KR102362030B1 - 역방향 접근법을 사용한 긴 rna의 고효율 합성 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 약 100-mer 내지 약 200-mer의 범위에서 RNA 올리고머의 역 5'→3' 방향 합성의 신규한 방법에 관한 것이다. 상기 방법을 사용하면, 99%에 도달하는 결합 효율로 고품질의 RNA 합성이 증명되었다.
Description
교차 참조
본 특허협력조약 출원은 이후에 참고로 전문통합되는, 2013년 9월 14일 출원된 미국 가특허출원 제61/877,980호에 기반을 두고 있으며, 이의 이익을 청구한다.
본 발명은 모노머 포스포라미다이트를 사용한 긴 RNA 올리고머의 합성, 및 역 5'→3' 방향으로 RNA 올리고뉴클레오타이드를 합성하는데 적당한 대응 고체 지지체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 약 100-mers 내지 약 200-mers의 긴 RNA 올리고머를 합성하는데 적합한 실험조건들을 사용하는 것에 관한 것이다.
본 특허협력조약 출원은 이후에 참고로 전문통합되는, 2013년 9월 14일 출원된 미국 가특허출원 제61/877,980호에 기반을 두고 있으며, 이의 이익을 청구한다.
본 발명은 모노머 포스포라미다이트를 사용한 긴 RNA 올리고머의 합성, 및 역 5'→3' 방향으로 RNA 올리고뉴클레오타이드를 합성하는데 적당한 대응 고체 지지체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 약 100-mers 내지 약 200-mers의 긴 RNA 올리고머를 합성하는데 적합한 실험조건들을 사용하는 것에 관한 것이다.
3'→5' 방향의 정의된 서열 RNA 합성은 이제 잘 정립되어 있으며, 현재는 매우 다양한 치료급 RNA 앱타머, tRNA, siRNA 및 생물학적으로 활성인 RNA 분자들의 합성 및 개발에 사용되고 있다. 이러한 3'→5' 합성접근법은 3'-아미다이트 및 3'-지지체를 사용하여, 올리고뉴클레오타이드들로 이어진다.
*
그러나, 3'→5' 합성 접근법은 3'-위치로부터 2'-위치까지 O-TBDMS기가 이동하는 것의 주된 단점을 가지며, 및 역으로도 마찬가지이다:
이와 대조적으로, "역방향" 합성, 또는 "역합성"이라고도 불리우는, 5'→3' 합성 접근법은 O-TBDMS 기가 이동하는 이슈는 성공적으로 면하였다. 5'→3' 합성 접근법은 5'-아미다이트 및 5'-지지체를 사용하여, 올리고뉴클레오타이드에 이르며, 하기와 같이 요약될 수 있다:
RNA 합성을 위한 5'→3' 접근법은 미국 특허 제8,309,707호 및 미국특허 제8,541,569호에 기록되어 있다. 5'→3' 접근법에 의하면, 다양한 길이의 RNA, 예컨대 31-mer, 43-mer, 74-mer 및 76-mer가 성공적으로 달성되었다. 예를 들면:
A. 31-mer G-풍부 RNA 키메라 합성(16개의 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오타이드)(도 1 참조). 서열은: 5’-ACG GGA AGA GGG AAmeU GAG GGmeU ACG AGG GCGme U-3’(SEQ. ID No. 4)이다. “meU”가 변형된 염기 2’-O-메틸우리딘이라는 점을 주목한다.
B. 43-mer RNA 합성(도 2 참조). 서열은: GGC CCA UCC GUG GAG 988 876 77C CCA GGG 888 767 76C GGU C(SEQ. ID No. 5)이다.
“6”이 변형된 염기 2’-O-메틸아데노신을 나타내고;
“7”이 변형된 염기 2’-O-메틸사이티딘을 나타내고;
“8”이 변형된 염기 2’-O-메틸구아노신을 나타내고; 및
“9”가 변형된 염기 2’-O-메틸우리딘을 나타낸다
는 점을 주목한다.
C. 74-mer RNA 합성(도 3 참조). 서열은: UCC UCU GUA GUU CAG UCG GUA GAA CGG CGG ACU UUC AAU CCG UAU GUC ACU GGU UCG AGU CCA GUC AGA GGA GC(SEQ. ID No. 6)이다.
D. 76-mer RNA 합성(도 4 참조). 서열은: GCC CGG AUA GCU CAG UCG GUA GAG CAU CAG ACU UUU UAU CUG AGG GUC CAG GGU UCA AGU CCC UGU UCG GGC GCC A(SEQ. ID No. 7)이다.
그러나, 특히 RNA 합성을 위해 5'→3' 접근법을 적용하는데 있어서, 긴 RNA, 예컨대 100-mer 내지 200-mer의 합성을 달성할 필요가 있다.
현재, 여러 상황들이, 긴 RNA의 연구를 매우 중요하게 한다.
(A)비-코딩 RNA(ncRNA)는 포유동물 X-염색체 불활성화를 조절하는 것으로 알려져 있으며, 및 또한 소형 RNA들을 생성하도록 처리될 수 있다(http://genesdev.cshlp.org/content/23/13/1494.long).
(B)RNA 간섭(RNAi) 기계는 유전자 발현을 후-전사로 조절하는, 마이크로RNAs(miRNAs) 및 소형 간섭 RNAs(siRNAs)의 생성에 잘-특징화된 역할들을 가진다. mrhl로 알려져 있는 2.4-kb 스플라이싱되지않은, 폴리아데닐화 핵-보유 ncRNA는 Drosha에 의해 처리되어, 80-nt 소형 RNA를 생성한다.
(C)miRNAs 및 piwi-간섭 RNAs(piRNAs)가 최근에 가장 큰 주목을 받았지만, 긴 RNA 전사물은 다르고 및 독특한 기능들을 갖는 소형 RNA로 처리하는 것을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 가진다.
(D)긴 ncRNA는 소형 RNA를 생성하기 위해 처리될 수 있지만, 이들은 또한, 소형 RNA로 절단될 수 있는 그들의 능력을 조절함으로써, 또는 그들의 전-mRNA 스플라이싱 패턴을 변형시킴으로써, 다른 전사물들이 처리되는 방법에 영향을 줄 수 있다.
(E)ncRNA는 다른 전사물들로부터 소형 RNA를 제조하는 것을 억제할 수 있다.
(F)비-코딩 RNA 및 호르몬 조절은 새로운 연구주제이다.
*
그러나, 3'→5' 합성 접근법은 3'-위치로부터 2'-위치까지 O-TBDMS기가 이동하는 것의 주된 단점을 가지며, 및 역으로도 마찬가지이다:
이와 대조적으로, "역방향" 합성, 또는 "역합성"이라고도 불리우는, 5'→3' 합성 접근법은 O-TBDMS 기가 이동하는 이슈는 성공적으로 면하였다. 5'→3' 합성 접근법은 5'-아미다이트 및 5'-지지체를 사용하여, 올리고뉴클레오타이드에 이르며, 하기와 같이 요약될 수 있다:
RNA 합성을 위한 5'→3' 접근법은 미국 특허 제8,309,707호 및 미국특허 제8,541,569호에 기록되어 있다. 5'→3' 접근법에 의하면, 다양한 길이의 RNA, 예컨대 31-mer, 43-mer, 74-mer 및 76-mer가 성공적으로 달성되었다. 예를 들면:
A. 31-mer G-풍부 RNA 키메라 합성(16개의 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오타이드)(도 1 참조). 서열은: 5’-ACG GGA AGA GGG AAmeU GAG GGmeU ACG AGG GCGme U-3’(SEQ. ID No. 4)이다. “meU”가 변형된 염기 2’-O-메틸우리딘이라는 점을 주목한다.
B. 43-mer RNA 합성(도 2 참조). 서열은: GGC CCA UCC GUG GAG 988 876 77C CCA GGG 888 767 76C GGU C(SEQ. ID No. 5)이다.
“6”이 변형된 염기 2’-O-메틸아데노신을 나타내고;
“7”이 변형된 염기 2’-O-메틸사이티딘을 나타내고;
“8”이 변형된 염기 2’-O-메틸구아노신을 나타내고; 및
“9”가 변형된 염기 2’-O-메틸우리딘을 나타낸다
는 점을 주목한다.
C. 74-mer RNA 합성(도 3 참조). 서열은: UCC UCU GUA GUU CAG UCG GUA GAA CGG CGG ACU UUC AAU CCG UAU GUC ACU GGU UCG AGU CCA GUC AGA GGA GC(SEQ. ID No. 6)이다.
D. 76-mer RNA 합성(도 4 참조). 서열은: GCC CGG AUA GCU CAG UCG GUA GAG CAU CAG ACU UUU UAU CUG AGG GUC CAG GGU UCA AGU CCC UGU UCG GGC GCC A(SEQ. ID No. 7)이다.
그러나, 특히 RNA 합성을 위해 5'→3' 접근법을 적용하는데 있어서, 긴 RNA, 예컨대 100-mer 내지 200-mer의 합성을 달성할 필요가 있다.
현재, 여러 상황들이, 긴 RNA의 연구를 매우 중요하게 한다.
(A)비-코딩 RNA(ncRNA)는 포유동물 X-염색체 불활성화를 조절하는 것으로 알려져 있으며, 및 또한 소형 RNA들을 생성하도록 처리될 수 있다(http://genesdev.cshlp.org/content/23/13/1494.long).
(B)RNA 간섭(RNAi) 기계는 유전자 발현을 후-전사로 조절하는, 마이크로RNAs(miRNAs) 및 소형 간섭 RNAs(siRNAs)의 생성에 잘-특징화된 역할들을 가진다. mrhl로 알려져 있는 2.4-kb 스플라이싱되지않은, 폴리아데닐화 핵-보유 ncRNA는 Drosha에 의해 처리되어, 80-nt 소형 RNA를 생성한다.
(C)miRNAs 및 piwi-간섭 RNAs(piRNAs)가 최근에 가장 큰 주목을 받았지만, 긴 RNA 전사물은 다르고 및 독특한 기능들을 갖는 소형 RNA로 처리하는 것을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 가진다.
(D)긴 ncRNA는 소형 RNA를 생성하기 위해 처리될 수 있지만, 이들은 또한, 소형 RNA로 절단될 수 있는 그들의 능력을 조절함으로써, 또는 그들의 전-mRNA 스플라이싱 패턴을 변형시킴으로써, 다른 전사물들이 처리되는 방법에 영향을 줄 수 있다.
(E)ncRNA는 다른 전사물들로부터 소형 RNA를 제조하는 것을 억제할 수 있다.
(F)비-코딩 RNA 및 호르몬 조절은 새로운 연구주제이다.
하기 구조식의 RNA 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법:
(상기 식중,
B는 아데닌, 시토신, 구아노신, 우라실, 이노신, 5-메틸-시토신, 5-메틸-우라실, 5-플루로-우라실, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-아데닌 및 5-플루로-시토신으로 구성된 그룹으로부터 선택된 일원이며;
n은 100 내지 약 200의 정수이며;
L은 링커 또는 스페이서를 갖는 콜레스테롤, 비오틴, 에틸렌글리콜, 글리세롤, 폴리에틸렌글리콜, 헥사에틸렌글리콜, 아미노 링커, 디설파이드 링커, 펩타이드 링커, 폴리펩타이드 링커, 단백질, 플루로포어(flurophore), 퀸처(quencher) 염료, 하나 또는 그 이상의 2',5'-연결된 데옥시뉴클레오시드 유닛, 하나 또는 그 이상의 2',5'-연결된 리보뉴클레오시드 유닛, 및 하나 또는 그 이상의 2',5'-연결된 데옥시리보스 유닛으로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오시드, 비-뉴클레오시드 리간드이며,
L은 중재 포스페이트를 통해 RNA 뉴클레오티드의 3'-말단에 부착된다); 및
RNA 뉴클레오티드의 5'-말단으로부터 3'-말단까지의 방향으로 RNA가 합성되는 방법은:
(a)화학식 2로 표시되는 뉴클레오시드 고체 지지체를 취하는 단계:
[화학식 2]
(상기 화학식 2에서,
M은 수소 라디칼 또는 링커이며;
M이 링커인 경우, 그것은 구조식 Y-C(O)에 의해 나타내며, 및 올리고뉴클레오타이드 합성에 적당한 고체 지지체에 선택적으로 연결되며,
상기 Y는 2개의 탄소들과 20개의 탄소들 사이의 길이를 갖는 탄화수소 디라디칼 모이어티이며, 및 Y는 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 및 아랄킬로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 및 탄화수소 디라디칼 모이어티는 선택적으로, 중재 -O-, -S-, -S(O)2- -C(O)- 및 -NR6-(여기에서, R6은 수소 라디칼, 또는 치환된 C1 내지 C20 알킬 또는 치환된 아랄킬임)을 포함하며;
W는 산소 디라디칼, N-H 디라디칼, 및 불소 라디칼로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 및 R은:
W가 산소 디라디칼인 경우, R이 tert 부틸 디메틸 실일(TBDMS) 또는 트리이소프로필실일 옥시메틸렌(TOM)이고; 및
W가 N-H 디라디칼인 경우, R이 형태 R5 X(여기에서, x는 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc), 트리플루오로아세틸, 아세틸, 알카노일 및 아로일로 구성된 그룹으로부터 선택됨)를 가지며; 및
W가 불소 라디칼인 경우, R이 존재하지 않도록
선택되며;
B는 9-(N6-벤조일아데니닐)-, 9-(N6-아세틸아데니닐)-, 9-(N6-tert-부틸 페녹시아세틸아데니닐)-, 9-(N6-페녹시아세틸아데니닐)-, 9-(N6-이소프로필 페녹시아세틸아데니닐)-, 1-(N4-벤조일시토시닐)-, 1-(N4-아세틸시토시닐)-, 1-(N4-(N,N-디메틸포름아미디닐)시토시닐)-, 1-(N4-페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-tert-부틸페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-이소프로필 페녹시아세틸시토시닐)-, 9-(N2-이소부틸구아니닐)-, 9-(N2-tert 부틸 페녹시아세틸구아니닐)-, 9-(N2-이소프로필 페녹시아세틸구아니닐)-, 1-(N4-페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-tert 부틸 페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-이소프로필 페녹시아세틸시토시닐)-, 및 1-우라실일-로 구성된 뉴클레오시드 염기 라디칼로 구성된 그룹으로부터 선택되며; 또는
B는 1-(N4-벤조일-5-메틸시토시닐)-, 1-(N4-(N,N-디메틸포름아미디닐)-5-메틸시토시닐)-, 1-(N4-아세틸-5-메틸시토시닐)-, 1-(5-메틸-우라실일)-, 1-(5-플루오로-우라실일)-, 1-(N4-벤조일-5-플루오로시토시닐)-, 9-(N6-벤조일-7-디아자아데니닐)-, 9-(N6-(N,N-디메틸포름아미디닐)-7-디아자아데닐)-, 9-(N2-이소부틸-7-디아자구아니닐)-, 및 9-(N2-(N,N-디메틸포름아미디닐)-7-디아자구아니닐)-로 구성된 그룹으로부터 선택된 변형된 뉴클레오시드 염기 라디칼이며;
Z는 디메톡시 트리페닐(DMT), 모노메톡시 트리페닐(MMT) 및 트리메톡시 트리페닐(TMT)로 구성된 보호기이다);
(b)올리고뉴클레오티드 신시사이저(synthesizer) 상에 화학식 1의 포스포라미다이트를 놓는 단계;
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
Y는 산소 원자 또는 황 원자이며;
W는 산소 디라디칼, N-H 디라디칼, 및 불소 라디칼로 구성된 그룹으로부터 선택되며; 및 R4는:
W가 산소 디라디칼인 경우, R4가 tert 부틸 디메틸 실일(TBDMS) 또는 트리이소프로필실일 옥시메틸렌(TOM)이고; 및
W가 N-H 디라디칼인 경우, R4가 형태 R5 X(여기에서, x는 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc), 트리플루오로아세틸, 아세틸, 알카노일 및 아로일로 구성된 그룹으로부터 선택됨)를 가지며; 및
W가 불소 라디칼인 경우, R4가 존재하지 않도록
선택되며;
B는 9-(N6-벤조일아데니닐)-, 9-(N6-아세틸아데니닐)-, 9-(N6-tert-부틸 페녹시아세틸아데니닐)-, 9-(N6-페녹시아세틸아데니닐)-, 9-(N6-이소프로필 페녹시아세틸아데니닐)-, 1-(N6-(N,N-디메틸포름아미디닐)아데니닐)-, 1-(N4-벤조일시토시닐)-, 1-(N4-아세틸시토시닐)-, 1-(N4-(N,N-디메틸포름아미디닐)시토시닐)-, 1-(N4-페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-tert-부틸페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-이소프로필 페녹시아세틸시토시닐)-, 9-(N2-이소부틸구아니닐)-, 9-(N2-tert 부틸 페녹시아세틸구아니닐)-, 9-(N2-이소프로필 페녹시아세틸구아니닐)-, 1-(N4-페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-tert 부틸 페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-이소프로필 페녹시아세틸시토시닐)-, 및 1-우라실일-로 구성된 뉴클레오시드 염기 라디칼로 구성된 그룹으로부터 선택되며; 또는
B는 1-(N4-벤조일-5-메틸시토시닐)-, 1-(N4-(N,N-디메틸포름아미디닐)-5-메틸시토시닐)-, 1-(N4-아세틸-5-메틸시토시닐)-, 1-(5-메틸-우라실일)-, 1-(5-플루오로-우라실일)-, 1-(N4-벤조일-5-플루오로시토시닐)-, 9-(N6-벤조일-7-디아자아데니닐)-, 9-(N6-(N,N-디메틸포름아미디닐)-7-디아자아데닐)-, 9-(N2-이소부틸-7-디아자구아니닐)-, 및 9-(N2-(N,N-디메틸포름아미디닐)-7-디아자구아니닐)-로 구성된 그룹으로부터 선택된 변형된 뉴클레오시드 염기 라디칼이며;
Z는 디메톡시 트리페닐(DMT), 모노메톡시 트리페닐(MMT) 및 트리메톡시 트리페닐(TMT)로 구성된 보호기이며;
R1은 알킬 또는 아릴 라디칼이며;
R2는 알킬 또는 아릴 라디칼이며; 및
R3은 시아노에틸, 알킬 또는 아릴 라디칼이며,
B는 수소, 또는 각 1차 아민에서 아민 보호기에 의해 선택적으로 관능화된 뉴클레오염기이다);
(c)화학식 2의 뉴클레오시드 고체 지지체로부터 보호기 Z를 제거하는 단계;
(d)보조제들의 혼합물을 사용하여, 화학식 2의 뉴클레오시드 및 화학식 1의 포스포라미다이트를 올리고뉴클레오티드 신시사이저내에서 결합시켜서, RNA 합성과정을 수행하여, 적어도 하나의 보호기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 얻는 단계;
(d)L 기를 갖는 포스포라미다이트를 제공하는 단계;
(e)올리고뉴클레오티드의 말단에서 L 기를 갖는 포스포라미다이트를 가하여, L 기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 얻는 단계;
(f)L 기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체로부터 분리하는 단계;
(g)올리고뉴클레오티드로부터 적어도 하나의 보호기를 제거하는 단계;
(h)실일 보호기를 제거하여, 올리고뉴클레오티드를 얻는 단계;
(i)올리고뉴클레오티드를 침전(precipitation)시키는 단계; 및
(j)순도 측정을 위해 올리고뉴클레오티드를 분석하는 단계를 포함하며,
상기 보조제는 CAP A(페녹시 아세트산 무수물/테트라히드로푸란/피리딘), CAP B(10% N-메틸이미다졸/테트로히드로푸란), DMT 제거 시약(톨루엔내 3% TCA), 산화 용액(0.05M 요오드/피리딘/물/테트라히드로푸란) 및 활성화제(아세토니트릴내 0.35M의 5-에틸티오-1-H-테트라졸)를 포함한다.
RNA 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법, 여기에서 L은 링커 또는 스페이서를 갖는 콜레스테롤이며, 및 n은 100 내지 약 200의 정수이다.
RNA 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법, 여기에서 L은 폴리에틸렌글리콜(PEG)이며, 및 n은 100 내지 약 200의 정수이다.
RNA 올리고뉴클레오티드, 여기에서 RNA 올리고뉴클레오티드는 RNA 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법에 의해 합성된다.
역 RNA 합성 방법론을 사용한 100-mer 내지 약 200-mer 장쇄 RNA의 RNA 합성 방법.
데옥시, 백본-변형된 염기, 변형된 DNA 및 변형된 RNA 염기들을 포함하는 장쇄 RNA 키메라.
역 방법론을 사용하여, 말단, 분지점 또는 사슬내에서 하나 또는 그 이상의 5', 2', 2', 3' 결합을 갖는 장쇄 RNA.
역 합성 방법론을 사용하여, 천연 및 변형된 뉴클레오시드, 무염기 부위, 역 무염기 부위, 발색단 및 리간드로 구성된 장쇄 RNA.
장쇄 RNA는 역 합성 방법론을 사용하여, 발색단, 리간드, 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트 기를 포함할 수 있다.
역 RNA 방법론을 사용한, 하나 또는 그 이상의 데옥시, 변형된 데옥시 또는 변형된 리보뉴클레오시드에 의해 분지점을 갖는 장쇄 RNA.
HPLC 겔 전기영동법 또는 다른 RNA 정제 기술들에 의한, 역 방법론에 의해 합성된 장쇄 RNA의 정제 방법.
표면 상에, 역 방법론에 의해 합성된 장쇄 RNA를 라벨링 및 부착하는 방법.
분자생물학 연구 및 개발에서, 역 방법론에 의해 합성된 장쇄 RNA를 사용한 방법.
(상기 식중,
B는 아데닌, 시토신, 구아노신, 우라실, 이노신, 5-메틸-시토신, 5-메틸-우라실, 5-플루로-우라실, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-아데닌 및 5-플루로-시토신으로 구성된 그룹으로부터 선택된 일원이며;
n은 100 내지 약 200의 정수이며;
L은 링커 또는 스페이서를 갖는 콜레스테롤, 비오틴, 에틸렌글리콜, 글리세롤, 폴리에틸렌글리콜, 헥사에틸렌글리콜, 아미노 링커, 디설파이드 링커, 펩타이드 링커, 폴리펩타이드 링커, 단백질, 플루로포어(flurophore), 퀸처(quencher) 염료, 하나 또는 그 이상의 2',5'-연결된 데옥시뉴클레오시드 유닛, 하나 또는 그 이상의 2',5'-연결된 리보뉴클레오시드 유닛, 및 하나 또는 그 이상의 2',5'-연결된 데옥시리보스 유닛으로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오시드, 비-뉴클레오시드 리간드이며,
L은 중재 포스페이트를 통해 RNA 뉴클레오티드의 3'-말단에 부착된다); 및
RNA 뉴클레오티드의 5'-말단으로부터 3'-말단까지의 방향으로 RNA가 합성되는 방법은:
(a)화학식 2로 표시되는 뉴클레오시드 고체 지지체를 취하는 단계:
[화학식 2]
(상기 화학식 2에서,
M은 수소 라디칼 또는 링커이며;
M이 링커인 경우, 그것은 구조식 Y-C(O)에 의해 나타내며, 및 올리고뉴클레오타이드 합성에 적당한 고체 지지체에 선택적으로 연결되며,
상기 Y는 2개의 탄소들과 20개의 탄소들 사이의 길이를 갖는 탄화수소 디라디칼 모이어티이며, 및 Y는 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 및 아랄킬로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 및 탄화수소 디라디칼 모이어티는 선택적으로, 중재 -O-, -S-, -S(O)2- -C(O)- 및 -NR6-(여기에서, R6은 수소 라디칼, 또는 치환된 C1 내지 C20 알킬 또는 치환된 아랄킬임)을 포함하며;
W는 산소 디라디칼, N-H 디라디칼, 및 불소 라디칼로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 및 R은:
W가 산소 디라디칼인 경우, R이 tert 부틸 디메틸 실일(TBDMS) 또는 트리이소프로필실일 옥시메틸렌(TOM)이고; 및
W가 N-H 디라디칼인 경우, R이 형태 R5 X(여기에서, x는 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc), 트리플루오로아세틸, 아세틸, 알카노일 및 아로일로 구성된 그룹으로부터 선택됨)를 가지며; 및
W가 불소 라디칼인 경우, R이 존재하지 않도록
선택되며;
B는 9-(N6-벤조일아데니닐)-, 9-(N6-아세틸아데니닐)-, 9-(N6-tert-부틸 페녹시아세틸아데니닐)-, 9-(N6-페녹시아세틸아데니닐)-, 9-(N6-이소프로필 페녹시아세틸아데니닐)-, 1-(N4-벤조일시토시닐)-, 1-(N4-아세틸시토시닐)-, 1-(N4-(N,N-디메틸포름아미디닐)시토시닐)-, 1-(N4-페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-tert-부틸페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-이소프로필 페녹시아세틸시토시닐)-, 9-(N2-이소부틸구아니닐)-, 9-(N2-tert 부틸 페녹시아세틸구아니닐)-, 9-(N2-이소프로필 페녹시아세틸구아니닐)-, 1-(N4-페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-tert 부틸 페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-이소프로필 페녹시아세틸시토시닐)-, 및 1-우라실일-로 구성된 뉴클레오시드 염기 라디칼로 구성된 그룹으로부터 선택되며; 또는
B는 1-(N4-벤조일-5-메틸시토시닐)-, 1-(N4-(N,N-디메틸포름아미디닐)-5-메틸시토시닐)-, 1-(N4-아세틸-5-메틸시토시닐)-, 1-(5-메틸-우라실일)-, 1-(5-플루오로-우라실일)-, 1-(N4-벤조일-5-플루오로시토시닐)-, 9-(N6-벤조일-7-디아자아데니닐)-, 9-(N6-(N,N-디메틸포름아미디닐)-7-디아자아데닐)-, 9-(N2-이소부틸-7-디아자구아니닐)-, 및 9-(N2-(N,N-디메틸포름아미디닐)-7-디아자구아니닐)-로 구성된 그룹으로부터 선택된 변형된 뉴클레오시드 염기 라디칼이며;
Z는 디메톡시 트리페닐(DMT), 모노메톡시 트리페닐(MMT) 및 트리메톡시 트리페닐(TMT)로 구성된 보호기이다);
(b)올리고뉴클레오티드 신시사이저(synthesizer) 상에 화학식 1의 포스포라미다이트를 놓는 단계;
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
Y는 산소 원자 또는 황 원자이며;
W는 산소 디라디칼, N-H 디라디칼, 및 불소 라디칼로 구성된 그룹으로부터 선택되며; 및 R4는:
W가 산소 디라디칼인 경우, R4가 tert 부틸 디메틸 실일(TBDMS) 또는 트리이소프로필실일 옥시메틸렌(TOM)이고; 및
W가 N-H 디라디칼인 경우, R4가 형태 R5 X(여기에서, x는 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc), 트리플루오로아세틸, 아세틸, 알카노일 및 아로일로 구성된 그룹으로부터 선택됨)를 가지며; 및
W가 불소 라디칼인 경우, R4가 존재하지 않도록
선택되며;
B는 9-(N6-벤조일아데니닐)-, 9-(N6-아세틸아데니닐)-, 9-(N6-tert-부틸 페녹시아세틸아데니닐)-, 9-(N6-페녹시아세틸아데니닐)-, 9-(N6-이소프로필 페녹시아세틸아데니닐)-, 1-(N6-(N,N-디메틸포름아미디닐)아데니닐)-, 1-(N4-벤조일시토시닐)-, 1-(N4-아세틸시토시닐)-, 1-(N4-(N,N-디메틸포름아미디닐)시토시닐)-, 1-(N4-페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-tert-부틸페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-이소프로필 페녹시아세틸시토시닐)-, 9-(N2-이소부틸구아니닐)-, 9-(N2-tert 부틸 페녹시아세틸구아니닐)-, 9-(N2-이소프로필 페녹시아세틸구아니닐)-, 1-(N4-페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-tert 부틸 페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-이소프로필 페녹시아세틸시토시닐)-, 및 1-우라실일-로 구성된 뉴클레오시드 염기 라디칼로 구성된 그룹으로부터 선택되며; 또는
B는 1-(N4-벤조일-5-메틸시토시닐)-, 1-(N4-(N,N-디메틸포름아미디닐)-5-메틸시토시닐)-, 1-(N4-아세틸-5-메틸시토시닐)-, 1-(5-메틸-우라실일)-, 1-(5-플루오로-우라실일)-, 1-(N4-벤조일-5-플루오로시토시닐)-, 9-(N6-벤조일-7-디아자아데니닐)-, 9-(N6-(N,N-디메틸포름아미디닐)-7-디아자아데닐)-, 9-(N2-이소부틸-7-디아자구아니닐)-, 및 9-(N2-(N,N-디메틸포름아미디닐)-7-디아자구아니닐)-로 구성된 그룹으로부터 선택된 변형된 뉴클레오시드 염기 라디칼이며;
Z는 디메톡시 트리페닐(DMT), 모노메톡시 트리페닐(MMT) 및 트리메톡시 트리페닐(TMT)로 구성된 보호기이며;
R1은 알킬 또는 아릴 라디칼이며;
R2는 알킬 또는 아릴 라디칼이며; 및
R3은 시아노에틸, 알킬 또는 아릴 라디칼이며,
B는 수소, 또는 각 1차 아민에서 아민 보호기에 의해 선택적으로 관능화된 뉴클레오염기이다);
(c)화학식 2의 뉴클레오시드 고체 지지체로부터 보호기 Z를 제거하는 단계;
(d)보조제들의 혼합물을 사용하여, 화학식 2의 뉴클레오시드 및 화학식 1의 포스포라미다이트를 올리고뉴클레오티드 신시사이저내에서 결합시켜서, RNA 합성과정을 수행하여, 적어도 하나의 보호기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 얻는 단계;
(d)L 기를 갖는 포스포라미다이트를 제공하는 단계;
(e)올리고뉴클레오티드의 말단에서 L 기를 갖는 포스포라미다이트를 가하여, L 기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 얻는 단계;
(f)L 기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체로부터 분리하는 단계;
(g)올리고뉴클레오티드로부터 적어도 하나의 보호기를 제거하는 단계;
(h)실일 보호기를 제거하여, 올리고뉴클레오티드를 얻는 단계;
(i)올리고뉴클레오티드를 침전(precipitation)시키는 단계; 및
(j)순도 측정을 위해 올리고뉴클레오티드를 분석하는 단계를 포함하며,
상기 보조제는 CAP A(페녹시 아세트산 무수물/테트라히드로푸란/피리딘), CAP B(10% N-메틸이미다졸/테트로히드로푸란), DMT 제거 시약(톨루엔내 3% TCA), 산화 용액(0.05M 요오드/피리딘/물/테트라히드로푸란) 및 활성화제(아세토니트릴내 0.35M의 5-에틸티오-1-H-테트라졸)를 포함한다.
RNA 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법, 여기에서 L은 링커 또는 스페이서를 갖는 콜레스테롤이며, 및 n은 100 내지 약 200의 정수이다.
RNA 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법, 여기에서 L은 폴리에틸렌글리콜(PEG)이며, 및 n은 100 내지 약 200의 정수이다.
RNA 올리고뉴클레오티드, 여기에서 RNA 올리고뉴클레오티드는 RNA 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법에 의해 합성된다.
역 RNA 합성 방법론을 사용한 100-mer 내지 약 200-mer 장쇄 RNA의 RNA 합성 방법.
데옥시, 백본-변형된 염기, 변형된 DNA 및 변형된 RNA 염기들을 포함하는 장쇄 RNA 키메라.
역 방법론을 사용하여, 말단, 분지점 또는 사슬내에서 하나 또는 그 이상의 5', 2', 2', 3' 결합을 갖는 장쇄 RNA.
역 합성 방법론을 사용하여, 천연 및 변형된 뉴클레오시드, 무염기 부위, 역 무염기 부위, 발색단 및 리간드로 구성된 장쇄 RNA.
장쇄 RNA는 역 합성 방법론을 사용하여, 발색단, 리간드, 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트 기를 포함할 수 있다.
역 RNA 방법론을 사용한, 하나 또는 그 이상의 데옥시, 변형된 데옥시 또는 변형된 리보뉴클레오시드에 의해 분지점을 갖는 장쇄 RNA.
HPLC 겔 전기영동법 또는 다른 RNA 정제 기술들에 의한, 역 방법론에 의해 합성된 장쇄 RNA의 정제 방법.
표면 상에, 역 방법론에 의해 합성된 장쇄 RNA를 라벨링 및 부착하는 방법.
분자생물학 연구 및 개발에서, 역 방법론에 의해 합성된 장쇄 RNA를 사용한 방법.
도 1은 31-mer RNA 합성에 관한 것이다.
도 2는 43-mer RNA 합성에 관한 것이다.
도 3은 74-mer RNA 합성에 관한 것이다.
도 4는 76-mer RNA 합성에 관한 것이다.
도 5는 100-mer 합성의 트리틸 막대(bar)이다.
도 6은 150-mer 합성의 트리틸 막대이다.
도 7은 200-mer 합성의 트리틸 막대이다.
도 8은 200-mer 합성의 UV 분석이다.
도 9는 폴리-리보 아데노신 100-mer 합성의 IE HPLC, 폴리-리보 아데노신 150-mer 합성의 IE HPLC, 및 폴리-리보-아데노신 200mer 합성의 IE HPLC이다.
도 10은 폴리-리보-아데노신 100-mer 및 200-mer 올리고뉴클레오티드의 겔이다.
도 2는 43-mer RNA 합성에 관한 것이다.
도 3은 74-mer RNA 합성에 관한 것이다.
도 4는 76-mer RNA 합성에 관한 것이다.
도 5는 100-mer 합성의 트리틸 막대(bar)이다.
도 6은 150-mer 합성의 트리틸 막대이다.
도 7은 200-mer 합성의 트리틸 막대이다.
도 8은 200-mer 합성의 UV 분석이다.
도 9는 폴리-리보 아데노신 100-mer 합성의 IE HPLC, 폴리-리보 아데노신 150-mer 합성의 IE HPLC, 및 폴리-리보-아데노신 200mer 합성의 IE HPLC이다.
도 10은 폴리-리보-아데노신 100-mer 및 200-mer 올리고뉴클레오티드의 겔이다.
본 발명은 일반적으로, 적어도 약 100-mer인 RNA 올리고뉴클레오티드로서 보통 허용되며, 및 약 200-mer 또는 그 이상 길 수 있는 "긴 RNA"에 관한 것이다. 용어 "긴 RNA" 및 "아주 긴 RNA"는 본 발명 내내 서로 교체사용이 가능하다.
약 100-mer 내지 약 200-mer의 범위의 긴 RNA를 합성하기 위해, 매우 효과적인 결합 및 감소된 결합 시간 모두 중요하다.
약 100-mer 내지 약 200-mer의 범위의 긴 RNA를 합성하기 위해서는, 본 방법에 보조제들의 신규한 조합을 사용하는 것이 결정적이다. 본 실험예들의 상세한 설명은 하기에 설명된다.
상기 "5"는 5'-말단 포스페이트를 나타낸다.
본 발명에 따르면, 5'에서 3' 방향으로 RNA 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 하기 구조식의 RNA 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다:
(상기 식중,
B는 아데닌, 시토신, 구아노신, 우라실, 이노신, 5-메틸-시토신, 5-메틸-우라실, 5-플루로-우라실, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-아데닌 및 5-플루로-시토신으로 구성된 그룹으로부터 선택된 일원이며;
n은 100 내지 약 200의 정수이며;
L은 링커 또는 스페이서를 갖는 콜레스테롤, 비오틴, 에틸렌글리콜, 글리세롤, 폴리에틸렌글리콜, 헥사에틸렌글리콜, 아미노 링커, 디설파이드 링커, 펩타이드 링커, 폴리펩타이드 링커, 단백질, 플루로포어, 퀸처 염료, 하나 또는 그 이상의 2',5'-연결된 데옥시뉴클레오시드 유닛, 하나 또는 그 이상의 2',5'-연결된 리보뉴클레오시드 유닛, 및 하나 또는 그 이상의 2',5'-연결된 데옥시리보스 유닛으로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오시드, 비-뉴클레오시드 리간드이며,
L은 중재 포스페이트를 통해 RNA 뉴클레오티드의 3'-말단에 부착된다)
RNA 뉴클레오티드의 5'-말단으로부터 3'-말단까지의 방향으로 RNA가 합성되는 방법은:
(a)화학식 2로 표시되는 뉴클레오시드 고체 지지체를 취하는 단계:
[화학식 2]
(상기 화학식 2에서,
M은 수소 라디칼 또는 링커이며;
M이 링커인 경우, 그것은 구조식 Y-C(O)에 의해 나타내며, 및 올리고뉴클레오타이드 합성에 적당한 고체 지지체에 선택적으로 연결되며,
상기 Y는 2개의 탄소들과 20개의 탄소들 사이의 길이를 갖는 탄화수소 디라디칼 모이어티이며, 및 Y는 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 및 아랄킬로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 및 탄화수소 디라디칼 모이어티는 선택적으로, 중재 -O-, -S-, -S(O)2- -C(O)- 및 -NR6-(여기에서, R6은 수소 라디칼, 또는 치환된 C1 내지 C20 알킬 또는 치환된 아랄킬임)을 포함하며;
W는 산소 디라디칼, N-H 디라디칼, 및 불소 라디칼로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 및 R은:
W가 산소 디라디칼인 경우, R이 tert 부틸 디메틸 실일(TBDMS) 또는 트리이소프로필실일 옥시메틸렌(TOM)이고; 및
W가 N-H 디라디칼인 경우, R이 형태 R5 X(여기에서, x는 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc), 트리플루오로아세틸, 아세틸, 알카노일 및 아로일로 구성된 그룹으로부터 선택됨)를 가지며; 및
W가 불소 라디칼인 경우, R이 존재하지 않도록
선택되며;
B는 9-(N6-벤조일아데니닐)-, 9-(N6-아세틸아데니닐)-, 9-(N6-tert-부틸 페녹시아세틸아데니닐)-, 9-(N6-페녹시아세틸아데니닐)-, 9-(N6-이소프로필 페녹시아세틸아데니닐)-, 1-(N6-(N,N-디메틸포름아미디닐아데니닐), 1-(N4-벤조일시토시닐)-, 1-(N4-아세틸시토시닐)-, 1-(N4-(N,N-디메틸포름아미디닐)시토시닐)-, 1-(N4-페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-tert-부틸페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-이소프로필 페녹시아세틸시토시닐)-, 9-(N2-이소부틸구아니닐)-, 9-(N2-tert 부틸 페녹시아세틸구아니닐)-, 9-(N2-이소프로필 페녹시아세틸구아니닐)-, 1-(N4-페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-tert 부틸 페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-이소프로필 페녹시아세틸시토시닐)-, 및 1-우라실일-로 구성된 뉴클레오시드 염기 라디칼로 구성된 그룹으로부터 선택되며; 또는
B는 1-(N4-벤조일-5-메틸시토시닐)-, 1-(N4-(N,N-디메틸포름아미디닐)-5-메틸시토시닐)-, 1-(N4-아세틸-5-메틸시토시닐)-, 1-(5-메틸-우라실일)-, 1-(5-플루오로-우라실일)-, 1-(N4-벤조일-5-플루오로시토시닐)-, 9-(N6-벤조일-7-디아자아데니닐)-, 9-(N6-(N,N-디메틸포름아미디닐)-7-디아자아데닐)-, 9-(N2-이소부틸-7-디아자구아니닐)-, 및 9-(N2-(N,N-디메틸포름아미디닐)-7-디아자구아니닐)-로 구성된 그룹으로부터 선택된 변형된 뉴클레오시드 염기 라디칼이며;
Z는 디메톡시 트리페닐(DMT), 모노메톡시 트리페닐(MMT) 및 트리메톡시 트리페닐(TMT)로 구성된 보호기이다);
(b)올리고뉴클레오티드 신시사이저(synthesizer) 상에 화학식 1의 포스포라미다이트를 놓는 단계;
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
Y는 산소 원자 또는 황 원자이며;
W는 산소 디라디칼, N-H 디라디칼, 및 불소 라디칼로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 및 R4는:
W가 산소 디라디칼인 경우, R4가 tert 부틸 디메틸 실일(TBDMS) 또는 트리이소프로필실일 옥시메틸렌(TOM)이고; 및
W가 N-H 디라디칼인 경우, R4가 형태 R5 X(여기에서, x는 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc), 트리플루오로아세틸, 아세틸, 알카노일 및 아로일로 구성된 그룹으로부터 선택됨)를 가지며; 및
W가 불소 라디칼인 경우, R4가 존재하지 않도록
선택되며;
B는 9-(N6-벤조일아데니닐)-, 9-(N6-아세틸아데니닐)-, 9-(N6-tert-부틸 페녹시아세틸아데니닐)-, 9-(N6-페녹시아세틸아데니닐)-, 9-(N6-이소프로필 페녹시아세틸아데니닐)-, 1-(N6-(N,N-디메틸포름아미디닐)아데니닐)-, 1-(N4-벤조일시토시닐)-, 1-(N4-아세틸시토시닐)-, 1-(N4-(N,N-디메틸포름아미디닐)시토시닐)-, 1-(N4-페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-tert-부틸페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-이소프로필 페녹시아세틸시토시닐)-, 9-(N2-이소부틸구아니닐)-, 9-(N2-tert 부틸 페녹시아세틸구아니닐)-, 9-(N2-이소프로필 페녹시아세틸구아니닐)-, 1-(N4-페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-tert 부틸 페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-이소프로필 페녹시아세틸시토시닐)-, 및 1-우라실일-로 구성된 뉴클레오시드 염기 라디칼로 구성된 그룹으로부터 선택되며; 또는
B는 1-(N4-벤조일-5-메틸시토시닐)-, 1-(N4-(N,N-디메틸포름아미디닐)-5-메틸시토시닐)-, 1-(N4-아세틸-5-메틸시토시닐)-, 1-(5-메틸-우라실일)-, 1-(5-플루오로-우라실일)-, 1-(N4-벤조일-5-플루오로시토시닐)-, 9-(N6-벤조일-7-디아자아데니닐)-, 9-(N6-(N,N-디메틸포름아미디닐)-7-디아자아데닐)-, 9-(N2-이소부틸-7-디아자구아니닐)-, 및 9-(N2-(N,N-디메틸포름아미디닐)-7-디아자구아니닐)-로 구성된 그룹으로부터 선택된 변형된 뉴클레오시드 염기 라디칼이며;
Z는 디메톡시 트리페닐(DMT), 모노메톡시 트리페닐(MMT) 및 트리메톡시 트리페닐(TMT)로 구성된 보호기이며;
R1은 알킬 또는 아릴 라디칼이며;
R2는 알킬 또는 아릴 라디칼이며; 및
R3은 시아노에틸, 알킬 또는 아릴 라디칼이며,
B는 수소, 또는 각 1차 아민에서 아민 보호기에 의해 선택적으로 관능화된 뉴클레오염기이다);
(c)화학식 2의 뉴클레오시드 고체 지지체로부터 보호기 Z를 제거하는 단계;
(d)보조제들의 혼합물을 사용하여, 화학식 2의 뉴클레오시드 및 화학식 1의 포스포라미다이트를 올리고뉴클레오티드 신시사이저내에서 결합시켜서, RNA 합성과정을 수행하여, 적어도 하나의 보호기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 얻는 단계;
(d)L 기를 갖는 포스포라미다이트를 제공하는 단계;
(e)올리고뉴클레오티드의 말단에서 L 기를 갖는 포스포라미다이트를 가하여, L 기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 얻는 단계;
(f)L 기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체로부터 분리하는 단계;
(g)올리고뉴클레오티드로부터 적어도 하나의 보호기를 제거하는 단계;
(h)실일 보호기를 제거하여, 올리고뉴클레오티드를 얻는 단계;
(i)올리고뉴클레오티드를 침전(precipitation)시키는 단계; 및
(j)순도 측정을 위해 올리고뉴클레오티드를 분석하는 단계를 포함한다.
상기 보조제는 CAP A(페녹시 아세트산 무수물/테트라히드로푸란/피리딘), CAP B(10% N-메틸이미다졸/테트로히드로푸란), DMT 제거 시약(톨루엔내 3% TCA), 산화 용액(0.05M 요오드/피리딘/물/테트라히드로푸란) 및 활성화제(아세토니트릴내 0.35M의 5-에틸티오-1-H-테트라졸)를 포함한다.
본 발명에 따르면, 긴 RNA는 100 내지 200개의 모노머들을 갖는 RNA 올리고머이다. 상기 목적을 달성하기 위해서는, 보조제들이 본 방법에 결정적이다. 즉, 5'-방향에서 3'-방향으로, RNA의 역합성에서, 보조제들은 일반적으로, TCA/DCM, DCA/DCM,TCA/톨루엔, DCA/톨루엔, 무수 아세토니트릴, CAP A, CAP B, 다양한 농도의 요오드/THF/피리딘/H2O의 조합, 적당한 황화제들 중 하나, 아세토니트릴 용액으로서 적당한 활성화제 중 하나이다.
본 발명에 사용되는 보조제들은 모노머-5'-아미다이트의 높은 결합을 완료시키는데 도움을 준다. 따라서, 더 짧은 결합시간에 0.3M BMT(5-벤질티오테트라졸) 또는 0.5M ETT(5-티오에틸테트라졸)과 같은 보조제들은 분명히 관련되어 있으며, 다른 결합시간을 사용하며, 더 짧은 RNA 올리고머들을 위해 사용된 동일한 제제들과 대조되는, 높은 결합효율의 특별한 결과를 양산한다.
본 발명의 구현예에 따르면, L은 링커 또는 스페이서를 갖는 콜레스테롤이며, 및 n은 100 내지 약 200의 정수이다.
본 발명의 다른 구현예에서, L은 폴리에틸렌글리콜(PEG)이며, 및 n은 100 내지 약 200의 정수이다.
본 발명의 다른 구현예는 상기 방법에 의해 합성된, n=100, 150 또는 약 200인 RNA 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. RNA 올리고뉴클레오티드가 5'에서 3' 방향으로 합성되기 때문에, "m+1" 종류로 언급되는 불순물들은 존재하지 않는다.
두 방법론들, 즉, 3'→5' 방향 및 5'→3' 방향으로 합성된, 3'-말단에 3'-콜레스테롤 접합(conjugation)을 갖는 올리고뉴클레오티드들에 대한 본 데이터는 본 발명의 공개된 특허에서 분명하게 알 수 있다.
본 발명의 다른 구현예는 역 RNA 합성 방법론을 사용한, 100-mer 내지 200-mer 장쇄 RNA의 RNA 합성 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 데옥시, 백본-변형된 염기, 변형된 DNA 및 변형된 RNA 염기들을 포함하는, 장쇄 RNA 키메라를 포함한다. 장쇄 RNA는 역 방법론을 사용하여, 말단에, 분지점에 또는 사슬내에, 하나 또는 그 이상의 5', 2', 2', 3' 결합을 갖는다.
본 발명에 따르면, 다른 구현예는 역 합성 방법론을 사용한, 천연 및 변형된 뉴클레오시드, 무염기 부위, 역 무염기 부위, 발색단 및 리간드를 포함하는 장쇄 RNA이다.
본 발명의 다른 구현예는 역 합성 방법론을 사용한, 발색단, 리간드, 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트기를 포함하는 장쇄 RNA이다.
본 발명의 또다른 구현예는 역 합성 방법론을 사용한, 하나 또는 그 이상의 데옥시, 변형된 데옥시 또는 변형된 리보뉴클레오시드에 의해 분지점을 갖는 장쇄 RNA이다.
게다가, 본 발명은 HPLC 겔 전기영동법 또는 다른 RNA 정제기술들에 의한 역 방법론에 의해 합성된 장쇄 RNA의 정제 방법을 포함한다.
본 발명은 또한, 합성된 올리고뉴클레오티드의 3'-말단을 통해, 다양한 종류의 칩들, 폴리에틸렌 글리콜들, 지지체들과 같은, 표면 상에 역 방법론에 의해 합성된 장쇄 RNA를 라벨링 및 부착하는 방법을 포함한다. 따라서, 올리고뉴클레오티드에 아민 작용기와 같은 작용기를 도입하면, 알데하이드 작용을 함유하는 칩 또는 표면에 부착시킬 것이다.
본 발명은 분자생물학 연구 및 개발에서 역 방법론에 의해 합성된 장쇄 RNA를 사용하는 방법을 추가로 포함한다. 본 발명에 따른 방법에 의해 합성된 RNA는 3'→5' 방향의 정상적인 방법으로 합성된 RNA와 구별되는 생화학적 특성들을 갖는 것으로 나타났다.
올리고뉴클레오티드 합성: 올리고뉴클레오티드 Seq. #1(SEQ ID No.1)(100-mer), Seq. #2(SEQ. ID No. 2)(150-mer), Seq. #3 SEQ. ID No. 3이 합성된다. Seq. #3외에는, 5'→3' 방향 REV-RNA 포스포라미다이트 화학을 1마이크로몰 규모로 사용하여, 200-mer까지 확장된 Seq. #2를 합성하였다. Seq. #3은 0.5υmole 규모로 합성되었다. 표준 RNA 1υmole 주기 및 고체 지지체 6.0분을 갖는 모노머의 결합시간을 사용하여, 엑스퍼다이트(Expedite) 8900 신시사이저 상에서 합성을 수행하였다. 올리고뉴클레오티드 합성에서, 5는 Universal UnyLinker support 3000A, ChemGenes Cat # N-4000-30을 나타낸다.
(1) 사용된 아미다이트 N6 -tbpac-2’-O-TBDMS-3’-O-DMT-아데노신-5’-시아노에틸-N,N-디이소프로필-포스포라미다이트. LOT # AT 239-9(ChemGenes Cat # ANP-3407)
(2) 사용된 CPG Universal UnyLinker support 3000A, ChemGenes Cat # N-4000-30, Lot # AT157-9
*(3) 사용된 보조제
무수 아세토니트릴 RN-1447
CAP A(페녹시 아세트산 무수물/THF/피리딘)
CAP B(10% N-메틸이미다졸/THF)
DMT 제거제(톨루엔내 3% TCA)
산화 용액(0.05M 요오드/피리미딘/H2O/THF)
활성화제, 5-에틸티오-1-H-테트라졸(ETT)(아세토니트릴내 0.35M)
첫째로, 60ml 엑스퍼다이트(expedite) 병에 아미다이트를 넣고, 건조 아세토니트릴에 용해하여, 용액 0.15M를 제조하였다. 그후, 모노머 병을 포트 #A 상에서 신시사이저에 부착한다.
*합성후, 조절 공극 유리(CPG) 고체 지지체를 3.0ml 디에틸 에테르로 세척하고, 2ml 마이크로퓨즈 튜브(microfuge tube)에 옮겼다. 올리고뉴클레오티드를 CPG로부터 분리하고, 절대 에탄올내 1.2ml의 33% 메틸아민에서 65℃에서 45분, Seq. #1을 배양하여, 탈보호하였다(Aldrich Cat # 534102-250ML, Lot # SHBC2933V).
Seq. #2 & 3에 대하여, 절대 에탄올내 1.2ml의 33% 메틸아민에서 65℃에서 90분(Aldrich Cat # 534102-250ML, Lot # SHBC2933V). 그후, 튜브를 -20℃에서 30분간 냉각시킨다. 그후, 상층액을 제거하고, CPG를 500ul의 물로 세척하고; 상층액을 풀링하고, 속도있게 진공(speed vac) 건조시켰다. 45℃의 초음파 배쓰에서 4시간동안 1000ul의 트리에틸아민 하이드로플루오라이드(Oakwood chemical, Cat # 003029, Lot # F29E)에 의한 처리로 t-부틸-디메틸실일 보호기를 RNA 잔기로부터 제거하였다. 올리고뉴클레오타이드를 3.0ml의 n-부탄올로 침전시키고, 샘플을 1시간동안 -20℃에서 냉각한후, 5,000g에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 디켄트하고, 펠릿을 n-부탄올로 한번 더 세척하였다. 500ul 아세토니트릴로 최종 세척한후, 5000rpm에서 5분간 다시 원심분리하고, 상층액을 디켄트하였다. 펠릿을 1000ul M.Q 물에 용해하고, OD의(원 탈염(Crude desalt))을 체크하였다.
그후, pH 7.5의 버퍼 A=(5.0%, 1.0M TRIS 및 10.0% 메탄올)에서 소듐 퍼클로레이트의 선형 구배를 사용한 이온-교환 HPLC에 의해 올리고뉴클레오티드를 정제하였다. 버퍼 B = 버퍼 A에서 0.5M 소듐 퍼클로레이트.
전체 샘플을 Source15Q 컬럼(1.0cm×25cm) 상에 로딩하고, 선형 0% 내지 85% 소듐 퍼클로레이트 구배에 의해 40분간 용출하였다. 샘플을 295nm에서 모니터링하고, 원하는 올리고뉴클레오티드 종류에 해당하는 피크들을 수집하고, 5.0용적의 (아세톤내 2% LiClO4)을 첨가하여 침전시킨 후, 5,000g에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 디켄트하고; 펠릿을 에탄올로 세척하였다.
100-mer RNA 합성의 트리틸 막대그래프는 도 5에 도시되어 있다. 트리틸 막대그래프가, 올리고의 단계당 결합효율이 일정한 방법으로 진행하고, 사슬길이가 성장함에 따라 결합 하락이 없다는 점을 보여준다는 것을 알 수 있다.
150-mer RNA 합성의 트리틸 막대그래프는 도 6에 도시되어 있다. 150-mer의 합성이 임의의 유의미한 하락없이 일정하게 및 부드럽게 진행한다는 점이 막대 그래프로부터 관찰될 수 있다.
200-mer RNA 합성의 트리틸 막대그래프는 도 7에 도시되어 있다. 상기와 같이 긴 길이의 올리고 뉴클레오티드에 대하여도, 단계당 결합 효율이 일정한 방법으로 진행하고, 사슬 길이가 성장함에 따라 결합이 유의미하게 하락하지 않는다는 점이 관찰될 수 있다.
100-mer 합성, 150-mer 합성 및 200-mer 합성의 IE HPLC(도 9): 예상대로 1.0umole 규모로 합성된 100-mer 원료는 예상된 용출시간에 넓은 피크를 나타낸다. 예상대로, 150-mer 원료 올리고뉴클레오티드의 IE HPLC는 여전히 예상된 용출시간에 더 넓은 피크를 나타낸다. 200-mer의 IE HPLC는 여전히 더 넓은 피크이며, 예상된 용출시간에 용출한다.
100-mer 및 200-mer RNA 합성의 겔(도 10)은 80-mer 마커보다 약간 느린 100-mer 이동에 대한 밴드를 나타낸다. 200-mer는 100-mer보다 느리게 이동하고, 150-mer보다 더 느린 것으로 나타났다.
본 발명에서 역 RNA 모노머 포스포라미다이트는 2'-tBD실일(tBDSi)-5'-시아노에틸포스포라미다이트(CED)(구조식 16), 3'-DMT-2'-tBD실일-5'-숙시닐-Icaa CPG-n-보호된 뉴클레오시드들(구조식 17) 또는 3'-DMT-2'-트리이소프로필실올옥시메틸(TOM)-5'-CED 포스포라미다이트 기(구조식 18)를 운반하면서, 리보뉴클레오시드내 3'-DMT 기를 운반한다.
본 발명은 본 조성물들을 제조하기 위한 방법을 교시하고 있다. 개시 염기 보호된 뉴클레오시드(19)는 이소프로필리덴 보호된 뉴클레오시드(20)를 제공한다. 벤조일화후, 이소프로필리덴 기 제거는 5'-벤조일화 뉴클레오시드(22)를 생산한다. 피리딘내에서 TBDMS 염화물과의 일련의 실일화 반응은 각각 3:2의 비의 2'- 및 3'- TBDMS 보호된 뉴클레오시드들(23 및 24)의 혼합물을 제공한다. 컬럼 크로마토그래피후, 이성질체가 용해되고, 수득율(%)로 분리된다. 이성질체(23)의 추가 반응으로, 3'-DMT-2'-TBDMS 보호된 뉴클레오시드(26)가 제공되었다.
그러므로, 3'-히드록실기의 이후 관능화동안, 2'-TBDMS 기의 유의미한 이동이 있을 것을 알 수 있다.
3'-히드록실기를 DMT-(4,4-디메톡시트리틸)로 관능화하는 동안, 유의미한 이동이 일어나지 않는 것으로 관찰되었다. 게다가, 3'-TBDMS 보호된 이성질체(24)는 또한, 피리딘내에서 DMT 염화물과 이성질체(23)로서 동일한 트리틸화 반응에 포함되었지만, 뉴클레오시드(25)는 그 반응에서 관찰되지 않았다. 그러므로, 그의 이성질체(24)에 의한 2'-TBDMS 보호된 뉴클레오시드(23)의 오염의 경우, 원치않는 이성질체(25)가 트리틸화 조건에서 형성될 수 없으며, 원하는 뉴클레오시드(26)가 고순도로 분리될 수 있다. 3'-TBDMS 보호된 뉴클레오시드(24)가 원하는 생성물의 합성에 사용될 수 있으며, 반응식 1에서 서술된 이성질화 프로세스로 인해 23으로 전환되었다.
메탄올내에서 수산화나트륨으로 5'-벤조일기를 제거한후, CEDP 및 DIPA 테트라졸레이트를 사용한 포스피틸화 반응에 의해, 최종 역 포스포라미다이트(16)를 제공한다.
역 포스포라미다이트를 사용한 올리고뉴클레오티드 합성은 5'→3' 방향으로 수행되었다.
하기 제공된 실시예들은 본 발명을 더 상세히 설명하며; 이들은 오로지 설명을 위한 것일뿐, 어떤 식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 특히, 하기 실시예들은 본 발명의 화합물들을 얻는 합성방법을 입증한다. 본 발명의 화합물을 제조하는데 유용한 개시 물질들 및 그의 중간물질들은 상업용으로 사용가능하거나, 공지된 합성방법 및 제제들을 사용하여 상업용으로 사용가능한 물질들로부터 제조될 수 있다. 모든 올리고뉴클레오티드 서열은 왼쪽 상의 5'-말단으로부터 오른쪽 상의 3'-말단으로 작성된다. 3'-DMT-5'-CED 포스포라미다이트의 결합 효율은 단계당 99%를 능가하는 결합을 나타냈으며, 고순도 RNA로 이어진다. 다수의 호모폴리머 및 20-21-mers 올리고뉴클레오티드들은 상기 모노머 포스포라미다이트를 사용하여 합성되었다.
본원의 데이터는 3'→5' 방향의 합성에서 표준 3'-CED 포스포라미다이트와 대조되는 역 RNA 모노머(5'→3'-방향)를 사용한 올리고 합성동안 결합효율에 있어서 차이가 없다.
다른 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드의 3'-말단의 변형 또는 라벨링에 의한 리보핵산 올리고머의 합성방법을 제공한다. 친수성, 장쇄 리간드 또는 발색단 형광단 및 퀸처(quencher)를 필요로 하는 3'-말단 변형된 RNA의 합성은 대응 포스포라미다이트를 사용하여 수행될 수 있다. 본원의 데이터는 5'→3' 방향 합성이 종래의 방법에 비해 매우 구별된 잇점을 가진다는 것을 보여준다.
게다가, HEG 또는 PEG-2000과 같은 고체 지지체 상에서 사용할 수 없는 3'-변형은 5'→3'-방향 합성을 사용하여 쉽게 도입될 수 있으며, 역-상 HPLC에 의해 정제될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 RP HPLC에 의해 정제되어, 95-98% 순수한 생성물을 얻었다.
실험 실시예
하기 노트들은 본 발명의 다양한 혁신들, 잇점들, 및 가능성들, 및 일부 생성물 및 방법을 요약하고 있다. 이 리스트는 편리하고 실례가 되는 요약으로서 제공하는 것을 의미하며, 완전하지 않으며, 철저하지 않거나 제한되지 않는다.
·일반식 1의 유도된 뉴클레오시드 및 포스포라미다이트:
(식중,
Y는 산소 또는 황이며;
W는 산소, 질소, 황 또는 불소이며;
R4는 W가 황이 아닌 경우, 실일 에테르, 예컨대 TBDMS, 트리이소프로필실일 옥시메틸렌, Fmoc, 알킬, 아릴, 또는 아세틸이며; W가 황인 경우, R4는 벤조일, 아세틸 또는 디설파이드이며;
Z는 DMT, MMT, TMT 보호기이며;
R1 및 R2는 독립적으로, 알킬 또는 아릴기로부터 선택되며;
R3은 시아노에틸, 알킬 또는 아릴이다)
·구조식 2의 고체 지지체에 부착된 유도된 뉴클레오시드:
*
(식중,
M은 수소 라디칼 또는 Y-CO-이며;
Y는 올리고뉴클레오티드 합성에 적당한 임의의 고체 지지체 또는 CPG, 폴리스티렌과 같이, 거기에 고체 지지체를 결합하기에 적당한 임의의 링커, 산소, 질소 및 황으로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나 또는 그 이상의 헤테로원자들에 의해 선택적으로 치환된 탄화수소 사슬로 기본적으로 구성된, 길이가 2 내지 20인 원자 사슬이며;
W는 산소, 질소, 황 또는 불소이며;
R은 W가 황이 아닌 경우, 실일 에테르, 예컨대 TBDMS, 트리이소프로필실일 옥시메틸렌, Fmoc, 알킬, 아릴, 아미노 또는 아세틸이며; 그러나 W가 황인 경우, R은 벤조일, 아세틸 또는 디설파이드이며;
Z는 DMT, MMT, TMT 보호기이다)
·합성 RNA 올리고머에서 구조식 10으로 도시된 5'에서 3' 방향의 올리고뉴클레오티드 결합 형성을 통한, 역 방법. RNA는 천연 또는 변형된 뉴클레오 염기, 갭머들(gapmers), 포스포디에스테르, 포스포로티에이트, 포스포셀레네이트로 구성될 수 있었다. 합성은 자동화, 반자동화 DNA/RNA 또는 다른 신시사이저 또는 수동으로 수행될 수 있다. 합성은 마이크로그램에서 킬로그램 규모의 다양한 규모로 수행될 수 있다.
·해당 포스포라미다이트(구조식 11)(여기에서, L은 비오틴 또는 콜레스테롤과 같은 변형, 또는 플루오로포어, 퀸처 염료, 폴리에틸렌 글리콜, 및 펩타이드로 구성된 그룹으로부터 선택됨)를 사용한 RNA 분자들의 3'-말단으로의 변형 부착방법.
·고순도 RNA를 얻는 역방향(5'→3') RNA 합성을 사용한 자동화 고순도 RNA의 합성.
·RNA와 거대분자, 예컨대 콜레스테롤, 헥사에틸옥시글리콜(HEG) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 3'-접합.
·역방향(5'→3')의 자동화 RNA 합성의 적용으로 M+1 올리고뉴클레오티드 불순물 부재의 결과를 가져오게 된다.
·상기 언급된 방법에 의해 통합된 변형된 뉴클레오시드들은 하나 또는 그 이상의 퓨린 또는 피리미딘 변형물, 예컨대 5-플루오로-U, 5-플루오로 dU, 5-플루오로-dC, 5-플루오로-rC, 슈도우리딘, 5-메틸-dU, 5-메틸-rU, 5-메틸-dC, 5-메틸-rC, 5-브로모-dU, 5-브로모-rU, 5-브로모-dC, 5-브로모-rC, 5-이오도-dU, 5-이오도-rU, 5-비닐-dU, 5-비닐-rU, 5-비닐 티미딘, N-3 메틸데옥시 우리딘, N-3 메틸-리보우리딘, N-3 메틸 티미딘, 4-티오 우리딘, 4-티오-2'-데옥시우리딘, 2,6-디아미노퓨린 데옥시 리보시드, N-3 메틸 리보티미딘, 2,6-디아미노퓨린 리보시드, 8-브로모 2'-데옥시 아데노신, 8-브로모-r-아데노신, 8-옥소-데옥시 아데노신, 8-옥소-리보아데노신, 8-옥소-2'-데옥시-아데노신, 8-옥소-리보아데노신, 8-옥소-데옥시 이노신, 8-옥소-리보 이노신, 8-브로모-데옥시 이노신, 8-브로모-리보-이노신, N-1 메틸-리보아데노신, N-1 메틸-2'-데옥시 아데노신, N-1 메틸 2'-데옥시 이노신, N-1 메틸 리보아데노신, N-1 메틸데옥시 구아노신, N-1-메틸-리보구아노신, 에테노 아데노신, 에테노 2'-데옥시 아데노신, 퓨린 2'-데옥시 리보시드, 퓨린-리보뉴클레오시드, 2-아미노퓨린-2'-데옥시리보시드, 2-아미노퓨린-리보뉴클레오시드로 구성될 수 있으며, 여기에 제한되지 않는다.
·본 방법에 의해 합성된 RNA의 내부 위치의 라벨링은 발색단, 예컨대, 비제한적인, 플루오로세인(Fluoroscein)-C-5 dT, 댑실-C-5 티미딘, 내부 카르복실기 5-dU-메틸아크릴레이트, 비오틴 dT (스페이서를 통해 dU의 C-5에 부착된 비오틴), 아미노-dT (C-6 스페이서를 통해 C-5 dU에 부착된 말단 아미노)에 의해 이루어질 수 있다.
·변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 본 발명의 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에서, 2'-데옥시-2'-플루오로 리보 뉴클레오시드(2'-F-ANAs) 예컨대 A, C, G, U, 이노신, 및, 2'-플루오로를 함유하는 변형된 뉴클레오시드로 구성될 수 있었다.
·변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 본 발명의 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에서, 2'-데옥시-2'-메톡시 리보 뉴클레오시드(2'-OMe-) 예컨대 A, C, G, U, 이노신, 및 2'-메톡시를 함유하는 변형된 뉴클레오시드로 구성될 수 있었다.
·변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 본 발명의 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에서, 2'-데옥시-2'-아미노 리보 뉴클레오시드(2'-NH2) 예컨대 A, C, G, U, 이노신, 및 2'-아미노를 함유하는 변형된 뉴클레오시드로 구성될 수 있었다.
·변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 본 발명의 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에서, 뉴클레오시드 상에 2-10개의 원자들로부터 스페이서를 통해 부착된, 2'-데옥시-2'-말단 아미노 리보 뉴클레오시드(2'-말단 NH2), 예컨대 A, C, G, U , 이노신, 및 2'-말단 아미노를 함유하는 변형된 뉴클레오시드로 구성될 수 있었다.
·변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 본 발명의 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에서, 2'-데옥시-2'-메톡시 에톡시 리보 뉴클레오시드(2'-MOE), 예컨대 A, C, G, U, 이노신, 및, 2'-MOE를 함유하는 변형된 뉴클레오시드로 구성될 수 있었다.
·변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 본 발명의 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에서, 다른 2'-O-알킬기, 예컨대 2'-데옥시-2'-에톡시, 프로파길, 부틴 리보 뉴클레오시드(2'-OEt, O-프로파길, 2'-O-부틴), 예컨대 A, C, G, U, 이노신, 및, 2'-2'-OEt, O-프로파길, 2'-O-부틴을 함유하는 변형된 뉴클레오시드로 구성될 수 있었다.
·변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 본 발명의 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에서, 2'-데옥시-2'-플루오로 아라비노 뉴클레오시드(2'-F-ANAs), 예컨대 A, C, G, U, 이노신, 및, 2'-F-ANAs를 함유하는 변형된 뉴클레오시드로 구성될 수 있었다.
·변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 본 발명의 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에서, 2'-데옥시-2'-플루오로 4'-티오아라비노 뉴클레오시드(4'-S-FANAs), 예컨대 A, C, G, U, 이노신, 및, 4'-S-FANAs를 함유하는 변형된 뉴클레오시드로 구성될 수 있었다.
·RNA는 서열의 3'-말단 또는 5'-말단의 서열내 하나 또는 그 이상의 2'-5'-결합에 의해 수행될 수 있다.
·3'-말단을 갖는 RNA는 그들의 3'-히드록실 작용기를 통해 부착된, 역 부착된 데옥시 뉴클레오시드, 예컨대 dT, dC, dG, 티미딘을 함유하는 본 발명의 방법에 의해 합성될 수 있다.
*·3'-말단을 갖는 RNA는 그들의 2' 또는 3'-히드록실 작용기를 통해 부착된, 역 부착된 뉴클레오시드, 예컨대 rA, rC, rG, rU를 함유하는 본 발명의 방법에 의해 합성될 수 있다.
·역 RNA 합성은 2'-트리이소프로필실일옥시 메틸(TOM) 보호기를 포함하여 달성될 수 있다.
·역 RNA 합성은 2'-t-부틸디티오메틸(DTM) 보호기를 포함하여 달성될 수 있다.
·역 RNA 합성은 2'-데옥시-2'-플루오로-베타-D-아라비노핵산(FANA)을 포함하는 변형된 염기를 포함하여 달성될 수 있다.
·역 RNA 합성은 4'-티오- 2'-데옥시-2'-플루오로-베타-D-아라비노핵산(4'-Thio- FANA)을 포함하는 변형된 염기를 포함하여 달성될 수 있다.
·역 RNA 합성은 2'-O-메틸 변형을 사용하여, 변형된 당을 포함하여 달성될 수 있다.
·역 RNA 합성은 두고리 잠금 핵산(LNA's)을 사용하여 달성될 수 있다.
·역 RNA 합성은 알트리톨 당 변형된 올리고뉴클레오티드(ANA)를 포함하는 변형된 당을 사용할 수 있다.
·역 RNA 합성은 소수성 모이어티 상의 아미다이트 작용기를 통해, 또는 말단 아미노기를 갖는 역 합성된 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 있는 아미노 링커를 통해 RNA의 3'-말단에서 친유성 또는 소수성 기의 접합단계를 포함할 수 있다. 이후 합성은 올리고뉴클레오티드의 3'-말단의 아미노와 친유성 모이어티 상의 카르복시 작용기 사이의 결합단계를 포함한다. 친유성 모이어티는 다양한 글리콜, 예컨대 트리에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 다양한 지질들로 구성된다.
·역 RNA 합성은 상기 펩타이드의 유리 아민 작용기 및 역 합성된 RNA 상의 3'-말단 카르복시 작용기를 사용하여, 펩타이드들, 예컨대 세포침투 펩타이드(CPPs) 또는 막투과 펩타이드(MPPs)의 접합단계를 포함할 수 있다. 적당한 카르복실 작용기를 갖는 CPPs 및 MPPs는 역 합성된 RNA의 3'-말단의 유리 말단 아미노 작용기에 결합될 수 있다.
·역 RNA 합성은 서열의 3'-말단 또는 서열의 5'-말단에서, 서열내 2'-5'-결합된 DNA 유닛들 또는 2'-5'-RNA 유닛들을 포함한다.
당해 분야의 통상의 기술자들은 일상적인 실험만을 사용하여, 본원에 설명된 본 발명의 특정 구현예의 많은 균등물을 인지하거나, 확인할 수 있을 것이다. 상기 균등물들은 하기 청구범위에 의해 포함된다. 종속항에 개시된 구현예의 임의 조합도 또한, 본 발명의 범주내에 있는 것으로 고려될 것이다.
본 발명은 여러 잇점들을 제공한다. 첫째, 역 방향, 즉 5'에서 3' 방향으로의 RNA 합성은 3'에서 5' 방향의 RNA 합성에 존재하는 M+1 불순물이 없는 RNA 올리고뉴클레오티드를 생성하였다. 의도한 수(M)의 모노머에서 합성이 정지하지 않지만, 의도하지 않은 수(M+1)의 모노머에서는 진행할때, M+1 종류가 발생한다. 둘째, 원 RNA 순도 범위는 89% 내지 93%이며, 이는 단계당 약 99.5%의 결합효율을 시사한다. 셋째, 원 RNA의 단일 정제는 95%-98% 순수한 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 넷째, 본 발명은 생체의학 연구의 많은 측면에 유용한 긴 RNA를 합성할 수 있게 한다.
약 100-mer 내지 약 200-mer의 범위의 긴 RNA를 합성하기 위해, 매우 효과적인 결합 및 감소된 결합 시간 모두 중요하다.
약 100-mer 내지 약 200-mer의 범위의 긴 RNA를 합성하기 위해서는, 본 방법에 보조제들의 신규한 조합을 사용하는 것이 결정적이다. 본 실험예들의 상세한 설명은 하기에 설명된다.
상기 "5"는 5'-말단 포스페이트를 나타낸다.
본 발명에 따르면, 5'에서 3' 방향으로 RNA 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 하기 구조식의 RNA 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다:
(상기 식중,
B는 아데닌, 시토신, 구아노신, 우라실, 이노신, 5-메틸-시토신, 5-메틸-우라실, 5-플루로-우라실, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-아데닌 및 5-플루로-시토신으로 구성된 그룹으로부터 선택된 일원이며;
n은 100 내지 약 200의 정수이며;
L은 링커 또는 스페이서를 갖는 콜레스테롤, 비오틴, 에틸렌글리콜, 글리세롤, 폴리에틸렌글리콜, 헥사에틸렌글리콜, 아미노 링커, 디설파이드 링커, 펩타이드 링커, 폴리펩타이드 링커, 단백질, 플루로포어, 퀸처 염료, 하나 또는 그 이상의 2',5'-연결된 데옥시뉴클레오시드 유닛, 하나 또는 그 이상의 2',5'-연결된 리보뉴클레오시드 유닛, 및 하나 또는 그 이상의 2',5'-연결된 데옥시리보스 유닛으로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오시드, 비-뉴클레오시드 리간드이며,
L은 중재 포스페이트를 통해 RNA 뉴클레오티드의 3'-말단에 부착된다)
RNA 뉴클레오티드의 5'-말단으로부터 3'-말단까지의 방향으로 RNA가 합성되는 방법은:
(a)화학식 2로 표시되는 뉴클레오시드 고체 지지체를 취하는 단계:
[화학식 2]
(상기 화학식 2에서,
M은 수소 라디칼 또는 링커이며;
M이 링커인 경우, 그것은 구조식 Y-C(O)에 의해 나타내며, 및 올리고뉴클레오타이드 합성에 적당한 고체 지지체에 선택적으로 연결되며,
상기 Y는 2개의 탄소들과 20개의 탄소들 사이의 길이를 갖는 탄화수소 디라디칼 모이어티이며, 및 Y는 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 및 아랄킬로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 및 탄화수소 디라디칼 모이어티는 선택적으로, 중재 -O-, -S-, -S(O)2- -C(O)- 및 -NR6-(여기에서, R6은 수소 라디칼, 또는 치환된 C1 내지 C20 알킬 또는 치환된 아랄킬임)을 포함하며;
W는 산소 디라디칼, N-H 디라디칼, 및 불소 라디칼로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 및 R은:
W가 산소 디라디칼인 경우, R이 tert 부틸 디메틸 실일(TBDMS) 또는 트리이소프로필실일 옥시메틸렌(TOM)이고; 및
W가 N-H 디라디칼인 경우, R이 형태 R5 X(여기에서, x는 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc), 트리플루오로아세틸, 아세틸, 알카노일 및 아로일로 구성된 그룹으로부터 선택됨)를 가지며; 및
W가 불소 라디칼인 경우, R이 존재하지 않도록
선택되며;
B는 9-(N6-벤조일아데니닐)-, 9-(N6-아세틸아데니닐)-, 9-(N6-tert-부틸 페녹시아세틸아데니닐)-, 9-(N6-페녹시아세틸아데니닐)-, 9-(N6-이소프로필 페녹시아세틸아데니닐)-, 1-(N6-(N,N-디메틸포름아미디닐아데니닐), 1-(N4-벤조일시토시닐)-, 1-(N4-아세틸시토시닐)-, 1-(N4-(N,N-디메틸포름아미디닐)시토시닐)-, 1-(N4-페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-tert-부틸페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-이소프로필 페녹시아세틸시토시닐)-, 9-(N2-이소부틸구아니닐)-, 9-(N2-tert 부틸 페녹시아세틸구아니닐)-, 9-(N2-이소프로필 페녹시아세틸구아니닐)-, 1-(N4-페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-tert 부틸 페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-이소프로필 페녹시아세틸시토시닐)-, 및 1-우라실일-로 구성된 뉴클레오시드 염기 라디칼로 구성된 그룹으로부터 선택되며; 또는
B는 1-(N4-벤조일-5-메틸시토시닐)-, 1-(N4-(N,N-디메틸포름아미디닐)-5-메틸시토시닐)-, 1-(N4-아세틸-5-메틸시토시닐)-, 1-(5-메틸-우라실일)-, 1-(5-플루오로-우라실일)-, 1-(N4-벤조일-5-플루오로시토시닐)-, 9-(N6-벤조일-7-디아자아데니닐)-, 9-(N6-(N,N-디메틸포름아미디닐)-7-디아자아데닐)-, 9-(N2-이소부틸-7-디아자구아니닐)-, 및 9-(N2-(N,N-디메틸포름아미디닐)-7-디아자구아니닐)-로 구성된 그룹으로부터 선택된 변형된 뉴클레오시드 염기 라디칼이며;
Z는 디메톡시 트리페닐(DMT), 모노메톡시 트리페닐(MMT) 및 트리메톡시 트리페닐(TMT)로 구성된 보호기이다);
(b)올리고뉴클레오티드 신시사이저(synthesizer) 상에 화학식 1의 포스포라미다이트를 놓는 단계;
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
Y는 산소 원자 또는 황 원자이며;
W는 산소 디라디칼, N-H 디라디칼, 및 불소 라디칼로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 및 R4는:
W가 산소 디라디칼인 경우, R4가 tert 부틸 디메틸 실일(TBDMS) 또는 트리이소프로필실일 옥시메틸렌(TOM)이고; 및
W가 N-H 디라디칼인 경우, R4가 형태 R5 X(여기에서, x는 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc), 트리플루오로아세틸, 아세틸, 알카노일 및 아로일로 구성된 그룹으로부터 선택됨)를 가지며; 및
W가 불소 라디칼인 경우, R4가 존재하지 않도록
선택되며;
B는 9-(N6-벤조일아데니닐)-, 9-(N6-아세틸아데니닐)-, 9-(N6-tert-부틸 페녹시아세틸아데니닐)-, 9-(N6-페녹시아세틸아데니닐)-, 9-(N6-이소프로필 페녹시아세틸아데니닐)-, 1-(N6-(N,N-디메틸포름아미디닐)아데니닐)-, 1-(N4-벤조일시토시닐)-, 1-(N4-아세틸시토시닐)-, 1-(N4-(N,N-디메틸포름아미디닐)시토시닐)-, 1-(N4-페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-tert-부틸페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-이소프로필 페녹시아세틸시토시닐)-, 9-(N2-이소부틸구아니닐)-, 9-(N2-tert 부틸 페녹시아세틸구아니닐)-, 9-(N2-이소프로필 페녹시아세틸구아니닐)-, 1-(N4-페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-tert 부틸 페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-이소프로필 페녹시아세틸시토시닐)-, 및 1-우라실일-로 구성된 뉴클레오시드 염기 라디칼로 구성된 그룹으로부터 선택되며; 또는
B는 1-(N4-벤조일-5-메틸시토시닐)-, 1-(N4-(N,N-디메틸포름아미디닐)-5-메틸시토시닐)-, 1-(N4-아세틸-5-메틸시토시닐)-, 1-(5-메틸-우라실일)-, 1-(5-플루오로-우라실일)-, 1-(N4-벤조일-5-플루오로시토시닐)-, 9-(N6-벤조일-7-디아자아데니닐)-, 9-(N6-(N,N-디메틸포름아미디닐)-7-디아자아데닐)-, 9-(N2-이소부틸-7-디아자구아니닐)-, 및 9-(N2-(N,N-디메틸포름아미디닐)-7-디아자구아니닐)-로 구성된 그룹으로부터 선택된 변형된 뉴클레오시드 염기 라디칼이며;
Z는 디메톡시 트리페닐(DMT), 모노메톡시 트리페닐(MMT) 및 트리메톡시 트리페닐(TMT)로 구성된 보호기이며;
R1은 알킬 또는 아릴 라디칼이며;
R2는 알킬 또는 아릴 라디칼이며; 및
R3은 시아노에틸, 알킬 또는 아릴 라디칼이며,
B는 수소, 또는 각 1차 아민에서 아민 보호기에 의해 선택적으로 관능화된 뉴클레오염기이다);
(c)화학식 2의 뉴클레오시드 고체 지지체로부터 보호기 Z를 제거하는 단계;
(d)보조제들의 혼합물을 사용하여, 화학식 2의 뉴클레오시드 및 화학식 1의 포스포라미다이트를 올리고뉴클레오티드 신시사이저내에서 결합시켜서, RNA 합성과정을 수행하여, 적어도 하나의 보호기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 얻는 단계;
(d)L 기를 갖는 포스포라미다이트를 제공하는 단계;
(e)올리고뉴클레오티드의 말단에서 L 기를 갖는 포스포라미다이트를 가하여, L 기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 얻는 단계;
(f)L 기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체로부터 분리하는 단계;
(g)올리고뉴클레오티드로부터 적어도 하나의 보호기를 제거하는 단계;
(h)실일 보호기를 제거하여, 올리고뉴클레오티드를 얻는 단계;
(i)올리고뉴클레오티드를 침전(precipitation)시키는 단계; 및
(j)순도 측정을 위해 올리고뉴클레오티드를 분석하는 단계를 포함한다.
상기 보조제는 CAP A(페녹시 아세트산 무수물/테트라히드로푸란/피리딘), CAP B(10% N-메틸이미다졸/테트로히드로푸란), DMT 제거 시약(톨루엔내 3% TCA), 산화 용액(0.05M 요오드/피리딘/물/테트라히드로푸란) 및 활성화제(아세토니트릴내 0.35M의 5-에틸티오-1-H-테트라졸)를 포함한다.
본 발명에 따르면, 긴 RNA는 100 내지 200개의 모노머들을 갖는 RNA 올리고머이다. 상기 목적을 달성하기 위해서는, 보조제들이 본 방법에 결정적이다. 즉, 5'-방향에서 3'-방향으로, RNA의 역합성에서, 보조제들은 일반적으로, TCA/DCM, DCA/DCM,TCA/톨루엔, DCA/톨루엔, 무수 아세토니트릴, CAP A, CAP B, 다양한 농도의 요오드/THF/피리딘/H2O의 조합, 적당한 황화제들 중 하나, 아세토니트릴 용액으로서 적당한 활성화제 중 하나이다.
본 발명에 사용되는 보조제들은 모노머-5'-아미다이트의 높은 결합을 완료시키는데 도움을 준다. 따라서, 더 짧은 결합시간에 0.3M BMT(5-벤질티오테트라졸) 또는 0.5M ETT(5-티오에틸테트라졸)과 같은 보조제들은 분명히 관련되어 있으며, 다른 결합시간을 사용하며, 더 짧은 RNA 올리고머들을 위해 사용된 동일한 제제들과 대조되는, 높은 결합효율의 특별한 결과를 양산한다.
본 발명의 구현예에 따르면, L은 링커 또는 스페이서를 갖는 콜레스테롤이며, 및 n은 100 내지 약 200의 정수이다.
본 발명의 다른 구현예에서, L은 폴리에틸렌글리콜(PEG)이며, 및 n은 100 내지 약 200의 정수이다.
본 발명의 다른 구현예는 상기 방법에 의해 합성된, n=100, 150 또는 약 200인 RNA 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. RNA 올리고뉴클레오티드가 5'에서 3' 방향으로 합성되기 때문에, "m+1" 종류로 언급되는 불순물들은 존재하지 않는다.
두 방법론들, 즉, 3'→5' 방향 및 5'→3' 방향으로 합성된, 3'-말단에 3'-콜레스테롤 접합(conjugation)을 갖는 올리고뉴클레오티드들에 대한 본 데이터는 본 발명의 공개된 특허에서 분명하게 알 수 있다.
본 발명의 다른 구현예는 역 RNA 합성 방법론을 사용한, 100-mer 내지 200-mer 장쇄 RNA의 RNA 합성 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 데옥시, 백본-변형된 염기, 변형된 DNA 및 변형된 RNA 염기들을 포함하는, 장쇄 RNA 키메라를 포함한다. 장쇄 RNA는 역 방법론을 사용하여, 말단에, 분지점에 또는 사슬내에, 하나 또는 그 이상의 5', 2', 2', 3' 결합을 갖는다.
본 발명에 따르면, 다른 구현예는 역 합성 방법론을 사용한, 천연 및 변형된 뉴클레오시드, 무염기 부위, 역 무염기 부위, 발색단 및 리간드를 포함하는 장쇄 RNA이다.
본 발명의 다른 구현예는 역 합성 방법론을 사용한, 발색단, 리간드, 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트기를 포함하는 장쇄 RNA이다.
본 발명의 또다른 구현예는 역 합성 방법론을 사용한, 하나 또는 그 이상의 데옥시, 변형된 데옥시 또는 변형된 리보뉴클레오시드에 의해 분지점을 갖는 장쇄 RNA이다.
게다가, 본 발명은 HPLC 겔 전기영동법 또는 다른 RNA 정제기술들에 의한 역 방법론에 의해 합성된 장쇄 RNA의 정제 방법을 포함한다.
본 발명은 또한, 합성된 올리고뉴클레오티드의 3'-말단을 통해, 다양한 종류의 칩들, 폴리에틸렌 글리콜들, 지지체들과 같은, 표면 상에 역 방법론에 의해 합성된 장쇄 RNA를 라벨링 및 부착하는 방법을 포함한다. 따라서, 올리고뉴클레오티드에 아민 작용기와 같은 작용기를 도입하면, 알데하이드 작용을 함유하는 칩 또는 표면에 부착시킬 것이다.
본 발명은 분자생물학 연구 및 개발에서 역 방법론에 의해 합성된 장쇄 RNA를 사용하는 방법을 추가로 포함한다. 본 발명에 따른 방법에 의해 합성된 RNA는 3'→5' 방향의 정상적인 방법으로 합성된 RNA와 구별되는 생화학적 특성들을 갖는 것으로 나타났다.
올리고뉴클레오티드 합성: 올리고뉴클레오티드 Seq. #1(SEQ ID No.1)(100-mer), Seq. #2(SEQ. ID No. 2)(150-mer), Seq. #3 SEQ. ID No. 3이 합성된다. Seq. #3외에는, 5'→3' 방향 REV-RNA 포스포라미다이트 화학을 1마이크로몰 규모로 사용하여, 200-mer까지 확장된 Seq. #2를 합성하였다. Seq. #3은 0.5υmole 규모로 합성되었다. 표준 RNA 1υmole 주기 및 고체 지지체 6.0분을 갖는 모노머의 결합시간을 사용하여, 엑스퍼다이트(Expedite) 8900 신시사이저 상에서 합성을 수행하였다. 올리고뉴클레오티드 합성에서, 5는 Universal UnyLinker support 3000A, ChemGenes Cat # N-4000-30을 나타낸다.
(1) 사용된 아미다이트 N6 -tbpac-2’-O-TBDMS-3’-O-DMT-아데노신-5’-시아노에틸-N,N-디이소프로필-포스포라미다이트. LOT # AT 239-9(ChemGenes Cat # ANP-3407)
(2) 사용된 CPG Universal UnyLinker support 3000A, ChemGenes Cat # N-4000-30, Lot # AT157-9
*(3) 사용된 보조제
무수 아세토니트릴 RN-1447
CAP A(페녹시 아세트산 무수물/THF/피리딘)
CAP B(10% N-메틸이미다졸/THF)
DMT 제거제(톨루엔내 3% TCA)
산화 용액(0.05M 요오드/피리미딘/H2O/THF)
활성화제, 5-에틸티오-1-H-테트라졸(ETT)(아세토니트릴내 0.35M)
첫째로, 60ml 엑스퍼다이트(expedite) 병에 아미다이트를 넣고, 건조 아세토니트릴에 용해하여, 용액 0.15M를 제조하였다. 그후, 모노머 병을 포트 #A 상에서 신시사이저에 부착한다.
*합성후, 조절 공극 유리(CPG) 고체 지지체를 3.0ml 디에틸 에테르로 세척하고, 2ml 마이크로퓨즈 튜브(microfuge tube)에 옮겼다. 올리고뉴클레오티드를 CPG로부터 분리하고, 절대 에탄올내 1.2ml의 33% 메틸아민에서 65℃에서 45분, Seq. #1을 배양하여, 탈보호하였다(Aldrich Cat # 534102-250ML, Lot # SHBC2933V).
Seq. #2 & 3에 대하여, 절대 에탄올내 1.2ml의 33% 메틸아민에서 65℃에서 90분(Aldrich Cat # 534102-250ML, Lot # SHBC2933V). 그후, 튜브를 -20℃에서 30분간 냉각시킨다. 그후, 상층액을 제거하고, CPG를 500ul의 물로 세척하고; 상층액을 풀링하고, 속도있게 진공(speed vac) 건조시켰다. 45℃의 초음파 배쓰에서 4시간동안 1000ul의 트리에틸아민 하이드로플루오라이드(Oakwood chemical, Cat # 003029, Lot # F29E)에 의한 처리로 t-부틸-디메틸실일 보호기를 RNA 잔기로부터 제거하였다. 올리고뉴클레오타이드를 3.0ml의 n-부탄올로 침전시키고, 샘플을 1시간동안 -20℃에서 냉각한후, 5,000g에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 디켄트하고, 펠릿을 n-부탄올로 한번 더 세척하였다. 500ul 아세토니트릴로 최종 세척한후, 5000rpm에서 5분간 다시 원심분리하고, 상층액을 디켄트하였다. 펠릿을 1000ul M.Q 물에 용해하고, OD의(원 탈염(Crude desalt))을 체크하였다.
그후, pH 7.5의 버퍼 A=(5.0%, 1.0M TRIS 및 10.0% 메탄올)에서 소듐 퍼클로레이트의 선형 구배를 사용한 이온-교환 HPLC에 의해 올리고뉴클레오티드를 정제하였다. 버퍼 B = 버퍼 A에서 0.5M 소듐 퍼클로레이트.
전체 샘플을 Source15Q 컬럼(1.0cm×25cm) 상에 로딩하고, 선형 0% 내지 85% 소듐 퍼클로레이트 구배에 의해 40분간 용출하였다. 샘플을 295nm에서 모니터링하고, 원하는 올리고뉴클레오티드 종류에 해당하는 피크들을 수집하고, 5.0용적의 (아세톤내 2% LiClO4)을 첨가하여 침전시킨 후, 5,000g에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 디켄트하고; 펠릿을 에탄올로 세척하였다.
100-mer RNA 합성의 트리틸 막대그래프는 도 5에 도시되어 있다. 트리틸 막대그래프가, 올리고의 단계당 결합효율이 일정한 방법으로 진행하고, 사슬길이가 성장함에 따라 결합 하락이 없다는 점을 보여준다는 것을 알 수 있다.
150-mer RNA 합성의 트리틸 막대그래프는 도 6에 도시되어 있다. 150-mer의 합성이 임의의 유의미한 하락없이 일정하게 및 부드럽게 진행한다는 점이 막대 그래프로부터 관찰될 수 있다.
200-mer RNA 합성의 트리틸 막대그래프는 도 7에 도시되어 있다. 상기와 같이 긴 길이의 올리고 뉴클레오티드에 대하여도, 단계당 결합 효율이 일정한 방법으로 진행하고, 사슬 길이가 성장함에 따라 결합이 유의미하게 하락하지 않는다는 점이 관찰될 수 있다.
100-mer 합성, 150-mer 합성 및 200-mer 합성의 IE HPLC(도 9): 예상대로 1.0umole 규모로 합성된 100-mer 원료는 예상된 용출시간에 넓은 피크를 나타낸다. 예상대로, 150-mer 원료 올리고뉴클레오티드의 IE HPLC는 여전히 예상된 용출시간에 더 넓은 피크를 나타낸다. 200-mer의 IE HPLC는 여전히 더 넓은 피크이며, 예상된 용출시간에 용출한다.
100-mer 및 200-mer RNA 합성의 겔(도 10)은 80-mer 마커보다 약간 느린 100-mer 이동에 대한 밴드를 나타낸다. 200-mer는 100-mer보다 느리게 이동하고, 150-mer보다 더 느린 것으로 나타났다.
본 발명에서 역 RNA 모노머 포스포라미다이트는 2'-tBD실일(tBDSi)-5'-시아노에틸포스포라미다이트(CED)(구조식 16), 3'-DMT-2'-tBD실일-5'-숙시닐-Icaa CPG-n-보호된 뉴클레오시드들(구조식 17) 또는 3'-DMT-2'-트리이소프로필실올옥시메틸(TOM)-5'-CED 포스포라미다이트 기(구조식 18)를 운반하면서, 리보뉴클레오시드내 3'-DMT 기를 운반한다.
본 발명은 본 조성물들을 제조하기 위한 방법을 교시하고 있다. 개시 염기 보호된 뉴클레오시드(19)는 이소프로필리덴 보호된 뉴클레오시드(20)를 제공한다. 벤조일화후, 이소프로필리덴 기 제거는 5'-벤조일화 뉴클레오시드(22)를 생산한다. 피리딘내에서 TBDMS 염화물과의 일련의 실일화 반응은 각각 3:2의 비의 2'- 및 3'- TBDMS 보호된 뉴클레오시드들(23 및 24)의 혼합물을 제공한다. 컬럼 크로마토그래피후, 이성질체가 용해되고, 수득율(%)로 분리된다. 이성질체(23)의 추가 반응으로, 3'-DMT-2'-TBDMS 보호된 뉴클레오시드(26)가 제공되었다.
그러므로, 3'-히드록실기의 이후 관능화동안, 2'-TBDMS 기의 유의미한 이동이 있을 것을 알 수 있다.
3'-히드록실기를 DMT-(4,4-디메톡시트리틸)로 관능화하는 동안, 유의미한 이동이 일어나지 않는 것으로 관찰되었다. 게다가, 3'-TBDMS 보호된 이성질체(24)는 또한, 피리딘내에서 DMT 염화물과 이성질체(23)로서 동일한 트리틸화 반응에 포함되었지만, 뉴클레오시드(25)는 그 반응에서 관찰되지 않았다. 그러므로, 그의 이성질체(24)에 의한 2'-TBDMS 보호된 뉴클레오시드(23)의 오염의 경우, 원치않는 이성질체(25)가 트리틸화 조건에서 형성될 수 없으며, 원하는 뉴클레오시드(26)가 고순도로 분리될 수 있다. 3'-TBDMS 보호된 뉴클레오시드(24)가 원하는 생성물의 합성에 사용될 수 있으며, 반응식 1에서 서술된 이성질화 프로세스로 인해 23으로 전환되었다.
메탄올내에서 수산화나트륨으로 5'-벤조일기를 제거한후, CEDP 및 DIPA 테트라졸레이트를 사용한 포스피틸화 반응에 의해, 최종 역 포스포라미다이트(16)를 제공한다.
역 포스포라미다이트를 사용한 올리고뉴클레오티드 합성은 5'→3' 방향으로 수행되었다.
하기 제공된 실시예들은 본 발명을 더 상세히 설명하며; 이들은 오로지 설명을 위한 것일뿐, 어떤 식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 특히, 하기 실시예들은 본 발명의 화합물들을 얻는 합성방법을 입증한다. 본 발명의 화합물을 제조하는데 유용한 개시 물질들 및 그의 중간물질들은 상업용으로 사용가능하거나, 공지된 합성방법 및 제제들을 사용하여 상업용으로 사용가능한 물질들로부터 제조될 수 있다. 모든 올리고뉴클레오티드 서열은 왼쪽 상의 5'-말단으로부터 오른쪽 상의 3'-말단으로 작성된다. 3'-DMT-5'-CED 포스포라미다이트의 결합 효율은 단계당 99%를 능가하는 결합을 나타냈으며, 고순도 RNA로 이어진다. 다수의 호모폴리머 및 20-21-mers 올리고뉴클레오티드들은 상기 모노머 포스포라미다이트를 사용하여 합성되었다.
본원의 데이터는 3'→5' 방향의 합성에서 표준 3'-CED 포스포라미다이트와 대조되는 역 RNA 모노머(5'→3'-방향)를 사용한 올리고 합성동안 결합효율에 있어서 차이가 없다.
다른 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드의 3'-말단의 변형 또는 라벨링에 의한 리보핵산 올리고머의 합성방법을 제공한다. 친수성, 장쇄 리간드 또는 발색단 형광단 및 퀸처(quencher)를 필요로 하는 3'-말단 변형된 RNA의 합성은 대응 포스포라미다이트를 사용하여 수행될 수 있다. 본원의 데이터는 5'→3' 방향 합성이 종래의 방법에 비해 매우 구별된 잇점을 가진다는 것을 보여준다.
게다가, HEG 또는 PEG-2000과 같은 고체 지지체 상에서 사용할 수 없는 3'-변형은 5'→3'-방향 합성을 사용하여 쉽게 도입될 수 있으며, 역-상 HPLC에 의해 정제될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 RP HPLC에 의해 정제되어, 95-98% 순수한 생성물을 얻었다.
실험 실시예
하기 노트들은 본 발명의 다양한 혁신들, 잇점들, 및 가능성들, 및 일부 생성물 및 방법을 요약하고 있다. 이 리스트는 편리하고 실례가 되는 요약으로서 제공하는 것을 의미하며, 완전하지 않으며, 철저하지 않거나 제한되지 않는다.
·일반식 1의 유도된 뉴클레오시드 및 포스포라미다이트:
(식중,
Y는 산소 또는 황이며;
W는 산소, 질소, 황 또는 불소이며;
R4는 W가 황이 아닌 경우, 실일 에테르, 예컨대 TBDMS, 트리이소프로필실일 옥시메틸렌, Fmoc, 알킬, 아릴, 또는 아세틸이며; W가 황인 경우, R4는 벤조일, 아세틸 또는 디설파이드이며;
Z는 DMT, MMT, TMT 보호기이며;
R1 및 R2는 독립적으로, 알킬 또는 아릴기로부터 선택되며;
R3은 시아노에틸, 알킬 또는 아릴이다)
·구조식 2의 고체 지지체에 부착된 유도된 뉴클레오시드:
*
(식중,
M은 수소 라디칼 또는 Y-CO-이며;
Y는 올리고뉴클레오티드 합성에 적당한 임의의 고체 지지체 또는 CPG, 폴리스티렌과 같이, 거기에 고체 지지체를 결합하기에 적당한 임의의 링커, 산소, 질소 및 황으로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나 또는 그 이상의 헤테로원자들에 의해 선택적으로 치환된 탄화수소 사슬로 기본적으로 구성된, 길이가 2 내지 20인 원자 사슬이며;
W는 산소, 질소, 황 또는 불소이며;
R은 W가 황이 아닌 경우, 실일 에테르, 예컨대 TBDMS, 트리이소프로필실일 옥시메틸렌, Fmoc, 알킬, 아릴, 아미노 또는 아세틸이며; 그러나 W가 황인 경우, R은 벤조일, 아세틸 또는 디설파이드이며;
Z는 DMT, MMT, TMT 보호기이다)
·합성 RNA 올리고머에서 구조식 10으로 도시된 5'에서 3' 방향의 올리고뉴클레오티드 결합 형성을 통한, 역 방법. RNA는 천연 또는 변형된 뉴클레오 염기, 갭머들(gapmers), 포스포디에스테르, 포스포로티에이트, 포스포셀레네이트로 구성될 수 있었다. 합성은 자동화, 반자동화 DNA/RNA 또는 다른 신시사이저 또는 수동으로 수행될 수 있다. 합성은 마이크로그램에서 킬로그램 규모의 다양한 규모로 수행될 수 있다.
·해당 포스포라미다이트(구조식 11)(여기에서, L은 비오틴 또는 콜레스테롤과 같은 변형, 또는 플루오로포어, 퀸처 염료, 폴리에틸렌 글리콜, 및 펩타이드로 구성된 그룹으로부터 선택됨)를 사용한 RNA 분자들의 3'-말단으로의 변형 부착방법.
·고순도 RNA를 얻는 역방향(5'→3') RNA 합성을 사용한 자동화 고순도 RNA의 합성.
·RNA와 거대분자, 예컨대 콜레스테롤, 헥사에틸옥시글리콜(HEG) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 3'-접합.
·역방향(5'→3')의 자동화 RNA 합성의 적용으로 M+1 올리고뉴클레오티드 불순물 부재의 결과를 가져오게 된다.
·상기 언급된 방법에 의해 통합된 변형된 뉴클레오시드들은 하나 또는 그 이상의 퓨린 또는 피리미딘 변형물, 예컨대 5-플루오로-U, 5-플루오로 dU, 5-플루오로-dC, 5-플루오로-rC, 슈도우리딘, 5-메틸-dU, 5-메틸-rU, 5-메틸-dC, 5-메틸-rC, 5-브로모-dU, 5-브로모-rU, 5-브로모-dC, 5-브로모-rC, 5-이오도-dU, 5-이오도-rU, 5-비닐-dU, 5-비닐-rU, 5-비닐 티미딘, N-3 메틸데옥시 우리딘, N-3 메틸-리보우리딘, N-3 메틸 티미딘, 4-티오 우리딘, 4-티오-2'-데옥시우리딘, 2,6-디아미노퓨린 데옥시 리보시드, N-3 메틸 리보티미딘, 2,6-디아미노퓨린 리보시드, 8-브로모 2'-데옥시 아데노신, 8-브로모-r-아데노신, 8-옥소-데옥시 아데노신, 8-옥소-리보아데노신, 8-옥소-2'-데옥시-아데노신, 8-옥소-리보아데노신, 8-옥소-데옥시 이노신, 8-옥소-리보 이노신, 8-브로모-데옥시 이노신, 8-브로모-리보-이노신, N-1 메틸-리보아데노신, N-1 메틸-2'-데옥시 아데노신, N-1 메틸 2'-데옥시 이노신, N-1 메틸 리보아데노신, N-1 메틸데옥시 구아노신, N-1-메틸-리보구아노신, 에테노 아데노신, 에테노 2'-데옥시 아데노신, 퓨린 2'-데옥시 리보시드, 퓨린-리보뉴클레오시드, 2-아미노퓨린-2'-데옥시리보시드, 2-아미노퓨린-리보뉴클레오시드로 구성될 수 있으며, 여기에 제한되지 않는다.
·본 방법에 의해 합성된 RNA의 내부 위치의 라벨링은 발색단, 예컨대, 비제한적인, 플루오로세인(Fluoroscein)-C-5 dT, 댑실-C-5 티미딘, 내부 카르복실기 5-dU-메틸아크릴레이트, 비오틴 dT (스페이서를 통해 dU의 C-5에 부착된 비오틴), 아미노-dT (C-6 스페이서를 통해 C-5 dU에 부착된 말단 아미노)에 의해 이루어질 수 있다.
·변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 본 발명의 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에서, 2'-데옥시-2'-플루오로 리보 뉴클레오시드(2'-F-ANAs) 예컨대 A, C, G, U, 이노신, 및, 2'-플루오로를 함유하는 변형된 뉴클레오시드로 구성될 수 있었다.
·변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 본 발명의 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에서, 2'-데옥시-2'-메톡시 리보 뉴클레오시드(2'-OMe-) 예컨대 A, C, G, U, 이노신, 및 2'-메톡시를 함유하는 변형된 뉴클레오시드로 구성될 수 있었다.
·변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 본 발명의 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에서, 2'-데옥시-2'-아미노 리보 뉴클레오시드(2'-NH2) 예컨대 A, C, G, U, 이노신, 및 2'-아미노를 함유하는 변형된 뉴클레오시드로 구성될 수 있었다.
·변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 본 발명의 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에서, 뉴클레오시드 상에 2-10개의 원자들로부터 스페이서를 통해 부착된, 2'-데옥시-2'-말단 아미노 리보 뉴클레오시드(2'-말단 NH2), 예컨대 A, C, G, U , 이노신, 및 2'-말단 아미노를 함유하는 변형된 뉴클레오시드로 구성될 수 있었다.
·변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 본 발명의 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에서, 2'-데옥시-2'-메톡시 에톡시 리보 뉴클레오시드(2'-MOE), 예컨대 A, C, G, U, 이노신, 및, 2'-MOE를 함유하는 변형된 뉴클레오시드로 구성될 수 있었다.
·변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 본 발명의 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에서, 다른 2'-O-알킬기, 예컨대 2'-데옥시-2'-에톡시, 프로파길, 부틴 리보 뉴클레오시드(2'-OEt, O-프로파길, 2'-O-부틴), 예컨대 A, C, G, U, 이노신, 및, 2'-2'-OEt, O-프로파길, 2'-O-부틴을 함유하는 변형된 뉴클레오시드로 구성될 수 있었다.
·변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 본 발명의 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에서, 2'-데옥시-2'-플루오로 아라비노 뉴클레오시드(2'-F-ANAs), 예컨대 A, C, G, U, 이노신, 및, 2'-F-ANAs를 함유하는 변형된 뉴클레오시드로 구성될 수 있었다.
·변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 본 발명의 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에서, 2'-데옥시-2'-플루오로 4'-티오아라비노 뉴클레오시드(4'-S-FANAs), 예컨대 A, C, G, U, 이노신, 및, 4'-S-FANAs를 함유하는 변형된 뉴클레오시드로 구성될 수 있었다.
·RNA는 서열의 3'-말단 또는 5'-말단의 서열내 하나 또는 그 이상의 2'-5'-결합에 의해 수행될 수 있다.
·3'-말단을 갖는 RNA는 그들의 3'-히드록실 작용기를 통해 부착된, 역 부착된 데옥시 뉴클레오시드, 예컨대 dT, dC, dG, 티미딘을 함유하는 본 발명의 방법에 의해 합성될 수 있다.
*·3'-말단을 갖는 RNA는 그들의 2' 또는 3'-히드록실 작용기를 통해 부착된, 역 부착된 뉴클레오시드, 예컨대 rA, rC, rG, rU를 함유하는 본 발명의 방법에 의해 합성될 수 있다.
·역 RNA 합성은 2'-트리이소프로필실일옥시 메틸(TOM) 보호기를 포함하여 달성될 수 있다.
·역 RNA 합성은 2'-t-부틸디티오메틸(DTM) 보호기를 포함하여 달성될 수 있다.
·역 RNA 합성은 2'-데옥시-2'-플루오로-베타-D-아라비노핵산(FANA)을 포함하는 변형된 염기를 포함하여 달성될 수 있다.
·역 RNA 합성은 4'-티오- 2'-데옥시-2'-플루오로-베타-D-아라비노핵산(4'-Thio- FANA)을 포함하는 변형된 염기를 포함하여 달성될 수 있다.
·역 RNA 합성은 2'-O-메틸 변형을 사용하여, 변형된 당을 포함하여 달성될 수 있다.
·역 RNA 합성은 두고리 잠금 핵산(LNA's)을 사용하여 달성될 수 있다.
·역 RNA 합성은 알트리톨 당 변형된 올리고뉴클레오티드(ANA)를 포함하는 변형된 당을 사용할 수 있다.
·역 RNA 합성은 소수성 모이어티 상의 아미다이트 작용기를 통해, 또는 말단 아미노기를 갖는 역 합성된 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 있는 아미노 링커를 통해 RNA의 3'-말단에서 친유성 또는 소수성 기의 접합단계를 포함할 수 있다. 이후 합성은 올리고뉴클레오티드의 3'-말단의 아미노와 친유성 모이어티 상의 카르복시 작용기 사이의 결합단계를 포함한다. 친유성 모이어티는 다양한 글리콜, 예컨대 트리에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 다양한 지질들로 구성된다.
·역 RNA 합성은 상기 펩타이드의 유리 아민 작용기 및 역 합성된 RNA 상의 3'-말단 카르복시 작용기를 사용하여, 펩타이드들, 예컨대 세포침투 펩타이드(CPPs) 또는 막투과 펩타이드(MPPs)의 접합단계를 포함할 수 있다. 적당한 카르복실 작용기를 갖는 CPPs 및 MPPs는 역 합성된 RNA의 3'-말단의 유리 말단 아미노 작용기에 결합될 수 있다.
·역 RNA 합성은 서열의 3'-말단 또는 서열의 5'-말단에서, 서열내 2'-5'-결합된 DNA 유닛들 또는 2'-5'-RNA 유닛들을 포함한다.
당해 분야의 통상의 기술자들은 일상적인 실험만을 사용하여, 본원에 설명된 본 발명의 특정 구현예의 많은 균등물을 인지하거나, 확인할 수 있을 것이다. 상기 균등물들은 하기 청구범위에 의해 포함된다. 종속항에 개시된 구현예의 임의 조합도 또한, 본 발명의 범주내에 있는 것으로 고려될 것이다.
본 발명은 여러 잇점들을 제공한다. 첫째, 역 방향, 즉 5'에서 3' 방향으로의 RNA 합성은 3'에서 5' 방향의 RNA 합성에 존재하는 M+1 불순물이 없는 RNA 올리고뉴클레오티드를 생성하였다. 의도한 수(M)의 모노머에서 합성이 정지하지 않지만, 의도하지 않은 수(M+1)의 모노머에서는 진행할때, M+1 종류가 발생한다. 둘째, 원 RNA 순도 범위는 89% 내지 93%이며, 이는 단계당 약 99.5%의 결합효율을 시사한다. 셋째, 원 RNA의 단일 정제는 95%-98% 순수한 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 넷째, 본 발명은 생체의학 연구의 많은 측면에 유용한 긴 RNA를 합성할 수 있게 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> ChemGenes Corporation
<120> HIGHLY EFFICIENT SYNTHESIS OF LONG RNA USING REVERSE DIRECTION
APPROACH
<130> 12245.1017 US
<140> US15068807
<141> 2016-03-14
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Completely Synthesized
<400> 1
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 100
<210> 2
<211> 150
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Completely Synthesized
<400> 2
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 150
<210> 3
<211> 200
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Completely Synthesized
<400> 3
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 200
<210> 4
<211> 31
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Completely Synthesized
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(15)
<223> At position 15, modified base um
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(21)
<223> At position 21, modified base um
<220>
<221> modified_base
<222> (31)..(31)
<223> At position 31, modified base um
<400> 4
acgggaagag ggaaugaggg uacgagggcg u 31
<210> 5
<211> 43
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Completely Synthesized
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(16)
<223> Modified base at position 16 is um
<220>
<221> modified_base
<222> (17)..(19)
<223> Modified base at positions 17 through 19 is gm
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(20)
<223> Modified base at position 20 is cm
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(21)
<223> Modified base at position 21 is 2'-O-methyladenosine
<220>
<221> modified_base
<222> (22)..(23)
<223> Modified base at positions 22 through 23 is cm
<220>
<221> modified_base
<222> (31)..(33)
<223> Modified base at positions 31 through 33 is gm
<220>
<221> modified_base
<222> (34)..(34)
<223> Modified base at position 34 is cm
<220>
<221> modified_base
<222> (35)..(35)
<223> Modified base at position 35 is 2'-O-methyladenosine
<220>
<221> modified_base
<222> (36)..(37)
<223> Modified base at positions 36 through 37 is cm
<220>
<221> modified_base
<222> (38)..(38)
<223> Modified base at position 38 is 2'-O-methyladenosine
<400> 5
ggcccauccg uggagugggc acccccaggg gggcaccacg guc 43
<210> 6
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Completely Synthesized
<400> 6
uccucuguag uucagucggu agaacggcgg acuuucaauc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag gagc 74
<210> 7
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Completely Synthesized
<400> 7
gcccggauag cucagucggu agagcaucag acuuuuuauc ugagggucca ggguucaagu 60
cccuguucgg gcgcca 76
Claims (13)
- 하기 구조식의 RNA 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법:
(상기 식중,
B는 아데닌, 시토신, 구아노신, 우라실, 이노신, 5-메틸-시토신, 5-메틸-우라실, 5-플루로-우라실, 7-데아자-아데닌, 5-플루로-시토신, 9-(N6-벤조일아데니닐)-, 9-(N6-아세틸아데니닐)-, 9-(N6-tert-부틸 페녹시아세틸아데니닐)-, 9-(N6-페녹시아세틸아데니닐)-, 9-(N6-이소프로필 페녹시아세틸아데니닐)-, 1-(N6-(N,N-디메틸포름아미디닐)아데니닐), 1-(N4-벤조일시토시닐)-, 1-(N4-아세틸시토시닐)-, 1-(N4-(N,N-디메틸포름아미디닐)시토시닐)-, 1-(N4-페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-tert-부틸페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-이소프로필 페녹시아세틸시토시닐)-, 9-(N2-이소부틸구아니닐)-, 9-(N2-tert 부틸 페녹시아세틸구아니닐)-, 9-(N2-이소프로필 페녹시아세틸구아니닐)-, 1-(N4-페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-tert 부틸 페녹시아세틸시토시닐)-, 1-(N4-이소프로필 페녹시아세틸시토시닐)-, 1-우라실일-,
1-(N4-벤조일-5-메틸시토시닐)-, 1-(N4-(N,N-디메틸포름아미디닐)-5-메틸시토시닐)-, 1-(N4-아세틸-5-메틸시토시닐)-, 1-(5-메틸-우라실일)-, 1-(5-플루오로-우라실일)-, 1-(N4-벤조일-5-플루오로시토시닐)-, 9-(N6-벤조일-7-디아자아데니닐)-, 9-(N6-(N,N-디메틸포름아미디닐)-7-디아자아데닐)-, 9-(N2-이소부틸-7-디아자구아니닐)-, 및 9-(N2-(N,N-디메틸포름아미디닐)-7-디아자구아니닐)-으로 구성된 그룹으로부터 선택된 일원이며;
n은 100 내지 200의 정수이며;
L은 링커 또는 스페이서를 갖는 콜레스테롤, 비오틴, 에틸렌글리콜, 글리세롤, 폴리에틸렌글리콜, 헥사에틸렌글리콜, 아미노 링커, 디설파이드 링커, 펩타이드 링커, 폴리펩타이드 링커, 단백질, 플루로포어(flurophore), 퀸처(quencher) 염료, 하나 또는 그 이상의 2',5'-연결된 데옥시뉴클레오시드 유닛, 하나 또는 그 이상의 2',5'-연결된 리보뉴클레오시드 유닛, 및 하나 또는 그 이상의 2',5'-연결된 데옥시리보스 유닛으로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오시드, 비-뉴클레오시드 리간드이며,
L은 중재 포스페이트를 통해 RNA 뉴클레오티드의 3'-말단에 부착된다), 및
RNA 뉴클레오티드의 5'-말단으로부터 3'-말단까지의 방향으로 RNA 올리고뉴클레오티드가 합성되는 방법은:
(a)화학식 2로 표시되는 뉴클레오시드 고체 지지체를 취하는 단계:
[화학식 2]
(상기 화학식 2에서,
M은 수소 또는 링커이며;
M이 링커인 경우, 그것은 구조식 Y-C(O)에 의해 나타내며, 및 올리고뉴클레오타이드 합성에 적당한 고체 지지체에 선택적으로 연결되며,
상기 Y는 2개의 탄소들과 20개의 탄소들 사이의 길이를 갖는 탄화수소 모이어티이며, 및 Y는 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 및 아랄킬로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 및 탄화수소 모이어티는 선택적으로, 중재 -O-, -S-, -S(O)2- -C(O)- 및 -NR6-(여기에서, R6은 수소, 또는 치환된 C1 내지 C20 알킬 또는 치환된 아랄킬임)을 포함하며;
W는 산소이며, R은 tert 부틸 디메틸 실일(TBDMS) 또는 트리이소프로필실일 옥시메틸렌(TOM)이고;
Z는 디메톡시 트리페닐(DMT), 모노메톡시 트리페닐(MMT) 및 트리메톡시 트리페닐(TMT)로 구성된 보호기이다);
(b)올리고뉴클레오티드 신시사이저(synthesizer) 상에 화학식 1의 포스포라미다이트를 놓는 단계;
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
Y는 산소 원자 또는 황 원자이며;
W는 산소이며; R4는 tert 부틸 디메틸 실일(TBDMS) 또는 트리이소프로필실일 옥시메틸렌(TOM)이고;
Z는 디메톡시 트리페닐(DMT), 모노메톡시 트리페닐(MMT) 및 트리메톡시 트리페닐(TMT)로 구성된 보호기이며;
R1은 알킬 또는 아릴이며;
R2는 알킬 또는 아릴이며; 및
R3은 시아노에틸, 알킬 또는 아릴이며,
B는 수소, 또는 각 1차 아민에서 아민 보호기에 의해 선택적으로 관능화된 뉴클레오염기이다);
(c)화학식 2의 뉴클레오시드 고체 지지체로부터 보호기 Z를 제거하는 단계;
(d)보조제들의 혼합물을 사용하여, 화학식 2의 뉴클레오시드 및 화학식 1의 포스포라미다이트를 올리고뉴클레오티드 신시사이저내에서 결합시켜서, RNA 합성과정을 수행하여, 적어도 하나의 보호기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 얻는 단계;
(e)L 기를 갖는 포스포라미다이트를 제공하는 단계;
(f)올리고뉴클레오티드의 말단에서 L 기를 갖는 포스포라미다이트를 가하여, L 기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 얻는 단계;
(g)L 기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체로부터 분리하는 단계;
(h)올리고뉴클레오티드로부터 적어도 하나의 보호기를 제거하는 단계;
(i)실일 보호기를 제거하여, 올리고뉴클레오티드를 얻는 단계;
(j)올리고뉴클레오티드를 침전(precipitation)시키는 단계; 및
(k)순도 측정을 위해 올리고뉴클레오티드를 분석하는 단계를 포함하며,
단계 (d)에서 보조제들의 혼합물은 페녹시 아세트산 무수물/테트라히드로푸란/피리딘, 10% N-메틸이미다졸/테트라히드로푸란, 톨루엔내 3% TCA, 0.05M 요오드/피리딘/물/테트라히드로푸란 및 아세토니트릴내 0.35M의 5-에틸티오-1-H-테트라졸로 이루어진 것인, 방법. - 제1항에 있어서,
L은 링커 또는 스페이서를 갖는 콜레스테롤이며, n이 100 내지 200의 정수인, 방법. - 제1항에 있어서,
L은 폴리에틸렌글리콜(PEG)이며, n은 100 내지 200의 정수인, 방법. - 삭제
- 제1항에 따른 역 RNA 합성 방법론을 사용한, 100-200-mer 장쇄 RNA의 RNA 합성 방법.
- 제1항에 따른 방법을 포함하는 장쇄 RNA 키메라(chimera) 합성 방법으로서,
장쇄 RNA 키메라는 데옥시, 백본-변형된 염기, 변형된 DNA 또는 변형된 RNA 염기를 추가로 포함하는, 장쇄 RNA 키메라 합성 방법. - 제1항에 있어서,
RNA 올리고뉴클레오티드는 말단, 분지점, 또는 RNA 올리고뉴클레오티드 사슬 내에 하나 또는 그 이상의 5',2',2',3' 결합을 추가로 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
RNA 뉴클레오티드는 천연 및 변형된 뉴클레오시드, 무염기 부위, 역 무염기 부위, 발색단 또는 리간드를 추가로 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
RNA 올리고뉴클레오티디는 발색단, 리간드, 모노포스페이트 기, 디포스페이트 기 또는 트리포스페이트 기를 추가로 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
RNA 올리고뉴클레오티디는 하나 또는 그 이상의 데옥시, 변형된 데옥시 또는 변형된 리보뉴클레오시드를 갖는 분지점을 추가로 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
HPLC 겔 전기영동법 또는 RNA 정제 기술을 사용하여 RNA 올리고뉴클레오티드를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
RNA 올리고뉴클레오티드 표면에 라벨링 및 부착하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
분자생물학 연구 및 개발에서 RNA 올리고뉴클레오티드를 사용하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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