CN103917661A - 用于快速多重扩增str基因座的方法和组合物 - Google Patents

用于快速多重扩增str基因座的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供多重聚合酶链式反应(PCR)扩增短串联重复序列(STR)基因座的方法，其可用于从靶核酸快速产生高特异性STR谱。所得的STR谱可以用于法律执行、国土安全、军事、情报和亲子测试应用中的人类鉴定目的。

Description

用于快速多重扩增STR基因座的方法和组合物
通过引用纳入
本申请通过引用将以下申请的全文纳入作为参考：标题为“RuggedizedApparatus for Analysis ofNucleic Acid and Proteins(用于核酸和蛋白质分析的强化设备)”的美国申请序列号11／132,712；标题为“Methods for Rapid MultiplexedAmplification of Target Nucleic Acids(用于靶核酸的快速多重扩增的方法)”的美国申请序列号12／080,746；标题为“Plastic Microfluidic Separation and DetectionPlatforms(塑料微流体分离与检测平台)”的美国申请序列号12／080,745；标题为“Integrated Nucleic Acid Analysis(完整核酸分析)”的美国申请序列号12／080,751和标题为“Unitary Biochips(整体型生物芯片)”的美国申请序列号13／044,485。
政府支持
本发明在国土***(Department of Homeland Security)的SBIR资金N10PC2010S号的政府资助下完成。政府可享有本发明的某些权利。
发明领域
本发明一般涉及用于核酸样品内的短串联重复序列(Short Tandem Repeat)基因座的快速扩增的组合物和方法。
发明背景
聚合酶链式反应(PCR)是促进核酸序列在体外快速指数型扩增的酶促反应。在法医学中，可使用PCR来鉴定个体，该鉴定基于对含有一类称为短串联重复序列(STR)的重复DNA的人基因组的小区域扩增来进行。给定的STR重复的单位长度为2～10个碱基对，并且STR通常落入非编码和侧接序列内，但偶尔在编码区内(Edwards等，Am.J.Hum.Genet.1991，49，746-756)。人类基因组中有数十万个STR基因座，平均每6～10kb出现一个(Beckman和Weber，Genomics1992，12,627-631)，并且这些中的许多是高多态性的(Edwards等，Trans.Assoc.Am.Physicians1989，102，185-194)。STR分析已经成为法医医疗设备中的主要工具，具有越来越多的应用，包括法律执行、亲子测试、大规模灾难中的人类鉴定和常规的儿童分型。
发明概述
一方面，本发明提供了用于STR基因座的多重扩增的方法，所述方法包括(a)使溶液中的样品接触针对STR基因座的至少6种不同引物对，其中用荧光染料标记各对的至少一种引物，并且其中所得到的STR多重物具有等于或高于3.20的多重密度；(b)通过聚合酶链式反应(PCR)，在一个反应室中使用所述至少6种引物对进行同时扩增，，以产生扩增的核酸产物；和(c)通过激光诱导的荧光来检测所述核酸产物。在相关方面，所述多重STR试验的多重密度为3.0或更高，3.1或更高，3.2或更高，3.3或更高，3.4或更高，3.5或更高，3.6或更高，3.7或更高，3.8或更高，3.9或更高，4.0或更高，4.2或更高，4.4或更高，4.6或更高，4.8或更高，5.0或更高，5.5或更高，6.0或更高，6.5或更高，7.0或更高，7.5或更高，8.0或更高，8.5或更高，9.0或更高，9.5或更高，或10.0或更高。在一些实施方式中，总共采用4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40或更多种荧光染料来标记引物(标记各引物对的一员)，并基于激光激发和检测来检测所述染料标记的片段。增加荧光染料的数量允许较高的多重密度。
在另一个方面中，本发明提供了用于STR基因座的多重扩增的方法，所述方法包括(a)在溶液中使样品接触针对STR基因座的至少6种不同的引物对，其中用荧光染料标记各对的至少一种引物，并且其中使用至少6种不同的荧光染料标记物，并且其中所得的STR多重物的STR基因座大小范围总和大于1044；(b)通过聚合酶链式反应(PCR)，在一个反应室中使用所述至少6种引物对进行同时扩增，以产生扩增的核酸产物；和(c)通过激光诱导的荧光检测所述核酸产物。在相关方面中，所述多重STR试验的STR基因座大小范围总和是1050个碱基或更大，1075个碱基或更大，1100个碱基或更大，1125个碱基或更大，1150个碱基或更大，1175个碱基或更大，1200个碱基或更大，1225个碱基或更大，1250个碱基或更大，1275个碱基或更大，1300个碱基或更大，1325个碱基或更大，1350个碱基或更大，1375个碱基或更大，1400个碱基或更大，1425个碱基或更大，1450个碱基或更大，1475个碱基或更大，1500个碱基或更大，1600个碱基或更大，1700个碱基或更大，1800个碱基或更大，1900个碱基或更大，2000个碱基或更大，2500个碱基或更大，3000个碱基或更大，4000个碱基或更大，或5000个碱基或更大。在一些实施方案中，总共采用4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40或更多种荧光染料来标记引物(标记各引物对的一员)，并且基于激光激发和检测来检测染料标记的片段。增加荧光染料的数量允许较大的STR基因座大小范围总和。
本文中提供的某些方面涉及多态性基因座的多重扩增的方法，所述方法包括(a)在一种溶液中使获自一个或多个来源的一个多个核酸模板的样品接触至少6种不同的引物对，各对与所述一个或多个核酸模板中的至少6个STR基因座之一杂交，其中所述引物对的至少一种引物是经标记的，并且其中使用至少6种(并且在一些方面中，5种，而在其它方面中，多于6种)不同的标记物；(b)通过聚合酶链式反应(PCR)，在一个反应室中对一个或多个核酸中的至少6个STR多态性基因座进行扩增，来产生至少6种核酸产物。在一些实施方式中，扩增6个或更多个基因座。在一些实施方式中，扩增7个或更多个，8个或更多个，9个或更多个，10个或更多个，11个或更多个，12个或更多个，13个或更多个，14个或更多个，15个或更多个，16个或更多个，17个或更多个，18个或更多个，19个或更多个，20个或更多个，21个或更多个，22个或更多个，23个或更多个，24个或更多个，25个或更多个，26个或更多个，27个或更多个，28个或更多个，29个或更多个，30个或更多个，31个或更多个，32个或更多个，34个或更多个，36个或更多个，38个或更多个，或40个或更多个STR基因座。
在一些实施方式中，所述多重STR试验包含针对STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D22S1045、FGA、D8S1179的引物对，和针对至少一个额外STR基因座的引物对。在一些实施方式中，所述多重STR试验包含针对STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D22S1045、FGA、D8S1179的引物对，和针对选自下组的STR基因座的至少一种引物对：STR基因座SE33、Penta C、Penta D、Penta E、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、DYS391和D6S1043。在一些实施方式中，总共采用4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40或更多种荧光染料来标记引物(标记各引物对的一员)，并且基于激光激发和检测来检测所述染料标记的片段。在一些实施方式中，在所述多重物中可任选地包括用于性别鉴定的釉原蛋白(amelogenin)或其它标志物。
在一些实施方式中，所述多重STR试验包含针对STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D16S539、vWA、D21S11、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、FGA、D8S1179的引物对，和针对至少一个额外STR基因座的引物对。在一些实施方式中，所述多重STR试验包含针对STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D16S539、vWA、D21S11、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、FGA、D8S1179的引物对，和针对选自下组的STR基因座的至少一种引物对：STR基因座SE33、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D12S391、D22S1045、DYS391和D6S1043。在一些实施方式中，总共采用4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40或更多种荧光染料来标记引物(标记各引物对的一员)，并且基于激光激发和检测来检测所述染料标记的片段。在一些实施方式中，在所述多重物中可任选地包含用于性别鉴定的釉原蛋白或其它标志物。
在一些实施方案中，所述多重STR试验包含针对STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、FGA、D8S1179、D6S1043的引物对，和针对至少一个额外STR基因座的引物对。在一些实施方式中，所述多重STR试验包含针对STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、FGA、D8S1179、D6S1043的引物对，和针对选自下组的STR基因座的至少一个额外引物对：STR基因座SE33、D10S1248、D2S441、Penta C、D22S1045和DYS391。在一些实施方式中，总共采用4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40或更多种荧光染料来标记引物(标记各引物对的一员)，并且基于激光激发和检测来检测所述染料标记的片段。在一些实施方式中，在所述多重物中可任选地包含用于性别鉴定的釉原蛋白或其它标志物。
在一些实施方式中，所述多重STR试验包含针对STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、CSF1PO、DYS391、FGA、D8S1179的引物对，和针对至少一个额外STR基因座的引物对。在一些实施方式中，所述多重STR试验包含针对STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、CSF1PO、DYS391、FGA、D8S1179的引物对，和针对选自下组的STR基因座的至少一种额外引物对：STR基因座SE33、Penta C、Penta D、TPOX、Penta E、D22S1045和D6S1043。在一些实施方式中，总共采用4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40或更多种荧光染料来标记引物(标记各引物对的一员)，并且基于激光激发和检测来检测所述染料标记的片段。在一些实施方式中，在所述多重物中可任选地包含用于性别鉴定的釉原蛋白或其它标志物。
在一些实施方式中，所述多重STR试验包含针对STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、D22S1045、DYS391、FGA、D8S1179的引物对，和针对至少两个额外STR基因座的引物对。在一些实施方式中，所述多重STR试验包含针对STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、D22S1045、DYS391、FGA、D8S1179的引物对，和分别针对选自下组的STR基因座的至少一种额外引物对：STR基因座Penta C、Penta D、Penta E、SE33和D6S1043。在一些实施方式中，总共采用4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40或更多种荧光染料来标记引物(标记各引物对的一员)，并且基于激光激发和检测来检测所述染料标记的片段。在一些实施方式中，在所述多重物中可任选地包含用于性别鉴定的釉原蛋白或其它标志物。
在一些实施方式中，所述多重STR试验包含针对STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、SE33、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、D22S1045、DYS391、FGA、D8S1179的引物对，和针对至少一个额外STR基因座的引物对。在一些实施方式中，所述多重STR试验包含针对STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、SE33、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、D22S1045、DYS391、FGA、D8S1179的引物对，和针对选自下组的STR基因座的至少一种额外引物对：STR基因座Penta C、Penta D、Penta E和D6S1043。在一些实施方式中，总共采用4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40或更多种荧光染料来标记引物(标记各引物对的一员)，并且基于激光激发和检测来检测所述染料标记的片段。在一些实施方式中，在所述多重物中可任选地包含用于性别鉴定的釉原蛋白或其它标志物。
在一些实施方案中，所述多重STR试验包含针对STR基因座D3S1358、TH01、D18S51、D16S539、vWA、D21S11、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、FGA、D8S1179的引物对，和各自分别扩增至少一个额外STR基因座的至少6种额外引物对，各自分别扩增至少一个其它的STR基因座。在一些实施方式中，所述多重STR试验包含针对STR基因座D3S1358、TH01、D18S51、D16S539、vWA、D21S11、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、FGA、D8S1179的引物对，和包含针对选自下组的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个额外STR基因座的至少一种引物对的至少六种额外引物对：STR基因座D19S433、D2S1338、SE33、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D12S391、Penta D、Penta E、D22S1045和DYS391。在一些实施方式中，总共采用4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40或更多种荧光染料来标记引物(标记各引物对的一员)，并且基于激光激发和检测来检测所述染料标记的片段。在一些实施方式中，在所述多重物中可任选地包含用于性别鉴定的釉原蛋白或其它标志物。
在一些实施方式中，所述多重STR试验包含针对STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S6156、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D22S1045、FGA、D8S1179的引物对，和各自分别扩增至少一个额外STR基因座的至少两种额外引物对。在一些实施方式中，所述多重STR试验包含针对STR基因座D3S1358、D19S433m D2S1338、TH01、D18S51、D16S539、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D22S1045、FGA、D8S1179的引物对，和各自分别扩增选自下组的至少一个额外STR基因座的至少两种额外引物对：STR基因座SE33、Penta C、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、DYS391和D6S1043。在一些实施方案中，总共采用4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40或更多种荧光染料来标记引物(标记各引物对的一员)，并且基于激光激发和检测来检测所述染料标记的片段。在一些实施方式中，在所述多重物中可任选地包括用于性别鉴定的釉原蛋白或其它标志物。
在一些实施方式中，所述多重STR试验包含针对STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、D18S51、D16S539、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、CSF1PO、FGA、D8S1179和D6S1043的引物对，和针对至少一个额外STR基因座的引物对。在一些实施方式中，所述多重STR试验包含针对STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、D18S51、D16S539、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、CSF1PO、FGA、D8S1179和D6S1043的引物对，和分别针对选自下组的STR基因座的至少一种额外引物对：STR基因座SE33、TH01、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、vWA、Penta D、D22S1045、Penta E、SE33和D6S1043。在一些实施方式中，总共采用4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40或更多种荧光染料来标记引物(标记各引物对的一员)，并且基于激光激发和检测来检测所述染料标记的片段。在一些实施方式中，在所述多重物中可任选地包含用于性别鉴定的釉原蛋白或其它标志物。
在一些实施方式中，所述多重STR试验包含针对STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、D18S51、D16S539、D10S1248、D21S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、CSF1PO、D22S1045、FGA和D8S1179的引物对，采用或不采用分别针对选自下组的STR基因座的至少一种额外引物对：STR基因座SE33、Penta C、Penta D、TPOX、Penta E、DYS391和D6S1043。在一些实施方式中，总共采用4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40或更多种荧光染料来标记引物(标记各引物对的一员)，并且基于激光激发和检测来检测所述染料标记的片段。在一些实施方式中，在所述多重物中可任选地包含用于性别鉴定的釉原蛋白或其它标志物。
在一些实施方式中，所述多重STR试验的多重密度为3.0或更高，3.1或更高，3.2或更高，3.3或更高，3.4或更高，3.5或更高，3.6或更高，3.7或更高，3.8或更高，3.9或更高，4.0或更高，4.2或更高，4.4或更高，4.6或更高，4.8或更高，5.0或更高，5.5或更高，6.0或更高，6.5或更高，7.0或更高，7.5或更高，8.0或更高，8.5或更高，9.0或更高，9.5或更高，或10.0或更高。在一些实施方式中，总共采用4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40或更多种荧光染料来标记引物(标记各引物对的一员)，并且基于激光激发和检测来检测所述染料标记的片段。增加荧光染料的数量允许更高的多重密度。
在一些实施方式中，所述多重STR试验的STR基因座大小范围总和是1044个碱基或更大，1050碱基或更大，1075个碱基或更大，1100个碱基或更大，1125个碱基或更大，1150个碱基或更大，1175个碱基或更大，1200个碱基或更大，1225个碱基或更大，1250个碱基或更大，1275个碱基或更大，1300个碱基或更大，1325个碱基或更大，1350个碱基或更大，1375个碱基或更大，1400个碱基或更大，1425个碱基或更大，1450个碱基或更大，1475个碱基或更大，1500个碱基或更大，1600个碱基或更大，1700个碱基或更大，1800个碱基或更大，1900个碱基或更大，2000个碱基或更大，2500个碱基或更大，3000个碱基或更大，4000个碱基或更大，或5000个碱基或更大。在一些实施方式中，总共采用4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40或更多种荧光染料来标记引物(标记各引物对的一员)，并且基于激光激发和检测来检测所述染料标记的片段。增加荧光染料的数量允许较大的STR基因座大小范围总和。
采用6种或更多种荧光标记物(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或更多种标记物)具有许多优势。例如，对于降解的DNA样品而言，通过所述多重STR评价中的小扩增子的应用，提高了产生所有所需扩增产物的可能性。6种或更多种标记染料的应用通过允许在大于引物和引物二聚体的矫作物(artifact)的最小可能范围中设计额外的基因座，通过允许减小基因座的平均扩增子大小类增加了对于降解的DNA样品而言的成功机会。在一些实施方式中，在多重组中扩增6个或更多个基因座，其中各引物对的至少一种引物是经标记的，并且其中使用至少6种不同的标记物。在一些实施方式中，在多重组中扩增12个或更多个基因座，其中各引物对的至少一种引物是经标记的，并且其中使用至少6种不同的标记物。在一些实施方式中，在多重组中扩增6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、40、45、50个或更多个基因座，其中各引物对的至少一种引物是经标记的，并且其中使用至少6种不同的标记物。特意设想了随着时间发展，政府将会批准其它的基因座以及在多重组中使用更多种颜色中的6种以允许设想超过27个基因座。可以替代多个基因座中的一个。例如，FBI目前考虑将TPOX基因座从其目前要求的状态降至所推荐的状态，对于将进入美国CODIS数据库的样品谱(profile)也是如此。
这种颜色的增加和可被探查的STR基因座数量的增加也将减少偶然配对的发生率(关于DNA数据库管理2010中的ENFSI文献，可参见http：／／www.enfsi.org／)，并且将增加许多其它基于STR的应用执行的可信度。例如，DNA序型的作用也已经拓展至包括数据库的家族性搜索(Bieber等，Finding criminals through DNA of theirrelatives(通过亲属的DNA来寻找罪犯).Science.2006；312(5778)：1315-6；Nothnagel等，Potentials and limits of pairwise kinship analysis using autosomal short tandemrepeat loci(使用常染色体的短串联重复基因座的成对亲属关系分析的潜力与限制).Int J Legal Med.2010；124(3)：205-15)，并且亲属关系分析正用于难民、避难者(asylee)和移民应用中(Baker等，Reuniting Families：An Online Database to Aid in theIdentification ofUndocumented Immigrant Remains*(重组家族：协助鉴定未存档移民的线上数据库*).J Forensic Sci.2008；53(1)：50-3；Preston.US set to begin a vastexpansion of DNA sampling；big effect on immigrants；law to cover most peopledetained or arrested by federal agents(美国开始扩大DNA取样；对移民的巨大影响；覆盖被联邦探员拘留或逮捕的大多数人的法律).The New York times.2007：A1，A15)。
使用6种或更多种标记物的另一个优势基于：数个国家已经确定了用于协助鉴定各种犯罪行为的罪犯的国家数据库中应用的标准STR基因座的组(Budowel等，Population Data on the Thirteen CODIS Core Short Tandem Repeat Loci mAfrican-Americans，US Caucasians，Hispanics，Bahamians，Jamaicans，andTrinidadians(关于非洲裔美国人、美国白种人、西班牙人、巴哈马人、牙买加人和特立尼达岛人的十三个CODIS核心短串联重复基因座的人口数据库).J Forensic Sci.1999；44：1277-86；Butler，Genetics and genomics of core short tandem repeat loci usedin human identity testing(人鉴定测试中使用的核心短串联重复基因座的遗传学和基因组学).J Forensic Sci.2006Mar；51(2)：253-65；Gill等，New multiplexes forEurope--Amendments and clarification of strategic development(针对欧洲的新型多重物——战略性发展的改善与阐明).Forensic Sci Int.2006；163(1-2)：155-7)。这些标准组在国家与国家之间是不同的。随着时间推移，由于希望跨国界共享STR序型数据，区域、国家和国际数据库的大小有所增加。可以同时分析的STR基因座的数量的增加将有益于数据库搜索兼容性。使用6种或更多种标记物允许形成新的国际STR标准，其基本上纳入了个体国家中使用的所有STR基因座。
存在几类可以纳入多重STR试验的STR基因座。这些包括常染色体的STR(上文所述那些中的大部分)、X STR、Y STR和微小-STR(常染色体、Y-STR和X-STR的较低分子量形式)。STR试验可以由给定试验中的一种类型的STR基因座或STR基因座的组合组成(例如，可以同时探查常染色体、X-STR和Y-STR)。
在待评价直系男性-男性(male-to-male)遗传的情况中，亲属关系分析和地理血统的研究明显得益于Y染色体STR标志物的使用。在一些实施方式中，在多重组中扩增6个或更多个Y染色体STR基因座，(就一些应用而言，优选6、8、10、12、14、15、18、21、24、27、30或更多个Y染色体STR基因座)，其中各引物对的至少一种引物是经标记的，并且其中使用至少6种不同的标记物。在一些实施方式中，在多重组中扩增18个或更多个基因座，其中各引物对的至少一种引物是经标记的，并且其中使用至少6种不同的标记物。在一些实施方案中，在多重组中扩增18个或更多个基因座，其中至少一个选自DYS19、DYS378I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385a／b、DYS437、DYS438、DYS439、DYS472、DYS476、DYS480、DYS481、DYS485、DYS487、DYS488、DYS490、DYS491、DYS492、DYS494、DYS495、DYS497、DYS505、DYS508、DYS511、DYS522、DYS525、DYS530、DYS531、DYS533、DYS537、DYS540、DYS549、DYS554、DYS556、DYS565、DYS567、DYS568、DYS569、DYS570、DYS572、DYS573、DYS575、DYS576、DYS578、DYS579、DYS580、DYS583、DYS589、DYS590、DYS594、DYS617、DYS618、DYS636、DYS640、DYS641或DYS643，其中各引物对的至少一种引物是经标记的，并且其中使用至少6种不同的标记物。在一些实施方式中，在多重组中扩增24个或更多个基因座，其中至少一个选自DYS19、DYS378I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385a／b、DYS437、DYS438、DYS439、DYS472、DYS476、DYS480、DYS481、DYS485、DYS487、DYS488、DYS490、DYS491、DYS492、DYS494、DYS495、DYS497、DYS505、DYS508、DYS511、DYS522、DYS525、DYS530、DYS531、DYS533、DYS537、DYS540、DYS549、DYS554、DYS556、DYS565、DYS567、DYS568、DYS569、DYS570、DYS572、DYS573、DYS575、DYS576、DYS578、DYS579、DYS580、DYS583、DYS589、DYS590、DYS594、DYS617、DYS618、DYS636、DYS640、DYS641或DYS643，其中各引物对的至少一种引物是经标记的，并且其中使用至少6种不同的标记物。
在一些实施方式中，在多重组中扩增30个或更多个基因座，其中至少一个选自DYS19、DYS378I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385a／b、DYS437、DYS438、DYS439、DYS472、DYS476、DYS480、DYS481、DYS485、DYS487、DYS488、DYS490、DYS491、DYS492、DYS494、DYS495、DYS497、DYS505、DYS508、DYS511、DYS522、DYS525、DYS530、DYS531、DYS533、DYS537、DYS540、DYS549、DYS554、DYS556、DYS565、DYS567、DYS568、DYS569、DYS570、DYS572、DYS573、DYS575、DYS576、DYS578、DYS579、DYS580、DYS583、DYS589、DYS590、DYS594、DYS617、DYS618、DYS636、DYS640、DYS641或DYS643，其中各引物对的至少一种引物是经标记的，并且其中使用至少6种不同的标记物。
在亲属关系、法医学和人类学中复杂缺陷情况中，X染色体标志物对于分析特别有用。男性的X-染色体谱作为单元型传给后代，使其成为用于家族鉴定的高多态性结合的***。在一些实施方式中，在多重组中扩增6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30个或更多个X染色体STR基因座，其中各引物对的至少一种引物是经标记的，并且其中使用至少6种不同的标记物。在一些实施方式中，在多重组中扩增13个或更多个基因座，其中至少一个选自DXS6807、DXS9895、DXS10135、DXS8378、DXS9902、DXS10076、DXS10077、DXS10078、DXS7132、DXS10074、DXS981、DXS6800、DXS9898、DXS6801、DXS6809、DXS6789、DXS7424、DXS101、DXS6797、DXS7133、GATA172D05、HPRTB、DXS10101、DXS9908、DXS8377、DXS10134、DXS7423、DXS10011、DXS10102、DXS10103、DXS10104、DXS10105、DXS10106或DXS10107，其中各引物对的至少一种引物是经标记的，并且其中使用至少6种不同的标记物。
在一些实施方案中，将针对13个CODIS基因座(即，CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TPOX、vWA)中至少五个的引物对和至少一种Y-标志物掺入所述多重物。而在另一个实施方式中，将针对所述13个CODIS基因座中至少五种的引物对、至少一种Y-标志物和选自D1S1656、D2S441、D2S1338、D6S1043、D10S1248、D12S391、D19S433、Penta B、Penta C、Penta D、Penta E、D22S1045和SE33的两种或更多种标志物掺入所述多重物。在这些实施方式中，采用总共5、6、7、8、9、10、11、12种或更多种荧光染料来标记引物(一种标记物／引物对)，并且在所述多重物中可任选地包含用于性别鉴定的釉原蛋白或其它标志物(该可任选的标志物不同于上述的至少一种Y-标志物)。
在一些实施方式中，将针对13个CODIS基因座(即，CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TPOX、vWA)中至少五种的引物对和至少一种X-标志物掺入所述多重物。而在另一个实施方式中，将针对所述13个CODIS基因座中至少五种的引物对、至少一种X-标志物和选自D1S1656、D2S441、D2S1338、D6S1043、D10S1248、D12S391、D19S433、Penta B、Penta C、Penta D、Penta E、D22S1045和SE33的两种或多种标志物掺入所述多重物。在这些实施方式中，采用总共5、6、7、8、9、10、11、12种或更多种荧光染料来标记引物(一种标记物／引物对)，并且在所述多重物中可任选地包含用于性别鉴定的釉原蛋白或其它标志物(该可任选的标志物不同于上述的至少一种X-标志物)。
在一些实施方式中，对引物对的正向或反相引物或两者进行独特标记(例如，使用荧光染料)。在一些实施方式中，所述标记物是荧光染料。在一些实施方式中，使用激光(例如，蓝宝石(Sapphire)488nm激光)检测所述荧光标记的扩增子。使用激光的优势在于，相较于例如酶标仪，试验的灵敏度和检测限制有显著改善。
在一些实施方式中，所述核酸产物在以下时间内扩增：短于180分钟、短于120分钟、短于90分钟、短于80分钟、短于70分钟、短于60分钟、短于55分钟、短于50分钟、短于45分钟、短于40分钟、短于35分钟、短于30分钟、短于25分钟、短于20分钟、短于18分钟、短于17分钟、短于16分钟、短于15分钟、短于14分钟、短于13分钟、短于12分钟、短于11分钟、短于10分钟、短于9分钟、短于8分钟、短于7分钟、短于5分钟或短于约4分钟。
就本文提供的实施方式中任一项所述的方法而言，所述反应室可以在微流体生物芯片上(参见，例如，Giese等(2009)，“Fast multiplexed polymerase chain reactionfor conventional and microfluidic short tandem repeat analysis(用于常规和微流体短串联重复序列分析的快速多重聚合酶链式反应)”，J Forensic Sci54(6)：1287-96))。此外，所述反应室可以在完全整合的(fully-integrated)微流体生物芯片上，所述生物芯片能够以“样品入一结果出”(sample-in to results out)***设定同时针对一个或多个样品进行一系列复杂的处理步骤，其中不需要操作员操作。在一些实施方式中，所述方法包括核酸产物的电泳分离和检测。在一些实施方式中，在微流体生物芯片上进行所述核酸产物的分离和／或检测。
在本文中所述的任何实施方案中，所述样品可包含约1pg～超过10μg的一种或多种核酸(模板)。在一些实施方式中，所述样品包含少于1ng的一种或多种核酸(模板)。在某些方面中，就0.05ng～4.0ng范围的核酸模板水平而言，各核酸产物的杂合峰高比(heterozygous peak height ratio)(PHR)对于为0.6～1.0。
本发明的其它方面涉及用于快速多重扩增多态性基因座的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)盐、缓冲剂、dNTP和聚合酶；(b)选自上述那些的STR引物对的组，各引物对具有正向引物和反相引物，并且与一种或多种核酸或核酸混合物中的至少6个基因座之一杂交，其中各引物对的正向或反相引物或两者用荧光染料标记；(c)用于STR基因座的快速多重扩增的成分(例如，盐、缓冲剂、镁、dNTP和聚合酶)，其中成分(a)、(b)和(c)被放在单个反应容器内。
在本文中所述的任何实施方式中，可以采用任何DNA聚合酶。示例包括水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)、强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)、伍斯氏火球菌(Pyrococcus woesei)(Pwo)、黄栖热菌(Thermas flavus)(Tfl)、嗜热栖热菌(Themusthermophilus)(Tth)、里氏栖热菌(Thermus litoris)(Tli)和海栖热袍菌(Thermotogamaritime)(Tma)。这些酶、这些酶的修饰形式和酶的组合可从供应商购得，如罗氏公司(Roche)、英杰公司(Invitrogen)、恰根公司(Qiagen)、司查塔基公司(Strategene)和应用生物***公司(Applied Biosystems)。代表性的酶包括PHUSION(马萨诸塞州伊普斯威奇的NEB公司)、Hot MasterTaq.TM.(艾本德公司(Eppendorf))、PHUSIONMpx(芬酶公司(Finnzymes))、PyroStart(富酶泰斯公司(Fermentas))、KOD(EMD生物科学公司)、Z-Taq(TAKARA公司)和CS3AC／LA(密苏里州大学城的克兰泰克公司(KlenTaq))。
本发明的指导可应用于任何核酸扩增方法，包括但不限于，多重终点PCR、实时PCR、逆转录PCR、不对称PCR、巢式PCR、LATE PCR、降落式PCR、数字PCR、等温PCR、滚环式扩增、链置换扩增和多重置换扩增。
本发明的指导可应用于通过改变给定基因座处的等位基因大小来表征的任何多重基因座的分析。多重STR分析可应用于多种生物体，包括非人类哺乳动物、鱼类、鸟类、爬行动物和两栖动物物种。此外，本发明可用于通过多个基因座可变数目串联重复序列分析(MLVA)和扩增的片段长度多态性(AFLP)分析的细菌(包括病原体)的鉴定和表征。这些方法与STR分析相似，并且也可以广泛地用于菌株分型以及植物、真菌和动物中的表征。本发明的指导可用于非多态性基因座的分析，或多态性与非多态性基因座组合的分析。最后，本发明可直接应用于单核苷酸多态性(SNP)的多重分析。
附图简述
图15-色26-基因座，25-STR正式基因座的设计
图2A是进行PCR的微流体生物芯片的照片。
图2B是接受图2A的生物芯片的快速热循环仪的照片。
图3是对于26-基因座，25STR正式基因座多重反应上的各基因座的扩增产物的颜色校正扫描。
图4说明25-STR基因座的实质无重叠STR试验的设计。
图5显示使用8种染料来标记基因座组扩增产物的设计。
图6显示使用8种染料来标记常染色体STR和Y STR基因座组扩增产物的设计。
图7说明允许26个STR基因座和釉原蛋白基因座在单个反应中共扩增的设计。
图8A说明了本发明的摄谱仪的图。
图8B描述选择与所述摄谱仪一起使用的像差校正凹全息光栅。
图8C显示允许将仪器容易地设置成供于采用集成波长模块或现有滤光器和离散PMT的运行的镜子。
图8D显示6-色和8-色仪器的射束路径。
图9说明核心5-染料组和DyLight633(DL633)染料的发射光谱图。穿过该图底部写有检测器通道。Y-轴显示相关信号强度。各框的区域中的数字表示各相应染料的最大发射波长(nm)。
图10说明经减去基线和颜色校正的扩增产物的8-色分离电泳图。在实施例6的8-色仪器上分离并检测扩增产物。所述扩增的片段由各组中对其所用的来指示。图11A说明向未标记引物的5’末端添加GTTTCTT尾部以减少iNTA的作用。
图11B说明向未标记引物的5’末端添加G-尾部以减少iNTA的作用。
图11C说明将染料标记从D8S1179引物对的一种引物交换至另一种引物的作用。
图12A表示在GeneBench FX仪器上分离之后以5色显示的6-染料26-基因座多重扩增产物范围中消除矫作物之前存在两种矫作物(箭头下)。
图12B表示在GeneBench FX仪器上分离之后以5色显示的6-染料26-基因座多重扩增产物中消除矫作物之前的存在两种矫作物(左图中的箭头下)，并且它们在消除矫作物之后消失(右图中的箭头下)的放大视图。
图12C表示在GeneBench FX仪器上分离之后以5色显示的6-染料26-基因座多重扩增产物范围中消除矫作物之后两个矫作物(箭头下)消失。
图13说明遵循本发明所述的开发在6-／8-色仪器上分离并检测的男性DNA的6-色27-基因座扩增产物。
图14A说明在6-／8-色仪器上分离并检测的男性DNA的6-色27-基因座扩增产物。
图14B说明了在6-/8-色仪器上分离并检测的女性DNA的6-色27-基因座扩增产物。
图15A显示使用5种染料来评价CODIS13核心STR基因座的设计。
图15B显示使用6种染料的设计，说明需要较小的多重大小范围(Multiplex SizeRange)，并且获得较大的多重密度来评价CODIS13核心STR基因座。
图15C显示使用8种染料的设计，说明需要较小的多重大小范围，并且获得较大的多重密度来评价CODIS13核心STR基因座。包括的表格说明5-染料、6-染料和8-染料选择所用的多重大小范围和多重密度的数值。
图16显示24个基因座扩增设计。
图17显示23个基因座扩增设计。
图18显示22个基因座扩增设计。
图19显示21个基因座扩增设计。
发明详述
本文中描述用于遗传分析的方法。所述方法的一些实施方式被设计成提供一个或多个核酸模板的高特异性遗传谱，例如，短串联重复序列(STR)谱。各个谱提供给定核酸模板内的多个、多态性基因组基因座的DNA“指纹”，其然后可用于一些实施方式以鉴定所得核酸模板的来源个体(或关于该个体或该个体血亲的信息)。
本发明的目的是提供多重STR试验，所述多重STR试验产生可用于各种应用的人类鉴定信息。例如，法医实验室最近鉴定的家族性搜索的增加值，即，搜索源自犯罪现场样品的谱与州、国家或国际数据库中存在的谱之间的联系，通过将可能的嫌疑犯范围缩小至在所述数据库中具有谱的个体的家族成员，以帮助调查。本发明的试验为家族搜索提供实质上更高的可信度，并且显著减少搜索规模增加的数据库获得的偶然配对的数量。
本发明的试验的较高辨别力还增强了在移民和难民应用分析中的DNA序型的使用。在这些情况中，可以更高的正确结果可信度来进行涉及美国公民或特定难民的个体权利相关的美国国务院政策的实施。尽管13个CODIS STR基因座在检测父母-子女关系和兄弟-姐妹关系中提供了适当的保证，但更远的关系(如祖父母-孙子女或阿姨／叔叔-侄子／侄女的)亲属关系分析导致许多可信度水平有限的结果。增加测试用的STR基因座数量和／或选择更多测试用的多态性基因座增加了亲属关系分析中结果可信度提高的可能性比率的强度，并降低了欺诈的潜在风险。本发明的试验还提供对有时获自法医样品的降解DNA样品的评价的优势。
尽管STR分析已经成为证据的黄金标准，但国际上并没有将STR基因座组标准化。在美国，联邦调查局选择了13个STR基因座和釉原蛋白基因座(用于性别确定)，以供与DNA联合索引***(CODIS)结合使用。该美国组通常称为“CODIS核心基因座”并且由STR基因座CSF1PO、FGA、THO1、TPOX、VWA、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51和D21S11组成。一般而言，各STR基因座以其被发现的染色体(例如，D3S1358位于人染色体3上)或以邻近基因(例如，CSF1PO位于编码集落刺激因子-1受体基因的人c-fms原癌基因受体的基因的内含子中)来命名。英国核心基因座是FGA、TH01、VWA、D2S1338、D3S1358、D8S1179、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11和釉原蛋白。欧洲核心基因座是FGA、ThO1、VWA、D1S1656、D2S441、D3S1358、D8S1179、D10S1248、D12S391、D18S51、D21S11、D22S1045和釉原蛋白。奥地利政府在欧洲核心基因座的基础上增加了D2S1338、D16S539和D19S433，而德国政府增加了基因座SE33。中国常常使用基因座D6S1043，并结合STR基因座CSF1PO、FGA、vWA、D2S1338、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11和釉原蛋白。国际刑警组织标准组基因座是FGA、THO1、VWA、D3S1358、D8S1179、D18S51、D21S11，以及可任选的釉原蛋白。
本发明提供同时探查所有STR基因座的STR试验，所述STR基因座是为包括全世界的国家数据库和含有这些基因座的子集而选择的。这样的国际STR标准组将显著提高国家之间的有效合作，以提高社会安全性。本领域技术人员应理解，设计和构建多重STR试验时，必须平衡多种因素。这些因素变得愈发难平衡，特别是因为试验中的STR基因座数量增加超过18个。必须平衡的因素包括STR矫作物(例如，iNTA，和两种或多种引物与样品核酸的非计划相互作用的产物)的预防或去除、绝对和相对信号强度、反应效率和时间、STR基因座重叠、STR扩增子分解、STR基因座大小范围和可耐受的重叠程度、STR基因座杂合性、反应中所用的荧光染料标记物的数量、多重大小范围，以及进行反应的一个或多个仪器的规格和性能。这些因素阻碍了STR试验在多重密度高于约3.15和STR基因座大小范围总和为1022的单个、同时的反应中移动超过18个正式基因座。根据所需的结果，这些工具和指导可被应用于允许数量多很多的正式基因座掺入STR多重物中，并且获得高得多的多重密度和STR基因座大小范围总和。
如本文中所用的术语“STR基因座”和“多个STR基因座”指由两个或多个核苷酸在给定的靶核酸的基因座处的重复模式组成的核苷酸序列。所述重复模式的长度可以是约2～约10个碱基对(bp)，并且通常在非编码内含子区中。所述重复模式可以含有不对应于所述重复单位的间插序列，或可以含有超过一种的重复模式。
如本文中所用的术语“STR等位基因”或“等位基因”指的是个体基因组中发现的STR基因座的形式。给定的STR基因座可以是杂合的，意味着两个等位基因(各生物学亲本固有的一个)的长度不同且碱基对组成不同，或可以是纯合的，意味着两个等位基因长度相同(碱基对组成通常相同但并不总是相同)。罕见地，对于给定的STR基因座，个体可能具有三个或更多个等位基因。偶尔，由于一个或多个突变，给定STR基因座的个体的等位基因可能不同于他或她的父母。
如本文中所用的术语“等位基因分型标准物(allelic ladder)”指的是一组长度与各STR基因座都观察到的共有等位基因相对应的DNA。不同的市售STR试剂盒在表示各基因座的等位基因分型标准物中具有不同的等位基因。
如本文中所用的术语“STR基因座大小范围”或“基因座大小范围”指的是群体中观察到的共有等位基因的大小范围。已知在测试的数千万中的一个或少数个体中检测或观察到任何特定数量的DNA样品，可能还没有观察到非共有等位基因。因为市售试剂盒具有不同的大小范围(公司倾向于随着时间推移将罕见的等位基因加入它们的等位基因分型标准物中)，因此确定所有感兴趣的STR基因座的STR基因座大小范围是重要的。这样的确定使不同STR试验能够相互比较。非共有等位基因目前可能还未被包括在任何特定的等位基因分型标准物中，或者可能是为方便起见而未被包括。等位基因分型标准物中不必包含全部已知的等位基因，因为其它的等位基因可通过与现有的等位基因分型标准物成分进行大小比较来鉴定。在市售可得的等位基因分型标准物组中，各基因座的最大和最小等位基因之间的大小差异被用于确定标准STR基因座大小范围，并且示于表1。对于应用生物***公司(AppliedBiosystems)的产品AmpFISTR I Identifiler、AmpFlSTR Identifiler Plus、AmpFlSTRIdentifiler Direct、AmpFlSTR NGM Select、AmpFlSTR Sinofiler以及普洛麦格公司(Promega Corporation)的产品PowerPlex16HS、ESX的PowerPlex17和PowerPlex18D而言，通过比较线上现有的市售公开技术材料来确定以下比较中包括的STR基因座大小范围。就各基因座而言，确定了上述技术材料中所述的市售可得的等位基因阶梯分型标准物的合并组中的最大和最小等位基因。然后基于重复序列的数量，以及所述基因座处是否存在四碱基或五碱基重复序列长度来确定最大和最小等位基因之间的大小差异，以碱基计。对于各基因座，分配一个针对该基因座的称为“基因座标准大小范围”的值。使用这些单个值来确定“多基因座大小范围总和”(即，针对各多重物内所含的单个基因座的全部标准大小范围的总和)。
表1的STR基因座可以归为四类：1)由一个或多个国家官方批准的基因座：CSF1PO、FGA、THO1、TPOX、VWA、D1S1656、D2S441、D2S1338、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D10S1248、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、D22S1045、SE33和釉原蛋白；2)在中国广泛使用的基因座：D6S1043；3)在美国提出使用的基因座：DYS391；和4)市售STR试剂盒中使用的三个基因座：Penta B、C、D和E。合在一起，这四类中所含的任何STR基因座被称为“正式STR基因座”。目前这些类别中的基因座通常已经接受了严格的验证和测试。随着时间推移，可以将新的基因座加入以上的类别中：1)由一个或多个国家官方批准的新基因座；2)由一个或多个国家广泛使用但非官方批准的新基因座；3)在美国提出使用的新基因座；和4)在市售试剂盒中发现的新基因座。对于之后成为这些类别之一的成员的新基因座，可以使用所述基因座的最大和最小等位基因的公开限制来确定各STR基因座的大小范围。对于没有落入这四类之一的“非正式”STR基因座，可以使用所述基因座的最大和最小等位基因的公开限制来确定各STR基因座的大小范围。
表1
如本文中所用的术语“实质上非重叠的STR试验”，指的是其中STR基因座大小范围的等位基因不与采用相同染料标记的(或可应用的其它检测方法)基因座的任何其它STR基因座大小范围重叠(除等位基因及其罕见并且在STR基因座大小范围之外以外)的STR多重试验。
如本文中所用的“STR基因座大小范围总和”，指的是多重STR组中包含的基因座的单一STR基因座大小范围的总和。例如，实施例I的26-基因座STR组的STR基因座大小范围总和是1487个碱基，而Identifiler基因座(生命技术公司(LifeTechnologies))的16-基因座STR组的STR基因座大小范围总和是809个碱基。
如本文中所用的“多重物大小范围”，指的是给定STR多重物的任何基因座中的最大等位基因和所述多重物的任何基因座中的最小等位基因的大小差异。这两个基因座和所述多重物大小范围的特征是特异性多重物。为了计算多重物大小范围：1)鉴定包含最小共有等位基因的多重物中的STR基因座；2)测定所述基因座中的最小共有等位基因的大小(使用针对“STR基因座大小范围”所述的相同方法)；3)鉴定包含最大标准等位基因的多重物中的STR基因座；4)测定所述基因座中的最大标准等位基因的大小(使用针对“STR基因座大小范围”所述的相同方法)；5)计算所述两个标准等位基因之间的差异。例如，实施例I的26-基因座STR组的多基因座大小范围是411个碱基，而Identifiler组(生命技术公司(Life Technologies))的16-基因座STR组的多重物大小范围是257个碱基。
几个因素影响给定试验中所用的多重大小范围。可以使用多种方法，包括电泳和质谱，来表征STR等位基因。对于电泳分离，例如，当来自STR引物、引物二聚体或其它扩增矫作物的短扩增子变得难以区分开来时的大小会影响大小的下限。大小的上限会受到***分辨力的影响，所述***分辨有一个或少数碱基差异的大等位基因时的能力较差。相似地，给定试验中的等位基因越大，降解的DNA样品将不具有足以允许所述大等位基因大量扩增的平均片段长度的可能性越高。
对于MALDI-TOF(基质辅助激光解吸／电离飞行时间)质谱，STR片段的大小基于用激光脉冲含有所述片段的样品，并测量检测器的飞行时间(相较于质量标准)。大小上限受到质谱分光光度计不能检测或分辨STR等位基因的影响。注意到MALDI-TOF产生精确的STR片段分子量，并因此不需要等位基因分型标准物。为能与基于电泳的方法进行直接比较，如上所述计算STR基因座大小范围总和、多重大小范围和多重密度。归因于使用质谱提高的准确度，STR基因座在不与等位基因分型标准物相比较的情况下可被可靠地分型。使用质谱，而不是如电泳分析中那样的相对移动性测量(与DNA测量标准相比较)来测量绝对质量。然后，GeneTrace设计的基因分型软件基于获自参照序列的预计等位基因质量、PCR引物位置和重复单位的质量将观察到的峰质量反过来与基因型相关联。使用标准台式个人计算机，各样品可在大约一秒钟内被处理和基因分型。
如本文中所用的“多重密度”定义为“STR基因座大小范围总和”除以“多重大小范围”。该值是可获自给定多重物的STR信息密度的度量。较高的值指示多重物在允许检测的有限大小范围内显示较大范围的等位基因。例如，表2显示数个STR组的STR基因座总数、正式STR基因座的数量、染料数量、多重大小范围、多重大小范围总和以及多重密度。该表还包括基因座标准大小范围和允许测定这些值的潜在数据。本发明的STR组的多重密度是至少2或更高，2.25或更高，2.5或更高，2.75或更高，2.93或更高，3.00或更高，3.1或更高，3.2或更高，3.3或更高，3.4或更高，3.5或更高，3.6或更高，3.7或更高，3.8或更高，3.9或更高，4.0或更高，4.1或更高，4.2或更高，4.3或更高，4.4或更高，4.5或更高，5或更高，6或更高，7或更高，8或更高，9或更高，或10或更高的多重密度。
表2
如本文中所用的术语“核酸模板”或“多个核酸模板”指的是作为STR谱合成的起始材料使用的～个核酸或多个核酸。核酸模板可以是双链或单链。所述模板可以包含来自个体的一个或多个全部基因组的DNA、个体的部分基因组或来自个体的DNA的先前扩增产物，并且可包含来自两个或多个个体的全部和部分基因组的混合物。待分析的基因组可以源自人类、其它哺乳动物物种或混合物。
如本文中所用的术语“基因座”和“多个基因座(复数)”意指如本文中定义的给定物种的全部或部分基因组内的一个或多个具***置。
如本文中所用的术语“高多态性基因座”或“多个高多态性基因座”指的是多态性信息含量是至少0.5的基因座(多个基因座中的每一个)。多态性信息含量(PIC)[Botstein D，White RL，Skolnick M和Davis RW，1980.Am J Hum Genet32：314-331，其公开内容纳入本文]，其中每个皆为本领域普通技术人员已知的。可使用以下公式来计算特定基因座的PIC：其中pi是第i个等位基因的频率，而n是等位基因的数量。在一些实施方式中，高多态性基因座的PIC值是约0.5或更高。在一些实施方式中，高多态性基因座的PIC值是约0.5～约0.7。在一些实施方式中，使用本文所述的方法来扩增两个或多个高多态性基因座，而在其它的实施方式中，使用所述方法来扩增多态性(PIC<0.4)基因座和高多态性(PIC≥0.5)基因座的混合物。
在一些实施方式中，本文中所述的方法提供核酸样品中6个或更多个多态性基因座(其中一些基因座可具有高多态性)的基本上同时的快速聚合酶链式反应(PCR)扩增，所述基因座全部将通过激光诱导荧光来检测。在一些实施方式中，扩增至多35个或更多个多态性基因座。本发明多重物中的一些基因座可不具有高多态性。例如，用于物理性状、疾病的基因座，与地域种族性(geoethnicity)有关的基因座或出于常见用途而包括的基因座，可以最低多态性存在。在该实施例的多重物中，釉原蛋白基因座不具有高多态性。如本文中所用的术语“基本上同时”指的是立即或接近立即的及时连续。
所述的方法提供STR基因座的快速扩增。在一些实施方式中，本文中公开的方法提供在约45分钟或更短时间内，或约20分钟或更短时间内，从包含至少0.06ng的人基因组DNA的样品快速PCR扩增多态性基因座。在其它实施方式中，在约100分钟或更短时间内扩增多个多态性基因座。在其它实施方案中，在约80分钟或更短时间内，约70分钟或更短时间内，约60分钟或更短时间内，约50分钟或更短时间内，约40分钟或更短时间内，约30分钟或更短时间内，或约20分钟或更短时间内扩增多个多态性基因座。在其它实施方式中，在约1分钟～约10分钟内扩增多个STR基因座。
在一些实施方式中，可以从靶核酸基因座的至少一个拷贝开始扩增多个多态性基因座。例如，在多重扩增反应之前，待分析的样品(或核酸模板)可包含靶核酸的少于10,000个拷贝，少于1000个拷贝，少于400个拷贝，少于200个拷贝，少于100个拷贝，少于50个拷贝，少于30个拷贝，少于10个拷贝，少于6个拷贝或至少1个拷贝。此外，如果靶核酸基因座之一以一个拷贝存在于基因组中，或靶核酸基因座以多于一个拷贝存在于基因组中，则可利用小于单一基因组当量的DNA来扩增。在一些实施方式中，根据本文所述方法的一些实施方式，可在样品中在各靶核酸内同时扩增至少两个基因座且至多约250个基因座。在一些实施方式中，同时扩增约26或27个多态性(或高多态性)基因座。在其它实施方式中，可同时从一个或多个靶核酸扩增至少两个基因座且至多约250个基因座，其中各靶核酸获自不同来源或相同来源。
本文所用的靶核酸可以是任何核酸，例如，人核酸、细菌核酸或病毒核酸。所述靶核酸样品可以是，例如，来自以下生物样品：一种或多种细胞、组织或体液(如，血液、尿液、***、淋巴液、脑脊髓液或羊水)，或其它生物样品，如组织培养细胞、颊拭子、漱口水、粪便、组织切片、活体组织切片抽吸物和考古学样品，如骨或木乃伊化组织。靶核酸可以是，例如，DNA、RNA或RNA经反转录的DNA产物。靶样品可以源自任何来源，包括但不限于，真核生物、植物、动物、脊椎动物、鱼类、哺乳动物、人类、非人类、细菌、微生物、病毒、生物来源、血清、血浆、血液、尿液、***、淋巴液、脑脊髓液、羊水、活体组织切片、针吸活体组织切片、癌、肿瘤、组织、细胞、细胞溶解物、粗制细胞溶解物、组织溶解物、组织培养细胞、颊拭子、漱口水、粪便、木乃伊化组织、法医来源、尸体解剖、考古学来源、感染、医院内感染、生产来源、药物制剂、生物分子产品、蛋白质制剂、脂质制剂、碳水化合物制剂、无生命物体、空气、土壤、汁液、金属、化石、挖掘材料和／或其它地球或地球外材料及来源。样品也可含有一个来源或不同来源的材料的混合物。例如，当使用所公开的方法扩增受细菌或病毒感染的细胞或组织的核酸时，该感染细菌或病毒的核酸可以连同人类核酸一起扩增。有用的靶样品的类型包括真核样品、植物样品、动物样品、脊椎动物样品、鱼类样品、哺乳动物样品、人类样品、非人类样品、细菌样品、微生物样品、病毒样品、生物样品、血清样品、血浆样品、血液样品、尿液样品、***样品、淋巴液样品、脑脊髓液样品、羊水样品、活体组织切片样品、针吸活体组织切片样品、癌样品、肿瘤样品、组织样品、细胞样品、细胞溶解物样品、粗制细胞溶解物样品、组织溶解物样品、组织培养细胞样品、颊拭子样品、漱口水样品、粪便样品、木乃伊化组织样品、尸体解剖样品、考古学样品、感染样品、医院内感染样品、生产样品、药物制剂样品、生物分子生产样品、蛋白质制剂样品、脂质制剂样品、碳水化合物制剂样品、无生命体物样品、空气样品、土壤样品、汁液样品、金属样品、化石样品、挖掘材料样品和／或其它地球或地球外样品。法医学样品的类型包括血液、干燥血液、血迹、颊拭子、指纹、接触样品(例如留在玻璃杯沿、棒球帽内源或烟头上的上皮细胞)、激光切开的细胞、口香糖、胃内容物、唾液、指甲刮出物、土壤、性侵样品(包括***和***上皮细胞)、头发、骨、皮肤和实体组织。环境样品的类型包括未经过滤和经过滤的空气和水、土壤、表面的拭子样品、封皮和粉末。
例如，在一些实施方式中，本文所述的方法可以提供经扩增的核酸样品，其分析产生适用于法医解释的数据，并且特别地，满足法医解释导则的数据。所述导则包括信号强度、基因座间的峰高平衡、杂合峰高比(PHR)、不完全非模板核苷酸添加(iNTA)和残迹(stutter)(Scientific Working Group on DNA Analysis Methods，Short Tandem Repeat(STR)Interpretation Guidelines(科学工作团队关于DNA分析方法、短串联重复序列(STR)的说明导则)，Forensic Science Communications，2000，2(3))。
如本文中所述的术语“核酸”意在涵盖单链和双链DNA和RNA，以及任何和所有形式的含有经修饰碱基、糖和骨架的替代核酸。因此，应理解术语“核酸”包括但不限于，单链或双链DNA或RNA(及其可部分单链或部分双链的形式)、cDNA、适体、肽核酸(“PNA”)、2’-5’DNA(具有缩短骨架的合成材料，所述骨架具有与DNA的A构象匹配的碱基间隔；2’-5’DNA通常不与呈B形式的DNA杂交，但其将容易与RNA杂交)，以及锁核酸(“LNA”)。核酸类似物包括天然核酸的具有相似或改善的结合、碱基配对杂交特性的已知类似物。嘌呤和嘧啶的“类似”形式是本领域熟知的，并且包括但不限于，氮丙啶基胞嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N.sup.6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸和2,6-二氨基嘌呤。本发明提供的DNA骨架类似物包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯、氨基磺酸酯、3’-硫缩醛、亚甲基(甲基亚胺基)、3’-N-氨基甲酸酯、吗啉基氨基甲酸酯和肽核酸(PNA)、甲基膦酸酯连接或交替性甲基膦酸酯和磷酸二酯连接(Strauss-Soukup，1997，Biochemistry36：8692-8698)和苯甲基膦酸酯连接，如美国专利号6,664,057中所述的；还可以参见OLIGONUCLEOTIDES ANDANALOGUES，A PRACTICAL APPROACH(《寡核苷酸与类似物，实践方法》)，F.Eckstein编，牛津大学出版社的IRL出版公司(IRL Press at Oxford UniversityPress)(1991)；Antisense Strategies(《反义策略》)，Annals of the New York Academyof Sciences，第600卷，Baserga和Denhardt编(NYAS1992)；Milligan，1993，J.Med.Chem.36：1923-1937；Antisense Research and Applications(《反义研究与应用》)(1993，CRC出版社)。本文中的核酸可根据本领域技术人员已知的任何方式从细胞提取或合成制备；例如，核酸可经化学合成，或从cDNA或mRNA以及其它来源转录或反转录。
在某些方面中，本文中描述了通过快速聚合酶链式反应(PCR)基本上同时扩增一种或多种靶核酸中的多个核酸基因座的方法。在一些实施方案中，此类方法包括(a)在一种溶液中使获自一个或多个来源的一种多种核酸模板的样品接触至少6种不同的引物对，每对与一个或多个核酸模板中的至少6个基因座之一杂交，其中所述引物对中的至少一种引物是经标记的，并且其中使用至少6种不同的标记；(b)在一个反应室中通过聚合酶链式反应(PCR)扩增一种或多种核酸中的至少6个多态性基因座，以产生至少6种核酸产物。样品可以具有一种或多种获自(分离自或源自)单一个体或多于一个个体的核酸。所述一种或多种核酸也可获自多个来源，例如，来自两个或更多个个体，或来自相同个体的两个或更多个不同的组织样品(例如，器官、细胞类型)。反应室可以具有一种或多种核酸的一个样品，或一种或多种核酸的多于一个的样品。例如，可使用本文所述的方法来对相同的核酸样品或对多个核酸样品进行多个基本上同时的分析(扩增)。
用于PCR扩增的引物是经特别设计与靶DNA的基因座杂交的寡核苷酸序列。这些引物作为聚合酶延伸的起点使用。为了促进对扩增(核酸)片段的分析，也可在PCR反应中使用经标记的引物。经标记的引物是耦合(或偶联)至可检测部分的寡核苷酸序列；其非限制性实例包括荧光染料、放射性标记和可鉴别的金属、核酸序列和蛋白质。用采用荧光标记引物进行PCR时，产生了带有荧光标记的扩增子(核酸扩增产物)。在一些实施方式中，在单一扩增反应中(在一个反应室中)使用至少6种、至少7种，或至少8种或更多种荧光染料。可使用一种或多种染料来产生对照序列，如测量标准或等位基因分型标准物。
引物组可以是本领域技术人员已知的用于扩增靶核酸内的多个个体基因座的任何一种，如上文所述。例如，用于扩增人核酸样品中的一个或多个基因座的引物在以下文献中有描述：美国专利号5,582,989；美国专利号5,843,660；美国专利号6,221,598；美国专利号6,479,235；美国专利号6,531,282；和美国专利号7,008,771；以及美国专利申请公开号2003／0180724；2003／0186272；和2004／0137504，所述各文献通过引用纳入本文。
此外，用于扩增病毒核酸样品中的一个或多个基因座的引物在以下文献中有描述，例如，美国专利号7,312,036；美国专利号6,958,210；美国专利号6,849,407；美国专利号6,790,952和美国专利号6,472,155，所述各文献通过引用纳入本文。
用于扩增细菌核酸中的一个或多个基因座的引物的实例在以下文献中有描述：美国专利号7,326,779；美国专利号7.205,111；美国专利号7.074,599；美国专利号7,074,598；美国专利号6,664,080；和美国专利号5,994,066中，所述各文献通过引用纳入本文。
盐和缓冲液包括本领域熟知的那些，包括分别包含MgCl2以及Tris-HCl和KCl的那些。缓冲液可以含有添加剂，如表面活性剂、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、牛血清白蛋白(BSA)和聚乙二醇(PEG)，以及本领域技术人员熟知的其它添加剂。核苷酸通常是脱氧核糖核苷三磷酸，例如，脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)和脱氧胸苷三磷酸(dTTP)，也以适当的量加至反应室用于靶核酸扩增。
可任选地将溶液加热至第一温度，并且在该温度下保持适于热启动激活核酸聚合酶的第一时段。通常，第一时段短于约90秒。第一温度可以为约90～98℃。可以在60秒或更短时间内激活的具有热启动机制的聚合酶包括利用抗体介导的热启动和适体介导的热启动机制的那些。或者，在本文中所述的方法中不需要使用热启动聚合酶。
随后，反应溶液的温度可按序在变性状态、退火状态和延伸状态之间循环预定的循环次数。在一个实施方式中，以下列第一冷却速率将一种或多种反应溶液从变性状态冷却至退火状态：约1至约150℃／秒，或约1至约100℃／秒；或约1至约80℃／秒；或约1至约60℃／秒；或约1至约40℃／秒；或约1至约30℃／秒；或约1至约20℃／秒；或约4至约150℃／秒；或约4至约100℃／秒；或约4至约80℃／秒；或约4至约60℃／秒；或约4至约40℃／秒；或约4至约30℃／秒；或约4至约20℃／秒；或约10至约150℃／秒；或约10至约100℃／秒；或约10至约80℃／秒；或约10至约60℃／秒；约10至约40℃／秒；或约10至约30℃／秒；或约10至约20℃／秒。可以下列第一加热速率将一种或多种反应溶液从退火状态加热至延伸状态：约1至约150℃／秒，或约1至约100℃／秒；或约1至约80℃／秒；或约1至约60℃／秒；或约1至约40℃／秒；或约1至约30℃／秒；或约1至约20℃／秒；或约4至约150℃／秒；或约4至约100℃／秒；或约4至约80℃／秒；或约4至约60℃／秒；或约4至约40℃／秒；或约4至约30℃／秒；或约4至约20℃／秒；或约10至约150℃／秒；或约10至约100℃／秒；或约10至约80℃／秒；或约10至约60℃／秒；约10至约40℃／秒；或约10至约30℃／秒；或约10至约20℃／秒；和／或以下列第二加热速率将一种或多种反应溶液从延伸状态加热至变性状态：约1至约150℃／秒，或约1至约100℃／秒；或约1至约80℃／秒；或约1至约60℃／秒；或约1至约40℃／秒；或约1至约30℃／秒；或约1至约20℃／秒；或约4至约150℃／秒；或约4至约100℃／秒；或约4至约80℃／秒；或约4至约60℃／秒；或约4至约40℃／秒；或约4至约30℃／秒；或约4至约20℃／秒；或约10至约150℃／秒；或约10至约100℃／秒；或约10至约80℃／秒；或约10至约60℃／秒；约10至约40℃／秒；或约10至约30℃／秒；或约10至约20℃／秒。最后，使反应溶液保持在最终状态，以提供一种或多种经扩增的核酸产物。
退火温度和时间可以影响引物与靶核酸内特定基因座结合的特异性和效率，并且对于多重PCR反应而言是重要的。完整引物对的组在退火步骤期间的正确结合可允许产生多个基因座的多重扩增，例如，一种或多种具有可接受PHR和基因座间信号强度平衡的完全STR谱。对于给定的引物对而言，在一些实施方式中，退火状态可在约50℃～70℃范围内，并且时间在短于1秒～长于30秒范围内。实际时间和温度取决于酶、引物和靶标。
延伸温度和时间可影响等位基因产物产量，并且应理解为所用酶的固有性质。对于给定的酶而言，在一些实施方式中，延伸状态可在约45℃～80℃范围内，并且时间在约短于1秒～长于30秒的范围内。实际时间和温度取决于酶、引物和靶标。为了持续预定循环次数，可以下列第三速率将反应溶液从延伸状态加热至变性状态：约1至约150℃／秒，或约1至约100℃／秒；或约1至约80℃／秒；或约1至约60℃／秒；或约1至约40℃／秒；或约1至约30℃／秒；或约1至约20℃／秒；或约4至约150℃／秒；或约4至约100℃／秒；或约4至约80℃／秒；或约4至约60℃／秒；或约4至约40℃／秒；或约4至约30℃／秒；或约4至约20℃／秒；或约10至约150℃／秒；或约10至约100℃／秒；或约10至约80℃／秒；或约10至约60℃／秒；约10至约40℃／秒；或约10至约30℃／秒；或约10至约20℃／秒。在一些实施方式中，选择预定的循环次数为约10至约50次循环，但可以视需要使用更少或更多次循环。
对于STR反应而言，可显著缩短最终延伸时间，直至不完全NTA开始增加。对于给定的酶而言，在一些实施方式中，最终延伸温度可以在约60～75℃范围内，并且时间在约0～5400秒范围内。实际时间和温度取决于酶、引物和靶标。
除上述3-步热循环方法外，本发明的方法和组合物也适用于2-步热循环方法。在该方法中，在一些实施方式中，反应溶液按序在变性状态与退火／延伸状态之间循环预定的循环次数。该方法可利用设计用于在延伸温度下退火的引物，从而允许退火和延伸步骤具有相同的温度。减少温度转变次数可以进一步缩短循环时间。
在一些实施方式中，在约5分钟～约20分钟内获得多种经扩增的核酸产物。在某些其它实施方式中，在约5分钟～10分钟，约1分钟～5分钟，或短于5分钟内获得多种扩增的核酸产物。在一些实施方式中，可从少于约10ng的靶核酸开始产生各经扩增的核酸产物。在一些实施方式中，从少于约5ng或少于约2ng的核酸，或少于约1ng的核酸，或少于约0.5ng的核酸，或少于约0.2ng的核酸，或少于约0.1ng的核酸，或少于约0.05ng的核酸，或少于约0.006ng的核酸开始产生经扩增的核酸产物。
在其它实施方案中，如在临床或环境样品中鉴定生物武器试剂，或在人类、植物和动物中诊断细菌、病毒或真菌感染，可从靶核酸的至少一个拷贝开始产生经扩增的核酸产物。例如，在多重扩增反应之前，待分析的样品可包含靶核酸的少于1000个拷贝(例如，1～1000个拷贝)、少于400个拷贝、少于200个拷贝、少于100个拷贝、少于50个拷贝、少于30个拷贝、少于10个拷贝或1个拷贝。
在前述方法中的任一方法中，热循环可进行预定的循环次数，以获得靶核酸中的基因座的充分扩增，如本领域技术人员可以容易确定的那样。例如，预定的循环次数可以在约10次和约50次循环之间的范围中，并且在一些实施方式中，约20次至50次循环之间。此外，在前述方法中的至少一些实施方式中，可以基本上同时扩增一种或多种核酸的至少2个基因座。根据所需的应用而定，可同时扩增多于四个、5～10个、10～20个、20～30个，或约10～250个基因座。例如，对于STR基因座的扩增，可以扩增10～20个基因座。
许多市售聚合酶适可用于使用本文所述方法的快速PCR应用中。在一些实施方式中，核酸聚合酶具有至少100个碱基／秒的延伸速率。大量可用于PCR扩增的聚合酶包括水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)、强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)(Pfu)、伍斯氏火球菌(Pyrococcus woesei)(Pwo)、黄栖热菌(Thermasflavus)(Tfl)、嗜热栖热菌(Themus thermophilus)(Tth)、利托氏栖热菌(Thermuslitoris)(Tli)和海栖热袍菌(Thermotoga maritime)(Tma)。这些酶，这些酶的经修饰形式，以及酶的组合，可从供应商购得，如罗氏公司(Roche)、英杰公司(Invitrogen)、恰根公司(Qiagen)、司查塔基公司(Strategene)和应用生物***公司(AppliedBiosystems)。代表性的酶包括PHUSION(马萨诸塞州伊普斯威奇的NEB公司)、HotMasterTaq.TM.艾本德公司(Eppendorf)、PHUSION Mpx(芬酶公司(Finnzymes)、PyroStart(富酶泰斯公司(Fermentas))、KOD(EMD生物科学公司(EMD Biosciences))、Z-Taq(TAKARA公司)和CS3AC／LA(密苏里州大学城的克兰泰克公司(KlenTaq))。广泛用于STR分型的PCR扩增的酶是Taq DNA聚合酶。
大量染料(多于100种)可应用于荧光激发和检测。可用染料的宽范围允许选择发射波长遍布检测范围且因此在最大发射之间具有最小重叠的染料组。经过化学修饰用于共价连接至寡核苷酸和引物的可用染料包括来自荧光素、若丹明、AlexaFluor、氟硼荧(Bodipy)、香豆素、级联染料和花青染料家族的那些。荧光染料可以购自许多商业供应商，包括英杰公司(Invitrogen)／分子探针(MolecularProbes)(加利福尼亚州卡尔斯巴德)、Anaspec公司(加利福尼亚州费力蒙)、GE医疗集团(GE Healthcare)(新泽西州皮斯卡特维镇)和皮尔斯(Pierce)／赛默飞世尔(ThermoFisher)(马萨诸塞州的沃尔瑟姆)，这些染料可以作为化学修饰衍生物(例如，亚酰胺化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯、琥珀酸亚胺酯、异硫氰酸酯)获得，以用于连接至寡核苷酸。多个公司提供此类荧光标记的寡核苷酸和化学修饰的寡核苷酸的合成(例如，加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen)、亚拉巴马州亨茨维尔的欧派龙生物技术公司(Operon Biotechnologies)；艾奥瓦州科拉尔威利的IDT公司；纽约州霍桑的基因连接公司(Gene Link)；加利福尼亚州费利蒙的AnaSpec公司；德克萨斯州刘易斯威尔的生物合成公司(BioSynthesisi))。
经化学激活(修饰)的荧光染料可在寡核苷酸的合成过程中(亚酰胺化物化学，PhAm chemistry)或在合成后(经NHS酯、琥珀酸亚胺酯或异硫氰酸酯修饰的染料)连接至寡核苷酸探针／引物。尽管第一种方法(将亚磷酰胺连接的染料基团结合至生长中的寡链中)更方便，但已充分建立激活的染料(例如，NHS酯形式)与含有5’氨基连接基团的寡核苷酸的合成后偶联。氨基由此与激活的染料反应，从而形成在PCR、杂交和其它操作过程中稳定的共价键。亚磷酰胺连接的染料实例是FAM、JOE和一些Cy染料。
荧光染料的峰激发波长通常从其峰发射波长蓝移20nm～50nm(斯托克斯位移(Stokes shift))。因此，在宽范围的发射波长内使用染料可能需要使用多个激发源，其中激发波长用于实现染料在发射波长范围内的有效激发。例如，使用常规蓝色氩激光(最大激发在488nm下)在488nm下极有效地激发FAM，而相同激光(Cy5.5最大激发在673nm下)极无效地激发Cy5.5。一种有效激发这些红移染料的方法是通过能够有效单激光发射例如FAM和Cy5.5的荧光能量转移。这可以通过将由所选光源有效激发的染料(吸收器)紧密靠近不会受到相同光源有效激发但在红移波长下发射的染料(发射器)连接来实现。紧密靠近发射器放置吸收器允许所吸收能量从吸收器转移至发射器，从而允许更有效地激发长波长染料。吸收器与发射器的最佳空间距离称为距离，并且通过将合适间隔部分置于吸收器与发射器染料之间以实验方式来确定。这些部分可以是简单的碳间隔体(例如，C3、C6、C18连接体)、寡核苷酸间隔体或经修饰的核苷酸，两种染料可以与这些部分化学连接，以维持最佳距离。吸收器与发射器染料的最佳间隔将导致吸收器的激发、能量转移至发射器以及仅发射器染料的荧光发射。如果染料间隔过开，则荧光能量转移效率较低且吸收器可在其最大荧光波长下发射。相反，若吸收器与发射器间隔过密，则可观察到荧光淬灭(无荧光／发射)。
最终，染料可以改变扩增片段的电泳迁移率。一般而言，除非经改变迁移率引起与不同基因座的扩增子的重叠，否则这并非重要问题。在这些经改变迁移率会引起重叠的相对不常见事件中，需要消除重叠的引物设计(例如，通过将碱基添加至基因座的经标记引物的5’端，以产生重叠基因座的较大扩增子)。
可以使用本领域技术人员已知的数个参数来优化本文所述的PCR扩增方法。优化这些方案的标准包括产生全部谱、信号强度、动态范围、基因座间信号强度平衡、PHR、不完全NTA、残迹和总循环时间(Hill，CR，Bulter，JM，Vallone，PM.A26plex Autosomal STR Assay to Aid Human Indentity Testing(26重常染色体STR试验以协助人类鉴定测试).J Forensic Sci54：1008-1015.2009.Brownstein，MJ，Carpten，JD，Smith，JR.Modulation of Non-Template Nucleotide Addition by Taq DNAPolymerase：Primer Modifications that Facilitate Genotyping(通过Taq DNA聚合酶的非模板核苷酸添加的调节：促进基因分型的引物修饰).BioTechniques30：1004-1010.1996.SWGDAM Interpretation Guidelines for Autosomal STR Typing by ForensicDNA Testing Laboratories(通过法医DNA测试实验室对常染色体STR分型的说明导则).2010.http：／／www.fbi.gov.／about-us／lab／codis／swgdam-interpretation-guidelines)
在一些实施方式中，至少10次、20次或30次多重PCR循环的总循环时间可在约1分钟～约90分钟范围内。在一些实施方式中，至少10次、20次或30次多重PCR循环的总循环时间在以下范围内：约1分钟～约90分钟；或约1分钟～约85分钟；或约1分钟～约80分钟或约1分钟～约75分钟；或约1分钟～约70分钟；或约1分钟～约65分钟；或约1分钟～约60分钟；或约1分钟～约55分钟；或约1分钟～约50分钟；或约1分钟～约45分钟；或约1分钟～约40分钟；或约1分钟～约35分钟；或约1分钟～约30分钟；或约1分钟～约25分钟；或约1分钟～约20分钟；或约1分钟～约15分钟；或约1分钟～约10分钟或约1分钟～约5分钟。在其它实施方式中，至少10次、20次或30次多重PCR循环的总循环时间小于约90分钟。在其它实施方式中，至少10次、20次或30次多重PCR的总循环时间小于约89分钟、85分钟、80分钟、75分钟、70分钟、65分钟、60分钟、55分钟、50分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟或1分钟。
考虑本文中所述的方法可使用常规PCR热循环仪(如，PCR***9700(加利福尼亚州福斯特城的应用生物***公司(Applied Biosystems)))来进行。每个反应室可以包含在薄壁反应管内。薄壁反应管的壁厚度优选小于约200μm。优选地，薄壁反应管的壁厚度优选小于约100μm。
本文中的PCR扩增方法还考虑使用微流体芯片，如以下文献中所述的那些来进行：标题为“Methods for Rapid Multiplexed Amplification of Target Nucleic Acid(用于靶核酸的快速多重扩增的方法)”的申请序列号12／080,746和标题为“UnitaryBiochips(整体型生物芯片)”的申请序列号13／044,485，这两篇文献通过引用纳入本文。每个反应室可包含在生物芯片(例如，微流体生物芯片)内。
在一些实施方式中，可使用生物芯片来实施本发明的方法。某些生物芯片设计可以实现微流体领域的基本目标：在复杂过程中整合一些或在一些实施方式中所有步骤，从样品***至结果产生，在单一仪器中进行而无操作者介入。在一些实施方式中，生物芯片可经完全整合并且能够进行复杂的样品入-结果出(sample in toresults out)分析，包括细胞裂解、DNA纯化、多重扩增和电泳分离及检测，以从法医样品产生短串联重复序列序列(STR)谱；细胞裂解、DNA纯化、多重扩增、桑格(Sanger)测序、超滤以及电泳分离和检测，以从临床样品产生DNA序列；核酸纯化、逆转录、多重扩增、桑格(Sanger)测序、超滤以及电泳分离和检测，以从生物威胁样品产生DNA序列；以及核酸纯化、文库构建和单分子测序，以从人类、细菌和病毒临床和研究样品产生基因组DNA序列。
在一些实施方式中，在生物芯片中进行样品操作，包括核酸提取的组合；细胞裂解；细胞分离；差别细胞裂解；差别过滤；总核酸纯化；DNA纯化；RNA纯化；mRNA纯化；蛋白质纯化；核酸扩增前净化；核酸扩增(例如，单重和多重端点PCR、实时PCR、反转录PCR、不对称PCR、巢式PCR、LATE PCR、降落式PCR、数字PCR、滚环式扩增、链替代扩增和多重置换扩增)；Y-STR扩增；微型-STR扩增；单核苷酸多态性分析；VNTR分析；RFLP分析；核酸扩增后净化；核酸测序前净化；核酸测序(例如，桑格(Sanger)测序、焦磷酸测序和单分子测序)；核酸测序后净化；反转录；反转录前净化；反转录后净化；核酸连接；SNP分析；核酸杂交；电泳分离和检测；免疫分析；结合分析；蛋白质分析；酶促分析；质谱；以及核酸和蛋白质定量。
在一些实施方式中，生物芯片允许纯化、操作和分析来自未经处理生物样品的核酸和其它生物成分。未经处理生物样品是由个体收集并且随后***生物芯片的不具有中间处理步骤的样品接收室中的那些(但样品收集器在处理前可以经标记和／或存储)。操作者仅需收集或以其它方式获得样品，将该样品***装置中，将该装置***仪器中(如果预先将该装置置于该仪器中，则无需此步骤)，并按压启动按钮。在***装置中之前无需处理、操作或修饰样品，操作者不必切割拭子，打开采血管，收集组织或生物流体，将样品转移至另一个夹持器，或将样品暴露于试剂或条件(例如，热、冷、振动)。因此，操作者无需在生物科学或实验室技术方面经过广泛训练。可任选地，生物芯片可以接受处理过的生物样品(例如，供于随后纯化的细胞溶解物)，但这些应用可能需要经技术训练的操作者。
实际上，使用大量收集装置收集生物样品，这些装置全部可与本文所述方法一起使用。收集装置通常是市售可得的，但也可以是为了给定的应用而特意设计和制造的。对于临床样品，可以获得多种商业拭子类型，包括鼻、鼻咽、颊、口腔液、粪便、扁桃体、***、子宫颈和伤口拭子。样品收集装置的尺寸和材料不同，并且装置可以含有专门的手柄、盖、用于促进并引导破裂的刻痕和收集基质。将血样收集在多种不同容积的市售管中，这些管中的一些含有添加剂(包括抗凝剂，如肝素、柠檬酸盐和EDTA)、促进样品进入的真空、促进针***塞子和保护操作者免于暴露至样品的覆盖物。将组织和体液(例如，痰液、脓性材料、抽吸物)也收集于通常与采血管不同的管中。通常将这些临床样品收集装置发送至高级医院或商业临床实验室以供测试(但可以在护理点进行某些测试，例如评估喉／扁桃体拭子，以供快速链球菌测试)。环境样品可以以下列形式存在：过滤器或滤筒(例如，来自吸气装置、气溶胶或水过滤装置)、拭子、粉末或流体。
常见法医证据收集技术使用拭子实施。拭子可以购自Bode(坎布里亚郡洛顿)、Puritan(緬因州吉尔福德)、Fitzco(明尼苏达州斯普林公园)、Boca(佛罗里达州科勒尔斯普林斯)、Copan(加利福尼亚州穆列塔)和Starplex(加拿大安大略省怡陶碧谷)。也可以使用纱样材料、可弃式刷子或市售生物取样试剂盒来进行擦拭。法医样品可以含有血液、***、上皮细胞、尿液、唾液、粪便、各种组织和骨头。常常使用颊拭子亲自从存在的个体收集生物证据。广泛使用的商业颊拭子收集是SecurSwab(弗吉尼亚州洛顿的博德技术基团(Bode Technology Group))。颊样品通过指导个体或操作者将拭子置于口内面颊内表面上并上下移动拭子一次或多次来收集。
在一些实施方式中，在本文所述的方法中使用生物芯片，以对多个平行样品实行复杂处理。在一些实施方式中，使用相同的操作组处理多个样品，或者使用定制的操作组处理每个样品(或样品子集)。在一些实施方式中，对给定的样品进行若干独立的分析。例如，可通过分离DNA且随后对纯化材料进行STR分析、SNP分析和线粒体测序来分析法医样品。相似地，可通过纯化核酸和蛋白质以及进行PCR、反转录PCR、DNA测序和免疫试验来分析临床样品，从而允许(例如)在单一生物芯片上同时针对大量病原体和细胞过程来探查给定的样品。
可向生物芯片操作和数据分析提供一系列的软件和韧件。仪器硬件是通过支配组件功能并实施仪器自我测试的软件和韧件来控制。自动化脚本控制仪器与生物芯片的所有相互作用，包括施加所有脚本化过程步骤。分析软件实施原始数据的处理(例如，电泳图的色彩校正)与分析试验结果(例如，确定片段大小、STR等位基因调用、DNA序列分析)二者。仪器可含有图形化使用者界面，该界面允许使用者起始过程并且告知使用者过程状态。最终，***可以存储相关分析比较物(例如，来自感兴趣个体的STR谱或病原体的DNA序列)，或***可输出结果，用于外部数据库匹配和进一步分析。
以下实施例用于说明本发明具体实施方式及其各种用途。其仅出于解释的目来说明，并不认为限制本发明。
实施例
实施例1
在5-色扩增和分离和检测***中对同时多重扩增的STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta B、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、D8S1179、FGA和SE33以及釉原蛋白基因座的荧光检测。
该多重设计中的第一步骤需要选择基因座。使用几个标准，从几十万可用多态性基因座中选择，但主要的辨别因素是每一个基因座的多态性程度。具有较多展示较相似频率的等位基因的基因座显示较高的杂合性(Wier，BS.GeneticData Analysis II(《遗传学数据分析II》)，第4章，第141页，Sinaeur联合公司，出版社1996)和较高的多态性信息含量(Botstein，D，White，RL，Skolnick，M，Davis，RW.Construction of genetic Linkage Map in Manu Using RestrictionFragment Length Polymorphisms(使用限制性片段长度多态性构建摩奴(Manu)的遗传学连锁图)，Am J Hum Genet32：314-331，1980)。这个性状在使DNA样品源彼此匹配方面提供了显著优势。个别基因座的高多态性信息含量在包括有关个体的亲子和亲属关系分析中尤为重要，因为基因组仅适应有限数目的对于这些分析优选的未连锁基因座。因此，一般而言，除非其他因素影响选择，否则选择具有许多等位基因的高多态性基因座。
另一个重要因素是在美国和全世界纳入用于法律执行目的的基因座。并非所有国家使用相同的STR基因座组来用于鉴定。不同国家使用不同基因座组的事实会降低用一国收集的谱搜索另一国数据库的实用性。通过产生包括全部美国标准STR基因座和所有常规地用于全世界管辖区的基因座的引物组，搜索数据库并鉴定个体的信息量将大得多。这种方法在移民测试以及与国际犯罪有关的样品测试方面提供了额外的使用优势，这是因为多重物含有用于搜索全世界数据库的合适基因座。
设计含有25个STR基因座和釉原蛋白基因座的多重物，如表3中所示。该多重物包括美国CODIS数据库中接受的所有13个STR基因座(表3，美国CODIS栏)以及由欧洲DNA分析工作组(EDNAP)和欧洲法庭科学研究所联盟(ENFSI)针对欧洲国家的标准化推荐的那些[Schneider，PM.Expansion ofthe European Standard Set ofDNADatabase Loci-The Current Situation.Profiles in DNA(现状：DNA数据库基因座的欧洲标准组的扩张)，普洛麦格公司(Promega Corporation)，2009年3月.http：／／www.promega.com／resources／articles/profiles-in-dna／2009／expansion-of-the-european-standard-set／](表3，欧洲ENDAP／ENFSI栏)。奥地利国家数据库集合中包括3个不同基因座，且德国数据库中包括一个不同基因座SE33。最后，还包括五核苷酸基因座，其用于评价在扩增的等位基因之间观察到的增加的分离。
表3.基因座选择
将STR基因座置于多重物中是基于若干考虑，包括分离***中可检测片段的范围、分离***的分辨力(其可以基于两个待辨别片段的分子量而变化)以及在电泳分离的情况下可在分离期间检测的荧光染料的数目。25STR／釉原蛋白多重物将4个和5个具有相对较少且罕见的微变异等位基因(即，不与其它等位基因相差整数重复长度的等位基因)的碱基重复基因座置于较大扩增子位置中。该方法提供通过将较高分子量范围内的等位基因置于通常具有最低分辨力的区域中来优化分析这些等位基因(对于给定分离平台和给定分离时间)的优势。放置额外四个和五个具有在高分子量范围内的相对较少且罕见的微变异等位基因的重复基因座，同时放置含有三个碱基重复(即，D22S1045)的高多态性基因座和显示较高频率的较低分子量范围的微变异基因座的基因座是该多重设计的重要方面。相同设计特性允许在所包括基因座的整个范围内较快速地分离等位基因，这是因为高分子量范围内的具有5-碱基分离的等位基因比更常用的4碱基或3碱基STR重复更容易分离。该方法允许改进多重设计的高分子量区域的用途，从而允许包含较多具有高多态性特性的经染料标记的基因座，并且最终允许在多重物中包含较多这样的基因座。25个STR基因座以及釉原蛋白基因座用总共4种颜色标记(使用第5种颜色来标记大小标志物)，并且在74个碱基～485个碱基的总分子量范围内放置。我们还将最不常用的基因座放置在较大扩增子位点的位置中，以限制降解样品消除一些高分子量信息的情况中的信息损失。
图1说明允许在单一反应中共扩增26个基因座的设计。第一张图指示FAM标记的基因座，包括对于基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta B的那些，第二张图显示JOE标记的基因座，包括基因座TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C的那些，第三张图显示以羧基-四甲基若丹明(TMR)标记的基因座，包括基因座D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、釉原蛋白、Penta D的那些，第四张和第五张图显示以下基因座的用5，6-羧基若丹明6G(CXR)标记的基因座：D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、D8S1179、FGA和SE33。第6张图显示构成分析涉及的大小标志物的CC5-标记的片段。
构建多重STR组可能需要消除因混合物中意外引物相互作用产生的矫作物。例如，在聚合酶链式反应期间，一个基因座的标记引物可与另一个基因座的未标记引物协同作用以扩增不期望的序列。这可发生于基因组靶DNA，但更可能因反应期间设计的扩增子的浓度增加而发生；这种增加会向待发生的非有意扩增事件提供较高浓度的模板(产生矫作物)。这些矫作物在产生后，与冒犯性(offending)引物对完美匹配且在随后多轮扩增中有效地扩增。
鉴定两个在多重物中产生所讨论的具体矫作物的引物有助于解决这样的矫作物。这通过从混合物***地消除个别引物或引物组直至鉴定两个存在和不存在分别与矫作物的存在和不存在对应的具体引物来实现。在鉴定成因性引物后，可以以多种方式消除矫作物。这些方式包括(1)较少地使用引物对中含有冒犯性引物的那些，(2)通过将碱基添加至3’末端或通过完全重新设计成新结合位点来改变一个或两个冒犯性引物的序列；(3)将引物对中的经标记引物改变成未经标记的引物，并且将未经标记的引物改变成经标记的引物(由此使矫作物不可检测)，或(4)改变一对或两对中经标记引物与未经标记引物的比例，以减少不期望产物的产生。使用经验分析来确定实现每个矫作物或矫作物组的矫作物减少的最有效手段。
基因座-基因座间的平衡也是产生法医学上有用的多重组的重要属性。就此而言，初始引物设计包括设计在各自熔化温度中彼此相似的引物。将扩增过程中所用的退火温度设定于低于此熔化温度以确保所有引物靶标主要处于具有互补引物的双重状态而非变性状态。即使如此，每次循环的相对扩增效率可以在不同的基因座之间有所不同，从而产生一些基因座的表现大于其它基因座的最终多重扩增产物。一种克服该不平衡方式是增加一些引物的浓度，同时降低其它引物的浓度，以补偿一些影响扩增过程的其它因素。该方法具有局限性，这是因为不可能将扩增效率提高至每轮扩增增加超过2倍。
将26个STR基因座中每一个的引物序列合并至包括表4中所列引物序列的单一溶液中。
表4
使用该26-重25-STR溶液，在单一反应容器中同时于以下个别基因座处扩增人基因组DNA模板(株系9947)：D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta B、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、釉原蛋白、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、D8S1179、FGA和SE33。在微流体生物体芯片中的7μl反应中进行PCR扩增。以玻片模式注入来模制PCR生物芯片(图2A)，并且使用图2B的快速热循环仪顺利地测试快速多重PCR。该生物芯片厚25mm×75mm×1.1mm。该***允许从单一基因组当量的人DNA(6pg DNA，基本上为单拷贝检测极限)多重扩增STR片段。基本上如以下文献中所述来实施反应：Giese，H.，等(2009).“Fastmultiplexed polymerase chain reaction for conventional and microfiuidic short tandemrepeat analysis(用于常规和微流体短串联重复序列分析的快速多重聚合酶链式反应)”J Forensic Sci54(6)：1287-96。施加三十一次循环方案，以使反应在热循环室内循环，从而产生经标记的扩增子。循环条件如下：热启动93℃×20秒，之后31次循环(93℃×4秒、56℃×15秒以及70℃×7秒)，之后70℃×90秒的最终延伸。也可以参见标题为“Methods for Rapid Multiplexed Amplification of Target Nucleic Acids(用于快速多重扩增靶核酸的方法)”的申请序列号12／080,746和标题为“UnitaryBiochips(整体型生物芯片)”的申请序列号13／044,485，所述两篇文献通过引用纳入本文中。如以下实施例6中所述，使用网络百奥公司（NetBio)的Genebench-FX分离并检测扩增产物。
图3显示对所得26-重反应物的每个基因座的扩增产物的色彩校正扫描。使用26-基因座引物组来扩增每个基因座的片段，这些片段是利用网络百奥公司（NetBio)GeneBench FXTM仪器来分离并检测的。第一张图显示以FAM标记的峰，包括基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta B的那些峰，第二张图显示以JOE标记的峰，包括基因座TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、PentaC的那些峰，第三张图显示羧基-四甲基若丹明(TMR)标记的峰，包括基因座D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、釉原蛋白、Penta D的那些峰，第四张和第五张图显示用5，6-羧基若丹明6G(CXG)标记的峰：基因座D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、D8S1179、FGA和SE33。第6张图显示构成大小标志物的CC5-标记的片段。
实施例1显示有效共同扩增是利用25个不同STR基因座和釉原蛋白基因座实现的，并且分离并检测这些产物。这显示所用引物序列经过足够充分设计并平衡，以产生26个基因座中每一个的扩增产物，其具有与扩增材料中观察到的局部背景噪音不同的片段。由于扩增材料是来自人类品系9947的已知标准DNA，因此预计片段已知且经验证。然而，限制至5种染料会使得难以理解一些样品，因为CXR标记的D8S1179、FGA和SE33等位基因范围各自与其它六个经CXR-标记的基因座中的一个或多个显著重叠。实施例2克服了该限制，其采用6种荧光染料，以允许将每一个基因座的等位基因在每种个别染料内完全分离成独特大小范围。
实施例2
25-STR基因座多重物
实施例2展示了25个不同的人STR基因座与釉原蛋白基因座的共扩增，以及共扩增产物分离成不同等位基因大小范围及其检测，这些范围不具有经相同染料标记的相邻等位基因的重叠。该基因座组包括完整的13个CODIS基因座、8个额外的欧洲、奥地利和德国标准或经提议的标准基因座、4个Penta基因座和允许性别鉴定的釉原蛋白。该方法允许结合法医分型方法并在美国与全世界许多国家和组织之间共享较多有用数据。可以使用多重物来分析DNA样品，然后支持在欧洲、美国和全世界的数据库中进行搜寻，以支持在所有这些管辖地的法律执行、反恐和国土安全努力。
在6色扩增及分离及检测***中对同时多重扩增的基因座釉原蛋白、D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta B、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、D8S1179、FGA和SE33的荧光检测。该多重设计实施例是由共扩增与实施例1中所述相同的基因座的引物构成。其不同之处在于基因座D8S1179、FGA和SE33是利用含有被用于这3个基因座的第6种染料标记的引物代替ROX标记的如实施例1中的引物的引物对来扩增。第6种染料是DyLight633，但必要时可利用诸多其它染料。除此第6种染料外，该多重物中的其它染料是FAM、JOE、TMR、CXR和CC5。
图4说明在研发本发明多重***中所用的方法的优点。用于标记各列中特定基因座的染料列示于左栏中(A488代表ATTO488染料)。可从图顶部显示的标度确定各基因座的大致的等位基因大小。在多重物中放置若干高多态性基因座(各自呈现出许多等位基因在个体群中)极为合意。然而，在分离期间较高分子量范围的DNA片段的分辨力丧失产生可行扩增子大小范围的上限，因此限制可明显分离和分析的各荧光染料标记的基因座的数目。增加染料数目是克服该限制的一种方式(一种替代方法是增加由电泳***分离的有效MW范围)。包括第6种荧光染料偶联至D8S1179、FGA和SE33基因座的特定引物允许发生共扩增和分别呈现，而不产生重叠等位基因的扩增子，即产生一个基因座的等位基因出现在用相同染料标记的引物的另一个基因座的等位基因的大小范围内。
换言之，这种25-基因座分析是实质上非重叠STR分析。实质上非重叠分析的价值在于其基本上消除以相同方式标记的相邻基因座的重叠等位基因产生混淆的可能性。仅超出STR基因座大小范围的罕见等位基因可引起此混淆。我们实施例5的27重分析的设计具有4个这样的罕见重叠等位基因，16重ABI Identifiler分析具有至少6个罕见重叠等位基因，及Powerplex16重分析具有8个这样的罕见重叠等位基因。这些罕见等位基因中的大多数以基于一次或几次出现报道于文献中。因此，设计多重物以允许评估大量STR基因座，同时维持实质上非重叠分析是本发明的主要优点。
除实施例1的分析以外，实施例中提供的所有STR分析是实质上非重叠的。因此，代表等位基因的片段是通过大小或颜色或二者可靠地分离以用于可视化和分析。这是可能的，因为对于多重物中包括的基因座而言，许多群体中的实质性群体数据是可获得的。不使用这些数据时，需要实质上彼此分离等位基因范围，从而允许每一种颜色中展示的较少高多态性基因座，或在将其紧靠放置时，会产生相同颜色的相邻基因座的等位基因大小范围实质性重叠的风险。
在该实施例中，在单个反应容器中同时在以下的单个基因座处扩增DNA模板(株系9947)：用FAM标记的D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta B基因座，用JOE标记的基因座TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441和PentaC，用TMR标记的基因座D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、釉原蛋白和PentaD，用CXR标记的基因座D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO和Penta E，以及用第6种染料标记的基因座D8S1179、FGA和SE33。如实施例1中所述进行PCR扩增。将扩增的产物与经CC5-标记的大小标志物混合，然后按照实施例1中所述的，使用网络百奥公司(NetBio)的Genebench-FXTM来分离并检测。
实施例3
35-STR基因座多重设计
在8色扩增及分离及检测***中对同时多重扩增的以下基因座的荧光检测：D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta B、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、釉原蛋白、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、D8S1179、FGA、SE33、D17S974、D9S1122、D14S1434、D4S2408、D9S2157、D20S1082、D6S1043、D1SGATA113、D10S1435和D11S4463。这个35-重设计包括实施例1和2中的25个STR基因座和釉原蛋白基因座加上9个额外的STR基因座。
图5展示了采用8种染料标记经扩增基因座组的产物的设计(参见，标题为“Methods for Rapid Multiplexed Amplification of Target Nucleic Acids(靶核酸的快速多重扩增方法)”的申请系列号12／080,746，通过引用纳入本文)。基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045和Penta B用染料1标记，TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441和Penta C用染料2标记，D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、釉原蛋白和Penta D用染料3标记，D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO和Penta E用染料4标记，D8S1179、FGA和SE33用染料6标记，D17S974、D9S1122、D14S1434、D4S2408、D9S2157和D20S1082用染料7标记，以及D6S1043、D1SGATA113、D10S1435和D11S4463用染料8标记。大小标准物用染料5标记。
D6S1043基因座与染色体6上的SE33基因座物理上靠近并且可以与其遗传连接。该多重***中包括的D6S1043基因座是在中国使用的。D17S974、D9S1122、D14S1434、D4S2408、D9S2157、D20S1082、D1SGATA113、D10S1435和D11S4463基因座已经由Hill等(2009，见上文)报道。这些基因座均与多重组中包括的所有其它基因座的位置相距实质性的物理(染色体)距离，从而使得不可能与多重物中的其它基因座产生遗传连锁。
多重***中纳入34个STR基因座和釉原蛋白基因座相对于之前开发的STR多重组增加了显著的复杂性。混合物中包括至少70种引物，从而导致同时共扩增而没有矫作物生成的有害后果。纳入8种单独染料标记，以便利用每一种扩增较少的基因座，由此允许限制高分子量扩增子的大小。这进而允许较快速且精确地分离扩增产物。
实施例4
在8色扩增、分离和检测***中对同时多重扩增的以下基因座的荧光检测：D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、Penta B、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、釉原蛋白、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、Penta E、D8S1179、FGA、SE33、DYS391、D6S1043、DYS439、DYS389II、DYS19、DYS392、DYS393、DYS389I、DYS390、DYS385a、DYS385b、DYS437和DYS438。
这个38-重设计包括实施例1和2的25个STR基因座和釉原蛋白基因座、实施例3的D6S1043基因座和11个额外的Y染色体STR基因座。
在研究男性至男性遗传时，Y染色体基因座可以有效确定亲属关系。组合的体染色体STR和Y STR多重物在这个多维分析中提供了额外的实用性。可以使用这些Y STR基因座来建立叔伯关系、祖孙关系、堂兄弟关系和同父异母兄弟关系以及其它关系。已经使用Y STR在若干代时段内建立亲属关系。尤其当分析中缺少中间男性亲属时的二人分析(例如，伯叔父与侄子，没有来自伯叔父的兄弟(即，侄子的父亲)的样品)是有帮助的。其还提供附加价值，这是因为其可以用于确定父系的地理祖先。因此，这些基因座在研究分析和亲属关系确定中极其有用。
该实施例使用8种染料来标记扩增的基因座组的产物。这使得能够离散地分离并检测利用每一种染料标记产生的经扩增产物。
图6展示采用8种染料标记的经扩增基因座组的产物的设计。基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045和Penta B用染料1标记，TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441和Penta C用染料2标记，D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、釉原蛋白和Penta D用染料3标记，D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO和Penta E用染料4标记，D8S1179、FGA和SE33用染料6标记，DYS391、D6S1043、DYS439、DYS389II、DYS19和DYS392用染料7标记，并且DYS393、DYS389I、DYS390、DYS385、DYS437和DYS438用染料8标记。大小标准物用染料5标记。
多重***中纳入38个STR基因座和釉原蛋白基因座相对于先前研发的STR多重组增加显著复杂性。混合物中包括至少76种引物，从而导致同时共扩增而没有矫作物生成的有害后果。纳入8种单独染料标记，以便利用每一种扩增较少的基因座，由此允许限制高分子量扩增子的大小。这进而允许较快速其精确地分离扩增产物。
实施例5
基因座选择和多重设计
主要基于STR基因座在美国和欧洲数据库中接受的用途来选择STR基因座用于纳入27-基因座多重物中。这些基因座列于表5中，并且包括13个CODIS核心STR基因座(Budowle等，Population Data on the Thirteen CODIS Core Short TandemRepeat Loci in African-Americans，US Caucasians，Hispanics，Bahamians，Jamaicans，and Trinidadians(关于非洲裔美国人、美国白种人、西班牙人、巴哈马人、牙买加人和特立尼达岛人的十三个CODIS核心短串联重复基因座的人口数据库).JForensci Sci.1999；44：1277-86)、欧洲标准12个STR基因座(其中7个与CODIS基因座重叠)、用于奥地利数据库中的釉原蛋白基因座、D2S1138和D19S433基因座以及用于德国数据库中的SE33基因座(Parson等，Efficient DNA database laboratorystrategy for high through-put STR typing of reference samples(用于参考样品的高流通量STR分型的有效DNA数据库实验室策略).Forensic Sci Int.2001；122(1)：1-6；Schneider.Expansion of the European Standard Set of DNA Database Loci-the CurrentSituation(现状：欧洲DNA数据库基因座标准组的扩大).Profiles in DNA.2009；12(1)：6-7)。另外，包括Penta D、Penta E和DYS391基因座，最近提议将其纳入扩展的CODIS核心STR组中(Hares.Expanding the CODIS core loci in the United States(美国CODIS核心基因座的扩大).Forensic Sci Int Genet.2012；6(1)：e52-4)，也包括常用于中国的D6S1043基因座和额外的五核苷酸序列基因座Penta C(因为其大重复长度)。
建立允许共扩增27个基因座的多重设计需要迭代(iterative)引物设计和测试。扩增产物小于500个碱基，这是因为法医样品提取物有时候含有不大于该长度的DNA样品。从检查每一个基因座可用的NIST STR基础数据和NCBI DNA序列来确定每一基因座的最小和最大扩增子长度需要(国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)主页：http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／unists／；国家标准技术研究所(National Institute for Standards and Technology)主页：http：／／www.cstl.nist.gov／strbase／)。在一些情况中，与由市售等位基因分型标准物代表的范围相比，该多重物中扩增子范围实质上有所扩展，这是因为已经在引入商业试剂盒后发现了新的等位基因。尽管在该实施例中所述多重物中纳入11个额外的基因座并且放大个别基因座指定的扩增子范围，但27-重分析在整个毗邻基因座内仅仅具有4个潜在等位基因重叠的情形，并且这些情形仅仅会发生在极其罕见的等位基因。这与Identifiler试剂盒相比较为有利，其中6对相邻基因座具有潜在重叠；以及与Powerplex16***相比也较为有利，其中8对相邻基因座具有潜在重叠，两个试剂盒与27基因座分析相比均具有低得多的STR基因座大小范围总和和多重密度，并且具有更多基因座-基因座重叠。
为适应大量基因座和所选基因座方法的扩增子大小范围，使用6种荧光染料来标记PCR引物。多重设计以示意图的形式展示于图7。图7显示了27-基因座多重设计。代表所有27个基因座的等位基因的扩增产物的近似大小范围展示于大小标志物上方。每个大小标志物片段以其对应碱基大小显示。用于标记每一个扩增子的荧光染料指示在每个各自的基因座名称的左侧。采用以下基因座缩写：A=釉原蛋白，D10=D10S1248，D22=D22S1045，Y=DYS391
表5.所选基因座
实施例6
5、6和8色光学检测和电泳仪器。
使用网络百奥公司(NetBio)的Genebench-FXTM分离并检测实施例1的扩增产物。针对STR分析、DNA测序和SNP分型开发并优化该仪器并且已经针对实验室和场向(field-forward)利用进行强化，这描述于Giese等(2009)“Fast multiplexedpolymerase chain reaction for conventional and microfluidic short tandem repeatanalysis(用于常规和微流体短串联重复序列分析的快速多重聚合酶链式反应).”J Forensic Sci54(6)：1287-96以及标题为“Ruggedized Apparatus for Analysis ofNucleicAcids and Proteins(用于核酸和蛋白质分析的强化设备)”的申请序列号12／080,745，标题为“Integrated Nucleic Acids and Proteins(经整合的核酸与蛋白质)”的申请序列号11／132,712，标题为“Plastic Microfluidic Separation and Detection Platforms(塑料微流体分离和检测平台)”的申请序列号12／080,751，标题为“Integrated Nucleic AcidAnalysis(经整合的核酸分析)”的申请序列号12／080,751和标题为“UnitaryBiochips(整体型生物芯片)”的申请序列号13／044.485，所有这些文献通过引用纳入本文。向2.7μL的每种扩增产物中，添加9.87μL甲酰胺和1.02μL CC5-ILS(内泳道标准物，Promega公司，目录编号DG1521)。将样品加载至分离生物芯片中并通过施加90秒的350V／cm电场电泳移动至分离通道中。此后沿着分离通道施加150V／cm电场，以分离DNA片段。在50℃下实施所有分离。利用固态(488nm)激光激发连接分离至产物的染料并且通过二色滤波器和带通滤波器以通过波长分离荧光，并且通过一组5个光电倍增管检测。使所得谱经过数据处理和色彩分离软件以展示其各自的染料代表的片段。
Genebench FX仪器针对场向应用进行强化，具有低功耗，并且在Low VoltageDirective72／23／EEC下进行CE标记。为进行分离和检测，将微流体生物芯片置于仪器的生物芯片室中。生物芯片室提供高电压、激发和检测以及热子***与生物芯片的耦合。通过一组电极板将高电压施加于生物芯片。通过芯片室的封盖上的弹簧针连接(pogo pin connection)实现仪器与生物芯片之间的接触。高电压子***允许将至多10KV施加于分离通道，并且可任选地将至多1.5KV施加于样品加载通道。也可以使用气动压力将样品加载至分离通道中。预先编程的脚本通过控制转化构造、电压水平和电源定时来允许自动化操作。将一组电阻箔加热器安装至生物芯片室内的加热板上，以提供生物芯片的精确且一致的加热。
由激光器、检测器和光学元件串(optical train)组成的光学***提供经染料标记的DNA分子的激光激发和荧光检测，这些分子以电泳方式沿着分离通道运行至生物芯片的激发和检测窗口。光学激发通过200mW488nm激光(加利福尼亚州圣克拉拉的相干公司(Coherent))来完成。多色检测是通过一组二色镜、带通滤波器(佛蒙特州布拉特尔伯勒的欧米茄光学公司(Omega Optical))和5个光电倍增管(PMT)(新泽西州布里奇沃特的滨松公司(Hamamatsu))完成。一组透镜、电流计和10X物镜将生物芯片与激光器和检测器耦合。检测是使用步进凝视法(step-stare approach)来实现，其中电流计经过安置，以激发第一通道且经固定积分时间从该通道收集荧光。然后，电流计经布置以从毗邻通道激发并收集荧光，并且重复该过程直至探查生物芯片中的所有通道。除了单-或多色定量外，该光学构造还能够进行4-色DNA序列分析，1-5色SNP分析，以及4-和5-色多重DNA片段的大小检测分析。
在基于对Genebench FX光学元件串的改进的仪器上分离6-和8-色反应的扩增产物。该方法描述于标题为“Integrated Nucleic Acid Analysis(经整合的核酸分析)”的美国专利8,018,593中。经过改进的仪器是基于对由摄谱仪组成的检测***的研发，所述摄谱仪具有色散光栅和线性阵列检测器，以替代Genebench FX仪器的二色镜、带通滤波器和离散光电倍增管检测器。
选择具有以下规格的摄谱仪(图8A)：
·像差校正凹面全讯光栅。该光栅设计允许具有单一光学元件的摄谱仪。
·固定光栅座。将光栅牢牢地安装于摄谱仪内并锁定位置。通过释放光栅座上的锁紧螺丝并旋转光栅来针对波长校准调节光栅定向。牢牢地安装光栅以增加摄谱仪的坚固性。
·焦距。选择100mm焦距摄谱仪，以满足分辨力需要(1nm至5nm)，同时维持最小覆盖区。
·针孔。摄谱仪入口处的1.0mm针孔允许最大光收集和背景光减少。
·输出窗。32mm×10mm的输出窗允许波长分离光成像至线性阵列检测器。
·检测器安装。4个螺纹螺丝孔位于摄谱仪的输出窗附近，以用于安装线性阵列检测器。
选择像差校正凹面全息光栅用于摄谱仪。光栅规格为：
·影像平面处的平面场。这些光栅校准来自入口狭缝的光，并且将其重新聚焦至平面表面上以用于直接成像至线性阵列检测器上(图8B)。
·大小。42.4×42.4mm光栅允许最大光收集。
·槽密度。1200槽／mm光栅允许满足波长范围和分辨力需要。
·闪耀波长。选择450nm的闪耀角，以实现以可见范围为中心的峰光栅效率。
·色散。实现通过槽密度界定的7nm／mm色散。这允许224nm的波长范围于输出处在32mm影像平面内成像。
·波长范围-350nm～850nm的波长范围允许分离可见染料的发射光谱(在520nm至700nm范围内)并针对波长校准检测激光发射(488nm和514nm)。
Genebench FX的光学基板经过改进，以适应经整合的波长分离和检测模块。将安装支架设计并制造成将经整合的检测模块安装于基板上。整合检测模块位于基板上，使得输入口的位置保持在Genebench的检测路径长度。将设计并制造的支架上的镜子安装在基板上。该镜子允许仪器容易地被构造，以使用整合波长模块或现有滤波器和离散PMT来操作(图8C)。光学元件串的这些改进产生图8D中所示的束径。
在一些实施方式中，利用总共9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40种或更多种荧光染料来标记引物。可以施用摄谱仪、光栅、检测器和激光器的各种构造和组合，以从这些数目的荧光染料产生和收集荧光。光栅参数规格允许波长范围和中心波长界定波长范围和中心波长。可以通过扩展光栅的波长范围检测最大染料数目。压缩波长范围允许较高波长分辨力。波长范围移位至较低波长将允许检测紫外染料，而波长范围移位至较长波长允许检测近红外和红外染料。利用光栅调节中心波长与波长范围二者的能力允许检测紫外、可见、近红外和红外染料。多个摄谱仪、光栅和检测器模块可以串联实施以实现宽波长范围和高波长分辨力检测，从而适应大量染料的检测。在该构造中，入射荧光用二色镜***，并且该光的每一部分随后入射至摄谱仪、光栅及检测器模块中的一个上。线性检测模块(包括PMT、崩溃光二极体(avalanchephotodiode)、CCD)的合适选择允许有效地荧光检测。
一般而言，较短波长激光发射在从紫外和可见染料产生荧光方面比较有效，而较长波长激发对于从近红外和红外染料产生荧光而言较有效。为了能够同时从大量染料检测，可以串联使用来自多个激光源的多个激光激发波长。在利用宽波长范围和超出可见光的波长范围时，与宽范围的染料(例如，Cy7和Cy7.5，分别为773nm和808nm)和最大波长为800nm至900nm的红外染料匹配的光学***使得能够利用一大组荧光染料来标记引物。
实施例7
染料选择。
在选择用于6-染料多重研发的荧光染料时，建立工作性5-染料组并且评估新染料候选物与此收集物的相容性。表6的上部列出了FAM、JOE、TMR、CXR和CC5的5-染料组以及每一种染料的最大激发和发射波长。
表6.用于纳入多重组中的荧光染料的实例。
*Exc最大：最大激发波长(纳米)。
**Em最大：最大发射波长(纳米)。
图9展示了利用5种核心染料与Dylight633中的每一种观察到的发射光谱。对于这6种染料，可以利用每种相邻染料对之间的4个或更多个摄谱仪通道分离，以不同地检测每一种染料。这种分离量允许产生完全分离所有6种颜色的颜色校正矩阵。由于经ATTO488标记的产物比相同产物的经FAM标记形式产生更强的输出发射，并且两种染料以相似波长发射，因此在多重组中用ATTO488染料替代FAM染料。
实施例8
8-色染料检测和分离
评估改进的光学***同时检测经8种荧光染料标记的STR产物的实用性。8种所选染料是实施例7中讨论的那些加上最大发射波长为590nm的丽丝胺-若丹明染料和最大发射波长为627nm的ATTO594染料。为了测试这个模式，分别针对8个单独引物对中的每一个产生不同大小的扩增产物，其中每一种引物对是由一个未经标记的引物和一个经标记的引物组成，其中该标记选自8种不同荧光染料中的一种。在产生并施加颜色校正矩阵来分辨重叠光谱信号后，获得所用染料中的每一种的无噪信号(图10)。
实施例9
单重(monoplex)和微型多重(miniplex)测试
多重构建发生在多个阶段，并且通常遵循从单重物建立若干核心基因座组，随后在这些组上建立的策略，如我们之前的工作中所述的(Krenke等，Validation ofa16-locus fluorescent multiplex system(16-基因座荧光多重***的验证).J ForensicSci.2002；47(4)：773-85；Lins等，Development and population study of an eight-locusshort tandem repeat(STR)multiplex systems(8-基因座短串联重复序列(STR)多重***的发展与群研究).J Forensic Sci.1998；43(6)：1168-80；Lins等，Multiplex Sets forthe Amplification of Polymorphic Short Tandem Repeat Loci-Silver Stain andFluorescence Detection.BioTechniques(用于多态性短串联重复序列基因座扩增的多重组-银染色和荧光检测).1996；20(5)：882-9)。首先，如材料和方法中所述设计单重扩增每个单独基因的引物对。使用0.5μM正向引物和0.5μM反向引物测试单重性能，其中每对中的一种引物由选自FAM、JOE、CXR和ROX染料组的荧光染料标记。
组合产生强扩增产物而不产生显著矫作物(不包括由STR基因座展现的典型残迹和不完全非模板添加(iNTA))的引物对组，以同时测试4～6个基因座的小引物对组(即，微型多重物(数据未显示))。在大部分情况下，通过共扩增不会产生意料之外的扩增基因组序列(即，矫作物)。一些组呈现出矫作物并且这些结果需要重新设计引物并重新进行单重测试。对引物的单独逐对组合的扩增产物的分析显示出哪种引物涉及矫作物的产生。以小的多重形式再次测试通过单重评估的重新设计的引物，以鉴定较强的候选组合，以用于在稍后阶段的完全多重物中。该研发的任一阶段的失败尝试(包括产生矫作物片段的组合)均需要在单重基因座阶段重新设计，其中在单重阶段和多重阶段都进行测试。
实施例10
矫作物减少或去除：iNTA
STR基因座扩增常常呈现出残基矫作物。这些矫作物通常(但并不总是)比真正等位基因短一个重复长度(Klintschar等，Polymerase slippage in relation to theuniformity of tetramaric repeat stretches(聚合酶滑移与四聚体重复延伸的关联).Forensic Sci Int.2003；135(2)：163-6；Shinde等，Taq DNA polymerase slippagemutation rates measured by PCR and quasi-likelihood analysis：(CA／GT)n and(A／T)nmicrosatellites(通过PCR和准似然分析检测的Taq DNA聚合酶滑移突变速率：(CA／GT)n和(A／T)n微卫星).Nucleic Acids Res.2003；31(3)：974-80)。已知选择用于国家和国际数据库中并且因此用于该工作的基因座残迹量可根据标准拷贝数评价与单一来源样品的DNA分型中的真正等位基因区分。
在完成模板依赖性聚合后不完全添加非模板核苷酸是通常在STR扩增产物中观察到的第二矫作物(Clark.Novel non-templated nucleotide addition reactionscatalyted by prokaryotic and eukaryotic DNA polymerases(通过原核与真核DNA聚合酶催化的新型非模板核苷酸添加反应).Nucleic Acids Res.1988年10月25日；16(20)：9677-86；H.DNA Polymerase-catalyze addition of nontemplated extra nucleotides tothe3’of a DNA fragment(通过DNA聚合酶催化向DNA片段的3’添加非模板额外核苷酸).DNA and Cell Biology.1993；12(8)：763-70；Magnuson等，Substratenucleotide-determined non-templated addition of adenine by Taq DNA polymerase：implications for PCR-based genotyping and cloning(通过Taq DNA聚合酶的底物核苷酸测定的非模板腺嘌呤添加：基于PCR的基因分型和克隆启示).BioTechniques.1996年10月；21(4)：700-9)。该矫作物是作为比真正等位基因小一个碱基的第二片段观察到的。其存在通常会降低真正等位基因的峰高度并且可能因为两个代表之一的等位基因的片段的出现而产生混淆。当初始引物设计未完成完全模板添加时，将由Brownstein推荐的DNA序列5’-GTTTCTT-3’添加至引物对中未标记引物的5’末端以刺激较完全的非模板添加(Brownstein等，Modulation of non-templated nucleotideaddition by Taq DNA polymerase：primer modification that facilitate genotyping(通过Taq DNA聚合酶的非模板核苷酸添加的调节：便于基因分型的引物修饰).BioTechniques.1996年6月；20(6)：1004-6，8-10)。在几种情况下，测试仅5’-末端-G的添加，以实现相同效应。在一些情况下，替代方法是颠倒引物对中的经标记引物和未经标记引物，以产生未经标记引物的替代5’端。iNTA减少的实例呈现于图11中。
图11A说明了用于减少iNTA的GTTTCTT尾添加。上图呈现了D18S51引物对扩增产物，其中不将5’-GTTTCTT-3’序列尾添加至未经标记引物的5’-末端。下图显示使用修饰引物对的产物。该变化将iNTA从上图中的约150％减少至下图中的小于10％。还增加了片段长度。图11B说明用于减少iNTA的未经标记引物的5’末端的G-尾添加。上图呈现了D2S441引物对扩增产物，其中不将5’-G-3’序列尾添加至未经标记引物的5’末端。下图显示了使用修饰引物对的产物。该变化将iNTA从上图中的约90％减少至下图中的小于10％。还增加了片段长度。图11C说明颠倒引物对中的经标记引物以减少iNTA的产物。上图呈现出利用原始ROX染料标记方案的D8S1179引物对扩增产物。下图显示使用引物对中经ROX标记的相反引物的产物。该变化将可见iNTA从上图中的约80％减少至下图中的小于10％。这不会改变明显片段长度，但明显片段中的这种改变可以根据扩增产物中的序列变化而产生。
因为不期望的引物与核酸的相互作用而产生的STR矫作物包括但不限于iNTA、残迹和扩增子，这与引物序列和PCR反应条件有关。酶、缓冲液和循环时间和温度(以及仪器驱动的温度直线上升速度)对矫作物产生和减少具有显著效应。这些因素还可能影响单独扩增子的相对信号强度。因此，在研发STR多重物时，重要的是考虑基于给定扩增条件组来优化引物。例如，用于90分钟PCR反应的最佳多重物可能非常需要针对20分钟PCR反应中的相似性能进行改进。
实施例11
从多重扩增产物中除去矫作物
扩增矫作物是从两种引物与基因组序列的不期望的相互作用产生的，其中至少一种引物是经标记的，这些基因组序列对于所涉及引物中的至少一个而言并非引物设计中期望的杂交目标。这些矫作物可以通过首先鉴定矫作物产生中涉及的引物来去除。这可以通过从完全多重物中一次去除一种引物或引物对以将具体引物的去除与具体矫作物的去除相关联来实现。一旦鉴定产生矫作物的候选引物，可以使用这两个候选引物在其它引物不存在下扩增样品，以验证其在矫作物产生中的作用。重新设计一种或两种引物，之后再测试，常常除去了矫作物，同时保持所有多重基因座的扩增。将重新设计的引物纳入多重物组后，常常需要努力再平衡多个基因座在多重物中的表现。
图12A、12B和12C呈现了利用5色GeneBench FX检测仪对6色扩增产物的检测。在相同PMT通道中检测DL633标记的样品扩增片段和CC5标记的大小片段。图12A说明两个产生矫作物的情况。注意经ATTO488标记并且位于107碱基(B107)处的相对较弱片段和一系列在193碱基(B193)周围的ATTO488标记的片段。在图12B的左图以放大方式说明了这些相同的矫作物。图12B的右图说明用经修饰序列的引物替代两个单独引物后的扩增。图12C说明了引物替代后的样品扩增产物保持平衡。
实施例12
选择染料以提高扩增产物强度
可以使用几种不同的方法来尝试在多重扩增的情况下从单独基因座的扩增产物强度。例如，可以采用引物重新设计，以结合新基因组序列或提供较稳定的杂交。或者，增加或降低用于基因座的引物的引物浓度可以相对于其它基因座改变产物强度。有时，提高其它基因座的引物的引物浓度或总体混合引物浓度可以改变扩增产物强度。方案的改进(包括较低退火温度或较多扩增循环)也可以改变相对扩增产物的表现。材料和方法中的这些改变不提高实施例1中所述和图1中展示的26-基因座多重物中SE33扩增产物的含量。实施例7中的染料研发给我们揭示了使用ATTO488染料提供了比FAM染料使用相对更强的扩增产物表现。我们用ATTO488替代FAM重新标记经标记的SE33引物并且观察到相对于多重物组中其它基因座理想的更强的扩增产物表现。
在图13中，用于产生呈现于各图中的扩增产物的染料显示于各图的左端。该图呈现了26-基因座扩增，其显示了强SE33扩增产物。比较该扩增的经ATTO488标记的SE33扩增产物的相对强度与这些在图1中利用经FAM标记的SE33产物观察到的那些。较强表现源自ATTO488染料检测到的较强光发射。我们还将D3S1358、D19S433和D2S1338的经标记引物从经FAM标记转化成经ATTO488标记，以确保这4个基因座的光谱检测在多重染料组的情况内保持一致。
实施例13
建立并组合微型多重物作为多重研发策略
组合几个多重组，各自展示每个单独基因座的成功扩增产物且缺乏非特异性产物或与其它引物序列有关的矫作物，以产生19-基因座多重物。从另一个微型多重物添加3个额外基因座，以产生22-基因座形式且随后个别地添加其余引物对。测试每个中间多重物，以鉴定与引物有关的矫作物，评估基因座-基因座平衡并验证相邻基因座的扩增产物未重叠。通过将特定矫作物的存在和不存在与来自完全引物的一种引物的存在或不存在相关联，来鉴定造成许多与引物有关的矫作物中每一个的引物。将冒犯性引物重新设计并再测试，以解决这些后期研发阶段的大部分问题。再测试包括对经验性、非理论性结果的小心的扩增子范围大小分析，以确保相同颜色的相邻基因座的等位基因不会重叠。通常利用向一种或两种引物的5’末端添加序列以重新检测大小来解决基因座重叠的情况。使用3种不同方法来调节基因座-基因座平衡：a)调节输入引物浓度；b)调节PCR扩增反应的退火温度，和c)引物重新设计。在这些调节后。图14A呈现采用基因座平衡的27-基因座多重组的2.8ng男性DNA样品的19.5分钟扩增。图14B说明女性DNA样品的6色27-基因座扩增。使用8色光学***分离并检测扩增产物。
实施例14
纳入更多染料允许较小扩增产物
相对于5色检测改进的6色检测或8色检测允许改进的多重***的设计，用于人类鉴定的目的。对人类残骸进行操作的困难之一是例如一些样品含有降解的DNA。出现这种情况时，对较大扩增子的扩增变得更困难或甚至不可能。存在6、7、8、9、10、11、12、14、16种或更多种染料，使得能够重新设计多重STR扩增组，以产生较小扩增产物。这将进而允许样品扩增的较高成功率。
图15A展示在多重组中含有13个CODIS STR核心基因座的5色设计。其假定无扩增产物的限制低于70个碱基且在毗邻基因座之间需要5个～10个碱基以允许实质上非重叠STR分析。CODIS13STR基因座构成689个碱基的STR基因座大小范围总和。假定限制所选基因座的基因座大小范围且需要保留大小标志物的一种颜色，则可将3.25基因座／颜色的平均值设计至每一种颜色中，从而产生235个碱基的多重大小范围和2.93的多重密度。
图15B呈现出含有与图15A中的5色设计具有相同限制的相同基因座的6色设计。在包括第6种染料后，多重组的大小上限为约275个碱基。另外，平均基因座／颜色是2.6，并且每一种颜色中基因座的较低数目使得较容易避免等位基因的基因座-基因座重叠的可能性，以允许实质上非重叠STR分析。多重大小范围是205个碱基并且多重密度为3.36。
图15C呈现含有与图15A中的5色设计和图15B的6色设计具有相同限制的相同基因座的8色设计。在纳入8种染料后，多重组的大小上限为约230个碱基。此外，FGA基因座的大等位基因极其罕见，因此较常见等位基因不会超过155个碱基。这些等位基因大小的实质性减少实质上增加了获得降解样品的完整谱的能力。另外，1.86为平均基因座／颜色且每一种颜色中基因座的较低数目使得较容易避免等位基因的基因座-基因座重叠的可能性以允许实质上非重叠STR分析。实际上，每一种颜色中仅有两个或更少基因座且多重组中仅有6个相邻基因座对，相同颜色中基因座对之间增加的间隔使得可以完全避免该风险，如图15C中所示。该模式的多重大小范围(包括极罕见高分子量FGA等位基因)是160个碱基且多重密度为4.31。
表7中比较了3种形式的13-STR CODIS核心多重组的多重含量、STR基因座大小范围总和、多重大小范围和多重密度。
表7.多重组中的13-STR CODIS核心基因座的比较
实施例15
24-基因座23-STR正式基因座多重物
多重密度增加的多重设计提供多重扩增分析的更高效率。该方法允许评估较小大小范围内的多态性基因座的较多替代形式。这进而允许获得增加的信息和参照更多所获得的信息。
图16呈现同时共扩增釉原蛋白基因座与以下23个STR基因座的方法：D3S1358、SE33、D6S1043、TH01、D18S51、D1S1656、D19S433、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、CSF1PO、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、D2S1138、D22S1045、DYS391、FGA、D8S1179和D10S1248。该多重设计的STR基因座大小范围总和为1286，多重大小范围为340个碱基，且多重密度为3.78。
实施例16
23-基因座22-STR正式基因座多重物
多重密度增加的多重设计提供多重扩增分析的更高效率。该方法允许评估较小大小范围内的多态性基因座的较多替代形式。这进而允许获得增加的信息和参照更多所获得的信息。
图17呈现同时共扩增釉原蛋白基因座与以下23个STR基因座的方法：D3S1358、D6S1043、TH01、D18S51、D1S1656、D19S433、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、CSF1PO、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、D2S1138、D22S1045、DYS391、FGA、D8S1179和D10S1248。该多重设计的STR基因座大小范围总和为1136，多重大小范围为300个碱基，且多重密度为3.79。
实施例17
22-基因座21-STR正式基因座多重物
多重密度增加的多重设计提供多重扩增分析的更高效率。该方法允许评估较小大小范围内的多态性基因座的较多替代形式。这进而允许获得增加的信息和参照更多所获得的信息。
图18呈现同时共扩增釉原蛋白基因座与以下23个STR基因座的方法：D3S1358、TH01、D18S51、D1S1656、D19S433、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、CSF1PO、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、D2S1138、D22S1045、DYS391、FGA、D8S1179和D10S1248。该多重设计的STR基因座大小范围总和为1072，多重大小范围为292个碱基，且多重密度为3.67。
实施例18
21-基因座20-STR正式基因座多重物
多重密度增加的多重设计提供多重扩增分析的更高效率。该方法允许评估较小大小范围内的多态性基因座的较多替代形式。这进而允许获得增加的信息和参照更多所获得的信息。
图19呈现同时共扩增釉原蛋白基因座与以下23个STR基因座的方法：D3S1358、TH01、D18S51、D1S1656、D19S433、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、CSF1PO、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、D2S1138、D22S1045、FGA、D8S1179和D10S1248。该多重设计的STR基因座大小范围总和为1044，多重大小范围为278个碱基，且多重密度为3.76。
实施例19
6-色SNP分析
通过允许用于人类和兽医鉴定、临床和兽医诊断、生物威胁检测、食品安全和工业测试目的的多重***的改进设计，使用超过6、7、8、9、10、11、12、14、16或24色检测进行的检测也提高了非STR评价，例如SNP测试。特别地，使用较多的染料来区别较小的产物，如以上针对STR多重分析所显示的。或者，当使用较多染料时，可以在相同大小范围限制内测试较多基因座。一般而言，染料数目越大，可以从单一样品和单一检测泳道获得的信息越多。
在这个实施例中，我们描述了使用6-染料能力来分析6种SNP，以确定人类的虹膜颜色的用途。之前，Walsh公开的分析(Walsh等，(2011，Iris IrisPlex：A sensitiveDNA tool for accurate prediction of blue and brown eye color in the absence of ancestryinformation(虹膜虹膜丛：在缺乏祖先信息时用于蓝色和棕色眼睛颜色准确预测的敏感DNA工具).Forensic Science International：Genetics5：170-180))是基于人类样品DNA的6个区域的扩增，接着进行单碱基延伸分析(Chen等，3003，Single nucleotidepolymorohism genotyping：biochemistry，protocol，cost，and throughput(单核苷酸多态性基因分型：生物化学方案、成本和通量)，The Pharmacogenomics Journal3：77-96)，来探查每种扩增PCR产物内的一个单独碱基的存在。作为5-染料分析来进行该测试，其中大小标志物保留5种颜色中的一种。以4种颜色检测所有6个靶标位置中的每一个的两种潜在替代SNP产物，即12种潜在产物，其中产物大小在24个～54个碱基范围内。使用本发明的6种染料方法时，可以将单碱基延伸产物范围缩小至例如48个碱基。制备和纯化在单碱基延伸分析中检测较长产物需要的较长寡核苷酸中的困难证明了形成如本文中提及的依赖较短寡核苷酸的分析的优势。
在该方法的延伸中，许多SNP分析需要在单一反应和检测泳道中探查超过10、超过20、超过30、超过50、超过100、超过200、超过300、超过400、超过500、超过1000、超过2000、超过300，或超过5000种单独的SNP。在分析中纳入6-色***、8-色***或更多-颜色的***允许在与目前5色分析相同的大小范围内进行更多SNP分析。
用于SNP分析中的样品可以在样品中包括扩增或未扩增的核酸，包括通过PCR扩增的产物。所述分析包括但不限于电泳分离和检测以及基于微阵列的分析。在暴露于至少3个SNP多态性之前或之后，6种或更多种荧光标记可以连接至寡核苷酸。例如，可以在用于方法中之前或纳入具有核苷酸的标记的引物延伸分析的过程中标记寡核苷酸。
SNP分析的几种替代方法可以通过应用本发明来改进。一种方法是扩增核酸样品，然后在差别经标记的二去氧-dNTP存在下利用未经标记引物(寡核苷酸)来进行引物延伸(Syvanen，A-C等，1990.A primer-guided nucleotide incorporation assay inthe genotypin ofapolipoprotein E(载脂蛋白E的基因分型中的引物导向的核苷酸掺入试验)，Genomics8：684-192.)。使用不同长度的未经标记引物来进行引物延伸，以产生不同长度的产物。使用不同染料用于检测以与针对扩增STR产物相同的方式向检测过程增加了维度。在该方法的变化中，例如，可以结合脱氧核苷酸和二脱氧核苷酸的混合物。
另一种替代方法涉及采用6种或更多种，优选8种或更多种荧光标记的寡核苷酸进行等位基因特异性杂交。(Wallace1979.Hybriciation of syntheitologodeoxyribonucleotides to phi chi174DNA：the effect of single base pairmismatch(综合延长脱氧核糖核苷酸杂交至phi chi174DNA：单碱基对错配的影响)，Nucleic Acides Research10：3543-3557.)
本发明的另一种实施涉及在一种未经标记引物和两种经差别标记的具有相同(或接近相同)序列的引物存在下对每一个所分析的SNP使用PCR(Choi等，2012.Integrated allele-specific polymerase chain reaction-capillary electrophoresismicrodevice for single nucleotide polymorphism genotyping.Biosens(经整合的等位基因特异性聚合酶链式反应一用于单核苷酸多态性基因分型的毛细管电泳微型装置).Bioelectron.35：327-334)。在罕见的情况下，对每个SNP位点可以使用最多4种经差别标记的引物。以与STR基因座产物相同的方式，通过大小分离或颜色差别来分离和检测这些扩增产物。
应用于SNP分析的本发明的另一种实施涉及在核酸靶标存在下使用聚合酶、缓冲液、去氧核苷酸三磷酸和二去氧核苷酸三磷酸的混合物的组合进行序列引物延伸。在该过程期间，将来自一个核酸靶标的扩增产物通过4种连接dNTP或二去氧NTP的不同荧光染料标记(Sanger，Niclen和Coulson，1977.DNA sequencing withchain-terminating inhibitors(采用链终止抑制剂的DNA测序)，Proc Natl Acad Sci USA74：5463-5467)。在分开的位置中，第二个核酸靶标也用四种连接dNTP或二脱氧NTP的不同染料来标记。样品可以分开运行，或在本发明的形式中，混合，然后分离和检测，以供分析。
可以将至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50种或更多种荧光染料的使用施加于多种SNP检测方法(Chen和Sullivan，2003，Single nucleotide polymorphism genotyping：biochemistry，protocol，cost，and throughput(单核苷酸多态性分型：生物化学、方案、成本和通量).ThePharmacogenomics Journal3：77-96；Syvanen，2001，Accessing genetic variation：genotyping single nucleotide polymorphisms(接触遗传变异：基因分型单核苷酸多态性)，Nature Reviews2：930-942；Kwok，2000.High-throughput genotyping assayapproaches(高通量基因分型试验方法)，Pharmacogenetics1：1-5；Kwok，2003Detection of single nucleotide polymorphisms(单核苷酸多态性的检测)，Current Issuesin Molecular Biology5：43-60；Kim等.SNP Genotyping：Technologies and BiomedicalApplications Annual Review ofBiomedical Engineering(《SNP分型：生物医学工程的技术与生物医学应用年度综论》)，第9卷：289-320，2007；Nassir等，An ancestryinformative marker set for determining continental origin：validation and extensionusing human genome diversity panels(用于大陆来源测定的祖先信息制造组：采用人类基因组多样性组的验证和扩大)，BMC Genetics2009，10：39)
与本文所述电泳分离和光学检测能力结合，可以针对大量SNP进行探查，特别是法医、临床、兽医、食品安全和工业微生物样品。与本发明的测序分析和多重分析以及其它分析结合，SNP分析(包括高度多重SNP分析)可以提供大量关键信息。根据需要，这些SNP分析单独或组合可以适用于微流体生物芯片，包括完全整合微流体生物芯片***。
实施例20
用于SNP分析与STR分析的组合的6-色分析
实施例2、实施例3、实施例5、实施例15、实施例16、实施例17和实施例18阐述了使用6种或更多种染料来允许同时扩增并分析增加数目的体染色体STR基因座、较大的基因座大小范围总和分析和增加的多重密度。实施例4阐释了使用6种或更多种染料来允许同时扩增并分析增加数目的体染色体STR基因座与Y STR基因座的组合。实施例19阐释了使用6种或更多种染料来允许同时扩增并分析增加数目的SNP基因座或在SNP基因座分析中对多重大小范围的需要。
也可以通过纳入、检测和颜色分离6、7、8、10、12、14、24种或更多种染料允许的增加的大小范围分析来同时分析不同标志物类型。特别地，可以在分离的扩增产物的相同单一通道或泳道中检测实施例19中所述的基于SNP的虹膜检测分析和实施例5以及若干其它实施例中所述的基于体染色体STR的鉴定分析的扩增产物。因此，可以使用该方法来同时确定身份和物理性状分析。
可以同时针对多个标志物类型、多个DNA源和多个功能目的来分析组合不同多态性标志物类型(例如STR、SNP、序列变体)和不同的染色体类型源(例如，体染色体、X染色体、Y染色体、线粒体、细菌、真菌、植物)且用于不同的目的(例如，身份、亲属关系确定、法医学、物理性状、传染性病因、遗传特性)的多种扩增组。这些类型的多重扩增组也可以与非多态性核酸标志物组合，这些标志物提供关于生物体或另一种含有核酸的样品材料的存在、不存在、鉴定或状况的诊断信息。
实施例21
双序列分析
进行DNA序列分析以确定4种不同核苷酸在构成人类基因座的染色体中的顺序。尽管可以利用多种序列分析方法，但传统和普及的方法是由Sanger等研发的方法(1977，DNA sequencing with chain-terminating inhibiors(采用链终止抑制剂的DNA测序).PNAS74：5463-5467.)，其采用在未经标记的脱氧核苷酸三磷酸与经荧光标记的二脱氧核苷酸三磷酸的混合物存在下的引物延伸。4个经差别荧光标记的二脱氧核苷酸三磷酸针对每个单独碱基并以指示位置或单独碱基的不同长度终止链延长。
使用8-色检测允许包括桑格(Sanger)测序产物的两种不同的非重叠染料颜色组，用于检测并分开解释单一泳道的分离产物。因此，我们在单一分离测试中同时从两个测序反应检测测序产物。此外，能够以单一反应体积使用二脱氧核苷酸三磷酸的非重叠染料颜色组同时对两个不同DNA区域测序，以用于单独序列的随后分离、检测和分析。
以4的倍数增加颜色数目成比例地增加了可以在单一检测泳道上分离的DNA序列数目(例如，16种颜色允许4组序列)。通过明智地选择染料数目和分析需要，可以使用单一样品来收集大量信息。例如，单一人类样品可以提供身份和亲属关系信息(例如，使用6种颜色和STR分析)、表型信息(例如，使用6种颜色和SNP分析)、线粒体遗传信息(例如，使用4种颜色和测序分析)。相似地，可以使用该方法来进行人类鉴定和亲属关系分析(例如，使用8种颜色和STR分析)以及确定病原体身份和治疗方案(例如，使用8种颜色和两个多重测序分析)；这种组合可以用于分析送至急诊室的具有败血症体征的未鉴定个体的血样。在第三种情况中，可以使用分析来提供身份信息(例如，使用6种颜色和STR分析)、与组织分型或癌症分期有关的临床诊断信息(例如，使用4种额外的颜色和测序分析)；该组合可以用于术内评价组织，同时提供关于组织供体的身份的保证。
这些应用仅仅是通过本发明教导内容所实现的大量分析组合中的三种。可以基于这些教导内容进行的分析包括单独和组合分析，包括但不限于核酸扩增(例如，单重和多重端点PCR、实时PCR、逆转录PCR、不对称PCR、巢式PCR、LATE PCR、降落式PCR、数位PCR、滚环式扩增、链替代扩增和多重置置换扩增)；Y-STR扩增；微型STR扩增；单核苷酸多态性分析；VNTR分析；RFLP分析；核酸测序(例如，桑格(Sanger)测序、焦磷酸测序和单分子测序)；逆转录；核酸连接；核酸杂交；免疫分析；结合分析；蛋白质分析；酶促分析；质谱；以及核酸和蛋白质定量。

Claims (29)

1.一种从包含核酸的样品多重扩增STR基因座的方法，所述方法包括：
(a)在溶液中使所述样品与STR基因座的至少6种不同引物对接触，其中各引物对的至少一种引物用荧光染料标记，并且其中所得的STR多重物的多重密度等于或大于3.20；
(b)在一个反应室中使用所述至少6种引物对通过聚合酶链式反应(PCR)同时扩增，以产生扩增的核酸产物；和
(c)通过激光诱导的荧光检测所述核酸产物。
2.一种从包含核酸的样品多重扩增STR基因座的方法，所述方法包括：
(a)在一种溶液中使所述样品与STR基因座的至少6种不同引物对接触，其中各引物对的至少一种引物用荧光染料标记，并且其中使用至少6种不同的荧光染料标记物，并且其中所得的STR多重物的多重密度等于或大于2.0；
(b)在一个反应室中使用所述至少6种引物对通过聚合酶链式反应(PCR)同时扩增，以产生扩增的核酸产物；和
(c)通过激光诱导的荧光检测所述核酸产物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述所得的STR多重物的多重密度等于或大于3.2。
4.一种从包含核酸的样品多重扩增STR基因座的方法，所述方法包括：
(a)在溶液中使所述样品与STR基因座的至少6种不同引物对接触，其中各引物对的至少一种引物用荧光染料标记，并且其中使用至少6种不同的荧光染料标记物，并且其中所得的STR多重物的STR基因座大小范围总和大于1044；
(b)在一个反应室中使用所述至少6种引物对通过聚合酶链式反应(PCR)同时扩增，以产生扩增的核酸产物；和
(c)通过激光诱导的荧光检测所述核酸产物。
5.一种从包含核酸的样品多重扩增STR基因座的方法，所述方法包括：
(a)在溶液中使所述样品与STR基因座的至少16种不同引物对接触，其中各引物对的至少一种引物用荧光染料标记，并且使用至少6种不同的荧光染料标记物；和
(b)在一个反应室中通过聚合酶链式反应(PCR)同时扩增所述至少16个基因座，以产生至少16种扩增的核酸产物；和
(c)通过激光诱导的荧光检测所述核酸产物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括用于性别鉴定的标志物。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述STR谱在小于约2小时内产生。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述STR谱在微流体生物芯片中产生。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述STR谱在完全整合的微流体生物芯片中产生。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述检测方法通过质谱分光光度计实行。
11.一种多重扩增包含多个基因座的DNA分子的方法，所述方法包括：
a)提供至少21个STR基因座；
b)在单一扩增反应中扩增所述基因座，其中所述STR基因座选自下组：D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、PentaB、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、PentaC、D16S539、vWFA31、D21S11、D12S391、釉原蛋白、PentaD、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、PentaE、D8S1179、FGA、SE33、DYS391、D6S1043、DYS439、DYS389II、DYS19、DYS392、DYS393、DYS389I、DYS390、DYS385a、DYS385b、DYS437和DYS438，并且其中使用7种或更多种不同的标记物来标记各所述基因座的各引物对的一员。
12.一种多重扩增包含多个基因座的DNA分子的方法，所述方法包括：
a)提供至少16个基因座；
b)在单一扩增反应中扩增所述基因座，其中所述STR基因座中的15个来自下组：D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D22S1045、FGA、D8S1179，
并且所述多个中的至少1个STR基因座选自下组：SE33、Penta C、Penta D、Penta E、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、DYS391和D6S1043，并且其中使用6种或更多种不同的标记物来标记各所述基因座的各引物对的一员。
13.一种多重扩增包含多个基因座的DNA分子的方法，所述方法包括：
a)提供至少16个基因座；
b)在单一扩增反应中扩增所述基因座，并且其中所述STR基因座中的15个来自下组：D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D22S1045、FGA、D8S1179，和至少一个其它STR基因座，其中使用6种或更多种不同的标记物来标记各所述基因座的各引物对的一员。
14.一种多重扩增包含多个基因座的DNA分子的方法，所述方法包括：
a)提供至少18个基因座；
b)在单一扩增反应中扩增所述基因座，其中所述STR基因座中的5个是D3S1358、D8S1179、D18S51、D21S11和FGA，并且所述多个中的至少13个STR基因座选自下组：D19S433、D2S1338、D16S539、PentaD、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、PentaE、SE33、D1S1656、D10S1248、D2S441、PentaC、D12S391、D22S1045、DYS391、D6S1043、TH01和vWA，并且其中使用6种或更多种不同的标记物来标记各所述基因座的各引物对的一员。
15.一种多重扩增包含多个基因座的DNA分子的方法，所述方法包括：
a)提供至少15个基因座；
b)在单一扩增反应中扩增所述基因座，其中所述STR基因座中的5个是D3S1358、D8S1179、D18S51、D21S11和FGA，并且所述多个中的至少10个STR基因座选自下组：D19S433、D2S1338、D16S539、PentaD、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、PentaE、SE33、D1S1656、D10S1248、D2S441、PentaC、D12S391、D22S1045、DYS391、D6S1043、TH01和vWA，并且其中使用6种或更多种不同的标记物来标记各所述基因座的各引物对的一员。
16.一种多重扩增包含多个基因座的DNA分子的方法，所述方法包括：
a)提供至少21个基因座；
b)在单一扩增反应中扩增所述基因座，其中所述STR基因座中的5个是D3S1358、D8S1179、D18S51、D21S11和FGA，并且所述多个中的至少16个STR基因座选自下组：D19S433、D2S1338、D16S539、PentaD、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、PentaE、SE33、D1S1656、D10S1248、D2S441、PentaC、D12S391、D22S1045、DYS391、D6S1043、TH01和vWA，并且其中使用6种或更多种不同的标记物来标记各所述基因座的各引物对的一员。
17.一种多重扩增包含多个基因座的DNA分子的方法，该方法包括：
a)提供至少23个基因座；
b)在单一扩增反应中扩增所述基因座，其中所述STR基因座中的5个是D3S1358、D8S1179、D18S51、D21S11和FGA，并且所述多个中的至少18个STR基因座选自下组：D19S433、D2S1338、D16S539、PentaD、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、PentaE、SE33、D1S1656、D10S1248、D2S441、PentaC、D12S391、D22S1045、DYS391、D6S1043、TH01和vWA，并且其中使用6种或更多种不同的标记物来标记各所述基因座的各引物对的一员。
18.一种多重扩增包含多个基因座的DNA分子的方法，所述方法包括：
a)提供至少18个基因座；
b)在单一扩增反应中扩增所述基因座，其中所述STR基因座中的至少1个来自下组：DYS19、DYS378I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385a／b、DYS437、DYS438、DYS439、DYS472、DYS476、DYS480、DYS481、DYS485、DYS487、DYS488、DYS490、DYS491、DYS492、DYS494、DYS495、DYS497、DYS505、DYS508、DYS511、DYS522、DYS525、DYS530、DYS531、DYS533、DYS537、DYS540、DYS549、DYS554、DYS556、DYS565、DYS567、DYS568、DYS569、DYS570、DYS572、DYS573、DYS575、DYS576、DYS578、DYS579、DYS580、DYS583、DYS589、DYS590、DYS594、DYS617、DYS618、DYS636、DYS640、DYS641或DYS643，
并且其中使用6种或更多种不同的标记物来标记所述扩增的基因座。
19.如权利要求12、14、16、18、24或29所述的方法，其特征在于，所述方法还包括选自下组的至少一个其它STR标志物：常染色体STR、微型-STR、Y-STR和X-STR。
20.一种用于多重扩增STR基因座的***，所述***包含：
(a)生物芯片，所述生物芯片包含在至少一种溶液中的样品和STR基因座的至少6种不同的引物对，其中各引物对的至少一种引物用荧光染料标记，并且其中所得的STR多重物的多重密度等于或大于3.20；和
(b)扩增***，所述扩增***用于使用所述至少6种引物对通过聚合酶链式反应(PCR)同时扩增；和
(c)检测***，所述检测***包含能够检测所述至少6种不同荧光标记物的激光器。
21.一种用于多重扩增核酸基因座的***，所述***包含：
(a)生物芯片，所述生物芯片包含在至少一种溶液中的样品和STR基因座的至少6种不同引物对，其中各引物对的至少一种引物用荧光染料标记，并且其中使用至少6种不同的荧光染料标记物，并且其中所得的STR多重物的STR基因座大小范围总和大于1044；
(b)扩增***，所述扩增***用于使用所述至少6种引物对通过聚合酶链式反应(PCR)同时扩增；和
(c)检测***，所述检测***包含能够检测所述至少6种不同荧光标记物的激光器。
22.一种用于多重扩增STR基因座的***，所述***包含：
(a)生物芯片，所述生物芯片包含在至少一种溶液中的样品和STR基因座的至少16种不同引物对，其中各引物对的至少一种引物用荧光染料标记，并且使用至少6种不同的荧光染料标记物；和
(b)扩增***，所述扩增***用于使用所述至少16种引物对通过聚合酶链式反应(PCR)同时扩增；和
(c)检测***，所述检测***包含能够检测所述至少6种不同荧光标记物的激光器。
23.一种多重扩增包含多个基因座的DNA分子的方法，所述方法包括：
a)提供至少35个基因座；
b)在单一扩增反应中扩增所述基因座，其中至少一个STR基因座选自下组：D3S1358、D8S1179、D18S51、D21S11、FGA、TH01和vWA、D19S433、D2S1338、D16S539、PentaD、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1PO、PentaE、SE33、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D12S391、D22S1045、DYS391和D6S1043，并且其中使用6种或更多种不同的标记物来标记各所述基因座的各引物对的一员。
24.一种用于检测包含至少一个核酸的样品中的至少三种SNP多态性的存在的方法，所述方法包括：
(a)在溶液中使所述样品与至少3种不同的寡核苷酸接触，
(b)使用至少6种不同的荧光标记物来产生至少6种不同的荧光信号，和
(c)通过大小、序列或其它特征来分离经标记的产物，并且通过激光诱导的荧光检测包含单个荧光信号的产物。
25.一种从包含核酸的样品多重扩增STR基因座的方法，所述包括：
(a)在溶液中使所述样品与STR基因座的至少18种不同引物对接触，其中各引物对的至少一种引物用荧光染料标记，并且使用至少6种不同的荧光染料标记物；
(b)在一个反应室中通过聚合酶链式反应(PCR)同时扩增所述至少16个基因座，以产生至少16种扩增的核酸产物；和
(c)通过激光诱导的荧光检测所述核酸产物。
26.一种从包含核酸的样品多重扩增STR基因座的方法，所述方法包括：
(a)在溶液中使所述样品与STR基因座的至少21种不同引物对接触，其中各引物对的至少一种引物用荧光染料标记，并且使用至少6种不同的荧光染料标记物；和
(b)在一个反应室中通过聚合酶链式反应(PCR)同时扩增所述至少16个基因座，以产生至少16种扩增的核酸产物；和
(c)通过激光诱导的荧光检测所述核酸产物。
27.一种从包含核酸的样品多重扩增STR基因座的方法，所述包括：
(a)在溶液中使所述样品与STR基因座的至少22种不同引物对接触，其中各引物对的至少一种引物用荧光染料标记，并且使用至少6种不同的荧光染料标记物；和
(b)在一个反应室中通过聚合酶链式反应(PCR)同时扩增所述至少16个基因座，以产生至少16种扩增的核酸产物；和
(c)通过激光诱导的荧光检测所述核酸产物。
28.一种从包含核酸的样品多重扩增STR基因座的方法，所述方法包括：
(a)在溶液中使所述样品与STR基因座的至少23种不同引物对接触，其中各引物对的至少一种引物用荧光染料标记，并且使用至少6种不同的荧光染料标记物；和
(b)在一个反应室中通过聚合酶链式反应(PCR)同时扩增所述至少16个基因座，以产生至少16种扩增的核酸产物；和
(c)通过激光诱导的荧光检测所述核酸产物。
29.一种从包含核酸的样品多重扩增至少7个基因座的方法，所述方法包括：
(a)在溶液中使所述样品与所述基因座的至少7种不同引物对接触，其中各引物对的至少一种引物用荧光染料标记，并且使用至少7种不同的荧光染料标记物；和
(b)在一个反应室中通过聚合酶链式反应(PCR)同时扩增所述至少7个基因座，以产生至少7种扩增的核酸产物；和
(c)通过激光诱导的荧光检测所述核酸产物。
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