JP4905884B2 - バイオレメディエーションのモニタリング方法 - Google Patents
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Kakihara F., et al. (2005) Anal Biochem. 341: 77-82
ことを特徴とする遺伝子の検出方法(以下、本検出方法ともいう)、を提供する発明である。
プロセス(A)は、(1)上記の鋳型となる遺伝子増幅産物と、(2)一塩基置換対象塩基から一塩基分3’側の塩基から3’側に向かうDNA鎖に対して相補的な、5’末端にビオチンを結合させたビオチン化プライマーと、(3)一塩基置換対象塩基に相補的な塩基を有する標識されたジデオキシリボヌクレオチド3リン酸を共存させて、一塩基伸長反応を行うプロセスである。
20〜30塩基程度が好適である。また、5’末端のビオチン化は、常法に従い行うことができる。
〔実施例1〕規定量の遺伝子を用いた場合の実施例
Dhc. ethenogenes strain 195(以下、DHC195ともいう)の16S rRNAをコードする遺伝子(以下、16SrDNA又は16Sr遺伝子ともいう)の塩基配列(配列番号1)及びDhc. sp. strain BAV1(以下、BAV1ともいう)の16S rRNAをコードする遺伝子の塩基配列(配列番号2)を比較し、一塩基の違いのある部分(図2:印1→配列番号1の970番目の塩基と配列番号2の970番目の塩基に該当)をターゲットとした本検出方法を、以下の要領にて行った。
それぞれの菌株に由来する16Sr遺伝子の増幅産物を得るために、それぞれの菌株のDNAを鋳型としてPCR反応を行うことにより、当該遺伝子の増幅を行った。
Fw:5’−AAGTCGAACGGTCTTAAGCA−3’(配列番号3)
Rv:5’−GCGGTTACTAGCAACTCCAA−3’(配列番号4)
上記の遺伝子増幅により得られた、それぞれの菌株の16Sr遺伝子の遺伝子増幅産物における、図2の印1に示す一塩基置換塩基(DHC195:G、BAV1:A)を、それぞれターゲットにして、上述したMagSNiPer法を行った。
下記の塩基配列を有する5’ビオチン化プライマーを、DNA合成機を用いて常法により合成した。
標識ddNTPは、Tag標識として、蛍光物質であるフルオレセインが標識されている市販品を、滅菌水で希釈して用いた(Perkin Elmer社製)。
愛知県下の機械工場の揮発性有機塩素化合物により汚染された領域において、HRC(登録商標:粘性のある液体状のポリ乳酸エステル)を用いた嫌気的バイオレメディエーションが行われた領域の地下水におけるDHC195とBAV1の存在割合について、本検出方法によるモニタリングを行った。HRC(登録商標)は、水と反応して徐々に乳酸を放出し、乳酸は微生物の働きで分解して水素が生成し、その水素が微生物(主にDehalococcoides属)による還元的脱塩素化に利用されて、有機塩素化合物が段階的に分解され、最終的には、エチレンやエタンのような無害な化合物に転換されることが知られている。
Claims (3)
- 特定の一塩基置換の関係を有する複数のDehalococcoides属に属する微生物の16S rRNAをコードする遺伝子、を含有する可能性のある土壌又は地下水由来の試料に対して、当該一塩基置換が認められる遺伝子領域の増幅反応産物を調製し、
(A)(1)当該増幅反応産物、(2)一塩基置換対象塩基から一塩基分3'側の塩基から3'側に向かうDNA鎖に対して相補的な、5'末端にビオチンを結合させたビオチン化プライマー、(3)一塩基置換対象塩基に相補的な塩基を有する標識されたジデオキシリボヌクレオチド3リン酸、を共存させて一塩基伸長反応を行い、
(B)(A)の反応系に、アビジン化磁気ビーズを共存させて、当該磁気ビーズ上のアビジンと、上記増幅反応産物とビオチン化プライマーのハイブリダイズ鎖におけるビオチンとを結合させた後、余剰の標識されたジデオキシリボヌクレオチド3リン酸を反応系から除去して、
(C)反応系における1種又は2種以上の標識をカウントし、カウントした標識同士における強度の比を、試料中の検出対象遺伝子の存在比として表すことを特徴とする遺伝子の検出方法、を嫌気的バイオレメディエーション施行中において行い、これによりDehalococcoides属に属する微生物の存在比を把握することにより、当該嫌気的バイオレメディエーションの進捗をモニタリングすることを特徴とする、バイオレメディエーションのモニタリング方法。 - 嫌気的バイオレメディエーション施行中において、遺伝子の検出方法を行う回数は2回以上であることを特徴とする、請求項1に記載のモニタリング方法。
- 複数のDehalococcoides属に属する微生物は、Dehalococcoides ethenogenes strain 195、及び、Dehalococcoides sp. strain BAV1、であることを特徴とする請求項1又は2に記載のモニタリング方法。
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