物をレーザー励起蛍光法によって検出する
ことを含むことを特徴とする前記方法。 - 核酸を含有するサンプルからのSTR遺伝子座の多重増幅方法であって、
(a)前記サンプルとSTR遺伝子座のための少なくとも22の異なるプライマー対とを溶解状態で接触させ、ここに、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーを蛍光色素で標識し、および少なくとも6つの異なる蛍光色素標識を用い;
(b)1つの反応チャンバーでのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって前記少なくとも16の遺伝子座を同時に増幅して、少なくとも16の増幅された核酸生成物を生成し;次いで
(c)前記核酸生成物をレーザー励起蛍光法によって検出する
ことを含むことを特徴とする前記方法。 - 核酸を含有するサンプルからのSTR遺伝子座の多重増幅方法であって、
(a)前記サンプルとSTR遺伝子座のための少なくとも23の異なるプライマー対とを溶解状態で接触させ、ここに、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーを蛍光色素で標識し、および少なくとも6つの異なる蛍光色素標識を用い;
(b)1つの反応チャンバーでのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって前記少なくとも16の遺伝子座を同時に増幅して、少なくとも16の増幅された核酸生成物を生成し;次いで
(c)前記核酸生成物をレーザー励起蛍光法によって検出する
ことを含むことを特徴とする前記方法。 - 核酸を含有するサンプルからの少なくとも7つの遺伝子座の多重増幅方法であって、
(a)前記サンプルと前記遺伝子座のための少なくとも7つの異なるプライマー対とを溶解状態で接触させ、ここに、各プライマー対の少なくとも一方のプライマーを蛍光色素で標識し、および少なくとも7つの異なる蛍光色素標識を用い;
(b)1つの反応チャンバーでのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって少なくとも7つの遺伝子座を同時に増幅して、少なくとも7つの増幅された核酸生成物を生成し;次いで
(c)前記核酸生成物をレーザー励起蛍光法によって検出する
ことを含むことを特徴とする前記方法。
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