CN116083550A - 一种短串联重复序列的检测方法、引物组、试剂盒和应用 - Google Patents

一种短串联重复序列的检测方法、引物组、试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种短串联重复序列的检测方法、引物组、试剂盒和应用。与传统的基于聚合酶链式反应扩增及毛细管电泳检测的STR检测方法相比，本发明将聚合酶链式置换反应扩增技术与高通量测序技术进行结合用于STR的检测，可以实现PCDR引物的灵活设置和不同PCDR扩增子的完整检测，有效提高DNA样本的扩增效率；同时能够获得STR等位基因序列多态性信息，减少STR扩增过程中stutter产物的形成，有利于低拷贝和混合DNA样本的分析。

Description

一种短串联重复序列的检测方法、引物组、试剂盒和应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种短串联重复序列的检测方法、引物组、试剂盒和应用。
背景技术
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是法医DNA分析领域广泛采用的扩增技术。利用PCR技术扩增人类基因组微卫星基因座短串联重复序列(Short TandemRepeat，STR)并结合毛细管电泳(Capillary Electrophoresis,CE)对荧光标记的扩增子片段长度进行检测从而获得个体的DNA图谱是现代法医学进行个人识别和亲子鉴定的常规方法。PCR反应使用针对目标基因座设计的特异性前后引物与DNA模板结合，经过模板变性、引物退火和引物延伸三个步骤，理论上每次循环结束目标基因座扩增子产物即增加一倍，从而实现DNA模板的指数级扩增。但在实际情况下，由于模板和引物竞争、底物消耗、产物累积、酶活性降低，反应体系pH改变等因素影响，并非每次循环都能够对DNA模板进行成功复制。而当起始DNA模板拷贝数很低时，DNA分子的复制过程受PCR效率的影响加大，PCR扩增结果可能出现更大的变异性(PCR的随机效应)。等位基因的GC含量、等位基因长度差异、样本DNA降解程度、引物结合效率、热循环条件都可能导致某个等位基因差异性扩增，引起DNA图谱中等位基因峰高平衡性下降甚至出现等位基因丢失。
DNA序列自身的特殊性也会影响PCR的扩增过程。STR基因座由相对恒定的核心序列(基序)多次串联重复构成。在DNA图谱中，STR基因座等位基因峰前后间隔一个或多个重复基序的位置常出现一个或多个较小的峰，称为stutter峰。stutter是STR扩增过程中常见的伪峰，一般认为由STR等位基因复制过程中DNA链“滑脱”所产生，且随DNA模板量降低而增加。因此，低拷贝DNA和大比例混合DNA模板的STR分型结果更容易受stutter产物的影响。当等位基因峰较低时，stutter峰可能被错误识别为等位基因峰，导致将单一来源DNA图谱解释为混合DNA，从而误导案件的调查、侦察和审理过程。而对于比例不平衡的多个体混合DNA图谱，主要贡献者等位基因的stutter峰可能被误认为次要贡献者的等位基因峰，导致错误的证据结果。
聚合酶链式置换反应(Polymerase Chain Displacement Reaction，PCDR)是另一种高效的DNA扩增方法。PCDR采用两对或多对引物扩增模板序列，能够同时发挥PCR和链置换扩增反应的优势。由于使用了耐热的具有强烈链置换活性的SD DNA聚合酶，PCDR能够兼容与PCR相同的热循环条件，且全部扩增反应在同一管体系中完成。在引物退火过程中，特异性的内外引物同时结合到目标基因座的两侧，并在SD聚合酶的作用下进行延伸。当外引物延伸至内引物结合位置时，SD聚合酶的链置换活性可置换内引物延伸链，使外引物延伸得以继续进行(见附图1)。由此，通过设置不同数量的内、外引物对即可在单次反应中多次复制目标基因座，从而带来显著的扩增效率提升。引物与模板的成功结合及延伸是决定目标基因座能否成功扩增的关键环节。在PCDR反应中，嵌套的内外引物的使用进一步提高了引物与模板结合的可能性，使得低拷贝的DNA模板在反应的前期能够得到更为有效的累积，并在经过PCDR的高效扩增后最终得到成功检测，从而提高DNA图谱的等位基因检出率。同时，有研究发现PCDR可有效减少STR序列复制过程中stutter副产物的产生，降低stutter对低拷贝样本和混合样本DNA图谱的干扰。PCDR的这种stutter“抑制效应”可能与模板延伸过程中内引物延伸链对DNA模板的封闭，使得延伸引物、模板、DNA聚合酶构成的延伸复合体稳定性增强有关。
已有研究表明PCDR能够用于法医STR的扩增和检测并实现与常规PCR-CE检测体系的完全兼容。然而，在扩增过程中引入链置换反应会显著增加扩增产物的复杂度。以两对内外引物的PCDR反应为例，在经过引物延伸和链置换后会产生四种不同长度的扩增子。这些扩增子含有独特的末端序列(引物序列)和共有的STR序列。常规的基于CE的STR分型方法仅根据扩增子片段长度对基因座及等位基因进行区分，PCDR过程中由内外引物组合所产生的四种扩增子将加剧DNA图谱的复杂程度，导致等位基因及基因座信号峰的重叠。因此，基于CE的分析方法只能对PCDR的部分产物进行检测，且要求使用单侧的***引物进行PCDR扩增，这大大限制了PCDR的引物设计及其对扩增效率的提升作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种短串联重复序列的检测方法、引物组和试剂盒，所述检测方法可以实现PCDR引物的灵活设置，检测得到更多的等位基因多态性，减少STR扩增过程中stutter产物的形成，有效提高DNA样本的扩增效率，有利于低拷贝和混合DNA样本的检测。
本发明提供了一种短串联重复序列的检测方法，以STR引物对待测DNA样本进行PCDR扩增，对PCDR扩增得到的产物进行高通量测序，实现PCDR不同扩增子的完整检测，得到STR的序列信息；所述STR引物包括两对嵌套引物。
优选的，所述STR引物包括前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR；
所述前***引物OF位于所述前引物FW的5’端上游，所述后***引物OR位于所述后引物RV的5’端上游。
优选的，所述短串联重复序列的数量≥2；每一个短串联重复序列包括一组STR引物。
优选的，所述短串联重复序列包括法医常染色体STR基因座和/或性别鉴定基因座。
优选的，所述法医常染色体STR基因座包括CSF1PO，D10S1248，D12S391，D13S317，D16S539，D18S51，D19S433，D1S1656，D21S11，D22S1045，D2S1338，D2S441，D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，FGA，Penta D，Penta E，TH01，TPOX和VWA中的任意一种或多种；所述性别鉴定基因座为Amelogenin。
优选的，所述PCDR扩增为热循环扩增；
所述热循环扩增包括初始变性阶段、预扩增阶段、常规扩增阶段和终延伸阶段；
所述初始变性阶段：92℃预变性2min；1个循环；所述预扩增阶段：92℃变性0.5min，62～60℃(每个循环下降0.2℃)退火1min，68℃延伸1.5min；10个循环；
所述常规扩增阶段：92℃变性0.5min，60℃退火1min，68℃延伸1.5min；18个循环；
所述终延伸阶段：68℃延伸10min；1个循环。
优选的，用于所述PCDR扩增的试剂包括：SD聚合酶、SD聚合酶反应缓冲液、MgCl2、dNTP mix和水。
本发明还提供了一种用于上述技术方案所述检测方法的短串联重复序列检测的引物组，所述短串联重复序列包括法医常染色体STR基因座和/或性别鉴定基因座；所述法医常染色体STR基因座包括CSF1PO，D10S1248，D12S391，D13S317，D16S539，D18S51，D19S433，D1S1656，D21S11，D22S1045，D2S1338，D2S441，D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，FGA，Penta D，Penta E，TH01，TPOX和VWA中的任意一种或多种；所述性别鉴定基因座为Amelogenin；
所述CSF1PO的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.1～4所示；
所述D10S1248的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQID NO.5～8所示；
所述D12S391的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.9～12所示；
所述D13S317的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.13～16所示；
所述D16S539的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.17～20所示；
所述D18S51的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.21～24所示；
所述D19S433的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.25～28所示；
所述D1S1656的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.29～32所示；
所述D21S11的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.33～36所示；
所述D22S1045的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQID NO.37～40所示；
所述D2S1338的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.41～44所示；
所述D2S441的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.45～48所示；
所述D3S1358的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.49～52所示；
所述D5S818的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.53～56所示；
所述D7S820的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.57～60所示；
所述D8S1179的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.61～64所示；
所述FGA的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.65～68所示；
所述Penta D的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.69～72所示；
所述Penta E的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.73～76所示；
所述TH01的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.77～80所示；
所述TPOX的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.81～84所示；
所述VWA的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.85～88所示；
所述Amelogenin的前引物FW和后引物RV分别如SEQ ID NO.89～90所示。
本发明还提供了一种用于上述技术方案所述检测方法的短串联重复序列检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物组。
本发明还提供了上述技术方案所述的检测方法、引物组或试剂盒在法医鉴定中的应用。
有益效果：
本发明提供了一种短串联重复序列的检测方法，以STR引物对待测DNA样本进行PCDR扩增，对PCDR扩增得到的产物物进行高通量测序，得到STR的序列信息；所述STR引物包括两对嵌套引物。
与传统的基于聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增及毛细管电泳(Capillary Electrophoresis,CE)检测的STR检测方法相比，本发明将PCDR扩增技术与高通量测序技术进行结合用于STR的检测，具有如下优势：
1)具有更高的扩增效率。本发明对每个STR基因座设置了嵌套的两对特异性引物，并使用具有热稳定性及强烈链置换活性的DNA聚合酶进行PCDR扩增反应。在引物延伸过程中，外引物延伸链可置换内引物延伸链，每一次反应循环即两次扩增DNA模板链(见附图1)。在随后的反应中，***引物延伸形成的较长扩增子可作为内引物短扩增子的模板，进一步对扩增效率进行放大。单个DNA分子在经过n轮PCDR循环扩增后，理论上可产生(n2+5n+4)×2n-2个扩增子，远高于PCR扩增的2n个扩增子。因此，本发明相比传统的PCR方法具有更高的扩增效率，有利于低拷贝DNA样本的检测和分析。
2)具备更低的stutter副产物。STR基因座序列由相对固定的基序多次串联重复形成。低复杂度的串联重复序列在聚合酶复制过程中容易出现模板链和引物延伸链的相对滑动，形成stutter产物。stutter产物通常比STR等位基因产物少一个重复基序，且随DNA模板量降低而增加。在某些条件下，stutter产物可能被误判为等位基因，从而对DNA样本的正确分型产生干扰。本发明在STR等位基因扩增过程中引入了链置换过程，内引物延伸先于外引物，其延伸链对STR重复序列进行暂时封闭，增强了由DNA模板、引物延伸链、DNA聚合酶构成的延伸复合体的稳定性，降低了模板链与引物延伸链相对滑动的可能性，因而可减少stutter产物的形成。stutter的降低有利于等位基因的正确分型，提高低拷贝DNA及混合DNA分析的准确性。
3)完整的PCDR产物检测。经过PCDR扩增，两对嵌套的引物可产生四种扩增产物，每种产物具有不同的末端序列(引物序列)和相同的核心序列(STR序列)。普通基于CE的检测方法不能对这些长度各异的扩增子进行有效区分，导致基因座内及不同基因座间等位基因峰出现重叠。本发明首次采用高通量测序技术(MPS技术)对PCDR产物进行检测，通过高通量测序可以完整检测所有扩增子类型。基于此，本发明无需使用荧光基团预先对引物进行标记，也不需要通过扩增子长度对基因座和等位基因进行区分，因而允许灵活的引物设置和更多基因座的同时扩增。此外，由于能够直接获得STR的序列信息，本发明所述检测方法能够同时检测到STR等位基因的序列变异，提高基因座的鉴别能力。
4)单管靶向复合扩增，兼容PCR热循环反应。本发明能够实现多个基因座的单管复合扩增，同时，具有广泛的仪器兼容性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为PCDR扩增STR基因座的技术原理；
图2为梯度稀释DNA样品经复合PCDR和复合PCR体系扩增后的产物浓度；
图3为复合PCDR及复合PCR扩增产物各基因座平均覆盖度。
具体实施方式
本发明提供了一种短串联重复序列的检测方法，以STR引物对待DNA测样本进行PCDR扩增，对PCDR扩增得到的产物进行高通量测序，得到STR的序列信息；所述STR引物包括两对嵌套引物。
本发明以STR引物对待测DNA样本进行PCDR扩增，得到PCDR扩增产物。本发明所述短串联重复序列的数量优选≥2，更优选为10～30个。本发明每一个短串联重复序列均包括一组STR引物对，每一组STR引物对包括两对嵌套引物，优选包括前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR。本发明所述前***引物OF优选位于所述前引物FW的5’端上游，所述后***引物OR位于所述后引物RV的5’端上游。
本发明对所述短串联重复序列的种类和数量均没有特殊限定，任意短串联重复序列均可以采用本发明所述的检测方法进行测定。在本发明的具体实施过程中，所述短串联重复序列优选包括法医常染色体STR基因座和/或性别鉴定基因座，更优选包括法医常染色体STR基因座和性别鉴定基因座；所述法医常染色体STR基因座包括CSF1PO，D10S1248，D12S391，D13S317，D16S539，D18S51，D19S433，D1S1656，D21S11，D22S1045，D2S1338，D2S441，D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，FGA，Penta D，Penta E，TH01，TPOX和VWA中的任意一种或多种，更优选包括CSF1PO，D10S1248，D12S391，D13S317，D16S539，D18S51，D19S433，D1S1656，D21S11，D22S1045，D2S1338，D2S441，D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，FGA，Penta D，Penta E，TH01，TPOX和VWA；所述性别鉴定基因座优选为Amelogenin。尽管本发明以上述短串联重复序列为例对本发明中的检测方法进行说明，但不能仅仅将上述种类和数量的短串联重复序列认定为本发明全部的保护范围。
本发明所述PCDR扩增优选为热循环扩增；所述热循环扩增优选包括初始变性阶段、预扩增阶段、常规扩增阶段和终延伸阶段；所述初始变性阶段的扩增程序：92℃预变性2min；1个循环；所述预扩增阶段的扩增程序：92℃变性0.5min，62～60℃(每个循环下降0.2℃)退火1min，68℃延伸1.5min；10个循环；所述常规扩增阶段的扩增程序：92℃变性0.5min，60℃退火1min，68℃延伸1.5min；18个循环；所述终延伸阶段的扩增程序：68℃延伸10min；1个循环。本发明所述热循环扩增优选还包括维持阶段，所述维持阶段优选以4℃维持扩增产物的状态。
本发明用于所述PCDR扩增的试剂优选包括：SD聚合酶、SD聚合酶反应缓冲液、MgCl2、dNTP mix和水。本发明所述DNA聚合酶优选为耐热且具有强链置换活性的SDDNA聚合酶。在本发明的实施过程中，本发明所述SD聚合酶的浓度优选为10～100U/μL更优选为50U/μL，所述SD聚合酶优选购自Bioron，德国。本发明所述SD聚合酶反应缓冲液优选为10×SD聚合酶反应缓冲液，所述SD聚合酶反应缓冲液优选的购自Bioron，德国。本发明所述MgCl2优选为MgCl2溶液，所述MgCl2溶液的浓度优选为10～200mM，更优选为100mM；所述MgCl2优选的购自Thermo Fisher Scientific，美国；本发明所述dNTP mix的浓度优选为1～100mM，更优选为10mM，所述dNTP mix优选购自Promega，美国。本发明用于所述PCDR扩增的体系优选包括所述用于所述PCDR扩增的试剂、STR引物和基因组DNA。本发明所述PCDR扩增的体系优选为复合PCDR扩增体系，即多个STR基因座单管复合扩增；所述PCDR扩增的体系优选如表1所示：
表1 PCDR扩增体系
成分 PCDR扩增体系
SD聚合酶反应缓冲液(10×) 2.0μL
基因组DNA 1.0μL(0.05～10ng)
<![CDATA[MgCl<sub>2</sub>]]> 0.75μL
dNTP mix 1.0μL
引物混合物 2.5μL
SD聚合酶 0.05μL
<![CDATA[H<sub>2</sub>O]]> 补足体积至25μL
本发明所述表1中的引物混合物优选为1组或多组STR引物的混合引物，每一组STR引物优选包括前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR。本发明所述前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR的反应浓度均优选为0.05～1μM，更优选为0.1～0.8μM。本发明所述表1中基因组DNA的用量优选为0.05～10ng，更优选为0.5ng。
得到所述PCDR扩增产物后，本发明对PCDR扩增得到的产物进行高通量测序，得到STR的序列信息。进行所述高通量测序前，本发明优选还包括对所述PCDR扩增产物进行纯化，本发明对所述纯化方式没有特殊限定，采用本领域中常规纯化方式即可。在本发明的具体实施过程中采用的是MinElute PCR Purification Kit，购自QIAGEN，德国。
本发明所述高通量测序优选包括文库构建、测序反应和数据分析。本发明对所述文库构建的过程没有特殊限定，采用本领域中常规文库构建过程即可，在本发明的具体实施过程中，采用的是NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina试剂盒，购自New England Biolabs，美国。本发明优选将对单个样本构建的单一文库混合成混合文库后再进行测序反应。
本发明所述测序反应优选为双端250bp测序。本发明对所述测序反应所使用的测序仪没有特殊限定，采用本领域中常规测序仪即可，在本发明的具体实施过程中，采用的是Illumina Novaseq 6000测序仪(Illumina，美国)。
完成所述测序反应后，本发明优选对测序反应得到的数据进行数据分析，得到STR的等位基因分型信息。本发明所述数据分析优选包括质量控制、拼接、提取扩增子和等位基因分型。本发明对所述数据分析的具体过程和软件没有特殊限定，采用本领域常规过程和软件即可。在本发明的具体实施过程中，优选采用fastp v0.23.1进行质量控制，去除Phred质量值小于15或未识别碱基大于5的read。本发明优选使用FLASH v1.2.11对质量控制后的序列进行拼接。本发明优选采用Seqkit v2.0.0从拼接后的序列中提取扩增子；所述扩增子优选包括FW+RV，OF+RV，FW+RV和OF+OR四种引物序列组合扩增得到的扩增子。本发明优选采用FDSTools2.0软件包对提取得到的扩增子进行等位基因分型。本发明优选将所述等位基因分型后的数据进行如下判别：N-1 stutter定义为比等位基因序列少1个STR基序的序列；N-2 stutter定义为比等位基因少2个STR基序的序列。stutter比率(Stutter Ratio,SR)为stutter序列read数与相应等位基因read数的比值。杂合子平衡度(HeterozygoteBalance，Hb)定义为杂合基因座低覆盖度等位基因read数与高覆盖度等位基因的比值。组间均值差异使用双尾Mann-Whitney U检验进行统计检验，若p值小于0.05则认为两组数据均值差异具有统计学显著性。
本发明还提供了一种用于上述技术方案所述检测方法的短串联重复序列检测的引物组，所述短串联重复序列包括法医常染色体STR基因座和/或性别鉴定基因座；所述法医常染色体STR基因座包括CSF1PO，D10S1248，D12S391，D13S317，D16S539，D18S51，D19S433，D1S1656，D21S11，D22S1045，D2S1338，D2S441，D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，FGA，Penta D，Penta E，TH01，TPOX和VWA中的任意一种或多种；所述性别鉴定基因座为Amelogenin；所述CSF1PO的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQID NO.1～4所示；所述D10S1248的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.5～8所示；所述D12S391的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.9～12所示；所述D13S317的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.13～16所示；所述D16S539的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.17～20所示；所述D18S51的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.21～24所示；所述D19S433的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.25～28所示；所述D1S1656的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.29～32所示；所述D21S11的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.33～36所示；所述D22S1045的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.37～40所示；所述D2S1338的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.41～44所示；所述D2S441的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.45～48所示；所述D3S1358的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.49～52所示；所述D5S818的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.53～56所示；所述D7S820的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.57～60所示；所述D8S1179的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.61～64所示；所述FGA的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.65～68所示；所述Penta D的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.69～72所示；所述Penta E的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.73～76所示；所述TH01的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.77～80所示；所述TPOX的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.81～84所示；所述VWA的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.85～88所示；所述Amelogenin的前引物FW和后引物RV分别如SEQ ID NO.89～90所示。本发明所述法医常染色体STR基因座优选包括CSF1PO，D10S1248，D12S391，D13S317，D16S539，D18S51，D19S433，D1S1656，D21S11，D22S1045，D2S1338，D2S441，D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，FGA，Penta D，Penta E，TH01，TPOX和VWA。本发明所述性别鉴定基因座Amelogenin不设置***引物。
在本发明中，所述CSF1PO，D10S1248，D12S391，D13S317，D16S539，D18S51，D19S433，D1S1656，D21S11，D22S1045，D2S1338，D2S441，D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，FGA，Penta D，Penta E，TH01，TPOX和VWA的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR序列及浓度，以及Amelogenin的前引物FW、后引物RV的序列和浓度如表2所示。
表2前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR的具体序列、其在引物混合物中的浓度
Figure BDA0003754866190000071
Figure BDA0003754866190000081
Figure BDA0003754866190000091
本发明还提供了一种用于上述技术方案所述检测方法的短串联重复序列检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物组。本发明所述试剂盒优选还包括PCDR扩增的试剂和/或高通量测序用试剂，更优选包括PCDR扩增的试剂和高通量测序用试剂。本发明所述PCDR扩增的试剂优选与上述技术方案中相同，不再进行赘述。本发明对所述高通量测序用试剂没有特殊限定，采用本领域中常规试剂即可，在本发明的具体实施过程中，采用的高通量测序用试剂优选与上述技术方案中相同，在此不再进行赘述。
本发明还提供了上述技术方案所述的检测方法、引物组或试剂盒在法医鉴定中的应用。本发明为首次将PCDR技术和高通量测序技术结合进行短串联重复序列的鉴定尤其是法医STR的鉴定的技术方案。在本发明中，每个STR基因组均使用两对嵌套的内外引物进行PCDR扩增，较常规PCR扩增方法能够有效提高DNA样本的扩增效率。同时基于MPS高通量测序的高通量特点和碱基水平的分辨率，本发明能够在不增加图谱复杂度的情况下实现PCDR引物的灵活设置，并可以检测到更多的等位基因多态性。此外，本发明有效减少了STR扩增过程中stutter产物的形成，有利于低拷贝和混合DNA样本的检测。基于此，本发明中所述的检测方法、引物组和试剂盒均可以应用于法医鉴定中，为法医鉴定提供技术基础。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
如无特殊说明，在本发明实施例中所采用的试验方法均为本领域中的常规方法，所采用的试剂均可通过常规购买渠道获得。
实施例1
STR基因座引物设计：
本实施例中选择22个常染色体STR和1个性别鉴定基因座构建复合PCDR扩增体系。涉及的法医STR基因座包括：CSF1PO，D10S1248，D12S391，D13S317，D16S539，18S51，D19S433，D1S1656，D21S11，D22S1045，D2S1338，D2S441，D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，FGA，Penta D，Penta E，TH01，TPOX，VWA。性别鉴定基因座为Amelogenin。每个STR基因座均使用一对前引物(FW)和后引物(RV)，以及位于前后引物外侧成对的前***引物(OF)和后***引物(OR)。两对引物分别对STR基因座进行特异性扩增，其中两条***引物用于启动内引物延伸链的置换反应。PCDR扩增原理见附图1。性别鉴定基因座Amelogenin不设置***引物。本发明所涉及的23个基因座相应的引物序列及浓度如下表2所示，不再进行赘述。
梯度稀释DNA模板制备：
2800M标准DNA从Promega公司(美国)购得。使用Investigator Quantiplex KitPCR Assay(QIAGEN，德国)，在7500 Real-time PCR System(Applied Biosystems，美国)上对该标准品进行定量。根据定量结果，用超纯水将该标准品分别稀释至500pg/μL，250pg/μL，125pg/μL，62.5pg/μL，31.3pg/μL，15.6pg/μL。-20℃保存备用。
复合扩增体系配置：
根据表2中引物及浓度构建复合PCDR反应引物组，并设置相应的复合PCR对照反应。其中，复合PCDR体系为实施本发明的实验体系，复合PCR体系为对照体系，二者区别在于：复合PCDR体系含有表2中22个STR基因座的FW、RV、OF和OR引物，以及Amelogenin基因座的FW、RV引物；复合PCR体系仅包括表1中FW和RV引物。由于不含有启动链置换反应的***引物OF和OR，复合PCR体系中各基因座均以PCR的方式进行扩增，且其他条件与复合PCDR体系完全一致，以说明本发明的原理和优势。
复合PCDR及复合PCR反应体系所用试剂包括：1.SD聚合酶50U/μL(Bioron，德国)；2.10×SD聚合酶反应缓冲液(Bioron，德国)；3.MgCl2溶液100mM(Thermo FisherScientific，美国)；dNTP mix 10mM(Promega，美国)。具体扩增体系构成如表3所示：
表3复合PCDR体系及复合PCR体系
Figure BDA0003754866190000101
Figure BDA0003754866190000111
其中复合PCDR体系的引物为FW、RV、OF、OR引物及相应浓度，复合PCR体系中的引物为FW、RV引物。
热循环扩增：
复合PCDR反应和复合PCR反应在热循环仪中进行。热循环仪扩增程序见表4。
表4复合PCDR和复合PCR热循环扩增程序
Figure BDA0003754866190000112
扩增得到的产物4℃，避光保存。
测序文库构建及测序：
扩增产物经过MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN，德国)纯化，以25μL体积进行洗脱。纯化后产物使用NanoDrop 1000超微量分光光度计(Thermo FisherScientific，美国)测定纯度，并使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Invitrogen，美国)和Qubit 4荧光计测定产物浓度。随后，取15μL纯化后的扩增产物进行测序文库构建。
建库使用NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina试剂盒(NewEngland Biolabs,美国)，扩增产物经末端修复、加A尾后，与NEBNext Multiplex Oligosfor Illumina(New England Biolabs，美国)全长接头连接，获得完整的测序模版。使用1.3×的Agencourt AMPure XP磁珠(Beckman Coulter，美国)对文库进行纯化和片段筛选。文库质量使用Agilent DNA 1000 Kit(Agilent Technologies，美国)在2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies，美国)上进行评估。然后使用KAPA Library QuantificationKits(KAPA Biosystems，美国)在7500 Real-time PCR System(Applied Biosystems，美国)上对文库进行精确定量。
经过定量后，将各样本的单一文库稀释至10mM，再按相同体积进行混合构建最终的测序文库。将混合文库转移至cBot Cluster Generation System(Illumina，美国)上进行测序簇生成，最后在Illumina Novaseq 6000测序仪(Illumina，美国)上进行双端250bp测序。
测序数据分析：
测序数据FASTQ文件使用fastp v0.23.1进行质量控制，去除Phred质量值小于15或未识别碱基大于5的read。然后使用FLASH v1.2.11对双端测序read进行拼接。根据FW+RV，OF+RV，FW+RV及OF+OR四种引物序列组合，使用Seqkit v2.0.0从经双端read拼接后的FASTQ文件中提取PCDR扩增产生的四种扩增子。测序read的FASTQ文件使用FDSTools2.0软件包进行等位基因分型。
等位基因判别：
N-1 stutter定义为比等位基因序列少1个STR基序的序列，N-2 stutter定义为比等位基因少2个STR基序的序列。stutter比率(Stutter Ratio,SR)为stutter序列read数与相应等位基因read数的比值。杂合子平衡度(Heterozygote Balance，Hb)定义为杂合基因座低覆盖度等位基因read数与高覆盖度等位基因的比值。组间均值差异使用双尾Mann-Whitney U检验进行统计检验，若p值小于0.05则认为两组数据均值差异具有统计学显著性。
结果数据：
梯度稀释DNA样品经复合PCDR和复合PCR体系扩增后产物浓度如图2所示：其中图2中的误差条指示数据标准差。
由图2可以得出：不同数量DNA模板经本发明复合PCDR体系扩增后产物量均高于经复合PCR体系扩增的对照组，且差异具有统计学显著性(p＝8.9E-06)。以500pg DNA模板为例，经复合PCDR扩增后产物浓度为67.1±3.5ng/μL，远高于复合PCR扩增后的8.4±0.6ng/μL。表明本发明复合PCDR具有更高的扩增效率。
实施例2
采用本发明中的检测方法扩增46个单一来源DNA样本
DNA提取和定量
本实施例中的静脉血样本由46名健康志愿者提供。静脉采血后加入EDTA-Na2进行抗凝处理。使用QIAmp DNA Mini Kit(QIAGEN，德国)从静脉血样本中提取基因组DNA。DNA提取也可以采用其他经过广泛验证的方法，如Chelex100法，酚氯仿法等。9948 DNA标准品从AGCU公司(中国)购得。DNA定量使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Invitrogen，美国)在Qubit 4荧光定量仪上进行。DNA定量操作按试剂盒和仪器制造商提供的说明书进行。根据定量结果，将DNA样本分别稀释至0.5ng/μL，-20℃保存备用。
本实施例中的复合扩增体系配置、热循环扩增反应、测序文库构建、测序和数据分析均按照实施例1中的方法进行，不再进行赘述。
结果数据：
1、复合PCDR及复合PCR扩增产物各基因座平均覆盖度结果
本发明首先对内外引物组合产生的不同扩增产物类型进行合并分析。对于本发明中的复合PCDR体系，22个STR基因座平均覆盖度为26398±15997，高于对照组复合PCR体系的平均覆盖度19188±13018。随后，本发明利用引物序列匹配方法，对复合PCDR中四种不同的扩增产物进行提取。如图3所示，本发明提出的方法成功检测到由引物组合FW+RV，OF+RV，FW+OR及OF+OR产生的S、M1、M2及L全部四种PCDR扩增产物类型。其中，扩增产物S平均覆盖度最高，M1及M2次之，L最少。四种产物类型平均read数比值S:M1:M2:L约为81:12:12:1。
在图3中，Gross表示合并PCDR不同扩增产物类型；S、M1、M2、L分别为引物组合FW+RV，OF+RV，FW+OR及OF+OR经PCDR产生的扩增产物。误差条指示数据标准差。
2、复合PCDR及复合PCR扩增产物各基因座杂合平衡度
46个单一来源DNA样本经本发明复合PCDR体系扩增后，基因座平均杂合平衡度为0.80±0.17，对照组复合PCR体系基因座平均杂合度为0.81±0.15，二者差异无统计学显著性(p＝0.65)。
3、复合PCDR及复合PCR扩增产物各基因座stutter比率(SR)
对PCDR不同扩增产物类型进行合并分析表明，本发明复合PCDR体系显著降低了STR等位基因复制过程中的stutter产物。对于22个STR基因座，46个样本经复合PCDR体系扩增后的N-1SR如表4所示，基因座平均N-1SR为6.9±3.9％，而复合PCR对照体系的平均N-1SR则为8.3±4.5％(p＝1.4E-17)。对于更为罕见的N-2stutter，其在本发明复合PCDR组的平均SR为0.59±0.41％，显著低于其在复合PCR对照组中的平均值0.75±0.53％(p＝1.8E-11)。本发明对STR扩增中stutter产物的抑制作用具有基因座的普适性。以N-1 stutter为例，在本发明复合PCDR扩增体系中所有22个基因座均表现出SR的降低，其中73.3％的基因座stutter均值相对PCR对照组的降低具有统计学显著性。
表4复合PCDR和复合PCR体系STR基因座N-1SR
基因座 复合PCR(均值±标准差) 复合PCDR(均值±标准差) 显著性
CSF1PO 8.3±2.0％ 7.5±1.7％ NS
D10S1248 10.3±2.9％ 9.6±2.0％ *
D12S391 12.8±4.9％ 10.7±4.4％ ***
D13S317 5.3±2.2％ 4.3±1.9％ **
D16S539 5.9±4.4％ 4.8±3.6％ NS
D18S51 10.5±2.5％ 8.3±2.1％ ***
D19S433 11.4±3.3％ 9.0±2.2％ ***
D1S1656 9.9±4.5％ 8.4±3.9％ *
D21S11 12.4±1.9％ 10.8±1.6％ ***
D22S1045 12.4±4.3％ 11.5±4.2％ NS
D2S1338 11.1±5.2％ 8.6±4.7％ ***
D2S441 5.8±3.2％ 5.0±2.9％ NS
D3S1358 10.6±1.4％ 8.7±1.1％ ***
D5S818 7.9±2.8％ 6.8±2.6％ **
D7S820 5.6±3.5％ 4.7±3.1％ NS
D8S1179 9.3±3.0％ 6.6±3.4％ ***
FGA 9.8±2.5％ 7.9±2.0％ ***
Penta D 2.5±1.0％ 2.2±0.9％ NS
Penta E 4.6±2.2％ 4.3±2.1％ NS
TH01 3.3±1.5％ 2.9±2.2％ *
TPOX 4.3±1.7％ 3.1±1.1％ ***
VWA 7.8±5.8％ 6.2±4.8％ *
注：显著性标记：***，p<0.001；**，p<0.01；p<0.05；NS，p≥0.05。
4、复合PCDR及复合PCR扩增产物同等位基因
本发明使用MPS技术(大规模平行测序)对扩增产物进行检测，相比基于CE的检测方法能够提供更多STR序列变异，提高STR基因座的多态性。经过本发明中复合PCDR体系扩增和MPS检测后，我们在20个样本中观察到29个同等位基因。如表5所示，这些等位基因具有相同的片段长度，但存在重复区段或侧翼序列的变异。基于序列的同等位基因命名规则参考FDSTools软件包说明书。
表5单一来源DNA样本STR同等位基因
Figure BDA0003754866190000131
Figure BDA0003754866190000141
对比例1
采用EX25荧光试剂盒(AGCU，中国)与本发明进行对比。该试剂盒采用PCR反应扩增22个常染色体STR基因座，扩增产物通过CE进行检测和分型。该试剂盒在比较例中的使用方法为：
DNA提取和定量：按照实施例2中的方法提取实施例2中的46个样本的DNA并对DNA进行定量和稀释；
扩增体系配置：按试剂盒说明书配置扩增体系。所用基因组DNA模板与实施例2保持一致；
热循环扩增反应：按试剂盒说明书进行热循环扩增；
扩增产物检测：取1.0μL扩增产物与8.9μL去Hi-Di甲酰胺(Applied Biosystems，美国)和0.1μLAGCU Marker SIZ-500分子量内标(AGCU，中国)混合，用3500 GeneticAnalyzer(Applied Biosystems，美国)基因分析仪进行荧光检测；
等位基因峰和stutter峰的判别：使用GeneMapper ID-X 1.5进行STR等位基因分型。stutter峰定义为DNA图谱等位基因峰前少1个STR基序处的峰。stutter比率(SR)为stutter峰高除以相应等位基因峰高。
结果数据：
1、STR等位基因分型一致性
使用EX25试剂盒扩增结合CE检测成功获得46个单一来源DNA样本的完整分型，但其仅能根据STR长度对等位基因进行区分，不能区分只有序列差异的同等位基因。
与实施例2相比，本发明所提出的使用复合PCDR扩增结合MPS检测的方法对STR等位基因长度多态性的分型准确率为100％。
2、stutter比率(SR)
EX25图谱N-1stutter平均比率为7.7±3.1％，显著高于实施例2中的平均SR(p＝2.6E-06)。各基因座平均SR见表6。
表6 EX25中与本发明相同STR基因座平均SR
基因座 SR(均值±标准差) 基因座 SR(均值±标准差)
CSF1PO 7.6±1.6％ D2S441 6±1.8％
D10S1248 10.1±2％ D3S1358 10.3±1.6％
D12S391 11.8±2.2％ D5S818 8.6±1.9％
D13S317 5.1±2.1％ D7S820 5.6±1.7％
D16S539 6.6±1.9％ D8S1179 8±2.1％
D18S51 9±2.4％ FGA 8.2±1.5％
D19S433 7.8±1.8％ Penta D 2.2±0.9％
D1S1656 9.3±1.6％ Penta E 5.1±2％
D21S11 11±1.7％ TH01 2.6±0.9％
D22S1045 8.8±3.5％ TPOX 4.1±1.2％
D2S1338 10.2±1.7％ vWA 7.9±2.9％
由此可以得出：与常规基于PCR-CE的法医STR试剂盒相比，本发明具有同等的分型准确率，且能够区分STR等位基因序列变异。同时，本发明能够有效减少STR扩增过程中stutter副产物的产生。
由以上实施例可以得出：本发明所述PCDR扩增技术能够显著提高DNA样本的扩增效率，结合MPS检测技术，首次实现对PCDR的全部扩增产物进行有效检测。相比于基于PCR的方法，本发明能够显著降低STR等位基因复制过程中的stutter副产物，提高STR基因座检测的可靠性；同时，本发明提出的PCDR扩增方法几乎不影响杂合基因座等位基因扩增平衡性；此外，本发明还可有效检测STR等位基因内部变异，提高STR基因座多态性程度。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种短串联重复序列的检测方法，其特征在于，以STR引物对待测DNA样本进行PCDR扩增，对PCDR扩增得到的产物进行高通量测序，得到STR的序列信息；所述STR引物包括两对嵌套引物。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述STR引物包括前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR；
所述前***引物OF位于所述前引物FW的5’端上游，所述后***引物OR位于所述后引物RV的5’端上游。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述短串联重复序列的数量≥2；每一个短串联重复序列包括一组STR引物。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述短串联重复序列包括法医常染色体STR基因座和/或性别鉴定基因座。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述法医常染色体STR基因座包括CSF1PO，D10S1248，D12S391，D13S317，D16S539，D18S51，D19S433，D1S1656，D21S11，D22S1045，D2S1338，D2S441，D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，FGA，Penta D，Penta E，TH01，TPOX和VWA中的任意一种或多种；所述性别鉴定基因座为Amelogenin。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述PCDR扩增为热循环扩增；
所述热循环扩增包括初始变性阶段、预扩增阶段、常规扩增阶段和终延伸阶段；
所述初始变性阶段：92℃预变性2min；1个循环；所述预扩增阶段：92℃变性0.5min，62～60℃(每个循环下降0.2℃)退火1min，68℃延伸1.5min；10个循环；
所述常规扩增阶段：92℃变性0.5min，60℃退火1min，68℃延伸1.5min；18个循环；
所述终延伸阶段：68℃延伸10min；1个循环。
7.根据权利要求1～2和4～6任一项所述的检测方法，其特征在于，用于所述PCDR扩增的试剂包括：SD聚合酶、SD聚合酶反应缓冲液、MgCl2、dNTPmix和水。
8.一种用于权利要求1～7任一项所述检测方法的短串联重复序列检测的引物组，其特征在于，所述短串联重复序列包括法医常染色体STR基因座和/或性别鉴定基因座；所述法医常染色体STR基因座包括CSF1PO，D10S1248，D12S391，D13S317，D16S539，D18S51，D19S433，D1S1656，D21S11，D22S1045，D2S1338，D2S441，D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，FGA，Penta D，Penta E，TH01，TPOX和VWA中的任意一种或多种；所述性别鉴定基因座为Amelogenin；
所述CSF1PO的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.1～4所示；
所述D10S1248的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.5～8所示；
所述D12S391的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.9～12所示；
所述D13S317的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.13～16所示；
所述D16S539的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.17～20所示；
所述D18S51的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.21～24所示；
所述D19S433的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.25～28所示；
所述D1S1656的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.29～32所示；
所述D21S11的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.33～36所示；
所述D22S1045的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.37～40所示；
所述D2S1338的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.41～44所示；
所述D2S441的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.45～48所示；
所述D3S1358的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.49～52所示；
所述D5S818的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.53～56所示；
所述D7S820的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.57～60所示；
所述D8S1179的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.61～64所示；
所述FGA的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.65～68所示；
所述Penta D的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.69～72所示；
所述Penta E的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ IDNO.73～76所示；
所述TH01的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.77～80所示；
所述TPOX的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.81～84所示；
所述VWA的前引物FW、后引物RV、前***引物OF和后***引物OR分别如SEQ ID NO.85～88所示；
所述Amelogenin的前引物FW和后引物RV分别如SEQ ID NO.89～90所示。
9.一种用于权利要求1～7任一项所述检测方法的短串联重复序列检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求8所述的引物组。
10.权利要求1～7任一项所述的检测方法、权利要求8所述的引物组或权利要求9所述的试剂盒在法医鉴定中的应用。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004058987A2 (en) * 2002-12-20 2004-07-15 Qiagen Gmbh Nucleic acid amplification
CN101921861A (zh) * 2010-08-30 2010-12-22 河北医科大学 荧光标记str进行人类基因分型的试剂盒及检测方法
US20120309637A1 (en) * 2011-05-12 2012-12-06 Netbio, Inc. Methods and compositions for rapid multiplex amplification of str loci
US20140370580A1 (en) * 2010-03-09 2014-12-18 Netbio, Inc. Unitary Biochip Providing Sample-in to Results-out Processing and Methods of Manufacture
CN107012225A (zh) * 2017-04-20 2017-08-04 司法部司法鉴定科学技术研究所 一种基于高通量测序的str基因座的检测试剂盒及检测方法
CN113088575A (zh) * 2021-05-13 2021-07-09 四川大学 一种扩增短串联重复序列的方法、引物组及试剂盒

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004058987A2 (en) * 2002-12-20 2004-07-15 Qiagen Gmbh Nucleic acid amplification
US20140370580A1 (en) * 2010-03-09 2014-12-18 Netbio, Inc. Unitary Biochip Providing Sample-in to Results-out Processing and Methods of Manufacture
CN101921861A (zh) * 2010-08-30 2010-12-22 河北医科大学 荧光标记str进行人类基因分型的试剂盒及检测方法
US20120309637A1 (en) * 2011-05-12 2012-12-06 Netbio, Inc. Methods and compositions for rapid multiplex amplification of str loci
CN107012225A (zh) * 2017-04-20 2017-08-04 司法部司法鉴定科学技术研究所 一种基于高通量测序的str基因座的检测试剂盒及检测方法
CN113088575A (zh) * 2021-05-13 2021-07-09 四川大学 一种扩增短串联重复序列的方法、引物组及试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CLAIRE L HARRIS等: "Polymerase chain displacement reaction", BIOTECHNIQUES, vol. 54, no. 2, 28 February 2013 (2013-02-28), pages 93 *
YUGUO HUANG等: "A proof-of-principle study on implementing polymerase chain displacement reaction (PCDR) to improve forensic low-template DNA analysis", FORENSIC SCI INT GENET, vol. 56, 23 October 2021 (2021-10-23), pages 3, XP086885732, DOI: 10.1016/j.fsigen.2021.102609 *
张楚楚等: "基于二代测序平台的法医STR分型", 热带医学杂志, vol. 17, no. 12, 31 December 2017 (2017-12-31), pages 1573 - 1576 *
黄阿源等: "组织中少量细胞的微卫星长度精细分析", 中国生物化学与分子生物学报, vol. 32, no. 6, 30 June 2016 (2016-06-30), pages 714 - 720 *

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