CN112342303A - 一种基于ngs的人类y染色体str和snp遗传标记联合检测体系及检测方法 - Google Patents

一种基于ngs的人类y染色体str和snp遗传标记联合检测体系及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于法医遗传学技术领域，具体涉及一种基于NGS的人类Y染色体STR和SNP遗传标记联合检测体系及检测方法。本发明以建设Y染色体数据库为目的，选择男性特有的Y染色体STR以及Y染色体SNP标记，成功构建出一个50个Y‑STR遗传标记及150个Y‑SNP遗传标记的联合检测体系，实现了一次性地检测多种遗传信息，为国内法医NGS技术检测及相关领域的快速发展提供了技术支持。

Description

一种基于NGS的人类Y染色体STR和SNP遗传标记联合检测体系 及检测方法
技术领域
本发明属于法医遗传学技术领域，具体涉及一种基于NGS的人类Y染色体STR和SNP遗传标记联合检测体系及检测方法。
背景技术
Y染色体是一类仅存在于男性个体的染色体，其非重组区具有父系遗传、非重组、有效群体小和在地理学上的特殊性等特点。由于其仅存在于男性个体，使其在法医学方面发挥着重要作用，如在男性作为嫌疑人的性侵案件中，以及群体灾难事件遇难者身源鉴定和失踪人员调查中。而由于其父系遗传及地理学上的特殊性等特点，也使得其成为研究人类进化、群体结构的重要工具之一。近年来，越来越多的法医学工作者注意到，由于不同人群和不同地区间单倍群的分布存在一定的特征，可以通过对检案中未知来源的男性样本进行单倍群划分以推断其地理来源或所属群体，从而辅助案件侦查，因而，构建Y染色体数据库具有重要的法医学意义。
在上述背景下，我们有必要构建一个适用于中国群体的、简约的、高分辨率的数据库，这将不仅为检案中未知样本的溯源提供便利，在进一步了解中国群体亚结构方面也可提供一定的帮助。
在法医实际检案中，用于法医DNA分析的样品通常数量有限且质量较差，个体识别等疑难案件需要检测更多的遗传标记，获取更多的遗传信息。目前，在法医领域，荧光标记多重扩增结合毛细管电泳(PCR-CE)是STR分型的主流技术，目前可以做到一个体系中复合40多个STR位点，但仍旧不满足实际需求。另外，随着分辨率的提高，势必需要使用更多的Y-SNP位点，其中包括InDel位点，这就意味着需要一种能同时大批量检测包括InDel位点在内的SNP位点的方法，而这个要求是传统的检测方法，如SNaPshot无法满足的。
下一代测序技术(Next-generation sequencing technology)不受荧光标记限制可以在一个体系中检测更多的遗传标记，而且可同时获得个基因座的长度和序列信息，增加STR和SNP的有效等位基因数目，提高信息含量，是解决上述疑难案件的更好选择。
国外法庭科学二代测序领域有ForenSeqTM DNA Signature Prep试剂盒，允许同时测序59个STR(27个常染色体STR(aSTR)，7个X染色体STR(X-STR)，和24个Y染色体STR(Y-STR))和170个SNP(94个身份SNP(iSNPs)，56个祖先SNP(aSNP)和22个表型SNP(pSNP)，但其成本过高，同时位点的组合不符合中国人群的遗传数据特点，目前国内还没有类似于STR和SNP联合遗传标记检测试剂盒商品化的开发，国内急需构建一种适用于中国人群遗传特征的STR和SNP联合检测的技术体系及检测方法，在法医试剂国产领域有所突破。
在国内法医领域目前还存在以下问题亟待解决：
1.现有市面上的Y-STR试剂盒多为进口试剂盒，位点数目多为20几个，且所选位点并不符合中国人群的遗传数据特点，Y-STR位点数目不足，会致使返回结果个体数过多，无法有效减少刑侦工作量。另外，基于Y-STR本身突变和缺失的可能，Y-STR位点数目越多，会出现分型缺失或异常的概率越大，导致排查遗漏。
2.随着第三代遗传标记SNP的发现，国内外陆续有大量研究机构投入相关研究中，也有少量成品常染色体SNP检测试剂盒投入市场，相对而言，针对Y-SNP的遗传多态性研究仍显不足：群体数据较少，突变率研究不够等。且国外研究者获得的Y-SNP群体遗传学数据并不适用于我国人群，因此这些不足严重影响了Y-SNP位点在我国司法鉴定实务中的应用。
综上所述，筛选一组适宜的Y染色体STR和SNP遗传标记，应用二代测序技术，构建一个适用于中国人群的、简约的、高分辨率的、可将中国男性个体样本正确归属至现已公认的Y染色体***发育树分枝上的二代测序体系，将为法医的样本归属问题提供一种新的技术手段。同时，可构建中国男性个体样本数据库，辅助家系排查案件侦查手段，为公安案件的排查提供一种高效、高分辨，精准的技术手段。随着二代测序技术的普及，在此基础上开发出基于二代测序检测平台的Y染色体STR和SNP二代测序试剂盒，将极大地推动这种新技术在法医样本溯源和实际案件破获的推广和应用。
发明内容
本发明意在，筛选一组适宜我国人群群体遗传多态性分析的Y染色体STR和SNP遗传标记，应用二代测序技术，构建一个适用于中国人群的、简约的、高分辨率的、可将中国男性个体样本正确归属至现已公认的Y染色体***发育树分枝上的二代测序体系，为法医的样本归属问题提供一种新的技术手段。针对法医DNA样本中最常见难题之一的混合DNA样本进行分析，提供更加精准的建库数据，对全国范围的STR/SNP数据库建设具有重要意义；同时，也可以用于家系的精准排查、个人身份鉴别、群体迁徙研究、群体进化树研究等；另外，对国产多位点STR/SNP试剂盒的研发也提供借鉴方案。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于NGS技术检测200个基因座的检测体系，包含50个Y染色体STR基因座和150个Y染色体SNP遗传标记。
优选地，所述STR基因座的遗传标记名称分别为DYS19、DYS385a/b、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYF387S1a/b、DYS448、DYS456、DYS458、DYS635、GATA_H4、DYS481、DYS533、DYS576、DYS643、DYS460、DYS549、DYS520、DYS505、DYS518、DYS627、DYS570、DYS527a/b、DYS447、DYS444、DYS557、DYS596、DYS388、DYF404S1a/b、DYS593、DYS645、GATA-A10、DYS626、DYS612、DYS526、DYF399S1、DYF403S1、DYS449、DYS547、DYS522。
优选地，各遗传标记对应扩增引物如表1所示。
优选地，所述Y染色体SNP遗传标记及其对应的扩增引物序列如表2所示。
本发明还提供了一种利用所述检测体系检测混合DNA样本的方法，操作步骤如下：
S1、多重PCR扩增目的基因；
S2、对目的基因进行测序及数据分析。
发明人在试验过程中，针对市面上的Y-STR试剂盒位点数目不足的情况，进行了大量信息收集及整理：(1)参考法庭科学STR已知分型参照物质技术要求-GA/T1378-2018；(2)参考国内常用的商业化Y-STR试剂盒位点信息；(3)参考已有文献中研究的适用于中国人群的Y-STR群体遗传多态性的位点；(4)以低频突变，相对保守的Y-STR基因座为核心，适当增加多拷贝Y-STR；最终选取50个Y染色体STR遗传标记。
同时，针对Y-SNP的遗传多态性研究仍显不足的情况，本发明特别的进行了大量信息收集及整理：(1)参考国内已有专利筛选得到的20个从属于单倍群D亚单倍群，并与中国人群密切相关的Y染色体SNP遗传标记；(CN 108823294A)(2)参考已有的研究开发的Y染色体SNP遗传标记试剂盒(ForenseqTM DNA Signature Prep Kit)；(3)参考国际遗传谱系学会(ISOGG，www.isogg.org)提供的由38,818个Y染色体SNP位点构建的***进化树，这个***进化树有着极高的分辨率；(4)参考文献中(Y染色体SNP标记的分型及其法医学应用[D].2017；Y-SNP复合检测体系构建及其在族群地域推断与家系调查中的应用[D].2019.)我国汉族人群中表现出较好多态性的SNP位点；(5)参考我国法医SNP分型与应用规范SF/ZJD0105003-2015。最终选取150个Y染色体SNP遗传标记。下表3列出了所选择的150个Y染色体SNP遗传标记名称及在GRCh38人类基因组SNP数据库(https://www.snpedia.com/index.php/GRCh38)对应的位置。
表3 150个Y染色体SNP遗传标记及其位置
Figure BDA0002818937560000041
Figure BDA0002818937560000051
Figure BDA0002818937560000061
本发明150个Y-SNP遗传标记与其对应的主要单倍型如下表4所述：
表4 Y-SNP遗传标记与其对应的单倍群
Figure BDA0002818937560000071
Figure BDA0002818937560000081
引物设计筛选及引物混合物制备：本发明涉及多个遗传标记的结合，特别的，引物的设计本发明遵循以的思路及步骤设计引物：(1)引物既不能相互结合，也不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合；(2)引物的组合要解决不同扩增片段相互竞争的情况，避免高丰度模板完全覆盖，使得低丰度模板彻底沦为背景；(3)基因座序列信息搜集来自各种权威数据库和查找大量文献资料，以及成熟的商业化试剂盒,(数据库有：NCBI的GeneBank数据库；YHDR-Y染色体单倍型参考数据库https://yhrd.org/；GRCh38人类基因组SNP数据库https://www.snpedia.com/index.php/GRCh38；以及STRBase数据库https://strbase.nist.gov；SNPedia数据库https://www.snpedia.com)，使用primer5软件设计引物，通过GenBank中的BLAST功能考虑引物扩增特异性，通过数据库中的其他物种(4)基因组数据考虑所设计的这些基因座引物的种属特异性，采用的是多重PCR扩增体系，每组PCR的引物之间在混合体系中存在一定的干扰，因此必须根据检测方法的需要，设计大量引物进行实验筛选，并通过专业的引物设计软件考虑多重PCR的多组引物之间的干扰和平衡，调整引物；(5)然后进行PCR扩增，获得每个基因座的特异性扩增产物。综合单个基因座的扩增条件，选择适宜扩增程序，进行复合扩增。由于复合的基因座数目较多，引物间相互抑制情况复杂，所以需要一一排除，找出这些基因座，重新设计并合成引物。(6)此外，不同基因座的引物之间还会形成引物二聚体，降低引物的扩增效率，也需要重新设计并合成引物；(7)初次复合扩增时，各个引物在反应体系中的浓度均为0.02μM；之后对引物浓度进行调整，获得进行PCR扩增时各个引物的最佳浓度。
经过上述步骤，最终获得了适合本发明检测的STR和SNP遗传标记的最佳引物组合。引物序列为本发明设计筛选，引物混合物由通用生物***(安徽)有限公司合成,最终为干粉状态。引物混合物1包含设计的50对STR引物，引物混合物2包含设计的150对SNP引物。Y-STR引物混合物在合成时，需在上游引物F的5’端加上接头序列“CCTACACGACGCTCTTCCGATCT”；在下游引物R的5’端加上接头序列“CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT”。
本发明提供的复合扩增体系中200个基因座中扩增子长度均小于350bp。
本发明引物于通用生物***(安徽)有限公司合成，为明确溶解的引物浓度及方便后续体系构建，按如下方法溶解引物：将1×TE作为溶解液，统一将引物稀释到10μM用于后续实验。
本发明在进行基因检测时，先利用多重PCR扩增目的基因构建基因文库，主要过程为：
第一轮多重PCR反应：
将人基因组DNA与PCR引物、PCR扩增试剂混合，进行PCR反应，对目的基因进行扩增，体系在一个反应管中进行，不用分管。
(1)DNA的起始量均为50pg-300ng/反应管；
(2)引物反应终浓度为每条引物0.02μM-0.15μM。
第一轮反应体系如下表5所述：
表5第一轮多重PCR扩增体系
组分 用量
2×KAPA2GFast Multiplex Mix 12.5μL
Primer Pairs Mix F1/R1(F2/R2) 1μL(单引物浓度为0.02μM)
Template DNA (50pg-100ng)
H<sub>2</sub>O up to 25μL
Total 25μL
备注：(1)Primer Pairs Mix F1/R1为50对Y-STR引物混合液；(2)Primer PairsMix F2/R2为150对Y-SNP混合液；两个混合引物分别组成两个PCR体系；
第一轮PCR扩增反应程序如下表6：
表6第一轮多重PCR扩增程序
Figure BDA0002818937560000101
第一轮PCR产物磁珠纯化：
采用Agencourt AMPure XP磁珠，对第一轮PCR产物进行纯化，具体纯化过程为：
(1)向25μL PCR产物中补水至60μL，加入60μL(1x)室温平衡后的AMPure XP磁珠，用移液器吸打混匀数次；
(2)室温孵育5min后，将EP管置于磁力架上5min；
(3)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，用200μL 80％乙醇溶液洗涤2次；
(4)用移液器尽可能移除剩余的乙醇溶液，室温静置3-5min，使残留乙醇彻底挥发；
(5)将EP管从磁力架取下，加入20μL Nuclease-free water，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置5min；
(6)将PCR管重新置于磁力架上，静置3min；
(7)用移液器吸取上清液至一个新的EP管中，即得第一轮多重PCR纯化后产物。
(8)使用Qubit3.0对纯化后产物进行定量，用Qseq100质检确定片段大小。
第二轮接头序列PCR反应：
(1)将纯化后的第一轮多重PCR产物作为模版，加入第二轮接头序列引物及PCR反应体系，DNA的起始量均为10-100ng/反应。
(2)引物反应终浓度为每条引物0.2μM-0.4μM。
第二轮反应体系如下表7所示:
表7第二轮接头序列PCR扩增体系
Figure BDA0002818937560000102
Figure BDA0002818937560000111
其中，所述接头序列为index p5：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCT TTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ ID NO.393)
index p7：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ ID NO.394)
所述NNNNNNNN可以为AAGTCTCT、CCAGCGCT、ATGAACCT中的一种。
第二轮PCR反应程序如下表8所示：
表8第二轮PCR反应程序
Figure BDA0002818937560000112
第二轮磁珠纯化：
采用Agencourt AMPure XP磁珠，对第二轮PCR产物进行纯化。
(1)向25μL PCR产物中补水至60μL，加入60μL(1x)室温平衡后的AMPure XP磁珠，用移液器吸打混匀数次；
(2)室温孵育5min后，将EP管置于磁力架上5min；
(3)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，用200μL 80％乙醇溶液洗涤2次；
(4)用移液器尽可能移除剩余的乙醇溶液，室温静置3-5min，使残留乙醇彻底挥发；
(5)将EP管从磁力架取下，加入20μL Nuclease-free water，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置5min；
(6)将PCR管重新置于磁力架上，静置3min；
(7)用移液器吸取上清液至一个新的EP管中，即得第一轮多重PCR纯化后产物。
(8)使用Qubit3.0对纯化后产物进行定量，用Qseq100质检确定片段大小。
文库检测与测序文库混合：
采用Qubit3.0和Qseq100检测文库浓度及片段大小，根据定量结果，各文库根据Miseq测序前文库的稀释变性要求稀释(参考MiSeq FGx Sequencing System ReferenceGuide#VD2018006)，混合后总体积为20μL.终浓度在30-60pM范围内，以保证后续用于测序的模版混合物中来自各样本的模版含量均衡。
PCR产物测序及数据分析:
Miseq reagent kit v3-600cycles测序试剂为Illumina公司的产品，货号为MS-102-3003。Miseq FGx二代测序仪为Illumina公司的产品。根据《MiSeq FGx SequencingSystem Reference Guide#VD2018006》进行测序。同一文库采用PE250测序。
测序结束后仪器自动生成fastq文件，使用STRait Razor 2.6软件对fastq文件进行数据分析。BAM文件用IGV_2.3.72分析，每个基因座测序数据通过整合基因组查看器(IGV)v2.3.72进行可视化。使用SAMtools和PICARD进行数据处理以及BAM和BAI创建工具。数据提取和变体调用用GATK进行。Microsoft Excel和RStudio v1.2.1335,用于数据处理和统计分析。
相关参数定义计算如下：
(1)分析阈值
表示为过滤Noise序列所设定的界限值，是一个百分数。序列测序深度低于所设定的分析阈值与该基因座总测序深度的乘积则被考虑为Noise序列，并且不再被进一步分析研究。分析阈值的界定对NGS-STR-SNP体系的数据分析解释起着关键性作用。
(2)基因座序列构成比(locus constituent ratio)
基因座序列构成比为每个基因座中Allele、Stutter和Noise在该基因座中总覆盖度中的占比。(每个基因座的序列分为3类，即Allele、Stutter和Noise序列。Stutter定义为较对应的Allele长度±4bp的序列；Noise定义为既不是Allele也不是Stutter的序列。)
％allele＝allele reads/Total reads；
％stutter＝stutter reads/Total reads；％noise＝1-％allele-％stutter；
(3)基因座覆盖深度(depth of coverage,DoC)
表示为一个基因座测序深度，即该基因座的总reads数目。
(4)样本覆盖深度(average depth of coverage per sample)
表示一次测序中每个样本的平均测序深度。
(5)等位基因覆盖度比(Allele coverage ratio,ACR)
即杂合性均衡比(heterozygote balance ratio,Hb)，为一个杂合子两个不同Allele覆盖度比值。表示为
Figure BDA0002818937560000131
Figure BDA0002818937560000132
表示低覆盖度的等位基因；
Figure BDA0002818937560000133
表示高覆盖度的等位基因。
(6)混合比例(mixture proportion,MX)
用NGS混合图谱中等位基因reads数目计算混合比例得到实际测量值。
杂合子等位基因混合比例：M＝(A1 reads+A2 reads)/Total reads
纯合子等位基因混合比例：M＝A reads/Total reads
与现有技术相比，本发明提供的检测体系及检测方法具有以下优势：
(1)本发明提供的基于NGS技术检测200个基因座的检测体系；包含50个Y染色体STR基因座和150个Y染色体SNP遗传标记，可以一次性地检测更多的遗传信息。
(2)本发明检测技术体系及方法针对法医DNA样本中最常见难题之一的混合DNA样本进行分析，通过统计分析分析阈值，样本覆盖深度、基因座平均覆盖深度，基因座序列构成比和等位基因覆盖度比等参数，对数据质量进行分析。所有样本的平均测序深度为5675±546reads，基因座平均测序深度为5570±945reads，设定阈值为5％时，基因座构成比中的allele序列平均覆盖深度为97.96％，stutter序列平均覆盖深度为1.73％,noise序列的平均覆盖深度为0.31％。进一步分析体系基因座的平衡，数据表明大多数基因座平衡良好，值接近1的达95.14％；这在一定程度上为测序数据的准确性提供了可靠的保证。
(3)梯度稀释样本从1ng到50pg以不同起始DNA量制备文库并测序，分析阈值为5％时，当起始量DNA降为50pg时，仍能检测96.68％基因分型，以本发明建库测序方法，样本投入量可低至1到0.5ng，仍能得到准确的测序数据。表明了本发明基于NGS的人类STR和SNP遗传标记联合检测技术体系及检测方法能达到当前DNA分型技术相当的灵敏度，各梯度稀释样本间覆盖深度不存在差异，平均归一化读取深度，各DNA样本间无明显差异，说明本发明检测技术体系及方法重复性良好。
(4)通过分析不同混合比例基因座平均测序深度1:1(6174±668reads)，1:4(5963±984reads)，1:9(5359±522reads)，1:19(3963±284reads)，表明不同混合比率的混合样本各基因座较高的覆盖深度在一定程度上保证了测序的准确性，不同混合样本以1ng起始DNA量进行文库构建和测序检测。主要组分等位基因在各混合比率均能获得完整的分型且呈现出较好的均衡性。随着低目标组分模板量的降低，在混合比率低至1:19时，仍能检测到低目标组分的基因分型达78.6％，这表明本发明一种基于NGS的人类STR和SNP遗传标记联合检测技术体系及检测方法对混合样本有较高的检测能力。
附图说明
图1为Y-STR和Y-SNP混合引物毛细管电泳检测结果图；
图2为8个男性DNA样本测序深度结果；
图3为梯度稀释系列DNA的测序覆盖深度结果；
图4为DNA检出分型结果；
图5为每个标记的平均读数之间的差异结果；
图6为各标记之间的读数分布结果；
图7为50个为Y-STR基因座平衡分布结果；
图8为150个Y-SNP基因座平衡分布结果；
图9为样本混合比例为1：1时50个Y-STR基因座的测序深度；
图10为样本混合比例为1：1时150个Y-SNP基因座的测序深度；
图11为样本混合比例为1：4时50个Y-STR基因座的测序深度；
图12为样本混合比例为1：4时150个Y-SNP基因座的测序深度；
图13为样本混合比例为1：9时50个Y-STR基因座的测序深度；
图14为样本混合比例为1：9时150个Y-SNP基因座的测序深度；
图15为样本混合比例为1：19时50个Y-STR基因座的测序深度；
图16为样本混合比例为1：19时150个Y-SNP基因座的测序深度；
图17为混合样本低目标组分平均检出比例结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。
所述index p5，index p7及其他引物序列为本发明设计，通用生物***(安徽)有限公司合成；所述磁珠购自VAHTSTM DNA Clean Beads货号#N411；所述扩增试剂KAPA2GFast Multiplex Mix可购自Sigma公司，货号KK5802；所述Qubit dsDNA HS Assay Kit为Thermo Fisher公司的产品，货号为Q32854；所述片段大小分析仪器为Bioptic产品，产品型号为Qseq100；所述Miseq reagent kit v3-600cycles测序试剂为Illumina公司的产品，货号为MS-102-3003；所述二代测序仪为Illumina公司的产品，产品型号为：Miseq FGxTM。
实施例1一种基于NGS的人类Y染色体STR和SNP遗传标记联合检测技术体系及检测方法Y-STR和Y-SNP准确分型验证
实验准备：
对1例男性DNA的50个Y-STR和150个Y-SNP位点进行illumina测序，将单个位点检测结果与测序结果进行比较，保证检测的重要性。
将每个位点的上下游引物混合，为Primer Pairs Mix F1/R1(F2/R2)，根据上述实验技术方案中单扩及多次重复复合扩增检测试验的结果，调整PCR扩增引物和延伸引物的浓度，尽可能让各个位点出峰均衡，避免或者减少非特异性杂峰出现，确定最终引物池的配比。(单条引物浓度0.02-0.05μM)
结果：
(1)Y-STR和Y-SNP混合引物毛细管电泳检测：50个Y-STR和150个Y-SNP遗传标记的PCR扩增产物使用Qseq100进行检测，判定PCR扩增产物的大小与设计是否一致，检测结果如图1所述，Y-STR所有位点片段大小在300-400bp左右，Y-SNP所有位点片段大小在250bp左右，其结果表明每对引物都具有良好的扩增效率和特异性。
(2)1例男性DNA样本的Y-STR和Y-SNP位点测序结果：下表9给出了50个Y-STR位点的重复片段与重复数结果，表10给出了150个Y-SNP位点的突变位点或缺失位点及测序深度试验结果。
表9 50个Y-STR位点的重复片段与重复数结果
Figure BDA0002818937560000161
表10 150个Y-SNP位点的突变位点或缺失位点以及测序深度
Figure BDA0002818937560000162
Figure BDA0002818937560000171
Figure BDA0002818937560000181
Figure BDA0002818937560000191
Figure BDA0002818937560000201
备注：SNV(single nucleotide variants)：单核苷酸变异；
Covdepth：测序覆盖深度
由此可知，通过单位点引物和混合引物检测，无论是单个引物还是本发明检测方法的引物混合物都具有良好的扩增效率和特异性。通过测序结果分析，检测1例男性样本的DNA，本发明检测方法均可以得到有效且准确的分型结果，所选的50个Y-STR和150个Y-SNP可用于二代测序。
实施例2评估一种基于NGS的人类Y染色体STR和SNP遗传标记联合检测技术体系及检测方法对梯度稀释样本的性能
1.样本准备：
(1)取自8个无关健康男性个体FTA血卡样本，DNA提取根据GA/T383-2014中标准，采用chelex法。
(2)重复性和灵敏度部分
以1例样本应用qubit绝对定量结果制备梯度稀释系列DNA模板(1ng、500pg、200pg、100pg、50pg)进行测序，每个样本平行试验3次进行重复性和灵敏度研究。
2.利用多重PCR文库构建基因文库：
应用本发明的文库构建方法，具体实施步骤见具体技术方案里的文库构建环节实施方法。
3.测序及数据分析：
应用本发明的测序方法，利用NGS平台对构建的8个男性DNA样本及其中1例梯度稀释DNA样本和阳性标准品DNA样本进行测序性能分析，具体实施步骤见具体技术方案里的测序环节实施方法，8个样本的测序深度结果见图2。
4.结果分析：
(1)分析一例NTC(阴性空白对照)和标准男性DNA的测序数据对阈值设定进行研究
通过分析NTC样品，研究了测序结果产生的基线噪声。
分析的结果是，在50个STR中共获得884.3个reads，每个标记的平均读取深度为13.6±64.1reads(Mean±SD)。其中2个(DYS448和DYS626)显示了100个以上的reads(分别为248和466个reads)。NTC所获得的每个标记的平均读取深度比具有0.01ng的DNA的样品(在此测试的最低输入量)所得到的值低269.93倍。
分析一例标准男性DNA测序共得到83个allele,在设定的任何阈值下都没有发生等位基因丢失。阈值设定在2,5％，5％，10％时，分别检出48,12和0个stutter及2,0,0个Noise。检出结果见表11，考虑到尽可能减少非等位基因并增加真实等位基因检出率，最终选择检出5％的分析阈值。
表11样本1在不同分析阈值下各序列检出数目
Figure BDA0002818937560000211
(2)对8个样本的测序结果进行统计分析，结果如表11所示，包括样本测序覆盖深度，基因座平均覆盖深度，基因座序列构成比和等位基因覆盖度比等参数情况。所有测序深度数据参数以平均测序深度±标准差呈现(mean±SD)。
a.首先对8个男性DNA样本测序深度(reads)、基因座平均测序深度，基因座构成比计算和统计分析对数据进行评价，综合评价本发明检测体系及检测方法的测序效能。
数据质量参数经统计分析显示，8个男性DNA样本平均测序深度为5675±546reads(mean±SD)，基因座平均测序深度为5570±945reads；设定阈值为5％时，基因座构成比中的allele序列平均覆盖深度为97.96％，stutter序列平均覆盖深度为1.73％,noise序列的平均覆盖深度为0.31％。
表12样本3次重复检测平均测序覆盖深度对比
样本名 测序覆盖深度(reads)
样本1 5979
样本2 5169
样本3 5221
样本4 5340
样本5 5782
样本6 5227
样本7 6897
样本8 5782
8个样本的平均覆盖深度 (5676±1538)reads
b.对梯度稀释系列DNA模板(1ng、500pg、200pg、100pg、50pg)测序样本的灵敏度、重复性进行统计分析。投入量1ng的基因座测序覆盖深度为5260±2678reads；0.5ng的基因座测序覆盖深度为5037±2326reads；0.2ng的基因座测序覆盖深度为4873±2074reads；0.1ng的基因座测序覆盖深度为4275±1968reads；50pg的基因座测序覆盖深度3817±913reads；梯度稀释系列DNA的测序覆盖深度。见图3。
c.梯度稀释样本从1ng到50pg以不同起始DNA量制备文库并测序，分析阈值为5％时，当起始量DNA降为50pg时，仍能检测96.68％基因分型。如图4。
d.分析投入量1ng和0.5ng模板DNA的三个重复样本，从1ng到0.5ng,每个标记的平均读数之间没有显着差异，见图5.
e.平均归一化读取深度介于1ng和0.5ng之间，显示DNA之间没有明显差异。归一化的读取深度为0.00864，在两种DNA投入量下，只有2个STR(1.6％)在0.004以下。这表明，即使DNA投入量对总读数有影响，标记之间的读数分布也保持稳定。(图6)以本发明建库测序方法，样本投入量可低至1到0.5ng，仍能得到准确的测序数据。
f.进一步分析基因座平衡的分布，通过比较每个基因座获得的测序深度来评估基因座扩增和测序的性能。下图7、8显示了基因座平衡的分布，它是由每个基因座获得的读数与每个基因座的平均读数之比计算得出的。大多数基因座平衡良好，值接近1(98％)。只有1个STR基因座(2％)每个基因座的平均读数是接近总体的两倍，所有SNP位点平衡表现良好。
实施例3评估一种基于NGS的人类STR和SNP遗传标记联合检测技术体系及检测方法对混合样本的性
1.样本准备(混合DNA部分)：
根据实施例1的定量结果将8个男性样本的DNA定量结果进行分组，选择其中2例单一分型的DNA样本构建4组两男混合的DNA样本，每组混合样本设置4个混合比例(1:1，1:4，1：9，1:19)，每个混合样本平行试验3次。
2.文库构建：
应用本发明的文库构建方法，不同混合样本以1ng起始DNA量进行文库构建和测序检测，具体实施步骤见具体技术方案里的文库构建环节实施方法。
3.测序及数据分析：
应用本发明的测序方法，利用NGS平台对构建的两男混合样本进行测序分析，具体实施步骤见具体技术方案里的测序环节实施方法。
4.结果分析：
通过比较混合样本中每个基因座获得的测序深度来评估基因座扩增和测序的性能。
(1)分析4组混合样本的测序平均覆盖深度如下表13所示：
表13混合样本3次重复测序平均覆盖深度
混合样本 测序深度
混合样本1:1 6174±668reads
混合样本1:4 5963±984reads
混合样本1:9 5359±522reads
混合样本1:19 3963±284reads
在混合比例1:1时，基因座平均测序深度为6174±668reads，每个基因座获得的测序深度见下图9-图10；在混合比例1:4时，基因座平均测序深度为5963±984reads，每个基因座获得的测序深度见下图11-12；在混合比例1:9时，基因座平均测序深度为5359±522reads，每个基因座获得的测序深度见下图13-14；在混合比例1:19时，基因座平均测序深度为3963±284reads，每个基因座获得的测序深度见下图15-16。
(2)分析4组混合样本低目标组分基因型检出率：
分析混合样本低目标组分基因座检出情况，将3次重复进行归一化分析，混合样本1:1，检出率100％；混合样本1:4，检出率96.9％；混合样本1:9，共检出123个等位基因，检出率88.9％；混合样本1:19，检出率78.6％.各混合样本低目标组分基因座检出情况见下表14，而混合样本低目标组分平均检出比例如下图17所示：
表14不同混合样本低目标组分基因检出个数
Figure BDA0002818937560000241
综上可知，通过统计分析分析阈值，样本覆盖深度、基因座平均覆盖深度，基因座序列构成比和等位基因覆盖度比等参数，对数据质量进行分析。所有样本的平均测序深度为5675±546reads，基因座平均测序深度为5570±945reads，设定阈值为5％时，基因座构成比中的allele序列平均覆盖深度为97.96％，stutter序列平均覆盖深度为1.73％,noise序列的平均覆盖深度为0.31％。进一步分析体系基因座的平衡，数据表明大多数基因座平衡良好，值接近1的达95.14％；这在一定程度上为测序数据的准确性提供了可靠的保证。
梯度稀释样本从1ng到50pg以不同起始DNA量制备文库并测序，分析阈值为5％时，当起始量DNA降为50pg时，仍能检测96.68％基因分型，以本发明建库测序方法，样本投入量可低至1到0.5ng，仍能得到准确的测序数据。表明了本发明基于NGS的人类Y染色体STR和SNP遗传标记联合检测技术体系及检测方法能达到当前DNA分型技术相当的灵敏度。
各梯度稀释样本间覆盖深度不存在差异，平均归一化读取深度，各DNA样本间无明显差异，说明本发明检测技术体系及方法重复性良好。
通过分析不同混合比例基因座平均测序深度1:1(6174±668reads)，1:4(5963±984reads)，1:9(5359±522reads)，1:19(3963±284reads)，表明不同混合比率的混合样本各基因座较高的覆盖深度在一定程度上保证了测序的准确性。不同混合样本以1ng起始DNA量进行文库构建和测序检测。主要组分等位基因在各混合比率均能获得完整的分型且呈现出较好的均衡性。随着低目标组分模板量的降低，在混合比率低至1:19时，仍能检测到低目标组分的基因分型达78.6％，这表明本发明一种基于NGS的人类Y染色体STR和SNP遗传标记联合检测技术体系及检测方法对混合样本有较高的检测能力。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 郑州高新生物技术有限公司
<120> 一种基于NGS的人类Y染色体STR和SNP遗传标记联合检测体系及检测方法
<130> 2020.11.16
<160> 394
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> DYS19-F
<400> 1
atctgggtta aggagagtgt cact 24
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> DYS19-R
<400> 2
gattattttt tgatttcact atgactac 28
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> DYS385a/b-F
<400> 3
atctatctat tccaattaca tagtcctc 28
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> DYS385a/b-R
<400> 4
catgggtgac agagctagac accatgccaa ac 32
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> DYS389I-F
<400> 5
atccctgagt agcagaagaa tgtcatagat a 31
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> DYS389I-R
<400> 6
caactctcat ctgtattatc tatgtg 26
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> DYS389II-F
<400> 7
atccctgagt agcagaagaa tgtcatagat a 31
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> DYS389II-R
<400> 8
caactctcat ctgtattatc tatgtg 26
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> DYS390-F
<400> 9
tgtgtatact cagaaacaag gaaagata 28
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> DYS390-R
<400> 10
cctgcatttt ggtaccccat aatatatt 28
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> DYS391-F
<400> 11
cattcaatca tacacccata tctgtctg 28
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> DYS391-R
<400> 12
gaataaaatc tccctggttg caagcaattg 30
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> DYS392-F
<400> 13
tctcaaagaa gtcaaaacag agggatc 27
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> DYS392-R
<400> 14
tttcaagtgt ttgttattta aaagccaaga agga 34
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> DYS393-F
<400> 15
gtagttatgt tttatttgtc attcctaatg tggtc 35
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> DYS393-R
<400> 16
gtccaaaaaa tgaggtatgt ctcatag 27
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> DYS437-F
<400> 17
ctgagtagct gggactatgg gcgtgagt 28
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> DYS437-R
<400> 18
tgtgattatg ccagtgcact gcagcc 26
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> DYS438-F
<400> 19
cagtaataac tgatgcaaga aagattcact 30
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> DYS438-R
<400> 20
ttcagcctgg gcaacaagag tgaa 24
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> DYS439-F
<400> 21
atatacagat agatagatac ataggtgg 28
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> DYS439-R
<400> 22
ggcttggaat tcttttaccc atca 24
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> DYS448-F
<400> 23
agagcttcaa tggagattag aaataga 27
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> DYS448-R
<400> 24
tggccggtct ggaaatttat ctct 24
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> DYS456-F
<400> 25
gaactcggac tggctcatct tgctcctcag cct 33
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> DYS456-R
<400> 26
gaaaacccca tcaactcagc ccaa 24
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> DYS458-F
<400> 27
tgcagactga gcaacaggaa tgaaactc 28
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS458-R
<400> 28
gatccagcca cctcggcctc ccaaa 25
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS635-F
<400> 29
gatccagcca cctcggcctc ccaaa 25
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> DYS635-R
<400> 30
tgctgaatgg gagcagaaat gcc 23
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> GATA_H4-F
<400> 31
taacaggata aatcacctat ctatgta 27
<210> 32
<211> 31
<212> DNA
<213> GATA_H4-R
<400> 32
ttgtatccta ggaatcatca ttaaaatgtt a 31
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> DYS481-F
<400> 33
ctgtcccttt aagaggagtc tgctaaaagg 30
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> DYS481-R
<400> 34
taacaattca ttgcagattc ttggtc 26
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> DYS533-F
<400> 35
tctcttctaa ctatataact atgtattatc 30
<210> 36
<211> 29
<212> DNA
<213> DYS533-R
<400> 36
tttattcatg atcagttctt aactcaacc 29
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> DYS576-F
<400> 37
taggaagatc ccttgggctg aggag 25
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> DYS576-R
<400> 38
ctcatttcct ggagatgaag gaggagat 28
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> DYS643-F
<400> 39
tttttgcagg tgttcactgc aagccat 27
<210> 40
<211> 32
<212> DNA
<213> DYS643-R
<400> 40
aacttgttca tgtaaccaaa caccacccat tc 32
<210> 41
<211> 29
<212> DNA
<213> DYS460-F
<400> 41
agtagtgatg ctgtgtcact atatttctg 29
<210> 42
<211> 29
<212> DNA
<213> DYS460-R
<400> 42
cagaaatata gtgacacagc atcactact 29
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> DYS549-F
<400> 43
ataaggtaga catagcaatt aggtagg 27
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> DYS549-R
<400> 44
ccccttttcc atttgtgatt ttg 23
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> DYF387S1a/b-F
<400> 45
atcagtgctg gtgccacagt gtga 24
<210> 46
<211> 26
<212> DNA
<213> DYF387S1a/b-R
<400> 46
tccagcctgg gtgacagagc tagatt 26
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> DYS505-F
<400> 47
tgattttttg tttaaaaagt tccc 24
<210> 48
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<212> DNA
<213> DYS505-R
<400> 48
ttgcaccatt gcactctagg ttggac 26
<210> 49
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<212> DNA
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<400> 49
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<211> 33
<212> DNA
<213> DYS518-R
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caagaatagt ggacttagtt ttctaatcac atc 33
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<211> 25
<212> DNA
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ccaccctagg tgacagcgca ggatt 25
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ctttccttcc ttacttccat cc 22
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cttcagttat gtgacatcaa ggttatg 27
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<212> DNA
<213> DYS570-R
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gtgtgggtga aaattattca gcatagtc 28
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<212> DNA
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gcccagacaa cagagcaaaa ctc 23
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<211> 22
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aaatattcta ggaagattag cc 22
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tggtcacagc atggcttgg 19
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<211> 23
<212> DNA
<213> DYS447-R
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ctttgcgtta tctctgcctt tct 23
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<212> DNA
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atacagaaag aactctaagt attaatttac a 31
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<211> 31
<212> DNA
<213> DYS444-R
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aggaaatcta tatataagtg agcccatgcc a 31
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<212> DNA
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catgtgtttt gactattttt tctgtgccaa gcctacat 38
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<212> DNA
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aggtatagag gaatgtcaca atgggtcctg tag 33
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<212> DNA
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<210> 65
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<212> DNA
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accactgcgc tccagcctgg gc 22
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<212> DNA
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<212> DNA
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ctattactac cttccacaca cgtccactca 30
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<211> 29
<212> DNA
<213> DYS645-R
<400> 72
gtccatataa ttaacttagc tgtaattag 29
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<212> DNA
<213> GATA-A10-F
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<211> 19
<212> DNA
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aagaattttg ggccatgtt 19
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> DYS612-R
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ggaactgagg gaaggcaata g 21
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<211> 21
<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
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gtttgggtta cttcgccaga 20
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<212> DNA
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ggctttcacc agtttgcat 19
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<212> DNA
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ccatgtttag ggacattcct 20
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<212> DNA
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cctcccttct ccctgtctt 19
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<212> DNA
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agtctctcaa gcctgttcta tgaa 24
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attagctgga agtggagttt gctg 24
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ccatgttact gcaaaataca c 21
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<213> DYS547-R
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<212> DNA
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ttgggctgag gagttcaatc 20
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gcagtctcat ttcctggag 19
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<212> DNA
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caccagcccg ctatagacag t 21
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<212> DNA
<213> DYS520-R
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<211> 21
<212> DNA
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<212> DNA
<213> M175-R
<400> 94
aatcttataa aaataaatta aga 23
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<212> DNA
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ctccaggtgc tgtgtgtcac ag 22
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<211> 19
<212> DNA
<213> F265-R
<400> 96
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<211> 22
<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
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<211> 22
<212> DNA
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<400> 99
caagagcttc tctcaatgtc tg 22
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<211> 24
<212> DNA
<213> Z23193-R
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gattcacaaa gttatttcta attg 24
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<212> DNA
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<400> 101
cacatcaatg tacagactat caa 23
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<212> DNA
<213> M307.1-R
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gaagaaaaaa tccataatgc ttata 25
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<211> 23
<212> DNA
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ggagtcttgc tctgtcaccc agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> CTS5726-R
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ctcagctact tgggattctg agg 23
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<212> DNA
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tttgttctga cattcagatt tgg 23
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<212> DNA
<213> M110-R
<400> 106
gggtatttgg tgctgtgaat ttct 24
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<212> DNA
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cctgtttgca tgctaactct ca 22
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<212> DNA
<213> M268-R
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cactctcaaa cgcaaagcaa 20
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<212> DNA
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aatacggtgc aaagtagctt gagat 25
<210> 110
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<212> DNA
<213> F2320-R
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atccaccatt taattcattc tgttca 26
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<211> 20
<212> DNA
<213> M1470-F
<400> 111
gaaatggact gtagtgtggg 20
<210> 112
<211> 23
<212> DNA
<213> M1470-R
<400> 112
cttgctgtct ctaaaggcat cag 23
<210> 113
<211> 25
<212> DNA
<213> P49-F
<400> 113
attgatacag tcacatcttg cttac 25
<210> 114
<211> 24
<212> DNA
<213> P49-R
<400> 114
tttgctgagt ccagggacag aata 24
<210> 115
<211> 21
<212> DNA
<213> F1942-F
<400> 115
cactgatgga gtctcattgc t 21
<210> 116
<211> 25
<212> DNA
<213> F1942-R
<400> 116
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<211> 24
<212> DNA
<213> M122-F
<400> 117
ctaaatgtga aatcccatgg gaag 24
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<211> 22
<212> DNA
<213> M122-R
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gccatctttc tacaggtagc tc 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> M324-F
<400> 119
ggccaaatgt tggcttttct aac 23
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<211> 26
<212> DNA
<213> M324-R
<400> 120
ttttctctga cattcaggta tagttt 26
<210> 121
<211> 26
<212> DNA
<213> L127.1-F
<400> 121
tgggaacagg aggaggatag atggag 26
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<211> 25
<212> DNA
<213> L127.1-R
<400> 122
tcagggtaga aattaaaaga ggaat 25
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<211> 21
<212> DNA
<213> F1876-F
<400> 123
gagaacacat cagactctac t 21
<210> 124
<211> 24
<212> DNA
<213> F1876-R
<400> 124
cccttaacga aacttggtgg catt 24
<210> 125
<211> 23
<212> DNA
<213> IMS-JST002611-F
<400> 125
tcttcagctg agaaaggaca aca 23
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<212> DNA
<213> IMS-JST002611-R
<400> 126
tgtaatggtt aatcactgct tagttata 28
<210> 127
<211> 21
<212> DNA
<213> IMS-JST021354-F
<400> 127
ccaatccaat gaccctttgc a 21
<210> 128
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<212> DNA
<213> IMS-JST021354-R
<400> 128
gcagtattag ctgtgcacag ca 22
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 129
acctccaagt acaggctgat 20
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<212> DNA
<213> M188-R
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tcactggacc agtggagtc 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> P164-F
<400> 131
gatggttgag acacatcttc a 21
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<211> 23
<212> DNA
<213> P164-R
<400> 132
atcatactct ctgaaatgca gca 23
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<212> DNA
<213> F742-F
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acatacacat acaccccatg atccaaa 27
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<212> DNA
<213> F742-R
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acatgattgt gaaatattgg agcttgt 27
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<211> 27
<212> DNA
<213> F1150-F
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taaatccaga caagagtgct aaaaacc 27
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<212> DNA
<213> F1150-R
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ggtgtgttac ctgaacatcc 20
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<211> 27
<212> DNA
<213> F837-F
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gggatgaaca tcaacacctt attataa 27
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<211> 27
<212> DNA
<213> F837-R
<400> 138
taaactcctt gaaaacagta tggttaa 27
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<212> DNA
<213> BY56049-F
<400> 139
gaaccacgct cccggt 16
<210> 140
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<212> DNA
<213> BY56049-R
<400> 140
ttgggtgtaa gaaggcctg 19
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<212> DNA
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<400> 141
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<212> DNA
<213> F446-R
<400> 142
attctgctta gcctcactcc tatag 25
<210> 143
<211> 28
<212> DNA
<213> F140-F
<400> 143
cacaatttca gaaattcaca gcaccaaa 28
<210> 144
<211> 25
<212> DNA
<213> F140-R
<400> 144
aggacacaca acctgtgaag agtta 25
<210> 145
<211> 21
<212> DNA
<213> CTS8423-F
<400> 145
cccttcagag cattcctaat c 21
<210> 146
<211> 24
<212> DNA
<213> CTS8423-R
<400> 146
tagagatcat tcaagatccc agaa 24
<210> 147
<211> 26
<212> DNA
<213> CTS52-F
<400> 147
ggtgaaaaga gtagacaata aggaag 26
<210> 148
<211> 26
<212> DNA
<213> CTS52-R
<400> 148
attctgtcat cctggattga atctct 26
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<211> 23
<212> DNA
<213> CTS701-F
<400> 149
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<210> 150
<211> 21
<212> DNA
<213> CTS701-R
<400> 150
gtcctaaagt ccaagctcga g 21
<210> 151
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<212> DNA
<213> FGC66104-F
<400> 151
aaaatgttat gggttattcc aattcag 27
<210> 152
<211> 28
<212> DNA
<213> FGC66104-R
<400> 152
aagtgcaagt tagagatctc agtttcag 28
<210> 153
<211> 25
<212> DNA
<213> F2818-F
<400> 153
ctaaacacac gtaccataaa tcaaa 25
<210> 154
<211> 25
<212> DNA
<213> F2818-R
<400> 154
tttgaaataa aacatcgcaa taaag 25
<210> 155
<211> 27
<212> DNA
<213> F1600-F
<400> 155
gtgactttga gagtcacttg ctctgtg 27
<210> 156
<211> 27
<212> DNA
<213> F1600-R
<400> 156
acttggtaaa ctctacttag ttgcctt 27
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<211> 25
<212> DNA
<213> PK4-F
<400> 157
tttcctataa agcaaagttg aggtt 25
<210> 158
<211> 24
<212> DNA
<213> PK4-R
<400> 158
agcatatcag catcgcctga atac 24
<210> 159
<211> 24
<212> DNA
<213> M95-F
<400> 159
cagtgcttga aaccgagttt gtac 24
<210> 160
<211> 24
<212> DNA
<213> M95-R
<400> 160
acccaaggga tcaggagtta tgtg 24
<210> 161
<211> 21
<212> DNA
<213> F1803-F
<400> 161
caggaatgaa caagggcagt a 21
<210> 162
<211> 31
<212> DNA
<213> F1803-R
<400> 162
tatatttgta tgagccatga ttttatccaa c 31
<210> 163
<211> 24
<212> DNA
<213> CTS350-F
<400> 163
atgtgtgttt tggtgggatg ttgt 24
<210> 164
<211> 28
<212> DNA
<213> CTS350-R
<400> 164
atctctctct tcagcaacag taagtcga 28
<210> 165
<211> 27
<212> DNA
<213> F838-F
<400> 165
gagaattctc atttaccact gtggaga 27
<210> 166
<211> 27
<212> DNA
<213> F838-R
<400> 166
gacaatcaga atcatcaaac ccagaag 27
<210> 167
<211> 28
<212> DNA
<213> CTS892-F
<400> 167
tttaacataa aacattaaaa tttattta 28
<210> 168
<211> 25
<212> DNA
<213> CTS892-R
<400> 168
tcaccattcc tatacttcat gttaa 25
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<212> DNA
<213> F993-F
<400> 169
ttggtttgaa atattca 17
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<212> DNA
<213> F993-R
<400> 170
tttatttgta ttatgtaatg ataatc 26
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<211> 25
<212> DNA
<213> F1759-F
<400> 171
aggttcctcc cactcctttt tggat 25
<210> 172
<211> 24
<212> DNA
<213> F1759-R
<400> 172
gcatcatctt cagctagtaa caca 24
<210> 173
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<212> DNA
<213> F417-F
<400> 173
ccatcaccta tttggtggac gca 23
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<211> 24
<212> DNA
<213> F417-R
<400> 174
caaatgtgtt gagtctggga agag 24
<210> 175
<211> 22
<212> DNA
<213> F840-F
<400> 175
atgatgaaat ctgctttttg tt 22
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<211> 26
<212> DNA
<213> F840-R
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tgtaaacatc tcttacccaa actgct 26
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<212> DNA
<213> CTS1451-F
<400> 177
ggaatacctg gtcataacac tggaa 25
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<212> DNA
<213> CTS1451-R
<400> 178
tgaaacccac atacaacagt cttcacaa 28
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<211> 28
<212> DNA
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<400> 179
tcatgtttgt tcaaataatt gcagctct 28
<210> 180
<211> 28
<212> DNA
<213> CTS9996-R
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attttacagt gagacacaac ccacactg 28
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<212> DNA
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gatttttcat ttttatcccc caaacccat 29
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<212> DNA
<213> CTS9259-R
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tccatgttgg tttggaacag tttatcc 27
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<211> 30
<212> DNA
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<400> 183
taggtttgcc atataaattt actgtaactt 30
<210> 184
<211> 28
<212> DNA
<213> F1204-R
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gatcctgaaa acaaaacact ggcttatc 28
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<212> DNA
<213> CTS713-F
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gtccttttta atgtatcaaa tcgctt 26
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<212> DNA
<213> CTS713-R
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acaagaccca tcttgcaagg aaaa 24
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<212> DNA
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aaataataat actgactgtc tttgagc 27
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<212> DNA
<213> CTS203-R
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ctgatacctt tgtttctgtt cattcttgag aag 33
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<211> 25
<212> DNA
<213> F2868-F
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cttgagtgtg tggctttcgt acagt 25
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<212> DNA
<213> F2868-R
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ataagtatcg acctcgtcgg aa 22
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<211> 26
<212> DNA
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<400> 191
tatggatagc aatactcagt gtccca 26
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<212> DNA
<213> CTS10687-R
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atgaaaccaa aggccatata tagttctc 28
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<212> DNA
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<400> 193
ctttttcctt tgcagataga acagctg 27
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<212> DNA
<213> CTS562-R
<400> 194
tctgttaggt atagaacttg ggag 24
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<212> DNA
<213> F2159-F
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ttaattgatg atttcatctt tcccgcatc 29
<210> 196
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<212> DNA
<213> F2159-R
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gctaatgcta caagtagctc aaaac 25
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<212> DNA
<213> F1867-F
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gaaacctctg tcacaagtaa ggaaatgatc 30
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<212> DNA
<213> F1867-R
<400> 198
tccactgccc aggtccattt tct 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> F852-F
<400> 199
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<210> 200
<211> 20
<212> DNA
<213> F852-R
<400> 200
gtgatagcat gccgtttgcc 20
<210> 201
<211> 29
<212> DNA
<213> F915-F
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gacactgcaa tagttactac ttgagttac 29
<210> 202
<211> 28
<212> DNA
<213> F915-R
<400> 202
cagcttcatc caacactaag tacctatt 28
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<211> 23
<212> DNA
<213> F1478-F
<400> 203
gcaacagcag aggatttggt gga 23
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<211> 25
<212> DNA
<213> F1478-R
<400> 204
gcactccagc ttgagtgaca gagtg 25
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<211> 30
<212> DNA
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<400> 205
gaaaggaaaa atcagaagta tccctgaaga 30
<210> 206
<211> 30
<212> DNA
<213> F18-R
<400> 206
gtcacttcaa cctcttgttg gaagattatt 30
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<211> 32
<212> DNA
<213> F117-F
<400> 207
cttaatgatg gtttcaaaga tattcacaga cc 32
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<211> 32
<212> DNA
<213> F117-R
<400> 208
aaaagcctgt ttgtttagaa tacttgacac at 32
<210> 209
<211> 32
<212> DNA
<213> F449-F
<400> 209
ctaaattagt gacaccacaa attgtgatca tt 32
<210> 210
<211> 32
<212> DNA
<213> F449-R
<400> 210
ttaaatacac aacgtcttca tgtaatgtcc aa 32
<210> 211
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<212> DNA
<213> CTS498-F
<400> 211
cacactggaa agaaaaagaa tgctgtca 28
<210> 212
<211> 22
<212> DNA
<213> CTS498-R
<400> 212
gggtgtggtg agccatggaa at 22
<210> 213
<211> 32
<212> DNA
<213> CTS5907-F
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tttatatcct caaccagttt ttatgaagct ag 32
<210> 214
<211> 32
<212> DNA
<213> CTS5907-R
<400> 214
ataattgttc cagggtaagc ttttagtaaa ca 32
<210> 215
<211> 29
<212> DNA
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<400> 215
agatcattct aattactgta tcttcatat 29
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<211> 25
<212> DNA
<213> FGC3750-R
<400> 216
taagcatttg ataaagctgc tgtgg 25
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<211> 32
<212> DNA
<213> CTS879-F
<400> 217
tattatcctg gaaaatgtgg gctcgtttta at 32
<210> 218
<211> 31
<212> DNA
<213> CTS879-R
<400> 218
ttacaggtat gaattctttg acgatctttc c 31
<210> 219
<211> 28
<212> DNA
<213> SK1670-F
<400> 219
ggcatagaaa gtttgtgcaa aaaggtga 28
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<212> DNA
<213> SK1670-R
<400> 220
ccttacctag aacaactctg aagc 24
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<211> 27
<212> DNA
<213> F2588-F
<400> 221
cagtctgtat tattagatca cccagag 27
<210> 222
<211> 32
<212> DNA
<213> F2588-R
<400> 222
tttgttgtaa gaattcagta ggattgatgt gt 32
<210> 223
<211> 29
<212> DNA
<213> CTS445-F
<400> 223
gatgaattaa gatgctcagc taactagtc 29
<210> 224
<211> 26
<212> DNA
<213> CTS445-R
<400> 224
gtatgtagca actgtatgta gcaagc 26
<210> 225
<211> 26
<212> DNA
<213> CTS201-F
<400> 225
ttaggtttaa caccttttgt attatt 26
<210> 226
<211> 28
<212> DNA
<213> CTS201-R
<400> 226
ttaagctatg actaagaggg attccaag 28
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<211> 23
<212> DNA
<213> M7-F
<400> 227
tggatagcgg attcgatgga agc 23
<210> 228
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<212> DNA
<213> M7-R
<400> 228
agtgtcaaac tcgtagcttc aagca 25
<210> 229
<211> 25
<212> DNA
<213> F862-F
<400> 229
tgatcttaga aaggaaacga gataa 25
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<212> DNA
<213> F862-R
<400> 230
aatttaccag gattaaccaa accctgatc 29
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<212> DNA
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ggaatcttaa tcattatcct gagccgt 27
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<211> 24
<212> DNA
<213> F879-R
<400> 232
tccgctatcc agacttggta tatc 24
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<211> 32
<212> DNA
<213> F1226-F
<400> 233
tcttgactca gatgttaatg ctgtgaaaga at 32
<210> 234
<211> 30
<212> DNA
<213> F1226-R
<400> 234
ttccatattc caattttcct agtaccacct 30
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<211> 32
<212> DNA
<213> CTS8490-F
<400> 235
gaaatttaag ggcatctttc attttaggta cc 32
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<211> 24
<212> DNA
<213> CTS8490-R
<400> 236
ggaacaaggt acattcgcgg gata 24
<210> 237
<211> 25
<212> DNA
<213> M134-F
<400> 237
ggtaggcaaa gaaaagcagg agagt 25
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<211> 33
<212> DNA
<213> M134-R
<400> 238
attgtacttt aaaattacat cagctttgtt atc 33
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<212> DNA
<213> F450-F
<400> 239
ctataggttg atgtgttgag aaccaga 27
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<212> DNA
<213> F450-R
<400> 240
caggacttaa aacatgatca tctttggg 28
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<211> 32
<212> DNA
<213> F122-F
<400> 241
actgtagtaa agaaatattc tcaaactgtt gg 32
<210> 242
<211> 30
<212> DNA
<213> F122-R
<400> 242
gataatttaa atccagcaca gaagcatcag 30
<210> 243
<211> 25
<212> DNA
<213> AM01822-F
<400> 243
gtgaggaaca tagcaagacc caaaa 25
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<211> 32
<212> DNA
<213> AM01822-R
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aaattaaagg gaacaaattg atttccaggg at 32
<210> 245
<211> 20
<212> DNA
<213> CTS4452-F
<400> 245
gtctttcacg tagcccgaga 20
<210> 246
<211> 21
<212> DNA
<213> CTS4452-R
<400> 246
tcttgctctt tccccaacac g 21
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<212> DNA
<213> CTS6801-F
<400> 247
ctctaggaga gaggatatca aaaattgg 28
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<212> DNA
<213> CTS6801-R
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ggcaccaaag gtcatttgtg gttg 24
<210> 249
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<212> DNA
<213> BY37723-F
<400> 249
gctgtaggca gtacagctcc 20
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<212> DNA
<213> BY37723-R
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gccaaggaat gagcagcaag atc 23
<210> 251
<211> 23
<212> DNA
<213> L419-F
<400> 251
tggactctga gtgtagactt gtg 23
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<211> 30
<212> DNA
<213> L419-R
<400> 252
taatattgcc attgtaagca taattgagaa 30
<210> 253
<211> 32
<212> DNA
<213> M60-F
<400> 253
tttagaattt gttttatccc ttccactctt ag 32
<210> 254
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<212> DNA
<213> M60-R
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gtataaggat gaaacactga gggcaa 26
<210> 255
<211> 26
<212> DNA
<213> M130-F
<400> 255
ctctatgggt gccttttatc caattc 26
<210> 256
<211> 27
<212> DNA
<213> M130-R
<400> 256
ataggaggaa gtacagtgca gaaaatc 27
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<211> 26
<212> DNA
<213> M216-F
<400> 257
atcagttgta tttttattat ttattt 26
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<211> 31
<212> DNA
<213> M216-R
<400> 258
gaggctgagt gcaatgtctt aggtctgtaa t 31
<210> 259
<211> 28
<212> DNA
<213> M168-F
<400> 259
gggcaagaga aaagaaacat gtgaaaag 28
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<211> 27
<212> DNA
<213> M168-R
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tctcactgtg aaagctacta cttctga 27
<210> 261
<211> 26
<212> DNA
<213> P143-F
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gttcatattg aaaccttgtg gtccca 26
<210> 262
<211> 29
<212> DNA
<213> P143-R
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atctattaga gataggatgg agtgcatct 29
<210> 263
<211> 27
<212> DNA
<213> F3393-F
<400> 263
ggtagatttg atctgcttcc cctactt 27
<210> 264
<211> 30
<212> DNA
<213> F3393-R
<400> 264
caatgttgaa atttagagga agtccctact 30
<210> 265
<211> 21
<212> DNA
<213> CTS11043-F
<400> 265
ctcctgggta gcctgttcaa a 21
<210> 266
<211> 29
<212> DNA
<213> CTS11043-R
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atgaaaaatt tatctcccct tagctctcc 29
<210> 267
<211> 21
<212> DNA
<213> M8-F
<400> 267
ctgcatcacc aaagggcatg t 21
<210> 268
<211> 20
<212> DNA
<213> M8-R
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gttgagtgct gccgctttgt 20
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<211> 27
<212> DNA
<213> V20-F
<400> 269
cttatctgca gtattgtaaa acaatag 27
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<211> 30
<212> DNA
<213> V20-R
<400> 270
catttaaaaa atacattttc ttatctagca 30
<210> 271
<211> 32
<212> DNA
<213> F1370-F
<400> 271
gatataaaat caactgcaag tttagtgcct ca 32
<210> 272
<211> 27
<212> DNA
<213> F1370-R
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cagaaaatgg aagctgcatt aaagacc 27
<210> 273
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<212> DNA
<213> AM00694-F
<400> 273
gagataaatt tttcatgtta cattcaa 27
<210> 274
<211> 30
<212> DNA
<213> AM00694-R
<400> 274
gagacttgac tgaaccagag gcaagggact 30
<210> 275
<211> 25
<212> DNA
<213> B477-F
<400> 275
ggatgccaca tcactcccat tattt 25
<210> 276
<211> 27
<212> DNA
<213> B477-R
<400> 276
cagaagtact tgatctatga cagaagc 27
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<211> 23
<212> DNA
<213> M217-F
<400> 277
gcccacagaa ggatgctgct cag 23
<210> 278
<211> 24
<212> DNA
<213> M217-R
<400> 278
gcacactttg ggtccaggat cacc 24
<210> 279
<211> 32
<212> DNA
<213> L1373-F
<400> 279
tcaggaccct gaaatacaga actgcaaaga aa 32
<210> 280
<211> 30
<212> DNA
<213> L1373-R
<400> 280
ttgaaatgca taatgaagta agcgctacct 30
<210> 281
<211> 24
<212> DNA
<213> F3447-F
<400> 281
gatttccagt cagctgccag caat 24
<210> 282
<211> 23
<212> DNA
<213> F3447-R
<400> 282
gactctccta agcctacagg ttg 23
<210> 283
<211> 31
<212> DNA
<213> F1067-F
<400> 283
attcacccac ccactttgtt gctttgtaaa g 31
<210> 284
<211> 30
<212> DNA
<213> F1067-R
<400> 284
ctcacagagc actttaaagt gagctgtgat 30
<210> 285
<211> 32
<212> DNA
<213> F2613-F
<400> 285
catgaagcca ttgtgaagaa tgtacatgat ct 32
<210> 286
<211> 32
<212> DNA
<213> F2613-R
<400> 286
ctggcaatat ttactatttg gcaatacttt ac 32
<210> 287
<211> 32
<212> DNA
<213> CTS4660^-F
<400> 287
ttggggttgg gagaacatct taaagcatta aa 32
<210> 288
<211> 32
<212> DNA
<213> CTS4660^-R
<400> 288
ctcatcatga ctggaatggc ttaaagagtg ta 32
<210> 289
<211> 28
<212> DNA
<213> CTS3946-F
<400> 289
tgagaagcta ggattacaat tgcctgcg 28
<210> 290
<211> 30
<212> DNA
<213> CTS3946-R
<400> 290
tgtaatccca gaattttagg aggctgggtt 30
<210> 291
<211> 28
<212> DNA
<213> M145-F
<400> 291
cttaggagag tccagactta ctagggat 28
<210> 292
<211> 22
<212> DNA
<213> M145-R
<400> 292
tgaggtcctt cccagagatg ag 22
<210> 293
<211> 32
<212> DNA
<213> M174-F
<400> 293
catgaagcca ttgtgaagaa tgtacatgat ct 32
<210> 294
<211> 32
<212> DNA
<213> M174-R
<400> 294
ctggcaatat ttactatttg gcaatacttt ac 32
<210> 295
<211> 27
<212> DNA
<213> CTS11577-F
<400> 295
acaaaaacaa cagcaacgaa aaacact 27
<210> 296
<211> 36
<212> DNA
<213> CTS11577-R
<400> 296
attaaactga ttttatcttc aacacctagt tattat 36
<210> 297
<211> 32
<212> DNA
<213> F849-F
<400> 297
aacacattct attagttctg ttttatcctg ag 32
<210> 298
<211> 32
<212> DNA
<213> F849-R
<400> 298
caacaattgt gcaatgtgta atttcaccac tt 32
<210> 299
<211> 32
<212> DNA
<213> Z3660-F
<400> 299
ttttatctcc agacaaatct cgtctcataa aa 32
<210> 300
<211> 31
<212> DNA
<213> Z3660-R
<400> 300
ctatgttaca tttctgcccc taatcctgat g 31
<210> 301
<211> 21
<212> DNA
<213> M64.1-F
<400> 301
ggattcccgg caacgttcaa t 21
<210> 302
<211> 31
<212> DNA
<213> M64.1-R
<400> 302
gatttcagaa caaaggaaac ttcaattagg c 31
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<211> 30
<212> DNA
<213> CTS131-F
<400> 303
tttggattat ttattaagag tttcttcctc 30
<210> 304
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<212> DNA
<213> CTS131-R
<400> 304
tttcaaattt agtacccact tggtata 27
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<211> 25
<212> DNA
<213> L1378-F
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ctagggatgt atggatgtgt cacta 25
<210> 306
<211> 21
<212> DNA
<213> L1378-R
<400> 306
ctgtggccat tccatatctc g 21
<210> 307
<211> 28
<212> DNA
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<400> 307
gtgggctgta cctagaaatc acaatagg 28
<210> 308
<211> 32
<212> DNA
<213> M96-R
<400> 308
catgaaaaaa cctcaattac agtcccagga at 32
<210> 309
<211> 32
<212> DNA
<213> M89-F
<400> 309
gtaacactca gaacaatcat tctttgttat ct 32
<210> 310
<211> 31
<212> DNA
<213> M89-R
<400> 310
cacacacata gaattcctcc atcataaaga a 31
<210> 311
<211> 25
<212> DNA
<213> F1329-F
<400> 311
ggatcagatg ttgtggaagc agatt 25
<210> 312
<211> 27
<212> DNA
<213> F1329-R
<400> 312
caagtaacta ttgtcatcca aggagca 27
<210> 313
<211> 26
<212> DNA
<213> M201-F
<400> 313
cttccagata ttaccagcat gcagat 26
<210> 314
<211> 29
<212> DNA
<213> M201-R
<400> 314
tcaattattc atgctcccct ctttttcct 29
<210> 315
<211> 26
<212> DNA
<213> L901-F
<400> 315
gcttgggcag aatctagaag atgatt 26
<210> 316
<211> 31
<212> DNA
<213> L901-R
<400> 316
ttcatctgat tcacctccag gttttattca a 31
<210> 317
<211> 25
<212> DNA
<213> F929-F
<400> 317
ctctataaac gacttctcaa ttctc 25
<210> 318
<211> 30
<212> DNA
<213> F929-R
<400> 318
cattatatgc taacatttga catgtggtag 30
<210> 319
<211> 26
<212> DNA
<213> M170-F
<400> 319
gctttttcaa atagacaaat gccaga 26
<210> 320
<211> 24
<212> DNA
<213> M170-R
<400> 320
aggaatatgc ttgccagtag cttt 24
<210> 321
<211> 22
<212> DNA
<213> M429-F
<400> 321
cagctctgtc actgtcatag ca 22
<210> 322
<211> 27
<212> DNA
<213> M429-R
<400> 322
aagtcactga agaataagag tgtctat 27
<210> 323
<211> 26
<212> DNA
<213> L15-F
<400> 323
cattgagtct tacagactgg tttagg 26
<210> 324
<211> 28
<212> DNA
<213> L15-R
<400> 324
aattcagttt ttattgtgca ccaagttt 28
<210> 325
<211> 26
<212> DNA
<213> M304-F
<400> 325
ggagcattta agccagaatt gcagat 26
<210> 326
<211> 23
<212> DNA
<213> M304-R
<400> 326
ctggccaagg actcttaaat cag 23
<210> 327
<211> 27
<212> DNA
<213> M9-F
<400> 327
ctaattggtt gcacaacaat ctgttac 27
<210> 328
<211> 26
<212> DNA
<213> M9-R
<400> 328
gaatccacta gagaaagcta catagg 26
<210> 329
<211> 25
<212> DNA
<213> L298-F
<400> 329
gtctctttgg gtgaaagact acatt 25
<210> 330
<211> 26
<212> DNA
<213> L298-R
<400> 330
gcatgtaaca ccagtctaca ttttcc 26
<210> 331
<211> 27
<212> DNA
<213> M20-F
<400> 331
cttgagaaaa gattgctcta atcagcc 27
<210> 332
<211> 24
<212> DNA
<213> M20-R
<400> 332
gactttacac ttccgaagag caac 24
<210> 333
<211> 24
<212> DNA
<213> M526-F
<400> 333
cttctgtgtt tgtccagagg tatc 24
<210> 334
<211> 24
<212> DNA
<213> M526-R
<400> 334
gccttgactg ttgaatggag atac 24
<210> 335
<211> 26
<212> DNA
<213> M1221-F
<400> 335
tagaataata tttactgagc atgatg 26
<210> 336
<211> 24
<212> DNA
<213> M1221-R
<400> 336
cattttctag tgctgggtgc agtt 24
<210> 337
<211> 25
<212> DNA
<213> M4-F
<400> 337
ctacatggaa atggttggct attga 25
<210> 338
<211> 25
<212> DNA
<213> M4-R
<400> 338
gaacgaatgt gctgtattgt gctgt 25
<210> 339
<211> 23
<212> DNA
<213> M231-F
<400> 339
cttatggaac tcacccaagg aca 23
<210> 340
<211> 27
<212> DNA
<213> M231-R
<400> 340
cacttattta agcattggtt ggtcacg 27
<210> 341
<211> 18
<212> DNA
<213> M214-F
<400> 341
aacccctcag tctctccg 18
<210> 342
<211> 20
<212> DNA
<213> M214-R
<400> 342
ccttagatgc tgggtcttcc 20
<210> 343
<211> 22
<212> DNA
<213> F549-F
<400> 343
ttggggaaca ggtaggtggt at 22
<210> 344
<211> 21
<212> DNA
<213> F549-R
<400> 344
cacaccagcc tgggcaacag t 21
<210> 345
<211> 18
<212> DNA
<213> P295-F
<400> 345
gggtccctca gtggatac 18
<210> 346
<211> 26
<212> DNA
<213> P295-R
<400> 346
tgtgtaagca caaagtaggt tctggt 26
<210> 347
<211> 28
<212> DNA
<213> CTS196-F
<400> 347
gtacactgta cttcacaatt ttgtctgc 28
<210> 348
<211> 25
<212> DNA
<213> CTS196-R
<400> 348
gggataaaga gaaagtagtc tcagg 25
<210> 349
<211> 24
<212> DNA
<213> M242-F
<400> 349
cccttccagc aatgacattt gtgt 24
<210> 350
<211> 20
<212> DNA
<213> M242-R
<400> 350
tctccccatg aggaatgcag 20
<210> 351
<211> 26
<212> DNA
<213> M207-F
<400> 351
gatagtattt tctttaatca cctcac 26
<210> 352
<211> 21
<212> DNA
<213> M207-R
<400> 352
gctcatctta gcctcacctc a 21
<210> 353
<211> 25
<212> DNA
<213> M173-F
<400> 353
ccttgaacaa tgtggggtag tgacg 25
<210> 354
<211> 25
<212> DNA
<213> M173-R
<400> 354
aatacatata caaaatatgt gttca 25
<210> 355
<211> 27
<212> DNA
<213> L146-F
<400> 355
atcaaataat aatactgact gtctttg 27
<210> 356
<211> 32
<212> DNA
<213> L146-R
<400> 356
aatgatacct ttttttctac tgataccttt gt 32
<210> 357
<211> 22
<212> DNA
<213> M459-F
<400> 357
atatattttt agctcttcac ta 22
<210> 358
<211> 28
<212> DNA
<213> M459-R
<400> 358
aagcaaagat aatgttataa ttgttaat 28
<210> 359
<211> 28
<212> DNA
<213> M512-F
<400> 359
tataataggg gaggcttgtc actaattt 28
<210> 360
<211> 30
<212> DNA
<213> M512-R
<400> 360
tgctattcaa tttttctcac tacaccattg 30
<210> 361
<211> 32
<212> DNA
<213> M343-F
<400> 361
aaaattatat ggactctgag tgtagacttg tg 32
<210> 362
<211> 32
<212> DNA
<213> M343-R
<400> 362
taatattgcc attgtaagca taattgagaa gg 32
<210> 363
<211> 25
<212> DNA
<213> L754-F
<400> 363
aaatctctga atagatcaat aacaa 25
<210> 364
<211> 32
<212> DNA
<213> L754-R
<400> 364
ttggaatagt ttctgaagga atgttgccag ct 32
<210> 365
<211> 28
<212> DNA
<213> L388-F
<400> 365
cattccaacc tcttattcat ggttagca 28
<210> 366
<211> 26
<212> DNA
<213> L388-R
<400> 366
ggttctatgg tgatttgaac ttgagg 26
<210> 367
<211> 32
<212> DNA
<213> PH155-F
<400> 367
gtagtctcta ccctcatgaa ataacagttt gc 32
<210> 368
<211> 32
<212> DNA
<213> PH155-R
<400> 368
cacaaattag aggagatgga aagtgtgaag aa 32
<210> 369
<211> 32
<212> DNA
<213> M335-F
<400> 369
tgatttgcct gagtaagatt gtgcttcctt gt 32
<210> 370
<211> 32
<212> DNA
<213> M335-R
<400> 370
aaaagaattg actgaatttg acgtgccctt cc 32
<210> 371
<211> 26
<212> DNA
<213> M479-F
<400> 371
ggtccacttc aacggagatg tattta 26
<210> 372
<211> 28
<212> DNA
<213> M479-R
<400> 372
gagcgtgtcc aaattttctc cttttcta 28
<210> 373
<211> 29
<212> DNA
<213> M124-F
<400> 373
cttcttttct tcccctcctt ggaatttca 29
<210> 374
<211> 23
<212> DNA
<213> M124-R
<400> 374
tgggactggc cttacaacac cat 23
<210> 375
<211> 23
<212> DNA
<213> P267-F
<400> 375
gacaggagaa tcacttgaac cct 23
<210> 376
<211> 28
<212> DNA
<213> P267-R
<400> 376
tctatctatc atctacctaa ctatctat 28
<210> 377
<211> 21
<212> DNA
<213> FGC13188-F
<400> 377
gaagcgccac actatcttct g 21
<210> 378
<211> 26
<212> DNA
<213> FGC13188-R
<400> 378
catctcacac catttagaat gggcat 26
<210> 379
<211> 18
<212> DNA
<213> Y12100-F
<400> 379
cctcatagtg catcggca 18
<210> 380
<211> 24
<212> DNA
<213> Y12100-R
<400> 380
ttttttcctc aaatacaaat tagc 24
<210> 381
<211> 23
<212> DNA
<213> FGC46676-F
<400> 381
cctactctgc cctctaaagg aaa 23
<210> 382
<211> 29
<212> DNA
<213> FGC46676-R
<400> 382
tctccatgtc tggtcaaaag aaggaaata 29
<210> 383
<211> 22
<212> DNA
<213> B254-F
<400> 383
tgttatccag gatggtgggc ag 22
<210> 384
<211> 29
<212> DNA
<213> B254-R
<400> 384
cagaaaaaat aaaattagct gggcttggt 29
<210> 385
<211> 23
<212> DNA
<213> Z41335-F
<400> 385
tctcctctgt gtcattccaa ttt 23
<210> 386
<211> 27
<212> DNA
<213> Z41335-R
<400> 386
tgcggtttcc catcagtttt actgtga 27
<210> 387
<211> 30
<212> DNA
<213> M184-F
<400> 387
agaaaaagaa tgaatacagt atgccagttt 30
<210> 388
<211> 30
<212> DNA
<213> M184-R
<400> 388
tattgagtaa tctcctacct gctaatccct 30
<210> 389
<211> 30
<212> DNA
<213> M70-F
<400> 389
catataaagg cattcagttt taaggtattg 30
<210> 390
<211> 28
<212> DNA
<213> M70-R
<400> 390
ctaaattgga gtctacacta ttggctct 28
<210> 391
<211> 26
<212> DNA
<213> PH110-F
<400> 391
acaatctgaa caatgggcaa tatccc 26
<210> 392
<211> 31
<212> DNA
<213> PH110-R
<400> 392
catacatgaa tttgatccat gggtagtttg a 31
<210> 393
<211> 70
<212> DNA
<213> index p5
<400> 393
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnnaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 394
<211> 66
<212> DNA
<213> index p7
<400> 394
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nngtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66

Claims (5)

1.一种基于NGS技术检测200个基因座的检测体系，其特征在于，包含50个Y染色体STR基因座和150个Y染色体SNP遗传标记。
2.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述STR基因座的遗传标记名称分别为DYS19、DYS385a/b、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYF387S1a/b、DYS448、DYS456、DYS458、DYS635、GATA_H4、DYS481、DYS533、DYS576、DYS643、DYS460、DYS549、DYS520、DYS505、DYS518、DYS627、DYS570、DYS527a/b、DYS447、DYS444、DYS557、DYS596、DYS388、DYF404S1a/b、DYS593、DYS645、GATA-A10、DYS626、DYS612、DYS526、DYF399S1、DYF403S1、DYS449、DYS547、DYS522。
3.如权利要求2所述的检测体系，其特征在于，各遗传标记对应扩增引物如表1所示。
表1 50个Y-STR基因座对应的扩增引物
Figure FDA0002818937550000011
Figure FDA0002818937550000021
Figure FDA0002818937550000031
Figure FDA0002818937550000041
Figure FDA0002818937550000051
Figure FDA0002818937550000061
4.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述Y染色体SNP遗传标记及其对应的扩增引物序列如下表2所示。
表2 Y染色体SNP遗传标记及其对应的扩增引物序列
Figure FDA0002818937550000062
Figure FDA0002818937550000071
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Figure FDA0002818937550000091
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Figure FDA0002818937550000171
Figure FDA0002818937550000181
5.一种利用权利要求1所述检测体系检测混合DNA样本的方法，其特征在于，
操作步骤如下：
S1、多重PCR扩增目的基因，构建基因文库；
S2、对目的基因进行测序及数据分析。
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