JP2016063826A - ＧＮＡＱを標的としたｄｓＲＮＡ組成物および発現を阻害するための方法 - Google Patents

ＧＮＡＱを標的としたｄｓＲＮＡ組成物および発現を阻害するための方法 Download PDF

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Abstract

【課題】本発明は、ヘテロ三量体Ｇ遺伝子のＧアルファｑサブユニット（ＧＮＡＱ）を標的とする二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、およびＧＮＡＱの発現を阻害するためのｄｓＲＮＡの使用方法に関する。【解決手段】ヘテロ三量体Ｇ遺伝子のＧアルファｑサブユニット（ＧＮＡＱ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ＧＮＡＱをコード化するｍＲＮＡに相補性の領域を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、それぞれの鎖が、少なくとも１５ヌクレオチド長である、二本鎖リボ核酸。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００８年１２月１０日に出願された米国特許仮出願第６１／１２１，２５３号、および２００９年６月９日に出願された米国特許仮出願第６１／１８５，５４３号、および２００９年９月２２日に出願された米国特許仮出願第６１／２４４，７８０号の利益を主張し、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
配列表への言及
本出願は、２０１０年１２月１０日に作成された、５６０，４７４バイトの大きさの、１６２６７ＵＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔというテキストファイル名で電子出願された配列表を含む。本配列表は、参照によって組み込まれる。
本発明は、ヘテロ三量体Ｇ遺伝子のＧアルファｑサブユニット（ＧＮＡＱ）を標的とする二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、およびＧＮＡＱの発現を阻害するためにｄｓＲＮＡを使用する方法に関する。
グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）は、細胞表面の７回膜貫通ドメイン受容体を細胞内シグナル経路に共役させるヘテロ三量体タンパク質のファミリーである。Ｇタンパク質は、アルファ、ベータ、ガンマのサブユニットからなる。Ｇアルファｑサブユニット（ＧＮＡＱ）は、Ｇアルファのサブユニットのうちの１つである。ＧＮＡＱは、ホスホリパーゼＣベータの刺激およびＧＴＰの加水分解を媒介する。
ＧＮＡＱの過剰発現へと至るＧＮＡＱ変異を持つマウスは、皮膚色素沈着過剰を示す。ヒトＧＮＡＱ内の点変異は、黒色腫試料において報告された（Ｂａｍｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，９１：３５５−３５８）。国際公開番号ＷＯ／２００８／０９８２０８号（ＰＣＴ／ＵＳ第２００８／０５３４８４号）において、出願者は、メラニン細胞腫瘍、例えば、ブドウ膜黒色腫内でＧＮＡＱを構成的に活性化する変異の存在について記載した。
二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる高保存制御機構内の遺伝子発現を遮断することが示されている。国際公開番号ＷＯ／１９９９／０３２６１９号（Ｆｉｒｅら）は、線虫内の遺伝子の発現を阻害するための少なくとも２５ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡの使用を開示した。ｄｓＲＮＡは、植物（例えば、国際公開番号ＷＯ／１９９９／０５３０５０号、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、および国際公開番号ＷＯ／１９９９／０６１６３１号、Ｈｅｉｆｅｔｚらを参照）、ショウジョウバエ（例えば、Ｙａｎｇ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（２０００）１０：１１９１−１２００を参照）、および哺乳類（国際公開番号ＷＯ／２０００／０４４８９５号、Ｌｉｍｍｅｒ、および独国特許第１０１ ００ ５８６．５号、Ｋｒｅｕｔｚｅｒらを参照）を含む、他の生物内の標的ＲＮＡを分解することも示されている。
本明細書において、細胞内のＧＮＡＱの発現を阻害するためのＧＮＡＱを標的とするｄｓＲＮＡを開示する。また、ＧＮＡＱ発現のｓｉＲＮＡ阻害、ならびに例えば、ブドウ膜黒色腫等の、ＧＮＡＱの発現および／または過剰発現と関係する疾病の治療のための、ＧＮＡＱのｄｓＲＮＡを使用する方法を開示する。
したがって、本発明の一態様は、ヘテロ三量体Ｇ遺伝子のＧアルファｑサブユニット（ＧＮＡＱ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であり、本ｄｓＲＮＡは、ＧＮＡＱをコード化するｍＲＮＡに相補的な相補性の領域を有するセンス鎖およびアンチセンス鎖を有し、それぞれの鎖は、少なくとも１５ヌクレオチド長である。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ＡＤ−２００５７であり、例えば、センス鎖は配列番号１５７９であり、アンチセンス鎖は配列番号１５８０である。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号１４２１の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的であるか、または配列番号１４２１の少なくとも最初の１１個のヌクレオチドに相補的である。センス鎖は、配列番号１４２１または配列番号１５７９の１５個以上の連続するヌクレオチドを含むことができ、および／またはアンチセンス鎖は、配列番号１４２２または配列番号１５８０の１５個以上の連続するヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、センス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１４２１を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１４２２を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、以下を結果としてもたらす：Ａ３７５細胞への０．１ｎＭのｄｓＲＮＡの投与によって、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定される際に、ＧＮＡＱのｍＲＮＡ発現の約６６％の阻害をもたらすか、またはＡ３７５細胞への１ｎＭのｄｓＲＮＡの投与によって、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定される際に、ＧＮＡＱのｍＲＮＡ発現の約６１％の阻害をもたらすか、またはＡ５７９細胞への１ｎＭのｄｓＲＮＡの投与によって、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定される際に、ＧＮＡＱのｍＲＮＡ発現の約８２％の阻害をもたらすか、またはＯＭＭ１．３細胞への１０ｎＭのｄｓＲＮＡの投与によって、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定される際に、ＧＮＡＱのｍＲＮＡ発現の約４２％の阻害をもたらすか、またはＵＭＥＬ２０２細胞へのｄｓＲＮＡの投与によって、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定される際に、ＧＮＡＱのｍＲＮＡ発現の約８１％の阻害をもたらす。
別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ＡＤ−２００５１であり、センス鎖は、配列番号１５６５であり、アンチセンス鎖は、配列番号１５６６である。ｄｓＲＮＡは、配列番号１４０７の少なくとも最初の１１個のヌクレオチドに相補的、および／または配列番号１４０７の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的であることができる。いくつかの実施形態において、センス鎖は、配列番号１４０７または配列番号１５６５の１５個以上の連続するヌクレオチドを含み、および／またはアンチセンス鎖は、配列番号１４０８または配列番号１５６６の１５個以上の連続するヌクレオチドを含む。センス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１４０７を含むことができ、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１４０８を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、以下を結果としてもたらす：Ａ３７５細胞への０．１ｎＭのｄｓＲＮＡの投与によって、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定される際に、ＧＮＡＱのｍＲＮＡ発現の約４９％の阻害をもたらすか、またはＡ３７５細胞への１ｎＭのｄｓＲＮＡの投与によって、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定される際に、ＧＮＡＱのｍＲＮＡ発現の約５５％の阻害をもたらすか、またはＡ５７９細胞への１ｎＭのｄｓＲＮＡの投与によって、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定される際にＧＮＡＱのｍＲＮＡ発現の約８３％の阻害をもたらすか、またはＯＭＭ１．３細胞への１０ｎＭのｄｓＲＮＡの投与によって、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定される際に、ＧＮＡＱのｍＲＮＡ発現の約４２％の阻害をもたらす。
他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ＡＤ−２００５２またはＡＤ−２００６９である。
ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＧＮＡＱをコード化するｍＲＮＡ、例えばヒトＧＮＡＱのｍＲＮＡ（例えば、ＮＭ ００２０７２）またはラットＧＮＡＱのｍＲＮＡ（例えば、ＮＭ ０３１０３６）に一部または完全に相補的である。相補性の領域は、少なくとも１５ヌクレオチド長、例えば、１９〜２１ヌクレオチド長、例えば、１９ヌクレオチド長である。相補性の領域は、表２ａ、３ａ、または４ａに記載するアンチセンス配列のうちの１つの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むことができる。他の実施形態において、相補性の領域は、表２ａ、３ａ、または４ａに記載するアンチセンス配列のうちの１つである。
さらなる代表的なｄｓＲＮＡを、本明細書の表に提供する。いくつかの実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖を含み、アンチセンス鎖は、表２ｂ、３ｂ、４ｂ、または表２ｃ、３ｃ、もしくは４ｃ、または表２ｄ、３ｄ、もしくは４ｄから選択される。
一態様において、ｄｓＲＮＡのそれぞれの鎖は、３０ヌクレオチド長以下である。少なくとも１つの鎖は、少なくとも１個のヌクレオチド、例えば、２個のヌクレオチド、例えば、ｄＴｄＴの３’オーバーハングを含むことができる。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、修飾される。例えば、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡに生体試料中での増加した安定性を持たせる修飾を含むことができる。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、またはコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基と結合した末端ヌクレオチドを含む。他の実施形態において、修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックド（locked）ヌクレオチド、脱塩基（abasic）ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミダート、またはヌクレオチドを含む非天然塩基である。本発明のｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドおよび５’−ホスホロチオエート基を含む少なくとも１つの２’−デオキシチミジン−３’−リン酸ヌクレオチドを含むことができる。
本発明の任意のｄｓＲＮＡは、一連の規則に従って修飾され得る、例えばセンス鎖は全て２’−Ｏ−メチル修飾ピリミジンを含み、アンチセンス鎖は、ピリミジンがＡに隣接する時に、２’−Ｏ−メチル修飾ピリミジンを含み、それぞれの鎖が３’末端にｄＴｄＴを含む、またはセンス鎖は、全て２’−Ｏ−メチル修飾ピリミジンを含み、アンチセンス鎖は、ピリミジンがＡに隣接する時に、２’−Ｏ−メチル修飾ピリミジンを含み、それぞれの鎖が３’末端にｄＴｓｄＴを含む、またはセンス鎖は、全ての２’−Ｏ−メチル修飾ピリミジンを含み、アンチセンス鎖は、ａ）ピリミジンがＡに隣接するか、またはｂ）ピリミジンがＵまたはＧに隣接するウラシルである時に、２’−Ｏ−メチル修飾ピリミジンを含み、それぞれの鎖が３’末端にｄＴｓｄＴを含む。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、リガンドを含む。リガンドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端にコンジュゲート（conjugated）することができる。
本発明の別の態様は、ＧＮＡＱを標的とするｄｓＲＮＡおよび医薬製剤を含むＧＮＡＱ遺伝子の発現を阻害する組成物である。一実施形態において、医薬製剤は脂質製剤である。代表的な製剤は、本明細書に記載され、例えば、ＬＮＰ製剤、ＬＮＰ０１製剤、ＸＴＣ−ＳＮＡＬＰ製剤、ＳＮＡＬＰ製剤、またはＬＮＰ１１製剤を含む。
また、本明細書においては、本発明のｄｓＲＮＡを含有する単離した細胞、本発明のｄｓＲＮＡの少なくとも１つの鎖をコード化するヌクレオチド配列を含むベクター、および該ベクターを含む細胞が含まれる。
本発明のｄｓＲＮＡは、該ＧＮＡＱを発現する細胞と接触すると、そのように接触しない細胞と比較して、該ＧＮＡＱ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する。いくつかの実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、ｐＭ ＩＣ５０、例えば、１０ｐＭ未満のＩＣ５０を有する。
本発明の別の態様は、細胞内のＧＮＡＱ発現を阻害する方法であって、その方法は、本発明のｄｓＲＮＡのいずれかを細胞に導入することを含み、ＧＮＡＱ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るために十分な時間の間細胞を維持し、それによって細胞内のＧＮＡＱ遺伝子の発現を阻害する。いくつかの実施形態において、発現は、少なくとも２０％、４０％、６０％、または少なくとも８０％阻害される。また、かかる治療を必要とするヒトに、本発明のｄｓＲＮＡのいずれかの治療有効量を投与することによって、ＧＮＡＱ発現によって媒介される疾患を治療する方法を含む。かかる疾患の例は、ブドウ膜黒色腫、皮膚黒色腫、青色母斑、太田母斑、小細胞肺腫瘍、または神経内分泌腫瘍を含む。治療の方法は、追加の組成物、例えば、第２のｄｓＲＮＡを投与することを含むことができる。
一連のＧＮＡＱ標的ｄｓＲＮＡで形質移入後の、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−アルファサイトカイン誘導を示すグラフである。 一連のＧＮＡＱ標的ｄｓＲＮＡで形質移入後の、ヒトＰＢＭＣにおけるＴＮＦ−アルファサイトカイン誘導を示す。 １ｎＭのｄｓＲＮＡで形質移入後の、ＯＭＭ１．３およびＭＥＬ２８５細胞の細胞生存率を示す。Ｙ軸は、対照ＡＤ−１９５５に対して基準化した生存率である。 １ｎＭのｄｓＲＮＡで形質移入後の、ＭＥＬ２０２およびＭＥＬ２８５細胞の細胞生存率を示す。Ｙ軸は、対照ＡＤ−１９５５に対して基準化した生存率である。 ０．０１ｎＭのｄｓＲＮＡで形質移入後の、ＯＭＭ１．３およびＭＥＬ２８５細胞の細胞生存率を示す。Ｙ軸は、対照ＡＤ−１９５５に対して基準化した生存率である。 ０．０１ｎＭのｄｓＲＮＡで形質移入後の、ＭＥＬ２０２およびＭＥＬ２８５細胞の細胞生存率を示す。Ｙ軸は、ＡＤ−１９５５を対照するために基準化した生存率である。 ＡＤ−２００５７およびＡＤ−２００５１ｄｓＲＮＡで形質移入後の、ＯＭＭ１．３、ＭＥＬ２０２、およびＭＥＬ２８５細胞の７日目の細胞生存率を示す。 ＡＤ−２００６９およびＡＤ−２００９３ｄｓＲＮＡで形質移入後の、ＯＭＭ１．３、ＭＥＬ２０２、およびＭＥＬ２８５細胞の７日目の細胞生存率を示す。
本発明は、ｄｓＲＮＡ、および細胞または哺乳類においてヘテロ三量体Ｇ遺伝子のＧアルファｑサブユニット（ＧＮＡＱ）の発現を阻害するためにｄｓＲＮＡを使用する方法であって、ここに、ｄｓＲＮＡがＧＮＡＱ遺伝子を標的とするところの方法を提供する。本発明は、ＧＮＡＱ遺伝子の過剰発現によってもたらされる哺乳類におけるブドウ膜黒色腫等の病態および疾病を治療するための組成物および方法も提供する。ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスを通してｍＲＮＡの配列特有の分解を誘導する。
本明細書の特徴である組成物のｄｓＲＮＡは、３０ヌクレオチド長未満、一般的に１９〜２４ヌクレオチド長であって、ＧＮＡＱ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的である領域を有するアンチセンス鎖を含む。これらのｄｓＲＮＡの使用により、哺乳類におけるＧＮＡＱ発現と関連した病態に関係する遺伝子のｍＲＮＡの標的とされる分解が可能となる。特に、非常に低い投与量のＧＮＡＱ ｄｓＲＮＡは、特異的かつ効率的にＲＮＡｉを媒介することができ、ＧＮＡＱ遺伝子の発現の大きな阻害をもたらす。本発明者らは、細胞ベースのアッセイを使用して、ＧＮＡＱを標的とするｄｓＲＮＡが特異的かつ効率的にＲＮＡｉを媒介することができ、その結果、ＧＮＡＱ遺伝子の発現の大きな阻害をもたらすことを明らかにする。したがって、これらのｄｓＲＮＡを含む方法および組成物は、例えば、ブドウ膜黒色腫の治療等の、ＧＮＡＱ過剰発現を下方制御することによって媒介されることができる病的過程を治療するために有用である。
以下の詳細な説明は、ＧＮＡＱ遺伝子の発現を阻害するために、ｄｓＲＮＡを含有した組成物を作製し使用する方法、ならびにこの遺伝子の発現がもたらす疾病および疾患を治療するための組成物（例えば、医薬組成物）および方法を開示する。
したがって、いくつかの態様において、ＧＮＡＱ ｄｓＲＮＡを含有する医薬組成物および医薬的に許容可能な担体、ＧＮＡＱ遺伝子の発現を阻害するために該組成物を使用する方法、およびＧＮＡＱ遺伝子の発現がもたらす疾病を治療するために該医薬組成物を使用する方法が、本発明の特徴である。
定義
便宜上、明細書、実施例、添付の特許請求の範囲において使用する特定の用語および語句の意味を、以下に提供する。本明細書の他の箇所の用語の使用とこの節に提供する定義との間に明らかな相違がある場合は、この節の定義に従う。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、および「Ｕ」は、それぞれ一般的に、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルをそれぞれ塩基として含有するヌクレオチドを表す。「Ｔ」および「ｄＴ」は、本明細書において、互換的に使用され、核酸塩基がチミンであるデオキシリボヌクレオチドを示し、例えば、デオキシリボチミンである。しかし、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」または「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、以下にさらに詳述される修飾ヌクレオチド、または代理の置換部分を示し得ることが理解されるであろう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルが、かかる置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合の性質を実質的に変化させずに、他の部分と置換され得ることをよく認識している。例えば、限定無しに、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対合することができる。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列内で、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドと置換することができる。かかる置換部分を含む配列は、本発明の実施形態である。
本明細書で使用する「ＧＮＡＱ」は、ヘテロ三量体Ｇ遺伝子のＧアルファｑサブユニット（ＧＮＡＱ）を指す。ＧＮＡＱは、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、ｑポリペプチドおよびＧアルファｑ、ＧＡＱとしても知られる。ヒトＧＮＡＱ ｍＲＮＡ転写物の配列は、ＮＭ ００２０７２．２で見出され得る。ラットＧＮＡＱ ｍＲＮＡの配列は、ＮＭ ０３１０３６で見出され得る。
本明細書で使用する「標的」または「標的遺伝子」は、ＧＮＡＱ遺伝子を指す。
本明細書で使用する、「標的配列」は、ＧＮＡＱ遺伝子の転写中に形成されたｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する部分を指し、一次転写産物のＲＮＡプロセッシングの産物であるｍＲＮＡを包含する。
本明細書で使用する、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチド命名法を使用して、参照された配列によって記載されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書で使用する場合、別に示されない限り、「相補的」という用語は、第２のヌクレオチド配列に関係して第１のヌクレオチド配列を説明するために使用する際、第１のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、ある条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する能力を指し、当業者に理解されるであろう。かかる条件は、例えば、ストリンジェントな条件であることができ、ストリンジェントな条件は、以下を含むことができる：４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、１２〜１６時間の間５０℃または７０℃、その後の洗浄。組織内で遭遇する可能性がある生理学的に関係する条件等の他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリッド形成したヌクレオチドの最終的な適用に従って、２つの配列の相補性の試験に最も適した一連の条件を決定することができるだろう。
これには、第１のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの、第１および第２のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対合が含まれる。かかる配列は、本明細書において互いに関して「完全に相補的」であると称することもできる。しかし、本明細書において、第１の配列が第２の配列に関して「実質的に相補的」と称する場合、該２つの配列は完全に相補的であることができ、またはそれらは、それらの最終的な適用に最適な条件下でハイブリッド形成する能力を保持しながら、ハイブリダイゼーションの際に１以上（一般的には、４、３、または２個以下）のミスマッチ（mismatched）塩基対を形成していてもよい。しかし、ハイブリダイゼーションの際に、２個のオリゴヌクレオチドが１つ以上の１本鎖オーバーハングを形成するように設計される場合、かかるオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチとして見なされないものとする。さらに、例えば、２１ヌクレオチド長の１のオリゴヌクレオチドおよび２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドを含み、長い方のオリゴヌクレオチドが短い方のオリゴヌクレオチドに完全に相補的である２１個のヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡは、本明細書に記載する目的にぽて、「完全に相補的」であると称されうる。
本明細書で使用する「相補的」な配列は、ハイブリッド形成する能力に関する上記の要求が満たされる限り、非天然および修飾されたヌクレオチドから形成された非ワトソン・クリック塩基対および／または塩基対も含むことができるか、またはそれらから全てが形成される。かかる非ワトソン・クリック塩基対は、Ｇ：Ｕのゆらぎ（Wobble）またはフーグスタイン（Hoogstein）塩基対合を含むが、これらに限定されない。
本明細書における「相補的」、「完全に相補的」および「実質的に相補的」という用語は、これらの使用状況から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基マッチング（base matching）に関して使用されうる。
本明細書で使用する、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部に実質的に相補的」であるポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）、または３’ＵＴＲを含む対象のｍＲＮＡ（例えば、標的遺伝子、例えば、ＧＮＡＱをコード化するｍＲＮＡ）の連続する部分に実質的に相補的であるポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がＧＮＡＱをコード化するｍＲＮＡの非中断性部分に実質的に相補的である場合、ＧＮＡＱ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
本明細書で使用する「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、上記に定義するように、２つの逆平行かつ実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。一般的に、それぞれの鎖のヌクレオチドの多くは、リボヌクレオチドであるが、本明細書に詳細が記載されるように、それぞれの鎖または両方の鎖は、少なくとも１つの非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドを含むこともできる。さらに、本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡ」は、リボヌクレオチドに対する化学修飾を含むことができ、該修飾には、複数のヌクレオチドにおける実質的な修飾、および本明細書に開示されるか、または当該技術の分野で知られている全ての種類の修飾が包含される。ｓｉＲＮＡタイプの分子に使用する任意のかかる修飾は、本明細書および特許請求の範囲の目的において、「ｄｓＲＮＡ」に包含される。
二本鎖構造を形成する２つの鎖は、１つの大きなＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、またはそれらは別々のＲＮＡ分子であってもよい。該２つの鎖が１つの大きな分子の一部であり、そのため、二本鎖構造を形成する１の鎖の３’末端と他方の鎖の５’末端との間が非中断性ヌクレオチド鎖によって連結されている場合、該連結しているＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と呼ばれる。該２つの鎖が二本鎖構造を形成する１の鎖の３’末端と他方の鎖の５’末端との間で、非中断性ヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合で連結されている場合、該連結構造は、「リンカー」と呼ばれる。該ＲＮＡ鎖は、同一または異なる数のヌクレオチドを有していてもよい。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖のヌクレオチド数から二本鎖に存在する任意のオーバーハングを引いた数である。二本鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチドのオーバーハングを含んでいてもよい。「ｓｉＲＮＡ」という用語は、上記の通りｄｓＲＮＡを指すために本明細書で使用される。
本明細書で使用する「ヌクレオチドのオーバーハング」は、ｄｓＲＮＡの１つの鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて伸長する（または逆も同様）場合の、ｄｓＲＮＡの二本鎖構造から突出する対合していないヌクレオチド（複数も可）を指す。「平滑末端化」または「平滑末端」は、ｄｓＲＮＡの末端に対合していないヌクレオチドがないこと、すなわち、ヌクレオチドのオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端化した」ｄｓＲＮＡは、全長にわたって二本鎖になったｄｓＲＮＡ、すなわち、該分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがないｄｓＲＮＡである。
「アンチセンス鎖」という用語は、標的配列に実質的に相補的である領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書で使用する「相補性の領域」という用語は、本明細書に定義するように、配列、例えば、標的配列に実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性の領域が標的配列に完全に相補的ではない場合、該ミスマッチは、末端領域で最も許容され、存在する場合、一般的に末端領域（複数も可）、例えば、５’および／または３’末端の６、５、４、３または２ヌクレオチド以内にある。
本明細書で使用する「センス鎖」という用語は、アンチセンス鎖の領域に実質的に相補的である領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。
本明細書で使用する「ＳＮＡＬＰ」という用語は、安定した核酸−脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰは、ｉＲＮＡ剤またはプラスミド（該プラスミドからｉＲＮＡ剤が転写される）等の核酸を含む少量の水性内部を覆う脂質の小胞を表す。ＳＮＡＬＰは、例えば、２００８年４月１５日に出願された米国特許出願公開番号第２００６０２４００９３号、第２００７０１３５３７２号およびＵＳＳＮ第６１／０４５，２２８号に記載される。これらの出願は、出典明示により本明細書に組み込まれる。
ｄｓＲＮＡを指す際に、「細胞に導入する」とは、当業者によって理解されるように、細胞へ取り込みまたは吸収し易くすることを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収もしくは取り込みは、自発的な拡散もしくは活発な細胞プロセスを介して、または補助的な薬剤もしくは装置によって、発生することができる。この用語の意味は、インビトロでの細胞に限定されず、ｄｓＲＮＡは、生存生物の一部である「細胞に導入する」こともできる。そのような場合には、細胞への導入は、生物への送達を含むであろう。例えば、インビボ送達では、ｄｓＲＮＡは組織部位に注入される、または全身に投与されることができる。細胞へのインビトロ導入は、電気穿孔およびリポフェクション等の当該技術の分野で知られている方法を含む。
「サイレンス」、「発現を阻害する」、「発現を下方制御する」、「発現を抑制する」等の用語は、本明細書において、それらが標的遺伝子について言及する限り、第１の細胞または細胞群と実質的に同一だが、処置されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較して、ＧＮＡＱ遺伝子が転写され、ＧＮＡＱ遺伝子の発現が阻害されるように処置されている第１の細胞または細胞群から単離または検出され得るｍＲＮＡの量の減少によって顕在化するような、ＧＮＡＱ遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を指す。阻害の度合いは、通常、以下のように示される。
[{(対照細胞のmRNA)-(処理細胞のmRNA)}/(対照細胞のmRNA)]×100%
別法では、阻害の度合いは、ＧＮＡＱ遺伝子転写に機能的に結び付けられるパラメータ、例えば、細胞によって分泌されるＧＮＡＱ遺伝子によってコードされるタンパク質の量、または特定の表現型、例えば、アポトーシスを示す細胞数の減少に関して与えられてもよい。原則として、ＧＮＡＱ遺伝子サイレンシング（silencing）は、構成的に、またはゲノム操作によって、および任意の適切なアッセイによって、標的を発現する任意の細胞において決定されうる。しかし、与えられたｄｓＲＮＡがＧＮＡＱ遺伝子の発現をある程度阻害するかどうかを決定するためには基準が必要であり、したがって、本発明に包含される場合、下記の実施例に提供するアッセイがかかる基準として役立つであろう。
例えば、場合によっては、ＧＮＡＱ遺伝子の発現は、本発明の特徴である二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％抑制される。いくつかの実施形態において、ＧＮＡＱ遺伝子は、本発明の特徴である二本鎖のオリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約６０％、７０％、または８０％抑制される。いくつかの実施形態において、ＧＮＡＱ遺伝子は、本発明の特徴である二本鎖のオリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約８５％、９０％、または９５％抑制される。
ＧＮＡＱ発現と関連して本明細書で使用する「処置する」、「治療」等の用語は、ＧＮＡＱ発現によって媒介される病的過程からの解放またはその軽減を指す。本発明と関連して、本明細書において以下に列挙された他の条件のいずれか（ＧＮＡＱ発現によって媒介された病的過程以外）に関する限り、「処置する」、「治療」等の用語は、少なくとも１つのかかる条件と関連した症状から解放される、もしくはそれらを軽減するか、またはブドウ膜黒色腫の腫瘍の減少等の、かかる条件の進行を遅らせるもしくは逆転させることを意味する。
本明細書で使用する「治療有効量」および「予防的有効量」という語句は、ＧＮＡＱ発現によって媒介された病的過程、もしくはＧＮＡＱ発現によって媒介された病的過程の明らかな症状の治療、予防または管理において治療効果を得る量を指す。治療効果のある特定の量は、通常の医師によって容易に決定されることができ、例えば、ＧＮＡＱ発現によって媒介された病的過程の種類、患者の病歴および年齢、ＧＮＡＱ発現によって媒介された病的過程の段階、ＧＮＡＱ発現薬剤によって媒介された他の抗病的過程の投与等の、当該技術分野で知られている要因によって異なっていてもよい。
本明細書で使用する「医薬組成物」は、ｄｓＲＮＡの薬理学的に有効な量および医薬的に許容可能な担体を含む。本明細書で使用する「薬理学的に有効な量」、「治療有効量」、または単に「有効量」は、意図した薬理学的な、治療的な、または予防的な結果を産生するために有効なＲＮＡの量を指す。例えば、疾病または疾患と関連した測定可能なパラメータにおいて少なくとも２５％の減少がある時に、ある臨床治療が有効的であると考えられる場合、その疾病または疾患の治療のための薬物の治療有効量は、そのパラメータの少なくとも２５％の減少をもたらすために必要な量である。
「医薬的に許容可能な担体」という用語は、治療薬の投与のための担体を指す。かかる担体は、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。その用語は、細胞培地を特異的に除外する。経口投与される薬物の場合、医薬的に許容可能な担体は、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味料、調味料、着色料、および防腐剤等の医薬的に許容される賦形剤を含むがこれらに限定されない。適した不活性希釈剤は、炭酸ナトリウムおよびカルシウム、リン酸ナトリウムおよびカルシウムならびに乳糖を含むが、コーンスターチおよびアルギン酸は適した崩壊剤である。結合剤は、デンプンおよびゼラチンを含むことができるが、潤滑剤は、存在する場合、一般的にステアリン酸マグネシウム、ステアリン、または滑石であるであろう。望ましい場合、錠剤は、胃腸管において吸収を遅らせるために、モノステアリン酸グリセリン、またはジステアリン酸グリセリル等の物質でコーティングされ得る。
本明細書で使用する「形質転換細胞」は、ｄｓＲＮＡ分子が発現され得るベクターが導入された細胞である。
二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
本明細書においてより詳細に記載されるように、本発明は、細胞または哺乳類においてＧＮＡＱ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子であって、該ｄｓＲＮＡが第１の配列を有するセンス鎖およびＧＮＡＱをコード化するｍＲＮＡに相補的である第２の配列を含むアンチセンス鎖を含む分子を提供し、ここに、該第１の配列は、相補性の領域で該第２の配列に相補的であり、それぞれの鎖は、１５〜３０塩基対長である。いくつかの実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、例えば、ＰＣＲもしくは分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベースの方法、またはウエスタンブロットによる等のタンパク質ベースの方法によってアッセイされる場合、該ＧＮＡＱ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する。ＧＮＡＱ遺伝子の発現は、下記の実施例に記載されるアッセイによって測定される時、少なくとも３０％減少されることができる。例えば、ＨｅｐＢ３細胞中等の、細胞培養におけるＧＮＡＱ遺伝子の発現は、例えばｂＤＮＡまたはＴａｑＭａｎアッセイによって、ＧＮＡＱ ｍＲＮＡレベルを測定することによって、または例えばＥＬＩＳＡアッセイによって、タンパク質レベルを測定することによって、アッセイされることができる。
ｄｓＲＮＡは、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃから市販されているもの等、例えば、自動ＤＮＡ合成機の使用によって、以下にさらに論じるように、当該技術の分野において知られている標準方法によって合成され得る。ｄｓＲＮＡは、二本鎖構造を形成するようにハイブリッド形成するために十分に相補的である２つのＲＮＡ鎖を含む。
ｄｓＲＮＡの１の鎖（アンチセンス鎖）は、標的遺伝子の発現中に形成されたｍＲＮＡの配列に由来する標的配列に対して相補的である相補性の領域を含み、他方の鎖（センス鎖）は、該アンチセンス鎖に相補的である領域を含み、その結果、該２つの鎖は、適した条件下で組み合わせられる時にハイブリッド形成し、二本鎖構造を形成する。相補性の領域は、一般的に少なくとも１５ヌクレオチド長、または１９〜２１ヌクレオチド長、または１９、２０、または２１ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、相補性の領域は、表２ａ、３ａ、または４ａに記載するアンチセンス配列のうちの１つの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。他の実施形態において、相補性の領域は、表２ａ、３ａ、または４ａに記載するアンチセンス配列のうちの１つを含む。
一般的に、二本鎖構造は、１５〜３０、または２５〜３０、または１８〜２５、または１９〜２４、または１９〜２１、または１９、２０、もしくは２１塩基対長である。一実施形態において、二本鎖は１９塩基対長である。別の実施形態において、二本鎖は、２１塩基対長である。２つの異なるｄｓＲＮＡが組み合わせて使用される時、二本鎖の長さは、同一であってもよく、異なっていてもよい。
本発明のｄｓＲＮＡのそれぞれの鎖は、一般的に、１５〜３０、または１８〜２５、または１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ヌクレオチド長である。他の実施形態において、それぞれの鎖は、２５〜３０ヌクレオチド長である。二本鎖のそれぞれの鎖は、同じ長さまたは異なる長さであることができる。２つの異なるｓｉＲＮＡが組み合わせて使用される時、それぞれのｓｉＲＮＡの各鎖の長さは、同一であっても異なっていてもよい。
本発明のｄｓＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチドの１つ以上の単鎖のオーバーハングを含むことができる。一実施形態において、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端は、１〜４個、または１、２、３、もしくは４個のヌクレオチドの単鎖のヌクレオチドのオーバーハングを有する。別の実施形態において、オーバーハングは、ｄＴｄＴを含む。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、それぞれ、センス鎖上の３’末端および５’末端に１〜１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、それぞれ、アンチセンス鎖上の３’末端および５’末端に１〜１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。
少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、平滑末端化した対応物よりも予想外に優位な阻害性質を有することができる。いくつかの実施形態において、１つのみのヌクレオチドのオーバーハングの存在は、その全体的な安定性に影響せずに、ｄｓＲＮＡの干渉活性を強める。１つのみのオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、インビボ、ならびに様々な細胞、細胞培地、血液、および血清において特に安定的および有効的であることを証明した。一般的に、単鎖のオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端、またはセンス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡは、一般的にアンチセンス鎖の５’末端に位置する平滑末端も有することができる。かかるｄｓＲＮＡは、改善した安定性および阻害活性を有することができ、それによって、低い投与量、すなわち、１日当たりレシピエントの体重１ｋｇにつき５ｍｇ未満の投与を可能にする。一般的に、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドのオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。別の実施形態において、オーバーハング中の１つ以上のヌクレオチドは、ヌクレオシドチオホスフェートで置換される。
一実施形態において、ＧＮＡＱ遺伝子は、ヒトＧＮＡＱ遺伝子、例えばＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ ００２０７２．２で同定される配列である。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、表２〜４のセンス配列のうちの１つであり、アンチセンス鎖は、表２〜４のアンチセンス配列のうちの１つである。表２〜４に提供する標的配列のほかの部分を標的とする代わりのアンチセンス剤は、標的配列および隣接するＧＮＡＱ配列を使用して容易に決定することができる。
当業者は、２０個〜２３個の間、しかし特異的に２１個の塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘発することに特に有効的であると認められていることをよく知っている（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、ＥＭＢＯ２００１，２０：６８７７−６８８８）。しかし、他方、より短いまたは長いｄｓＲＮＡも有効であることを見出している。上述の実施形態において、表２〜４に提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質に基づいて、本発明の特徴であるｄｓＲＮＡは、その中に記載される長さの少なくとも１つの鎖を含む。表２〜４の配列のうちの１つであって、該配列から片方または両方の末端上の２、３個のヌクレオチドを引いた配列を有する短いｄｓＲＮＡが、上記のｄｓＲＮＡと比較して同様に効果的でありうることは、当然予想できる。従って、表２〜４の配列のうちの１つに由来する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２以上の連続するヌクレオチドの部分配列を有し、かつ、本明細書において下記するアッセイにおけるＧＮＡＱ遺伝子の発現を阻害するそれらの能力において、５、１０、１５、２０、２５または３０％以下の阻害によって、完全な配列を含むｄｓＲＮＡと異なるｄｓＲＮＡは、本発明によって意図される。さらに、所望のＧＮＡＱ標的配列内で切断するｄｓＲＮＡは、対応するＧＮＡＱアンチセンス配列および相補的センス配列を使用して、容易に作製することができる。
さらに、表２〜４に提供されるｄｓＲＮＡは、ＲＮＡｉベースの切断に影響されやすいＧＮＡＱ中の部位を同定する。そのため、本発明は、本発明の薬剤のうちの１つによって標的とされる配列内を標的とするｄｓＲＮＡでさらに特徴付けられる。本明細書で使用する第２のｄｓＲＮＡは、該第２のｄｓＲＮＡが第１のｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖に相補的であるｍＲＮＡ内のどこかのメッセージを切断する場合、該第１のｄｓＲＮＡの配列内を標的とすると考えられている。かかる第２のｄｓＲＮＡは、一般的に、ＧＮＡＱ遺伝子中の選択された配列に連続する領域から得られた追加ヌクレオチド配列と結合した表２〜４に提供される配列のうちの１つ由来の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドからなるであろう。
本発明の追加ｄｓＲＮＡは、いずれかの表に記載されるｄｓＲＮＡと同じ位置の標的ｍＲＮＡを切断するものを含む。一般的に、ＲＩＳＣ複合体は、本発明のｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖のヌクレオチド１０および１１に相補的であるヌクレオチド間の標的ｍＲＮＡを切断するであろう。切断ｅ部位は、例えば、５’ＲＡＣＥアッセイを使用してアッセイすることができる。
例えば、二本鎖ＡＤ−２００５７は、以下のセンスおよびアンチセンス鎖を含む。この二本鎖を用いる細胞の処置は、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０および１１に相補的であるヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド１２１１および１２１２でのヒトＧＮＡＱ ｍＲＮＡの切断をもたらす。従って、本発明は、その位置で切断するそれらのｄｓＲＮＡも含む。
本発明の特徴であるｄｓＲＮＡは、標的配列に対して１つ以上のミスマッチを含有することができる。一実施形態において、本発明の特徴であるｄｓＲＮＡは、ミスマッチを３個以下含有する。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対してミスマッチを含有する場合、ミスマッチ領域が相補性領域の中央に位置しないことが望ましい。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対してミスマッチを含有する場合、ミスマッチがいずれかの末端から５ヌクレオチド、例えば相補性領域の５’または３’末端のいずれかから５、４、３、２、または１ヌクレオチドに制限されることが望ましい。例えば、標的遺伝子の領域に相補的である２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖の場合、ｄｓＲＮＡは、一般的に、中央の１３ヌクレオチド内に１つもミスマッチを含有しない。本発明内に記載する方法は、標的配列に対するミスマッチを含有するｄｓＲＮＡが標的遺伝子の発現の阻害に効果的であるかどうかを決定するために使用することができる。標的遺伝子の発現阻害におけるミスマッチを有するｄｓＲＮＡの有効性の検討は、特に、標的遺伝子の相補性の特定領域が集団内の多形配列変動を有することが知られている場合に、重要である。
修飾
さらに別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、安定性を増強するために化学的に修飾される。本発明の特徴である核酸を、“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ（出典明示によって本明細書において組み込まれる）に記載されるもの等の、当該技術の分野で規定された方法によって合成および／または修飾してもよい。本発明において有用なｄｓＲＮＡ化合物の具体例は、修飾バックボーンを含有するか、または天然ヌクレオシド間結合（internucleoside linkage）を１つも含有しないｄｓＲＮＡを含む。本明細書に定義されるように、修飾バックボーンを有するｄｓＲＮＡは、バックボーン中にリン原子を保持するもの、およびバックボーン中にリン原子を有さないものを含む。本明細書の目的として、および当該技術の分野において時折参照されるように、ヌクレオシド間のバックボーンにリン原子を有さない修飾ｄｓＲＮＡは、オリゴヌクレオシドであるとも考えられ得る。
修飾ｄｓＲＮＡバックボーンは、例えば、ノーマルな３’−５’結合を有する、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィナート、３’−アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートを含むホスホルアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェート、これらの２’−５’結合した類似体、およびヌクレオシドユニットの隣接したペアが３’−５’と５’−３’または２’−５’と５’−２’で結合した逆転した極性を有するものを包含する。様々な塩、混合した塩、および遊離酸の形態もまた、含まれる。
上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許番号第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９５号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３１６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、および第５，６２５，０５０号を含むがこれらに限定されず、それぞれが本明細書において出典明示によって組み込まれる。
リン原子を含まない修飾ｄｓＲＮＡバックボーンは、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合したヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成されるバックボーンを有する。これらは、モルホリノ結合（一部において、ヌクレオシドの糖部分から形成される）を有するもの、シロキサンバックボーン、スルフィド、スルホキシドおよびスルホンバックボーン、ホルムアセチル（ｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）およびチオホルムアセチルバックボーン、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン、アルケンを含有するバックボーン、スルファマートバックボーン、メチレンイミノ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｏ）およびメチレンヒドラジノ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｈｙｄｒａｚｉｎｏ）バックボーン、スルホネートおよびスルホンアミドバックボーン、アミドバックボーン、ならびに混合したＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成成分部分を有するその他のものを含む。
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許番号第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、および第５，６７７，４３９号を含むがこれらに限定されない、本明細書に出典明示によって組み込まれる。
他の適したｄｓＲＮＡ模倣物において、ヌクレオチドユニットの糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、バックボーンは、新規な基で置換される。塩基ユニットは、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１のかかるオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション性質を有することが示されたｄｓＲＮＡ模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、ｄｓＲＮＡの糖バックボーンは、アミドを含有するバックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンで置換される。核酸塩基は、保持され、バックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許番号第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号を含むがこれらに限定されず、本明細書において出典明示によって組み込まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に見出すことができる。
本発明の他の実施形態は、ホスホロチオエートバックボーンを有するｄｓＲＮＡおよびヘテロ原子バックボーンを有するオリゴヌクレオシドであり、特に上記に参照した米国特許番号第５，４８９，６７７号の−−ＣＨ２−−ＮＨ−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩバックボーンとして知られる］、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、および−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−［天然リン酸ジエステルバックボーンは、−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２−−として表す］、ならびに上記に参照した米国特許番号第５，６０２，２４０号のアミドバックボーンである。また、上記に参照した米国特許番号第５，０３４，５０６号のモルホリノバックボーン構造を有するｄｓＲＮＡが好ましい。
修飾ｄｓＲＮＡは、１つ以上の置換した糖部分を含有することもできる。好ましいｄｓＲＮＡは、２’位置に、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルの１つを含み、ここに、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい。ｎおよびｍが１〜約１０であるＯ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が特に好ましい。他の好ましいｄｓＲＮＡは、２’位置に、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル（alkaryl）、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入基（intercalator）、ｄｓＲＮＡの薬物動態性質を改善するための基、またはｄｓＲＮＡの薬力学的性質を改善するための基、および同様の性質を有する他の置換基の１つを含む。好ましい修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）、すなわち、アルコキシ−アルコキシ基を含む。さらに好ましい修飾は、本明細書の下記の実施例において記載されるように、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および本明細書の下記の実施例において記載されるように、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても当該技術分野で知られる）、すなわち、２’−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ２）２を含む。
他の好ましい修飾は、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様の修飾は、ｄｓＲＮＡ上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’の位置、または２’−５’結合したｄｓＲＮＡ中、および５’末端ヌクレオチドの５’位置にも作製され得る。ｄｓＲＮＡは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分等の糖模倣物を有することもできる。かかる修飾した糖構造の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許番号第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、および第５，７００，９２０号を含むがこれらに限定されず、そのうちいくつかは本出願と共有の所有者であり、それぞれが本明細書において全てが出典明示によって組み込まれる。
ｄｓＲＮＡは、核酸塩基（単に「塩基」として当該技術の分野で多くの場合は称される）の修飾または置換を含むこともできる。本明細書で使用する「未修飾」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾した核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換したアデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換したウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン等の他の合成および天然核酸塩基を含む。さらなる核酸塩基は、米国特許番号第３，６８７，８０８号に開示されたもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されたもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示されたもの、Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されたものを含む。これらの核酸塩基のうち特定のものは、本発明の特徴であるオリゴマー化合物の結合親和性を増加するために特に有用である。これらは、５−置換したピリミジン、６−アザピリミジンならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６および、０−６置換したプリンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖安定性を０．６〜１．２℃増加することが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、さらに特に２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合に、代表的な塩基置換である。
特定の上記の修飾した核酸塩基ならびに他の修飾した核酸塩基の調製を教示する代表的な米国特許は、上記の米国特許番号第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許番号第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、および第５，６８１，９４１号を含むがこれらに限定されず、それぞれが出典明示によって本明細書に組み込まれ、米国特許番号第５，７５０，６９２号も本明細書に出典明示によって組み込まれる。
コンジュゲート（conjugate）
本発明の特徴であるｄｓＲＮＡの別の修飾は、ｄｓＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強する１つ以上の部分またはコンジュゲートとｄｓＲＮＡとを化学的に結合することを含む。かかる部分は、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４：１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ベリル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６−３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール（ｄｏｄｅｃａｎｄｉｏｌ）またはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯ Ｊ，１９９１，１０：１１１１−１１１８、Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７−３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４、Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７−３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３−９３７）等の脂質部分を含むがこれらに限定されない。
かかるｄｓＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許番号第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号、第５，５９１，５８４号、第５，１０９，１２４号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，４１４，０７７号、第５，４８６，６０３号、第５，５１２，４３９号、第５，５７８，７１８号、第５，６０８，０４６号、第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８３５，２６３号、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、第５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号、第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号、および第５，６８８，９４１号を含むがこれらに限定されず、それぞれが出典明示によって本明細書に組み込まれる。
所定の化合物中の全位置が均一に修飾される必要はなく、実際には前述の修飾のうちの１つ以上は、単一化合物またはｄｓＲＮＡ内の単一ヌクレオシドにおいても、組み込まれ得る。本発明は、キメラ化合物であるｄｓＲＮＡ化合物も含む。本発明との関係において、「キメラの」ｄｓＲＮＡ化合物または「キメラ」は、少なくとも１つの単量体ユニット（すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合、ヌクレオチド）でそれぞれ構成される２つ以上の化学的に別個の領域を含有するｄｓＲＮＡ化合物、特にｄｓＲＮＡである。これらのｄｓＲＮＡは、典型的に、ヌクレアーゼ分解に対する増加した耐性、増加した細胞の取り込み、および／または標的核酸に対する増加した結合親和性をｄｓＲＮＡに与えるようにｄｓＲＮＡが修飾された少なくとも１つの領域を含有する。ｄｓＲＮＡの追加領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質として役立つことができる。一例として、ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。ＲＮａｓｅ Ｈの活性化は、従って、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより、遺伝子発現のｄｓＲＮＡ阻害の効率を大いに増強させる。したがって、キメラｄｓＲＮＡが使用される際に、同じ標的領域とハイブリッド形成するホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、より短いｄｓＲＮＡを用いて、しばしば同様の結果を得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、および必要に応じて、当該技術の分野で知られる関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって、慣用的に検出することができる。
場合によっては、ｄｓＲＮＡは、非リガンド基によって修飾され得る。多くの非リガンド分子が、ｄｓＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強するために、ｄｓＲＮＡとコンジュゲートされており、かかるコンジュゲーション（conjugation）を実施するための手順は、科学文献において入手できる。かかる非リガンド部分は、コレステロール（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６、Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１、Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１、Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）等の脂質部分を含む。かかるｄｓＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、上述されている。典型的なコンジュゲーションプロトコールは、配列の１つ以上の位置にアミノリンカーを有するｄｓＲＮＡの合成を含む。該アミノ基は、その後、適切なカップリング試薬または活性化試薬を使用してコンジュゲートされている分子と反応する。コンジュゲーション反応は、固形支持体とまだ結合しているｄｓＲＮＡを用いて、または溶液相におけるｄｓＲＮＡの切断後に実施され得る。典型的に、ＨＰＬＣによるｄｓＲＮＡコンジュゲートの精製によって、純粋なコンジュゲートを得る。
ベクターでコード化されたｄｓＲＮＡ
別の態様において、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写ユニットから発現される（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａら、ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．ら、国際公開番号ＷＯ／２０００／２２１１３号、Ｃｏｎｒａｄ、国際公開番号ＷＯ／２０００／２２１１４号、およびＣｏｎｒａｄ、米国特許番号第６，０５４，２９９号を参照）。これらの導入遺伝子は、宿主ゲノム中に組み込まれる導入遺伝子として、組み込まれ、遺伝することができる線形コンストラクト、環状プラスミド、またはウイルス性ベクターとして導入されることができる。導入遺伝子は、染色体外のプラスミドとして遺伝することを可能にするためにも構築することができる（Ｇａｓｓｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
ｄｓＲＮＡの個々の鎖は、２つの異なる発現ベクター上のプロモーターによって転写され、標的細胞へ同時導入されることができる。あるいは、ｄｓＲＮＡのそれぞれの個々の鎖は、両方が同じ発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写されることができる。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが基部およびループ構造を有するように、リンカーのポリヌクレオチド配列によって連結される逆方向の反復として発現される。
組換えｄｓＲＮＡ発現ベクターは、一般的に、ＤＮＡプラスミドまたはウイルス性のベクターである。ｄｓＲＮＡ発現性ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（レビューについては、ＭｕｚｙｃｚｋａらＣｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９）を参照）、アデノウイルス（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８）６：６１６）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：４３１−４３４）、およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２），Ｃｅｌｌ６８：１４３−１５５）を参照）、またはアルファウイルス、ならびに当該技術の分野で知られる他のものに限定されないが、これらを基に構成されることができる。レトロウイルスは、インビトロおよび／またはインビボで、上皮細胞を含む多くの異なる細胞の種類に様々な遺伝子を導入するために使用されている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１３９５−１３９８、Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）８５：６４６０−６４６４、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：３０１４−３０１８、Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：６１４１６１４５、Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８０３９−８０４３、Ｆｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８３７７−８３８１、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１８０２−１８０５、ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７６４０−１９、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７、Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０８９２−１０８９５、Ｈｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５、米国特許番号第４，８６８，１１６号、米国特許番号第４，９８０，２８６号、ＰＣＴ出願ＷＯ／１９８９／０７１３６号、ＰＣＴ出願ＷＯ／１９８９／０２４６８号、ＰＣＴ出願ＷＯ／１９８９／０５３４５号、およびＰＣＴ出願ＷＯ／１９９２／０７５７３号を参照）。細胞のゲノムに挿入された遺伝子を伝達し発現することができる組換えレトロウイルス性ベクターは、組換えレトロウイルス性ゲノムをＰＡ３１７およびＰｓｉ−ＣＲＩＰ等の適したパッケージング細胞株に形質移入することによって産生されることができる（Ｃｏｍｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：５−１０、Ｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６３４９）。組換えアデノウイルス性のベクターは、感受性宿主（例えば、ラット、ハムスター、イヌ、チンパンジー）の幅広い種類の細胞および組織を感染させるために使用することができ（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，１６６：７６９）、感染のために有糸***的に活発な細胞を必要としない強みも有する。
発現されるべきｄｓＲＮＡ分子のためのコード配列を許容可能な任意のウイルス性のベクター、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）、ヘルペスウイルス等に由来するベクターを使用することができる。ウイルス性ベクターの親和性は、外被タンパク質もしくは他のウイルス由来の他の表面抗原でベクターをシュードタイピングすることによって、または異なるウイルス性のカプシドタンパク質を置換することによって、適宜、修飾することができる。
例えば、本発明の特徴であるレンチウイルス性のベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラ等由来の表面タンパク質でシュードタイピングされることができる。本発明の特徴であるＡＡＶベクターは、異なるカプシドタンパク質血清型を発現するようにベクターを操作することによって、異なる細胞を標的とさせることができる。例えば、血清型２のゲノム上に血清型２のカプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と称される。ＡＡＶ２／２ベクター中のこの血清型２のカプシド遺伝子は、ＡＡＶ２／５ベクターを産生するように、血清型５のカプシド遺伝子と置換されることができる。異なるカプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構成するための技術は、当該技術の分野の範囲内であり、例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１−８０１を参照されたく、全ての開示は本明細書において出典明示によって組み込まれる。
本発明での使用に適した組換えウイルス性ベクターの選択、ｄｓＲＮＡを発現するための核酸配列をベクターに挿入する方法、および対象の細胞へウイルス性ベクターを送達する方法は、当該技術の分野の範囲内である。例えば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ Ｒ（１９９５），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１−３１０、Ｅｇｌｉｔｉｓ Ｍ Ａ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８−６１４、Ｍｉｌｌｅｒ Ａ Ｄ（１９９０），Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．１：５−１４、Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｗ Ｆ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２５−３０、およびＲｕｂｉｎｓｏｎ Ｄ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１−４０６を参照されたく、これらの全ての開示は、出典明示によって本明細書に組み込まれる。
ウイルス性ベクターは、ＡＶおよびＡＡＶに由来することができる。一実施形態において、本発明の特徴であるｄｓＲＮＡは、例えば、Ｕ６もしくはＨ１ ＲＮＡプロモーターまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを有する組換えＡＡＶベクターから２つの異なる相補性の単鎖ＲＮＡ分子として発現される。
本発明の特徴であるｄｓＲＮＡを発現するために適したＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構成するための方法、および標的細胞へベクターを送達する方法は、Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載される。
本発明の特徴であるｄｓＲＮＡを発現するために適したＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構成するための方法、および標的細胞へベクターを送達するための方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１、Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０−５３２、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６、米国特許番号第５，２５２，４７９号、米国特許番号第５，１３９，９４１号、国際特許出願ＷＯ／１９９４／１３７８８号、および国際特許出願ＷＯ／１９９３／２４６４１号に記載され、これらの全ての開示は、本明細書に出典明示によって組み込まれる。
本発明の特徴であるＤＮＡプラスミドまたはウイルス性ベクターのいずれかにおいてｄｓＲＮＡ発現を駆動するプロモーターは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（例えば、リボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶ初期プロモーターまたはアクチンプロモーターまたはＵ１ ｓｎＲＮＡプロモーター）または一般的にＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６ ｓｎＲＮＡまたは７ＳＫ ＲＮＡプロモーター）または原核生物プロモーター、例えば、Ｔ７プロモーターであってもよいが、但し、発現プラスミドは、Ｔ７プロモーターからの転写に必要なＴ７ＲＮＡポリメラーゼもコード化する。プロモーターは、膵臓へ導入遺伝子発現を指示することもできる（例えば、膵臓のインスリン制御配列（Ｂｕｃｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：２５１１−２５１５）を参照）。
さらに、導入遺伝子の発現は、例えば、誘導性制御配列、および特定の生理学的制御因子、例えば、循環性グルコースレベルまたはホルモンに感受性がある制御配列等の発現系を使用することによって、正確に制御することができる（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：２０−２４）。細胞または哺乳類における導入遺伝子発現の制御に適した、かかる誘導性発現系は、エクジソンによる、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体形成の化学誘導物質、およびイソプロピル−ベータ−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）による制御を含む。当業者は、ｄｓＲＮＡ導入遺伝子の使用目的に基づいて、適切な制御／プロモーター配列を選択することができるであろう。
一般的に、ｄｓＲＮＡ分子を発現することができる組換えベクターは、以下に記載する通り送達され、標的細胞において持続する。あるいは、ウイルス性ベクターは、ｄｓＲＮＡ分子の一過性発現を得るために使用されることができる。かかるベクターは、必要に応じて繰り返し投与されることができる。ｄｓＲＮＡは、一度発現すると、標的ＲＮＡに結合し、その機能または発現を調節する。ｄｓＲＮＡ発現性ベクターの送達は、静脈内または筋肉内投与によって、患者から外植された標的細胞への投与に続く患者への再導入によって、または所望の標的細胞への導入を可能にする他の方法によって等、全身性であることができる。
ｄｓＲＮＡ発現ＤＮＡプラスミドは、典型的に、陽イオン性脂質の担体（例えば、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）または非陽イオン性脂質ベースの担体（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））を含む複合体として、標的細胞へ形質移入される。１週間以上の期間にわたる、単一標的遺伝子または複数の標的遺伝子の異なる領域を標的とするｄｓＲＮＡ媒介ノックダウンのための複数の脂質形質移入も、本発明によって意図される。宿主細胞へのベクターの導入の成功は、様々な既知の方法を使用して監視され得る。例えば、一過性形質移入は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光マーカー等のレポーターを用いてシグナル化されることができる。エクスビボでの細胞の安定した形質移入は、ハイグロマイシンＢ耐性等の特定の環境因子（例えば、抗生物質および薬物）に対する耐性を形質移入細胞に提供するマーカーを使用して、確実にすることができる。
標的遺伝子特異的ｄｓＲＮＡ分子は、ベクターに挿入することもでき、ヒト患者の遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注入、局部投与（米国特許番号第５，３２８，４７０号を参照）によって、または定位注入によって、対象に送達されることができる（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７を参照）。遺伝子治療ベクターの薬剤は、許容可能な希釈液中の遺伝子治療ベクターを含むことができるか、または遺伝子送達媒体が包埋される持続放出マトリックスを含むことができる。あるいは、完全遺伝子送達ベクターが、組換え細胞、例えば、レトロウイルス性ベクターから無傷で産生されることができる場合、該薬剤は、遺伝子送達システムを産生する１つ以上の細胞を含むことができる。
ｄｓＲＮＡを含有する医薬組成物
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載するｄｓＲＮＡおよび医薬的に許容可能な担体を含有する医薬組成物を提供する。ｄｓＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＧＮＡＱ遺伝子の発現または活性に関連する疾病または疾患、例えば、ＧＮＡＱ発現によって媒介される病的過程等を処置するために有用である。かかる医薬組成物は、送達様式に基づいて製剤化される。一例は、非経口送達、例えば、静脈内（ＩＶ）送達を介する全身投与のために製剤化される組成物である。別の例は、例えば、継続的なポンプ注入等の脳への注入によって、脳実質への直接送達のために製剤化される組成物である。
本明細書の特徴である医薬組成物は、ＧＮＡＱ遺伝子の発現を阻害するために十分な投与量で投与される。一般的に、ｄｓＲＮＡの適した投与量は、１日に、レシピエントの体重の１キログラムにつき０．０１〜２００．０ミリグラムのｓｉＲＮＡの範囲、一般的に、１日に体重の１キログラムにつき１〜５０ｍｇの範囲であるであろう。例えば、ｄｓＲＮＡは、１回の投与につき、０．００５９ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２９５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０５９０ｍｇ／ｋｇ、０．１６３ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５４３ｍｇ／ｋｇ、０．５９００ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６２８ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇを投与され得る。
一実施形態において、投与量は、０．０１〜０．２ｍｇ／ｋｇである。例えば、ｄｓＲＮＡは、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．１１ｍｇ／ｋｇ、０．１２ｍｇ／ｋｇ、０．１３ｍｇ／ｋｇ、０．１４ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．１６ｍｇ／ｋｇ、０．１７ｍｇ／ｋｇ、０．１８ｍｇ／ｋｇ、０．１９ｍｇ／ｋｇ、または０．２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。
一実施形態において、投与量は０．００５ｍｇ／ｋｇ〜１．６２８ｍｇ／ｋｇである。例えば、ｄｓＲＮＡは、０．００５９ｍｇ／ｋｇ、０．０２９５ｍｇ／ｋｇ、０．０５９０ｍｇ／ｋｇ、０．１６３ｍｇ／ｋｇ、０．５４３ｍｇ／ｋｇ、０．５９００ｍｇ／ｋｇ、または１．６２８ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。
一実施形態において、投与量は０．２ｍｇ／ｋｇ〜１．５ｍｇ／ｋｇである。例えば、ｄｓＲＮＡは、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、または１．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。
ｄｓＲＮＡは、０．０３ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。
医薬組成物は、１日１回投与され得るか、またはｄｓＲＮＡは、１日を通して適切な間隔で２、３回以上のサブ用量またはさらに徐放製剤を通して継続的な注入または送達を使用して投与され得る。その場合、各サブ用量に含有されるｄｓＲＮＡは、１日の合計投与量を達成するために、それ相応に少量でなければならない。投与単位は、数日間かけて送達するために、例えば、数日間かけてのｄｓＲＮＡの徐放を提供する従来の徐放製剤を使用して、配合され得る。徐放製剤は、当該技術の分野においてよく知られており、特定の部位における薬剤の送達に特に有用であり、例えば、本発明の薬剤と共に使用できる。この実施形態において、投与単位は、対応する多様な１日量を含有する。
ＧＮＡＱレベルに対する単回投与の効果は長続きし、その結果、その後の投与量は、３、４、もしくは５日以下の間隔、または１、２、３、もしくは４週間以下の間隔、または５、６、７、８、９、もしくは１０週間以下の間隔で投与される。
当業者は、疾病または疾患の重症度、以前の治療、総合的な健康状態および／または対象の年齢、存在する他の疾病を含むがこれらに限定されない特定の要因が、対象を効果的に処置するために必要な投与量およびタイミングに影響する可能性があることを理解するであろう。さらに、組成物の治療有効量を用いた対象の治療は、単一治療または一連の治療を含むことができる。本発明によって包含される個々のｄｓＲＮＡに対する効果的な投与量およびインビボ半減期の推定は、従来の方法論を使用して、または本明細書の他の部分に記載する適切な動物モデルを使用してインビボ試験に基づいて見積もることができる。
マウス遺伝学の進歩は、ＧＮＡＱ発現によって媒介される病的過程等、様々なヒト疾病の研究に対して多くのマウスモデルを生成した。かかるモデルは、ｄｓＲＮＡのインビボ試験に、ならびに治療効果のある用量を決定するために使用される。適したマウスモデルは、例えば、ヒトＧＮＡＱを発現するプラスミドを含有するマウスである。別の適したマウスモデルは、ヒトＧＮＡＱを発現する導入遺伝子を保有する遺伝子導入マウスである。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータは、ヒト用に投与量の範囲を処方するために使用され得る。本発明の特徴である組成物の投与量は、一般的に、毒性がほとんどないか、全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される投薬形態および利用される投与の経路次第でこの範囲内で変動することができる。本発明の特徴である方法で使用される任意の化合物に関して、治療効果のある用量は、細胞培養アッセイから最初に推定され得る。用量は、化合物、または必要に応じて、細胞培養で測定されるＩＣ５０（すなわち、症状の半数の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む標的配列（例えば、ポリペプチドの減少した濃度を達成する）のポリペプチド産物の循環性血漿濃度の範囲を達成するために、動物モデルにおいて処方されうる。かかる情報は、ヒトにおける有用な用量をより正しく決定するために使用され得る。血漿のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
本発明の特徴であるｄｓＲＮＡは、標的遺伝子発現によって媒介される病的過程の治療に効果的な他の既知の薬剤と併せて投与され得る。いずれにしても、投与する医師は、当該技術に知られているまたは本明細書に記載する有効性の標準的な方法を使用して認められた結果を基に、ｄｓＲＮＡ投与の量および時期を調整することができる。
投与
また、本発明は、本発明の特徴であるｄｓＲＮＡ化合物を含む医薬組成物および製剤を含む。本発明の医薬組成物は、局所または全身性治療が所望されるか、および処置されるべき領域に依存して、多数の手段で投与することができる。投与は局所性、例えば噴霧器によるものを包含する粉末またはエアロゾルの吸入または吹送法によって、肺性、気管内、鼻腔内、上皮性および経皮性、経口、または非経口であってもよい。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射あるいは注入；または頭蓋内、例えば、実質内、くも膜下腔内または脳室内投与を含む。
ｄｓＲＮＡは、肝臓（例えば、肝臓の肝細胞）等の特定の組織を標的とする方法で、送達されることができる。
本発明は、脳への直接的な注射によって送達することができる医薬組成物を含む。その注射は、脳の特定の領域（例えば、黒質、皮質、海馬、線条体、または淡蒼球）への定位的注射により得るか、またはそのｄｓＲＮＡを、中枢神経系の複数の領域（例えば、脳の複数の領域および／または脊髄へと）へと送達し得る。また、そのｄｓＲＮＡを、脳の拡散領域（例えば、脳の皮質への拡散送達）へと送達することもできる。
一実施形態において、ＧＮＡＱを標的とするｄｓＲＮＡを、組織、例えば、脳、例えば、脳の黒質、皮質、海馬、線条体、脳梁または淡蒼球に移植される１つの末端を有するカニューレまたは他の送達デバイスの手段によって送達することができる。そのカニューレは、そのｄｓＲＮＡ組成物の貯蔵部に結合することができる。その流動または送達を、ポンプ、例えば、Ａｌｚｅｔポンプ（Ｄｕｒｅｃｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）等の浸透圧ポンプまたはミニポンプによって媒介することができる。一実施形態において、ポンプおよび貯蔵部は、組織の遠位にある領域、例えば、腹部中に移植され、送達は、ポンプまたは貯蔵部から放出の部位へと導く導管によって達成される。ｄｓＲＮＡ組成物の脳への注入は、数時間または数日、例えば、１、２、３、５、または７日もしくはそれ以上を越え得る。脳への送達のためのデバイスは、例えば、米国特許番号第６，０９３，１８０号および第５，８１４，０１４号に説明される。
局所投与のための医薬組成物および製剤は、経皮性パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム、ゲル、液滴、坐薬、噴霧剤、液体、および粉末を含み得る。従来の医薬担体、水性、粉末、または油性基剤、増粘剤等が必要もしくは所望され得る。また、被覆コンドーム、グローブ等も有用であり得る。適した局所製剤は、本発明の特徴であるｄｓＲＮＡが脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤、および界面活性剤等の局所送達薬剤との混合物であるものを含む。適した脂質およびリポソームは、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）、および陽イオン（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）を含む。本発明の特徴であるｄｓＲＮＡは、リポソーム中に被包され得るか、またはそれら、特に陽イオンリポソームとの複合体を形成し得る。あるいは、ｄｓＲＮＡは、脂質、特に陽イオン脂質と複合体を形成し得る。適した脂肪酸およびエステルは、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１−１０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、または医薬的に許容されるその塩を含むが、それらに限定されない。局所製剤は、出典明示により本明細書に組み込まれる米国特許番号第６，７４７，０１４号に詳細が記載される。
リポソーム製剤
薬物の製剤化のために研究され、使用されたマイクロエマルションと並んで、多くの組織化界面活性剤構造が存在する。これらは、単分子層、ミセル、二重層、および小胞を含む。リポソーム等の小胞は、薬物送達の立場から、それらの特異性およびそれらが提供する作用の持続時間のために、大きな関心を誘引した。本発明で使用されるように、「リポソーム」という用語は、球形二重層（複数も可）に配置された両親媒性脂質を含む小胞を意味する。
リポソームは、親油性物質から形成された膜および水性の内部を有する単層または多層状小胞である。その水性部分は、送達されるべき組成物を含有する。陽イオンリポソームは、細胞壁に融合することが可能であるという利点を所有する。非陽イオンリポソームは、細胞壁と効率的に融合することはできないが、インビボでマクロファージによって取り込まれる。
無傷の哺乳類の皮膚を通過するため、脂質小胞は、適した経皮性勾配の影響下で、一連の細孔（それぞれが５０ｎｍ未満の直径を有する）を通過しなければならない。従って、非常に変形可能であり、かかる細孔を通過可能であるリポソームを使用することが所望される。
リポソームのさらなる利点は、天然リン脂質から得られたリポソームが生体適合性および生分解性であること、リポソームが水および脂溶性薬物の広範囲を組み込み得ること、リポソームがその内部区画中の被包薬物を代謝および分解から保護することができることを含む（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な検討は、リポソームの脂質表面電荷、小胞の大きさ、および水性量である。
リポソームは、活性成分の作用部位への伝達および送達に有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似するため、リポソームが組織に適用される時、そのリポソームは細胞膜と同化し始め、リポソームの同化および細胞進行と共に、そのリポソーム内容物が細胞中に移され、そこで活性剤が作用し得る。
リポソーム製剤は、多くの薬物の送達の様式として、広範な調査の焦点となっている。局所投与のために、リポソームが他の製剤を超えるいくつかの利点を提示するという証拠が増えてきている。かかる利点は、投与された薬物の高い全身性吸収に関係する副作用の低下、投与された薬物の所望の標的での増加した蓄積、および親水性および疎水性の双方の幅広い種類の薬物の皮膚への投与能力を含む。
いくつかの報告は、高分子量ＤＮＡを含む薬剤を皮膚へと送達するためのリポソームの能力を詳述する。鎮痛剤、抗体、ホルモン、および高分子量ＤＮＡを含む化合物を、皮膚に投与した。その適用の多くは、表皮上層の標的化をもたらした。
リポソームは、２つの広範なクラスに分類される。陽イオンリポソームは、安定複合体を形成するために、負に帯電しているＤＮＡ分子と相互作用する陽に帯電しているリポソームである。その陽に帯電しているＤＮＡ／リポソーム複合体は、負に帯電している細胞表面に結合し、エンドソーム中に内部移行される。エンドソーム中の酸性ｐＨのため、そのリポソームは破裂され、それらの内容物を細胞質中に放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。
ｐＨ感受性または負に帯電しているリポソームは、ＤＮＡと複合体化するより、むしろＤＮＡを封入する（entrap）。そのＤＮＡおよび脂質の双方は同様に帯電されるため、複合体形成よりも、むしろ反発が発生する。にもかかわらず、いくつかのＤＮＡは、これらのリポソームの水性の内部中に封入される。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコード化するＤＮＡを、培養物中の細胞単分子層に送達するために使用される。外因性遺伝子の発現を標的細胞中に検出した（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９−２７４）。
リポソーム組成物の一つの主要なタイプは、天然由来ホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。陰イオン性リポソーム組成物は、一般的に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、陰イオン性融合性リポソームは、主に、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。リポソーム組成物の別のタイプは、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば、ダイズＰＣおよびタマゴＰＣ等から形成される。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
いくつかの研究は、リポソーム薬物製剤の皮膚への局所送達を評価した。インターフェロンを含有するリポソームのモルモット皮膚への適用は、皮膚ヘルペス口内炎の低下をもたらしたが、他の手段を介したインターフェロンが送達（例えば、溶液またはエマルションとして）は効果的ではなかった（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，２，４０５−４１０）。さらに、追加の研究は、水性系が使用されるインターフェロンの投与に対し、リポソーム製剤の一部として投与されるインターフェロンの有効性を試験し、リポソーム製剤が水性投与よりも優れていたと結論を出した（ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，１８，２５９−２６５）。
また、非イオン性リポソーム系は、非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む特定の系中で、薬物の皮膚への送達におけるそれらの有用性を決定するために検討された。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（グリセリルジラトレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を、シクロスポリンＡをマウス皮膚の真皮に送達するために使用した。結果は、かかる非イオン性リポソーム系が、シクロスポリンＡの皮膚の異なる層への沈着を促進することに効果的であることを示した（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。
また、リポソームは、「立体的に安定した」リポソームを含み、本明細書で使用する用語は、１以上の特定の脂質がリポソームに組み込まれる時、かかる特定の脂質を欠乏するリポソームと比較して、増強された循環生存期間をもたらす１以上の特定の脂質を含むリポソームを指す。立体的に安定したリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１等の１つ以上の糖脂質を含むか、あるいは（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分等の１つ以上の親水性ポリマーで誘導体化するものである。いずれの特定の理論にも縛られることを望むわけではないが、当技術分野において、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的に安定したリポソームに対して、これらの立体的に安定したリポソームの増強された循環半減期は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞への低下した取り込みに由来すると考えられる（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
１つ以上の糖脂質を含む様々なリポソームは、当技術分野において知られている。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、リポソームの血液半減期を改善する、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシド硫酸、およびホスファチジルイノシトールの能力を報告した。これらの所見は、Ｇａｂｉｚｏｎらによって解説された（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）。米国特許番号第４，８３７，０２８号および国際公開番号ＷＯ／１９８８／０４９２４号（双方ともＡｌｌｅｎらの特許権）は、（１）スフィンゴミエリンおよび（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示する。米国特許番号第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開番号ＷＯ／１９９７／１３４９９号（Ｌｉｍら）に開示される。
１つ以上の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多くのリポソームおよびその調製の方法は、当技術分野において知られている。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３，２７７８）は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン性界面活性剤２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームを記載した。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９８４，１６７，７９）は、重合体グリコールを用いたポリスチレン粒子の親水性コーティングが、有意に増強された血液半減期をもたらすことを記した。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボキシル基の結合によって修飾される合成リン脂質は、Ｓｅａｒｓ（米国特許番号第４，４２６，３３０号および４，５３４，８９９号）によって説明される。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２６８，２３５）は、ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＥＧで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが、血液循環半減期の有意な増加を有することを証明する実験を説明した。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１）は、かかる観察を、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）およびＰＥＧの組み合わせから形成された他のＰＥＧ誘導体化リン脂質、例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧにまで拡張した。外面に共有結合したＰＥＧ部分を有するリポソームは、欧州特許第０ ４４５ １３１ Ｂ１号および国際公開番号ＷＯ／１９９０／０４３８４号（Ｆｉｓｈｅｒの特許権）に説明される。ＰＥＧで誘導体化されたＰＥを１〜２０モルパーセント含有するリポソーム組成物およびその使用の方法は、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許番号第５，０１３，５５６号および５，３５６，６３３号）およびＭａｒｔｉｎら（米国特許番号第５，２１３，８０４号および欧州特許第０ ４９６ ８１３ Ｂ１号）によって説明される。多数の他の脂質−ポリマーコンジュゲートを含むリポソームは、国際公開番号ＷＯ／１９９１／０５５４５号および米国特許番号第５，２２５，２１２号（双方共Ｍａｒｔｉｎらの特許権）および国際公開番号ＷＯ／１９９４／２００７３号（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に開示される。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームは、国際公開番号ＷＯ／１９９６／１０３９１号（Ｃｈｏｉら）に説明される。米国特許番号第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉら）および米国特許番号第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａら）は、その表面上で、機能的部分でさらに誘導体化されることのできるＰＥＧを含有するリポソームを説明する。
核酸を含む多数のリポソームは、当技術分野において知られている。Ｔｈｉｅｒｒｙらの国際公開番号ＷＯ／１９９６／４００６２号は、リポソーム中の高分子量核酸を被包するための方法を開示する。Ｔａｇａｗａらの米国特許番号第５，２６４，２２１号は、タンパク質結合リポソームを開示し、かかるリポソームの内容物がｄｓＲＮＡを含み得ることを主張する。Ｒａｈｍａｎらの米国特許番号第５，６６５，７１０号は、リポソーム中にオリゴデオキシヌクレオチドを被包するある特定の方法を説明する。Ｌｏｖｅらの国際公開番号ＷＯ／１９９７／０４７８７号は、ｒａｆ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含むリポソームを開示する。
さらにトランスフェルソームは、リポソームの別のタイプであり、薬物送達媒体の候補である非常に変形可能な脂質凝集物である。トランスフェルソームは、液滴よりも小さい孔を容易に透過することができるほど非常に変形可能である脂質液滴として説明され得る。トランスフェルソームは、それらが使用される環境に適応可能であり、例えば、それらは自己最適化し（皮膚中の孔の形状に適応性がある）、自己修復し、頻繁に、断片化することなく、それらの標的に達し、度々自己負荷する。トランスフェルソームを作製するために、表面エッジ活性化剤（通常、界面活性剤）を標準リポソーム組成物に添加することが可能である。トランスフェルソームは、血清アルブミンを皮膚へ送達するために使用されている。血清アルブミンのトランスフェルソーム媒介送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同程度の効果があることが示された。
界面活性剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）およびリポソーム等の製剤において、幅広い適用を見出す。天然および合成の双方である界面活性剤の多くの異なるタイプの性質を分類し、順位付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（また、「ヘッド」として知られる）の性質は、製剤中で使用される異なる界面活性剤のカテゴリー化のための最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧品における幅広い適用を見出し、広範囲のｐＨ値にわたり使用可能である。一般的に、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に依存して、２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤は、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステル、およびエトキシレート化エステル等の非イオン性エステルを含む。また、脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシレート化アルコール、およびエトキシレート化／プロポキシレート化遮断ポリマー等の非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルも、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最もポピュラーなメンバーである。
界面活性剤分子が水中に溶解または分散される時に陰性電荷を保有する場合、その界面活性剤は陰イオンとして分類される。陰イオン性界面活性剤は、石鹸等のカルボキシレート、乳酸アシル、アミノ酸のアシルアミド、硫酸アルキルおよびエトキシレート化硫酸アルキル等の硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネート等のスルホネート、イセチオ酸アシル、アシルタウレート（acyl taurate）およびスルホサクシネート、ならびにホスフェートを含む。陰イオン性界面活性剤クラスの最も重要なメンバーは、硫酸アルキルおよび石鹸である。
界面活性剤分子が水中に溶解または分散される時に陽性電荷を保有する場合、その界面活性剤は陽イオンとして分類される。陽イオン界面活性剤は、四級アンモニウム塩およびエトキシレート化アミンを含む。四級アンモニウム塩は、このクラスの最も使用されるメンバーである。
界面活性剤分子が陽性または陰性電荷のいずれかを保有する能力を有する場合、その界面活性剤は両性として分類される。両性界面活性剤は、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびホスファチドを含む。
薬物製品、製剤、およびエマルション中の界面活性剤の使用が概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
核酸脂質粒子
一実施形態において、本発明の特徴であるＧＮＡＱ ｄｓＲＮＡは、例えば、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰまたは他の核酸脂質粒子を形成するために、脂質処方中に完全に被包される。本明細書で使用する「ＳＮＡＬＰ」という用語は、ＳＰＬＰを含む安定した核酸−脂質粒子を指す。本明細書で使用する「ＳＰＬＰ」という用語は、脂質小胞中に被包されたプラスミドＤＮＡを含む核酸−脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、陽イオン脂質、非陽イオン脂質、および粒子の凝集を防止する脂質（例えば、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート）を典型的に含有する。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、静脈内（i.v.）注射後に拡張した循環生存期間を示し、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に分離した部位）に蓄積するので、全身性適用に対して非常に有用である。ＳＰＬＰは、ＰＣＴ公開ＷＯ／２０００／０３６８３号で示されるように、被包縮合剤−核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」を含む。本発明の粒子は、平均直径が典型的に約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、さらに典型的には約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍ〜約９０ｎｍであり、実質的に無毒性である。さらに、核酸は、本発明の核酸−脂質粒子中に存在する場合、水溶液中において、ヌクレアーゼでの分解に耐性がある。核酸−脂質粒子およびその調製方法は、例えば、米国特許番号第５，９７６，５６７号、５，９８１，５０１号、６，５３４，４８４号、６，５８６，４１０号、６，８１５，４３２号、および国際公開番号ＷＯ／１９９６／４０９６４号に開示される。
一実施形態において、脂質／薬物比（質量／質量比）（例えば、脂質／ｄｓＲＮＡ比）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、または約６：１〜約９：１の範囲であるだろう。いくつかの実施形態において、脂質／ｄｓＲＮＡ比は、約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、または１１：１であり得る。
陽イオン脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、または３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）またはその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチルアザンジイル）ジドデカン−２−オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、またはそれらの混合物であり得る。陽イオン脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０モル％〜約５０モル％または約４０モル％を構成し得る。
非陽イオン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはそれらの混合物を含むが、それらに限定されない陰イオン性脂質または中性脂質であり得る。非陽イオン脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５モル％〜約９０モル％、約１０モル％、またはコレステロールが含まれる場合、約５８モル％を構成し得る。
粒子の凝集を阻害するそのコンジュゲートした脂質は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、またはそれらの混合物を含むが、それらに限定されないＰＥＧ−脂質であり得る。ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）であり得る。ＰＥＧコンジュゲートの他の例は、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ（Ｎ−［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバミル］−１，２−ジミリスチルオキシルプロピル−３−アミン）、ｍＰＥＧ２０００−ＤＭＧ（ｍＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（２，０００の平均分子量を伴う）、およびＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（Ｒ−３−［（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル）］−１，２−ジミリスチルオキシルプロピル−３−アミン）を含む。粒子の凝集を防止するコンジュゲートした脂質は、粒子中に存在する総脂質の０モル％〜約２０モル％、または約１．０、１．１．、１．２、．１３、１．４、１．５、１．６，１．７、１．８、１．９、または２モル％であり得る。
いくつかの実施形態において、核酸−脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％〜約６０モル％、または約４８モル％で、コレステロールをさらに含む。
一実施形態において、化合物２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランを用いて、脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製することができる。２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランの合成は、２００８年１０月２３日に出願された米国仮出願第６１／１０７，９９８号で説明され、それは、出典明示により本明細書に組み込まれる。
例えば、脂質−ｓｉＲＮＡ粒子は、粒子サイズ６３．０±２０ｎｍおよびｓｉＲＮＡ／脂質比０．０２７で、４０％の２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン：１０％のＤＳＰＣ：４０％のコレステロール：１０％のＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（モルパーセント）を含むことができる。
さらに別の実施形態において、化合物１，１’−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチルアザンジイル）ジドデカン−２−オル（Ｔｅｃｈ Ｇ１）を用いて、脂質−ｓｉＲＮＡ粒子を調製することができる。例えば、ｄｓＲＮＡは、７：１（ｗｔ：ｗｔ）の総脂質／ｓｉＲＮＡ比で、５０：１０：３８．５：１．５のモル比で、Ｔｅｃｈ−Ｇ１、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、およびｍＰＥＧ２０００−ＤＭＧを含む脂質製剤中に製剤化することができる。
ＬＮＰ０１
一実施形態において、脂質様物質ＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ１４８７）（式１）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、およびＰＥＧ−セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社）を用いて、脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子（すなわち、ＬＮＰ０１粒子）を調製することができる。エタノール中のそれぞれの保存液を、以下のように調製することができる：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍＬ、コレステロール、２５ｍｇ／ｍＬ、ＰＥＧ−セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍＬ。次いで、ＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ−セラミドＣ１６保存液を、例えば、４２：４８：１０のモル比で組み合わせることができる。最終エタノール濃度が約３５〜４５％であり、最終酢酸ナトリウム濃度が約１００〜３００ｍＭになるように、その組み合わせた脂質溶液を水性ｓｉＲＮＡ（例えば、ナトリウム酢酸ｐＨ５中）と混合することができる。脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子は、典型的に、混合の際に自発的に形成する。所望の粒子サイズ分布に依存して、得られたナノ粒子混合物は、例えばＬｉｐｅｘ押出機（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ， Ｉｎｃ）等のサーモバレル押出機を使用して、ポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通して押し出すことができる。いくつかの場合において、押出ステップは省略することができる。エタノール除去および同時緩衝交換は、例えば、透析または接線方向流動ろ過により、達成することができる。緩衝液は、例えば、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４のリン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）と交換することができる。
Figure 2016063826
ＬＮＰ０１製剤は、例えば、国際出願公開ＷＯ／２００８／０４２９７３号で説明され、それは、出典明示により本明細書に組み込まれる。
追加の代表的な脂質−ｓｉＲＮＡ製剤は以下の通りである。
Figure 2016063826
Figure 2016063826
ＬＮＰ０９製剤およびＸＴＣを含む製剤は、例えば、２００９年９月３日に出願された米国仮出願第６１／２３９，６８６号に説明され、それは、出典明示によって本明細書に組み込まれる。
ＬＮＰ１１製剤およびＭＣ３を含む製剤は、例えば、２００９年９月２２日に出願された米国仮出願第６１／２４４，８３４号に説明され、それは、出典明示によって本明細書に組み込まれる。
ＬＮＰ１２製剤およびＴｅｃｈＧ１を含む製剤は、例えば、２００９年５月５日に出願された米国仮出願第６１／１７５，７７０号に説明され、それは、出典明示によって本明細書に組み込まれる。
標準または押出されない方法のいずれかによって調製される製剤は、同様の様式で特徴付けられる。例えば、製剤は、典型的に目視検査によって特徴付けられる。それらは、凝集物または沈降物を含まない白色の半透明溶液であるべきである。脂質−ナノ粒子の粒子サイズおよび粒子サイズ分布は、光散乱、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＳＡ）を使用して測定できる。粒子は、約２０〜３００ｎｍ、例えば、４０〜１００ｎｍの大きさであるべきである。粒子サイズ分布は、単峰形であるべきである。製剤中ならびに封入（entrapped）フラクション中の総ｓｉＲＮＡ濃度は、色素排除アッセイを使用して推定される。製剤化されたｓｉＲＮＡの試料は、製剤崩壊性界面活性剤、例えば、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の存在または不在下において、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）等のＲＮＡ結合色素と共にインキュベートできる。製剤中の総ｓｉＲＮＡは、検量線と比較して、界面活性剤を含有する試料からのシグナルによって決定することができる。封入フラクションは、「遊離」のｓｉＲＮＡ含有量（界面活性剤の不在下において、そのシグナルによって測定される）を、総ｓｉＲＮＡ含有量から減算することによって決定される。封入されたｓｉＲＮＡのパーセントは、典型的に＞８５％である。ＳＮＡＬＰ製剤の場合、粒子サイズは、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、および少なくとも１２０ｎｍである。その適した範囲は、典型的に少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、または少なくとも約８０ｎｍ〜少なくとも約９０ｎｍである。
経口投与のための組成物および製剤は、粉末または顆粒、微小粒子、ナノ微粒子、水または非水性培地中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サッシェ（sachet）、錠剤、またはミニ錠剤を含む。増粘剤、フレーバー剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、または結合剤が所望され得る。いくつかの実施形態において、経口製剤は、本発明の特徴であるｄｓＲＮＡが、浸透促進剤、界面活性剤、およびキレート剤の１つ以上と組み合わせて投与されるものである。適した界面活性剤は、脂肪酸および／またはそのエステルまたは塩、胆汁酸および／またはその塩を含む。適した胆汁酸／塩は、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ナトリウムタウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシデート、およびナトリウムグリコジヒドロフシデートを含む。適した脂肪酸は、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、もしくはその医薬的に許容される塩（例えば、ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、浸透促進剤の組み合わせが使用され、例えば、胆汁酸／塩との組み合わせで脂肪酸／塩が使用される。一の代表的な組み合わせは、ラウリン酸のナトリウム塩、カプリン、およびＵＤＣＡである。さらなる浸透促進剤は、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルを含む。本発明の特徴であるｄｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子を含む顆粒状で経口的に送達され得るか、またはミクロまたはナノ粒子を形成するために複合化され得る。ｄｓＲＮＡ複合体化剤は、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート；陽イオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ−誘導体化ポリイミン、プルラン、セルロース、およびデンプンを含む。適した複合体化剤は、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギレート、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。ｄｓＲＮＡのための経口製剤およびそれらの調製は、米国特許番号第６，８８７，９０６号、米国特許出願公開番号第２００３００２７７８０号、および米国特許番号第６，７４７，０１４号に詳細が記載され、そのそれぞれは、出典明示によって本明細書に組み込まれる。
非経口、実質内（脳中へ）、くも膜下腔内、脳室内、または肝内投与のための組成物および製剤は、緩衝液、希釈剤、および他の適した添加剤、例えば、限定するものではないが、浸透促進剤、担体化合物、および他の医薬的に許容可能な担体または賦形剤も含有し得る無菌水溶液を含んでいてもよい。
本発明の医薬組成物は、溶液、エマルション、およびリポソーム含有製剤を含むが、それらに限定されない。これらの組成物を、予め形成された液体、自己乳化性固体および自己乳化性半固体を含むが、それらに限定されない様々な構成成分から生成されうる。特に好まれるのは、肝細胞癌等の肝障害を処置する時、肝臓を標的とする製剤である。
都合よく単位投与形態で提供されうる本発明の医薬製剤は、製薬業界においてよく知られている従来の技術に従って調製することができる。かかる技術は、活性成分を医薬担体（複数可）または賦形剤（複数可）と会合させるステップを含む。一般的に、製剤は、均一かつ完全に、液体担体または微粉化固形担体またはその両方に活性成分を会合させ、次いで、必要である場合、その生成物を成形することによって調製される。
本発明の組成物は、限定するものではないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトゲル、坐薬、および浣腸剤等などの、いずれの多くの可能な剤型にも製剤化することができる。また、本発明の組成物を、水性、非水性、または混合培地中で懸濁液として製剤化することができる。さらに、水性懸濁液は、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む懸濁液の粘性を増加する物質を含有することができる。また、その懸濁液は、安定化剤も含有することができる。
エマルション
本発明の組成物を、エマルションとして、調製し、製剤化することができる。エマルションは、典型的に、１の液体が通常直径０．１μｍを超える液滴の形態で、別の液体中に分散された不均一な系である（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５、Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５、Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１）。エマルションは、大抵、互いに本質的に混合され、分散される２つの非混和性液体相を含む二相系である。一般的に、エマルションは、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかの型であり得る。水相がバルク油相中に細分され、分液滴として分散される場合、得られる組成物は、油中水型（ｗ／ｏ）エマルションと称される。あるいは、油相がバルク水相中に細分され、分液滴として分散される場合、得られる組成物は、水中油型（ｏ／ｗ）エマルションと称される。エマルションは、分散された相、および水相または油相中の溶液として、またはそれ自体が分離相として存在し得る活性な薬物のほかに、追加の構成成分を含有していてもよい。また、乳化剤、安定剤、色素、および抗酸化剤等の医薬賦形剤も、必要に応じ、エマルション中に存在し得る。また、医薬エマルションは、例えば、油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションの場合、２つを超える相からなる多重（multiple）エマルションであり得る。かかる複雑な製剤は、大抵、単純なバイナリーエマルションが提供しないある種の利点を提供する。ｏ／ｗエマルションの個々の油滴が小さな水液滴を封入する多重エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、油性連続相中で安定化された水の小球に封入された油滴からなる系は、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
エマルションは、わずかな熱力学的安定性によって、あるいは熱力学的安定性がないことによって特徴付けられる。大抵、エマルションの分散された相または非連続相は、外相または連続相中によく分散され、乳化剤の手段または製剤の粘性を通して、この形態で維持される。エマルションの相のいずれかは、エマルションスタイル軟膏基剤およびクリームの場合のように、半固体であっても、固体であってもよい。エマルションを安定化する他の手段は、エマルションのいずれかの相に組み込まれ得る乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、広範に４つのカテゴリーに分類することができる：合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微粉化固体（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
また表面活性剤としても知られている合成界面活性剤は、エマルションの製剤において幅広い適用性を見出し、文献で再検討されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。典型的に、界面活性剤は両親媒性であり、親水性および疎水性部分を含む。界面活性剤の親水性と疎水性の比は、親水性／親油バランス（ＨＬＢ）と呼ばれ、製剤の調製における界面活性剤のカテゴリー化および選択において貴重なツールである。界面活性剤を、親水性基の性質に基づいて、異なるクラスに分類することができる：非イオン、陰イオン、陽イオン、および両性（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５）。
エマルション製剤において使用される天然乳化剤は、ラノリン、密蝋、ホスファチド、レシチン、およびアカシアを含む。無水ラノリンおよび親水性ペトロラタム等の吸収基剤は、親水性性質を所有し、よってそれらは水を吸収することができ、ｗ／ｏエマルションを形成するが、それらの半固体コンシステンシーをいまだ保持する。また、微粉化固体も、界面活性剤との組み合わせで、および粘稠調製物中で特に優れた乳化剤として使用されている。これらは、重金属水酸化物等の極性無機固体、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウム等の非膨潤粘土、色素、および炭素またはトリステアリン酸グリセリル等の無極性固形物を含む。
また、幅広い種類の非乳化物質もエマルション製剤中に含まれ、エマルションの性質に寄与する。これらは、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、防腐剤、および抗酸化剤を含む（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
親水性コロイドまたは親水コロイドは、多糖類（例えば、アカシア、カンテン、アルギン酸、カラゲナン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）等の天然ガムおよび合成ポリマーを含む。これらは、水中で分散あるいは膨潤し、分散相液滴の周囲で強い界面薄膜を形成することによって、および外相の粘性を増加することによって、エマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。
エマルションは大抵、微生物の成長を容易に補助できる炭水化物、タンパク質、ステロールおよびホスファチド等の多数の成分を含有するので、これらの製剤は大抵、防腐剤を組み込んでいる。エマルション製剤に含まれる通常使用される防腐剤は、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸を含む。また、抗酸化剤も通常エマルション製剤に添加され、製剤の劣化を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウム等の還元剤、およびクエン酸、酒石酸およびレシチン等の抗酸化力剤等のフリーラジカルスカベンジャーであり得る。
皮膚科学的、経口および非経口経路を介したエマルション製剤の適用、およびそれらの製造の方法は、文献で再検討されている（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。経口送達のためのエマルション製剤は、吸収および生物学的利用率の立場から、製剤の容易性、ならびに有効性のため、非常に広範に使用されている（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。通常ｏ／ｗエマルションとして経口的に投与される物質のなかでも、鉱油ベース緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養調製物がある。
本発明の一実施形態において、ｄｓＲＮＡおよび核酸の組成物を、マイクロエマルションとして、製剤化する。マイクロエマルションは、水、油、および両親媒性の系として定義することができ、それは、単一の光学的に等方性で、熱力学的に安定した液体溶液である（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。典型的に、マイクロエマルションは、第１に、水性界面活性剤溶液中で油を分散し、次いで十分な量の第４の構成成分、一般的に透明系を形成するために中鎖長アルコールを添加することによって調製される系である。また、従って、マイクロエマルションは、界面活性分子の界面薄膜によって安定化される２つの非混和性液体の熱力学的に安定な等方的に明白な分散液としても説明される（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，ｉｎ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ １８５−２１５）。通常、マイクロエマルションは、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤、および電解液を含む３〜５個の構成成分の組み合わせを介して調製される。マイクロエマルションが油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）タイプであるかは、使用される油および界面活性剤の性質、および界面活性剤分子の極性ヘッドおよび炭化水素尾の構造および幾何学的パッキングによる（Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
相図を利用する現象学的アプローチは、広範囲にわたって研究され、当業者にマイクロエマルションをどのようにして製剤化するかに対する、広範な知識をもたらした（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５、Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、自発的に形成される熱力学的に安定な液滴の処方において非水溶性薬物を可溶化するという利点を提供する。
マイクロエマルションの調製において使用される界面活性剤は、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）を単独または補助界面活性剤と組み合わせて含むが、それらに限定されない。補助界面活性剤は、通常はエタノール、１−プロパノール、および１−ブタノール等の短鎖アルコールであるが、界面活性剤分子間で産生されるボイドスペースのため、界面活性剤膜に浸透し、結果として乱れた膜を生じることによって、界面流動性を増加する役割を果たす。しかし、マイクロエマルションは、補助界面活性剤の使用無しで調製してもよく、アルコール不含の自己乳化性マイクロエマルション系が当技術分野において知られている。典型的に、水相は、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得るが、それらに限定されない。油相は、Ｃａｐｔｅｘ３００、Ｃａｐｔｅｘ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８−Ｃ１２）モノ、ジおよびトリ−グリセリド、ポリオキシエチレート化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８−Ｃ１０グリセリド、植物油、およびシリコン油等の物質を含み得るが、それらに限定されない。
薬物可溶化および薬物の増強された吸収の立場から、マイクロエマルションは、特に関心が持たれる。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの双方）は、ペプチドを含む薬物の経口生物学的利用率を増強することが提示される（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５）。マイクロエマルションは、改善された薬物可溶化、酵素加水分解からの薬物の保護、膜流動性および浸透性における界面活性剤誘導性変化による薬物吸収の可能な増強、調製の容易性、固形物剤型よりも勝る経口投与の容易性、改善された臨床的有効性、および減少した毒性の利点を産出する（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５、Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３）。大抵、マイクロエマルションは、その構成成分を外気温で一緒にした時、自発的に形成し得る。これは、熱不安定性薬物、ペプチド、またはｄｓＲＮＡｓを製剤化する時、特に有益であり得る。また、マイクロエマルションは、化粧品および医薬適用の双方において、活性成分の経皮性送達において効果的でもある。本発明のマイクロエマルション組成物および製剤が、胃腸管からのｄｓＲＮＡおよび核酸の増加した全身性吸収を促進し、かつｄｓＲＮＡおよび核酸の局所細胞取り込みを改善するであろうことが予想される。
また、本発明のマイクロエマルションは、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透促進剤等の追加の構成成分および添加剤を含有して、製剤の性質を改善し、本発明のｄｓＲＮＡおよび核酸の吸収を増強してもよい。本発明のマイクロエマルション中で使用される浸透促進剤は、５つの広範なカテゴリー：界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート化剤、非キレート化非界面活性剤の内の１つに属すると分類され得る（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらのクラスのそれぞれは、上述されている。
浸透促進剤
一実施形態において、本発明は様々な浸透促進剤を用い、動物の皮膚への核酸、特にｄｓＲＮＡの効率的な送達をもたらす。大抵の薬物は、イオン化および非イオン化形態の双方で、溶液中に存在する。しかし、通常、脂溶性または親油性薬物のみが容易に細胞膜を通過する。通過されるべき膜が浸透促進剤で処置された場合、非親油性薬物でさえも細胞膜を通過することができることが見出された。また、細胞膜を横断する非親油性薬物の拡散を補助することに加えて、浸透促進剤は、親油性薬物の浸透性も増強する。
浸透促進剤は、５つの広範なカテゴリー：界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート化剤、非キレート化非界面活性剤の内の１つに属すると分類され得る（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。浸透促進剤の上記のクラスのそれぞれは、以下で詳述される。
界面活性剤：本発明と関連して、界面活性剤（または「界面活性薬剤」）は、水溶液に溶解される時、溶液の表面張力または水溶液および別の液体間の界面張力を低下する化学物質であり、結果として、粘膜を介するｄｓＲＮＡの吸収を増強する。胆汁塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤は、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）、およびＦＣ−４３等のペルフルオロケミカルエマルション（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）を含む。
脂肪酸：浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体は、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ラク−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そのＣ．置換１−１０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル、およびｔ−ブチル）、およびそれらのモノ−およびジ−グリセリド（すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエート等）を含む（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３、Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４）。
胆汁塩：胆汁の生理学的役割は、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進を含む（Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５）。様々な天然胆汁塩、およびそれらの合成誘導体は、浸透促進剤として作用する。従って、「胆汁塩」という用語は、胆汁の天然構成成分、ならびにそれらの合成誘導体のいずれも含む。適した胆汁塩は、例えば、コール酸（またはその医薬的に許容されるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（glucholic acid）（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（glycholic acid）（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、ナトリウムタウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシデート（ＳＴＤＨＦ）、ナトリウムグリコジヒドロフシデート、およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）を含む（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２、Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ ７８２−７８３、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５、Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３）。
キレート化剤：本発明と関連して使用されるキレート化剤は、それらとの複合体を形成することによって、溶液から金属イオンを除去する化合物として定義することができ、結果として、粘膜を介したｄｓＲＮＡの吸収を増強する。本発明における浸透促進剤としてのそれらの使用に関して、大抵の特徴付けされたＤＮＡヌクレアーゼは触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、かくしてキレート化剤によって阻害されるので、キレート化剤は、ＤＮａｓｅ阻害剤としの役割も果たすという追加の利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５−３３９）。適したキレート化剤は、エチレンジアミンテトラ酢酸ジナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えば、ナトリウムサリチレート、５−メトキシサリチレート、およびホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、β−ジケトンのラウレス−９およびＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）を含むが、それらに限定されない（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３、Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１）。
非キレート化非界面活性剤：本明細書で使用されるように、非キレート化非界面活性浸透増強化合物は、キレート化剤として、または界面活性剤としてのわずかな活性を証明するが、消化粘膜を介したｄｓＲＮＡの吸収を増強する化合物として定義することができる（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３）。浸透促進剤のこのクラスは、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２）、ならびにジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾン等の非ステロイド抗炎症薬剤を含む（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）。
担体
また、本発明のある組成物は、製剤中に担体化合物も組み込む。本明細書で使用されるように、「担体化合物」または「担体」は、核酸、またはその類似体を指し、それは不活性（すなわち、それ自体は生物学的活性を所有しない）であるが、例えば、生物学的に活性な核酸の分解または循環からのそれらの除去の促進によって、生物学的活性を有する核酸の生物学的利用率を低下するインビボでのプロセスによる核酸として理解される。核酸および担体化合物の同時投与は、典型的には、過剰な後者の物質を伴うが、恐らく共通の受容体に対する担体化合物および核酸間の競合のため、肝臓、腎臓、または他の外部循環貯蔵部において回収される核酸の量の実質的減少をもたらすことができる。例えば、肝臓組織中の部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、ポリイノシン酸、デキストランサルフェート、ポリシチジル酸、または４−アセタミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と共に同時投与される時、低下されることができる（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１、Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３）。
賦形剤
担体化合物と対照的に、「医薬担体」または「賦形剤」は、動物への１つ以上の核酸の送達のための、医薬的に許容される溶剤、懸濁薬剤、またはいずれの他の薬理学的に不活性な媒体である。その賦形剤は液体または固形物であり得、核酸および所与の医薬組成物の他の構成成分と組み合わせた時、所望のバルク、コンシステンシー等を提供するために、投与の計画的様式を用いて選択される。典型的な医薬担体結合剤（例えば、プレゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース等）；賦形剤（例えば、乳糖および他の糖質、結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、またはリン酸水素カルシウム等）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム等）；ならびに湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）を含むが、それらに限定されない。
また、核酸と有害に反応しない、非経口ではない投与に適した医薬的に許容される有機または無機賦形剤は、本発明の組成物を製剤化するためにも使用することができる。適した医薬的に許容可能な担体は、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、珪酸、粘稠パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等含むが、それらに限定されない。
核酸の局所投与のための製剤は、アルコール等の通常の溶剤中の無菌および非無菌水溶液、非水性溶液、または液体または固形油ベースにおける核酸の溶液を含むことができる。また、その溶液は、緩衝剤、希釈剤、および他の適した添加剤も含有することができる。また、核酸と有害に反応しない、非経口ではない投与に適した医薬的に許容される有機または無機賦形剤を、使用することができる。
適した医薬的に許容可能な賦形剤は、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、珪酸、粘稠パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等含むが、それらに限定されない。
他の構成成分
本発明の組成物は、当該分野において確立された使用レベルで、医薬組成物中に従来見出される他の補助構成成分をさらに含有することができる。従って、例えば、その組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔剤、または抗炎症薬剤等の追加の、適合性がある、医薬的に活発な物質を含有することができ、または色素、フレーバー剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、肥厚薬剤、および安定剤等の本発明の組成物の様々な剤型の物理的に製剤化において有用である追加の物質を含有することができる。しかし、添加される時、かかる物質は、本発明の組成物の構成成分の生物学的活性を過度に妨げるべきではない。その製剤は無菌化され、所望の場合、浸透圧、緩衝剤、着色料、香料、および／または芳香物質等に影響を与えるために、製剤の核酸（複数可）と有害に相互作用しない補助的な薬剤、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、塩と混合される。
水性懸濁液は、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、および／またはデキストランを含む懸濁液の粘性を増加する物質を含有できる。また、その懸濁液は安定剤も含有できる。
いくつかの実施形態において、本発明の特徴である医薬組成物は、（ａ）１つ以上のｄｓＲＮＡ化合物、および（ｂ）非ＲＮＡｉ機構によって機能する１つ以上の抗サイトカイン生物学的薬剤、を含む。かかる生物製剤の例は、ＩＬ１β（例えば、アナキンラ）、ＩＬ６（トシリズマブ）、またはＴＮＦ（エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、またはセルトリズマブ）を標的とする生物製剤を含む。
かかる化合物の毒性および治療的な有効性は、細胞培養物または実験動物における標準薬学的手順によって、例えば、ＬＤ５０（その集団の５０％に対する致死量）およびＥＤ５０（その集団の５０％に対して用量治療効果がある）を決定するために、決定することができる。有毒と治療効果との用量比は治療指標であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として示される。高い治療指標を示す化合物が好まれる。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおいての使用のための投与量の範囲の製剤化において、使用することができる。一般的に、本発明の特徴である組成物の投与量は、わずかな毒性を伴う、あるいは毒性を伴わないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。その投与量は、用いられる剤型および利用される投与の経路によって、この範囲内で変化する。本発明の特徴である方法において使用されるいずれの化合物に対して、その治療上効果的な用量が細胞培養アッセイから初期に推定できる。用量は、化合物の循環血漿濃度範囲、または適切である場合、細胞培養物中で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の半数の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む標的配列のポリペプチド生成物の循環血漿濃度範囲を達成する（例えば、ポリペプチドの減少した濃度を達成する）ため、動物モデルにおいて処方されうる。かかる情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
上述のように、それらの投与に加えて、本発明の特徴であるｄｓＲＮＡを、ＧＮＡＱ発現によって媒介される病的過程の治療において効果的である他の知られている薬剤と組み合わせて投与することができる。いずれの事象においても、投与する医師は、当技術分野において知られているか、または本明細書で説明される有効性の標準測定を使用して観察される結果に基づいて、ｄｓＲＮＡ投与の量およびタイミングを調整することができる。
ＧＮＡＱ遺伝子の発現に起因する疾病を処置するための方法
本発明は、特に、ＧＮＡＱを標的とするｄｓＲＮＡの使用、およびＧＮＡＱ媒介性疾患または疾病の治療のために少なくとも１つのｄｓＲＮＡを含有する組成物に関連する。例えば、ＧＮＡＱ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡは、ＧＮＡＱの活性化変異および／またはＧＮＡＱの過剰発現の結果のいずれかを有する癌の治療に対して有用であり得る。標的とされる腫瘍は、ブドウ膜黒色腫、皮膚黒色腫、青色母斑、太田母斑、および神経内分泌腫瘍（カルチノイド腫瘍、肺大細胞癌、および肺小細胞癌を含むが、それらに限定されない）を含む。
また、ＧＮＡＱ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡは、ブドウ膜黒色腫等の疾患の症状の治療のために使用され得る。関連する症状は、例えば、黒色腫進行（眼圧、目の痛み、および周辺視野の傷害を増加する）を含む。
ＧＮＡＱ発現に対する阻害効果のため、本発明の組成物またはそこから調製される医薬組成物は、生活の質を増強することができる。
さらに、本発明は、例えば、ＧＮＡＱ媒介性疾患または疾病を治療するために、他の医薬品および／または他の治療方法、例えば、これらの疾患を治療するために現在用いられているもの等の知られている医薬品および／または知られている治療方法と組み合わせた、ｄｓＲＮＡまたはその医薬組成物の使用に関する。一例において、ＧＮＡＱを標的とするｄｓＲＮＡは、放射線療法と組み合わせて投与することができる。他の例において、ＧＮＡＱを標的とするｄｓＲＮＡは、鎮痛薬等のＧＮＡＱ疾病の症状を処置するための医薬または治療方法と組み合わせて投与することができる。
そのｄｓＲＮＡおよび追加の治療薬は、同じ組み合わせ、例えば、非経口的に投与することができるか、または追加の治療薬は、別々の組成物の一部として、または本明細書で説明される別の方法によって投与することができる。
本発明は、ブドウ膜黒色腫等のＧＮＡＱ発現によって媒介される疾病または疾患を有する患者への、ＧＮＡＱを標的とするｄｓＲＮＡの投与の方法を特徴とする。ｄｓＲＮＡの投与は、例えば、ブドウ膜黒色腫を患う患者において、視力を安定し、改善することができる。患者に、ｄｓＲＮＡの０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、または２．５ｍｇ／ｋｇ等の治療量のｄｓＲＮＡを投与することができる。そのｄｓＲＮＡは、一定期間にわたる、例えば、５分、１０分、１５分、２０分、または２５分間にわたる静脈内注入によって、投与することができる。その投与は、例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、またはそれ以上にわたり隔週（すなわち、毎２週間ごと）等の定期的で、繰り返される。初期治療計画後、その治療を頻度を減らして投与することができる。例えば、３ヶ月にわたる隔週投与後、投与は、６ヶ月または１年、もしくはそれ以上にわたって１ヶ月に１度で繰り返され得る。ｄｓＲＮＡの投与は、少なくとも２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％、もしくはそれ以上、患者の血液または尿中のＧＮＡＱレベルを低下することができる。
ｄｓＲＮＡの総用量の投与前、患者に５％の注入反応等の少量が投与されてもよく、アレルギー反応等の有害作用に対して監視され得る。
多くのＧＮＡＱに関連する疾病および疾患は、遺伝性である。従って、ＧＮＡＱ ｄｓＲＮＡを必要とする患者を、家族歴を取得することによって同定することができる。医師、看護師、または家族等の医療提供者は、ＧＮＡＱ ｄｓＲＮＡの処方または投与前に家族歴を取得し得る。また、ＤＮＡ試験も、ＧＮＡＱ ｄｓＲＮＡが患者に投与される前にＧＮＡＱ遺伝子の変異を同定するために、患者に実施され得る。
ＧＮＡＱ遺伝子の発現を阻害するための方法
さらに別の態様において、本発明は、哺乳類中のＧＮＡＱ遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。その方法は、標的ＧＮＡＱ遺伝子の発現を低下するか、または発現抑制するための、本発明の特徴である組成物の哺乳類への投与を含む。
処置される生物がヒト等の哺乳類である場合、その組成物は、頭蓋内（例えば、脳室内、実質内、およびくも膜下腔内）、静脈内、筋肉内、皮下、経皮性、気道（エアロゾル）、経鼻、直腸、および局所（頬側および舌下を含む）投与を含む、経口または非経口経路を含むが、それらに限定されない当技術分野において知られているいずれの手段によっても投与され得る。ある実施形態において、その組成物は静脈内注入または注射によって投与される。
別に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野に精通する者によって通常理解されるものと、同じ意味を有する。本明細書で説明されるものと同様、あるいは同等の方法および物質は、本発明の特徴であるｄｓＲＮＡおよび方法の実践または試験において使用され得るが、適した方法および物質を以下に説明する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によって、それらの全体が組み込まれる。矛盾する場合において、定義を含む本明細書が制御するであろう。さらに、その物質、方法、および実施例は例示のみであり、限定することを意図しない。
以下は、本発明を行うための具体的な実施形態の実施例である。実施例は例示目的のみのために提示され、本発明の範囲をいずれの形でも、限定することを意図しない。使用される数字（例えば、量、温度等）に関して正確性を確保する努力は行われてはいるが、いくつかの実験誤差および偏差は、当然ながら許容されるべきである。
他の実施形態は、例えば、請求項中にある。
本発明の実践は、別に示されない限り、当技術分野内において、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、および薬理学の従来の方法を用いるであろう。かかる技術は、文献中に完全に説明される。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）、Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照されたい。
実施例１． ｄｓＲＮＡ合成
試薬の供給源
試薬の供給源が具体的に本明細書において提供されていない場合、かかる試薬を、分子生物学における適用に対する品質／純度標準で、分子生物学の試薬のいずれの供給者から得てもよい。
コンジュゲート（Conjugate）
３’−コレステロール−コンジュゲート化ｓｉＲＮＡ（本明細書で−Ｃｈｏｌ−３’という）の合成のために、適切に修飾された固形支持体をＲＮＡ合成のために使用する。その修飾された固形支持体を、以下のように調製する：
ジエチル−２−アザブタン−１，４−ジカルボキシレートＡＡ
Figure 2016063826
 水酸化ナトリウム（５０ｍＬ）の４．７Ｍの水溶液を、水（５０ｍＬ）中のエチルグリシネート塩酸塩（３２．１９ｇ、０．２３モル）の撹拌し、氷冷した溶液に添加する。次いで、アクリル酸エチル（２３．１ｇ、０．２３モル）を添加し、その混合物を、反応の終了がＴＬＣによって確認されるまで、室温で撹拌する。１９時間後、その溶液をジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で分配する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、蒸発させる。残渣を蒸留し、ＡＡ（２８．８ｇ、６１％）を得る。
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル−アミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ
Figure 2016063826
 Ｆｍｏｃ−６−アミノ−ヘキサン酸（９．１２ｇ、２５．８３ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、氷冷する。ジイソプロピルカルボジイミド（３．２５ｇ、３．９９ｍＬ、２５．８３ｍｍｏｌ）を、０℃で該溶液に添加する。次いで、ジエチル−アザブタン−１，４−ジカルボネート（５ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を添加する。溶液を室温に戻し、６時間にわたってさらに撹拌する。反応の終了はＴＬＣによって確認する。反応混合物を真空下で濃縮し、酢酸エチルを添加し、ジイソプロピル尿素を沈殿させる。その懸濁液をろ過する。濾液を、５％の水性塩酸、５％の重炭酸ナトリウム、および水で洗浄する。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、粗生成物を得、それをカラムクロマトグラフィー（５０％のＥｔＯＡＣ／ヘキサン）によって精製し、１１．８７ｇ（８８％）のＡＢを得る。
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣ
Figure 2016063826
 ３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ（１１．５ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）を、０℃で、ジメチルホルムアミド中の２０％のピペリジンに溶解する。その溶液を１時間にわたり継続して撹拌する。その反応混合物を真空下で濃縮し、水を残渣に添加し、その生成物を、酢酸エチルを用いて抽出する。粗生成物を、その塩酸塩への転換によって精製する。
３−（｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル−アミノ）−プロピオン酸エチルエステルＡＤ
Figure 2016063826
 ３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣ（４．７ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）の塩酸塩を、ジクロロメタン中に溶解する。懸濁液を氷上で０℃まで冷却する。懸濁液に、ジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ、５．２ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を添加する。得られた溶液に、クロロギ酸コレステリル（６．６７５ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を添加する。その反応混合物を一晩撹拌する。その反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１０％の塩酸で洗浄する。生成物を、フラッシュクロマトグラフィーによって精製する（１０．３ｇ、９２％）。
１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−４−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステルＡＥ
Figure 2016063826
 カリウムｔ−ブトキシド（１．１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を、３０ｍＬの乾燥トルエン中でスラリーにする。その混合物を氷上で０℃まで冷却し、５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）のジエステルＡＤを２０分以内で撹拌しながら緩徐に添加する。その温度を、添加の間、５℃未満で維持する。その撹拌を０℃で３０分にわたって維持し、１ｍＬの氷酢酸を添加した直後に、４０ｍＬの水中における４ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏを添加する。得られた混合物を、それぞれ１００ｍＬのジクロロメタンを用いて２度抽出し、合わせた有機抽出物を、それぞれ１０ｍＬのリン酸塩緩衝液で２度洗浄し、乾燥し、蒸発乾固させる。残渣を６０ｍＬのトルエンに溶解し、０℃まで冷却し、３つの５０ｍＬの量の冷たいｐＨ９．５炭酸塩緩衝液を用いて抽出する。その水性抽出物を、リン酸を用いてｐＨ３に調節し、５つの４０ｍＬの量のクロロホルムを用いて抽出し、それらを合わせ、乾燥し、蒸発乾固させる。残渣を、２５％の酢酸エチル／ヘキサンを使用してカラムクロマトグラフィーによって精製し、１．９ｇのｂ−ケトエステル（３９％）を得る。
［６−（３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン−１−イル）−６−オキソ−ヘキシル］−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステルＡＦ
Figure 2016063826
 メタノールの（２ｍＬ）を、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中のｂ−ケトエステルＡＥ（１．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）および水素化ホウ素ナトリウム（０．２２６ｇ、６ｍｍｏｌ）の還流混合物に、１時間の期間にわたって滴下する。撹拌を、還流温度で１時間にわたり継続する。室温まで冷却後、１Ｎ ＨＣｌ（１２．５ｍＬ）を添加し、その混合物を酢酸エチル（３×４０ｍＬ）用いて抽出する。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮し、生成物を得、それをカラムクロマトグラフィー（１０％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）によって精製する（８９％）。
（６−｛３−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル｝−６−オキソ−ヘキシル）−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステルＡＧ
Figure 2016063826
 ジオールＡＦ（１．２５ｇｍ、１．９９４ｍｍｏｌ）を、真空中でピリジン（２×５ｍＬ）を用いて蒸発することによって、乾燥させる。無水ピリジン（１０ｍＬ）および４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（０．７２４ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を撹拌しながら添加する。その反応を室温で一晩実行する。その反応物をメタノールの添加によってクエンチする。反応混合物を真空下で濃縮し、残渣にジクロロメタン（５０ｍＬ）に添加する。有機層を、１Ｍの水性重炭酸ナトリウムで洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮する。残留ピリジンを、トルエンを用いて蒸発させることによって除去する。粗生成物を、カラムクロマトグラフィー（２％のＭｅＯＨ／クロロホルム、５％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３中のＲｆ＝０．５）によって精製する（１．７５ｇ、９５％）。
コハク酸モノ−（４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈシクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−ピロリジン−３−イル）エステルＡＨ
Figure 2016063826
 化合物ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を、無水コハク酸（０．１５０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０７３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）と混合し、真空中で、４０℃で一晩乾燥させる。その混合物を無水ジクロロエタン（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３１８ｇ、０．４４０ｍＬ、３．１５ｍｍｏｌ）を添加し、その溶液を、１６時間にわたってアルゴン雰囲気下で、室温で撹拌する。次いで、それをジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、氷冷の水性クエン酸（５ｗｔ％、３０ｍＬ）および水（２×２０ｍＬ）で洗浄する。有機相を、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾固するまで濃縮する。残渣をそのまま次のステップで使用する。
コレステロール誘導体化ＣＰＧＡＩ
Figure 2016063826
 スクシネートＡＨ（０．２５４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン／アセトニトリル（３：２、３ｍＬ）の混合物に溶解する。その溶液に、アセトニトリル（１．２５ｍＬ）中のＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）、アセトニトリル／ジクロロエタン（３：１、１．２５ｍＬ）中の２，２’−ジチオ−ビス（５−ニトロピリジン）（０．０７５ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を連続的に添加する。得られた溶液に、アセトニトリル（０．６ｍＬ）中のトリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を添加する。その反応混合物が鮮やかなオレンジ色に変わった。その溶液を、リストアクション振盪機を使用することによって、簡単に撹拌する（５分）。長鎖アルキルアミン−ＣＰＧ（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）（１．５ｇ、６１ｍＭ）を添加する。その懸濁液を２時間にわたって撹拌する。そのＣＰＧを、焼結漏斗を通してろ過し、アセトニトリル、ジクロロメタン、およびエーテルで連続洗浄する。未反応アミノ基を無水酢酸／ピリジンを使用してマスクする。ＣＰＧの得られた負荷を、ＵＶ測定を行うことによって、測定する（３７ｍＭ／ｇ）。
５’−１２−ドデカン酸ビスデシルアミド基（本明細書で「５’−Ｃ３２−」という）または５’−コレステリル誘導体基（本明細書で「５’−Ｃｈｏｌ−」という）を有するｓｉＲＮＡの合成を、国際公開番号ＷＯ／２００４／０６５６０１号で説明されるように実行する。但し、コレステリル誘導体の場合、その酸化ステップを、核酸オリゴマーの５’末端にホスホロチオエート結合を導入するため、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬を使用して実施する。
核酸配列は、標準命名法を使用して本明細書に表され、具体的には、表１の略名で表される。
Figure 2016063826
実施例２． ｓｉＲＮＡ設計および合成
転写物
ｓｉＲＮＡ設計を実行し、ヘテロ三量体Ｇ遺伝子のＧアルファｑサブユニット（ＧＮＡＱ）を標的とするｓｉＲＮＡを同定した。それぞれ異種間の異なるセットに対して特異的な３つのセットを設計した：１）ヒトおよびサル、２）ヒト、サル、およびマウス、ならびに３）マウスおよびラット。ＧＮＡＱ配列を、２００８年１１月２４日にＮＣＢＩ参照配列コレクションより、以下のとおりに得た：
Figure 2016063826
ｓｉＲＮＡ設計および特異性予測
全ての可能な１９塩基長の予測される特異性を、各配列に対して決定した。ＧＮＡＱ ｓｉＲＮＡを、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用して、ヒト、カニクイザル、マウス、およびラットトランスクリプトーム（ヒト、マウス、およびラットに対するＮＣＢＩ参照配列セット中でＮＭ およびＸＭ 記録のセット、およびカニクイザル（Macaca fascicularis）の単一遺伝子クラスター由来の「コア」配列として定義される）に対する総合検索において使用した。次いで、Ｐｙｔｈｏｎスクリプト「ｏｆｆｔａｒｇｅｔＦａｓｔａ．ｐｙ」を使用して、その配列アラインメントを解析し、ｓｉＲＮＡおよびいずれかの潜在的な「オフターゲット」転写物間のミスマッチの位置および数に基づいたスコアを作成した。オフターゲットスコアは、分子の５’末端からの位置２〜９で、ｓｉＲＮＡの「種」領域における相違を強調するために、ウェートを与えられる。オフターゲットスコアは以下のように算出する。オリゴおよび転写物間のミスマッチにペナルティを与える。オリゴの位置２〜９における種領域中のミスマッチに２．８のペナルティを与える。推定切断部位１０および１１中のミスマッチに１．２のペナルティを与え、全ての他のミスマッチに１のペナルティを与える。次いで、各オリゴ転写物対に対するオフターゲットスコアを、ミスマッチペナルティを合計することによって、算出する。次いで、全てのオリゴ−転写物対由来の最も低いオフターゲットスコアを決定し、オリゴのその後の選別に使用する。双方のｓｉＲＮＡ鎖を、算出したスコアに従って、特異性のカテゴリーに割り当てた。３より大きいスコアは非常に特異的、３と同等のスコアは特異的、２．２〜２．８のスコアは中程度に特異的であると認定される。いずれのオリゴを合成するかの選択において、アンチセンス鎖のオフターゲットスコアを高いものから低いものへと選別した。
ｄｓＲＮＡの合成
ｄｓＲＮＡ二本鎖のセンスおよびアンチセンス鎖を、１μｍｏｌスケールで、ＭｅｒＭａｄｅ１９２合成機で合成した。表２ａ、３ａ、および４ａに記載されるそれぞれのセンスおよびアンチセンス配列に対して、配列を以下のように、かつ表２ｄ、３ｄ、および４ｄに記載されるように修飾した。
１． センス鎖において、全てのピリミジン（Ｕ、Ｃ）を、対応する２’−Ｏ−メチル塩基（２’Ｏ−メチルＣおよび２’−Ｏ−メチルＵ）で置換した。アンチセンス鎖において、Ａ（ＵＡ、ＣＡ）に隣接する全てのピリミジン（Ｕ、Ｃ）を、対応する２’−Ｏ−メチル塩基（２’Ｏ−メチルＣおよび２’−Ｏ−メチルＵ）で置換した。双方の鎖の３’末端に、２塩基ｄＴｄＴ伸長を導入した。
２． センス鎖において、全てのピリミジン（Ｕ、Ｃ）を、対応する２’−Ｏ−メチル塩基（２’Ｏ−メチルＣおよび２’−Ｏ−メチルＵ）で置換し；アンチセンス鎖において、Ａ（ＵＡ、ＣＡ）に隣接する全てのピリミジン（Ｕ、Ｃ）を、対応する２’−Ｏ−メチル塩基（２’Ｏ−メチルＣおよび２’−Ｏ−メチルＵ）で置換し；双方の鎖の３’末端に、２塩基ｄＴｓｄＴ（ホスホロチオエートを含む）伸長を導入した。
３． センス鎖において、全てのピリミジン（Ｕ、Ｃ）を、対応する２’−Ｏ−メチル塩基（２’Ｏ−メチルＣおよび２’−Ｏ−メチルＵ）で置換し；アンチセンス鎖において、Ａ（ＵＡ、ＣＡ）に隣接する全てのピリミジン（Ｕ、Ｃ）および別のＵ（ＵＵ）またはＧ（ＵＧ）に隣接する全てのＵを、対応する２’−Ｏ−メチル塩基（２’Ｏ−メチルＣおよび２’−Ｏ−メチルＵ）で置換し；双方の鎖の３’末端に、２塩基ｄＴｓｄＴ（ホスホロチオエートを含む）伸長を導入した。
ｄｓＲＮＡのそれぞれの鎖の合成は、ホスホルアミダイト化学を使用する、固体担持オリゴヌクレオチド合成を使用した。
合成を、９６ウェルプレートにおいて、１ｕｍｏｌｅスケールで、実施した。アミダイト溶液を０．１Ｍの濃度で調製し、エチルチオテトラゾール（アセトニトリル中で０．６Ｍ）を活性化因子として使用した。その合成した配列を、第１のステップにおいてメチルアミンおよび第２のステップにおいてトリエチルアミン３ＨＦを使用して、９６ウェルプレートにおいて切断し、脱保護した。かくして得られた粗配列を、アセトン：エタノール混合物を用いて沈殿させ、ペレットを、０．５Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液中で再懸濁した。各配列由来の試料をＬＣ−ＭＳによって分析し、得られた大量データにより、配列のアイデンティティーを確認した。また、試料の選択されたセットも、ＩＥＸクロマトグラフィーによって分析した。
全ての配列を、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑカラムを使用して、ＡＫＴＡエクスプローラー精製システム上で精製した。全長配列に対応する単一のピークを溶出液中で収集し、その後、イオン交換クロマトグラフィーによって純度について分析した。
精製した配列を、ＡＫＴＡ精製剤を使用して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム上で脱塩した。脱塩した配列を、濃度および純度について分析した。二本鎖の調製のために、等モル量のセンスおよびアンチセンス鎖を、２〜５分間、９５℃で必要とされる緩衝液（例えば、１×ＰＢＳ）中で加熱し、ゆっくりと室温まで冷却した。二本鎖の完全性を、ＨＰＬＣ分析によって確認した。
インビボ研究のための合成および二本鎖アニーリング
ステップ１． オリゴヌクレオチド合成
インビボ研究のためのオリゴヌクレオチドを、ＡＫＴＡオリゴパイロット合成機またはＡＢＩ３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機で合成した。市販されている制御細孔ガラス固形支持体（ｄＴ−ＣＰＧ， ５００Å， Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）または社内で合成した固形支持体コレステロール−ＣＰＧ、ＡＩを、合成のために使用した。本発明を受け入れられる他のリガンドとコンジュゲートした固形支持体は、２００４年９月２１日に出願された米国特許出願番号第１０／９４６，８７３号に記載されており、それは、全ての目的のために出典明示によって本明細書中に組み込まれる。標準保護基（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ−メチル−アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイトおよび５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−チミジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト）を有するＲＮＡホスホルアミダイトおよび２’−Ｏ−メチル修飾ＲＮＡホスホルアミダイトを、商業的に得た（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよびＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。
ＡＫＴＡオリゴパイロット合成機での合成のために、グアノシンおよび２’−Ｏ−メチル−ウリジンを除き、全てのホスホルアミダイトをＣＨ３ＣＮ中で０．２Ｍの濃度で使用し、グアノシンおよび２’−Ｏ−メチル−ウリジンを１０％のＴＨＦ／ＣＨ３ＣＮ（ｖ／ｖ）中で０．２Ｍの濃度で使用した。１６分の結合／再利用時間を、全てのホスホルアミダイト結合に対して使用した。活性化因子は、５−エチル−チオ−テトラゾールであった（０．７５Ｍ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。ＰＯ酸化に対して、水／ピリジン（１０：９０ｖ／ｖ）中の５０ｍＭのヨウ素を使用し、ＰＳ酸化に対して、２，６−ルチジン／ＣＨ３ＣＮ（１：１ｖ／ｖ）中の２％のＰＡＤＳ（ＧＬ合成）を使用した。ＡＢＩ３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機での合成の場合、２’−Ｏ−メチル−ウリジンを除き、全てのホスホルアミダイトをＣＨ３ＣＮ中で０．１５Ｍの濃度で使用し、２’−Ｏ−メチル−ウリジンを１０％のＴＨＦ／ＣＨ３ＣＮ（ｖ／ｖ）中で０．２Ｍの濃度で使用した。１０分の結合時間を、全てのホスホルアミダイト結合に対して使用した。活性化因子は、５−エチル−チオ−テトラゾールであった（０．２５Ｍ、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。ＰＯ酸化に対して、水／ピリジン（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）中の２０ｍＭのヨウ素を使用し、ＰＳ酸化に対して、ピリジン中の０．１ＭのＤＤＴＴ（ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用した。
ステップ２． オリゴヌクレオチドの脱保護
合成の終了後、その支持体を、１００ｍＬのガラスビン（ＶＷＲ）に移した。そのオリゴヌクレオチドを、４５℃で９０分にわたる、４０ｍＬの４０％水性メチルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いる塩基およびホスフェート基の同時脱保護を用いて、支持体から切断した。ビンを簡単に氷上で冷却し、次いでそのメチルアミンを、新しい５００ｍＬのビン中にろ過した。そのＣＰＧを、４０ｍＬ分量のＤＭＳＯで３回洗浄した。次いで、その混合物を、ドライアイス上で冷却した。
２’位置のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去するために、６０ｍＬのトリエチルアミントリヒドロフルオライド（Ｅｔ３Ｎ−ＨＦ）を、上記の混合物に添加した。その混合物を、４０℃で、６０分にわたり加熱した。次いで、その反応物を、２２０ｍＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）でクエンチし、精製までフリーザー中で貯蔵した。
ＡＢＩ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機上で合成した配列
合成の終了後、その支持体を、１５ｍＬの管（ＶＷＲ）に移した。そのオリゴヌクレオチドを、６５℃で１５分にわたる、７ｍＬの４０％水性メチルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いる塩基およびホスフェート基の同時脱保護を用いて、支持体から切断した。ビンを簡単に氷上で冷却し、次いでそのメチルアミン溶液を、１００ｍＬのビン（ＶＷＲ）中にろ過した。そのＣＰＧを、７ｍＬ分量のＤＭＳＯで３回洗浄した。次いで、その混合物を、ドライアイス上で冷却した。
２’位置のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去するために、１０．５ｍＬのトリエチルアミントリヒドロフルオライド（Ｅｔ３Ｎ−ＨＦ）を、上記の混合物に添加した。その混合物を、６０℃で、１５分にわたり加熱した。次いで、その反応物を、３８．５ｍＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）でクエンチし、精製までフリーザー中で貯蔵した。
ステップ３． 粗オリゴヌクレオチドの定量化
全ての試料について、１０μＬアリコートを、９９０μＬの脱イオン化したヌクレアーゼを含まない水（１．０ｍＬ）で希釈し、２６０ｎｍで、その吸光度測定値を得た。
ステップ４． オリゴヌクレオチドの精製
非コンジュゲート化オリゴヌクレオチド
非コンジュゲート化試料を、社内で充填したＴＳＫ−Ｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ（２０）カラム（１７．３×５ｃｍ）、またはＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅより入手可能な市販のＴＳＫ−Ｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラム（１５×０．２１５ｃｍ）上で、ＨＰＬＣによって精製した。緩衝液は、１０％のＣＨ３ＣＮ中の２０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ８．５（緩衝液Ａ）、および１０％のＣＨ３ＣＮ中の２０ｍＭのリン酸塩、１．０ＭのＮａＢｒ、ｐＨ８．５（緩衝液Ｂ）であった。流速は、社内充填カラムに対して５０．０ｍＬ／分であり、市販のカラムに対して１０．０ｍＬ／分であった。２６０および２９４ｎｍの波長を監視した。全長オリゴヌクレオチドを含有するフラクションを、共にプールし、蒸発させ、脱イオン水を用いて〜１００ｍＬに再構成させた。
コレステロールとコンジュゲートしたオリゴヌクレオチド
コレステロールとコンジュゲートした配列を、社内で充填したＲＰＣ−Ｓｏｕｒｃｅ１５逆相カラム（１７．３×５ｃｍまたは１５×２ｃｍ）上でＨＰＬＣ精製した。緩衝液は、１０％のＣＨ３ＣＮ中の２０ｍＭのＮａＯＡｃ（緩衝液Ａ）および７０％ＣＨ３ＣＮ中の２０ｍＭのＮａＯＡｃ（緩衝液Ｂ）であった。流速は、１７．３×５ｃｍカラムに対して５０．０ｍＬ／分であり、１５×２ｃｍカラムに対して１２．０ｍＬ／分であった。２６０および２８４ｎｍの波長を監視した。全長オリゴヌクレオチドを含有するフラクションを、プールし、蒸発させ、脱イオン水を用いて１００ｍＬに再構成させた。
ステップ５． 精製したオリゴヌクレオチドの脱塩
精製したオリゴヌクレオチドを、社内で充填したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを使用して、ＡＫＴＡ ＥｘｐｌｏｒｅｒまたはＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかで脱塩した。第１に、カラムを、２０〜３０分にわたり、４０ｍＬ／分の流速で、水で洗浄した。次いで、試料を、４０〜６０ｍＬフラクションにおいてアプライした。溶出した塩を含まないフラクションを合わせ、乾燥させ、〜５０ｍＬのＲＮａｓｅを含まない水中で再構成させた。
ステップ６． 純度分析
脱塩オリゴヌクレオチドのそれぞれの約０．３ＯＤを、３００μＬまで水中で希釈し、ＣＧＥ、イオン交換ＨＰＬＣ、およびＬＣ／ＭＳによって分析した。
ステップ７． 二本鎖形成
二本鎖の調製のために、等モル量のセンスおよびアンチセンス鎖を、５分にわたって、９５℃で必要とされる緩衝液（例えば、１×ＰＢＳ）中で加熱し、緩徐に室温まで冷却した。二本鎖の完全性を、ＨＰＬＣ分析によって確認した。
ｄｓＲＮＡ配列の表
表２は、サルＧＮＡＱと交差反応するヒトＧＮＡＱを標的とするｄｓＲＮＡの設計のために使用された配列を提供する。表３は、サルおよびラットＧＮＡＱの双方と交差反応するヒトＧＮＡＱを標的とするｄｓＲＮＡの設計のために使用された配列を提供する。表４は、マウスＧＮＡＱと交差反応するラットＧＮＡＱを標的とするｄｓＲＮＡの設計のために使用された配列を提供する。
以下の表の表２ａ、３ａ、および４ａは、ＧＮＡＱ標的配列のセンスおよびアンチセンス鎖を提供する。表２ｂ、３ｂ、および４ｂは、ＮＮ２塩基オーバーハングを伴う、例示的なセンスおよびアンチセンスｄｓＲＮＡ鎖を提供する。表２ｃ、３ｃ、および４ｃは、ｄＴｄＴ２塩基オーバーハングを伴う、例示的なセンスおよびアンチセンスｄｓＲＮＡ鎖を提供する。表２ｄ、３ｄ、および４ｄは、ｄＴｄＴ２塩基オーバーハングおよび修飾ヌクレオチドを含む、合成したｄｓＲＮＡの配列を提供する。
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実施例３：インビトロスクリーニング
インビトロスクリーニングのために、ＧＮＡＱ発現細胞を利用した。いくつかの代表的なＧＮＡＱ発現細胞株は、ヒト黒色腫株化細胞ＯＭＭ１．３およびＭＥＬ２８５、ならびにＭｅｌ２０２含むが、それらに限定されない。ＯＭＭ１．３は、変異ＧＮＡＱ遺伝子を含む肝転移細胞である。ＭＥＬ２８５は、ＷＴ ＧＮＡＱ遺伝子を含む原発性ブドウ膜黒色腫細胞である。また、ＭＥＬ２０２は、原発性ブドウ膜黒色腫であるが、変異ＧＮＡＱ遺伝子も含む。Ａ５４９（肺癌）およびＡ３７５（悪性黒色腫）は、ＷＴ ＧＮＡＱ発現する癌細胞株である。
活性化ＧＮＡＱ変異と共にヒトＧＮＡＱを発現する細胞を、国際公開番号ＷＯ／２００８／０９８２０８号（全ての目的のために、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載される方法に従って得た。
ｄｓＲＮＡを、標的遺伝子のインビトロでの阻害についてスクリーンした。組織培養細胞に、ｄｓＲＮＡを形質移入した。標的遺伝子ｍＲＮＡレベルを、ｑＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）を使用してアッセイした。
細胞培養および形質移入：
Ａ５４９、Ａ３７５、ＯＭＭ１．３、およびＵＭＥＬ２０２細胞を、トリプシン処理によってプレートからはずされる前に、１０％のＦＢＳ、ストレプトマイシン、およびグルタミン（ＡＴＣＣ）を補充した特定培地（ＡＴＣＣ）中で、５％のＣＯ２の雰囲気中において３７℃でコンフルエンスに近いところまで成長させた。９６ウェルプレート中に、ウェル当たり１０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭおよび０．２μＬのリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．カタログ番号１３７７８−１５０）と共に、ウェル当たり５μＬのｓｉＲＮＡ二本鎖に５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭを添加することによって、逆形質移入を行い（表５−７）、１５分にわたり室温でインキュベートした。次いで、２×１０４細胞を含有する抗生剤無しの８０μＬの完全成長培地を添加した。細胞を、ＲＮＡ精製前に、２４時間にわたってインキュベートした。単一用量実験を、０．１ｎＭ、１．０ｎＭ、または／および１０．０ｎＭの最終二本鎖濃度のいずれかで実施し、用量応答実験を、１０、１．６６、０．２７、０．０４６、０．００７７、０．００１２、０．０００２１、０．００００３５ｎＭの選択二本鎖を用いて行った。
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ＭａｇＭＡＸ−９６総ＲＮＡ単離キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ、部品番号：ＡＭ１８３０）を使用した総ＲＮＡ単離：
細胞を収集し、１４０μＬの溶解／結合溶液中で溶解し、次いでＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを使用して、８５０ｒｐｍで１分にわたり混合した（混合速度はプロセスを通して同じであった）。２０マイクロリットルの磁性ビーズを細胞可溶化液中に添加し、５分にわたって混合した。磁性ビーズを、磁気スタンドを使用して捕獲し、その上清を、ビーズをかき乱すことなく除去した。上清を除去後、磁性ビーズを、洗浄溶液１（イソプロパノールを添加）を使用して洗浄し、１分にわたって混合した。ビーズを、再度捕獲し、上清を除去した。次いで、ビーズを１５０μＬの洗浄溶液２（エタノールを添加）で洗浄し、捕獲し、上清を除去した。次いで、５０ｕＬのＤＮａｓｅ混合物（ＭａｇＭａｘ ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ緩衝液およびＴｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ）をビーズに添加し、それらを１０〜１５分にわたって混合した。混合後、１００μＬのＲＮＡ再結合溶液を添加し、３分にわたって混合した。上清を除去し、磁性ビーズを再度、１５０μＬの洗浄溶液２で洗浄し、１分にわたって混合し、上清を完全に除去した。その磁性ビーズを、２分にわたって混合し、ＲＮＡを５０μＬの水と共に溶出する前に、乾燥させた。
ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）を使用した総ＲＮＡ単離−９６ウェルプレート手法（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ、部品番号：１８１２）：
細胞を、５分にわたって、２００μＬの溶解／結合溶液中で溶解した。１００μＬの１００％のエタノールを各細胞可溶化液中に添加し、その総３００μＬの可溶化液を「フィルタープレート」の１個のウェルに移した。フィルタープレートを、２分にわたって１０，０００〜１５，０００ｇのＲＣＦで遠心分離した。次いで、３００μＬの洗浄溶液を各ウェルに添加し、そのプレートを２分にわたって１０，０００〜１５，０００ｇのＲＣＦで遠心分離した。ＤＮａｓｅ処理のために、２０ｕＬのＤＮａｓｅ混合物を、各フィルターの上部に添加し、そのプレートを室温で１５分にわたってインキュベートした。ＲＮＡ再結合を、２００μＬの再結合ミックスでフィルターを洗浄することによって実施し、１分後、試料を１０，０００〜１５，０００ｇのＲＣＦで遠心分離した。次いで、フィルターを２００μＬの洗浄溶液で２度洗浄し、２分にわたって１０，０００〜１５，０００ｇのＲＣＦで遠心分離した。次いで、２分の３度目の遠心分離を、貯蔵部ユニットを空にした後適用し、清潔な培養プレート中へのＲＮＡの溶出を、５０μＬの予熱された（８０℃）ヌクレアーゼを含まない水をフィルターに添加することによって行った。
ＡＢＩ高キャパシティーｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ、カタログ番号４３６８８１３）を使用したｃＤＮＡ合成：
反応当たり２μＬの１０倍緩衝液、０．８μＬの２５倍ｄＮＴＰ、２μＬのランダムプライマー、１μＬの逆転写酵素、１μＬのＲＮａｓｅ阻害剤、および３．２μＬのＨ２Ｏのマスター混合物を、１０μＬの総ＲＮＡ中に添加した。ｃＤＮＡを、以下のステップを介して、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃ−１０００またはＳ−１０００サーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して産生した：２５℃で１０分、３７℃で１２０分、８５℃で５秒、４℃で保持。
リアルタイムＰＣＲ：
２μＬのｃＤＮＡを、ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６ウェルプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３２６６５）中、１ウェル当たり、１μＬのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ（Ｈｕｍａｎ ＧＡＰＤ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＶＩＣ／ＭＧＢＰｒｏｂｅ， Ｐｒｉｍｅｒ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３２６３１７Ｅ）、１μＬのＧＮＡＱＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＨＳ００３８７０７３＿Ｍ１）、および１０μＬのＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３２４０１８）のマスター混合物に添加した。リアルタイムＰＣＲを、ΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを使用して、ＡＢＩ ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。全ての反応を３回繰り返して行った。
リアルタイムデーを、ΔΔＣｔ方法を使用して分析し、１０ｎＭのＢｌｏｃｋＩＴ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｏｌｉｇｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２０１３）、または１０ｎＭのＡＤ−１９５５（ルシフェラーゼを標的とする二本鎖）を形質移入された細胞から実施されるアッセイに対して基準化して、何倍の変化かを算出した。
結果
全部で９４個の化学的に修飾したｓｉＲＮＡをスクリーンした。単一用量スクリーンを、Ａ５４９（肺癌）、Ａ３７５（悪性黒色腫）、およびブドウ膜黒色腫細胞株ＧＮＡＱｍｕｔ、ＯＭＭ１．３、およびＭＥＬ２０２において実施した。表８〜１４は、単一用量インビトロｓｉＲＮＡスクリーンの結果を示す。
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所望のレベルのＧＮＡＱ阻害を伴う二本鎖を、Ａ５４９（肺癌）ＭＥＬ２０２（ＧＮＡＱｍｕｔブドウ膜黒色腫）、およびＯＭＭ１．３細胞（ＧＮＡＱｍｕｔ肝転移）のＩＣ５０のさらなる分析のために選択した。表１５〜１７は、Ａ５４９、ＭＥＬ２０２、およびＯＭＭ１．３細胞におけるＩＣ５０実験の結果を示す。用量応答スクリーンは、二本鎖ＡＤ−２００５７およびＡＤ−２００５１を含む、肺癌細胞株およびＧＮＡＱｍｕｔブドウ膜黒色腫ＭＥＬ２０２およびＯＭＭ１．３のｐＭ ＩＣ５０を同定した。
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実施例４：インビトロ用量応答
インビトロ用量応答実験のために、ＧＮＡＱ発現細胞を利用した。いくつかの代表的なＧＮＡＱ発現細胞株は、ヒト黒色腫細胞株ＯＭＭ１．３およびＭｅｌ２０２ならびにＭＥＬ−２８５を含むが、それらに限定されない。
ｄｓＲＮＡを、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ、および０．００１ｎＭで、標的遺伝子のインビトロ阻害についてスクリーンした。組織培養細胞に、ｄｓＲＮＡを形質移入した。標的遺伝子ｍＲＮＡレベルを、ｑＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）を使用してアッセイした。
細胞培養および形質移入
ノックダウンのために、ＯＭＭ−１．３、ＭＥＬ−２０２およびＭＥＬ−２８５を、トリプシン処理によってプレートからはずされる前に、１０％のＦＢＳ、ストレプトマイシン、およびグルタミン（ＡＴＣＣ）を補充したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、５％のＣＯ２の雰囲気中において３７℃でコンフルエンスに近いところまで成長させた。９６ウェルプレート中に、ウェル当たり１０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭおよび０．２μＬのリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．カタログ番号１３７７８−１５０）と共に、ウェル当たり５μＬのｓｉＲＮＡ二本鎖に５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭを添加することによって、逆形質移入を行い、１５分にわたり室温でインキュベートした。次いで、２．０×１０４ ＯＭＭ−１．３、ＭＥＬ−２０２、またはＭＥＬ−２８５細胞を含有する抗生剤無しの８０μＬの完全成長培地を添加した。細胞を、ＲＮＡ精製前に、２４時間にわたってインキュベートした。実験を、１、０．１、０．０１、および０．００１ｎＭの最終二本鎖濃度で実施した。
ＭａｇＭＡＸ−９６総ＲＮＡ単離キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ、部品番号：ＡＭ１８３０）を使用した総ＲＮＡ単離：
細胞を収集し、１４０μＬの溶解／結合溶液中で溶解し、次いでＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを使用して、８５０ｒｐｍで１分にわたり混合した（混合速度はプロセスを通して同じであった）。２０マイクロリットルの磁性ビーズおよび溶解／結合エンハンサー混合物を細胞可溶化液中に添加し、５分にわたって混合した。磁性ビーズを磁気スタンドを使用して捕獲し、その上清をビーズをかき乱すことなく除去した。上清を除去後、磁性ビーズを、洗浄溶液１（イソプロパノールを追加）を使用して洗浄し、１分にわたって混合した。ビーズを、もう一度捕獲し、上清を除去した。次いで、ビーズを１５０μＬの洗浄溶液２（エタノールを添加）で洗浄し、捕獲し、上清を除去した。次いで、５０ｕＬのＤＮａｓｅ混合物（ＭａｇＭａｘ ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ緩衝液およびＴｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ）を、ビーズに添加し、それらを１０〜１５分にわたって混合した。混合後、１００μＬのＲＮＡ再結合溶液を添加し、３分にわたって混合した。上清を除去し、磁性ビーズを再度、１５０μＬの洗浄溶液２で洗浄し、１分にわたって混合し、上清を完全に除去した。その磁性ビーズを、２分にわたって混合し、ＲＮＡを５０μＬの水と共に溶出する前に、乾燥させた。
ＡＢＩ高キャパシティーｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ、カタログ番号４３６８８１３）を使用したｃＤＮＡ合成：
反応当たり２μＬの１０倍緩衝液、０．８μＬの２５倍ｄＮＴＰ、２μＬのランダムプライマー、１μＬの逆転写酵素、１μＬのＲＮａｓｅ阻害剤、および３．２μＬのＨ２Ｏのマスター混合物を、１０μＬの総ＲＮＡ中に添加した。ｃＤＮＡを、以下のステップを介して、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃ−１０００またはＳ−１０００サーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）を使用して産生した：２５℃で１０分、３７℃で１２０分、８５℃で５秒、４℃で保持。
リアルタイムＰＣＲ：
２μＬのｃＤＮＡを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ ３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４７２９７４００１）中、ウェル当たり０．５μＬのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３２６３１７Ｅ）、０．５μＬのＧＮＡＱ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｈｓ００３８７０７３ ｍ１）、および５μＬのＲｏｃｈｅ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４８８７３０１００１）を含有するマスター混合物に添加した。リアルタイムＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲ機（Ｒｏｃｈｅ）で行った。各二本鎖を、２つの独立的な形質移入において試験し、各形質移入を二連でアッセイした。
リアルタイムデータをΔΔＣｔ方法を用いて分析した。各試料をＧＡＰＤＨ発現に対して基準化し、ノックダウンを、非標的二本鎖ＡＤ−１９５５を形質移入された細胞と比較して評価した。
そのデータを表１８ａに示す。データを、ＡＤ−１９５５で標的化された細胞と比較して、残存するメッセージのフラクションとして表す。算出したＩＣ５０を表１８ｂに示す。
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実施例５： 免疫賦活性アッセイ：免疫賦活性能力に対するｓｉＲＮＡ配列のスクリーニング
１２個のｓｉＲＮＡ候補を、免疫刺激に関連するサイトカイン（ＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−アルファ）の誘導について試験した。
ヒトＰＢＭＣを、標準Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離技術によって、健常なドナー（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）由来の全血から単離した。ＰＢＭＣ（１×１０５／ウェル／１００μＬ）を９６ウェル平底プレートに播種し、１０％熱不活化胎仔ウシ血清（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１％抗生剤／抗真菌剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ１６４０ＧｌｕｔａＭａｘ−１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。
ＧＮＡＣ ｓｉＲＮＡを、メチル硫酸Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ； Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ＰＢＭＣ中に形質移入した。ＤＯＴＡＰを、第１に、等量のｓｉＲＮＡを含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭとの混合前に、５分にわたってＯｐｔｉ−ＭＥＭ低下血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で希釈した。ｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体を、１０〜１５分にわたって室温でインキュベートし、その後、ＰＢＭＣ（５０μＬ／ウェル）に添加し、次いで、それを３７℃、５％のＣＯ２で培養した。ｓｉＲＮＡを、１３３ｎＭの最終濃度で使用した。ＲＮＡと形質移入試薬との比率は、ＤＯＴＡＰの１μＬ当たり１６．５ピコモルであった。全ての実験において、形質移入を４連で行い、細胞プレーティングの２時間以内に実施した。培養上清を２０〜２４時間後に収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−αおよびＴＮＦ−αについてアッセイした。
サイトカインを、Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ（Ｖｉｅｎｎａ， Ａｕｓｔｒｉａ）から市販されているＩＦＮ−α（ＢＭＳ２１６ＩＮＳＴ）およびＴＮＦ−α（ＢＭＳ２２３ＩＮＳＴ）に対するＥＬＩＳＡキットを用いて、培養上清中で検出し、定量化した。
結果
表１９中のデータを、ＡＤ−５０４８で刺激されたサイトカイン反応に対する百分率として示す。ＡＤ−５０４８（陽性対照）は、ヒトアポリポタンパク質Ｂを標的とする配列に相当し（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００４）、ＩＦＮ−αおよびＴＮＦ−αの双方を誘発する。図１および図２は、ｓｉＲＮＡで形質移入後のサイトカイン誘導を示す。
試験されたｓｉＲＮＡのいずれも、ＡＤ−５０４８と比較して、ヒトＰＢＭＣ中のＩＦＮ−αおよびＴＮＦ−αの有意な発現を実証しなかった。特に、ＡＤ−２００５１およびＡＤ−２００５７は、ＨｕＰＢＭＣアッセイにおいて非免疫賦活性であることが見い出された。
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実施例６：インビトロ細胞生存率
一連のｄｓＲＮＡを、インビトロ細胞生存率に対する効果についてスクリーンした。組織培養細胞をｄｓＲＮＡで形質移入し、生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＢＬｕｅで染色し、微視的評価によって、アッセイした。
細胞培養および形質移入
生存率のために、ＯＭＭ−１．３、ＭＥＬ−２０２およびＭＥＬ−２８５細胞を、トリプシン処理によってプレートからはずされる前に、１０％のＦＢＳ、Ｐｅｎｎ／ストレプトマイシン、およびグルタミン（ＡＴＣＣ）を補充したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、５％のＣＯ２の雰囲気中において３７℃でコンフルエンスに近いところまで成長させた。９６ウェルプレート中に、ウェル当たり１０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭおよび０．２μＬのリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．カタログ番号１３７７８−１５０）と共に、ウェル当たり５μＬのｓｉＲＮＡ二本鎖に５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭを添加することによって、逆形質移入を行い、１５分にわたり室温でインキュベートした。次いで、１．０×１０３ ＯＭＭ−１．３、ＭＥＬ−２０２、またはＭＥＬ−２８５細胞を含有する抗生剤無しの８０μＬの完全成長培地を添加した。細胞を、生存率アッセイ前に、３、５、または７日間にわたってインキュベートした。実験を、１、０．１、０．０１、および０．００１ｎＭの最終二本鎖濃度で実施した。全ての形質移入を３連で行った。ｓｉＲＮＡ ＰＬＫ、およびＡＤ−１９２００を正の対照として含み（生存力の喪失をもたらす）、ＡＤ−１９５５を負の対照として含み、データ基準化のために使用した。
細胞生存率アッセイ
生存率アッセイのために、２０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒＢｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ８０８０）を、１、０．１、０．０１、または０．００１ｎＭの最終濃度で、ｓｉＲＮＡで形質移入３、５、または７日後、培養プレートの各ウェル中に添加し、混合した。形質移入され、培養された細胞、培地およびＣｅｌｌＴｉｔｅｒＢｌｕｅを含有するプレートを、１．５時間にわたってインキュベートし、次いで、５６０ｎｍ（励起）および５９０ｎｍ（発光）で、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で読み取った。
生存率を測定するために、３個の複製ウェルを平均し、バックグラウンド（培地およびＣｅｌｌＴｉｔｅｒＢｌｕｅを含有するが、細胞を含有しないウェル）から減算した。生存率は、基準化された値（ここに、ＧＮＡＱ特異的ｓｉＲＮＡまたは他の対照で形質移入された細胞が、同じ条件下で培養されたＡＤ−１９５５（非標的二本鎖）で形質移入された細胞と比較される）として表される。
結果
結果を表２０に示す。単一濃度での二本鎖のそれぞれで処置後の、単一細胞株中の３、５、および７日目の生存率を比較した結果の図式的概要を、図３、図４、図５、および図６に示す。
結果は、ＧＮＡＱ変異細胞株（例えば、ＯＭＭ１．３、ＭＥＬ２０２）に特異的であったが、ＧＮＡＱ野生型（例えば、ＭＥＬ２８５）細胞株には特異的ではなかったＧＮＡＱノックダウン後、減少したインビトロ細胞生存率を示す。特に、これらの結果を、図７および図８のグラフによって説明されるように、二本鎖ＡＤ−２００５７、ＡＤ−２００５１、ＡＤ−２００６９、およびＡＤ−２００９３について示した。
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実施例７．インビボ有効性研究
ｄｓＲＮＡを、マウス中の標的遺伝子のインビボ阻害についてスクリーンする。マウスにｄｓＲＮＡの変化量を注射する。標的遺伝子タンパク質レベルを、例えば、マウス血漿および標的遺伝子特異抗体を用いたＥＬＩＳＡを使用して、アッセイする。標的遺伝子ｍＲＮＡレベルを、例えば、マウス肝臓および分岐ＤＮＡアッセイを使用してアッセイする。そのリード候補は、用量依存的様式で、標的遺伝子タンパク質および／またはｍＲＮＡのレベルを低下するｄｓＲＮＡである。
ｄｓＲＮＡを用いたマウスの処置のための計画
単一用量ＩＶボーラス有効性研究を、試験されるそれぞれのｄｓＲＮＡに対して設計する。用量レベル、投与日数、製剤、および動物の数。マウスに、濃度の範囲、例えば、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、または６．０ｍｇ／ｋｇで、標的遺伝子特異的ｄｓＲＮＡ、対照ｄｓＲＮＡまたはＰＢＳを全身に静脈内（ｉ．ｖ．）投与し、および／または皮下投与する。
マウスを４０時間にわたって観察し、次いで２００μＬのケタミンで麻酔し、右尾動脈を切断することによって失血させる。全血を単離し、ＥＤＴＡ血漿分離管中に入れ、１０分にわたって３０００ｒｐｍで遠心分離する。血漿を単離し、アッセイまで、８０℃で貯蔵する。肝臓組織を収集し、急速冷凍し、処理まで−８０℃で貯蔵する。
処置の有効性を、（ｉ）出血前および投与後４８時間での血漿中のタンパク質の測定、（ｉｉ）投与後４８時間での肝臓中のｍＲＮＡの測定、および（ｉｉｉ）標的遺伝子特異的表現型、例えば、抗腫瘍活性の調節における有効性、を含む方法によって評価する。
マウス血漿中の標的遺伝子タンパク質のアッセイ
製造者のガイドラインに従って、標的血漿レベルを、市販の抗ＧＮＡＱ抗体、例えば、Ｇアルファｑ（Ｋ−１７）またはＧアルファｑ（Ｅ−１７）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ、カタログ番号ＳＣ−２６７９１およびカタログ番号ＳＣ−３９３）を利用するＥＬＩＳＡによって、アッセイする。
マウス肝臓中の標的遺伝子ｍＲＮＡレベルのアッセイ
標的遺伝子ｍＲＮＡレベルを、分岐ＤＮＡアッセイＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ２．０を利用して、アッセイする（Ｐａｎｏｍｉｃｓ、カタログ番号：ＱＳ００１１）。簡単に言うと、マウス肝臓試料を粉砕し、組織可溶化液を調製する。肝臓溶解混合物（最終濃度の２０ｍｇ／ｍＬに対して、１ｍｌあたり、１用量の溶解混合物、２用量のヌクレアーゼを含まない水、および１０ｕＬのプロテイナーゼ−Ｋの混合物）を、６５℃で３５分にわたってインキュベートする。次いで、２０μＬのＷｏｒｋｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ Ｓｅｔ（標的遺伝子の検出のための標的プローブおよび内在性対照のためのＧＡＰＤＨプローブ）および８０ｕＬの組織可溶化液を、捕獲プレート中に添加する。捕獲プレートを５５℃±１℃（約１６−２０時間）でインキュベートする。次の日、その捕獲プレートを、１×洗浄緩衝液（ヌクレアーゼを含まない水、緩衝液成分１および洗浄緩衝液成分２）で３回洗浄し、次いで、２４０ｇで１分にわたって、遠心分離によって乾燥する。１００ｕＬのｐｒｅ−Ａｍｐｌｉｆｅｒ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔを捕獲プレート中に添加し、アルミ箔で密閉し、５５℃±１℃で１時間にわたってインキュベートする。１時間のインキュベートに続いて、その洗浄ステップを繰り返し、次いで１００μＬのＡｍｐｌｉｆｉｅｒ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔを添加する。１時間後、その洗浄および乾燥ステップを繰り返し、１００μＬのラベルプローブを添加する。捕獲プレートを、１時間にわたって、５０℃±１℃でインキュベートする。次いで、そのプレートを１×洗浄緩衝液で洗浄し、乾燥し、１００μＬの基質を捕獲プレート中に添加する。捕獲プレートを、５〜１５分のインキュベートの後に、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して読み取る。ｂＤＮＡデータを、各３連の試料から平均バックグラウンドを減算し、３連のＧＡＰＤＨ（対照プローブ）および標的遺伝子プローブ（実験プローブ）を平均化し、次いでその比率：（実験プローブ−バックグラウンド）／（対照プローブ−バックグラウンド）を取得することによって分析する。
ＧＮＡＱ物質および方法
ＧＮＡＱ特異的ｄｓＲＮＡを、本明細書に説明されるように、脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）中に製剤化し、全身または皮下的に、肝臓に移植されたＧＮＡＱ変異ヒトブドウ膜黒色腫細胞腫瘍を有するマウスに投与し、インビボ標的ノックダウンおよび抗腫瘍活性を評価する。陽性結果を伴うｄｓＲＮＡ二本鎖をさらなる研究のために選択し、肝臓転移性のＧＮＡＱ変異ブドウ膜黒色腫を患う患者において、Ｉ／ＩＩ相試験を展開する。
実施例８．ヒトにおけるＧＮＡＱの阻害
ヒト対象を、ＧＮＡＱ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡで治療し、ＧＮＡＱ遺伝子の発現を阻害し、状態を治療する。
治療の必要な対象を選択または同定する。対象は、ブドウ膜黒色腫、皮膚黒色腫、青色母斑、太田母斑、神経内分泌腫瘍、または小細胞肺腫瘍を有することができる。
対象の同定は、臨床背景、またはいずれの場所、例えば、自己試験キットの対象自身の使用を通して、対象の家においてでも起こることができる。
時間ゼロで、適した最初の用量の抗ＧＮＡＱ ｓｉＲＮＡを対象に投与する。ｄｓＲＮＡは、本明細書で説明されるように、製剤化される。最初の投与から一定期間後、例えば、７日、１４日、および２１日後、対象の状態を、例えば、腫瘍成長の測定によって、評価する。この測定は、該対象中のＧＮＡＱ発現の測定、および／またはＧＮＡＱｍＲＮＡの成功したｓｉＲＮＡ標的化の産物に付随する。また、他の関係する判断基準も測定することができる。用量の数と強度を、対象の必要性に従って調整する。
治療後、その対象の腫瘍成長率は、治療前に存在する率と比較して、または同様に患っているが未治療の対象における測定された率と比較して、低下する。
実施例９．ＧＮＡＱｍＲＮＡ配列
ヒトＧＮＡＱ ｍＲＮＡ ＮＭ＿００２０７２．２（配列番号１７６１）
1 agggggtgcc ggcggggctg cagcggaggc actttggaag aatgactctg gagtccatca
61 tggcgtgctg cctgagcgag gaggccaagg aagcccggcg gatcaacgac gagatcgagc
121 ggcagctccg cagggacaag cgggacgccc gccgggagct caagctgctg ctgctcggga
181 caggagagag tggcaagagt acgtttatca agcagatgag aatcatccat gggtcaggat
241 actctgatga agataaaagg ggcttcacca agctggtgta tcagaacatc ttcacggcca
301 tgcaggccat gatcagagcc atggacacac tcaagatccc atacaagtat gagcacaata
361 aggctcatgc acaattagtt cgagaagttg atgtggagaa ggtgtctgct tttgagaatc
421 catatgtaga tgcaataaag agtttatgga atgatcctgg aatccaggaa tgctatgata
481 gacgacgaga atatcaatta tctgactcta ccaaatacta tcttaatgac ttggaccgcg
541 tagctgaccc tgcctacctg cctacgcaac aagatgtgct tagagttcga gtccccacca
601 cagggatcat cgaatacccc tttgacttac aaagtgtcat tttcagaatg gtcgatgtag
661 ggggccaaag gtcagagaga agaaaatgga tacactgctt tgaaaatgtc acctctatca
721 tgtttctagt agcgcttagt gaatatgatc aagttctcgt ggagtcagac aatgagaacc
781 gaatggagga aagcaaggct ctctttagaa caattatcac atacccctgg ttccagaact
841 cctcggttat tctgttctta aacaagaaag atcttctaga ggagaaaatc atgtattccc
901 atctagtcga ctacttccca gaatatgatg gaccccagag agatgcccag gcagcccgag
961 aattcattct gaagatgttc gtggacctga acccagacag tgacaaaatt atctactccc
1021 acttcacgtg cgccacagac accgagaata tccgctttgt ctttgctgcc gtcaaggaca
1081 ccatcctcca gttgaacctg aaggagtaca atctggtcta attgtgcctc ctagacaccc
1141 gccctgccct tccctggtgg gctattgaag atacacaaga gggactgtat ttctgtggaa
1201 aacaatttgc ataatactaa tttattgccg tcctggactc tgtgtgagcg tgtccacaga
1261 gtttgtagta aatattatga ttttatttaa actattcaga ggaaaaacag aggatgctga
1321 agtacagtcc cagcacattt cctctctatc ttttttttag gcaaaacctt gtgactcagt
1381 gtattttaaa ttctcagtca tgcactcaca aagataagac ttgtttcttt ctgtctctct
1441 ctctttttct tttctatgga gcaaaacaaa gctgatttcc cttttttctt cccccgctaa
1501 ttcatacctc cctcctgatg tttttcccag gttacaatgg cctttatcct agttccattc
1561 ttggtcaagt ttttctctca aatgatacag tcaggacaca tcgttcgatt taagccatca
1621 tcagcttaat ttaagtttgt agtttttgct gaaggattat atgtattaat acttacggtt
1681 ttaaatgtgt tgctttggat acacacatag tttctttttt aatagaatat actgtcttgt
1741 ctcactttgg actgggacag tggatgccca tctaaaagtt aagtgtcatt tcttttagat
1801 gtttaccttc agccatagct tgattgctca gagaaatatg cagaaggcag gatcaaagac
1861 acacaggagt cctttctttt gaaatgccac gtgccattgt ctttcctccc ttctttgctt
1921 ctttttctta ccctctcttt caattgcaga tgccaaaaaa gatgccaaca gacactacat
1981 taccctaatg gctgctaccc agaacctttt tataggttgt tcttaatttt tttgttgttg
2041 ttgttcaagc ttttcctttc ttttttttct tagtgtttgg gccacgattt taaaatgact
2101 tttattatgg gtatgtgttg ccaaagctgg ctttttgtca aataaaatga atacgaactt
2161 aaaaaataaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa
ラットＧＮＡＱ ｍＲＮＡ ＮＭ＿０３１０３６（配列番号１７６２）
1 atgactctgg agtccatcat ggcgtgctgc ctgagcgagg aggccaagga agcccggagg
61 atcaacgacg agatcgagcg gcagctgcgc agggacaagc gcgacgcccg ccgggagctc
121 aagctgctgc tgctggggac aggggagagt ggcaagagta ccttcattaa gcagatgagg
181 atcatccacg ggtcggggta ctctgatgaa gacaagaggg gctttaccaa actggtgtat
241 cagaacatct ttacagccat gcaggccatg gtcagagcta tggacactct caagatccca
301 tacaagtatg aacacaataa ggctcatgca caattggttc gagaggttga tgtggagaag
361 gtgtctgctt ttgagaatcc atatgtagac gcaataaaga gcttgtggaa tgatcctgga
421 atccaggaat gctacgatag acggcgagaa tatcagctat ctgactctac caaatactat
481 ctgaacgact tggaccgtgt ggctgaccct tcctatctgc ctacacaaca agatgtgctt
541 agagttcgag tccccaccac agggatcatt gagtacccct tcgacttaca gagtgtcatc
601 ttcagaatgg tcgatgtagg aggccaaagg tcagagagaa gaaaatggat acactgcttt
661 gaaaacgtca cctcgatcat gtttctggta gcgcttagcg aatacgatca agttcttgtg
721 gagtcagaca atgagaaccg aatggaggag agcaaagcac tctttagaac cattatcaca
781 tatccctggt tccagaactc ctctgttatt ctgttcttaa acaagaaaga tcttctagag
841 gagaaaatta tgtattccca cctagtcgac tacttcccag aatatgatgg accccagaga
901 gatgcccagg cagcacgaga attcatcctg aagatgttcg tggacctgaa ccccgacagt
961 gacaaaatca tctactcgca cttcacgtgt gccacagaca cggagaacat ccgcttcgtg
1021 tttgctgctg tcaaggacac catcctgcag ctgaacctga aggagtacaa tctggtctaa

Claims (65)

  1. ヘテロ三量体Ｇ遺伝子のＧアルファｑサブユニット（ＧＮＡＱ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ＧＮＡＱをコード化するｍＲＮＡに相補性の領域を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、それぞれの鎖が、少なくとも１５ヌクレオチド長である、二本鎖リボ核酸。
  2. 前記センス鎖は配列番号１５７９からなり、前記アンチセンス鎖は配列番号１５８０からなる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  3. 前記アンチセンス鎖は、配列番号１４２１の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  4. 前記アンチセンス鎖は、配列番号１４２１の少なくとも最初の１１個のヌクレオチドに相補的である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  5. 前記センス鎖は、配列番号１４２１または配列番号１５７９の１５個以上の連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  6. 前記アンチセンス鎖は、配列番号１４２２または配列番号１５８０の１５個以上の連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  7. 前記センス鎖配列は、配列番号１４２１を含み、前記アンチセンス鎖配列は、配列番号１４２２を含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  8. Ａ３７５細胞への０．１ｎＭの前記ｄｓＲＮＡの投与は、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定される際に、ＧＮＡＱのｍＲＮＡの発現の約６６％の阻害をもたらすか、またはＡ３７５細胞への１ｎＭの前記ｄｓＲＮＡの投与は、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定される際に、ＧＮＡＱのｍＲＮＡの発現の約６１％の阻害をもたらすか、またはＡ５７９細胞への１ｎＭの前記ｄｓＲＮＡの投与は、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定される際に、ＧＮＡＱのｍＲＮＡの発現の約８２％の阻害をもたらすか、またはＯＭＭ１．３細胞への１０ｎＭの前記ｄｓＲＮＡの投与は、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定される際に、ＧＮＡＱのｍＲＮＡの発現の約４２％の阻害をもたらすか、またはＵＭＥＬ２０２細胞への前記ｄｓＲＮＡの投与は、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定される際に、ＧＮＡＱのｍＲＮＡの発現の約８１％の阻害をもたらす、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  9. 前記ｄｓＲＮＡは、ＡＤ−２００５１であり、前記センス鎖は配列番号１５６５からなり、前記アンチセンス鎖は配列番号１５６６からなる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  10. 前記アンチセンス鎖は、配列番号１４０７の少なくとも最初の１１個のヌクレオチドに相補的である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  11. 前記アンチセンス鎖は、配列番号１４０７の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  12. 前記センス鎖は、配列番号１４０７または配列番号１５６５の１５個以上の連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  13. 前記アンチセンス鎖は、配列番号１４０８または配列番号１５６６の１５個以上の連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  14. 前記センス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１４０７を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１４０８を含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  15. Ａ３７５細胞への０．１ｎＭの前記ｄｓＲＮＡの投与は、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定される際に、ＧＮＡＱのｍＲＮＡの発現の約４９％の阻害をもたらすか、またはＡ３７５細胞への１ｎＭの前記ｄｓＲＮＡの投与は、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定される際に、ＧＮＡＱのｍＲＮＡの発現の約５５％の阻害をもたらすか、またはＡ５７９細胞への１ｎＭの前記ｄｓＲＮＡの投与は、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定される際に、ＧＮＡＱのｍＲＮＡの発現の約８３％の阻害をもたらすか、またはＯＭＭ１．３細胞への１０ｎＭの前記ｄｓＲＮＡの投与は、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定される際に、ＧＮＡＱのｍＲＮＡの発現の約４２％の阻害をもたらす、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  16. 前記ｄｓＲＮＡはＡＤ−２００５２である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  17. 前記アンチセンス鎖は、配列番号の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  18. 前記アンチセンス鎖は、配列番号の少なくとも最初の１１個のヌクレオチドに相補的である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  19. 前記センス鎖は、配列番号または配列番号の１５個以上の連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  20. 前記アンチセンス鎖は、配列番号または配列番号の１５個以上の連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  21. 前記センス鎖は、配列番号からなり、前記アンチセンス鎖は、配列番号からなる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  22. 前記ｄｓＲＮＡはＡＤ−２００６９である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  23. 前記アンチセンス鎖は、配列番号の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  24. 前記アンチセンス鎖は、配列番号の少なくとも最初の１１個のヌクレオチドに相補的である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  25. 前記センス鎖は、配列番号または配列番号の１５個以上の連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  26. 前記アンチセンス鎖は、配列番号または配列番号の１５個以上の連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  27. 前記センス鎖は、配列番号からなり、前記アンチセンス鎖は、配列番号からなる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  28. 前記ＧＮＡＱは、ＮＭ ００２０７２によってコードされるヒトＧＮＡＱである、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  29. 前記ＧＮＡＱは、ＮＭ ０３１０３６によってコードされるラットＧＮＡＱである、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  30. 前記相補性の領域は、少なくとも１５ヌクレオチド長である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  31. 前記相補性の領域は、１９〜２１ヌクレオチド長である、請求項２１に記載のｄｓＲＮＡ。
  32. 前記相補性の領域は、１９ヌクレオチド長である、請求項２１に記載のｄｓＲＮＡ。
  33. 前記相補性の領域は、表２ａ、３ａ、または４ａに記載されるアンチセンス配列のうちの１つの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  34. 前記相補性の領域は、表２ａ、３ａ、または４ａに記載されるアンチセンス配列のうちの１つからなる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  35. 前記センス鎖およびアンチセンス鎖は、表２ｂ、３ｂ、４ｂから選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  36. 前記センス鎖およびアンチセンス鎖は、表２ｃ、３ｃ、または４ｃから選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  37. 前記センス鎖およびアンチセンス鎖は、表２ｄ、３ｄ、または４ｄから選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  38. それぞれの鎖は、３０ヌクレオチド長以下である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  39. 少なくとも１つの鎖が、少なくとも１個のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  40. それぞれの鎖が、２個のヌクレオチドからなる３’オーバーハングを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  41. それぞれの鎖が、ｄＴｄＴからなる３’オーバーハングを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  42. 前記ｄｓＲＮＡに生体試料中での増加した安定性を持たせる修飾を含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  43. 前記ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  44. 前記修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド（ｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｓｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ）基と結合した末端ヌクレオチドの群から選択される、請求項４２に記載のｄｓＲＮＡ。
  45. 前記修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミダート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基の群から選択される、請求項４２に記載のｄｓＲＮＡ。
  46. 少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドおよび５’−ホスホロチオエート基を含む少なくとも１つの２’−デオキシチミジン−３’−リン酸ヌクレオチドを含む、請求項４２に記載のｄｓＲＮＡ。
  47. 前記センス鎖は、全ての２’−Ｏ−メチル修飾ピリミジンを含み、前記アンチセンス鎖は、前記ピリミジンがＡに隣接する時に、２’−Ｏ−メチル修飾ピリミジンを含み、それぞれの鎖が３’末端にｄＴｄＴを含む、請求項４２に記載のｄｓＲＮＡ。
  48. 前記センス鎖は、全ての２’−Ｏ−メチル修飾ピリミジンを含み、前記アンチセンス鎖は、前記ピリミジンがＡに隣接する時に、２’−Ｏ−メチル修飾ピリミジンを含み、それぞれの鎖が３’末端にｄＴｓｄＴを含む、請求項４２に記載のｄｓＲＮＡ。
  49. 前記センス鎖は、全ての２’−Ｏ−メチル修飾ピリミジンを含み、前記アンチセンス鎖は、ａ）前記ピリミジンがＡに隣接するか、またはｂ）前記ピリミジンがＵまたはＧに隣接するウラシルである時に、２’−Ｏ−メチル修飾ピリミジンを含み、それぞれの鎖が３’末端にｄＴｓｄＴを含む、請求項４２に記載のｄｓＲＮＡ。
  50. リガンドをさらに含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  51. 前記リガンドは、前記ｄｓＲＮＡの前記センス鎖の３’末端にコンジュゲートする、請求項５０に記載のｄｓＲＮＡ。
  52. 請求項１に記載のｄｓＲＮＡおよび医薬製剤を含む、ＧＮＡＱ遺伝子の発現を阻害するための組成物。
  53. 前記医薬製剤は、脂質製剤である、請求項５２に記載の組成物。
  54. 前記医薬製剤は、ＬＮＰ製剤、ＬＮＰ０１製剤、ＸＴＣ−ＳＮＡＬＰ製剤、ＳＮＡＬＰ製剤、またはＬＮＰ１１製剤である、請求項５２に記載の組成物。
  55. 請求項１に記載のｄｓＲＮＡを含有する、単離した細胞。
  56. 請求項１に記載のｄｓＲＮＡの少なくとも１つの鎖をコード化するヌクレオチド配列を含む、ベクター。
  57. 請求項５６に記載のベクターを含む、細胞。
  58. 前記ｄｓＲＮＡは、前記ＧＮＡＱを発現する細胞と接触すると、そのように接触しない細胞と比較して、前記ＧＮＡＱ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  59. 前記ｄｓＲＮＡは、１０ｐＭ未満のＩＣ５０を有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  60. 細胞内のＧＮＡＱ発現を阻害する方法であって、前記方法は、
    （ａ） 請求項１に記載のｄｓＲＮＡを前記細胞に導入することと、
    （ｂ） ＧＮＡＱ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るために十分な時間の間、ステップ（ａ）で産生された前記細胞を維持し、それによって、前記細胞内の前記ＧＮＡＱ遺伝子の発現を阻害することと、を含む、方法。
  61. 発現は、少なくとも２０％、４０％、６０％、または少なくとも８０％阻害される、請求項６０に記載の方法。
  62. ＧＮＡＱ発現によって媒介される疾患を治療する方法であって、かかる治療を必要とするヒトに、治療有効量の請求項１に記載のｄｓＲＮＡを投与することを含む、方法。
  63. 前記ヒトは、ブドウ膜黒色腫、皮膚黒色腫、青色母斑、太田母斑、小細胞肺腫瘍、または神経内分泌腫瘍を有する、請求項６２に記載の方法。
  64. 追加組成物を投与することをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
  65. 第２のｄｓＲＮＡを投与することをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
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