MXPA01003643A

MXPA01003643A - Produccion de adnss in vivo.

Info

Publication number: MXPA01003643A
Application number: MXPA01003643A
Authority: MX
Inventors: Charles A Conrad
Original assignee: Ingene Inc
Priority date: 1998-10-09
Filing date: 1999-10-12
Publication date: 2003-07-21
Also published as: WO2000022114A1; BR9914773A; WO2000022114A9; AU6298899A; CA2345936A1

Abstract

Métodos y composiciones para producir ADNc de un solo filamento (ADNc-ss) en células eucarióticas, específicamente un cartucho de ADN que produce ADNc-ss in vivo. El cartucho contiene el gen que codifica transcriptasa inversa/ARNasa H del virus de la leucemia en murino Moloney, un gen de endonucleasa de restricción bacteriana, y una secuencia de interés que produce una plantilla de ARN a partir de la cual la transcriptasa inversa sintetiza ADNc-ss de una secuencia especificada. El ADNc-ss es luego modificado para remover todas las secuencias de vector de flanco aprovechando la estructura de"espira de tallo"del ADNc-ss, que se forma como resultado de la inclusión de una repetición en tándem invertida que permite que el ADNc-ss se doble sobre símismo, formando un tallo de ADN de doble hélice, en la secuencia de interés. El tallo de doble hélice contiene uno o mas elementos genéticos funcionales tales como un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción y la espira, que permanece como ADN-ss, constituida por cualquier secuencia de nucleótido deseada. Este diseño permite que el tallo de doble hélice de la espira de tallo intermedia por romperse a la endonucleasa(s) de restricción correspondiente(s) específica(s) para el sitio en el tallo y la porción de espira, o secuencia de interés, sea entonces liberada como un pedazo de ADN linealizado, de un solo filamento. Este pedazo de ADN-ss liberado (o roto) contiene información de secuencia mínima, si acaso, ya sea corriente arriba de 5'o corriente abajo de 3'de la porción detallo de doble hélice previa que contiene el sitio de corte de endonucleasa de restricción. Transfecciones in vivo que usan el sistema vector de ADN descrito en la presente demuestran el uso de este sistema para producir ADN-ss en células hospeder

Description

PRODUCCION DE ADNss IN VIVO Descripción La presente invención se relaciona con una construcción de ADN estable, a la que convenientemente se hace referencia como un cartucho, adentro del cual se incorpora una secuencia de ácidos nucleicos para usarse como una plantilla para la producción subsecuente de esa secuencia en una célula anfitriona procariótica o eucariótica, y unos sistemas de vectores para la expresión de esa secuencia adentro de las células anfitrionas eucarióticas sin (o con mínimas) secuencias de flanqueo. El cartucho incluye invertida una repetición tándem que forma el tallo de un intermediario de tallo-espira que funciona in vivo para provocar la expresión de la secuencia como una secuencia de ADN de una sola cadena (ADNss) , a la que se hace referencia como la secuencia de interés. El sistema de vectores de la presente invención remueve el plásmido contiguo (u otras secuencias de vectores) de la secuencia de ADNss de interés, ya sea mediante la formación de tallo-espira con la terminación subsecuente de una reacción de transcripción inversa por medio del tallo, o mediante la disociación del intermediario de tallo-espira. El ADNss que se produce mediante este método se puede diseñar de tal manera que éste sea complementario para cualquier secuencia de ácidos nucleicos endógena objetivo.

Hasta donde se sabe, no hay ningún método disponible para producir especies de ácido desoxirribonucleico de una sola cadena (ADNss) en células eucarióticas, que no contienen secuencias de vectores interpuestas y/o flanqueadoras . La literatura científica y de patentes incluye la descripción de vectores productores de ADNc (ver A. Ohshima, y colaboradores, 89 Proc. Nati. Acad. Sci . USA 1016-1020 (1992); S. Inouye, y colaboradores, 3 Current Opin. Genet. Develop. 713-718 (1993); O. Mirochnitchenko, y colaboradores, 269 J. 3iol. Chem. 2380-2383 (1994); J. R. Mao, y colaboradores, 270 J. Biol. Chem. 19684-19687 (1995); y las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,436,141 y 5,714,323), pero los sistemas descritos en estas referencias no parecen haber demostrado la habilidad para producir ADNss en células eucarióticas sin intervenir las secuencias de vectores que puedan interferir con la función pretendida del producto ADNss . Es por lo tanto un objetivo de la presente invención proporcionar un método para producir ácido nucleico de una sola cadena en levadura, células procarióticas y/o eucarióticas, que supera esta limitación por medio de proporcionar un método, y una construcción de ADN que dirige la síntesis del ADNss de cualquier secuencia de nucleótidos deseada in vivo, sin bases de nucleótido interpuestas o flanqueadoras indeseables. El ADNss puede ser (pero ni se limita a) un ácido nucleico inhibidor tal como una secuencia anti-sentido para fijación al ARNm de una manera anti-sentido para regular descendentemente un producto genético o un producto genético viral de interés, o para fijación al dúplex (ADN nativo) para formar estructuras triples que puedan interferir con la transcripción y regulación de genes normales. El ADNss producido de esta manera también puede funcionar para interrumpir una o más de muchas funciones celulares altamente reguladas. Por ejemplo, se pueden alterar las colas del ADNss de repeticiones teloméricas, por medio de la producción de un ADNss que tenga composición de base de nucleótido idéntico o complementaria a la secuencia del ADN nativo en las repeticiones teloméricas u otra secuencia reguladora. Este objetivo, y los muchos otros que serán evidentes para aquellos técnicos en la materia, por la siguiente descripción de muchas modalidades de la invención, se consiguen por medio de proporcionar un cartucho , o construcción de ácido nucleico, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos, que comprende una secuencia de interés flanqueada por repeticiones tándem invertidas, un gen que codifica una polimerasa de ADN dependiente del ARN, y un gen que codifica una endonucleasa de restricción. El cartucho también incluye de preferencia un gen que codifica un NRasa H y promotor (es) /mej orador (es) eucarióticos ya sea constitutivos o que se pueden inducir para la polimerasa de ADN dependiente del ARN y los genes de endonucleasa de restricción. La invención también contempla que el cartucho esté incorporado dentro de un plásmido, y que el plásmido esté incorporado dentro de una célula anfitriona adecuada. En otro aspecto, la presente invención comprende un método para producir ADN de una sola cadena in vivo, que comprende los pasos de transcripción y traslación de un cartucho que comprende un gen de polimerasa de ADN dependiente del ARN, y una secuencia de interés, en una célula eucariótica, y la conversión del transcrito de ARNm de la secuencia de interés a ADNc, con la polimerasa producida por el gen de polimerasa de ADN dependiente del ARN, con la digestión simultánea de la plantilla del componente de ARNm con una enzima expresada de NRasa H. La secuencia de interés incluye además una repetición tándem invertida. El cartucho también puede incluir un gen de endonu-cleasa de restricción que, cuando se transcribe o traslada, produce una endonucleasa de restricción que hace lineal al transcrito de la secuencia de interés, por medio de cortar el ADN-ss en el sitio de la endonucleasa de restricción formado cuando la repetición tándem invertida provoca que el transcrito forme un intermediario de tallo-espira. En otro aspecto, la presente invención comprende un método para producir un oligonucleótido de una sola cadena en una célula objetivo. En una modalidad, se pretende que este método envié una secuencia anti-sentido . En otras modalidades, el método se usa para enviar secuencias formadoras de triples, o secuencias que sean reconocidas y se fijen mediante proteínas de fijación de ADN específicas, u otros ácidos nucleicos y/o proteínas que funcionen en el metabolismo y/o la réplica celular. El método comprende la codificación del oligonucleótido en una secuencia de interés complementaria, en un cartucho que incluya un gen que codifique para una polimerasa de ADN dependiente del ARN, que incluya de preferencia un gen de NRasa H, y un promotor/mej orador eucariótico que se pueda inducir o constitutivo, apropiado para ese gen de polimerasa/NRasa H. El cartucho incluye un gen que codifica una endonucleasa de restricción (RE) y, en la modalidad preferida, un promotor/mej orador apropiado para ese gen RE. El cartucho comprende adicionalmente una repetición tándem invertida y, cuando se asimila dentro de la célula objetivo, la célula transcribe el cartucho (incluyendo la secuencia de interés y las repeticiones tándem invertidas), bajo el control del (os) promotor (es) /mejorador (es) . La función normal de la célula objetivo provoca que se traslade el transcrito de ARNm resultante de la polimerasa y los genes RE, proporcionando todo lo que sea necesario para la producción de ADN-ss a partir del transcrito de ARNm de la secuencia de interés. Específicamente, la polimerasa de ADN dependiente del ARN producida a partir del cartucho, convierte el transcrito de ARNm de la secuencia de interés, y las repeticiones tándem invertidas a ADNc-ss, el ADNc-ss forma un intermediario de tallo-espira como las bases del nucleótido que comprenden las repeticiones tándem invertidas en pares, y la endonucleasa de restricción producida a partir del gen RE en el cartucho digiere la porción de cadena doble del intermediario de tallo-espira, para liberar el oligonucleótido de ADN de una sola cadena de la porción de ciclo del intermediario de tallo-espira. Se pueden usar múltiples sistemas para enviar el cartucho a la célula objetivo, para dirigir la síntesis del ADNss adentro de la célula, incluyendo sistemas de plásmidos o de vectores basados en plásmidos, o sistemas de vectores basados en virus, y estos sistemas se adaptan para ese propósito de conformidad con un técnico practicante. Estos sistemas incluyen, pero no están limitados a, sistemas basados en virus tales como adenovirus, virus adeno-asociados , vectores retrovirales, y vectores conjugados que usan sistemas de transfección basados en ADN de plasma de doble cadena. Una vez adentro de la célula, el cartucho se transcribe en el curso normal del metabolismo celular, produciendo un transcrito de ARNm de la secuencia de interés, que se convierte entonces a ADNc por medio de la transcriptasa inversa, la cual es producida igualmente por la célula a partir de la transcriptasa inversa/gen NRasa H, incluido en el cartucho, bajo el control del promotor. De conformidad con la presente invención, se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una repetición tándem invertida, un sitio de fijación de cebador para una transcriptasa inversa localizado en una posición 3 con respecto a la repetición tándem invertida, y una secuencia de interés localizada ya sea entre la repetición tándem invertida, o entre la repetición tándem invertida y el sitio de fijación del cebador 3'.

La construcción de ácido nucleico de a presente invención permite que se produzca de manera confiable y de manera estable una secuencia de ácidos nucleicos de una sola cadena en una célula objetivo. En particular, la repetición tándem invertida se puede usar para crear un intermediario de tallo-espira de ácido nucleico, para producir y/o controlar la producción de ADNss in vivo, con secuencias de nucleótidos contiguas reducidas o eliminadas. Debido a la configuración de la construcción de ácido nucleico, con el sitio de fijación de cebador en una posición que sea 3 ' a la secuencia de interés, no hay limite para el tamaño o el tipo de secuencia de interés que se pueda producir usando la construcción de ácido nucleico de la presente invención, y la construcción se puede incorporar fácilmente dentro de un vector para envió mediante cualquier ruta deseada a una célula objetivo. En donde la secuencia de interés está localizada entre la repetición tándem invertida, la repetición tándem invertida es, de preferencia, capaz de formar un intermediario de tallo-espira, con la secuencia de interés en la espira, y la repetición tándem invertida formando el tallo. Una ventaja de esta estructura de tallo-espira es que la secuencia de interés se puede liberar de la espira como un ADNc de una sola cadena, con flanqueo reducido o eliminado y/o secuencias de vectores interpuestas, por medio de cortar la espira en donde ésta se une en el tallo. El ADNss asi obtenido está libre o sustancialmente libre de cualesquier secuencias de nucleótidos interpuestas y/o flanqueadoras, por ejemplo, secuencias de nucleótidos de vector, que pudieran interferir con la función pretendida del producto ADNss. Donde una secuencia de interés está localizada entre la repetición tándem invertida, se puede proporcionar adicionalmente una segunda secuencia de interés entre la repetición tándem invertida y el sitio de fijación de cebador 3'. Esta modalidad de la invención tiene la ventaja de que la repetición tándem invertida se puede seleccionar para producir tallos-espiras de diferentes estabilidades, por medio de lo cual se pueden conseguir cantidades variables de lectura a través del transcrito ARNm, o la terminación temprana de la transcripción, proporcionando mediante lo mismo un método para regular la producción de dos o más secuencias de interés mediante el doblado secundario del transcrito ARNm intermediario. De preferencia, la repetición tándem invertida comprende una o más secuencia (s) de reconocimiento de enzimas especifica ( s ) . De más preferencia, la secuencia de reconocimiento de enzimas especifica comprende un sitio de endonucleasa de restricción. Al sitio de endonucleasa de restricción ya sea lo puede reconocer una endonucleasa de restricción endógena, o la construcción de ácido nucleico de la presente invención puede comprender adicionalmente un gen que codifique una endonucleasa de restricción para ese sitio de endonucleasa de restricción. En el caso de que la construcción de ácido nucleico comprenda adicionalmente un gen de endonucleasa de restricción, el gen de endonucleasa de restricción está localizado, de preferencia, en una posición 5' con respecto a la repetición tándem invertida. La secuencia de reconocimiento de enzima especifica puede incluir, por ejemplo, los sitios de restricción ya sea Hind III y Not I, Hind III, o Not I. De hecho, la secuencia de reconocimiento de enzima especifica puede ser cualquiera de una endonucleasa de restricción tipo I, endonucleasa tipo II, endonucleasa tipo III, reconocimiento de receptor eucariótico, reconocimiento de receptor procariótico, promotor, promotor/mejorador, y sitio PCR voladizo en T, o combinaciones de los mismos. Donde la secuencia de interés está localizada entre la repetición tándem invertida y el sitio de fijación de cebador 3', o donde una primera secuencia de interés está localizada entre la repetición tándem invertida, y una segunda secuencia de interés está localizada entre la repetición tándem invertida y el sitio de fijación de cebador 3', la repetición tándem invertida es, de preferencia, capaz de formar un tallo-espira estable, un tallo-espira inestable o un tallo-espira de estabilidad intermedia. Las repeticiones tándem invertidas se seleccionan para formar un tallo-espira estable en el transcrito ARNm como un medio para provocar la terminación prematura de la transcripción, de tal manera que si una secuencia de interés está localizada en el transcrito de ARNm entre el sitio de inicio para la transcripción inversa y la estructura de tallo-espira, se pueda producir nuevamente ADNss sustancialmente libre de secuencias de vectores contiguas . La(s) repetición (es) doble(s) invertida(s) de la presente invención permiten el uso de una estructura de tallo-espira como un vehículo para remover las secuencias de nucleótidos contiguas no deseadas, por ejemplo, ya sea por medio de provocar la terminación prematura de la transcripción inversa de los transcritos de ARNm, o por medio de cortar las secuencias no deseadas del ADNc por medio de sitios de endonucleasa de restricción en las repeticiones tándem invertidas . De conformidad con otra modalidad preferida de la presente invención, la repetición tándem invertida puede comprender uno o más sitios de fijación de ADN de proteína eucariótico, procariótico, y/o viral. La estructura de tallo-espira de la presente invención, por lo tanto, tiene la ventaja adicional de que ésta también puede servir como una entidad funcional en ella misma, por ejemplo, para proteger el ADNss en la espira de degradación por nucleasas intracelulares, o para realizar ciertas aplicaciones por medio de elementos funcionales (por ejemplo, sitios de fijación de proteína) en las repeticiones tándem invertidas. De preferencia, la repetición tándem invertida actúa de la manera orientada a cis. El sitio de fijación de cebador puede ser específico para una transcriptasa inversa endógena (por ejemplo, en el caso de una célula infectada con el virus de inmunodeficiencia humano o el virus de inmunodeficiencia simiesco) . Alternativamente, la construcción de ácido nucleico puede comprender adicionalmente un gen que codifique una transcriptasa inversa. El gen de transcriptasa inversa está localizado, de preferencia, en una posición 5', con respecto a la repetición tándem invertida. Alternativamente, la construcción de ácido nucleico puede comprender adicionalmente un gen que codifique una poliproteina de transcriptasa inversa/ARNasa H. El gen de poliproteina de transcriptasa inversa/ARNasa H está localizado, de preferencia, en una posición 5 , con respecto a la repetición tándem invertida. El gen de poliproteina de transcriptasa inversa/ARNasa H se puede derivar del virus de leucemia murino de Moloney, el virus de inmunodefi-ciencia humano, o el virus de inmunodeficiencia simiesco. En el caso de que la construcción de ácido nucleico de la presente invención se proporcione con un gen de transcriptasa inversa o de poliproteina de transcriptasa inversa/ARNasa H, el sitio de fijación de cebador es, de preferencia, especifico para la transcriptasa inversa o para la poliproteina de transcriptasa inversa/ARNasa H codificadas por sus respectivos genes. De preferencia, el ácido nucleico de la presente invención comprende además un promotor y, opcionalmente, un mejorador para cada una de la primera o la segunda secuencia de interés, esa endonucleasa de restricción, la transcriptasa inversa y/o el gen de transcriptasa inversa/ARNasa H.

De más preferencia, el promotor y/o mejorador es un promotor/mej orador eucariótico. El promotor puede ser un promotor constitutivo, que se puede inducir de amplio espectro, o especifico al tejido. De preferencia, la construcción de ácido nucleico de la presente invención comprende adicionalmente una secuencia de cola de poliadenilación, localizada en una posición 3' con respecto al sitio de fijación de cebador 3'. La cola de poliA permite la estabilización del transcrito ARNm. De preferencia, la primera o segunda secuencia de interés incluye una secuencia que codifica un ADN de una sola cadena que tiene actividad enzimática. Un ejemplo de ese ADN de una sola cadena que tiene actividad enzimática comprende la secuencia 5'-GGCTAGCTACAACGA-3 ' , que tiene actividad de ARNasa. Esta secuencia está flanqueada en ambas direcciones 5' y 3' por una o más secuencia (s) que son complementarias a una especie de ARNm objetivo, por ejemplo, cinasa h-ras, c-raf, secuencia anti-sentido al factor de crecimiento angiogénico pleiotrófino, o la región tat del virus de inmunodeficiencia simiesco. De preferencia, el sitio de fijación de cebador es complementario a un ARN de transferencia (ARNt) . De preferencia, la construcción de ácido nucleico es ADN. La construcción de ácido nucleico de la presente invención proporciona asi un sistema eficiente para dirigir la síntesis de una secuencia de ácidos nucleicos de una sola cadena, estable, tanto in vivo como in vitro. La secuencia de ácidos nucleicos se puede usar para proporcionar un efecto deseado en una célula, tejido u organismo. Debido a que la producción de la secuencia de ácidos nucleicos de una sola cadena de interés tiene lugar adentro de la célula, se superan, o cuando menos se mitigan los problemas de la técnica anterior que surgen por el envió de la secuencia de ácidos nucleicos de una sola cadena a la célula. También se proporciona un transcrito de ARNm de la construcción de ácido nucleico de la presente invención. De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un transcrito de ARNm que comprende una secuencia de interés flanqueada por una repetición tándem invertida, y que comprende además un sitio de fijación de cebador localizado en 3' a la repetición tándem invertida. De conformidad con este aspecto de la presente invención, también se proporciona un transcrito de ARNm que comprende una repetición tándem invertida y un sitio de fijación de cebador localizado en 31 a la repetición tándem invertida, y una secuencia de interés localizada entre la repetición tándem invertida y el sitio de fijación de cebador 3' . De conformidad con este aspecto de la presente invención, se proporciona adicionalmente un transcrito de ARNm que comprende una primera secuencia de interés flanqueada por una repetición tándem invertida, un sitio de fijación de cebador localizado en 3' con respecto a la repetición tándem invertida, y una segunda secuencia de interés entre la repetición tándem invertida y el sitio de fijación de cebador 3'. Además se proporciona un transcrito de ADN de una sola cadena del ARNm de la presente invención. También se proporciona un vector que comprende una construcción de ácido nucleico de conformidad con la presente invención . Las construcciones de ácido nucleico de la presente invención son tales que éstas pueden estar incorporadas en vectores de envío comercialmente disponibles para propósitos terapéuticos de mamíferos y humanos, y se pueden administrar mediante cualquier ruta factible, dependiendo de la célula objetivo. De conformidad con la presente invención, también se proporciona un vector que comprende una repetición tándem invertida, un sitio de fijación de cebador para una transcriptasa inversa localizado en una posición 3' con respecto a la repetición tándem invertida, y un sitio de inserción para una secuencia de interés entre la repetición tándem invertida, o entre la repetición tándem invertida y el sitio de fijación de cebador. De preferencia, el vector comprende un primer sitio de inserción entre la repetición tándem invertida, y un segundo sitio de inserción entre la repetición tándem invertida y el sitio de fijación de cebador 3'. Esto le permite al usuario insertar cualquier secuencia de interés deseada adentro de cualquiera o de ambos de los sitios de inserción. Debido a la configuración de la construcción de ácido nucleico, con el sitio de fijación de cebador en una posición que está a 3' a la repetición tándem invertida, no hay ningún límite en el tamaño o el tipo de la secuencia de interés que se puede insertar adentro del sitio de inserción. De preferencia, el vector comprende adicionalmente un gen que codifica una transcriptasa inversa, o un gen que codifica una poliproteína de transcriptasa inversa/ARNse H. De preferencia, el gen de transcriptasa inversa o de poliproteína de transcriptasa inversa/ARNse H está localizado en una posición 5' con respecto a la repetición tándem invertida. De conformidad con la presente invención, se proporciona adicionalmente un sistema de vectores, que comprende un primer vector de conformidad con la presente invención, (es decir, un vector que comprende una repetición tándem invertida, un sitio de fijación de cebador para una transcriptasa inversa localizado en una posición 3' con respecto a la repetición tándem invertida, y un sitio de inserción para una secuencia de interés entre la repetición tándem invertida, o entre la repetición tándem invertida y el sitio de fijación de cebador) , y un segundo vector que comprende un gen que codifica una transcriptasa inversa, una poliproteína de transcriptasa inversa/ARNasa H, o una poliproteína de transcriptasa inversa/ARNasa H enlazada por medio de un enlazador rico en prolina a una endonucleasa de restricción. El vector o sistema de vectores de la presente invención también se pueden diseñar para permitir que se remueva e intercam-bie el sitio de fijación de cebador, de tal manera que se puedan usar diferentes sitios de fijación de cebador, dependiendo de los requerimientos del usuario y la especificidad de la transcriptasa inversa que se esté usando. De preferencia, el gen de transcriptasa inversa, poliproteina de transcriptasa inversa/ARNasa H, o transcriptasa inversa/ARNasa H/endonucleasa de restricción, está operablemente enlazado a una secuencia de control de expresión. El vector o sistema de vectores de la presente invención se pueden emplear convenientemente para enviar una secuencia antisentido, sentido, triple, o cualquier otra secuencia de nucleótidos de una sola cadena de interés, dentro de una célula, usando técnicas de digestión y ligación conocidas para empalmar la secuencia de interés dentro del vector. El vector o sistema de vectores descrito en la presente proporciona todas las instrucciones de señalización y funciones enzimáticas necesarias para permitir que una célula anfitriona produzca una molécula de ácido nucleico de una sola cadena que tenga una secuencia deseada. También se proporciona una célula anfitriona establemente transformada o transfectada con un vector o sistema de vectores de conformidad con la presente invención. En particular, la célula anfitriona puede ser una célula eucariótica o procariótica . Las células eucarióticas incluyen células de levadura, planta y mamífero. Las células procarióticas incluyen células bacterianas. De conformidad con la presente invención, se proporciona adicionalmente un estuche para producir una secuencia de ácidos nucleicos de una sola cadena, estuche que comprende un vector o sistema de vectores de conformidad con la presente invención, y una endonucleasa de restricción para cada sitio de inserción. De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un estuche para producir una secuencia de ácidos nucleicos de una sola cadena, estuche que comprende un vector o sistema de vectores de conformidad con la presente invención, un recipiente para el vector/sistema de vectores, e instrucciones para el uso del vector/sistema de vectores. De conformidad con la presente invención, también se proporciona un método in vivo o in vitro para producir una secuencia de ácidos nucleicos de una sola cadena de interés, método que comprende los pasos de introducir una construcción de ácido nucleico de conformidad con la presente invención, dentro de una célula objetivo, transcribir la construcción de ácido nucleico dentro del ARNm, y transcribir a la inversa el transcrito de ARNm dentro del ADNc. De preferencia, el método también comprende el paso de remover el transcrito de ARNm del heterodúplex ARNm/ADNc, formado por la transcripción inversa del ARNm. La transcripción inversa se puede realizar ya sea mediante una transcriptasa inversa que sea endógena a la célula objetivo, o el método de la presente invención puede comprender además el paso de introducir un gen que codifique una transcriptasa inversa, o un gen que codifique una poliproteína de transcriptasa inversa/ARNasa H, dentro de la célula objetivo. De preferencia, el método de la presente invención comprende además el paso de hacer lineal el transcrito de ADNc de la secuencia de interés, por medio de cortar la estructura de tallo-espira del ADNc, formada por la repetición tándem invertida en donde la estructura de espira se une al tallo. De conformidad con esta última modalidad de la presente invención, el método comprende adicionalmente el paso de introducir un gen que codifique una endonucleasa de restricción dentro de la célula objetivo. Por medio de proporcionar uno o más sitios de endonucleasa de restricción en la repetición tándem invertida, la endonucleasa de restricción expresada mediante el gen de endonucleasa de restricción se puede usar entonces para cortar la estructura de tallo-espira del ADNc. Alternativamente, el corte de la estructura de tallo-espira del ADNc puede depender de las endonucleasas de restricción que sean endógenas a la célula objetivo. La endonucleasa de restricción también se puede proporcionar mediante el paso de introducir un gen que codifique una poliproteína de transcriptasa inversa/ARNasa H, enlazada por medio de un enlazador rico en prolina, a una endonucleasa de restricción dentro de la célula objetivo. Donde la secuencia de ácidos nucleicos de una sola cadena se prepara mediante un método in vivo de la presente invención, el método puede comprender adicionalmente el paso de aislar el transcrito de ARNm, el heterodúplex de ARNm/ADNc y/o el ADNc de una sola cadena de la célula objetivo. También se proporciona un transcrito de ADNc de una sola cadena, una molécula de ácido nucleico inhibidora (por ejemplo, una secuencia anti-sentido o aptámero) , un ADN de una sola cadena que tenga actividad enzimática (por ejemplo, actividad de ARNasa) , un transcrito de ARNm y/o una molécula heterodúplex producida mediante los métodos de la presente invención. Una molécula de ácido nucleico inhibidora puede ser ADN de una sola cadena sintetizado a partir del transcrito de ARNm, o el transcrito de ARNm mismo, que se puede fijar específicamente a una secuencia de ácidos nucleicos complementaria. Esas moléculas de ácido nucleico inhibidoras pueden ser secuencias "sentido" o "antisentido", y son particularmente útiles para regular la función de genes. Una molécula de ácido nucleico inhibidora también puede ser un oligonucleótido que se fije específicamente a una biomolécula, por ejemplo, trombina, bradiquinina o PGF2a, que normalmente no se fija al ARN ni al ADN. " De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una construcción de ácido nucleico, el vector o sistema de vectores, o la célula anfitriona de conformidad con la presente invención, junto con un auxiliar, diluyente o portador farmacológicamente aceptable .

De conformidad con la presente invención, se proporciona una construcción de ácido nucleico, vector o sistema de vectores, o célula anfitriona de conformidad con la presente invención, para usarse en terapia, especialmente para usarse en el envío de una molécula de ácido nucleico inhibidora a una célula anfitriona. La construcción de ácido nucleico, el vector o sistema de vectores y la célula anfitriona de la presente invención son particularmente útiles para aliviar una condición patológica mediante la regulación de la expresión de genes. De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se proporciona adicionalmente el uso de una construcción de ácido nucleico, vector o sistema de vectores, o célula anfitriona de conformidad con la presente invención, para la fabricación de un medicamento para aliviar una condición patológica mediante la regulación de la expresión de genes, especialmente para aliviar una condición patológica mediante el envío de una molécula de ácido nucleico inhibidora a una célula objetivo. También se describen otros usos. Los conjuntos de elementos genéticos, vectores, sistemas de vectores y células anfitrionas de la presente invención se pueden usar para el tratamiento profiláctico o terapéutico de un amplio rango de condiciones o enfermecades, particularmente condiciones o enfermedades que sean provocadas por la expresión anormal o alterada de genes, o condiciones o enfermedades que se puedan aliviar mediante la regulación de la expresión de genes.

Los conjuntos de elementos genéticos, vectores, células anfitrionas, estuches y métodos de la presente invención se pueden usar para producir moléculas de ácido nucleico de una sola cadena, o virtualmente cualquier composición base de nucleótido definida previamente o deseada en una célula anfitriona, y se pueden adaptar y aplicar a cualquier sistema in vivo o in vitro. De conformidad con una modalidad preferida, la construcción de ácido nucleico de la presente invención es un producto artificialmente sintetizado, recombinante, quimérico, y/o heterólo-go, y la secuencia de interés puede ser extraña a la célula en la cual se produce ésta. Las muchas modalidades de la invención se ilustran en las figuras en las que la Figura 1 es una ilustración esquemática de la producción de ADNc-ss en una célula anfitriona, de conformidad con la presente invención. La Figura 2 es una ilustración esquemática del intermediario de tallo-espira formado mediante el método que se ilustra en la Figura 1. La Figura 3A es una representación esguemática de la fijación de una secuencia anti-sentido, producida de conformidad con la presente invención, que incorpora la enzima ADN 10-23 que se fija a un ARNm objetivo, y la disociación subsecuente del ARNm objetivo. La Figura 3B es una representación agrandada de la fijación de la secuencia anti-sentido de la Figura 3A al ARNm objetivo, mostrando la interacción de la enzima ADN 10-23 (incluida en una secuencia de ácidos nucleicos inhibidora generalizada) con el sitio de disociación del ARNm objetivo. La Figura 4 es un mapa esquemático del plásmido ADNpss-Express A construido de conformidad con la presente invención. Las Figuras 5A, 5B, y 5C representan un mapa esquemático del plásmido ADNpss-Express B construido de conformidad con la presente invención, una porción agrandada del plásmido ADNpss-Express B, y la secuencia de la región de inserción del plásmido ADNpss-Express B, respectivamente. Las Figuras 6A y 6B representan la secuencia de las regiones de inserción entre los sitios Apa I y Nhe I de los plásmidos pTest y pTelo construidos a partir del plásmido ADNpss-Express B, de conformidad con la presente invención. La Figura 7A es un mapa esquemático del plásmido de partida ADNpc3.1Zeo+ (Invitrogen, Inc.) para el plásmido ADNpc3. lZeo+/NM-link2-gag/ADNpss-Express-4B construido de conformidad con la presente invención. La Figura 7B es un mapa esquemático de ADNpc3. lZeo+/NM-link2-gag (también designado pssADN-Express-4B) . La Figura 7C es una representación esquemática de los sitios de clonación, las repeticiones invertidas, y la región PBS (flecha) para ADNpc3. lZeo+/NM-link2-gag/ADNpss-Express-4B . La Figura 7D es un mapa de secuencia de los sitios de clonación, las repeticiones invertidas, y la región PBS (flecha) para ADNpc3. lZeo+/NM-link2-gag/ADNpss-Express-4B . La Figura 8A es un mapa esquemático del plásmido ADNpss-Express A construido de conformidad con la presente invención. La Figura 8B es un mapa esquemático del plásmido ADNpss-Express A después de la supresión del gen Mbo II mediante digestión con Xma I y Sac II. La Figura 9A es un mapa esquemático del plásmido ADNpss-Express-C construido de conformidad con la presente invención. La Figura 9B es una representación esquemática de los sitios de clonación, las repeticiones invertidas, y la región PBS (flecha) para el plásmido ADNpss-Express-C . la Figura 9C es un mapa de secuencia de los sitios de clonación, las repeticiones invertidas, y la región PBS (flecha) para el plásmido ADNpss-Express-C. La Figura 10A muestra la secuencia parcial del 23avo codón de la secuencia de fijación anti-sentido h-ras, con la secuencia de la enzima ADN 10-23 insertada entre las secuencias complementarias 5' y 3'. La Figura 10B muestra la secuencia parcial de la secuencia de fijación anti-sentido de cinasa c-raf, con la secuencia de la enzima ADN 10-23 insertada entre las secuencias complementarias 5' y 3'. La Figura 10C muestra la secuencia parcial de la secuencia de fijación anti-sentido de pleiotrofina, con la secuencia de la enzima ADN 10-23 insertada entre las secuencias complementarias 5' y 3'. La Figura 10D muestra la secuencia parcial de la región de fijación anti-sentido tat de la secuencia SIV, con la secuencia de la enzima ADN 10-23 insertada entre las secuencias complementarias 5 ' y 3 ' . Las figuras 11A y 11B son geles que muestran los resultados de los ensayos de transcriptasa inversa de PCR (J. Silver, y colaboradores, 21 Nucleic Acids Res . 3593-3594 (1993)) en extractos de ARN/ADNss de lineas celulares HeLa, transformadas con el plásmido pTest construido de conformidad con la presente invención. Carriles, Figura 11A: (1) marcadores de tamaño, (2) células HeLa sin transformar, (3) células HeLa transformadas con el vector ADNpc3. lZeo+, (4) células HeLa transformadas con pssXa, (5) control positivo que contiene 2 miliunidades de transcriptasa inversa MoMuLV, y (6) control negativo que no contiene ningún extracto de proteina. La flecha indica el producto de amplificación de 150 pares de base. Carriles, Figura 11B: (1) clona A12, (2) B8, (3) B12, (4) D7, (5) control positivo que contiene 2 miliunidades de transcriptasa inversa MoMuLV, y (6) control negativo que no contiene ningún extracto de proteina. La Figura 12 son geles que muestran la amplificación PCR del ADN de una sola cadena de extractos de lineas celulares HeLa transformadas con el plásmido pTest construido de conformidad con la presente invención. Se usaron preparaciones de ARN/ADNss como plantillas en reacciones PCR, usando cebadores específicos al producto ADNss esperado. Panel izquierdo, carriles 1-3: plantilla PCR de ARN/ADNss total aislada de la colonia Al2 establemente transformada (línea celular HeLa estable transfectada con el plásmido ADNpss-Express-A) (1) usada sin ningún tratamiento previo, (2) tratada con nucleasa SI, (3) tratada con ARNasa A. Carril (4) ARN/ADNss total de una colonia establemente transformada con el vector ADNpc3. lZeo+ solo. Panel derecho, carriles 1-3: plantilla PCR de ARN/ADNss total aislada de la colonia B12 establemente transformada (línea celular HeLa establemente transfectada con el plásmido ADNpss-Express-A) (1) usada sin ningún tratamiento previo, (2) tratada con nucleasa SI, (3) tratada con ARNasa A. Carril (4) ARN/ADNss total de una colonia establemente transformada con el vector ADNpc3.1Zeo+ solo. Carril (5) , plantilla de control positivo, plásmido pTest. La Figura 13 es un gel que muestra la amplificación PCR de ADN de una sola cadena de extractos de células transformadas con el plásmido pTelo construido de conformidad con la presente invención. Se cosechó el ARN/ADNss de los cultivos de células transfectadas, a las 36 horas después de la transíección, y se usaron como plantillas para las reacciones PCR, usando cebadores específicos al producto ADNss esperado. Se usó el marcador de carril de 25 pares de base. Carriles 1-5 con aislamiento de la línea celular HeLa A12, (1) fracción de ARN/ADNss total, (2) ARN total tratado con nucleasa SI, (3) ARN total tratado con ARNasa A, (4) control negativo, (5) plásmido de ADN de telómero de control positivo. Carriles 6-9, ARN aislado de la línea celular B12, (6) fracción de ARN/ADNss total, (7) ARN total tratado con nucleasa SI, (8) ARN total tratado con ARNasa A, (9) control negativo, (10) plásmido de ADN de telómero de control positivo. Carriles 11-12, controles negativos de repetición. Gel de acrilamida al 8 por ciento a 45 V durante 20 minutos.

La Figura 14 es un gel que muestra el truncamiento de la transcripción de ADNc-ss y los productos de lectura mediante la reacción de transcriptasa inversa in vitro. Los carriles 1-5 representan las construcciones de plásmido con estructuras de tallo-espira construidas de conformidad con la presente invención, y diferentes secuencias de interés clonadas adentro de la región de espira. La plantilla de ARN se produjo mediante transcripción in vitro con la polimerasa de ARN T7 bajo condiciones estándares, después se trató con ADNasa para remover la plantilla del plásmido. Después se transcribieron a la inversa grupos de ARN extraído por fenol/cloroformo, con transcriptasa inversa de Moloney de ratón, se trataron con ARNasa A durante 15 minutos, y se resolvieron sobre un gel de acrilamida al 6 por ciento a 45 V durante 30 minutos. Marcador de 25 pares de base en las orillas. (1) Reacción RT de 10 µ? del plásmido original ADNpss-Express-B construido de conformidad con la presente invención, (2) reacción RT de 10 µ? del plásmido original pTest construido de conformidad con la presente invención, (3) reacción RT de 10 µ? del plásmido original pTelo construido de conformidad con la presente invención, (4) plásmido de control negativo ADNpc-Zeo ( Invitrogen) , (5) repetición de 3 µ? ADNpss-Express-B . La Figura 15 muestra una mancha Northern de un vector productor de anti-sentido, construido de conformidad con la presente invención, que produce una secuencia anti-sentido contra la cinasa c-raf (Figura 10B) , y que incluye la "enzima ADN 10-23" después de la transfección del plásmido ADNpss-Express-C (Figura 9) que incluye esa secuencia dentro de una linea celular de cáncer de pulmón in vi tro. En esta descripción de las modalidades preferidas de la presente invención, los métodos y las construcciones de ácido nucleico, se describen para usarse para producir oligonucleótidos de ácido desoxirribonucleico de una sois cadena (ADNc-ss) de virtualmente cualquier composición base de nucleótidos definida previamente o deseada in vitro, en levadura, células procarióti-cas, y/o células eucarióticas, con o sin secuencias de nucleótidos flanqueadoras . Se describen métodos y construcciones que usan la síntesis biológica más bien que la síntesis in vitro, o artificial del ADN-ss de la composición base de nucleótidos deseada. Debido a que se usan reacciones biológicas, es decir, enzimáticas en estos métodos, éstos se pueden aplicar a cualquier sistema in vivo. Se diseñó un sistema de vectores (como se usa en la presente, el término "vector" se refiere a un plásmido o construcción viral modificada para enviar y manipular segmentos de ADN de interés) para producir cualquier secuencia de ADN como una molécula de ADNc-ss, libre de la mayoría de las secuencias de vectores contiguas, adentro de células de levadura, procarióti-cas, y/o eucarióticas. El sistema de vectores contiene todas las funciones enzimáticas e instrucciones de señalización necesarias para habilitar a la célula anfitriona a la cual se envía el vector, para producir el ADNc-ss. La célula a la cual se envía el vector de la presente invención, produce un transcrito de ARN (Figura 1), accionado por un promotor eucariótico, justo como los promotores eucarióticos accionan las enzimas descritas anteriormente, que se usa como una plantilla para dirigir la síntesis de cualquier secuencia de ADN de una sola cadena deseada (una "secuencia de interés") . Con más detalles, en la presente se describe un primer sistema en el que el vector comprende dos plásmidos que se co-transfectan adentro de una célula anfitriona adecuada, que puede ser levadura o cualquier célula procariótica o eucariótica, para producir un ADNss que incluya la secuencia de interés en la célula. Se describe un segundo sistema en el que el sistema de vectores comprende un solo plásmido que contiene la secuencia de interés que se transfecta dentro de una célula anfitriona adecuada para la producción de un ácido nucleico inhibidor, tal como la secuencia anti-sentido, de la secuencia de interés . Los ácidos nucleicos inhibidores se pueden sintetizar a ADNss a partir de la plantilla de ARNm o la plantilla ARNm misma, que se puede fijar específicamente a una secuencia de ácidos nucleicos complementaria. Mediante la fijación a la secuencia objetivo apropiada, se forma un doble o triple de ARN-ARN, AD —ADN, o ARN-ADN. Estos ácidos nucleicos frecuentemente se denominan "anti-sentido" porque éstos usualmente son complementarios a la cadena sentido o de codificación del gen, pero la secuencia "sentido" también se utiliza en la célula para propósitos terapéuticos. Por ejemplo, ahora se ha demostrado la identificación de oligonucleótidos que se fijan específicamente a biomoléculas que normalmente no se fijan al ARN ni al ADN, para muchas biomoléculas que varían ampliamente en tamaño, estructura y composición. Los ejemplos de esas moléculas incluyen (pero no están limitados a) : (1) trombina, una proteína reguladora de múltiples funciones que convierte el fibrinogeno a fibrina en el proceso de la formación de coágulos; (2) bradiquinina, una quinina nonapéptida envuelta en la regulación de la presión sanguínea, e implicada en la hipertensión; (3) PGF2 alfa, una prostglandina o derivado de ácido graso que exhibe actividad hormonal. Adicionalmente, ahora se ha demostrado la interacción de oligonucleótidos con biomoléculas cuya función biológica natural es principalmente extracelular (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5,840,867). El término "ácidos nucleicos inhibidores", como se usa en la presente, por lo tanto, se refiere a ácidos nucleicos tanto "sentido" como "antisentido" . Mediante la fijación al ácido nucleico objetivo, un ácido nucleico inhibidor inhibe la función del ácido nucleico objetivo. Este efecto inhibidor es el resultado de, por ejemplo, el bloqueo de la transcripción del ADN, el procesamiento o la adición de poli (A) al ARNm, los mecanismos inhibidores de réplica, traslación o promoción del ADN de las células (tales como la promoción de la degradación del ARN) . Los métodos de ácidos nucleicos inhibidores, por lo tanto, abarcan muchos diferentes planteamientos para alterar la expresión de genes. Estos diferentes tipos de ácidos nucleicos inhibidores se describen en Helene, C. y J. Toulme, 1049 Biochim. Biophys. Acta. 99-125 (1990) . Brevemente, los planteamientos de terapia de ácido nucleico inhibidor se pueden clasificar en (1) aquellos que se dirigen a secuencias de ADN, (2) aquellos que se dirigen a secuencias de ARN (incluyendo ARNm previo y ARNm) , (3) aquellos que se dirigen a las proteínas (planteamientos de cadena sentido), y (4) aquellos que provocan la disociación o la modificación química de los ácidos nucleicos objetivo tales como las enzimas de ADNss, incluyendo la llamada "enzima 10-23", como se describió en la presente. El primer planteamiento contempla muchas categorías. Los ácidos nucleicos están diseñados para fijarse a la ranura mayor del ADN doble para formar una estructura helicoidal triple o "triplex". Alternativamente, los ácidos nucleicos inhibidores están diseñados para fijarse a regiones de ADN de una sola cadena que sean el resultado de la abertura del ADN doble durante la réplica o la transcripción. Más comúnmente, los ácidos nucleicos inhibidores están diseñados para fijarse al ARNm o a precursores de ARNm. Los ácidos nucleicos inhibidores se usan para evitar la maduración del ARNm previo. Los ácidos nucleicos inhibidores pueden estar diseñados para interferir con el procesamiento, empalme, o traslación del AR . En el segundo planteamiento, los ácidos nucleicos inhibidores están dirigidos al ARNm. En este planteamiento, los ácidos nucleicos inhibidores están diseñados para bloquear específicamente la traslación de la proteína codificada. Usando este segundo planteamiento, el ácido nucleico inhibidor se usa para suprimir selectivamente ciertas funciones celulares mediante la inhibición de la traslación del ARNm que codifica proteínas críticas. Se ha mostrado que los ácidos nucleicos inhibidores que se dirigen al ARNm trabajan por medio de muchos diferentes mecanismos para inhibir la traslación de la(s) proteína (s) codificada (s) . Un ejemplo de ese ácido nucleico inhibidor es la secuencia que es complementaria a regiones del ARNm de c-myc, que inhibe la expresión de la proteína c-myc en una línea celular de leucemia promielocítica humana, HL60, que sobre-expresa el proto-oncogen c-myc. ickstrom E. L., y colaboradores, 85 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1028-1032 (1988), Harel-Bellan, A., y colaboradores, 168 Exp. Med.2309-2318 (1988) . Los ácidos nucleicos inhibidores producidos en la célula también pueden utilizar el tercer planteamiento para diseñar la cadena "sentido" del gen o el ARNm para atrapar o competir por las enzimas o las proteínas de fijación envueltas en la traslación de ARNm. Finalmente, los ácidos nucleicos inhibidores se usan para inducir la inactivación química o disociación de los genes o el ARNm. Objetivo. La inactivación química ocurre, por ejemplo, mediante la inducción de reticulaciones entre el ácido nucleico inhibidor y el ácido nucleico objetivo adentro de la célula, y mediante el método que se contempla en la presente, a saber, la disociación del ARNm objetivo mediante la secuencia que tiene actividad enzimática contra el ARNm que está incorporado dentro del cartucho de la presente invención. Brevemente, en un primer aspecto, la presente invención comprende un conjunto de elementos genéticos, adaptados para enviarse dentro de una célula, para producir ADN-ss in vitro o in vivo. El conjunto de elementos genéticos está incorporado dentro de cuando menos un vector para envió dentro de la célula e incluye un gen de polimerasa de ADN dependiente del ARN (trans-criptasa inversa), y un cartucho que incluye (1) una repetición tándem invertida (IR), (2) una secuencia de interés localizada ya sea entre la repetición invertida (IR) o en 3 ' a la repetición invertida, y (3) un sitio de fijación de cebador (PBS) para la transcriptasa inversa que está localizada en 31 a la repetición invertida . El sistema de vectores también incluye de preferencia las funciones e instrucciones de señalización para la transcripción de estos elementos in vivo, y las funciones e instrucciones de señalización para la traslación del gen de transcriptasa inversa (RT) . Los elementos adicionales que se puede incluir en el conjunto de elementos genéticos de la presente invención incluyen un gen de endonucleasa de restricción (RE) , que puede estar incluido para un propósito que se describe posteriormente, y una secuencia que tiene actividad enzimática cuando el ADN-ss linealizado se dobla a la configuración secundaria que confiere actividad enzimática sobre la secuencia. La secuencia enzimática está localizada de preferencia adentro de una secuencia de interés, sin importar si la secuencia de interés está localizada entre las repeticiones tándem invertidas, o entre el aspecto 3' de la repetición invertida y el PBS . En una primera modalidad del sistema de vectores descrito en la presente, el vector comprende un sistema de dos plásmidos, y el primer plásmido incluye un gen de polimerasa de ADN dependiente del ARN (transcriptasa inversa) y un gen de ARNasa H, enlazado con un enlazador de histidina-prolina a un gen de endonucleasa de restricción. El plásmido adentro del cual se insertaron estos genes contiene los elementos de control de transcripción y traslación necesarios para estos genes, junto con secuencias de cola de poliadenilación . En la presente se hace referencia a este plásmido como el plásmido "A" (ADNpss-Express-A como se muestra en la Figura 4 en una de las modalidades preferidas descritas en la presente) . Se construyó un segundo plásmido "B" que, en la modalidad descrita en la presente, incluye el cartucho que comprende tres de los elementos enlistados anteriormente, a saber, una secuencia de fijación de cebador (PBS) acoplada a la transcriptasa inversa, una secuencia de interés, y una repetición tándem invertida. En dos modalidades que se describen en la presente (pMN-enlace-n evo y pssADN-Express-4B, la última se muestra en la Figura 7B) , la secuencia de interés está colocada ya sea entre las repeticiones tándem invertidas, o en una posición 5' (con respecto al transcrito de ARNm) a la secuencia de fijación de cebador (PBS) , la PBS estando localizada en el aspecto más 3' del transcrito de ARNm. En otras palabras, la secuencia de interés está localizada (1) en medio de las repeticiones invertidas, (2) entre las repeticiones invertidas y la PBS, y/o (3) tanto entre las repeticiones invertidas como en medio de las repeticiones invertidas y la PBS. Igual que el plásmido A, el plásmido B también incluye una combinación de elementos de control de transcripción. Sin embargo, en cuando menos una modalidad preferida descrita en la presente, el plásmido B no incluye (o requiere) los elementos de control de traslación, puesto que no se produce ningún producto de proteína a partir de esta construcción. En otra modalidad que se describe en la presente, el sistema de vectores de la presente invención comprende un solo plásmido, designado como el plásmido C, en el cual están incorporados todos los elementos del conjunto de elementos genéticos enlistados anteriormente, con la excepción del gen RE, el cual no se incluyó por razones que se harán claras en la siguiente discusión. Adicionalmente, los componentes del cartucho incluido en el plásmido B del sistema de dos plásmidos descrito anteriormente, por ejemplo, la secuencia de fijación de cebador (PBS), la secuencia de interés, y la repetición tándem invertida, residen en la porción 3 ' no trasladada de la poliproteina de transcriptasa inversa en el plásmido C. En otras palabras, cuando el componente RT-ARNasa H del plásmido C se transcribe bajo el control de un promotor apropiado (en las modalidades preferidas descritas en la presente, se utilizó el promotor RSV) , el transcrito de ARNm resultante contiene la región de codificación para la poliproteina de transcriptasa inversa-ARNasa H y, en el final de la traslación en las señales de detención, el transcrito de ARNm adicional contiene (3' a esta proteina trasladada) los elementos del plásmido B con eventos de señalización corriente abajo otros 3' para las señales de poliadenilación, que permanecen intactas del componente RT-ARNasa H. El sistema de vectores de un solo plásmido particular descrito en la presente (ADNpss-Express-C como se muestra en la Figura 9) no contiene el gen de endonucleasa de restricción, y por lo tanto, no incluye la habilidad para digerir el tallo del intermediario de tallo-espira formado por las repeticiones invertidas. Consecuentemente, la secuencia de interés (incluyendo la enzima ADN) se inserta dentro del plásmido C únicamente en una posición 3' a las repeticiones invertidas, y se remueven las secuencias de vectores no deseadas por medio del truncamiento prematuro del producto ADNc-ss, a medida que el transcrito encuentra el tallo relativamente estable, y es incapaz de continuar transcribiendo el ADNc-ss a partir del transcrito de ARNm. Más específicamente, como se hará evidente en la siguiente descripción, cada una de las secuencias de interés se insertó únicamente adentro de los sitios de restricción Bam H 1-Pac 1 del plásmido ADNpss-Express-C . Como también será evidente por la siguiente descripción de los plásmidos B y C, los plásmidos incluyen la clonación de sitios para la inserción de la secuencia de interés. En la modalidad preferida del plásmido B descrito en la presente se proporcionan ambos sitios Not 1 (localizados entre las repeticiones invertidas) y los sitios Pac I/BamH (3' a las repeticiones invertidas, por ejemplo, entre las repeticiones invertidas y la PBS) . El plásmido C preferido descrito en la presente incluye solamente los sitios Pac I/BamH para este propósito. Sin embargo, aquellos técnicos en la materia que tienen el beneficio de esta descripción reconocerán que estos sitios de clonación particulares se seleccionaron para los sistemas particulares descritos en la presente, y que otros sitios de clonación pueden ser igualmente útiles para este mismo propósito. No se pretendía que el plásmido A particular que comprende el sistema de vectores de dos plásmidos descrito en la presente incluyera la secuencia de interés, pero aquellos técnicos en la materia que tengan el beneficio de esta descripción reconocerán que, si se va a usar un sistema de vectores de dos plásmidos, se puede insertar el conjunto de elementos genéticos de la presente invención, y particularmente la secuencia de interés, dentro de cualquier plásmido según sea conveniente. La secuencia de ácidos nucleicos a que se hace referencia en la presente como un cartucho proporciona la plantilla para la síntesis del ADNc-ss en las células objetivo. Es este elemento el que incluye la secuencia de interés, la repetición tándem invertida, y el sitio de fijación de cebador. Como es el caso para los otros elementos del conjunto de elementos genéticos de la presente invención, este elemento genético se regula de preferencia por medio de un promotor/mejorador de amplio espectro o específico al tejido, tal como el promotor CMV, o la combinación de promotores/mej oradores , localizados corriente arriba del elemento genético. También como es el caso para los otros elementos genéticos, el promotor/ mejorador puede ser un promotor ya sea constitutivo o que se pueda inducir. Aquellos técnicos en la materia que tengan el beneficio de esta descripción reconocerán que se pueden usar muchos otros promotores eucarióticos para controlar convenientemente la expresión de la secuencia de interés, incluyendo SV-40, RSV (específico a tipo no celular) o proteína ácida fibular glial (GFPA) específica. Como se muestra en la Figura 1, para la expresión en células eucarióticas , el cartucho también incluye una secuencia de señal de poliadenilación corriente abajo, de tal manera que el ARNm producido por medio de la secuencia de interés tenga una cola poli (A) . El sitio de fijación de cebador (PBS) para la iniciación del cebado para la síntesis del ADNc, está localizado entre la repetición tándem invertida 31 y la señal de poliadeni-lación. La PBS es una secuencia que es complementaria a un ARN de transferencia (ARNt) que es residente adentro de la célula eucariótica objetivo. En el caso de la transcriptasa inversa de ratón de Maloney descrita en la presente, como se ha estado utilizando en conjunción con la presente invención, la PBS toma provecho del ARNt de la prolina. La PBS que se utiliza en conexión con la modalidad actualmente preferida de la invención, que se describe en la presente, se tomó de la región de secuencia de 18 nucleótidos actual del virus de ratón de Moloney. Ver 293 Nature 81. En el caso del gen de transcriptasa inversa del virus de inmunodeficiencia humano que también se probó como se notó anteriormente, la PBS que se usó se tomó de la secuencia de nucleótidos del VIH. Y. Li, y colaboradores, 66 J. Virology 6587-6600 (1992). Brevemente, cualquier PBS que se acopla a la transcriptasa inversa, que se utiliza en conexión con el método de la presente invención, se utiliza con este propósito. El cartucho de la presente invención también comprende un par de repeticiones tándem invertidas. Después de la digestión del ARNm a partir del heterodúplex de ARNm-ADNc, por medio de ARNasa H y la liberación del ADNc-ss, las repeticiones invertidas provocan que el ADNc-ss se doblen hacia atrás sobre sí mismas, para formar el tallo de una estructura de tallo-espira, la estructura de tallo comprendiendo ADN anti-paralelo de doble cadena. El ADNc-ss que se produce se transcribe con las regiones codificadas 3' y 5' que flanquean el tallo (constituido de la repetición invertida) y una espira que contiene la secuencia de interés. Se pueden diseñar uno o más elementos genéticos funcionales dentro de la porción de doble cadena, es decir, la repetición invertida, que forma el tallo del intermediario de tallo-espira. En los ejemplos descritos en la presente, el elemento genético funcional es uno o más sitio (s) de endonucleasa de restricción que se corta (n) por medio de la endonucleasa de restricción producida a partir del gen de endonucleasa de restricción descrito anteriormente (en el caso de aquellos plásmidos que incluyen un gen RE), pero aquellos técnicos en la materia reconocerán que se puede diseñar la repetición invertida para que incluya otros elementos genéticos funcionales, tales como una secuencia de reconocimiento de enzima especifica (aparte de un sitio de endonucleasa de restricción) , sitios de reconocimiento de receptor eucariótico y/o procariótico, sitios de promotor o promotor/mejorador para conducir la expresión de una secuencia objetivo (que pudiera o no estar igualmente diseñada dentro del tallo) de una manera orientada a cis aislada. En el caso de que el elemento genético funcional comprenda una secuencia de reconocimiento de enzima especifica tal como un sitio de endonucleasa de restricción, entonces se corta (también denominado digiere o disocia) el tallo por medio de cualquiera de las muchas enzimas de endonucleasa de restricción que reconocen el sitio de corte designado dentro del tallo (nótese que el sitio de reconocimiento de endonucleasa se puede diseñar dentro del tallo, aunque el gen RE no esté incluido en el sistema de vectores de la presente invención) , para liberar la espira de ADNc-ss. La porción de espira del ADNc-ss, que no forma ningún ADN doble aparente, es inmune a la actividad de la endonucleasa de restricción, puesto que las endonucleasas de restricción reconocen únicamente el ADN de doble cadena como un sustrato objetivo. Aquellos técnicos en la materia reconocerán que, si se está utilizando el segundo aspecto de la presente invención, el (os) sitio (s) de endonucleasa de restricción no se necesitan diseñar dentro de las repeticiones invertidas que forman el tallo del intermediario de tallo-espira. En otras palabras, si se desea producir ADNss a partir de una segunda secuencia de interés localizada entre el sitio de fijación de cebador y las repeticiones invertidas, con la transcripción del cartucho para terminar en el tallo formado por las repeticiones invertidas, no hay necesidad de un sitio de endonucleasa de restricción en el tallo. Otra opción es diseñar las repeticiones invertidas para que contengan sitios de fijación de ADN eucariótico, procariótico o de proteina viral, que actúan para titular de manera competitiva proteínas celulares seleccionadas. Las combinaciones de los sitios de restricción u otros elementos específicos de secuencia pueden estar incluidos en las repeticiones tándem invertidas, dependiendo de la composición de pares de base seleccionada para la construcción de repeticiones invertidas, de tal manera que se produzcan formas intermedias lineales o de tallo-espira cortadas de manera precisa del ADN-ss. Generalmente se prefiere usar elementos genéticos funcionales construidos de manera sintética en la repetición tándem invertida puesto que (si el elemento genético funcional es un sitio de endonucleasa de restricción) es improbable que una repetición invertida naturalmente ocurrente tenga los sitios de restricción apropiadamente alineados. Como se notó anteriormente, el cartucho que comprende uno de los elementos del conjunto de elementos genéticos de la presente invención, además incluye opcionalmente una secuencia de ADN con actividad catalítica. Debido a la inclusión de la llamada "enzima de ADN" en el cartucho, y específicamente, a que se contempla que la enzima de ADN esté localizada adentro de la secuencia de interés, la presente invención se usa para provecho particular cuando la secuencia de interés sirve como la plantilla para la síntesis de un ácido nucleico inhibidor, que es una secuencia anti-sentido . Por esa razón, los ejemplos expuestos en la presente describen la producción de cuatro secuencias anti-sentido interés, como se establece en la Figura 6, cada una incluyendo una secuencia que tiene actividad enzimática contra el ARNm, que incluyen la cinasa C-raf, la secuencia anti-sentido liras, la secuencia anti-sentido al factor de crecimiento angiogé-nico de pleiotrofina, y la región tat del virus de inmunodefi-ciencia simiesco (VIS) . Aquellos técnicos en la materia reconocerán, sin embargo, que la presente invención no se limita solamente a las secuencias anti-sentido, y que la secuencia de ácidos nucleicos inhibidores puede ser cualquiera de los otros tipos de secuencias de ácidos nucleicos inhibidores descritos anteriormente. La secuencia de ácidos nucleicos que tiene actividad enzimática, que comprende el cartucho de la presente invención, puede ser cualquiera de esas secuencias enzimáticas. La secuencia que tiene la actividad catalítica deseada se inserta dentro del cartucho en cualquiera o ambas de las dos ubicaciones, por ejemplo, (a) entre las repeticiones invertidas y adentro de la secuencia de interés, o (b) adentro de la segunda secuencia de interés que está localizada en 3 ' a las repeticiones invertidas y a 5' a la PBS. De cualquier manera, el aptámero resultante es específico para el objetivo de la secuencia de interés, y por lo tanto se usa para dirigir otras secuencias de ADN, secuencias de ARNm, y cualquier otro sustrato adecuado, para inhibir o cambiar los mecanismos de empalme del ADN o ARNm, o hasta para alterar directamente el genoma celular de una manera específica. Las secuencias de ácidos nucleicos con actividad enzimática, que son apropiadas para usarse en conexión con la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, secuencias que tengan actividad de ARNasa tales como las llamadas "enzimas 10-23" y "8-17" (Santoro, S. W. , y G. F. Joyce, supra (1997)) y otras ARNasas dependientes del metal (Breaker, R. R., y G. F. Joyce, 1 Biol. Chem. 223-229 (1994), Breaker, R. R. y G. F. Joyce, 2 Biol. Chem. 655-660 (1995)) y la ARNasa dependiente de la histidina (Roth, A., y R.R. Breaker, 95 Proc . Nati. Acad. Sci. USA 6027-6031 (1998)); secuencias que tengan actividad de ADNasa tales como la ADNasa dependiente del cobre (Carmi, N. , y colaboradores, 3 Chem. Biol. 1039-1046 (1996), Carmi, N., y colaboradores, 95 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 2233-2237 (1998); Sen, D. y C. R. Geyer, 2 Curr. Opin. Chem. Biol. 680-687 (1998)) y ADNasas que requieren iones de metal divalente como co-factores, o hidrolizan el sustrato independientemente de los iones de metal divalente como lo reporta Faulhammer, D. y . Famulok (269 J. Molec. Bio. 18-203 (1997)); secuencias con actividad de ligasa de ADN, tales como la ADNasa dependiente del cobre (Breaker, R. R., 97 Chem. Rev. 371-390 (1997)) y la ligasa E47 dependiente del zinc (Cuenoud, B. Y J. W. Szostak, 375 Nature 611-613 (1995) ) ; secuencias con actividad de cinasa de ADN tales como la cinasa de ADN dependiente del calcio (Li, Y. Y R. R. Breaker, 96 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 2746-2751 (1999)); y secuencias con actividad de cinasa de ARN tales como la cinasa de ADN dependiente del calcio (Li, Y., supra (1999)). La secuencia de ácidos nucleicos particular que tiene actividad enzimática, que se utiliza en los ejemplos descritos en la presente, es la "enzima 10-23" (Santoro, S. W. y G. F. Joyce, supra (1997)), y es esta secuencia enzimática que se representa esquemáticamente en las Figuras 3A y 3B. Sin embargo, aquellos técnicos en la materia reconocerán, por esta descripción, que cualquiera de las secuencias reportadas en la literatura enlistada anteriormente funcionará para el propósito pretendido, cuando se inserte dentro del cartucho de la presente invención. Respecto a la polimerasa de ADN dependiente del ARN, o el gen de transcriptasa inversa (RT) que además comprenda un elemento del conjunto de elementos genéticos de la presente invención, como se notó anteriormente, se usó el gen de transcriptasa inversa/ARNasa H del virus de leucemia de murino de oloney, para provecho en los ejemplos descritos en la presente. También se ha probado el gen de transcriptasa inversa/ARNasa H del virus de inmunodeficiencia humano (VIH) . Se pueden usar muchos otros genes retrovirales de transcriptasa inversa/ARNasa H para provecho en conexión con la presente invención, incluyendo aquellos de retrovirus tales como SIV, cepas de hepatitis B, hepatitis C, elementos retrones bacterianos, y retrones aislados a partir de diferentes especies de levadura y bacterianas, siendo preferible que el gen de transcriptasa inversa/ARNasa H sea un gen de transcriptasa inversa/NRasa H, que se regule por medio de un promotor/mej orador corriente arriba apropiado tal como el promotor de citomegalovirus (CMV) o virus de sarcoma de Rouse (RSV) para expresión en células eucarióticas . Como se encuentran en la naturaleza, estas polimerasas de ADN dependientes del ARN usualmente tienen una enzima componente de NRasa asociada adentro del mismo transcrito de codificación. Sin embargo, la presente invención no requiere el gen de NRasa H naturalmente ocurrente para una transcriptasa inversa particular. En otras palabras, aquellos técnicos en la materia reconocerán, por esta descripción, que se pueden empalmar juntas diferentes combinaciones de genes de transcriptasa inversa y Rasa H, para usarse en conexión con la presente invención, para cumplir con esta función, y que están disponibles, y/o que aquellos técnicos en la materia conocen, modificaciones y/o versiones híbridas de estos dos sistemas de enzimas, los cuales funcionarán de la manera pretendida. Aquellos técnicos en la materia también reconocerán que la célula objetivo puede tener, ella misma, suficiente NRasa H endógena para cumplir con esta función. De manera similar, aquellos técnicos en la materia reconocerán que la célula objetivo puede tener ella misma suficiente actividad de transcriptasa inversa endógena de, por ejemplo, infección retroviral previa, para cumplir esta función. El gen de transcriptasa inversa/NRasa H también incluye de preferencia una secuencia de señal de poliadenilación corriente abajo, de tal manera que el ARNm producido a partir del gen de transcriptasa inversa/NRasa H incluya una cola poli (A) 3' para estabilidad del ARNm. Como saben aquellos técnicos en la materia, están disponibles múltiples colas poli (A) , y se usan rutinariamente para la producción de genes eucarióticos expresados .

La transcriptasa inversa producida en la célula sintetiza un ADN complementario (ADNc) , usando como la plantilla el elemento genético que incluye la secuencia de interés descrita posteriormente. La actividad de ARNasa H de la transcriptasa inversa, junto con la actividad de la ARNasa endógena adentro de la célula, degrada el componente de plantilla de ARNm del híbrido de ARN/ADNc, para producir ADN-ss in vivo. El gen que codifica la endonucleasa de restricción (que se usa solamente en el sistema de dos plásmidos, y no es ni siquiera un componente requerido de ese sistema) puede ser cualquiera de muchos genes que codifiquen para endonucleasas de restricción, y de preferencia aquellos que se controlen por medio de uno o más promotores/me oradores constitutivos o que se puedan inducir, de amplio espectro y/o específicos al tejido como se describe posteriormente. Las endonucleasas de restricción particulares que se utilizaron en la presente fueron Mbo II y Fok I, pero aquellos técnicos en la materia que tengan el beneficio de esta descripción reconocerán que se puede incluir cualquier sitio de endonucleasa de restricción (tipo I, II, IIS, o III) en la repetición tándem invertida. Estas enzimas "abrazan", o digieren, el tallo del intermediario de tallo-espira para hacer lineal la secuencia de interés como ADN de una sola cadena. Aunque la expresión del gen RE se puede regular por medio de un promotor/mej orador constitutivo o que se pueda inducir apropiado, localizado corriente arriba del gen de endonucleasa de restricción tal como el promotor CMV o RSV para expresión en células humanas, en el plásmido ADNpss-Express-A descrito en la presente, el gen RE (Mbo II) está enlazado al polipéptido RT-ARNasa H. El gen RE también incluye de preferencia una secuencia de señal de poliadenilación corriente abajo, de tal manera que el transcrito de ARNm del gen de endonucleasa de restricción tendrá una cola poli (A) 3'. Aquellos técnicos en la materia que tengan el beneficio de esta descripción también reconocerán que también se pueden usar muchos promotores/mejoradores específicos al tejido o de amplio espectro, o combinaciones de promotores/mejoradores aparte de aquellos enlistados anteriormente, para provecho para regular el gen de transcriptasa inversa/NRasa H, el gen RE (si se utiliza), y la secuencia de interés. Aunque no es necesaria una lista de todos los promotores/mejoradores disponibles para ejemplificar la invención, como se notó anteriormente, los promotores/mejoradores pueden ser constitutivos o inducibles, y pueden incluir los promotores/mejoradores de CMV o RSV (no especifico a tipo de célula) o GFAP (especifico al tejido), y muchos otros promotores virales o de mamífero. Los promotores/mejoradores representativos que son apropiados para usarse en conexión con los elementos de la presente invención pueden incluir, pero no se limitan a, HSVtk (S.L. McKnight, y colaboradores, 217 Science 316 (1982)), promotor de ß-globulina humana (R. Breathnach, y colaboradores, 50 Ann . Rev. Of Biochem. 349 (1981)), ß-actina (T. Kawamoto, y colaboradores, 8 Mol. Cell Biol. 267 (1988)), hormona de crecimiento de rata (P.R. Larsen, y colaboradores, 83 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 8283 (1986)), MMTV (A.L. Huang, y colaboradores, 27 Cell 245 (1981)), adenovirus 5 E2 (M.J. Imperiale, y colaboradores, 4 Mol. Cell. Biol. 875 (1984)), SV40 (P. Angel, y colaboradores, 49 Cell 729 (1987)), a-2-macroglobulina (D. Kunz, y colaboradores, 17 Nucí. Acids Res. 1121 (1989)), gen MHC clase I H-2kb (M. A. Blanar, y colaboradores, 8 EMBO J. 1139 (1989)), y hormona estimulante de la tiroides (V. K. Chatterjee, y colaboradores, 86 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 9114 (1989)) . Cuando los elementos que comprenden el conjunto de elementos genéticos de la presente invención se incorporan dentro de un vector, se prefiere que el vector contenga otros elementos genéticos especializados, para facilitar la identificación de células que lleva el vector y/o para incrementar el nivel de expresión del cartucho. Los elementos genéticos especializados incluyen genes marcadores que se pueden seleccionar, de tal manera que se pueda transformar y amplificar el vector en un sistema procariótico . Por ejemplo, los marcadores que se pueden seleccionar más comúnmente usados son genes que confieren a las bacterias (por ejemplo, E. Coli) resistencia a antibióticos como la ampicilina, cloranfenicol , canamicina (neomicina) , o tetraci-clina. También se prefiere que el vector contenga elementos genéticos especializados para transíección, identificación y expresión subsecuente en un sistema eucariótico. Para la expresión en células eucarióticas, se pueden usar estrategias de selección múltiple (por ejemplo, Ovario de Hámster Chino OHC) , que confieran a la célula resistencia a un antibiótico u otro fármaco, o que alteren el fenotipo de la célula tal como cambios morfológicos, pérdida de inhibición de contacto, o velocidad de crecimiento incrementada. Los marcadores que se pueden seleccionar que se pueden usar en los sistemas eucarióticos incluyen, pero no están limitados a, marcadores de resistencia para Zeocina, resistencia a G418, resistencia a antibióticos de aminoglucósidos, o marcadores de selección fenotipica tales como ß-gal o proteina de fluorescencia verde. La incorporación de estos componentes dentro de un vector apropiado permite dos métodos convenientes para remover secuencias de vectores determinadas previamente, después de la producción de ADNss. En el primer método, la porción de espira del intermediario de tallo-espira del ADNss que se produce comprende la secuencia de nucleótidos de interés y, después de la digestión con la endonucleasa de restricción, se libera la espira como ADNc de una sola cadena, linealizado, sin secuencias flanqueadoras . En el segundo método en el que se incluye una segunda secuencia de interés en el cartucho 3' a la repetición tándem invertida, se termina la transcripción inversa en el tallo de la estructura de tallo-espira, de tal manera que se produce el ADNss resultante sin secuencias flanqueadoras . Si se desea producir ADNss utilizando el segundo método, el cartucho se diseña con una repetición invertida, que forma un tallo que es más estable que el tallo del intermediario de tallo-espira a partir del cual se produce el ADNss, mediante la digestión del tallo, de conformidad con el primer aspecto de la presente invención. Por medio de diseñar el cartucho con una repetición invertida que forme un tallo que se desnaturalice fácilmente, de conformidad con el primer aspecto de la invención, la transcripción inversa procede adelante a través de la segunda secuencia de interés (si ésta está diseñada dentro del cartucho) a la secuencia de interés localizada entre la repetición invertida. Un tallo que sea de estabilidad intermedia permite la producción de tanto la primera como la segunda secuencias de interés. Se descubrió esta terminación prematura del transcrito de ADNc de transcriptasa inversa en el aspecto 3' de la estructura de tallo, cuando se usó un vector con un tallo que incluía 29 pares de base en experimentos in vitro, los pares de base adicionales incluidos en el tallo proporcionando la estabilidad adicional que provoca la producción de tanto la primera como la segunda secuencias de interés. El diseño de un intermediario de tallo-espira que tenga un tallo de la estabilidad deseada para obtener ya sea la producción de la primera (entre la repetición invertida) o la segunda (entre el aspecto 3' de la repetición invertida y la PBS) , está dentro de la experiencia de aquellos técnicos en la materia que tengan el beneficio de esta descrip-ción. Brevemente, se pueden manipular (usando, por ejemplo, el sistema in vitro descrito en la presente) factores tales como la longitud de la repetición invertida (por ejemplo, el número de nucleótidos que comprenden la repetición) y la identidad de las bases que comprenden la repetición, para obtener un tallo que tenga tan poca o tanta estabilidad como se pueda desear, para obtener la producción de la primera o segunda secuencia de interés, o una mezcla de ambas secuencias. Por esta descripción también será evidente para aquellos técnicos en la materia que la estructura de ADNc-ss de tallo-espira intacta puede funcionar de manera similar en muchas aplicaciones como la forma de ADNc-ss linealizada. En consecuencia, el cartucho también se usa para provecho sin el gen de endonucleasa de restricción y los elementos reguladores asociados y/o con una secuencia de interés que carezca del sitio de endonucleasa de restricción correspondiente. Para aquellos técnicos en la materia también será evidente, por esta descripción de las modalidades preferidas de la presente invención, que se puede hacer un cartucho que codifique un ADNc-ss que tenga una estructura de tallo-espira "arreglada". Los sitios de endonucleasa de restricción codificados en las repeticiones invertidas que flanquean la secuencia de interés están diseñados de tal manera que la porción del tallo (después de la formación del dúplex) se digiera con la endonucleasa de restricción correspondiente, con el objeto de cortar el ADNds que comprende el tallo, de una manera que remueva una porción del tallo, y las secuencias flanqueadoras asociadas todavía dejan suficiente ADN dúplex, de tal manera que el transcrito retiene la estructura de tallo-espira descrita anteriormente. Esa estructura de ADNc-ss puede ser más resistente a las nucleasas intracelulares por medio de retener los "extremos" de un ADNss en forma de doble cadena. Para aquellos técnicos en la materia también será evidente que el tallo (ADN dúplex) se puede diseñar para que contenga una secuencia (o secuencias) determinada previamente, es decir, aptámeros, que se reconocen y fijan por medio de las proteínas de fijación al ADN específicas. Entre otros usos, esa estructura de tallo se usa en la célula como un competidor para titular una (s) proteína (s) seleccionada (s) que regule (n) la función específica del gen. Por ejemplo, se produce un tallo-espira de ADNc-ss de conformidad con la presente invención, en una célula que contiene un sitio de fijación para un factor de transcripción positivo seleccionado tal como el adenovirus Ela. El adenovirus Ela, como otros oncogenes, modula la expresión de muchos genes adenovirales y celulares, por medio de afectar la actividad de los factores de transcripción codificados por las células, dando como resultado el cambio de células normales a células transformadas. Jones, y colaboradores, 2 Genes Dev. 267-281 (1988). El tallo dúplex del intermediario de tallo-espira producido de conformidad con la presente invención, por lo tanto, está diseñado para funcionar para "fijar" este factor de transcripción, evitando que la proteina fije un promotor, y de esta manera, inhibiendo la expresión del gen dañino particular, para aquellos técnicos en la materia, estará claro que la estructura de tallo dúplex puede contener opcionalmente múltiples sitios de fijación, por ejemplo, sitios que se reconocen por medio de diferentes factores de transcripción que regulan activamente la expresión del gen particular. Por ejemplo, se ha encontrado que el adenovirus Ela expresa la transcripción del gen de colagenasa por medio del elemento que responde al éster de forbol, un elemento promotor responsable de la inducción de transcripción mediante 13-acetato de 12-0-tetradecanoliforbol (TPA) , por medio de muchos otros nitrógenos, y por medio de los oncogenes ras, mos, src, y trk. El mecanismo envuelve la inhibición de la función de la familia del factor de transcripción AP-1. Offringa, y colaboradores, 62 Cell 527-538 (1990). Se puede insertar cualquier secuencia de nucleótidos deseada dentro de elemento genético que codifica la porción de "espira" del intermediario de tallo-espira, para realizar finalmente una función inhibidora deseada, por ejemplo, fijación anti-sentido, regulación descendente de un gen, etcétera, como se describe en la presente. En otro aspecto que reconocerán aquellos técnicos en la materia, la presente invención se usa para construir estructuras de ADNss secundarias complejas, que confieran reacciones biológicas en el transcrito de ADNc, en base al doblamiento de la estructura secundaria de conformación. Esa estructura secundaria se puede diseñar para satisfacer cualquiera de muchas funciones. Por ejemplo, la secuencia de interés puede incluir (pero ni se limita a) una secuencia que se incorpora dentro de la porción de espira del transcrito de ADNc de una sola cadena, que forma las llamadas estructuras parecidas a "hoja de trébol" o "crisol", tales como aquellas que se encuentran en las repeticiones de terminal larga de virus asociados con adeno o en retro-transposones. Bajo las circunstancias correctas, esa estructura se integra de una manera específica al sitio dentro del genoma anfitrión. Debido a que el conjunto de elementos genéticos de la presente invención se puede adaptar para incorporación dentro de múltiples vectores de envío comercialmente disponibles, para propósitos terapéuticos de mamíferos y humanos, son factibles múltiples rutas de envío, dependiendo del vector seleccionado para una célula objetivo particular. Por ejemplo, actualmente los vectores virales son el medio más frecuentemente usado para transformar las células del paciente e introducir el ADN dentro del genoma. En un método indirecto, se usan vectores virales que llevan nueva información genética, para infectar células objetivo removidas del cuerpo, y después se vuelven a implantar las células infectadas (es decir, ex vivo) . Se ha reportado la transferencia de genes directa ín vivo, dentro de animales postnatales, para las formulaciones de ADN encapsulado en liposomas, y ADN atrapado en proteo-liposomas que contienen proteínas receptoras de envoltura viral. Nicolau, y colaboradores, 80 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1068-1072 (1983); Kaneda, y colaboradores, 243 Science 375-378 (1989), Mannino, y colaboradores, 6 Biotech-niques 682-690 (1988) . También se han descrito resultados positivos con ADN co-precipitado con fosfato de calcio. Benve-nisty y Reshef, 83 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 9551-9555 (1986). Otros sistemas que se usan para provecho incluyen inyección intravenosa, intramuscular, y subcutánea, así como inyección intra-tumoral e intra-cavidad directa. El conjunto de elementos genéticos, cuando se incorpora dentro del vector de elección, también se administra convenientemente a través de métodos de aplicación local, trans-mucosal, rectal, oral, o de tipo de inhalación. El vector que incluye el conjunto de elementos genéticos de la presente invención se emplea convenientemente para enviar una secuencia de interés de nucleótidos anti-sentido, triple, o cualquier otra secuencia de nucleótidos de ácidos nucleicos inhibidores o de una sola cadena, usando técnicas de digestión y ligación conocidas, para empalmar la secuencia particular de interés dentro del cartucho Centre la repetición tándem invertida o entre la PBS y la repetición tándem invertida) . Aquellos técnicos en la materia que tengan el beneficio de esta descripción, también reconocerán que las señales descritas anteriormente que se usan para la expresión adentro de células eucarióticas , se pueden modificar de maneras conocidas en la materia, dependiendo de la secuencia de interés particular, por ejemplo, un cambio probable es cambiar el promotor, con el objeto de conferir características de expresión convenientes en el cartucho, en el sistema en el cual se desea expresar la secuencia de interés. También hay demasiados posibles promotores y otras señales, y éstos son tan dependientes de la célula objetivo particular para la cual se ha seleccionado la secuencia de interés, que es imposible enlistar todos los mejoradores potenciales, sistemas promotores inducibles y constitutivos, y/o sistemas de cola poli (A) que se pudieran preferir para una célula objetivo particular y secuencia de interés. En otra modalidad, la presente invención toma la forma de un estuche que comprende un plásmido que tiene la polimerasa de ADN dependiente del ARN descrita anteriormente, y genes de endonucleasa de restricción clonados en el mismo, así como un sitio de clonación múltiple (MCS) adentro del cual el usuario del estuche inserta una(s) secuencia (s) de interés particular (es ) . El sitio de clonación adentro del cual se inserta (n) la(s) secuencia (s) de interés está localizado entre las repeticiones tándem invertidas descritas anteriormente, por ejemplo, corriente arriba desde el elemento genético que codifica el sitio de fijación de cebador. El plásmido resultante se purifica entonces del cultivo celular en el cual se mantiene éste, se liofiliza o conserva de otra manera para empacarlo y embarcarlo, y se envía al usuario.

El estuche también incluye de preferencia la endonucleasa de restricción para el sitio de clonación adentro del cual se va a clonar la secuencia de interés, las ligasas y otras enzimas, junto con reguladores del pH apropiados, para ligar la secuencia de interés dentro del plásmido, y un mapa del plásmido y/u otras instrucciones para el usuario. En la modalidad descrita en la presente, las secuencias de interés se envían a una célula anfitriona, ya sea mediante la co-transfección de las células con dos plásmidos, designados A y B, cada plásmido estando diseñado y construido para incluir uno o más de los elementos genéticos enlistados anteriormente, o un solo plásmido "C". Para resumir, en el sistema de dos plásmidos, el plásmido B codifica el cartucho gue incluye la secuencia de interés, anidada adentro de secuencias flanqueadoras que incluyen la repetición invertida, y el sitio de fijación primario que proporciona las señales de procesamiento después de la transcripción, que median la conversión del ARNm a ADN de una sola cadena. El plásmido B también incluye la segunda secuencia de interés cuando se utiliza este segundo aspecto de la invención (como se estableció anteriormente, cuando se omite el gen RE de la construcción de la presente invención, por ejemplo en el plásmido "C" individual descrito en la presente, es esta segunda secuencia de interés que codifica el ácido nucleico inhibidor particular que tiene la actividad deseada) . Las actividades requeridas para procesar el producto genético primario del plásmido B a ADN de una sola cadena, con la remoción de las secuencias de vectores y las señales de procesamiento, específicamente la transcriptasa inversa/ARNasa H, y la endonucleasa de restricción, se expresan a partir del plásmido A. La secuencia de ADN de una sola cadena que se libera mediante la interacción de los productos de transcripción de estos componente in vivo está libre para fijar objetivos intracelulares tales como especies de ARNm y promotores de ADN en estrategias anti-sentido y triples. Como se notó anteriormente, como se describe en la presente, el plásmido B incluye sitios de clonación (se utilizaron sitios Not I en una modalidad del plásmido B descrita en la presente) entre los cuales se coloca cualquier secuencia de ADN de interés (como se notó anteriormente, en los ejemplos descritos en la presente, las secuencias incluyen un "relleno", o prueba, secuencia, repeticiones teloméricas, h-ras, cinasa de c-raf, una región que codifica el factor de crecimiento angiogénico pleiotrofina, y la región que codifica tat de SIV) . Flanqueando los sitios de clonación están las señales que dirigen el procesamiento del transcrito de ARNm primario, producido a partir de un promotor (se utilizó un promotor CMV en el plásmido B preferido descrito en la presente) , adentro del ácido nucleico inhibidor de una sola cadena deseado. Después de la clonación de la secuencia de interés deseada dentro del plásmido B, los plásmidos A y B se co-transfectan dentro de una linea celular de elección, para la expresión constitutiva del ADNss. De manera similar, en el sistema de un solo plásmido ("C") descrito en la presente, se clona la secuencia de interés adentro de ese plásmido, y se transfecta adentro de la linea celular para procesamiento adicional. Sin importar la distribución de los elementos del conjunto descrito anteriormente de elementos genéticos entre dos (o hasta más) plásmidos, o si todos los elementos están contenidos en un solo plásmido, este procesamiento precede en tres pasos después de la transcripción de la región de ADN de una sola cadena (es decir, la secuencia de interés, las repeticiones invertidas y la PBS) : (1) transcripción inversa del transcrito de ARN del plásmido B o C, por medio de una transcriptasa inversa, que en la modalidad preferida descrita en la presente es la transcriptasa inversa expresada por el plásmido A o B (en la modalidad preferida descrita en la presente, la transcriptasa inversa es transcriptasa inversa del virus de leucemia de ratón de Moloney (MoMuLV) ) , procediendo desde el sitio de fijación de cebador que se encuentra en 3' a la secuencia de interés (incluyendo la secuencia con actividad enzimática) , las repeticiones invertidas, y el sitio de fijación de cebador, como se muestra en la Figura 1; (2) digestión de ARNasa H del heterodúplex resultante, ya sea por medio de la actividad de la ARNasa H de la poliprotei-na de transcriptasa inversa, o por medio de la actividad de la ARNasa H endógena, para liberar el precursor de ADN de una sola cadena de su complemento de ARN; y (3) remoción de las secuencias flanqueadoras mediante la digestión de cualquier endonucleasa de restricción del tallo de un intermediario de tallo-espira formado después de la formación de pares de base de atson-Crick de las bases que comprenden la repetición invertida, o por medio de la terminación prematura del transcrito de ADNc, mediante la formación de la estructura secundaria de tallo-espira por medio de las repeticiones tándem invertidas auto-complementarias. Aquellos técnicos en la materia reconocerán, por esta descripción, que lo sitios de clonación particulares que flanquean la secuencia de interés, la transcriptasa inversa particular, la endonucleasa de restricción (si se utiliza), el promotor, el sitio de fijación de cebador, y todos los otros elementos del conjunto de elementos genéticos de la presente invención, se seleccionan dependiendo de la secuencia de interés y/o sistema particular en el cual se vaya a expresar el ADNss. Excepto en donde se indique de otra manera, en los ejemplos que se describen posteriormente se utilizaron técnicas estándares como las describen Seabrook, y colaboradores (1989) (J. Seabrook, y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edición), Cold Spring Harbor Press (1989), al que se hace referencia de aquí en adelante como "Maniatis, y colaboradores (1989)") y Ausubel, y colaboradores (1987) (F. M. Ausubel, y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, New York: John Wiley & Sons (1987)), ambos de los cuales están incorporados en su totalidad mediante esta referencia especifica a los mismos. Se debe entender que también se pueden utilizar otros métodos de producción de ADNss, tanto mediante procesos naturales como mediante métodos artificiales diseñados, que usan diferentes productos de enzimas o sistemas, en conexión con el método de la presente invención, y que los ejemplos establecidos en la presente se establecen para propósitos de ejemplificación, y no se pretende que limiten el alcance de esta descripción o de la invención descrita en la presente. Se compró el plásmido ADNpc3.1/Zeo (+) con Invitrogen Corp. (Carlsbad, California, Estados Unidos) y el plásmido pBK-RSV con Statagene (La Jolla, California, Estados Unidos). Los oligodesoxinucleótidos (ODN) fueron sintetizados por Midland Certified Reagent Co. (Midland, Texas, Estados Unidos) . Las reacciones de cadena de polimerasa (PCR) se realizaron usando la polimerasa de ADN Taq, que se compró con Boehringer Mannheim Corp. (Indianapolis, Indiana, Estados Unidos) en un ciclador térmico de gradiente ROBO (Stratagene (La Jolla, California, Estados Unidos) ) . Las endonucleasas de restricción y la ligasa de ADN T4 se obtuvieron con Boehringer Mannheim Corp. (Indianapolis, Indiana, Estados Unidos) . Los ODNs que se usaron se enlistan en el Listado de Secuencias anexo. EJEMPLO 1. Síntesis In vltro de ADN-ss Se diseñaron cuatro ODNs de una sola cadena (129, 121, 111, y 103 bases de longitud, Nos. ID de Secuencia: 4, 5, 15, y 16, respectivamente) (ver el Listado de Secuencias en la Tabla 1) para que contuvieran una estructura de repetición tándem invertida con una región llamada "relleno" de composición de secuencia de nucleótidos aleatoria, insertada como una secuencia de interés entre la repetición tándem invertida. La repetición tándem invertida se diseñó de tal manera (Figura 2) como para tener un par de sitios de corte de reconocimiento de endonucleasa de restricción adentro de las repeticiones. Los sitios de corte designados para ?? I y Fok I (cortes de reconocimiento de endonucleasa de restricción tipo II y tipo IIS, respectivamente) fueron los oligonucleótidos de longitud de base 111 (ID de Secuencia 15) y 102 (ID de Secuencia 16), y los sitios de corte de endonucleasa de restricción designados para Not I y Mbo II fueron los oligonucleótidos de longitud de 129 (ID de Secuencia 4) y 121 (ID de secuencia 5) bases. En adición, se diseñó una secuencia de fijación de cebador (PBS) de ARNt para el reconocimiento por parte del cebador para la transcriptasa inversa, adentro de los oligonucleótidos. La PBS se localizó 3' corriente abajo desde la repetición tándem invertida. Para cada uno de los oligonucleótidos sintéticos, se añadió 1 µ? (5 µg µl en agua) de alícuotas a cuatro tubos separados, y se calentaron a 70°C durante 5 minutos, y se permitió que se auto-templaran durante 15 minutos a la temperatura ambiente. Este proceso permite la hibridación óptima para la formación de una estructura de tallo-espira; la porción de tallo, que no tiene tramos de secuencia complementaria, no deben experimentar auto-templado significativo, y permanece predominantemente de una sola cadena. Después se realizaron las digestiones de la endonucleasa de restricción estándares con Not I, Fok I, bo II (apropiados para cada oligonucleótido para el cual estaba presente un sitio de corte de endonucleasa de restricción) y EcoR I (como un control negativo) con 10 unidades de enzima, en un volumen de reacción total de 15 µ? y reguladores del pH de reacción apropiados. Se confirmaron las digestiones mediante análisis de gel electroforáticos . Los resultados de este experimento mostraron que un ADNc-ss sintético con repeticiones invertidas formó ADN doble. El ADN doble, presumiblemente el tallo de una estructura de tallo-espira, formó sitios de endonucleasa de restricción específicos y reconocibles, a partir de las secuencias en las repeticiones tándem invertidas, que se diseñaron con el propósito de formar los sitios de endonucleasa de restricción Not I y Fok I mediante la formación de pares de base de Watson-Crick de las bases que comprenden las repeticiones tándem invertidas. Cuando se incubó el ADNc-ss con Not I y Fok I, el ADN se digirió. Cuando se incubó con EcoR I (control negativo) , no se digirió el mismo ADN. EJEMPLO 2. Formación in vltro de ADN-ss a Partir de Transcritos de Cartucho Para conducir este experimento se construyeron dos plásmidos de prueba. Se digirió ADNpc3.1/Zeo (+) con Nhe I y Apa I bajo condiciones estándares. Se permitió que se hibridaran dos conjuntos (A y B) de oligonucleótidos fosforilados 5', que se diseñaron para ser complementarios uno con el otro (ver listados de secuencias anexos). La hibridación se realizó mediante el calentamiento de los oligonucleótidos complementarios a 95°C, y después se les permitió que se enfriaran a la temperatura ambiente durante 15 minutos. Los enlazadores de oligonucleótido dúplex resultantes con extremos de cohesión apropiados, se ligaron bajo condiciones estándares al vector ADNpc3.1/Zeo (+) previamente preparado. Se realizó la selección de clones positivos en placas de ampicilina, después de la transformación a células XLl-Blue MRF (Stratagene) , como lo describen Maniatis, y colaboradores (1989) y la instrucción acompañante. Después de que se captaron los clones positivos, se aisló el ADN del plásmido usando un estuche de aislamiento de plásmidos comercialmente disponible (Quiagen, Inc., Sant Caita, California, Estados Unidos). La confirmación de la ligación del ADN se realizó mediante secuen-ciamiento del ADN. Se linealizaron plásmidos de prueba circulares positivos mediante digestión con Pme I, y se realizaron reacciones de transcripción inversa estándares como sigue. A cada tubo se le añadió 0.1 µg de ADN de plásmido linealizado, 25 unidades de polimerasa T7 (es decir, una polimerasa de ARN dependiente del ADN) , 2.5 rtiM de rNTPs (trifosfatos de ribonucleótido rUTP, rCTP, rGTP, rATP) y un regulador del pH apropiado. Se incubó el tubo de reacción a 37 °C durante 90 minutos. Después de la incubación, se añadieron 10 unidades de ADNasa y se incubó durante 15 minutos a 37°C. se terminó la reacción mediante incubación a 70°C durante 10 minutos. Se realizaron reacciones de síntesis de ADNc estándares, usando las reacciones anteriores. A un tubo fresco se añadieron 5 µ? de la reacción de transcriptasa inversa anterior, 0.2 µg de cebador (ver listado de secuencias) complementario a la región PBS (corriente abajo desde las repeticiones tándem invertidas) . A esta mezcla se añadieron 25 unidades de transcriptasa inversa del virus de leucemia de murino de Moloney , 2.5 mM de dNTPs (trifosfatos de desoxirribonucleótido dTTP, dCTP, dGTP, dATP) , y el regulador del pH de reacción apropiado. Se incubaron las mezclas de reacción a 37 °C durante 1.5 horas. Después del período de incubación, se añadieron 100 unidades de NRasa H y se incubaron los tubos a 37 °C durante 15 minutos. Se incubaron los tubos de reacción a 70°C y se permitió que se templaran mediante enfriamiento a la temperatura ambiente durante 15 minutos. Se dividió la mezcla equitativamente en cuatro tubos, en los cuales se añadieron cualquiera de 10 unidades de enzima de restricción Not I, Fok I, Mbo II, o EcoR I, junto con el regulador del pH de reacción apropiado. Se incubaron los tubos a 37 °C durante 1 hora. Se trataron reacciones de réplica con nucleasa SI (específica para ADNss) . Se resolvió el ADN de las reacciones anteriores mediante electroforesis de gel. Este experimento demostró la producción in vitro del ADNss mediante las actividades enzimáticas secuenciales de la polimerasa de ARN T7, transcriptasa inversa, y NRasa H. El enlazador contenia repeticiones tándem invertidas con los sitios de restricción Not I, Fok I, y Mbo II, una región de "relleno" (que comprendía la espira del intermediario de tallo-espira) , y una PBS de AR t . El plásmido contenía el promotor T7 inmediatamente corriente arriba de la región del enlazador. El análisis de electroforesis de gel de agarosa mostraron la producción por pasos de (1) un intermediario de ARNm de longitud predicha, (s) un ADNc de longitud predicha, y (3) la digestión subsecuente del ADNss por las endonucleasas de restricción correspondientes Not I, Fok I, y Mbo II. Un control negativo en el cual se usó EcoRI no digirió el ADNc-ss. EJEMPLO 3. Síntesis in vivo de ADNc-ss en Células Eucarióticas Los siguientes experimentos in vivo se diseñaron para probar los plásmidos hechos en el Ejemplo 2, que contenían diferentes regiones de "relleno" que se insertaron entre las repeticiones tándem invertidas. Las células del cultivo de tejido que se usaron en estos experimentos codificaron y expresaron endógenamente la polimerasa II de ARN dependiente del ADN eucariótico, que utiliza el promotor RSV localizado corriente arriba del elemento genético clonado que es el segmento de enlazador/relleno descrito en el Ejemplo 1, anterior. Aquellos técnicos en la materia que tengan el beneficio de esta descripción, reconocerán que se puede usar cualquier promotor eucarióti-co para este propósito. Además esas personas reconocen que una polimerasa de ARN dependiente del ADN codificado por vector también funcionará en esta capacidad. Construcciones de plásmidos . Se permitió que los ODNs se hibridaran en 1 µ? (5 µ?/µ? en agua) en cuatro tubos separados que se incubaron a 70°C durante 5 minutos, y se permitió que hibridaran durante 15 minutos a la temperatura ambiente. Se realizaron digestiones de endonucleasa de restricción estándares (EcoR I usado como un control negativo) con 10 unidades de enzima en un volumen de reacción total de 15 µ? y reguladores del pH de reacción apropiados. Se resolvieron fragmentos de ADN, y se aislaron de geles de agarosa. La selección de clones positivos en placas de ampicilina se realizó después de la transformación a células XLl-Blue MRF competentes (Stratagene) como lo describen Maniatis, y colaboradores (1989) . Después de que se seleccionaron los clones positivos, se aisló el ADN de plásmido usando el estuche de aislamiento de plásmido Quiagen descrito anteriormente . Se describe la construcción de tres plásmidos de expresión. El primer plásmido B se derivó de ADNpc3.1/Zeo (+) (Figura 7A) mediante la digestión con las endonucleasas de restricción Nhe I y Apa I, que se localizan en el sitio de clonación múltiple (MCS) . Se ligó el oligodesoxinucleótido de doble cadena que tenia los extremos compatibles Nhe I y Apa I, que se formó por medio de templar los oligodesoxinucleótidos sintéticos, de una sola cadena con ID de Secuencia 4 /ODN-PMMV ( + ) e ID de Secuencia 5/ODN-PMMV (-) , dentro del ADNpc3.1/Zeo ( + ) digerido, para dar pMMV. Este inserto contiene la región del promotor/sitio de fijación de cebador (PBS) de la transcriptasa inversa del virus de leucemia de Ratón de Moloney (MoMuLV-RT) . Este también contiene dos sitios Not I, únicos para pMMV, y un sitio Mbo II. En este plásmido, y los plásmidos derivados a partir de esta construcción, las cadenas designadas (+) se colocan para que se transcriban dentro del ARN del promotor de citomegalovirus de ADNpc3.1/Zeo ( + ) . El plásmido B, ADNpss-Express-B, que contiene sitios para la inserción conveniente de una secuencia de interés que se vaya a expresar in vivo como ADNss, se obtuvo mediante la ligación de la secuencia de doble cadena formada por medio de templar ODN-XB(+) y ODN-XB(-), que tenia voladizos compatibles de Not I, entre los sitios Not I de pMMV. En la Figura 5 se muestra la estructura del ADNpss-Express-B. Las células de mamíferos que contienen el plásmido, se pueden seleccionar con la zeocina antibiótica. En la Figura 5A se muestra la posición y la configuración general de las regiones clave del inserto y la configuración específica de las secuencias del inserto se muestran en la Figura 5B. La transcripción de la región del inserto se activa mediante el promotor del citomegalo-virus y se termina en la región poliA del BGH. El transcrito del ARN contiene el promotor núcleo del MoMuL V junto con algunas regiones de flanqueo de este promotor, cuyas posiciones se indican en la Figura 5B. La transcriptasa inversa sintetiza una copia de la cadena ( + ) (superior), usando el pro ARNt como un cebador, empezando en la posición del promotor del núcleo. La digestión de la cadena del ARN mediante la ARNasa H, libera una secuencia de ADN de una sola cadena que contiene las repeticiones invertidas complementarias IR-L e IR-R (Figura 1). La formación doble mediante estas repeticiones en la Figura 2, crea un tallo-espira con la secuencia de interés en el ciclo. El tallo contiene un sitio de reconocimiento para el Mbo II, GAAGA, que se coloca de manera que la enzima, la cual disocia 8/7 bases 3' para el sitio de reconocimiento GAAGA, libera la secuencia de interés a partir de las secuencias del vector de flanqueo. Para obtener el pTest del plásmido B, a partir del cual se expresa una secuencia de interés que sirvió como una secuencia de control, el oligonucleótido de cadena doble que se forma mediante el sintético ablandado, la Seq. ID 11/ODN-Test (+) y la Seq. ID 12 /ODN-Test ( - ) de los oligonucleótidos de cadena única, las cuales tienen extremos Not 1 compatibles, se insertó entre los sitios Not 1 del pMMV. El plásmido B que expresa la secuencia de repetición telomérica pTelo como la secuencia de interés, se obtuvo de manera similar, insertando las Seq. ID 13/0DN-Telo (+) y Seq. ID 14/ODN-Telo (-) de los oligonucleótidos compatibles Not 1, ablandados entre los sitios Not 1 del pMMV (Figura 6A) . La última secuencia enlazadora contiene nueve repeticiones de la secuencia de telómera del vertebrado 5 ' -AGGGTT-3 ' (Figura 6B) . Blackburn, E.H., 350 Nature 569-575 (1991). Se construyó un tercer plásmido B, que se llama pMN-nuevo-enlace, en el cual el tallo comprendió 29 pares de base (más bien que el sitio del tallo de 27 pares base del p NV) debido a que el tallo de 29 pares de base da una estructura de tallo-espira más estable en el intermediario de tallo-espira, que el sitio de tallo de 27 pares de base del pMNV. El pNM-nuevo-enlace se formó por medio de ligar dos ODN' s auto-complementarios, el ODN-NM-enlace-nuevo (+) y el ODN-NM-enlace-nuevo (-) , entre los dos sitios Not 1 dentro del pMNV. El plásmido A, el ADNpss-Express-A (Figura 4), se preparó a partir de pBK-RSV (Stratagene) usando RF Azul XL-1 como la célula anfitriona. Se obtuvo una linea celular de ratón que expresó el virus de leucemia murina de Moloney, a partir de la Colección de Tipos de Cultivos Americana (#CRL-1858) . Se aisló el ARN del virus y se preparó para la transcriptasa-Reacción de Cadena de Polimerasa inversa (RT-PCR) . Se amplificó mediante reacción de cadena de polimerasa un fragmento de 2.4 kb que contenia la secuencia de codificación del MoMuL V-RT, usando cebadores como comienzo en la Seq. ID l/ODN-RT(-) (posición del cebador en el nucleótido #2545) y la Seq. ID 2/ODN-RT(+) (posición del cebador en el nucleótido #4908), para producir un fragmento de ADN con un 5 ' -Sac y un 31 -Hind III de extremo compatible. El producto de 2.4 kb que se obtuvo incluía la secuencia del genoma MoMuLV entre las posiciones 2546 y 4908. Se codificó la transcriptasa inversa del virus maduro mediante la secuencia entre las posiciones 2337 y 4349 (Petropoulos, C.J., Taxonomía retroviral, estructura de la proteína, secuencias y mapas genéticos, en J.M. Coffin (ed. ) , Retrovirus, 757, Apéndice 2, New York; Cold Spring Harbor Press (1997)), pero los péptidos que se truncaron en la terminación amino retienen la actividad completa (N. Tañese y colaboradores, 85 Proc. Nati. Acad. Sci . USA 1777-1781 (1998)). El péptido que se codificó mediante esta construcción incluye una parte del gen de integrasa, el cual sigue la transcriptasa inversa en la poliproteína del MoMuLV, pero no es relevante aquí de manera que la longitud de la construcción se seleccionó debido a la capacidad de un sitio de restricción conveniente para la clonación. La bacteria Moraxella bovis, la cual codifica la endonucleasa de restricción MboII (Bocklage, H. y colaboradores, 19 Nucleic Acids Res. 1007-1013 (1991)), se obtuvo de la Colección de Tipos de Cultivos Americana (ATCC#10900) . Se aisló el ADN genómico a partir de la M. bovis y se usó como el ADN de plantilla en la reacción de cadena de polimerasa. Se amplificó un fragmento de 1.2 kb que contenía el gen Mbo II mediante la reacción de cadena de polimerasa, usando como cebadores la Seq.

ID 3/0DN-Mbo(+) (posición del cebador en el nucleótido #887) y la Seq. ID 8/0DN-Mbo(-) (posición del cebador en el nucleótido #2206) . Estos cebadores contienen desigualdades que se diseñan para introducir un sitio Hind III dentro del cebador 5' y un sitio Xba dentro del cebador corriente abajo 3'. El producto de amplificación de ADN de 1.2 kb, que copia el genoma de la M. bovis entre las posiciones 888 y 2206, contiene por tanto la región de codificación para la proteina del Mbo II. Se digirió el producto de amplificación con el Hind III y el Xba I. El pBK-RSV se digirió con el Xba y el Nhe I para remover la región del promotor. El extremo Nhe I se convirtió en un extremo Sac I, usando el enlazador que se formó mediante la Seq. ID 6/ODN-N>S(+) y la Seq. ID 7/ODN-N>S(-) de los oligonu-cleótidos suavizados. Se ligaron la transcriptasa inversa y los amplimeros del Mbo II a través de los sitios Hind III y esta construcción se ligó subsecuentemente entre los sitios Sac I y Xba I del p-BK-RSV, para producir el pBK-RSV-RT/Mbo . Para insertar un enlazador flexible entre la transcriptasa inversa y los dominios del Mbo II de la poliproteina y para proporcionar una etiqueta útil para la purificación de la proteina, se insertó la secuencia de cadena doble que se formó por medio de suavizar la Seq. ID 9/ODN-HisPro (+) y la Seq. ID 10/ODN-HisPro (-) de los oligonucleótidos , que codifican los aminoácidos de la histidina y la prolina alternativas, dentro del pBK-RSV-RT/Mbo por medio de digerirla con el Hind III. El enlazador his-pro, con los extremos Hind III compatibles, se insertó en el sitio Hind III para producir el plásmido pBK-RSV-RT/Mbo-L y se confirmó la orientación mediante el secuenciamien-to. Sin embargo, el pBK-RSV-RT/Mbo-L de secuenciamiento reveló una mutación de cambio de estructura en el extremo 5' del dominio Mbo II. Se corrigió esta mutación y se removió simultáneamente la parte extraña, por medio de extirpar el fragmento del plásmido que yacia entre los sitios Ase I y Bgl II, los cuales codifican el extremo 5' del gen Mbo II, la región del enlazador his-pro y el fragmento del gen 51 -Mbo II. El enlazador his-pro modificado incrementó el número de histidinas en uno, hasta seis, e incluyó en el extremo 5' un número de sitios de restricción únicos. Se modificó el extremo 5' del gen Mbo II para reemplazar la leucina en el término N que se introdujo, mediante la desigualdad en el cebador de la reacción de cadena de polimerasa, a la metionina original y para optimizar el uso del codón para la expresión de este segmento del gen en las células de mamíferos. La construcción de reparación se obtuvo mediante la síntesis del ADN cebado de manera mutua a partir de dos plantillas, ODN-Rep(+) y ODN-Rep(-), que tienen secuencias complementarias de 16 bases en los extremos 3'. Se suavizaron estos oligonucleótidos y se extendieron con la enzima de polimerasa del ADN SEQUENASE® modificado (United States Biochemical Corp.). Se digirió el producto de cadena doble con Ase I y Bgl II y se insertó dentro del plásmido para dar el ADNpss-Express-A (plásmido A) .

En la Figura 8A se muestra la estructura del ADNpss-Express-A. Como se estableció anteriormente, para construir este plásmido, las secuencias que codifican un fragmento activo de la transcriptasa inversa del MoMuLV y la enzima de restricción Mbo II de la M. bovis se clonaron entre los sitios Nhe I y Xma I del vector de expresión eucariótico pBK-RSV. La transcripción de la región clonada se activa mediante el promotor RSV y la selección para las células transformadas se realiza en la presencia del antibiótico G418 (neomicina) . La transcriptasa inversa y el Mbo II se expresan como una sola cadena de proteínas, difuncional con los dos dominios funcionales separados mediante un enlazador rico en histidina y prolina, corto. Estudios de Cultivos de Tejidos. Se realizaron transfecciones estables y pasajeras mediante el uso de lipofec-tante (Boehringer Mannhiem Corp.), usando las instrucciones acompañantes del fabricante. Todas las construcciones de los plásmidos se transfectaron dentro de las líneas celulares de HeLa. Los ensayos para el ADNss se realizaron mediante la reacción de cadena de polimerasa y mediante el análisis de punto-mancha de 24 a 48 horas después de la transfección. Se sometió a ensayo la actividad de la transcriptasa inversa usando el ensayo RT-reacción de cadena de polimerasa que desarrollaron Silver, J. y colaboradores (21 Nucleic Acids Res . 3593-3594 (1993)). Después de la transfección con el plásmido ADNpss-Express-A (Figura 11, panel A) . Los aislados de la colonia individual de las líneas celulares HeLa sustituidas de manera estable (A12 y B12), se sometieron a ensayo de manera adicional para la actividad de RT (Figura 11B) . Se aisló el ADNss-c a partir de las células que se transfectaron de 48 a 72 horas antes. Como se describió anteriormente, el ADNss-c, el cual se localiza junto con el ARB, se realizó usando reactivo de trizol (Gibco Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, Estados Unidos) . Los ensayos para las especies de ADNss-c especificas, se realizaron tanto por medio de ensayos basados en la reacción de cadena de polimerasa (Figura 12 para el pTest y Figura 13 para pTelo) para el fragmento interno, como por medio de electroforesis de gel de cadena única desnaturalizada con manchado y sondeo de nailon subsecuente, con una sonda etiquetada con biotina interna. Este experimento mostró que las células del cultivo de tejido humano (las lineas celulares HeLa y Cos-7), que se co-transfectaron con los plásmidos A y B, produjeron el ADNss-c del tamaño predicho. Aquellos técnicos en la materia, sin embargo, reconocerán que también se puede usar un solo plásmido que incluya la plantilla de ARN para el intermediario de tallo-espira y los genes para la transcriptasa inversa y la endonuclea-sa de restricción para este propósito, como se describe en otros ejemplos que se describen en la presente. El vector pNM-Enlace-Nuevo (el cual después de la conversión de una sola cadena contiene la estructura de tallo de 29 pares de base más estable, se usó para los experimentos in vitro para demostrar la terminación prematura del transcrito de ADNc de la transcriptasa inversa en el aspecto 3 de la estructura de tallo. Como se muestra en la Figura 14, también hubo alguna lectura "pasante" de este transcrito a través de la estructura de tallo también (ver las bandas más grandes en la Figura 14) . La secuencia de interés que se produjo a partir de esta terminación prematura, es la segunda secuencia de interés a la que se hace referencia en la presente. EJEMPLO 4. Síntesis In vivo del ADNss-c Que Incluye la Enzima del ADN en las Células Eucarióticas . Los siguientes experimentos in vivo se diseñaron para probar si se puede utilizar el sistema de vector de la presente invención para producir el ADNss que incluye una secuencia de enzima de ADN en las células del cultivo de tejido eucariótico. Construcciones de Plásmido . Se prepararon ODNs y se construyeron los plásmidos de la misma manera que se describe en el Ejemplo 3, anterior. Construcción del Plásmido B. Una segunda modalidad del primero de los dos plásmidos que comprenden una modalidad de dos plásmidos del sistema de vector de la presente invención, es el plásmido "4B". El plásmido 4B, al igual que el plásmido ADNpss-Express-B que se describe en el Ejemplo 3, se derivó a partir del ADNpcA3.1/Zeo (+) (Invitrogen Corp.), que se muestra en la Figura 7. El ADNpss-Express-4B se construyó por medio de digerirse con las endonucleasas de restricción Hind III y Not I en las posiciones 911 y 978, respectivamente. La región del enlazador de cadena doble que tiene los extremos Hind III y Not I que se forman por medio de suavizar los oligonucleótidos sintéticos, de una sola cadena ODN-5 ' -N/M (enlace) 2-H/N y ODN-3 ' -N/M (enlace) 2-H/N de una sola cadena, se ligó bajo condiciones estándares dentro del ADNpcA3.1/Zeo ( + ) digerido que se transformó en células Sure II (Stratagene, Inc.). Se permitió que los ODNs se hibridaran en 1 µ? (5 ug/µ? en agua) en tubos de Ependorf que se incubaron a 70 °C durante 5 minutos y se permitió que se hibridaran durante 15 minutos a la temperatura ambiente. Se seleccionaron clones apropiados y se secuenciaron para asegurar la inserción apropiada de la región del enlazador. Al plásmido resultante se le llamó ADNpcA3.1/Zeo (+) /NM-enlace2-gag y se le renombró ADNpss-Express-4B. En la Figura 7B se muestra el ADNpss-Express-4B y es el plásmido dentro del cual se clona la secuencia de interés. Para clonar las secuencias de interés entre las repeticiones de tándem invertidas, se usaron los dos sitios Not I en las posiciones 935 y 978, respectivamente (ver la Figura 7B) . Estos dos sitios están contenidos dentro de las repeticiones de tándem invertidas. Para insertar las secuencias de interés entre las repeticiones de tándem invertidas y el sitio de fijación del cebador, se usaron dos sitios de endonucleasa de restricción convenientes, el Pac I y el Bam H I, en las posiciones 1004 y 1021, respectivamente. Construcción del Plásmido A. El segundo plásmido del sistema de dos plásmidos que comprende esta segunda modalidad del vector de la presente invención, es el plásmido A, ADNpss-Express-A, que se muestra en la Figura 8A, que se preparó como se describe en el Ejemplo 3. Construcción del Plásmido C. Como se notó anteriormente, el sistema de vector de la presente invención puede tomar también la forma de un solo plásmido. Para producir un sistema de vector de un solo plásmido, o plásmido "C", se digirió el plásmido ADNpss-Express-A con Sac I y Xma I para remover el gen Mbo II (Figura 8B) . Una región del enlazador que comprende los oligonucleótidos 5 '- (enlace) 2-Hind/Xba y 31 - (enlace) 2-Hind/Xba (Tabla 1), a los cuales se les permitió suavizarse a 70°C durante 15 minutos y que se enfriaron lentamente a la temperatura ambiente, se ligó dentro del plásmido después de la digestión bajo condiciones estándares. Se cultivaron los clones positivos y se secuenciaron para verificar la colocación del enlazador y después se digirió este plásmido con Xba e Hind III. Después se digirió el plásmido ADNpss-Express-B con el Hind III y el Xba y los fragmentos correspondientes de ADN de 300 pares de base que contenían las repeticiones de tándem invertidas que se describieron previamente, el sitio de clonación múltiple, y el PBS, se clonaron dentro del plásmido digerido par dar el ADNpss-Express-C (Figura 9A) . Se realizaron las reacciones de ligación estándares y se transformaron en células Sure II (Stratagene, Inc.). Se cultivaron las colonias positivas transformadas y se identificaron los clones positivos mediante el análisis de restricción.

Se clonaron las secuencias de interés dentro del sitio de múltiple clonación del ADNpss-Express-C, mediante el uso de los sitios Bam H I y Pac I en el sitio de clonación múltiple (Figura 9B) . Las cuatro diferentes secuencias de interés como se enlistan en la Tabla 1, cada una incluyendo la "enzima ADN 10-23" insertada entre los aspectos 5' y 3' de la secuencia anti-sentido (Figura 9C) y que se muestran en las Figuras 10A-10D, se sintetizaron para estas construcciones, y se utilizaron procedimientos similares par insertar cada una de las cuatro secuencias de interés. Se preparó cada construcción por medio de permitir que los oligonucleótidos emparejados se suavizaran a 70°C durante 15 minutos y que se enfriaran a la temperatura ambiente, seguido por la ligación dentro del plásmido bajo condiciones estándares. Después de la transformación en células Sure II, se seleccionaron las colonias apropiadas con la verificación mediante secuenciamien-to para los insertos individuales. Se probó la capacidad antisentido de cada uno de estos plásmidos por medio de transfectar cada plásmido con los controles apropiados, los cuales contenían una secuencia aleatoria de longitud igual y no contenían insertos anti-sentido ni la "enzima ADN 10-23", dentro de las células HeLa, usando el reactivo lipofectante (Boehringer Mannheim) bajo condiciones estándares. Se usó el reactivo Trizol para cultivar las células y la fracción de ARN, y se realizó un análisis de manchado Northern subsecuente para demostrar la expresión anti-sentido específica .

Estudios de cultivo de tejidos. Se realizaron transfec-ciones estables y pasajeras mediante el uso del lipofectante (Boehringer Mannheim Corp.), usando las instrucciones acompañantes del fabricante. Se transfectaron todas las construcciones de los plásmidos en lineas celulares HeLa. Los ensayos para el ADNss se realizaron mediante la reacción de cadena de polimerasa y mediante análisis de punto-mancha de 24 a 48 horas después de la transfec-ción. Se sometió a ensayo la actividad de la transcriptasa inversa, usando el ensayo RT-PCR que desarrollaron Silver, J. y colaboradores, supra, después de la transfección con el plásmido del ADNpss-Express-A. Los aislados de la colonia individual de las lineas celulares HeLa que se sustituyeron de manera estable (A12 y B12) se sometieron a ensayo adicionalmente para la actividad RT. Se aisló el ADNss-c a partir de las células que se transfectaron de 48 a 72 horas antes, usando el reactivo Trizol. Se realizaron los ensayos para las especies de ADNss-c mediante los dos ensayos basados en la reacción de cadena de polimerasa para el fragmento interno y mediante electroforesis desnaturalizada de gel de una sola cadena con manchado de nailon y sondeo con una sonda etiquetada con biotina interna. Este experimento mostró que las células del cultivo de tejido humano (linea celular HeLa) que se transfectaron con los plásmidos que se diseñaron para sintetizar un ADN-ss-c procesa-do, produjeron el ADNss-c del tamaño predicho. Como se describió en el Ejemplo 3, la secuencia del ADNss de interés que se produjo de conformidad con el método de la presente invención, se produce a partir ya sea de la posición entre las repeticiones invertidas después de la digestión del tallo del intermediario de tallo-espira, o a partir de la posición entre las repeticiones invertidas y el sitio de fijación del cebador, mediante la terminación prematura del transcrito del ADNc de transcriptasa inversa en el aspecto 3' de la estructura de tallo. La secuencia de interés que se produjo a partir de esta terminación prematura, es la segunda secuencia de interés a la que se hace referencia en la presente. La Figura 15 muestra que las células que se transfectan con el plásmido ADNpss-Express-4B que tiene la enzima 10-23 incluida en la secuencia anti-sentido contra la cinasa c-raf que se utilizó como la secuencia de interés, produjo una secuencia anti-sentido contra la cinasa c-raf que incluía la enzima de ADN 10-23 a partir de la posición entre las repeticiones tándem invertidas y el sitio de fijación del cebador. * * * * * * * * * * * * Los experimentos que se describieron anteriormente demuestran un método de producción de ADNss in vitro e in vivo mediante múltiples reacciones por paso, usando las reacciones de la transcriptasa inversa eucariótica y diferentes reacciones de cebado del ADNc. Esta reacción fue seguida por la formación de un intermediario de "tallo-espira", el cual se puede usar para eliminar cualesquier secuencias no deseadas ya sea corriente arriba 5' o corriente abajo 3' a partir de un "tallo" diseñado (y formado) después de haberse disociado de manera subsecuente mediante una endonucleasa de restricción. Se podría producir cualquier secuencia de nucleótidos de interés mediante este método en una célula eucariótica. Esta secuencia de interés se clona (o se sintetiza) entre las repeticiones tándem invertidas diseñadas y representa la secuencia en la "espira", después de la producción del ADNss y la subsecuente formación del tallo-espira. La secuencia de interés que se va a producir puede ser de cualquier composición base (es decir, ?, T, G, C) , siempre que la secuencia no interfiera con la formación del tallo del intermediario de tallo-espira estable, el cual puede incluir de manera opcional el elemento genético funcional tal como una secuencia de reconocimiento de enzima especifica, por ejemplo, un sitio que sirva como un sustrato para una endonucleasa de restricción particular. Nuevamente, también se puede usar cualquier endonucleasa de restricción para digerir (o disociar) la porción del tallo del intermediario de tallo-espira, siempre que el sitio de reconocimiento para esa endonucleasa de restricción particular se haya diseñado dentro de la repetición tándem invertida. Aunque se describe con referencia a las figuras y los ejemplos específicos que se establecen en la presente, aquellos técnicos en la materia reconocerán que se pueden hacer ciertos cambios a los elementos específicos que se describen en la presente, sin cambiar la manera en la cual esos elementos funcionan para lograr sus resultados respectivos propuestos. Por ejemplo, el cartucho que se describe en la presente está comprendido por tres elementos genéticos, una secuencia de interés, una repetición tándem invertida, y un sitio de fijación del cebador. Otros elementos genéticos incluyen un gen de endonucleasa de restricción opcional y un gen de transcriptasa de reversa, proporcionándose cada uno de estos genes con los promotores apropiados, como se describe en la presente. Aquellos técnicos en la materia reconocerán que, por ejemplo, el gen de transcriptasa de reversa del virus de leucemia Moloney que se describió para el uso como el gen de transcriptasa de reversa del cartucho, se puede reemplazar con otros genes de transcriptasa de reversa (el gen de transcriptasa de reversa a partir del virus de inmunodeficiencia humano fue uno de estos genes, el cual se anotó anteriormente) y se pueden usar promotores que no sean el promotor CMV de manera conveniente. Además, anteriormente se alistaron diferentes genes de endonucleasa de restricción, pero aquellos técnicos en la materia reconocerán a partir de esta descripción que la lista que se estableció anteriormente no es exhaustiva, y que muchos otros genes de endonucleasa de restricción funcionarán a conveniencia en conexión con la presente invención. De manera similar, el promotor RSV que se describe usándose en conexión con los genes de endonucleasa de restricción que se describen en la presente, no es el único promotor que se puede usar a conveniencia. Se pretende que todos estos cambios y modificaciones que no se apartan del espíritu de la presente invención, caigan dentro del alcance de las siguientes reivindica-ciones no limitantes.

Tabla # 1 ODN- PMMV(+) 5'-CTAGGTCGGCGGCCGCGAAGATTGGTGCGCACACACACAACGCGCA 129 bases (#23) CCAATCTTCGCGGCCGCCGACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCATTTGGGGG CTCGTCCGGGATCGGGAGACCCCTGCCCAGGGCC-3' ODN-PMMV(-) 5'-CTGGGCAGGGGTCTCCCGATCCCGGACGAGCCCCCAAATGAAAGAC 121 bases (#24) CCCCGCTGACGGGTCGGCGGCCGCGAAGATTGGTGCGCGTTGTGTGTGT GCGCACCAATCTTCGCGGCCGCCGAC-3 ' ODN-Test (+) 5'-GGCCGGAAGATTGGGGCGCCAAAGAGTAACTCTCAAAGGCACGCGC 5 7 bases (#38) CCCAATCTTCC-3 ' ODN-Test (-) 5 ' -GGCCGGAAGATTGGGGCGCGTGCCTTTGAGAGTTACTCTTTGGCGC 57 bases (#39) CCCAATCTTCC-3 ' ODN-Telo (+) 5'-GGCCGGAAGATTGGGGCGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAG 92 bases (#40) GGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGCGCCCCAATCTTCC-3' ODN-Telo (-) 5 '-GGCCGGAAGATTGGGGCGCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCT 92 bases (#41) AACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACGCCCCAATCTTCC-3' ODN-XB(+) 5'-GGCCTTGAAGAGCGGCCGCACTAACACCACCACAGTGCGGCCGCTC 51 bases TTCAA-3' ODN-XB(-) 5'-GGCCTTGAAGAGCGGCCGCACTGTGGTGGTGTTAGTGCGGCCGCTC 51 bases TTCAA-3' ODN-RT (+) 5 '-GGGATCAGGAGCTCAGATCATGGGACCAATGG-3 ' 32 bases (#13) ODN-RT (-) 5 '-CTTGTGCACAAGCTTTGCAGGTCT-3 ' 24 bases (#12) ODN-N>S(+) 5 '-CTAGCGGCAAGCGTAGCT-3 ' 18 bases (#25) ODN-N>S (-) 5'-ACGCTTGCCG-3' 10 bases (#26) ODN-Mbo (+) 5 '-CAATTAAGGAAAGCTTTGAAAAATTATGTC-3 ' 30 bases (# 16) ODN -Mbo (-) 5 '-TAATGGCCCGGGCATAGTCGGGTAGGG-3 ' 27 bases (#33) ODN-HisPro (+) 5 '-AGCTGGATCCCCCGCTCCCCACCACCACCACCACCCTGCCCCT-3 ' 43 bases (#36) ODN-HisPro (-) 5 '-AGCAGGGGCAGGGTGGTGGTGGTGGTGGGGAGCGGGGGATCC-3 ' 42 bases (#37) ODN-Rep(+) 5 ' - ATATCTATTAATTTTGGCAAATCATAGCGGTTATGCTGACTCAGGT 121 bases GAATGCCGCGATAATTTTCAGATTGCAATCTTTCATCAATGAATTTCAG TGATGAATTGCCAAG ATTGATGTTGC-3 ' ODN-Rep(-) 5'-GACGAGATCTCCTCCAGGAATTCTCGAGAATTCGGATCCCCCGCTC 111 bases CCCACCACCACCACCACCACCCTGCCCCGCGGATGAAAAATTATGTGAG C AACATCAATCTTGGC-3 ' . Nombre: 3 '- T Mol-Hind III (24-mer) Secuencia: 5'-CTT GTG CAC AAG CTT TGC AGG TCT-3' 2. Nombre: 5'-RT/Mol-Sac I (32-mer) Secuencia: 5'-GGG ATC AGG AGC TCA GAT CAT GGG ACC AAT GG-3 ' 3. Nombe: 5 '-Mbo II-Hind III (30-mer) Secuencia: 5 '-CAA TTA AGG AAA GCT TTG AAA AAT TAT GTC-3' 4. Nombre: 5'-RT-Not-Mbo-Link (129-mer) , Secuencia: 5'-CTA GGT CGG CGG CCG CGA AGA TTG GTG CGC ACA CAC ACA ACG ' CGC ACC AAT CTT CGC GGC CGC CGA CCC GTC AGC GGG GGT CTT TCA TTT GGG GGC TCG TCC GGG ATC GGG AGA CCC CTG CCC AGG GCC 5. Nombre: 5'-RT-Not-Mbo-Link (121-mer) Secuencia: 5'-CT GGG CAG GGG TCT CCC GAT CCC GGA CGA GCC CCC AAA TGA AAG ACC CCC GCT GAC GGG TCG GCG GCC GCG AAG ATT GGT GCG CGT TGT GTG TGT GCG CAC CAA TCT TCG CGG CCG CCG AC-3' 6. Nombre: 5'-Nhe-Sac-Link (18-mer) Secuencia: 5'-CTA GCG GCA AGC GTA GCT-3 ' 7. Nombre: 3 '-Nhe-Sac-Link (10-mer) Secuencia: 5'-ACG CTT GCC G-3 ' 8. Nombre: 3 '-Mbo II-Xba l (27-mer) Secuencia: 5'-TAA TGG CCC GGG CAT AGT CGG GTA GGG -3 ' 9. Nombre: 5'-Hind-link-Histag (43-mer) Secuencia: 5'-A GCT GGA TCC CCC GCT CCC CAC CAC CAC CAC CAC CCT GCC CCT- 3 ' 10. Nombre: 3'-Hind-link-Histag (42-mer) Secuencia: 5'-AGC AGG GGC AGG GTG GTG GTG GTG GTG GGG AGC GGG GGA TCC- 3 ' 1 1. Nombre: 5'-Not-link-testl (57-mer) Secuencia: 5'-G GCC GGA AGA TTG GGG CGC CAA AGA GTA ACT CTC AAA GGC ACG CGC CCC AAT CTT CC-3' ^12.. Nombre: 3'-Not-link-testl (57-mer) Secuencia: 5'-GGC CGG AAG ATT GGG GCG CGT GCC TTT GAG AGT TAC TCT TTG GCG CCC CAA TCT TCC-3' 13. Nombre: 5'-Not-Mbo-link-telo (92-mer) Secuencia: 5'-GGC CGG AAG ATT GGG GCG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG ITA GGG CGC CCC AAT CTT CC- 3' 14. Nombre: 3'-Not-Mbo-link-telo (92-mer) Secuencia: 5'-GGC CGG AAG ATT GGG GCG CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CGC CCC AAT CTT CC-3' ^ 15. 5 '-SL-linker-Fokl -RT (111 -mer) Secuencia :5'-CTA GTC GGA TGC GGC CGC TGC ACA ACA ACA CAC AAC ACA GCG GCC GCA TCC GAT CAG CGG GGG TCT TTC ATT TGG GGG CTC GTC CGG ATC GGG AGA CCC CTG CCC AGC GCC-3' 16. 3 '-SL-linker-Fokl -RT (103-mer) Secuencia: 5'-CTG GGC AGG GGT CTC COG ATC CGG ACG AGC CCC CAA ATG AAA GAC CCC CGC TGA TCG GAT GCG GCC GCT GTG TTG TTT GTT GTT GTG CAG CGG CCG CAT COG A-3'

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un conjunto de elementos genéticos adaptados para incorporación en un vector para entrega a una célula, que comprende : un cartucho que comprende (a) una codificación de secuencia para una secuencia de interés flanqueada por secuencias complementarias 31 y 5 ' que comprenden una repetición tándem invertida y (b) una secuencia que codifica un primer sitio de ligadura en una posición 3' respecto de la repetición tándem invertida; y un gen que codifica una transcriptasa inversa.
2. El conjunto de elementos genéticos de la reivindicación 1, donde dicho gen de transcriptasa inversa es seleccionado del grupo que consiste en los genes de transcriptasa inversa del virus de leucemia de murino Moloney o el virus de la inmunodefi-ciencia humana.
3. El conjunto de elementos genéticos de la reivindicación 1, comprendiendo adicionalmente un promotor eucariótico para dicho gen de transcriptasa inversa.
4. El conjunto de elementos genéticos de la reivindicación 1, comprendiendo adicionalmente un promotor eucariótico para dicha secuencia de interés .
5. El conjunto de elementos genéticos de acuerdo con ya sea la reivindicación 3 o 4, donde el promotor es seleccionado del grupo que promotores que comprenden promotores constitutivos, inducibles, de amplio espectro, o específicos de tejido.
6. El conjunto de elementos genéticos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, comprendiendo adicionalmen-te una segunda codificación de secuencia para una secuencia de interés entre la secuencia que codifica PBS y la repetición tándem invertida de dicho cartucho.
7. Un conjunto de elementos genéticos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la secuencia de interés es una molécula de ácido nucleico de un solo filamento.
8. Un conjunto de elementos genéticos de acuerdo con la reivindicación 7, donde la molécula de ácido nucleico de un solo filamento es ADNc.
9. Un conjunto de elementos genéticos de acuerdo con la reivindicación 7, donde la molécula de ácido nucleico de un solo filamento en ARNm.
10. Un conjunto de elementos genéticos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, donde la molécula de ácido nucleico de un solo filamento es una molécula de ácido nucleico inhibitoria.
11. Un conjunto de elementos genéticos de acuerdo con la reivindicación 10, donde la molécula de ácido nucleico inhibitoria es una secuencia anti-sentido o aptámero.
12. Una transcripción de ARNm del conjunto de elementos genéticos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores .
13. Un método de producir ADN de un solo filamento que tiene una secuencia de interés, que comprende los pasos de transcribir un gen de transcriptasa inversa y un cartucho que comprende (a) una codificación de secuencia para una secuencia de interés flanqueada por secuencias complementarias 3' y 5' comprendiendo una repetición tándem invertida y (b) una secuencia que codifica un primer sitio de ligadura en una posición 3' con respecto de la repetición tándem invertida en el núcleo de una célula, y transcribir de manera inversa la transcripción de ARNm del cartucho con la transcriptasa inversa producida por el gen de transcriptasa inversa.
14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, comprendiendo además el paso de remover ARNm del heterodúplex ARNm/ADNc formado por transcripción inversa del ARNm.
15. El método de la reivindicación 13 o 14, comprendiendo adicionalmente linealizar el ADNc resultante.
16. El método de la reivindicación 15, donde el ADNc es linealizado incluyendo un sitio de endonucleasa de restricción en la repetición tándem invertida, el ADNc formando un tallo-espira intermedio por formación de pares de bases Watson-Crick de la repetición tándem invertida, y cortar el tallo del tallo-espira intermedio con una endonucleasa de restricción.
17. El método de la reivindicación 13, comprendiendo adicionalmente promover de manera inducible la transcripción del gen de transcriptasa inversa.
18. El método de la reivindicación 17, donde la transcripción del gen de transcriptasa inversa es promovida con un promotor eucariótico.
19. Una construcción de ácido nucleico para entrega en una célula, que comprende: secuencias complementarias 3 ' y 5 ' que comprenden una repetición tándem invertida, una secuencia que codifica un primer sitio de ligadura para una transcriptasa inversa ubicada en una posición 3 ' con respecto de la repetición tándem invertida, y una codificación de secuencia para una secuencia de interés ubicada ya sea entre las secuencias complementarias 3' y 5' de la repetición tándem invertida, o entre la repetición tándem invertida y la secuencia que codifica el sitio de ligadura de cebador 31.
20. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 19, donde la secuencia que codifica la secuencia de interés está ubicada entre las secuencias complementarias 3' y 5' de la repetición tándem invertida.
21. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 20, donde la repetición tándem invertida es capaz de formar un tallo-espira intermedio en un producto de ácido nucleico de un solo filamento codificado por dicha construcción de ácido nucleico, dicha secuencia de interés o secuencia que codifica dicha secuencia de interés en la espira y dicha repetición tándem invertida formando el tallo.
22. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 20 o 21, la cual comprende una segunda codificación de secuencia para una secuencia de interés ubicada entre la repetición tándem invertida y la secuencia que codifica el sitio de ligadura de cebador 3'.
23. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, donde la repetición tándem invertida comprende una secuencia que codifica una o mas secuencias de reconocimiento de enzima especificas.
24. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 23, donde la secuencia de reconocimiento de enzima especifica comprende un sitio de endonucleasa de restricción.
25. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 24, comprendiendo además un gen que codifica una endonucleasa de restricción.
26. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 25, donde el gen de endonucleasa de restricción está ubicado en una posición 5' respecto de la repetición tándem invertida .
27. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, donde la secuencia de reconocimiento de enzima especifica incluye sitios de restricción ya sea Hind III y Not I, Hind III, o Not I.
28. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, donde la secuencia de reconocimiento de enzima especifica es seleccionada del grupo que consiste en una endonucleasa de restricción tipo I, endonucleasa tipo II, endonucleasa tipo III, reconocimiento de receptor eucariótico, reconocimiento de receptor procariótico, promotor, promotor/mej orador y sitio PCR con T colgante, y sus combinaciones.
29. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 19, donde la secuencia que codifica la secuencia de interés está ubicada entre la repetición tándem invertida y la secuencia que codifica el sitio de ligadura de cebador 3'.
30. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 19 o 29, donde la repetición tándem invertida es capaz de formar un tallo-espira estable, un tallo-espira inestable, o un tallo-espira de estabilidad intermedia en un producto de ácido nucleico de un solo filamento codificado por dicha construcción de ácido nucleico.
31. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 30, donde la repetición tándem invertida comprende una secuencia que codifica uno o mas sitios de ligadura de ADN eucarióticos, procarióticos y/o de proteina viral.
32. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 31, donde la repetición tándem invertida actúa en forma cis-orientada .
33. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 32, donde el sitio de ligadura de cebador es especifico para una transcriptasa inversa endógena .
34. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 32, comprendiendo además un gen que codifica una transcriptasa inversa.
35. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 34, donde el gen de transcriptasa inversa está ubicado en una posición 5' respecto de la repetición tándem invertida .
36. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 32, comprendiendo además un gen que codifica una poliproteina de transcriptasa inversa/ARNasa H.
37. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 36, donde el gen que codifica la poliproteina de transcriptasa inversa/ARNasa H está ubicado en una posición 5' respecto de la repetición tándem invertida.
38. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 36 o 37, donde el gen que codifica la poliproteina de transcriptasa inversa/ARNasa H es del virus de leucemia de murino Moloney, virus de inmunodeficiencia humana, o virus de inmunodeficiencia simia.
39. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 38, donde el sitio de ligadura de cebador es especifico para una transcriptasa inversa codificada por el gel de transcriptasa inversa o de poliproteina de transcriptasa inversa/ARNasa H.
40. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo además un promotor y, opcionalmente, un mej orador para cada una de dichas secuencias primera o segunda que codifican una secuencia de interés, dicha endonucleasa de restricción, dicha transcriptasa inversa y/o dicho gen de transcriptasa inversa/ARNasa H.
41. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 40, donde el promotor y/o mej orador es un promotor/mej orador eucariótico.
42. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 40 o 41, donde el promotor es un promotor constitutivo, inducible, de espectro amplio o especifico de tejido.
43. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo además una secuencia que codifica una secuencia de cola de poliadenilacion ubicada en una posición 3' respecto del sitio de ligadura de cebador 3 ' .
44. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la primera o segunda secuencia que codifica una secuencia de interés incluye una secuencia que codifica un ADNss que tiene actividad enzimática.
45. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 44, donde la primera o segunda secuencia que codifica una secuencia de interés incluye la secuencia 5'-GGCTAGCTACAACGA-3 ' , flanqueada en ambas direcciones 3' y 5' por secuencias que codifican una o mas secuencias complementarias a la especie de ARNm objetivo. 46. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 45, donde la especie de ARNm objetivo es para: (i) h-ras, (ii) c-raf cinasa, (iii) secuencia anti-sentido a factor de crecimiento angiogénico de pleiotrofina, o (iv) la región tat del virus de inmunodeficiencia simia
(SIV) .
47. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el sitio de ligadura de cebador 3' es complementario a un ARN de transferencia (AR t ) .
48. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 47, donde la secuencia de interés es una molécula de ácido nucleico de un solo filamento.
49. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 48, donde la molécula de ácido nucleico de un solo filamento es ADNc.
50. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 48, donde la molécula de ácido nucleico de un solo filamento en ARNm.
51. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 50, donde la molécula de ácido nucleico de un solo filamento es una molécula de ácido nucleico inhibitoria.
52. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 51, donde la molécula de ácido nucleico inhibitoria es una secuencia anti-sentido o aptámero.
53. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 52, donde el ácido nucleico es ADN.
54. Una transcripción de ARNm del ADN de la reivindicación 52.
55. Una transcripción de ARNm, que comprende (a) una codificación de secuencia para una secuencia de interés flanqueada por secuencias complementarias 3' y 5' que comprenden una repetición tándem invertida, y comprendiendo además un sitio de ligadura de cebador ubicada 3' respecto de la repetición tándem invertida.
56. Una transcripción de ARNm, que comprende (a) secuencias complementarias 3' y 5' que comprenden una repetición tándem invertida y (b) una codificación de secuencia para una secuencia de interés ubicada entre la repetición tándem invertida y el sitio de ligadura de cebador 3'.
57. Una transcripción de ARNm, que comprende (a) una primera codificación de secuencia para una secuencia de interés flanqueada por secuencias complementarias 3' y 5' que comprenden una repetición tándem invertida, (b) un sitio de ligadura de cebador ubicado 3' respecto de la repetición tándem invertida, y (c) una segunda codificación de secuencia para una secuencia de interés entre la repetición tándem invertida y el sitio de ligadura de cebador 3 ' .
58. Una transcripción de ARNm de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 54 a 57, donde la repetición tándem invertida es capaz de formar un tallo-espira estable, un tallo-espira inestable o un tallo-espira de estabilidad intermedia.
59. La transcripción de ARNm de cualquiera de las reivindicaciones 55 a 58, donde la secuencia que codifica la secuencia de interés incluye una secuencia que codifica un ADNss que tiene actividad enzimática.
60. Una transcripción de ADNss del ARNm de cualquiera de las reivindicaciones 55 a 59.
61. Un vector, que comprende la construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 53.
62. Un vector, que comprende: secuencias complementarias 3 ' y 5 ' que comprenden una repetición tándem invertida, una secuencia que codifica un sitio de ligadura de cebador para una transcriptasa inversa ubicada en una posición 3' respecto de la repetición tándem invertida, y un sitio de inserción para una codificación de secuencia para una secuencia de interés entre las secuencias complementarias 3' y 5' de la repetición tándem invertida, o entre la repetición tándem invertida y la secuencia que codifica el sitio de ligadura de cebador 31.
63. Un vector de acuerdo con la reivindicación 62, el cual comprende un primer sitio de inserción entre las secuencias complementarias 3' y 5' de la repetición tándem invertida y un segundo sitio de inserción entre la repetición tándem invertida y la secuencia que codifica el sitio de ligadura de cebador 3'.
64. Un vector de acuerdo con la reivindicación 62 o 63, comprendiendo además un gen que codifica una transcriptasa inversa.
65. Un vector de acuerdo con la reivindicación 62 o 63, comprendiendo además un gen que codifica una poliproteina de transcriptasa inversa/ARNasa H.
66. Un vector de acuerdo con la reivindicación 64 o 65, donde la transcriptasa inversa o el gen de la poliproteina de transcriptasa inversa/ARNasa H está ubicado en una posición 5' respecto de la repetición tándem invertida.
67. Un sistema vector, que comprende un primer vector de acuerdo con la reivindicación 62 o 63, y un segundo vector que comprende un gen que codifica una transcriptasa inversa.
68. Un vector o sistema vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 67, donde el vector es un plásmido o una construcción viral modificada.
69. Un vector o sistema vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 68, donde el gen está enlazado de manera operable a una secuencia de control de expresión.
70. Una célula hospedera transformada establemente o transfectada con un vector o sistema vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 69.
71. Una célula hospedera de acuerdo con la reivindicación 70, la cual es una célula eucariótica.
72. Una célula hospedera de acuerdo con la reivindicación 70, la cual es una célula bacteriana.
73. Un kit para producir una molécula de ácido nucleico de un solo filamento, el cual kit comprende un vector o un sistema vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 69, y una endonucleasa de restricción para cada sitio de inserción.
74. Un kit para producir una molécula de ácido nucleico de un solo filamento, el cual kit comprende un vector o sistema vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 69, un recipiente para el vector/sistema vector e instrucciones para uso del vector/sistema vector.
75. Un método in vivo o in vitro de producir una molécula de ácido nucleico de un solo filamento que tiene una secuencia de interés, el cual método comprende los pasos de introducir una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 53 en una célula objetivo, transcribir la construcción de ácido nucleico en ARNm, y transcri-bir en forma inversa la transcripción de ARNm en ADNc.
76. Un método de acuerdo con la reivindicación 75, comprendiendo además el paso de remover la transcripción de ARNm del heterodúplex ARNm/ADNc formado por transcripción inversa del ARNm.
77. Un método de acuerdo con la reivindicación 75 o 76, donde la transcripción inversa es llevada a cabo por una transcrip-tasa inversa que es endógena a la célula objetivo.
78. Un método de acuerdo con la reivindicación 75 o 76, que comprende además el paso de introducir un gen que codifica una transcriptasa inversa en una célula objetivo.
79. Un método de acuerdo con la reivindicación 75 o 76, comprendiendo además el paso de introducir un gen que codifica una poliproteina de transcriptasa inversa/ARNasa H en la célula objetivo .
80. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 75 a 79, comprendiendo además el paso de linealizar la transcripción de ADNc cortando la estructura de tallo-espira de ADNc formada por la repetición tándem invertida donde la estructura de espira se une al tallo.
81. Un método de acuerdo con la reivindicación 80, comprendiendo además el paso de introducir un gen que codifica una endonucleasa de restricción en la célula objetivo.
82. Un método de acuerdo con la reivindicación 80, comprendiendo además el paso de introducir un gen que codifica una endonucleasa de restricción en la célula objetivo.
83. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 75 a 82, comprendiendo además el paso de aislar de la célula objetivo la transcripción de ARNm, el heterodúplex ARNm/ADC y/o el ADNc de un solo filamento.
84. Una transcripción de ADNc de un solo filamento, producida por el método de cualquiera de las reivindicaciones 75 a 83.
85. Una molécula de ácido nucleico inhibitoria, producida por el método de cualquiera de las reivindicaciones 75 a 83.
86. Una molécula de ácido nucleico inhibitoria de acuerdo con la reivindicación 85, la cual es una secuencia antisentido o aptámero.
87. Un ADNc de un solo filamento, que tiene actividad enzimática, producido de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 75 a 83.
88. Una transcripción de ARNm producida de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 75 a 83.
89. Una molécula heterodúplex producida por el método de cualquiera de las reivindicaciones 75 a 83.
90. Una composición farmacéutica, que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 53, junto con un adyuvante, diluyente o portador farmacológicamente aceptable.
91. Una composición farmacéutica, que comprende un vector o sistema vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 69, junto con un adyuvante, diluyente o portador farmacológicamente aceptable.
92. Una composición farmacéutica, que comprende una célula hospedera de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 70 a 72, junto con un adyuvante, diluyete o portador farmacológicamente aceptable.
93. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 53, para uso en terapia, especialmente para uso en la entrega de una molécula de ácido nucleico inhibitoria a una célula objetivo.
94. Un vector o sistema vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 69, para uso en terapia, especialmente para uso en la entrega de una molécula de ácido nucleico inhibitoria a una célula objetivo.
95. Una célula hospedera de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 70 a 72 para uso en terapia, especialmente para uso en la entrega de una molécula de ácido nucleico inhibitoria a una célula objetivo.
96. El uso de una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 53 para la manufactura de un medicamento para aliviar una condición patológica regulando la expresión de genes, especialmente para aliviar una condición patológica mediante la entrega de una molécula de ácido nucleico inhibitoria a una célula objetivo.
97. El uso de un vector o sistema vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 69 para la manufactura de un medicamento para aliviar una condición patológica regulando la expresión de genes, especialmente para aliviar una condición patológica mediante la entrega de una molécula de ácido nucleico inhibitoria a una célula objetivo.
98. El uso de una célula objetivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 70 a 72 para la manufactura de un medicamento para aliviar una condición patológica regulando la expresión de genes, especialmente para aliviar una condición patológica mediante la entrega de una molécula de ácido nucleico inhibitoria a una célula objetivo. Resumen Métodos y composiciones para producir ADNc de un solo filamento (ADNc-ss) en células eucarióticas, específicamente un cartucho de ADN que produce ADNc-ss in vivo. El cartucho contiene el gen que codifica transcriptasa inversa/ARNasa H del virus de la leucemia en murino Moloney, un gen de endonucleasa de restricción bacteriana, y una secuencia de interés que produce una plantilla de ARN a partir de la cual la transcriptasa inversa sintetiza ADNc-ss de una secuencia especificada. El ADNc-ss es luego modificado para remover todas las secuencias de vector de flanco aprovechando la estructura de "espira de tallo" del ADNc-ss, que se forma como resultado de la inclusión de una repetición en tándem invertida que permite que el ADNc-ss se doble sobre si mismo, formando un tallo de ADN de doble hélice, en la secuencia de interés. El tallo de doble hélice contiene uno o mas elementos genéticos funcionales tales como un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción y la espira, que permanece como ADN-ss, constituida por cualquier secuencia de nucleótido deseada. Este diseño permite que el tallo de doble hélice de la espira de tallo intermedia por romperse a la endonucleasa (s) de restricción correspondiente (s) específica (s) para el sitio en el tallo y la porción de espira, o secuencia de interés, sea entonces liberada como un pedazo de ADN linealizado, de un solo filamento. Este pedazo de ADN-ss liberado (o roto) contiene información de secuencia mínima, si acaso, ya sea corriente arriba de 51 o corriente abajo de 3' de la porción de tallo de doble hélice previa que contiene el sitio de corte de endonucleasa de restricción. Transfecciones in vivo que usan el sistema vector de ADN descrito en la presente demuestran el uso de este sistema para producir ADN-ss en células hospederas.