JP5529142B2 - 血清アミロイドａ遺伝子の発現を阻害するための脂質製剤組成物および方法 - Google Patents

血清アミロイドａ遺伝子の発現を阻害するための脂質製剤組成物および方法 Download PDF

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Description

本発明は、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）遺伝子を標的とする脂質製剤化二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、およびＳＡＡの発現を阻害するためにｄｓＲＮＡを使用する方法に関する。
血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）は、外傷、炎症、および腫瘍を含む様々な損傷に反応して最高１０００倍まで血中濃度が上昇する、１０４アミノ酸のＨＤＬ随伴アポリポタンパク質である。ＳＡＡタンパク質は、コレステロール代謝および輸送、リンパ球および内皮細胞増殖の阻害、マトリックスメタロプロテアーゼの誘導、抗炎症性活性と炎症性活性の双方による炎症反応の調節に関与する。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＴＮＦα等の炎症性サイトカインは、炎症を誘発し、ＳＡＡ１およびＳＡＡ２を含む、急性期タンパク質の産生を刺激する。
肝臓は、ＳＡＡの発現の主要部位であり、肝外のＳＡＡの発現はまた、ヒトアテローム性動脈硬化症において、アルツハイマー病患者の脳において、および関節リウマチ患者の滑膜組織においても記載されている。ＳＡＡレベルはまた、広範の悪性腫瘍を有する患者の血清中で上昇し、未知の原発部位の転移性癌に罹患した患者において最も高いことが見出されている。ＳＡＡのｍＲＮＡおよびタンパク質はまた、ヒト結腸癌組織および上皮性腫瘍で局所的に発現されることが見出されている。
全て染色体１１ｐにマップされた、４つのＳＡＡ遺伝子座が記載されている。遺伝子座のうちの２つ（ＳＡＡ１およびＳＡＡ２）は、急性期ＳＡＡ（Ａ−ＳＡＡ）をコードし、炎症性刺激に反応して、血清濃度の劇的な過度の増加を示し、第３の遺伝子座（ＳＡＡ３）は、偽遺伝子を定義し、第４の遺伝子座（ＳＡＡ４）は、構成的に発現するＳＡＡ（Ｃ−ＳＡＡ）をコードし、それは炎症性刺激に適度にのみ反応する。ＳＡＡ３は、マウスおよび他の哺乳動物種に発現するが、ヒトでは発現しない。ＳＡＡ１およびＳＡＡ２は、それらのコードおよび非コード領域の両方で９５％相同的であり、炎症に反応して協調的に誘発される。Ａ−ＳＡＡは、続発性アミロイドーシス（ＡＡアミロイドーシス、または反応性アミロイドーシスとも称される）において、主要臓器に蓄積される不溶性切断産物の循環する前駆体であり、関節リウマチおよびハンセン病等の慢性または一過性炎症疾患の偶発的結果である進行性かつ致命的な疾病である。
二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる、高度に保存された調節機序で遺伝子発現を遮断することが示されている。国際公開ＷＯ第９９／３２６１９号（Ｆｉｒｅら）は、線虫の遺伝子の発現を阻害するための、少なくとも２５ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡの使用を開示している。また、ｄｓＲＮＡは、植物（例えば、国際公開ＷＯ第９９／５３０５０号、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、および国際公開ＷＯ第９９／６１６３１号、Ｈｅｉｆｅｔｚらを参照）、ショウジョウバエ（例えば、Ｙａｎｇ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（２０００）１０：１１９１−１２００を参照）、ならびに哺乳動物（国際公開ＷＯ第００／４４８９５号、Ｌｉｍｍｅｒ、および独国特許ＤＥ第１０１ ００ ５８６．５号、Ｋｒｅｕｔｚｅｒらを参照）を含む、他の生物の標的ＲＮＡを分解することが示されている。
本発明は、細胞または哺乳動物等において、ＳＡＡ１およびＳＡＡ２のうちの１つまたは両方のＳＡＡ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含有する組成物および方法を提供する。本発明はまた、ＳＡＡ遺伝子の発現によって引き起こされる、アミロイドーシス等の病態および疾患を治療するための、組成物および方法も提供する。
本明細書で取り上げられる組成物に含まれるｄｓＲＮＡは、３０ヌクレオチド長未満、一般に１９〜２４ヌクレオチド長であり、ＳＡＡ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を有するｄｓＲＮＡを含む。
一実施形態において、ＳＡＡ遺伝子の発現を阻害するためのｄｓＲＮＡは、互いに相補的である少なくとも２本の鎖を含む。このｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。アンチセンス鎖は、ＳＡＡをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、相補性の領域は、３０ヌクレオチド長未満で、少なくとも１５ヌクレオチド長である。一般に、ｄｓＲＮＡは、１９〜２４、例えば、１９〜２１ヌクレオチド長である。ｄｓＲＮＡは、ＳＡＡを発現する細胞と接触すると、本明細書に記載される方法によってアッセイされる場合等、ＳＡＡ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する。
例えば、本明細書で取り上げられるｄｓＲＮＡ分子は、表２のセンス配列からなる群から選択されるセンス鎖と、表２のアンチセンス配列からなる群から選択されるアンチセンス鎖とを含むことができる。本明細書で取り上げられるｄｓＲＮＡ分子は、天然に存在するヌクレオチドを含むことができるか、または２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、およびコレステリル誘導体に結合した末端ヌクレオチド等の少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含むことができる。代替として、該修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基からなる群から選択され得る。一般に、このような修飾配列は、表２のセンス配列からなる群から選択される該ｄｓＲＮＡの第１の配列および表２のアンチセンス配列からなる群から選択される第２の配列に基づく。
１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、表２から選択されるセンス鎖配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むセンス鎖を含むことができる。１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、表２から選択されるアンチセンス配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含むことができる。
一実施形態において、該センス鎖は、配列番号３７、配列番号１２７、配列番号９５、配列番号１０５、配列番号５９、配列番号２３、配列番号１５５、配列番号１９３、配列番号２８３、配列番号２５１、配列番号２６１、配列番号２１５、配列番号１７９、または配列番号３１１のヌクレオチド配列の１５個以上の連続するヌクレオチドを含むことができる。１つの実施形態において、該アンチセンス鎖は、配列番号３８、配列番号１２８、配列番号９６、配列番号１０６、配列番号６０、配列番号２４、配列番号１５６、配列番号１９４、配列番号２８４、配列番号２５２、配列番号２６２、配列番号２１６、配列番号１８０、または配列番号３１２のヌクレオチド配列の１５個以上の連続するヌクレオチドを含むことができる。別の実施形態において、該センス鎖は、配列番号３７、配列番号１２７、配列番号９５、配列番号１０５、配列番号５９、配列番号２３、配列番号１５５、配列番号１９３、配列番号２８３、配列番号２５１、配列番号２６１、配列番号２１５、配列番号１７９、または配列番号３１１からなり得、該アンチセンス鎖は、配列番号３８、配列番号１２８、配列番号９６、配列番号１０６、配列番号６０、配列番号２４、配列番号１５６、配列番号１９４、配列番号２８４、配列番号２５２、配列番号２６２、配列番号２１６、配列番号１８０、または配列番号３１２からなり得る。１つの実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、１８３９７、１８３７９、１８４４５、１８４２０、１８４１５、１８４３１、または１８３２６である。１つの実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、配列番号１９３、配列番号２８３、配列番号２５１、配列番号２６１、配列番号２１５、配列番号１７９、または配列番号３１１を標的とする。
１つの実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、リガンドに結合する。１つの実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、脂質製剤に製剤化される。１つの実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、ＬＮＰ製剤、ＬＮＰ０１製剤、ＬＩＰＩＤ Ａ−ＳＮＡＬＰ製剤、またはＳＮＡＬＰ製剤に製剤化される。
１つの実施形態において、細胞への該ｄｓＲＮＡの投与は、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定される、ＳＡＡのｍＲＮＡ発現の約９７％、９５％、９２％、８９％、または７４％の阻害をもたらす。１つの実施形態において、細胞への該ｄｓＲＮＡの投与は、分岐ＤＮＡアッセイによって測定される、ＳＡＡのｍＲＮＡ発現の約８９％、８７％、８３％、６８％、または５４％の阻害をもたらす。１つの実施形態において、細胞への該ｄｓＲＮＡの投与は、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定される、ＳＡＡタンパク質の発現の約１００％、９９％、または９３％の阻害をもたらす。１つの実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、１０ｐＭ未満のＩＣ５０を有する。１つの実施形態において、該ｄｓＲＮＡの投与は、ｓｉＲＮＡ対照と比較して、マウスにおいて、ＳＡＡタンパク質の発現を約８０％低減する。
１つの実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、オーバーハングを含む。１つの実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、ｄＴｄＴオーバーハングを含む。１つの実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、該センス鎖および該アンチセンス鎖の３’末端に２つのｄＴｄＴオーバーハングを含む。
１つの実施形態において、該センス鎖は、２１ヌクレオチド長である。１つの実施形態において、該アンチセンス鎖は、２１ヌクレオチド長である。１つの実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、１つもしくは複数の２’−Ｏ−メチルシチジン−５’−リン酸塩および／または１つもしくは複数の２’−Ｏ−メチルウリジン−５’−リン酸塩を含む。
別の実施形態において、本発明は、本発明で取り上げられる少なくとも１個のｄｓＲＮＡを含有する細胞を提供する。該細胞は、一般に、ヒト細胞等の哺乳動物細胞である。
別の実施形態において、本発明は、生物、一般に、ヒト対象における、ＳＡＡ遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。該組成物は、典型的には、本明細書に記載のｄｓＲＮＡおよび医薬上許容される担体つまり送達媒体のうちの１つもしくは複数を含む。一実施形態において、該組成物は、アミロイドーシス、例えば、ＡＡ（続発性または反応性）アミロイドーシスを治療するために使用される。
別の実施形態において、該医薬組成物は、例えば、４週間に１回以下、３週間に１回以下、２週間に１回以下、１週間に１回以下、本明細書に記載される投薬レジメンの投与のために製剤化される。別の実施形態において、該医薬組成物は、１ヶ月間もしくはそれ以上長く、例えば、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、または６ヶ月間、または１年間もしくはそれ以上長く、維持され得る。
別の実施形態において、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡ、すなわち、ＳＡＡを標的とするｄｓＲＮＡを含有する組成物は、アミロイドーシス、またはアミロイドーシスの症状を治療するために知られている薬剤等の非ｄｓＲＮＡ治療薬と共に投与される。例えば、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、慢性炎症性関節炎等の炎症性疾患の治療のための薬剤および腎機能障害の治療のための薬剤と共に投与される。慢性炎症性関節炎の治療のための例示的な薬剤には、アナキンラ、トシリズマブ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、エタネルセプト、インフリキシマブ、アドリムマブ、セルトリズマブ、リツキサン、リツキシマブ、クロラムブシル、およびエプロディセート（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、Ｃａｎａｄａ）等の抗サイトカイン生物製剤が挙げられる。腎機能障害の治療のための例示的な薬剤には、例えば、利尿薬、ＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）阻害剤、ＡＲＢ（アンジオテンシン受容体遮断薬）、末期腎不全（ＥＳＲＤ）の透析、および腎移植が挙げられる。
別の実施形態において、ＳＡＡのｄｓＲＮＡが患者に投与され、次いで、非ｄｓＲＮＡ剤が該患者に投与される（またはその逆）。別の実施形態において、ＳＡＡのｄｓＲＮＡおよび非ｄｓＲＮＡ治療薬は、同時に投与される。
別の実施形態において、本発明は、以下のステップを行うことによって、細胞内のＳＡＡ遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する：
（ａ）二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を該細胞に導入するステップであって、該ｄｓＲＮＡは、互いに相補的である少なくとも２つの配列を含む。該ｄｓＲＮＡは、第１の配列を有するセンス鎖と、第２の配列を有するアンチセンス鎖とを有し、該アンチセンス鎖は、ＳＡＡをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補性の領域を有し、該相補性の領域は、３０ヌクレオチド長未満、一般に、１９〜２４ヌクレオチド長であり、該ｄｓＲＮＡは、ＳＡＡを発現する細胞と接触すると、ＳＡＡ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する、ステップと、
（ｂ）ＳＡＡ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るために十分な時間、ステップ（ａ）において産生された該細胞を維持し、それによって、該細胞内の該ＳＡＡ遺伝子の発現を阻害する、ステップ。
別の実施形態において、該方法は、腫瘍細胞内の遺伝子発現を阻害するためのものである。
別の実施形態において、本発明は、アミロイドーシス、例えば、ＡＡアミロイドーシス等のＳＡＡの発現によって媒介された病理過程を治療、阻止、または管理するための方法を提供する。一実施形態において、該方法は、本発明で取り上げられる、治療上または予防上有効な量の１つもしくは複数のｄｓＲＮＡを、かかる治療、阻止、または管理を必要とする患者に投与することを含む。一実施形態において、該患者は、アミロイドーシスを有する。別の実施形態において、ＳＡＡを標的とする該ｄｓＲＮＡの投与は、患者における、ＳＡＡ媒介性障害の少なくとも１つの症状の重症度を緩和または軽減する。一実施形態において、該患者は、乾癬性関節炎、慢性若年性関節炎、強直性脊椎炎、ベーチェット症候群、ライター症候群、成人スティル病、炎症性腸疾患、遺伝性周期性発熱、結核、骨髄炎、気管支拡張症、ハンセン病、腎盂腎炎、褥瘡性潰瘍、ウィップル病、集簇性座瘡、一般変異型免疫不全症、低／無ガンマグロブリン血症、嚢胞性線維症、肝臓癌、腎臓癌、キャッスルマン病、ホジキン病、成人有毛細胞白血病、ワルデンストレーム病、腫瘍、慢性感染症、慢性炎症性疾患、慢性関節炎、慢性敗血症、周期性発熱症候群、家族性地中海熱、またはクローン病を有する。
別の実施形態において、本発明は、細胞内のＳＡＡ遺伝子の発現を阻害するためのベクターを提供する。一実施形態において、該ベクターは、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡの少なくとも１本の鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する少なくとも１つの調節配列を含む。
別の実施形態において、本発明は、細胞内のＳＡＡ遺伝子の発現を阻害するためのベクターを含有する細胞を提供する。該ベクターは、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡのうちの１つの少なくとも１本の鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する調節配列を含む。
さらなる実施形態において、本発明は、ＳＡＡのｄｓＲＮＡを含有し、病理的疾患に関与する第２の遺伝子を標的とする第２のｄｓＲＮＡと組み合わせて、疾患、例えば、アミロイドーシスを治療するために有用である、組成物を提供する。
本発明の１つもしくは複数の実施形態の詳細は、以下の添付図面および説明に記載される。本発明の他の特性、目的、利点は、説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
図１Ａおよび１Ｂは、ＨｅｐＢ３細胞培養内のＳＡＡのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルに対するＩＬ−１βおよびＩＬ−６サイトカインの効果を示すグラフである。 図２は、候補ＳＡＡのｓｉＲＮＡの投与後のＨｅｐ３Ｂ細胞内のＳＡＡのｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。 図３は、候補ＳＡＡのｓｉＲＮＡの投与後のＨｅｐ３Ｂ細胞内のＳＡＡのタンパク質レベルを示す棒グラフである。 図４Ａ〜４Ｇは、選択したＳＡＡのｓｉＲＮＡの用量反応曲線を示すグラフである。 図５は、ＬＰＳ注射前のＳＡＡレベルと比較して、ＬＰＳ注射から２４時間後に試験した全てのマウスにおいてＳＡＡレベルが増加したことを示すグラフである。 図６は、ＬＮＰ０１に製剤化した１８４４５およびＳＮＡＬＰに製剤化した１８４４５は、対照と比較して、ＳＡＡレベルが有意に下方調節されたことを示すグラフである。 図７は、ｈＳＡＡ１の発現が、ｈＳＡＡ１アデノウイルスの単回注射から約２週間、持続することができることを示すグラフである。 図８は、肝細胞内のｈＳＡＡ１の発現のコンストラクトを示す図である。 図９は、流体力学的注射後のマウスにおけるｈＳＡＡ１の発現を示すグラフである。 図１０は、ｈＳＡＡ１導入遺伝子発現のために設計されたコンストラクトを示す図である。
本発明は、ｄｓＲＮＡ、およびｄｓＲＮＡがＳＡＡ遺伝子を標的とする細胞または哺乳動物における、ＳＡＡ遺伝子の発現を阻害するためのｄｓＲＮＡを使用する方法を提供する。幾つかの実施形態において、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、ＳＡＡ１遺伝子およびＳＡＡ２遺伝子の両方を標的とする。本発明はまた、ＳＡＡ遺伝子の発現によって引き起こされる、哺乳動物における、アミロイドーシス等の病態および疾患を治療するための、組成物および方法も提供する。ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる過程を通じてｍＲＮＡの配列に特異的な分解を導く。
本明細書で取り上げられる組成物のｄｓＲＮＡは、３０ヌクレオチド長未満、一般に、１９〜２４ヌクレオチド長である、領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、ＳＡＡ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である。これらのｄｓＲＮＡの使用は、哺乳動物における、炎症反応（例えば、急性期炎症反応）に関連する病理学に関係している遺伝子のｍＲＮＡの標的化分解を可能にする。特に、ＳＡＡのｄｓＲＮＡの非常に低い投薬量は、特異的かつ効率的にＲＮＡｉを媒介することができ、ＳＡＡ遺伝子の発現の著しい阻害をもたらす。細胞に基づくアッセイを用いて、本発明者は、ＳＡＡを標的とするｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉを特異的かつ効率的に媒介することができ、ＳＡＡ遺伝子の発現の著しい阻害をもたらすことを実証した。したがって、これらのｄｓＲＮＡを含む方法および組成物は、アミロイドーシスの治療等において、ＳＡＡを下方調節することによって媒介され得る病理過程を治療するのに有用である。
該組成物のｄｓＲＮＡは、表２から選択されるセンス鎖配列の少なくとも１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、またはそれ以上のヌクレオチドを含むセンス鎖を含むことができる。該組成物のｄｓＲＮＡは、表２から選択されるセンス鎖配列の少なくとも１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、またはそれ以上のヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含むことができる。１つの実施形態において、該センス鎖は、配列番号３７、配列番号１２７、配列番号９５、配列番号１０５、配列番号５９、配列番号２３、または配列番号１５５の１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含むことができる。１つの実施形態において、該アンチセンス鎖は、配列番号３８、配列番号１２８、配列番号９６、配列番号１０６、配列番号６０、配列番号２４、または配列番号１５６の１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含むことができる。
該組成物のｄｓＲＮＡは、ＳＡＡのｍＲＮＡ、配列番号２８６、配列番号２２０、配列番号２３０、配列番号３２４、配列番号２２３、配列番号３８６、および／または配列番号３７３の１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを標的とすることができる。
該ｄｓＲＮＡは、リガンドに結合され得る。該ｄｓＲＮＡは、脂質製剤に製剤化され得る。１つの実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、ＬＮＰ製剤、ＬＮＰＯｌ製剤、脂質Ａ−ＳＮＡＬＰ製剤またはＳＮＡＬＰ製剤に製剤化される。
該組成物のｄｓＲＮＡは、細胞に投与される場合、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定される、ＳＡＡのｍＲＮＡ発現の約５０〜１００％、９７％、９５％、９２％、８９％、または７４％の阻害をもたらし得る。該組成物のｄｓＲＮＡは、細胞に投与される場合、分岐ＤＮＡアッセイによって測定される、ＳＡＡのｍＲＮＡ発現の約５０〜１００％、８９％、８７％、８３％、６８％、または５４％の阻害をもたらし得る。該組成物のｄｓＲＮＡは、細胞に投与される場合、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定される、ＳＡＡタンパク質の発現の約５０〜１００％、１００％、９９％、または９３％の阻害をもたらし得る。該組成物のｄｓＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ｐＭ未満のＩＣ５０を有する。該組成物のｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ対照と比較して、マウスにおけるＳＡＡタンパク質の発現を約４０、５０、６０、７０、８０、または９０％軽減することができる。
ＳＡＡのｄｓＲＮＡを含有する方法および組成物は、アミロイドーシス等の炎症関連疾患等のＳＡＡの発現によって媒介される病理過程を治療するために有用である。他の病理過程は、乾癬性関節炎、慢性若年性関節炎、強直性脊椎炎、ベーチェット症候群、ライター症候群、成人スティル病、炎症性腸疾患、遺伝性周期性発熱、結核、骨髄炎、気管支拡張症、ハンセン病、腎盂腎炎、褥瘡性潰瘍、ウィップル病、集簇性座瘡、一般変異型免疫不全症 低／無ガンマグロブリン血症、嚢胞性線維症、肝臓癌、腎臓癌、キャッスルマン病、ホジキン病、成人有毛細胞白血病、ワルデンストレーム病、腫瘍、慢性感染症、慢性炎症性疾患、慢性関節炎、慢性敗血症、周期性発熱症候群、家族性地中海熱、またはクローン病を含むことができる。
以下の詳細な説明は、ＳＡＡ遺伝子の発現を阻害するための、ｄｓＲＮＡを含有する組成物の作製方法および使用方法、ならびにこれらの遺伝子の発現によって引き起こされる疾患および障害を治療するための、組成物および方法を開示する。本発明で取り上げられる医薬組成物は、医薬上許容される担体と共に、３０ヌクレオチド長未満、一般に１９〜２４ヌクレオチド長であり、ＳＡＡ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である、相補性の領域を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡを含む。また、本発明で取り上げられる医薬組成物は、３０ヌクレオチド長未満、一般に１９〜２４ヌクレオチド長であり、ＳＡＡ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である、相補性の領域を有するアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡも含む。
したがって、幾つかの態様において、ＳＡＡのｄｓＲＮＡおよび医薬上許容される担体を含有する医薬組成物、ＳＡＡ遺伝子の発現を阻害するために組成物を使用する方法、ＳＡＡ遺伝子の発現によって引き起こされる疾患を治療するための医薬組成物を使用する方法が、本発明で取り上げられる。
Ｉ．定義
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される、特定の用語および語句の意味を以下に提供する。本明細書の他の部分の用語の用法と、本項で提供されるその定義との間に明らかな相違がある場合、本項の定義が優先される。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、および「Ｕ」のそれぞれは、一般に、塩基としてそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを含有するヌクレオチドを表す。「Ｔ」および「ｄＴ」は、本明細書で交換可能に使用され、核酸塩基がチミン、例えば、デオキシリボチミン（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｔｈｙｍｉｎｅ）である、デオキシリボヌクレオチドを指す。しかしながら、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」または「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、以下でさらに詳述する修飾ヌクレオチド、または代替の置換部分も指すことができることが理解されよう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルが、かかる置換部分を担持するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成性を実質的に変化させることなく、他の部分によって置換可能であることを十分認識している。例えば、限定されないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対を形成することができる。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドと置換され得る。かかる置換部分を含む配列が、本発明の実施形態である。
本明細書で使用される、「血清アミロイドＡ」（「ＳＡＡ」）とは、細胞内のＳＡＡ１またはＳＡＡ２遺伝子（例えば、内因性ＳＡＡ１またはＳＡＡ２遺伝子）を指す。ＳＡＡ１は、血清アミロイドＡ１、ＭＧＣ１１１２１６、ＰＩＧ４、ＳＡＡ、および腫瘍タンパク質ｐ５３誘導タンパク質４（ＴＰ５３Ｉ４）としても知られている。２つの代替的なヒトＳＡＡ１のｍＲＮＡ転写物の配列は、ＮＭ＿０００３３１．３およびＮＭ＿１９９１６１．２で見出され得る。マウスＳＡＡ１のｍＲＮＡの配列は、ＮＭ＿００９１１７．３で見出され得る。カニクイザルからの完全長に近い、単一のＳＡＡ様トレースｃＤＮＡ配列は、Ｍｆａ＃Ｓ２７７９５０７６（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））である。
ＳＡＡ２は、血清アミロイドＡ２およびＳＡＡとしても知られている。２つの代替的なヒトＳＡＡ２のｍＲＮＡ転写物の配列は、ＮＭ＿００１１２７３８０．１およびＮＭ＿０３０７５４．３で見出され得る。マウスＳＡＡ２のｍＲＮＡの配列は、ＮＭ＿０１１３１４．１である。
本明細書で使用される、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、ＳＡＡ遺伝子の転写の間に形成される、ｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する部分を指す。該標的配列は、ｄｓＲＮＡアンチセンス配列に相補的であり、故に、センス鎖内に存在する任意のオーバーハングを差し引いた、ｄｓＲＮＡセンス配列と同一の配列を有する。
本明細書で使用される、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチド命名法の使用に言及される配列によって説明される、ヌクレオチド鎖を含む、オリゴヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される場合、別途記載のない限り、第２のヌクレオチド配列に関連して第１のヌクレオチド配列を説明するために使用される時の「相補的」という用語は、当業者には理解されるように、特定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドとハイブリダイズして二重鎖構造を形成する、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの能力を指す。かかる条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得、ストリンジェントな条件には、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１２〜１６時間５０℃もしくは７０℃、その後の洗浄が含まれ得る。生物内で遭遇され得る、生理的に適切な条件等の他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に応じて、２つの配列の相補性の試験に最も適切な、一連の条件を決定することができよう。
これには、第１および第２のヌクレオチド配列の全長にわたる、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドに対する、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの塩基対形成が含まれる。かかる配列は、本明細書において、互いの配列に対して「完全に相補的」と呼ぶことができる。しかし、本明細書において、第１の配列が第２の配列に対して「実質的に相補的」であると呼ばれる場合、２つの配列は完全に相補的であり得るか、あるいはそれらの最終的な用途に最も適した条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、ハイブリダイズ時に、１個もしくは複数個であるが、一般に４、３、または２個を超えないミスマッチ塩基対を形成してもよい。しかし、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズ時に１つもしくは複数の単鎖のオーバーハングを形成するように設計される場合、かかるオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチとはみなされないものとする。例えば、２１ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡ（より長いオリゴヌクレオチドが、より短いオリゴヌクレオチドに完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含む）は、本明細書に記載の目的上、やはり「完全に相補的」であると称され得る。
また、本明細書で使用される、「相補的」な配列は、それらのハイブリダイズ能に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソンクリック塩基対、および／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含み得るか、または完全にそれらから形成され得る。かかる非ワトソンクリック塩基対には、Ｇ−Ｕゆらぎまたはフーグスティーン型塩基対が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書における「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、これらが使用される文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基一致に対して使用され得る。
本明細書で使用される、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に実質的に相補的」であるポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、または３’ＵＴＲを含む、対象となるｍＲＮＡ（例えば、ＳＡＡ１またはＳＡＡ２等のＳＡＡをコードするｍＲＮＡ）の連続する部分に実質的に相補的である、ポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列が、ＳＡＡをコードするｍＲＮＡの中断されていない部分に実質的に相補的である場合、ＳＡＡのｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
本明細書で使用される、「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、逆平行で、上で定義されるように実質的に相補的である、２本の核酸鎖を含む二重鎖構造を有する、リボ核酸分子の複合体を指す。一般に、各鎖のヌクレオチドの大半はリボヌクレオチドであるが、本明細書で詳細に説明されるように、それぞれもしくは両方の鎖は、少なくとも１個の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドも含み得る。加えて、本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡ」は、複数のヌクレオチドでの実質的な修飾を含み、本明細書で開示されるか、または当該技術分野において既知であるあらゆる種類の修飾を含む、リボヌクレオチドへの化学修飾を含み得る。ｓｉＲＮＡ型分子内で使用される、このようなどの修飾も、本明細書および特許請求の範囲の目的上、「ｄｓＲＮＡ」に包含される。
二重鎖構造を形成する２本の鎖は、より長い１つのＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、あるいはそれらは別個のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖がより長い１つの分子の一部であり、したがって二重鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とそれぞれのもう一方の鎖の５’末端との間の中断されていないヌクレオチド鎖によって接続される場合、接続するＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と称される。２本の鎖が、二重鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とそれぞれのもう一方の鎖の５’末端との間の、中断されていないヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合的に接続される場合、該接続構造は、「リンカー」と称される。該ＲＮＡ鎖は、同一または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、二重鎖内に存在するすべてのオーバーハングを差し引いた、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖内のヌクレオチド数である。二重鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つもしくは複数のヌクレオチドのオーバーハングを含み得る。また、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、上に記載の通り、ｄｓＲＮＡを言及するために本明細書に使用される。
本明細書で使用される、「ヌクレオチドのオーバーハング」とは、不対ヌクレオチド、つまりｄｓＲＮＡの１本の鎖の３’末端がもう一方の鎖の５’末端を越えて延びるか、またはその逆である時に、ｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突出するヌクレオチドを指す。「平滑」または「平滑末端」は、ｄｓＲＮＡのその末端に不対ヌクレオチドがない、すなわち、ヌクレオチドのオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端の」ｄｓＲＮＡは、その長さ全体にわたって二本鎖であるｄｓＲＮＡであり、すなわち、該分子のどちらの末端にもヌクレオチドのオーバーハングがない。１つの実施形態において、表２の欄「化学反応のない配列（５’−３’）」に示される配列（ＳＡＡのｓｉＲＮＡ、以下）は、１つもしくは複数のヌクレオチドからなる１つもしくは複数のオーバーハングを含むことができる。一態様において、該オーバーハングは、配列ＮＮを含む２つのヌクレオチド３’オーバーハングであり、ＮＮは、任意のヌクレオチド、例えば、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｔであり得る。１つの実施形態において、該オーバーハングは、オーバーハング上に１つもしくは複数のホスホロチオエートを含み得、例えば、該オーバーハングの末端３’ｄＴは、ホスホロチオエートを有し得る。１つの実施形態において該オーバーハングは、ｄＴｓｄＴである。
「アンチセンス鎖」という用語は、標的配列に実質的に相補的である領域を含む、ｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書で使用される、「相補性の領域」という用語は、配列、例えば本明細書において定義される標的配列に実質的に相補的である、アンチセンス鎖の領域を指す。相補性の領域が標的配列に完全に相補的ではない場合、該ミスマッチは、該末端領域内に最も許容され、存在する場合、一般に、末端領域内、例えば、５’および／または３’末端の６、５、４、３、もしくは２ヌクレオチド以内にある。
本明細書で使用される、「センス鎖」という用語は、アンチセンス鎖の領域に実質的に相補的である領域を含む、ｄｓＲＮＡの鎖を指す。
ｄｓＲＮＡについて言及する際、「細胞への導入」とは、当業者には理解されるように、細胞への取り込みまたは吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取り込みは、支援を伴わない（ｕｎａｉｄｅｄ）拡散過程もしくは細胞の能動的過程を通じて、または補助的な薬剤もしくは装置によって発生し得る。この用語の意味は、インビトロでの細胞に限定されず、ｄｓＲＮＡは、生命体の一部である「細胞に導入」することもできる。そのような場合、細胞への導入は、該生物への送達を含む。例えば、インビボ送達については、ｄｓＲＮＡを組織部位に注射するか、または全身投与することができる。細胞へのインビトロでの導入には、電気穿孔法およびリポフェクション法等の当該技術分野において既知の方法が含まれる。
「発現停止させる（ｓｉｌｅｎｃｅ）」、「〜の発現を阻害する」、「〜の発現を下方制御する」、および「〜の発現を抑制する」等の用語は、それらがＳＡＡ遺伝子について言及する限り、本明細書において、第１の細胞もしくは細胞群と実質的に同一であるが、そのように処理されていない第２の細胞もしくは細胞群（対照細胞）と比較して、ＳＡＡ遺伝子が転写され、ＳＡＡ遺伝子の発現が阻害されるように処理された第１の細胞もしくは細胞群から単離され得る、および／または検出され得る、ｍＲＮＡの量の低下によって明らかになる、ＳＡＡ遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を指す。阻害の程度は、通常、以下で表される。
Figure 0005529142
代替として、阻害の程度は、ＳＡＡ遺伝子転写物に機能的に関連するパラメータ、例えば細胞によって分泌されるＳＡＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の量、または特定の表現型、例えばアポトーシスを提示する細胞の数の低下に関して示されてもよい。原則的に、ＳＡＡ遺伝子の発現停止は、構成的に、またはゲノム工学によって、ならびに任意の適切なアッセイによって、該標的を発現する任意の細胞において決定することができる。しかし、あるｄｓＲＮＡが特定の程度、ＳＡＡ遺伝子の発現を阻害し、したがって本発明に包含されるかどうかを決定するために参照が必要とされる場合、以下の実施例で提供されるアッセイが、かかる参照の役割を果たす。
例えば、特定の場合において、ＳＡＡ遺伝子の発現は、本発明で取り上げられる二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％抑制される。幾つかの実施形態においてＳＡＡ遺伝子は、本発明で取り上げられる二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約６０％、７０％、または８０％抑制される。幾つかの実施形態において、ＳＡＡ遺伝子は、本発明で取り上げられる二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約８５％、９０％、または９５％抑制される。表３、４、および５、ならびに図２および３は、種々のＳＡＡのｄｓＲＮＡ分子を種々の濃度で使用して、インビトロおよびエクスビボアッセイにおいて得られた発現の阻害範囲を示す。
ＳＡＡの発現の文脈において本明細書で使用される、「治療する」、「治療」等の用語は、ＳＡＡの発現によって媒介される病理過程の軽減または緩和を指す。本発明の文脈において、本明細書で以下に列挙される他の病態のうちのどの病態にも関連する限り（ＳＡＡの発現によって媒介される病理過程以外）、「治療する」、「治療」等の用語は、かかる病態に関連する少なくとも１つの症状の軽減もしくは緩和、またはアミロイドーシスの進行の遅延等の、かかる病態の進行の遅延もしくは逆行を意味する。
本明細書で使用される、「治療上有効な量」および「予防上有効な量」という句は、ＳＡＡの発現によって媒介される病理過程の治療、阻止、もしくは管理、またはＳＡＡの発現によって媒介される病理過程の明らかな症状において、治療的有用性を提供する量を指す。治療上有効である具体的な量は、普通の開業医が容易に決定することができ、例えば、ＳＡＡの発現によって媒介される病理過程の種類、患者の病歴および年齢、ＳＡＡの発現によって媒介される病理過程の段階、ならびに他のＳＡＡの発現によって媒介される病理過程に抗する薬剤の投与等の、当該技術分野において既知の因子に依存して異なり得る。
本明細書で使用される、「医薬組成物」は、薬理学上有効な量のｄｓＲＮＡと、医薬上許容される担体とを含む。本明細書で使用される、「薬理学上有効な量」、「治療上有効な量」、または単に「有効量」は、目的とする薬理学的、治療的、または阻止的結果を生み出すのに効果的なＲＮＡの量を指す。例えば、ある臨床的治療が、疾患または障害に関連する測定可能なパラメータにおいて、少なくとも２５％の低下がある時に有効であると見なされる場合、該疾患または障害を治療するための薬物の治療上有効な量は、該パラメータにおいて少なくとも２５％の低下をもたらすために必要な量である。例えば、ＳＡＡを標的とするｄｓＲＮＡの治療上有効な量は、ＳＡＡの血清レベルを少なくとも２５％低下させることができる。別の例において、ＳＡＡを標的とするｄｓＲＮＡの治療上有効な量は、腎機能を少なくとも２５％向上させることができる。
「医薬上許容される担体」という用語は、治療薬を投与するための担体を指す。かかる担体には、食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。該用語は、特に細胞培養液を除く。経口投与される薬物について、医薬上許容される担体には、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、着色剤、および防腐剤等の医薬上許容される賦形剤が含まれるが、これらに限定されない。好適な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウムおよびカルシウム、リン酸ナトリウムおよびカルシウム、ならびにラクトースが含まれ、コーンスターチおよびアルギン酸が好適な崩壊剤である。結合剤にはデンプンおよびゼラチンを含むことができ、一方潤滑剤が存在する場合は、概してステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクであろう。所望の場合、錠剤をモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル等の材料でコーティングして、消化管内での吸収を遅らせることができる。
本明細書で使用される、「形質転換細胞」は、ベクターが導入されて、そこからｄｓＲＮＡ分子を発現することができる細胞である。
ＩＩ．二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
本明細書でより詳細に記載されるように、本発明は、細胞または哺乳動物内、例えば、アミロイドーシスに罹患しているヒトのＳＡＡ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供し、該ｄｓＲＮＡは、ＳＡＡ遺伝子の発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補性の領域を有する、アンチセンス鎖を含み、該相補性の領域は、３０ヌクレオチド長未満、一般に１９〜２４ヌクレオチド長であり、該ｄｓＲＮＡは、該ＳＡＡ遺伝子を発現する細胞と接触すると、例えば、ＰＣＲまたは分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベースの方法によって、またはウェスタンブロット等によるタンパク質ベースの方法によってアッセイされるように、該ＳＡＡ遺伝子の発現を少なくとも３０％阻害する。ＳＡＡ遺伝子の発現は、以下の実施例で説明されるアッセイによって測定される場合、少なくとも３０％軽減され得る。例えば、ＨｅｐＢ３細胞等の細胞培養内のＳＡＡ遺伝子の発現は、ｂＤＮＡまたはＴａｑＭａｎアッセイ等によるＳＡＡのｍＲＮＡレベルを測定することによって、またはＥＬＩＳＡアッセイ等によるタンパク質レベルを測定することによってアッセイされるように、アッセイされ得る。本発明のｄｓＲＮＡは、１本以上の単鎖のヌクレオチドのオーバーハングをさらに含み得る。
該ｄｓＲＮＡは、以下でさらに説明されるように、当該技術分野において既知の標準的な方法、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されるもの等の自動ＤＮＡ合成装置の使用によって、合成することができる。該ｄｓＲＮＡは、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分相補的である、２本のＲＮＡ鎖を含む。該ｄｓＲＮＡの１本の鎖（アンチセンス鎖）は、ＳＡＡ遺伝子の発現の間に形成されたｍＲＮＡの配列から派生した標的配列に実質的に相補的であり、概して完全に相補的である、相補性の領域を含み、もう一方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に相補的である領域を含み、その結果、２本の鎖は、好適な条件下で組み合わされると、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成する。任意に、ＳＡＡのｍＲＮＡの配列に実質的に相補的であるアンチセンス鎖の領域は、ＳＡＡ１およびＳＡＡ２のｍＲＮＡの両方に実質的に相補的である。一般に、二重鎖構造は、１５〜３０塩基対長であり、より一般には１８〜２５、さらに一般には１９〜２４、そして最も一般には１９〜２１塩基対長である。同様に、該標的細胞への相補性の領域は、１５〜３０、または２５〜３０、または１８〜２５、または１９〜２４、または１９〜２１、または１９、２０もしくは２１塩基対長である。一実施形態において、該二重鎖は１９塩基対長である。別の実施形態において、該二重鎖は２１塩基対長である。２本の異なるｓｉＲＮＡを組み合わせて使用する場合、該二重鎖の長さは同一であってもよく、または異なってもよい。
本発明のｄｓＲＮＡのそれぞれの鎖は、一般に１５〜３０、または１８〜２５、または１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ヌクレオチド長である。他の実施形態において、それぞれの鎖は２５〜３０ヌクレオチド長である。二重鎖のそれぞれの鎖は、同一長さであってもよく、または異なる長さであってもよい。２本の異なるｓｉＲＮＡを組み合わせて使用する場合、各ｓｉＲＮＡのそれぞれの鎖の長さは、同一であってもよく、または異なってもよい。
本発明のｄｓＲＮＡは、１個もしくは複数個のヌクレオチドの１つもしくは複数の単鎖のオーバーハングを含むことができる。一実施形態において、該ｄｓＲＮＡの少なくとも一端は、１〜４個、一般には１個または２個のヌクレオチドの、単鎖のヌクレオチドのオーバーハングを有する。別の実施形態において、該ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、センス鎖の３’末端および５’末端のそれぞれに、１〜１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。さらなる実施形態において、該ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端および５’末端のそれぞれに、１〜１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。
一般に、該ｄｓＲＮＡは、２つの３’オーバーハングを含む。１つの実施形態において、該ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドのオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。別の実施形態において、該ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドのオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。別の実施形態において、該ｄｓＲＮＡの両端は平滑であり得る。別の実施形態において、オーバーハング内のヌクレオチドのうちの１つもしくは複数のヌクレオチドが、ヌクレオシドチオリン酸と置換される。
一実施形態において、ＳＡＡ遺伝子はヒトＳＡＡ遺伝子である。具体的な実施形態において、該ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、表２からのセンス配列のうちの１つであり、アンチセンス鎖は、表２からのアンチセンス配列のうちの１つである。表２に提供される標的配列のほかの箇所を標的とする代替のアンチセンス剤を、標的配列および隣接するＳＡＡ配列を使用して、容易に決定することができる。
当業者は、２０〜２３個、しかし具体的には２１個の塩基対の二重鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉の誘発に特に効果的であるとして称賛を得ていることをよく認識している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ２００１，２０：６８７７−６８８８）。しかし、他の者は、より短いもしくはより長いｄｓＲＮＡが、同様に効果的であり得ることを見出している。上記の実施形態において、表２に提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質のために、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、そこに記載の長さの少なくとも１本の鎖を含むことができる。一端または両端のわずかな数のヌクレオチドを差し引いた、表２の配列のうちの１つを有するより短いｄｓＲＮＡが、上記のｄｓＲＮＡと比較して、同様に効果的であり得ることは、妥当に予想され得る。したがって、表２の配列のうちの１つからの、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドの部分的配列を有し、本明細書で以下に記載されるアッセイにおいて、完全な配列を含むｄｓＲＮＡと比べてＳＡＡ遺伝子の発現を５、１０、１５、２０、２５、もしくは３０％以下阻害するそれらの能力が異なるｄｓＲＮＡが、本発明によって企図される。さらに、所望のＳＡＡ標的配列内で切断するｄｓＲＮＡを、対応するＳＡＡアンチセンス配列および相補的なセンス配列を用いて容易に作製することができる。
加えて、表２に提供されるｄｓＲＮＡは、ＲＮＡｉに基づく切断の影響を受けやすい、ＳＡＡのｍＲＮＡ（例えば、ＳＡＡ１および／またはＳＡＡ２のｍＲＮＡ）内の部位を特定する。したがって、本発明は、本発明の薬剤のうちの１つによって標的とされる配列内を標的とする、ｄｓＲＮＡをさらに特徴付ける。本明細書で使用される、第２のｄｓＲＮＡは、第２のｄｓＲＮＡが、第１のｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖に相補的であるｍＲＮＡ内のどの箇所でもメッセージを切断する場合、第１のｄｓＲＮＡの配列内を標的とすると言われる。かかる第２のｄｓＲＮＡは、一般に、ＳＡＡ１またはＳＡＡ２遺伝子内の選択した配列に隣接する領域から取られたさらなるヌクレオチド配列に連結される、表２に提供される配列のうちの１つからの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドからなる。例えば、配列番号１の最後の１５ヌクレオチドは、標的ＳＡＡ遺伝子から次の６ヌクレオチドと組み合わせて、表２に提供される配列のうちの１つに基づく２１ヌクレオチドの単鎖薬剤を産生する。
本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、標的配列との１つもしくは複数のミスマッチを含有してもよい。一実施形態において、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、３つ以下のミスマッチを含有する。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチの範囲が、相補性の領域の中心に位置しないことが好ましい。該ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、どちらかの末端から５ヌクレオチド、例えば、相補性の領域の５’もしくは３’末端のいずれかの末端から５、４、３、２、もしくは１ヌクレオチドに制限されることが好ましい。例えば、ＳＡＡ遺伝子の領域に相補的である２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖について、該ｄｓＲＮＡは、一般には、中央の１３個のヌクレオチド内にはいずれのミスマッチも含有しない。本発明内で記載される方法を使用して、標的配列とのミスマッチを含有するｄｓＲＮＡが、ＳＡＡ遺伝子の発現の阻害に効果的であるかどうかを判定することができる。ＳＡＡ遺伝子の発現の阻害における、ミスマッチを有するｄｓＲＮＡの有効性を考慮することは、特にＳＡＡ遺伝子内の特定の相補性の領域が、集団内に多型の配列多様性を有することが既知である場合、重要である。
修飾
また別の実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、安定性を亢進させるために化学修飾される。本発明で取り上げられる核酸は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるもの等の、当該技術分野において十分確立された方法によって、合成および／または修飾することができ、該文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明において有用であるｄｓＲＮＡ化合物の具体例には、修飾された骨格、または非天然のヌクレオシド間結合を含有するｄｓＲＮＡが含まれる。本明細書で定義されるように、修飾された骨格を有するｄｓＲＮＡには、該骨格にリン原子を保持するもの、および該骨格にリン原子を有しないものが含まれる。本明細書の目的上、また当該技術分野において時折言及されるように、それらのヌクレオシド間骨格にリン原子を有しない修飾されたｄｓＲＮＡも、オリゴヌクレオシドであると見なすことができる。
修飾されたｄｓＲＮＡ骨格には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに正常な３’−５’結合を有するボラノホスフェート、２’−５’結合したこれらの類似体、そしてヌクレオシド単位の隣接する対が３’−５’から５’−３’へ、または２’−５’から５’−２’へ結合する、逆向きの極性を有するものが含まれる。また、種々の塩、混合塩、および遊離酸形態も含まれる。
上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９５号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３１６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、および第５，６２５，０５０号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
ｄｓＲＮＡ骨格の中にリン原子を含まない、修飾されたｄｓＲＮＡ骨格は、単鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１個もしくは複数個の単鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成された）、シロキサン骨格、硫化物、スルホキシド、およびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびにＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２を混合した構成成分を有する他のもの、を有するものが含まれる。
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、および第５，６７７，４３９号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
他の好適なｄｓＲＮＡ模倣体において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、骨格が、新規の基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とハイブリダイズするために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているそのようなオリゴマー化合物の１つであるｄｓＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物では、ｄｓＲＮＡの糖骨格が、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は保持され、該骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に見出すことができる。
本発明の他の実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するｄｓＲＮＡ、およびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドであり、特に上述の米国特許第５，４８９，６７７号の−−ＣＨ２−−ＮＨ−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる］、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、および−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−［式中、天然のホスホジエステル骨格は、−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２−−として表される］、および上述の米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格である。また、上述の米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有するｄｓＲＮＡも好ましい。
また、修飾されたｄｓＲＮＡは、１つもしくは複数の置換糖部分も含有することができる。好ましいｄｓＲＮＡは、２’位に、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含み、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が特に好ましく、式中、ｎおよびｍは１〜約１０である。他の好ましいｄｓＲＮＡは、２’位に、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、もしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、ｄｓＲＮＡの薬物動態特性を改善するための基、またはｄｓＲＮＡの薬力学的特性を改善するための基、ならびに類似した特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。好ましい修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であって、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）すなわち、アルコキシ−アルコキシ基が含まれる。好ましいさらなる修飾には、本明細書において以下の実施例に記載される、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、ならびに、同様に、本明細書において以下の実施例に記載される、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野で２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルもしくは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ２）２が含まれる。
他の好ましい修飾には、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。同様の修飾を、ｄｓＲＮＡの他の位置、特に３’末端ヌクレオチドもしくは２’−５’結合ｄｓＲＮＡ内の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位で作製することもできる。また、ｄｓＲＮＡは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖模倣体を有してもよい。かかる修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、および第５，７００，９２０号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許のうちのあるものは本出願によって共同所有され、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
また、ｄｓＲＮＡは、核酸塩基（当該技術分野ではしばしば単に「塩基」と称される）修飾または置換を含み得る。本明細書で使用される、「非修飾」もしくは「天然」の核酸塩基には、プリン塩基、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾された核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾのウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン等の、他の合成および天然の核酸塩基が含まれる。さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号で開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０で開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３で開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３で開示されるものが含まれる。これらの核酸塩基のうちの特定のものは、本発明で取り上げられるオリゴマー化合物の結合親和性を高めるために、特に有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されていて（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、例示的な塩基置換であり、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされると、さらに特に好ましい。
上記の修飾された核酸塩基の特定のもの、ならびに他の修飾された核酸塩基の調製を教示する代表的な米国特許には、上記の米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、および第５，６８１，９４１号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれ、米国特許第５，７５０，６９２号も、参照により本明細書に組み込まれる。
共役体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）
本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡの別の修飾は、該ｄｓＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞取り込みを亢進させる、１つもしくは複数の部分または共役体の該ｄｓＲＮＡへの化学的結合を伴う。かかる部分には、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４：１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ベリル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６−３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１９９１，１０：１１１１−１１１８、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７−３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７−３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３−９３７）等の脂質部分が含まれるが、これらに限定されない。
かかるｄｓＲＮＡ共役体の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号、第５，５９１，５８４号、第５，１０９，１２４号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，４１４，０７７号、第５，４８６，６０３号、第５，５１２，４３９号、第５，５７８，７１８号、第５，６０８，０４６号、第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８３５，２６３号、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、第５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号、第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号、および第５，６８８，９４１号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
ある化合物の全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際、前述の修飾のうちの２つ以上を単一化合物に、あるいはさらにはｄｓＲＮＡ内の単一ヌクレオシドに導入することができる。また、本発明は、キメラ化合物であるｄｓＲＮＡ化合物も含む。本発明の文脈において、「キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」ｄｓＲＮＡ化合物または「キメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）」は、ｄｓＲＮＡ化合物であり、特に２つ以上の化学的にはっきりと異なる領域を含有し、それぞれ、少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合のヌクレオチドから作製される、ｄｓＲＮＡである。これらのｄｓＲＮＡは、典型的には少なくとも１つの領域を含有し、該ｄｓＲＮＡは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、および／または標的核酸に対する結合親和性の増加を該ｄｓＲＮＡに付与するように、修飾される。該ｄｓＲＮＡのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質としての役割を果たすことができる。一例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。ＲＮアーゼＨの活性化は、したがって、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより遺伝子発現のｄｓＲＮＡ阻害の効率を大きく亢進させる。それ故、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、同一標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、しばしばより短いｄｓＲＮＡによって匹敵する結果を得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、および必要であれば、当該技術分野において既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技法によって、日常的に検出することができる。
特定の場合において、該ｄｓＲＮＡは、非リガンド基によって修飾されてもよい。多くの非リガンド分子が、ｄｓＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞取り込みを亢進させるためにｄｓＲＮＡに結合されており、かかる結合を行うための手順は、科学文献で入手可能である。かかる非リガンド部分には、コレステロール（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）等の脂質部分が含まれている。かかるｄｓＲＮＡ結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の調製を教示する代表的な米国特許は、上記に列記されている。典型的な結合プロトコルは、配列の１つもしくは複数の位置にアミノリンカーを有するｄｓＲＮＡの合成を伴う。次いで、該アミノ基を、適切なカップリングもしくは活性化試薬を使用して、結合される分子と反応させる。この結合反応は、依然として固体支持体に結合されたｄｓＲＮＡを用いて、または溶液相中でのｄｓＲＮＡの切断後に実行することができる。典型的には、ＨＰＬＣによってｄｓＲＮＡ結合体を精製して、純粋な結合体が得られる。
ベクターによりコードされたｄｓＲＮＡ
本発明の別の態様では、ＳＡＡのｄｓＲＮＡ分子が、ＤＮＡもしくはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現される（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ（１９９６），１２：５−１０、Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａらの国際ＰＣＴ公開ＷＯ第００／２２１１３号、Ｃｏｎｒａｄの国際ＰＣＴ公開ＷＯ第００／２２１１４号、およびＣｏｎｒａｄの米国特許第６，０５４，２９９号を参照されたい）。これらの導入遺伝子は、線状構築物、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができ、宿主ゲノムに統合される導入遺伝子として導入されて、受け継がれ得る。また、導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして受け継がれるのを可能にするように、構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
ｄｓＲＮＡの個々の鎖を、２つの個別の発現ベクター上のプロモーターを用いて転写し、標的細胞に同時形質移入することができる。あるいは、ｄｓＲＮＡのそれぞれ個々の鎖を、いずれも同一発現プラスミド上に位置するプロモーターを用いて転写してもよい。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステムアンドループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって接合される逆方向反復として発現される。
組換えｄｓＲＮＡ発現ベクターは、一般に、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。ｄｓＲＮＡを発現するウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（概評として、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９を参照）、アデノウイルス（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８）６：６１６）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４）、およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）、Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５を参照））、またはアルファウイルス、ならびに当該技術分野において既知の他のものに基づいて構築することができるが、これらに限定されない。種々の遺伝子を、上皮細胞を含む多くの異なる細胞型にインビトロおよび／またはインビボで導入するために、レトロウイルスが使用されている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１３９５−１３９８、Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）８５：６４６０−６４６４、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３０１４−３０１８、Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６１４１６１４５、Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８０３９−８０４３、Ｆｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８３７７−８３８１、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５、ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ． ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７６４０−１９、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７、Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０８９２−１０８９５、Ｈｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５、米国特許第４，８６８，１１６号、米国特許第４，９８０，２８６号、ＰＣＴ出願ＷＯ第８９／０７１３６号、ＰＣＴ出願ＷＯ第８９／０２４６８号、ＰＣＴ出願ＷＯ第８９／０５３４５号、およびＰＣＴ出願ＷＯ第９２／０７５７３号を参照）。細胞のゲノムに挿入された遺伝子を形質導入して発現することができる組換えレトロウイルスベクターは、組換えレトロウイルスゲノムを、ＰＡ３１７およびＰｓｉ−ＣＲＩＰ等の好適なパッケージング細胞系に形質移入することによって、産生することができる（Ｃｏｍｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：５−１０、Ｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６３４９）。感受性宿主（例えば、ラット、ハムスター、イヌ、およびチンパンジー）内の多岐にわたる細胞および組織を感染させるために、組換えアデノウイルスベクターを使用することができ（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，１６６：７６９）、これは、感染に有糸***的に活性な細胞を必要としない利点も有する。
発現されるｄｓＲＮＡ分子のコード配列を受け入れることができる任意のウイルスベクターを使用することができ、例としては、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）、ヘルペスウイルス等に由来するベクターである。ウイルスベクターの指向性は、エンベロープタンパク質もしくは他のウイルスからの他の表面抗原を用いて該ベクターをシュードタイピング（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）することにより、または異なるウイルスのキャプシドタンパク質を適宜置換することによって、修正することができる。
例えば、本発明で取り上げられるレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラ等からの表面タンパク質でシュードタイピングすることができる。本発明で取り上げられるＡＡＶベクターは、ベクターが異なるキャプシドタンパク質の血清型を発現するように操作することにより、異なる細胞を標的とするようにすることができる。例えば、血清型２のゲノム上に血清型２のキャプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と称される。ＡＡＶ２／２ベクター内のこの血清型２のキャプシド遺伝子を、血清型５のキャプシド遺伝子と置換して、ＡＡＶ２／５ベクターを産生することができる。異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための技法は、当該技術分野の技能内であり、例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１−８０１を参照されたく、その開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明における使用に好適な組換えウイルスベクターの選択、ｄｓＲＮＡの発現のために核酸配列を該ベクターに挿入するための方法、および該ウイルスベクターを対象となる細胞に送達する方法は、当該技術分野の技能内である。例えば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ Ｒ（１９９５），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１−３１０、Ｅｇｌｉｔｉｓ Ｍ Ａ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８−６１４、Ｍｉｌｌｅｒ Ａ Ｄ（１９９０），Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．１：５−１４、Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｗ Ｆ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２５−３０、およびＲｕｂｉｎｓｏｎ Ｄ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１−４０６を参照されたく、それらの開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
ウイルスベクターは、ＡＶおよびＡＡＶに由来し得る。一実施形態において、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、例えば、Ｕ６もしくはＨ１ ＲＮＡプロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを有する組換えＡＡＶベクターから、２つの別個の相補的な単鎖ＲＮＡ分子として発現される。
本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡを発現するために好適なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、該ベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載されている。
本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡを発現するために好適なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、該ベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１、Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０−５３２、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６、米国特許第５，２５２，４７９号、米国特許第５，１３９，９４１号、国際特許出願ＷＯ第９４／１３７８８号、および国際特許出願ＷＯ第９３／２４６４１号に記載され、それらの開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明で取り上げられるＤＮＡプラスミドもしくはウイルスベクターのいずれか内でｄｓＲＮＡの発現を駆動するプロモーターは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（例えばリボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えばＣＭＶ初期プロモーター、もしくはアクチンプロモーター、もしくはＵ１ ｓｎＲＮＡプロモーター）、または一般にＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えばＵ６ ｓｎＲＮＡもしくは７ＳＫ ＲＮＡプロモーター）、あるいは原核生物プロモーター、例えば、発現プラスミドもＴ７プロモーターからの転写に必要なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするという条件で、Ｔ７プロモーターであり得る。該プロモーターは、膵臓への導入遺伝子の発現を導くこともできる（例えば、ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｓ（Ｂｕｃｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：２５１１−２５１５）を参照）。
さらに、導入遺伝子の発現は、例えば、特定の生理的調節因子、例えば、循環ブドウ糖レベル、またはホルモンに感受性である調節配列等の、誘発可能な調節配列および発現系を使用することによって、正確に調節することができる（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：２０−２４）。細胞または哺乳動物内の導入遺伝子の発現を制御するために好適である、かかる誘発可能な発現系には、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量化の化学誘発物質、およびイソプロピル−ベータ−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）による調節が含まれる。当業者は、ｄｓＲＮＡ導入遺伝子の目的とする用途に基づいて、適切な調節／プロモーター配列を選択することができよう。
一般に、ｄｓＲＮＡ分子を発現することができる組換えベクターは、以下に記載するように送達され、標的細胞内に持続する。代替として、ｄｓＲＮＡ分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを使用することができる。かかるベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。発現すると、ｄｓＲＮＡは標的ＲＮＡに結合し、その機能または発現を調節する。ｄｓＲＮＡを発現するベクターの送達は、静脈内もしくは筋肉内投与等によって、患者から外植された標的細胞に投与後、該患者へ再導入することによって、または所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段等の送達によって、全身的であり得る。
ｄｓＲＮＡ発現ＤＮＡプラスミドは、典型的には、カチオン性脂質担体（例えばオリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ））、または非カチオン性脂質に基づく担体（例えばＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として、標的細胞に形質移入される。１週間以上の期間にわたって、単一のＳＡＡ遺伝子の異なる領域または複数のＳＡＡ遺伝子を標的とする、ｄｓＲＮＡによって媒介されるノックダウンのための複数回の脂質の形質移入もまた、本発明によって企図される。ベクターの宿主細胞への導入の成功は、種々の既知の方法を使用して監視することができる。例えば、一過性形質移入は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光マーカー等のレポーターを用いて示すことができる。エクスビボ細胞の安定な形質移入は、形質移入細胞に、ハイグロマイシンＢ耐性等の、特定の環境因子（例えば、抗生物質および薬物）に対する耐性を提供するマーカーを使用して、保証することができる。
また、ＳＡＡに特異的なｄｓＲＮＡ分子は、ベクターに挿入して、ヒト患者用の遺伝子療法ベクターとして使用することもできる。遺伝子療法ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照）、または定位固定注射（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７を参照）によって、対象に送達することができる。遺伝子療法ベクターの医薬調製物は、許容される希釈剤中の遺伝子療法ベクターを含んでもよく、または遺伝子送達媒体が中に埋め込まれる徐放性マトリックスを含んでもよい。代替として、組換え細胞から、完全な遺伝子送達ベクター(例えば、レトロウイルスベクター)を無傷で産生することができる場合、医薬調製物は、遺伝子送達系を産生する１つもしくは複数の細胞を含んでもよい。
ＩＩＩ．ｄｓＲＮＡを含有する医薬組成物
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡを含有する医薬組成物と、医薬上許容される担体とを提供する。該ｄｓＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＳＡＡの発現によって媒介される病理過程等の、ＳＡＡ遺伝子の発現もしくは活性に関連する疾患もしくは障害の治療に有用である。かかる医薬組成物は、送達様式に基づいて製剤化される。一例は、非経口投与を介して、例えば、静脈（ＩＶ）送達による全身投与用に製剤化される組成物である。別の例は、例えば、持続ポンプ注入等による脳への注入によって、脳実質への直接送達用に製剤化される組成物である。
一般に、ｄｓＲＮＡの好適な用量は、１日当たり受容者の体重１キログラムにつき０．０１〜２００．０ミリグラムの範囲、一般には、１日当たり体重１キログラムにつき０．１〜５０または０．１〜５．０ｍｇの範囲であろう。例えば、該ｄｓＲＮＡは、単回用量当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。該医薬組成物は、１日１回投与することができ、あるいは、該ｄｓＲＮＡは、１日にわたって適切な間隔で、２、３、またはそれ以上の分割用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）として、さらに、持続注入または放出制御製剤による送達を用いて投与されてもよい。その場合、各分割用量に含有されたｄｓＲＮＡは、１日当たりの総投薬量を達成するように、対応してより小さくなければならない。また、投薬量単位は、例えば、数日間にわたって該ｄｓＲＮＡの持続放出を提供する、従来の持続放出製剤を使用して、数日間にわたる送達用に配合することもできる。持続放出製剤は当該技術分野において周知であり、本発明の薬剤を用いて使用され得る部位等の特定の部位での薬剤の送達に特に有用である。本実施形態では、投薬量単位は、対応する複数の１日量を含む。
ＳＡＡレベル（またはＳＡＡ１およびＳＡＡ２レベルの両方）に対する単回用量の効果は長く続き、その結果、その後の用量は、３、４、もしくは５日以下の間隔で、または１、２、３、もしくは４週間以下の間隔で投与される。
本発明には、脳に直接注射することによって送達することができる医薬組成物が含まれる。該注射は、脳の特定領域（例えば、黒質、皮質、海馬、線条体、もしくは淡蒼球）への定位固定注射によるものであり得、該ｄｓＲＮＡは、中枢神経系への多重領域（例えば、脳の多重領域へ、および／または脊髄へ）に送達され得る。該ｄｓＲＮＡは、脳の拡散領域に送達（例えば、脳の皮質への拡散送達）され得る。
一実施形態において、ＳＡＡを標的とするｄｓＲＮＡは、カニューレ、または例えば、脳等の組織（例えば、脳の黒質、皮質、海馬、線条体、もしくは淡蒼球）内に埋め込まれた一端を有する他の送達デバイスを経由して送達され得る。該カニューレは、該ｄｓＲＮＡ組成物の貯蔵所に接続することができる。流入または送達は、ポンプ、例えば、Ａｌｚｅｔポンプ等の浸透圧ポンプもしくはミニポンプによって媒介され得る（Ｄｕｒｅｃｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）。一実施形態において、ポンプまたは貯蔵所は、組織から離れたエリア、例えば腹部内に埋め込まれ、送達は、ポンプまたは貯蔵所から放出部位に誘導する導管によって達成される。該ｄｓＲＮＡ組成物の脳への注入は、数時間にわたって、または数日間、例えば、１、２、３、５、もしくは７日間、もしくはそれ以上であり得る。脳への送達用のデバイスは、例えば、米国特許第 ６，０９３，１８０号、および第５，８１４，０１４号に記載されている。
当業者には、以下の因子に限定されないが、疾患もしくは障害の重症度、以前の治療、総体的な健康、および／または対象の年齢、ならびに存在する他の疾患を含む特定の因子が、対象を効果的に治療するために必要とされる投薬量およびタイミングに影響を及ぼし得ることが理解されよう。さらに、治療上有効な量の組成物を用いた対象の治療には、単回治療または一連の治療が含まれ得る。本発明により包含される個々のｄｓＲＮＡに対する効果的な投薬量およびインビボ半減期の推定は、従来の方法を使用して、または本明細書の他の箇所で記載される適切な動物モデルを使用したインビボ試験に基づいて、行うことができる。
マウス遺伝学における進歩によって、ＳＡＡの発現によって媒介される病理過程等の種々のヒト疾患の研究用に、いくつかのマウスモデルが生成されている。かかるモデルは、ｄｓＲＮＡのインビボ試験、ならびに治療上有効な用量を決定するために使用される。好適なマウスモデルは、例えば、アデノウイルスベクターからヒトＳＡＡ１またはＳＡＡ２を発現するプラスミドを含有するマウスである。別の好適なマウスモデルは、ヒトＳＡＡ１またはＳＡＡ２を発現する導入遺伝子を保有する遺伝子導入マウスである。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のためにさまざまな投薬量を調整するのに使用することができる。本発明で取り上げられる組成物の投薬量は、一般に、ほとんどまたは全く毒性のないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。該投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存して、この範囲内で異なってもよい。本発明で取り上げられる方法において使用されるいずれの化合物についても、治療上有効な用量は、まず細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養において決定された、ＩＣ５０（すなわち、症状の半値阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物、または適切な場合は、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲（例えば、該ポリペプチドの濃度の低下を達成する）を達成するように、処方することができる。かかる情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の発現によって媒介される病理過程の治療に効果的な他の既知の薬剤と併用して投与することができる。いずれの場合においても、投与する医師は、当該技術分野において既知であるか、または本明細書に記載される、標準的な有効性の測定値を使用して得られた結果に基づいて、ｄｓＲＮＡ投与の量およびタイミングを調整することができる。
投与
本発明はまた、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡ化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。本発明の医薬組成物は、局所的または全身的な治療が所望されるか、および治療される範囲に依存して、さまざまな方法で投与することができる。投与は、局所的、噴霧器によってを含む、例えば、粉末もしくは噴霧剤の吸入もしくは吹送による経肺、気管内、鼻腔内、表皮および経皮、経口もしくは非経口であり得る。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腔内、もしくは筋肉内注射もしくは注入、または頭蓋内、例えば、実質内、くも膜下腔内、もしくは脳室内投与が含まれる。
局所投与用の医薬組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、グリーム、ゲル、ドロップ剤、座薬、スプレー、液体、および粉末が含まれ得る。従来の医薬用担体、水性、粉末、もしくは油性基剤、増粘剤等が必要であるか、または望ましくあり得る。被覆したコンドーム、手袋等も有用であり得る。好適な局所製剤には、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、および界面活性剤等の局所送達剤と混合されるものが含まれる。好適な脂質およびリポソームには、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジル（ＤＯＰＥ）エタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ））、ならびにカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル（ＤＯＴＡＰ）、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＴＭＡ））が含まれる。本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、リポソーム内にカプセル化されてもよく、あるいはそれ、特にカチオン性リポソームと複合体を形成してもよい。代替として、ｄｓＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質と複合されてもよい。好適な脂肪酸およびエステルには、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１−１０アルキルエステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピル（ＩＰＭ））、モノグリセリド、ジグリセリド、あるいはその医薬上許容される塩が含まれるが、これらに限定されない。局所製剤は、米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載され、当該特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
経口投与用の組成物および製剤には、粉末もしくは顆粒、微粒子、ナノ粒子、水もしくは疎水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、ゲルカプセル、サシェット、錠剤、またはミニタブレットが含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましくあり得る。幾つかの実施形態において、経口製剤とは、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡが、１つもしくは複数の浸透促進剤、界面活性剤、およびキレート化剤と併用して投与されるものである。好適な界面活性剤には、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩が含まれる。好適な胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコール酸（ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム、ならびにグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが含まれる。好適な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、もしくはその医薬上許容される塩（例えば、ナトリウム）が含まれる。幾つかの実施形態において、浸透促進剤の組み合わせが使用され、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩が挙げられる。例示的な１つの組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透促進剤には、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが含まれる。本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子を含む顆粒形態で経口的に送達されるか、または微小もしくはナノ粒子を形成するように複合されてもよい。ｄｓＲＮＡ複合剤には、ポリ−アミノ酸類；ポリイミン類；ポリアクリレート類；ポリアルキルアクリレート類、ポリオキセタン類、ポリアルキルシアノアクリレート類；カチオン化ゼラチン類、アルブミン類、デンプン類、アクリレート類、ポリエチレングリコール類（ＰＥＧ）、およびデンプン類；ポリアルキルシアノアクリレート類；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン類、ポルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎ）類、セルロース類、およびデンプン類が含まれる。好適な複合剤には、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。ｄｓＲＮＡ用の経口製剤およびそれらの調製は、米国特許第６，８８７，９０６号、米国特許公開第２００３００２７７８０号、および米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載され、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
非経口、実質内（脳内への）、くも膜下腔内、脳室内、または肝内投与用の組成物および製剤には、滅菌水溶液が含まれてもよく、これも、浸透促進剤、担体化合物、および他の医薬上許容される担体もしくは賦形剤等の緩衝液、希釈剤（ただし、これらに限定されない）等の他の好適な添加剤を含有し得る。
本発明の医薬組成物には、溶液、エマルジョン、およびリポソームを含有する製剤が含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物は、予め形成された液体、自己乳化型固体および、自己乳化型半固体を含む種々の構成成分から生成することができるが、これらに限定されない。肝臓癌等の肝障害を治療する際に肝臓を標的とする製剤が特に好ましい。
本発明の医薬製剤は、簡便に単位剤形で提示することができ、医薬産業において周知である従来の技法によって、調製することができる。かかる技法には、活性成分を１つもしくは複数の医薬用担体または１つもしくは複数の賦形剤といっしょにさせるステップが含まれる。一般に、該製剤は、活性成分を液体担体もしくは微粉化した固体担体、あるいはその両方と均一かつ密接にいっしょにさせ、次いで必要であれば該産物を成形することによって調製される。
リポソーム製剤
薬物の製剤化用に研究されて、使用されているマイクロエマルジョンの他に、組織立った多くの界面活性剤の構造がある。これらには、単層、ミセル、二重層、および小胞が含まれる。リポソーム等の小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）は、薬物送達の観点から、それらが提示する特異性および作用の持続時間から、大きな関心を集めている。本発明において使用される、「リポソーム」という用語は、球状の１つまたは複数の二重層に配置された両親媒性脂質の小胞を意味する。
リポソームは、親油性材料および水性の内部から形成される膜を有する、単層状または多層状の小胞である。その水性部分が、送達される組成物を含有する。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができる利点を有する。非カチオン性のリポソームは、細胞壁とさほど効率的に融合することはできないが、マクロファージによってインビボで取り込まれる。
哺乳動物の皮膚を無傷で通過するために、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下、それぞれ５０ｎｍ未満の直径を有する、一連の微細孔を通過しなければならない。したがって、高度に変形可能で、そのような微細孔を通過することができるリポソームを使用することが望ましい。
リポソームのさらなる利点には、天然のリン脂質から得られたリポソームは、生体適合性および生分解性であること、リポソームは、広範な水溶性および脂溶性の薬物を組み込むことができること、リポソームは、それらの内部区画でカプセル化された薬物を、代謝および分解から保護することができること、が含まれる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要な事項は、脂質の表面電荷、小胞の大きさ、およびリポソームの水性容積である。
リポソームは、作用部位への活性成分の移送および送達に有用である。リポソーム膜は、構造的に生体膜と同様であるため、リポソームが組織に塗布されると、リポソームは細胞膜との融合を開始し、リポソームと細胞との融合が進行するに従って、リポソームの内容物が細胞内へ出て、そこで活性薬剤が作用し得る。
リポソーム製剤は、多くの薬物のための送達様式として、広範な研究の焦点となっている。局所投与について、リポソームが他の製剤に勝る幾つかの利点を提示するという証拠が増えつつある。かかる利点には、投与された薬物の高度な体内吸収に関連する副作用の減少、投与された薬物の所望の標的での蓄積の増加、ならびに親水性および疎水性の両方の多岐にわたる薬物を皮膚へ投与する能力が含まれる。
幾つかの報告は、高分子量のＤＮＡを含む薬剤を皮膚へ送達するリポソームの能力について詳述している。鎮痛剤、抗体、ホルモン、および高分子量のＤＮＡを含む化合物が、皮膚に投与されている。大半の適用が、表皮上層の標的化をもたらした。
リポソームは、広義の２つのクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に荷電したＤＮＡ分子と相互に作用し、安定な複合体を形成する、正に荷電したリポソームである。この正に荷電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面と結合し、エンドソーム内に取り入れられる。エンドソーム内の酸性ｐＨにより、リポソームが破裂し、その内容物を細胞の細胞質内に放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。
ｐＨ感受性であるか、または負に荷電したリポソームは、ＤＮＡと複合するのではなく、それを捕捉する。ＤＮＡおよび脂質はともに同様に荷電されているため、複合体形成ではなく反発が生じる。それでもなお、ＤＮＡの一部は、これらのリポソームの水性内部内に捕捉される。チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養下の細胞単層へ送達するために、ｐＨ感受性リポソームが使用されている。外因性遺伝子の発現が、標的細胞中で検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９−２７４）。
リポソーム組成物の１つの主要な種類には、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。例えば、中性のリポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性のリポソーム組成物は、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、一方アニオン性の膜融合性リポソームは、主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。リポソーム組成物の別の種類は、例えば、大豆ホスファチジルコリン、および卵ホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別の種類は、リン脂質、および／またはホスファチジルコリン、および／またはコレステロールの混合物から形成される。
幾つかの研究が、リポソーム製剤の皮膚への局所送達を評価している。インターフェロンを含有するリポソームのモルモット皮膚への塗布は、皮膚ヘルペス炎の軽減をもたらし、一方他の手段（例えば、溶液またはエマルジョンとして）を介したインターフェロンの送達は効果がなかった（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，２，４０５−４１０）。さらに、さらなる研究は、リポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの、水性系を使用するインターフェロンの投与に対する有効性を試験し、リポソーム製剤は水溶性投与より優れていると結論付けた（ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，１８，２５９−２６５）。
また、非イオン性のリポソーム系は、特に非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系における、薬物の皮膚への送達の実用性を決定するために調べられている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性のリポソーム製剤が、シクロスポリンＡをマウス皮膚の真皮に送達するために使用された。結果は、かかる非イオン性のリポソーム系が、皮膚の異なる層へのシクロスポリンＡの沈着の促進に効果的であることを示した（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。
また、リポソームには、「立体的に安定化された」リポソームが含まれ、該用語は、本明細書で使用される場合、１つもしくは複数の特定化された脂質を含むリポソームを指し、リポソームに組み込まれると、かかる特定化された脂質を欠くリポソームと比較して、循環寿命の向上をもたらす。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１等の１つもしくは複数の糖脂質を含むか、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分等の１つもしくは複数の親水性ポリマーで誘導体化されるものである。いずれの特定の理論にも束縛されるものではないが、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームについて、これらの立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の増加は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内への取り込みの減少に由来すると、当該技術分野では考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
１つもしくは複数の糖脂質を含む種々のリポソームが当該技術分野において既知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシド硫酸、およびホスファチジルイノシトールの、リポソームの血中半減期を改善する能力について報告した。これらの所見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）によって詳しく説明されている。ともにＡｌｌｅｎらに認可された、米国特許第４，８３７，０２８号および国際公開ＷＯ第８８／０４９２４号は、（１）スフィンゴミエリン、および（２）ガングリオシドＧＭ１もしくはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開ＷＯ第９７／１３４９９号（Ｌｉｍら）に開示されている。
１つもしくは複数の親水性ポリマーによって誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびその調製方法は、当該技術分野において既知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら （Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３，２７７８）は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン性界面活性剤、２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームについて記載している。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９８４，１６７，７９）は、ポリスチレン粒子のポリマーグリコールによる親水性コーティングが、血中半減期の著しい増加をもたらすことを指摘している。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボン酸基の結合によって修飾された合成リン脂質が、Ｓｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号、および第４，５３４，８９９号）によって記載されている。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２６８，２３５）は、ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＥＧによって誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが、血中循環半減期の著しい増加を有することを示す実験について記載している。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１）は、このような観察を、他のＰＥＧ誘導体化リン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧとの混合から形成されるＤＳＰＥ−ＰＥＧに広げた。外部表面に共有結合されたＰＥＧ部分を有するリポソームが、欧州特許ＥＰ第０ ４４５ １３１ Ｂ１号および国際公開ＷＯ第９０／０４３８４号（Ｆｉｓｈｅｒ）に記載されている。ＰＥＧによって誘導体化された１〜２０モルパーセントのＰＥを含有するリポソーム組成物、およびその使用方法が、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５５６号、および第５，３５６，６３３号）、ならびにＭａｒｔｉｎら（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許ＥＰ第０ ４９６ ８１３ Ｂ１号）によって記載されている。他のいくつかの脂質−ポリマー結合体を含むリポソームが、国際公開ＷＯ第９１／０５５４５号および米国特許第５，２２５，２１２号（ともにＭａｒｔｉｎらに認可された）、ならびに国際公開ＷＯ第９４／２００７３号（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームが、国際公開ＷＯ第９６／１０３９１号（Ｃｈｏｉら）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉら）および米国特許第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａら）は、表面に官能基部分をさらに誘導体化することができるＰＥＧ含有リポソームについて記載している。
核酸を含むいくつかのリポソームが当該技術分野において既知である。Ｔｈｉｅｒｒｙらの国際公開ＷＯ第９６／４００６２号は、高分子量の核酸をリポソーム中にカプセル化するための方法を開示している。Ｔａｇａｗａらの米国特許第５，２６４，２２１号は、タンパク質結合リポソームを開示し、かかるリポソームの内容物にはｄｓＲＮＡが含まれ得ると主張している。Ｒａｈｍａｎらの米国特許第５，６６５，７１０号は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソーム中にカプセル化する特定の方法について記載している。Ｌｏｖｅらの国際公開ＷＯ第９７／０４７８７号は、ｒａｆ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含むリポソームを開示している。
トランスファーソームはさらに別の種類のリポソームであり、薬物送達媒体の興味を引く候補物質である、高度に変形可能な脂質凝集物である。トランスファーソームは脂質小滴として記載されてもよく、これは、高度に変形可能であるため、この小滴より小さな孔に容易に浸透することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適合可能であり、例えば、自己最適化性（皮膚の孔の形状に適合する）、自己修復性であり、しばしば断片化されることなく標的に到達し、しばしば自己負荷性（ｓｅｌｆ−ｌｏａｄｉｎｇ）である。トランスファーソームを作製するために、標準的なリポソーム組成物に、表面エッジアクチベータ（ｓｕｒｆａｃｅ ｅｄｇｅ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、通常界面活性剤を添加することができる。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚へ送達するために使用されている。血清アルブミンのトランスファーソームによって媒介される送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同様に効果的であることが示されている。
界面活性剤は、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）およびリポソーム等の製剤中に幅広い用途を見出す。天然および合成の両方の、多くの異なる種類の界面活性剤の性質を分類および順位付ける最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（「頭部基」としても知られる）の性質が、製剤に使用される異なる界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されていない場合、これは、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧品に幅広い用途を見出し、広範なｐＨ値にわたって使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値は、その構造に依存して、２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシ化エステル等の非イオン性エステルが含まれる。脂肪アルコールエトキシ化物（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、プロポキシ化（ｐｒｏｐｏｘｙｌａｔｅｄ）アルコール、およびエトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマー等の非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルも、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤が、非イオン性界面活性剤のクラスのうちで最も一般的な構成物質である。
界面活性剤分子が水中に溶解または分散された時に負の電荷を保有する場合、その界面活性剤は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤には、石鹸等のカルボン酸塩、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキル硫酸塩およびエトキシ化アルキル硫酸塩等の硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート（ｉｓｅｔｈｉｏｎａｔｅ）、アシルタウレート（ｔａｕｒａｔｅ）、およびスルホコハク酸塩等のスルホネート、ならびにリン酸塩が含まれる。アニオン性界面活性剤のクラスのうちで最も重要な構成物質は、アルキル硫酸塩および石鹸である。
界面活性剤分子が正の荷電を保有する場合、それが水中に溶解または分散されると、その界面活性剤はカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤には、第四アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが含まれる。第四アンモニウム塩がこのクラスで最も使用される構成物質である。
界面活性剤分子が正または負の電荷のいずれをも保有する能力を有する場合、その界面活性剤は、両性として分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびフォスファチドが含まれる。
薬品、製剤、およびエマルジョン中の界面活性剤の使用が概評されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
ＳＮＡＬＰ
一実施形態において、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、脂質製剤中に完全にカプセル化されて、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰ、または他の核酸脂質粒子を形成する。本明細書で使用される、「ＳＮＡＬＰ」という用語は、ＳＰＬＰを含む安定な核酸脂質粒子を指す。本明細書で使用される、「ＳＰＬＰ」という用語は、脂質小胞内にカプセル化されたプラスミドＤＮＡを含む核酸脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を阻止する脂質（例えば、ＰＥＧ脂質結合体）を含有する。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に長時間の循環寿命を呈し、遠位の部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するため、全身適用に非常に有用である。ＳＰＬＰには、「ｐＳＰＬＰ」が含まれ、これには、ＰＣＴ公開ＷＯ第００／０３６８３号に記載されるカプセル化された縮合剤と核酸との複合体が含まれる。本発明の粒子は、典型的には約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０〜約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に無毒である。さらに、該核酸は、本発明の核酸脂質粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に抵抗性である。核酸脂質粒子およびその調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号、第５，９８１，５０１号、第６，５３４，４８４号、第６，５８６，４１０号、第６，８１５，４３２号、およびＰＣＴ公開ＷＯ第９６／４０９６４号に開示されている。
一実施形態において、脂質の薬物に対する比率（質量／質量比率）（例えば、脂質のｄｓＲＮＡに対する比率）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、または約６：１〜約９：１、または５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、もしくは１１：１の範囲内であろう。
カチオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルクロライド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルクロライド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルクロライド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ（ＤｉＬｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｎｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌｏｘｙ）−３−ジメチルアミノプロパン（Ｄｌｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（Ｄｌｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（Ｄｌｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｔｈｉｏ）−３−ジメチルアミノプロパン（Ｄｌｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ（ｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−３−ジメチルアミノプロパン（Ｄｌｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロライド塩（Ｄｌｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロライド塩（Ｄｌｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（Ｄｌｉｎ−ＭＰＺ）、または３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ（Ｄｉｏｌｅｙｌａｍｉｎｏ）−１，２−プロパンジオール（ＤｌｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏ）（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｏ）−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（Ｄｌｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌ）−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（Ｄｌｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、またはそれらの類似体、あるいはそれらの混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０モル％〜約６０モル％、または約４０モル％、５０モル％、５１モル％、５２モル％、５３モル％、５４モル％、５５モル％、５６モル％、５７モル％、５８モル％、５９モル％、または６０モル％からなり得る。
別の実施形態において、脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製するために、カチオン性脂質である、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（脂質Ａ）を使用することができる。２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（脂質Ａ）の合成については、２００８年１０月２３日出願の米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号に記載され、当該特許は、参照により本明細書に組み込まれる。
一実施形態において、脂質−ｓｉＲＮＡ粒子には、４０％の２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（脂質Ａ）、１０％ ＤＳＰＣ、４０％のコレステロール、１０％のＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（モルパーセント）が含まれ、粒径６３．０±２０ｎｍおよび０．０２７のｓｉＲＮＡ／脂質比である。
非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されない、アニオン性脂質または中性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、コレステロールが含まれる場合、粒子中に存在する総脂質の約５モル％〜約９０モル％、約１０モル％、または約５８モル％であり得る。幾つかの実施形態において、非カチオン性脂質は、約７モル％〜約８モル％、または７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０モル％である。
粒子の凝集を阻害する複合脂質（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｌｉｐｉｄ）は、例えば、制限されないが、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、またはそれらの混合物を含む、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質であり得る。ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体は、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃｉ８）であり得る。粒子の凝集を阻止する複合脂質は、粒子中に存在する総脂質の０モル％〜約２０モル％、または約２モル％であり得る。
幾つかの実施形態において、該核酸脂質粒子には、例えば、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％〜約６０モル％、または約４８モル％のコレステロールがさらに含まれる。
ＬＮＰ０１
一実施形態において、脂質様（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）ＮＤ９８−４ＨＣｌ（ＭＷ１４８７）（式１）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子（すなわち、ＬＮＰ０１粒子）を調製することができる。それぞれエタノール中の原液を、ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ；ＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６、１００ｍｇ／ｍｌのように調製することができる。次いで、ＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６の原液を、例えば、４２：４８：１０のモル比に混合することができる。この混合された脂質溶液は、最終エタノール濃度が約３５〜４５％、および最終酢酸ナトリウム濃度が約１００〜３００ｍＭになるように、（例えば、酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中の）ｓｉＲＮＡ水溶液と混合することができる。脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子は、典型的には、混合時に自然発生的に形成される。所望の粒径分布に依存して、得られたナノ粒子混合物は、例えば、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）等のサーモバレル押出機（ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ ｅｘｔｒｕｄｅｒ）を使用して、ポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通して押し出すことができる。場合によっては、押出ステップは割愛されてもよい。エタノール除去および同時の緩衝液交換は、例えば、透析または接線流濾過によって達成することができる。緩衝液は、例えば、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と交換することができる。
Figure 0005529142
ＬＮＰ０１製剤については、例えば、国際出願公開ＷＯ第２００８／０４２９７３号に記載されており、当該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
さらなる例示的な脂質−ｓｉＲＮＡ製剤は、以下の通りである。
Figure 0005529142
Figure 0005529142
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬、および浣腸（ただし、これらに限定されない）等の考えられる多くの剤形のうちのいずれかに製剤化することができる。また、本発明の組成物は、水性、疎水性、または混合媒体中の懸濁液として製剤化することもできる。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増加させる物質をさらに含有することができる。また、当該懸濁液は、安定剤も含有することができる。
エマルジョン
本発明の組成物は、エマルジョンとして調製および製剤化することができる。エマルジョンは、典型的には、１つの液体が、通常直径０．１μｍを超える液滴の形態の別の液体中に分散された多相系である（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５、Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５、Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１）。エマルジョンは、しばしば、互いに密接に混合および分散される、２つの非混合性の液相を含む二相系である。一般に、エマルジョンは、油中水（ｗ／ｏ）型または水中油（ｏ／ｗ）型のいずれかの種類であり得る。水相が、大部分を占める油相中に微細に分割されて、微小液滴として分散される場合、得られる組成物は、油中水（ｗ／ｏ）型エマルジョンと称される。あるいは、油相が、大部分を占める水相中に微細に分割されて、微小液滴として分散される場合、得られる組成物は、水中油（ｏ／ｗ）型エマルジョンと称される。エマルジョンは、分散相に加えてさらなる構成成分と、水相または油相のいずれか中の溶液として、またはそれ自体別個の相として存在し得る、活性薬物とを含有することができる。また、乳化剤、安定剤、染料、および抗酸化剤等の医薬用賦形剤が、必要に応じてエマルジョン中に存在してもよい。また、医薬用エマルジョンは、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）型および水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）型エマルジョンの場合等の、３つ以上の相を含む、多重エマルジョンであってもよい。このような複合製剤は、しばしば、単純な二元エマルジョンが提供しない、特定の利点を提供する。ｏ／ｗ型エマルジョンの個々の油滴が小さな水滴を囲む多重エマルジョンは、ｗ／ｏ／ｗ型エマルジョンを構成する。同様に、油の連続相中で安定化された水の小球内に囲まれた油滴の系は、ｏ／ｗ／ｏ型エマルジョンを形成する。
エマルジョンは、熱力学的安定性によってほとんどまたは全く特徴づけられない。しばしば、エマルジョンの分散相または不連続相が、外相または連続相中に良好に分散され、乳化剤の手段または製剤の粘度によってこの形態が維持される。エマルジョンの相のいずれも、エマルジョン型軟膏基剤およびクリームの場合のように、半固体または固体であり得る。エマルジョンを安定化する他の手段は、エマルジョンのどちらの相にも取り込むことができる乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、大きく、合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収基剤、および微細に分散された固体の４つのカテゴリーに分類することができる（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
合成界面活性剤は、表面活性剤としても知られ、エマルジョン製剤における広範な適用性が見出されており、文献で概評されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。界面活性剤は、典型的には両親媒性であり、親水性および疎水性の部分を含む。界面活性剤の、親水性の疎水性に対する比率は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称されており、製剤の調製時の界面活性剤の分類および選択における、貴重なツールである。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性の異なるクラスに分類することができる（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５）。
エマルジョン製剤に使用される天然に存在する乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、フォスファチド類、レシチン、およびアカシアが含まれる。吸収基剤は、水を吸収してｗ／ｏ型エマルジョンを形成するが、依然として無水ラノリンおよび親水性ペトロラタム等のそれらの半固体の稠度を保持することができる、親水性を有する。微細に分割された固体も、特に界面活性剤と組み合わせて、また粘性の調製物中で、良好な乳化剤として使用されている。これらには、極性の無機固体、例えば、重金属水酸化物、非膨張性粘土、例えば、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド性ケイ酸アルミニウムおよびコロイド性ケイ酸アルミニウムマグネシウム、顔料、ならびに非極性固体、例えば、炭素もしくはトリステアリン酸グリセリルが含まれる。
また、多岐にわたる非乳化材料もエマルジョン製剤に含まれ、エマルジョンの性質に寄与する。これらには、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、防腐剤、および抗酸化剤が含まれる（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
親水性コロイドつまり親水コロイドには、多糖類（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲニン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）等の、天然に存在するガムおよび合成ポリマーが含まれる。これらは、水中で分散または膨張して、分散相の液滴の周りに強い界面薄膜を形成し、外相の粘度を増加させることによってエマルジョンを安定化させる、コロイド溶液を形成する。
エマルジョンは、しばしば、微生物の増殖を容易に支持することができる炭水化物、タンパク質、ステロール、およびフォスファチド等のいくつかの成分を含有するため、これらの製剤には、しばしば防腐剤が組み込まれる。エマルジョン製剤に含まれる一般的に使用される防腐剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が含まれる。また、製剤の劣化を阻止するために、抗酸化剤も一般的にエマルジョン製剤に添加される。使用される抗酸化剤は、フリーラジカルスカベンジャー、例えば、トコフェロール、アルキルガレート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、または還元剤、例えば、アスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウム、ならびに抗酸化剤シナージスト、例えば、クエン酸、酒石酸、およびレシチンであり得る。
外皮、経口、および非経口経路を介するエマルジョン製剤の適用、ならびにそれらを製造するための方法は、文献で概評されている（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。経口送達用のエマルジョン製剤は、製剤化の容易さ、ならびに吸収および生物学的利用能の見地からの有効性から、非常に広範に使用されている（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。鉱油基材の緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養調製物が、ｏ／ｗ型エマルジョンとして一般的に経口投与されている材料に含まれる。
本発明の一実施形態において、ｄｓＲＮＡおよび核酸の組成物が、マイクロエマルジョンとして製剤化される。マイクロエマルジョンは、水、油、および単一の、光学的に等方性かつ熱力学的に安定な液体溶液である両親媒性物質の系として定義することができる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。典型的には、マイクロエマルジョンは、まず油を界面活性剤水溶液中に分散し、次に十分な量の第４の構成成分、一般には中間鎖長のアルコールを添加して透明な系を形成することによって調製される、系である。したがって、マイクロエマルジョンは、表面活性分子の界面薄膜によって安定化される、２つの非混和液の熱力学的に安定で等方的な、透明の分散物質としても記載されている（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，ｉｎ： Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ： Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ １８５−２１５）。マイクロエマルジョンは、一般的に、油、水、界面活性剤、共界面活性剤、および電解質を含む、３〜５つの構成成分の組み合わせを通じて調製される。マイクロエマルジョンが油中水（ｗ／ｏ）型、または水中油（ｏ／ｗ）型であるかは、使用される油および界面活性剤の性質、ならびに界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的な充填に依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
相図を利用する現象論的手法が広範に研究されており、マイクロエマルジョンを製剤化する方法についての包括的な知識を当業者にもたらしている（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５、Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５）。従来のエマルジョンと比較して、マイクロエマルジョンは、自然発生的に形成される熱力学的に安定な液滴の製剤において、不水溶性薬物を可溶化する利点を提供する。
マイクロエマルジョンの調製に使用される界面活性剤には、単独、または共界面活性剤と組み合わせた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセクイオレエート（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）が含まれるが、これらに限定されない。共界面活性剤は、通常、エタノール、１−プロパノール、および１−ブタノール等の短鎖アルコールであるが、界面活性剤の薄膜中に浸透し、その結果、界面活性剤分子の間に生成される空隙のために不規則な薄膜を作製することによって、界面流動性を増加させる役目を果たす。しかしながら、マイクロエマルジョンは、共界面活性剤の使用を伴わずに調製することができ、アルコールを含まない自己乳化型のマイクロエマルジョン系が、当該技術分野において既知である。水相は、典型的には、水、該薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得るが、これらに限定されない。油相には、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）のモノ、ジ、およびトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油、ならびにシリコーンオイル等の材料が含まれ得るが、これらに限定されない。
マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化および薬物吸収の亢進の見地から、特に興味深い。ペプチドを含む薬物の経口での生物学的利用能を亢進させるために、脂質基剤のマイクロエマルジョン（ｏ／ｗ型およびｗ／ｏ型の両方）が提案されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５）。マイクロエマルジョンは、改善された薬物の可溶化、酵素的加水分解からの薬物の保護、界面活性剤が誘発する膜流動性および透過性の変化による薬物吸収の潜在的な亢進、調製の容易さ、固形剤形より優れた経口投与の容易さ、改善された臨床的効力、および低減した毒性の利点を提供する（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５、Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３）。しばしば、マイクロエマルジョンは、その構成成分が周囲温度で引き合わされると、自然発生的に形成され得る。これは、熱不安定性の薬物、ペプチド、またはｄｓＲＮＡを製剤化する際に特に有利であり得る。また、マイクロエマルジョンは、化粧用途および医薬用途の双方における活性構成成分の経皮送達に効果的である。本発明のマイクロエマルジョン組成物および製剤は、消化管からのｄｓＲＮＡおよび核酸の向上された体内吸収を促進し、ｄｓＲＮＡおよび核酸の局所的な細胞取り込みを改善することが予想される。
また、本発明のマイクロエマルジョンは、製剤の特性を改善し、本発明のｄｓＲＮＡおよび核酸の吸収を亢進させるための、モノステアリン酸ソルビタン（Ｇｒｉｌｌ ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透促進剤等のさらなる構成成分および添加剤を含有することができる。本発明のマイクロエマルジョンに使用される浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤の、５つの大きなカテゴリーのうちの１つに属するものとして分類することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらのクラスのそれぞれが、上述されている。
浸透促進剤
一実施形態において、本発明は、核酸、特にｄｓＲＮＡの、動物の皮膚への効率的な送達を達成させるために、種々の浸透促進剤を用いる。ほとんどの薬物は、イオン化および非イオン化の両方の形態で溶液中に存在する。しかしながら、通常脂溶性または親油性の薬物のみが、容易に細胞膜を通過する。通過される膜が浸透促進剤で処理されている場合、非親油性薬物でさえも、細胞膜を通過し得ることが発見されている。非親油性薬物の細胞膜を通過する拡散の補助に加えて、浸透促進剤は、親油性薬物の透過性も亢進する。
浸透促進剤は、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤の、５つの大きなカテゴリーのうちの１つに属するものとして分類することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。浸透促進剤の前述のクラスのそれぞれについて、以下により詳細に記載する。
界面活性剤：本発明に関連して、界面活性剤（または「表面活性剤」）とは、水溶液中に溶解されると、溶液の表面張力または該水溶液と別の液体との間の界面張力を減少させ、粘膜を通るｄｓＲＮＡの吸収が亢進されるという結果をもたらす、化学物質である。胆汁塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）、ならびにＦＣ−４３等のペルフルオロ化合物エマルジョンが含まれる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）。
脂肪酸：浸透促進剤として作用する種々の脂肪酸およびそれらの誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１−１０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル、およびｔ−ブチル）、ならびにそれらのモノおよびジ−グリセリド（すなわち、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノール酸塩等）が含まれる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｙｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３、Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４）。
胆汁塩：胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が含まれる（Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ： Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５）。種々の天然胆汁塩、およびそれらの合成誘導体は、浸透促進剤として作用する。したがって、「胆汁塩」という用語には、胆汁の天然に存在する構成成分のうちのどの構成成分も、ならびにそれらの合成誘導体のうちのどの合成誘導体も含まれる。好適な胆汁塩には、例えば、コール酸（もしくはその医薬上許容されるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｕｃｈｏｌａｔｅ））、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が含まれる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ： Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ ７８２−７８３、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５、Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３）。
キレート剤：本発明に関連して使用されるキレート剤は、金属イオンとの複合体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、粘膜を通るｄｓＲＮＡの吸収の亢進という結果をもたらす化合物として、定義することができる。本発明における浸透促進剤としての使用に関して、ほとんどの特徴づけられたＤＮＡヌクレアーゼは触媒作用に二価金属イオンを必要とすることから、キレート剤によって阻害されるため、キレート剤は、ＤＮアーゼ阻害剤としても機能するさらなる利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５−３３９）。好適なキレート剤には、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸塩、およびホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、およびベータ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が含まれるが、これらに限定されない（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３、Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１）。
非キレート非界面活性剤： 本明細書で使用される、非キレート非界面活性剤の浸透促進化合物は、キレート剤または界面活性剤としてわずかな活性を示すが、それにもかかわらず消化器粘膜を通じてのｄｓＲＮＡの吸収を亢進する化合物として、定義することができる（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３）。このクラスの浸透促進剤には、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２）、ならびにジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾン等の非ステロイド性抗炎症薬（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）が含まれる。
また、細胞レベルでのｄｓＲＮＡの取り込みを亢進させる薬剤も、本発明の医薬用および他の組成物に添加することができる。また、例えば、カチオン性脂質、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｊｕｎｉｃｈｉら、米国特許第５，７０５，１８８号）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリカチオン性分子、例えばポリリジン（Ｌｏｌｌｏら、ＰＣＴ出願ＷＯ第９７／３０７３１号）も、ｄｓＲＮＡの細胞取り込みを亢進させることが知られている。
グリコール、例えば、エチレングリコールおよびプロピレングリコール、ピロール、例えば、２−ピロール、アゾン、ならびにテルペン、例えば、リモネンおよびメントンを含む他の薬剤を利用して、投与される核酸の浸透を亢進させてもよい。
担体
また、本発明の特定の組成物に、製剤中に担体化合物が組み込まれる。本明細書で使用される、「担体化合物」または「担体」は、不活性（すなわち、それ自体生物活性を有さない）であるが、例えば、生物活性のある核酸の分解、または循環からのその除去の促進によって、生物活性を有する核酸の生物学的利用能を減少させるインビボ過程によって、核酸として認識される、核酸、またはその類似体を指すことができる。核酸と担体化合物との同時投与は、典型的には後者の物質を過剰に伴い、おそらく共通の受容体に対する担体化合物と核酸との間の競合により、肝臓、腎臓、または他の循環外の貯蔵所で回収される核酸の量の著しい減少をもたらし得る。例えば、肝組織中の部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、それがポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、または４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と同時投与される場合、減少され得る（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１、Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３）。
賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬用担体」または「賦形剤」は、１つもしくは複数の核酸を動物に送達するための、医薬上許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性な媒体である。賦形剤は液体または固体であり得、核酸および所定の医薬組成物の他の構成成分と組み合わされた時に、所望の用量、軟度等を提供するように、計画された投与の様態を念頭において選択される。典型的な医薬用担体には、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、またはリン酸水素カルシウム等）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム等）、ならびに湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）が含まれるが、これらに限定されない。
また、核酸と有害に反応しない、経口（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）投与に好適な医薬上許容される有機または無機賦形剤を、本発明の組成物を製剤化するために使用することができる。好適な医薬上許容される担体には、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これらに限定されない。
核酸の局所投与用の製剤には、滅菌および非滅菌水溶液、アルコール等の一般的な溶媒中の非水溶液、または液体もしくは固形の油基剤中の核酸の溶液が含まれ得る。該溶液は、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る。核酸と有害に反応しない、経口（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）投与に好適な医薬上許容される有機または無機賦形剤を使用することができる。
好適な医薬上許容される賦形剤には、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これらに限定されない。
他の構成成分
本発明の組成物は、医薬組成物中に従来認められる他の補助的な構成成分を、それらの当該技術分野において確立された使用量レベルで、さらに含有することができる。したがって、例えば、本組成物は、さらに、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬、または抗炎症薬等の、適合性の、薬剤として活性な材料を含有してもよく、あるいは、染料、香味剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤等の、本発明の組成物の種々の剤形に物理的に製剤化するために有用な、さらなる材料を含有してもよい。しかし、かかる材料は、添加された時に、本発明の組成物の構成成分の生物活性を過度に妨げないべきである。該製剤を滅菌し、所望される場合、補助的な薬剤、例えば、該製剤の１つまたは複数の核酸と有害に相互作用しない潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝液、着色物質、香味物質、および／または芳香物質等と混合してもよい。
水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有することができる。また、当該懸濁液は、安定剤も含有することができる。
幾つかの実施形態において、本発明で取り上げられる医薬組成物には、（ａ）１つもしくは複数のｄｓＲＮＡ化合物および（ｂ）非ＲＮＡｉ機序によって機能する、１つもしくは複数の抗サイトカイン生物剤が含まれる。かかる生物学の例には、ＩＬ１β（例えばアナキンラ）、ＩＬ６（トシリズマブ）、またはＴＮＦ（エタネルセプト、インフリキシマブ、アドリムマブ、もしくはセルトリズマブ）を標的とする生物製剤が含まれる。
幾つかの実施形態において、本発明で取り上げられる医薬組成物には、非ＲＮＡｉ機序によって機能する、（ａ）１つもしくは複数のｄｓＲＮＡ化合物および（ｂ）１つもしくは複数の他の化学療法剤が含まれる。かかる化学療法剤の例には、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マフォスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロソウレア（ｂｉｓ−ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソウレア（ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホルアミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦｕｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲンシタビン、テニポシド、シスプラチン、およびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）等が含まれるが、これらに限定されない。一般に、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５ｔｈ Ｅｄ．１９８７，ｐｐ．１２０６−１２２８，Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．を参照されたい。本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡと共に使用する場合、かかる化学療法剤は、単独に（例えば、５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド）、別個に（例えば、一定期間、５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド、次いで、ＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド）、または１つもしくは複数の他のかかる化学療法剤（例えば、５−ＦＵ、ＭＴＸ、およびオリゴヌクレオチド、または５−ＦＵ、放射線治療およびオリゴヌクレオチド）と併用して、使用され得る。非ステロイド系抗炎症薬およびコルチコステロイドが含まれるが、これらに限定されない抗炎症薬、ならびにリビビリン、ビダラビン、アシクロビル、およびガンシクロビルが含まれるが、これらに限定されない抗ウイルス薬はまた、本発明で取り上げられる組成物とも併用され得る。一般に、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５ｔｈ Ｅｄ．，Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐａｇｅｓ２４９９−２５０６および４６−４９のそれぞれを参照されたい。他の非ＲＮＡｉ化学療法剤はまた、本発明の範囲内である。２つ以上の併用した化合物は、一緒に、または連続的に使用され得る。
かかる化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）、およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な医薬的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を呈する化合物が好ましい。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のためのさまざまの投薬量の製剤に使用することができる。本発明で取り上げられる組成物の投薬量は、一般に、ほとんどまたは全く毒性のないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。この投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存して、この範囲内で異なってもよい。本発明で取り上げられる方法において使用されるどんな化合物についても、治療上有効な用量は、まず細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養において決定される、ＩＣ５０（すなわち、症状の半値阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物、または適切な場合は、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲（例えば、該ポリペプチドの濃度の低下を達成する）を達成するように、調整することができる。かかる情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
それらの投与に加えて、上述のように、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、ＳＡＡの発現によって媒介される病理過程の治療に効果的な他の既知の薬剤と併用して投与することができる。いずれの場合においても、投与する医師は、当該技術分野において既知であるか、または本明細書に記載される、標準的な有効性の測定値を使用して得られた結果に基づいて、ｄｓＲＮＡ投与の量およびタイミングを調整することができる。
ＳＡＡ遺伝子の発現によって引き起こされる疾患を治療するための方法
本発明は、特に、ＳＡＡを標的とするｄｓＲＮＡ、およびＳＡＡ媒介性障害もしくは疾患の治療のための少なくとも１つのかかるｄｓＲＮＡを含有する組成物の使用に関する。例えば、ＳＡＡ遺伝子、例えば、ＳＡＡ１およびＳＡＡ２のうちの１つまたは両方を標的とするｄｓＲＮＡは、関節炎（例えば、関節リウマチ）、または組織傷害、反応性（続発性）アミロイドーシスもしくは全身性アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、またはアルツハイマー病等の炎症と関連する疾患の治療のために有用であり得る。
ＳＡＡ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡはまた、慢性炎症性疾患、慢性感染症、および新生組織形成等の症状および障害の治療にも使用される。かかる障害は、しばしばアミロイドーシスと関連する。慢性炎症性疾患の例には、関節リウマチ、乾癬性関節炎、慢性若年性関節炎、強直性脊椎炎、ベーチェット症候群、ライター症候群、成人スティル病、炎症性腸疾患（例えば、クローン病）、および家族性地中海熱等の遺伝性周期性発熱が含まれる。アミロイドーシスと関連し、ＳＡＡのｄｓＲＮＡによる治療に適している慢性感染症の例には、結核、骨髄炎、気管支拡張症、ハンセン病、腎盂腎炎、褥瘡性潰瘍、ウィップル病、集簇性座瘡、一般変異型免疫不全症 低／無ガンマグロブリン血症、嚢胞性線維症が含まれる。アミロイドーシスと関連し、ＳＡＡのｄｓＲＮＡによる治療に適している新生組織形成の例には、肝臓癌、腎臓癌、キャッスルマン病、ホジキン病、成人有毛細胞白血病、およびワルデンストローム病が含まれる。
一実施形態において、ＳＡＡ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡは、タンパク尿／腎不全、下痢／便秘／吸収不良、甲状腺腫、神経障害／手根管症候群、肝腫大、リンパ節腫脹症、心臓病等の臨床的障害を治療するために使用される。これらの障害は、しばしば、アミロイドーシスに罹患している患者に見られる。
ＳＡＡ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡはまた、結腸癌等の癌等の増殖性障害を治療するために使用することもできる。また、ＳＡＡ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含有する組成物は、胸部、卵巣、頸部、腎臓、または扁平上皮細胞の癌腫を治療するためにも使用される。
また、ＳＡＡ、例えば、ＳＡＡ１もしくはＳＡＡ２のうちの１つ、または両方を標的とするｄｓＲＮＡを含有する組成物は、乳癌、肺癌、頭頸部癌、脳癌、腹部癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、消化管癌、舌癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮頸癌（例えば、頸部の扁平上皮癌）、リンパ系腫瘍、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫等の他の腫瘍および癌の治療、黒色腫のような皮膚癌の治療、ならびにリンパ腫および血液癌の治療にも使用することができる。本明細書で取り上げられる組成物は、脳および脊椎の腫瘍を治療するために使用することができる。
ＳＡＡを標的とするｄｓＲＮＡは、増殖性障害または分化障害を治療するために使用され得る。細胞増殖および／または分化障害の例には、癌、例えば、上皮癌、肉腫、転移性障害、または造血腫瘍性障害、例えば、白血病が含まれる。転移性腫瘍は、前立腺、結腸、肺、***、および肝臓由来のそれを含む、複数の原発腫瘍型に起因することがあり得る。本明細書で使用される、「癌」、「高増殖性」、および「腫瘍性」という用語は、自律的成長、すなわち急速に増殖する細胞成長を特徴とする条件の異常な状態のための能力を有する細胞を指す。これらの用語は、組織病理学的タイプまたは侵襲性の段階にかかわりなく、全てのタイプの癌成長または発癌過程、転移性組織、または悪性形質転換細胞、組織、または器官を含むことを意味する。また、増殖性障害には、造血由来の、例えば、骨髄、リンパ球、または赤血球系列、またはその前駆細胞に起因する、過形成／腫瘍性細胞を伴う疾患を含む、造血腫瘍性障害も含まれる。
ＳＡＡの発現に対する阻害効果により、本発明に従う組成物またはそこから調製される医薬組成物は、生活の質を向上させることができる。
本発明は、さらに、例えば、この障害を治療するために現在用いられているもの等の、他の医薬品および／または他の治療方法、例えば、既知の医薬品および／または既知の治療方法と併用して、例えば、アミロイドーシスを治療するための、ｄｓＲＮＡまたはその医薬組成物の使用に関する。一例では、ＳＡＡを標的とするｄｓＲＮＡは、抗ＩＬ１β剤（例えば、アナキンラ）、ＩＬ６剤（例えば、トシリズマブ）、またはＴＮＦα剤（例えば、エタネルセプト、インフリキシマブ、アドリムマブ、もしくはセルトリズマブ）等の抗サイトカイン剤と併用投与することができる。他の例では、ＳＡＡを標的とするｄｓＲＮＡは、リツキサン（リツキシマブ）、エプロディセート（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、Ｃａｎａｄａ）と併用投与することができる。さらに別の例では、ＳＡＡを標的とするｄｓＲＮＡは、例えば、慢性炎症性関節炎を抑制するために、ステロイドまたはメトトレキサートと併用投与することができる。他の例では、ＳＡＡを標的とするｄｓＲＮＡは、例えば、腎機能の管理のために、利尿薬、ＡＣＥ阻害剤、またはＡＲＢと併用投与することができる。
本発明は、さらに、例えば、これらの障害を治療するために現在用いられているもの等の、他の医薬品および／または他の治療方法、例えば、既知の医薬品および／または既知の治療方法と併用して、例えば、癌を治療するための、ｄｓＲＮＡまたはその医薬組成物の使用に関する。一例では、ＳＡＡを標的とするｄｓＲＮＡの投与は、テモゾロマイド、デオキシコホルマイシン、シスプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、タモキシフェン アウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マフォスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロソウレア（ｂｉｓ−ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソウレア（ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホルアミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦｕｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲンシタビン、テニポシド、シスプラチン、およびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）等の化学療法剤と併用投与することができる。一般に、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５ｔｈ Ｅｄ．１９８７，ｐｐ．１２０６−１２２８，Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊを参照されたい。本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡと共に使用する場合、かかる化学療法剤は、単独に、別個に（例えば、一定期間、ｄｓＲＮＡ、次いで、化学療法）、または１つもしくは複数の他のかかる薬剤（例えば、化学療法およびｄｓＲＮＡ）と併用して、使用され得る。２つ以上の併用した化合物は、一緒に、または連続的に使用され得る。
ｄｓＲＮＡおよびさらなる治療薬は、同様の併用で、例えば、非経口で投与することができるか、またはさらなる治療薬は、別個の組成物の一部として、または本明細書に記載の別の方法によって投与することができる。
また、ＳＡＡを標的とするｄｓＲＮＡによる治療は、結腸癌または上皮癌等の癌の治療のための、放射線療法と併用して行うこともできる。本明細書で取り上げられるｄｓＲＮＡは、癌を治療する（例えば、腫瘍、または悪性細胞または細胞集団を摘出する）ための外科手術前後、投与され得る。
本発明は、ＡＡアミロイドーシス等のＳＡＡの発現によって媒介される疾患または障害を有する患者に、ＳＡＡを標的とするｄｓＲＮＡを投与する方法を取り上げる。該ｄｓＲＮＡの投与は、例えば、ＡＡアミロイドーシスに罹患している患者において、腎機能を安定させ、向上させることができる。患者は、治療量のｄｓＲＮＡ、例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、または２．５ｍｇ／ｋｇ等のｄｓＲＮＡを投与することができる。該ｄｓＲＮＡは、一定期間、例えば、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、または２５分間にわたって投与することができる。例えば、定期的に、例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、またはそれ以上の期間、隔週で（すなわち、２週間ごとに）、反復投与される。初期治療レジメン後、該治療は、より低い頻度で、投与することができる。例えば、隔週で３ヶ月間、投与した後、６ヶ月間、またはそれ以上の期間、１ヶ月に１回、反復投与することができる。該ｄｓＲＮＡの投与は、患者における血清ＳＡＡレベルを、少なくとも２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％軽減することができる。
総量の該ｄｓＲＮＡを投与する前に、患者に、５％ 注入反応等の少量の用量を投与し、患者のアレルギー反応または肝機能の変化等の副作用を監視することができる。例えば、肝機能の変化に対して監視される患者において、ＬＦＴ（肝機能検査）の変化の低い発生率（例えば、ＬＦＴの１０〜２０％発生率）は、許容される（例えば、可逆的な、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）および／またはＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）レベルの３倍の増加）。
ＳＡＡ遺伝子の発現を阻害するための方法
さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物における、ＳＡＡ遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。該方法は、標的ＳＡＡ遺伝子（例えば、ＳＡＡ１およびＳＡＡ２のうちの１つまたは両方）の発現が停止される（ｓｉｌｅｎｃｅｄ）ように、本発明で取り上げられる組成物を該哺乳動物に投与することを含む。
治療される生物がヒト等の哺乳動物である場合、本組成物は、頭蓋内（例えば脳室内、脳実質内、およびくも膜下腔）、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（噴霧剤）、経鼻、直腸、ならびに局所（口腔および舌下を含む）投与を含む、経口または非経口の経路を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において既知の任意の手段によって投与することができる。ある実施形態において、本組成物は、静脈内注入もしくは注射によって投与される。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野における当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡおよび方法の実践または試験に際して、本明細書に記載されるものと同様または等価の方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含み、本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および例は例示に過ぎず、限定するものではない。
実施例１．ｄｓＲＮＡ合成
試薬の供給源
試薬の供給源が本明細書に具体的に与えられていない場合、かかる試薬は、分子生物学の用途に標準的な質／純度で、分子生物学用の試薬の任意の供給業者から得ることができる。
ｓｉＲＮＡ合成
Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐｐｌｅｒａ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および固体支持体として制御細孔ガラス（ＣＰＧ、５００Å、Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用して、１μモルの規模で固相合成によって単鎖ＲＮＡを生成する。ＲＮＡおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有するＲＮＡを、対応するホスホラミダイトおよび２’−Ｏ−メチルホスホラミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））をそれぞれ用いて、固相合成によって生成する。これらの構成要素を、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるような、標準的なヌクレオシドホスホラミダイト化学反応を用いて、オリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択された部位に組み込む。ヨウ素酸化剤溶液を、アセトニトリル（１％）中のＢｅａｕｃａｇｅ試薬（Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ Ｌｔｄ（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ））の溶液と置き換えて、ホスホロチオエート結合を導入する。さらなる補助試薬をＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ（Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手する。
確立された手順に従い、陰イオン交換ＨＰＬＣによって、粗オリゴリボヌクレオチドの脱保護および精製を行う。収率および濃度を、分光光度計（ＤＵ ６４０Ｂ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧｍｂＨ（Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉβｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用した、２６０ｎｍの波長でのそれぞれのＲＮＡの溶液のＵＶ吸収によって決定する。アニーリング緩衝液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ 塩化ナトリウム）中で相補鎖の等モル溶液を混合し、３分間８５〜９０℃の水浴中で加温し、３〜４時間かけて室温に冷却することによって、二本鎖ＲＮＡを生成する。このアニールされたＲＮＡ溶液は、使用するまで−２０℃で保管する。
３’−コレステロールで結合した（−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ｓｉＲＮＡ（本明細書で−Ｃｈｏｌ−３’と称される）の合成には、ＲＮＡ合成のために適切に修飾された固体支持体が使用される。修飾された固体支持体は、以下のように調製する。
ジエチル−２−アザブタン−１，４−ジカルボキシレートＡＡ
Figure 0005529142
水酸化ナトリウムの４．７Ｍの水溶液（５０ｍＬ）を、水（５０ｍＬ）中のグリシンエチル塩酸塩（３２．１９ｇ、０．２３モル）の、撹拌して氷冷した溶液に添加する。次いで、エチルアクリレート（２３．１ｇ、０．２３モル）を添加し、混合物を、反応の完了がＴＬＣによって確認されるまで、室温で撹拌する。１９時間後、該溶液をジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で分割する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させる。残渣を蒸留して、ＡＡ（２８．８ｇ、６１％）を得る。
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ
Figure 0005529142
Ｆｍｏｃ−６−アミノ−ヘキサン酸（９．１２ｇ、２５．８３ミリモル）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、氷冷する。ジイソプロピルカルボジイミド（３．２５ｇ、３．９９ｍＬ、２５．８３ミリモル）を該溶液に０℃で添加する。その後、ジエチル−アザブタン−１，４−ジカルボキシレート（５ｇ、２４．６ミリモル）、およびジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇ、２．５ミリモル）を添加する。該溶液が室温になるようにし、さらに６時間撹拌する。反応の完了をＴＬＣで確認する。反応混合物を真空下で濃縮し、酢酸エチルを添加して、ジイソプロピル尿素を沈殿させる。この懸濁液を濾過する。濾液を５％塩酸水溶液、５％飽和重炭酸ナトリウム、および水で洗浄する。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させて濃縮し、粗生成物を得て、カラムクロマトグラフィー（５０％ ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）で精製し、１１．８７ｇ（８８％）のＡＢを得る。
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣ
Figure 0005529142
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ（１１．５ｇ、２１．３ミリモル）を、０℃のジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンに溶解する。この溶液を１時間撹拌し続ける。反応混合物を真空下で濃縮し、残渣に水を添加し、酢酸エチルで生成物を抽出する。この粗生成物をその塩酸塩に変換することによって精製する。
３−（｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル−アミノ）−プロピオン酸エチルエステルＡＤ
Figure 0005529142
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣ（４．７ｇ、１４．８ミリモル）の塩酸塩をジクロロメタンに取り込む。この懸濁液を氷上で０℃に冷却する。この懸濁液にジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ、５．２ｍＬ、３０ミリモル）を添加する。得られた溶液に、コレステリルクロロホルメート（６．６７５ｇ、１４．８ミリモル）を添加する。反応混合物を終夜撹拌する。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸で洗浄する。生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製する（１０．３ｇ、９２％）。
１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−４−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステルＡＥ
Figure 0005529142
カリウムｔ−ブトキシド（１．１ｇ、９．８ミリモル）を３０ｍＬの乾燥トルエンでスラリーにした。この混合物を氷上で０℃に冷却し、５ｇ（６．６ミリモル）のジエステルＡＤを２０分以内のうちに、撹拌しながらゆっくりと添加する。この添加の間、温度は５℃未満に維持する。撹拌を０℃で３０分間継続し、１ｍＬの氷酢酸、その直後に４０ｍＬの水中の４ｇのＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏを添加する。得られた混合物を２回、それぞれ１００ｍＬのジクロロメタンで抽出し、合わせた有機抽出物を２回、それぞれ１０ｍＬのリン酸緩衝液で洗浄し、乾燥させ、蒸発乾固させる。残渣を６０ｍＬのトルエンに溶解し、０℃に冷却し、５０ｍＬの３つの部分の冷たいｐＨ９．５の炭酸塩緩衝液で抽出する。この水性抽出液をリン酸でｐＨ３に調整し、４０ｍＬの５つの部分のクロロホルムで抽出し、合わせて乾燥させ、蒸発乾固させる。残渣を２５％酢酸エチル／ヘキサンを使用して、カラムクロマトグラフィーで精製し、１．９ｇのｂ−ケトエステルを得る（３９％）。
［６−（３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン−１−イル）−６−オキソ−ヘキシル］−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステルＡＦ
Figure 0005529142
メタノール（２ｍＬ）を、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中のｂ−ケトエステルＡＥ（１．５ｇ、２．２ミリモル）と水素化ホウ素ナトリウム（０．２２６ｇ、６ミリモル）との還流混合物に、１時間かけて滴下する。撹拌を還流温度で１時間継続する。室温に冷却後、１Ｎ ＨＣｌ（１２．５ｍＬ）を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出する（３×４０ｍＬ）。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下で濃縮して生成物を得て、カラムクロマトグラフィー（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）で精製する（８９％）。
（６−｛３−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル｝−６−オキソ−ヘキシル）−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステル
ＡＧ
Figure 0005529142
ジオールＡＦ（１．２５ｇ、１．９９４ミリモル）を、真空内でピリジン（２×５ｍＬ）を用いて蒸発乾固する。無水ピリジン（１０ｍＬ）および４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（０．７２４ｇ、２．１３ミリモル）を撹拌しながら添加する。この反応は、終夜室温で行う。メタノールを添加してこの反応を停止させる。反応混合物を真空下で濃縮し、残渣にジクロロメタン（５０ｍＬ）を添加する。この有機層を１Ｍの飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮する。トルエンと蒸発させて残渣のピリジンを除去する。この粗生成物をカラムクロマトグラフィー（２％ ＭｅＯＨ／クロロホルム、５％ ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３中Ｒｆ＝０．５）で精製する（１．７５ｇ、９５％）。
コハク酸モノ−（４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈシクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−ピロリジン−３−イル）エステルＡＨ
Figure 0005529142
化合物ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ミリモル）を無水コハク酸（０．１５０ｇ、１．５ミリモル）およびＤＭＡＰ（０．０７３ｇ、０．６ミリモル）と混合し、終夜４０℃の真空内で乾燥させる。該混合物を無水ジクロロエタン（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３１８ｇ、０．４４０ｍＬ、３．１５ミリモル）を添加し、この溶液をアルゴン雰囲気下で１６時間、室温で撹拌する。次いで、これをジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、氷冷クエン酸水溶液（５重量％、３０ｍＬ）および水（２×２０ｍＬ）で洗浄する。該有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮乾固する。残渣をそのまま次のステップに使用する。
コレステロール誘導体化ＣＰＧ ＡＩ
Figure 0005529142
コハク酸ＡＨ（０．２５４ｇ、０．２４２ミリモル）を、ジクロロメタン／アセトニトリル（３：２、３ｍＬ）の混合物に溶解する。その溶液に、アセトニトリル（１．２５ｍＬ）中のＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ、０．２４２ミリモル）、アセトニトリル／ジクロロエタン（３：１、１．２５ｍＬ）中の２，２’−ジチオ−ビス（５−ニトロピリジン）（０．０７５ｇ、０．２４２ミリモル）を連続して添加する。得られた溶液に、アセトニトリル（０．６ｍＬ）中のトリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ、０．２４２ミリモル）を添加する。反応混合物の色が鮮やかな橙色に変わった。この溶液を、手首動作式振盪機（ｗｒｉｓｔ−ａｃｔｉｏｎ ｓｈａｋｅｒ）を使用してほんの少しの間撹拌する（５分）。長鎖アルキルアミン−ＣＰＧ（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）（１．５ｇ、６１ｍＭ）を添加する。この懸濁液を２時間撹拌する。焼結漏斗を通してＣＰＧを濾過し、アセトニトリル、ジクロロメタン、およびエーテルで連続して洗浄する。無水酢酸／ピリジンを使用して未反応のアミノ基を遮蔽する。達成されたＣＰＧの装填を、ＵＶ測定値を取ることによって測定する（３７ｍＭ／ｇ）。
５’−１２−ドデカン酸ビスデシルアミド（ｂｉｓｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ）基（本明細書で「５’−Ｃ３２−」と称される）または５’−コレステリル誘導体基（本明細書で「５’−Ｃｈｏｌ−」と称される）を担持するｓｉＲＮＡの合成は、コレステリル誘導体について、酸化ステップが、核酸オリゴマーの５’末端にホスホロチオエート結合を導入するために、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬を使用して行われることを除いて、国際公開ＷＯ第２００４／０６５６０１号に記載されるように行う。
核酸配列を、標準的なヌクレオチド命名法、具体的には、表１の略語を使用して、以下に示す。
Figure 0005529142
Figure 0005529142
実施例２．ｓｉＲＮＡ設計
ｓｉＲＮＡ設計は、ＳＡＡ１およびＳＡＡ２を標的とするｓｉＲＮＡを同定するように行われた。該設計は、ＳＡＡ１の転写物、ＮＭ＿０００３３１．３（ヒト）、ＮＭ＿００９１１７．３（マウス）、およびカニクイザルからの完全長に近い、単一のＳＡＡ様トレースｃＤＮＡ配列、Ｍｆａ＃Ｓ２７７９５０７６（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））を使用した。ｓｉＲＮＡを設計するのに使用されたＳＡＡ２の転写物は、ＮＭ＿０３０７５４．２（ヒト）およびＮＭ＿０１１３１４．１（マウス）を含んだ。
ＳＡＡ１およびＳＡＡ２遺伝子の両方に１００％同一性がある、ｓｉＲＮＡ二重鎖を設計した。ヒトおよびマウス、ヒトおよびカニクイザル、ならびにヒト−カニクイザルとの交差反応性の幾つかのセットを設計した。
全ての可能な１９量体を、それぞれの配列から作製した。ヒト−マウス、ヒト−カニクイザル、およびヒト−カニクイザル−マウスのサブセットを、ＰｙｔｈｏｎスクリプトｐｏｌｙＦａｓｔａＴｏＮｍｅｒ．ｐｙを用いて、それぞれの種から同一の１９量体を検索することによって作製した。２５４個のヒトセンス１９量体のｓｉＲＮＡがあった。これらの２５４個のうち、２１個は、ヒトおよびマウスの転写物に１００％同一性があり、７８個は、ヒトおよびカニクイザルにおいて１００％同一性があり、２個は、３種（ヒト、カニクイザル、およびマウス）において、１００％同一性があった。
それぞれのｓｉＲＮＡ設計の予測される特異性を、最終選択の判断基準として使用した。ＳＡＡのｓｉＲＮＡを、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いて、マウス、ヒト、およびカニクイザルのトランスクリプトームに対する包括的検索において使用した。次いで、Ｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、整列を解析し、ｓｉＲＮＡと任意の潜在的「オフターゲット」転写物との間のミスマッチの位置および数に基づいてスコアを得た。該スコアは、分子の５’末端から２〜９位での、ｓｉＲＮＡの「播種」領域の差異を強調するように加重する。両方のｓｉＲＮＡ鎖は、算出したスコアに従って、特異性のカテゴリーに割り当てた。３を超えるスコアは、高度の特異性があり、３に等しいスコアは、特異性があり、２．２〜２．８のスコアは、中程度の特異性があると見なす。
約５００〜７００個の１９量体のＳＡＡのｓｉＲＮＡは、ＳＡＡのアイソフォーム／種の交差反応性およびオフターゲットの予測に対して設計され、分析された。７８個のｄｓＲＮＡが、さらなる分析のために選択された。これらの７８個のｓｉＲＮＡは、ＳＡＡ１およびＳＡＡ２（今後、「ＳＡＡ」または「ＳＡＡ１／２」と称する）の両方を標的とするように予測された。全ての７８個のセンスおよびアンチセンスのヒト−カニクイザルに特異的なｓｉＲＮＡは、内部２’Ｏｍｅ修飾で合成され、二重鎖に形成された。
実施例３．血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）のインビトロの有効性のスクリーニング
２’ＯＭエンドライト修飾を有する７８個のＳＡＡのｓｉＲＮＡは、インビトロモデルにおける有効性に対してスクリーニングされた。ＳＡＡ−ｓｉＲＮＡを、ＬＦ−Ｍａｘを用いて、Ｈｅｐ３Ｂ細胞において２０ｎＭの濃度でリバーストランスフェクションした。２４時間後、ＳＡＡを、混合したＩＬ−１βおよびＩＬ６サイトカインを添加することによって誘発させた。誘発してから１８時間後、ＳＡＡのｓｉＲＮＡ活性は、ｂＤＮＡ２．０およびＴａｑＭａｎアッセイよってｍＲＮＡレベルを測定することによって分析した。タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。表３に示される結果は、２つの生物学的製剤および２つの技術的複写からのものである。
材料および方法：
細胞培養：Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＨＢ−８０６４（商標））は、１０％ＦＢＳ（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ＃ＦＢ０２）１％ 抗生物質／抗生物質（Ｃａｔ＃１５２４０−０６２）を含有する、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ−ＧＩＢＣＯ）中で、３７℃で、５％ＣＯ２にて維持された。
保存培養のために、細胞は、分割する前に、９０〜１００％のコンフルエンスであるものとする。細胞は、洗浄し、３ｍＬの０．２５％ トリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理し、３７℃で、５％ＣＯ２にて、インキュベートする。７ｍＬのＤＭＥＭ １０％ＦＢＳ １％ 抗生物質／抗有糸***薬を添加し、細胞を完全に再懸濁する。適切な細胞のアリコートを、３０ｍＬの未使用のＤＭＥＭ １０％ＦＢＳ １％ 抗生物質／抗有糸***薬を含有する新しいフラスコに添加し、所望の日において、９０〜１００％のコンフルエンスを得る。細胞を、再懸濁し、３７℃で、５％ＣＯ２にて、インキュベートする。
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを用いたリバーストランスフェクション Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ番号１３７７８−１５０（１．５ｍＬサイズ）は、製造業者に推奨されるように、＋４℃で保存した。
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ還元血清培地（カタログ番号３１９８５−０６２）は、複合体を形成する前に、ＲＮＡｉ二重鎖およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸを希釈するために使用した。
ＢＬＯＣＫ−ＩＴ（商標）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｏｌｉｇｏ（カタログ番号１４７５０−１００）は、トランスフェクション効率を評価するために使用した。
リバーストランスフェクション法は、９６ウェル形式において、Ｈｅｐ３Ｂ細胞にｓｉＲＮＡを形質移入するために使用した。リバーストランスフェクションにおいて、複合体がウェル内に調製された後、細胞懸濁液を添加した。形質移入される各ウェルのために、ＲＮＡｉ二重鎖−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ複合体を以下の通りに調製した。
２ｕＬの（２０ｕＭの原液からの）ｓｉＲＮＡ複合体は、希釈プレートの各ウェルにおいて、１９８μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）中で希釈し、１回量のスクリーニングのための２０ｎＭの最終濃度を得た。ＩＣ５０の決定のために、さらなる希釈を、前の希釈物（ｄｉｌｌ）を緩やかに混合し、連続的に５倍希釈する（１回目の希釈物（ｄｉｌｌ）からの４０ｕＬ＋１６０ｕＬのＯＰＴ−ＭＥＭ）ことによって行い、２０ｎＭ〜５０ｆＭの範囲のＲＮＡ最終濃度に達した。１０ｕＬ／ウェルのｓｉＲＮＡ希釈液は、培養プレートに移した。
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸを緩やかに混合し、次いで、２０ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸを、１０ｍＬのＯｐｔ−ＭＥＭ（０．２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）／ウェル）に添加した。１０ｕＬの混合物を、培養プレート中で各ウェルに添加した。該溶液を緩やかに混合し、室温で、１０〜２０分間インキュベートした（２０ｕＬのｌｉｐｏｐｌｅｘ／ウェル）。
８０μＬが、適切な細胞数（２×１０４／ウェル）を含有するように、細胞を分割し、計数し、抗生物質なしで完全な増殖培地中で希釈し、細胞を藩種してから２４時間後、３０〜５０％のコンフルエンスを得た。
ＲＮＡｉ二重鎖−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ複合体を含有する各ウェルに、８０μＬの希釈した細胞を添加した。これにより、１００μＬの最終容量、ならびに２０ｎＭ（単回用量アッセイ用）および２０ｎＭ〜５０ｆＭ（ＩＣ５０アッセイ）の最終ＲＮＡ濃度を得た。プレートを前後に振動させることによって、細胞を緩やかに混合した。細胞を、終夜３７℃で、ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。
サイトカイン（ＩＬ−１β＋ＩＬ−６）を用いたＨｅｐ−３Ｂにおける、ヒトＳＡＡの誘発 ５００ｕＬの脱イオン水を、組換えヒトＩＬ−１β（（ｒＩＬ−ｌβ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＥＤ５０、または１単位の活性＝３ｐｇ／ｍＬ）のバイアルに添加し、作業用の原液を調製した。この希釈液は、５００ｕＬ中で、合計２０００００００ｐｇ／５００ｕＬ＝１３３３３３３３単位および１ｕＬの原液＝２６６６６単位をもたらした。
５００ｕＬの脱イオン水を、組換えヒトＩＬ−６（ＲＩＬ−６１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＤ５０、または１単位の活性＝５２．５ｐｇ／ｍＬ）のバイアルに添加し、作業用の原液を調製した。この希釈液は、５００ｕＬ中で、合計２０００００００ｐｇ／５００ｕＬ＝７６０４５６．３単位および１ｕＬの原液＝１５２１単位をもたらした。
抗生物質を含有する増殖培地を、アッセイプレートで用いるのに十分な容量に調製し、各ウェルは、１００ｕＬの培地を得た。
各４ｍＬの培地について、１．２ｕＬ（８００単位／ウェル）のＩＬ−１βの作業用の原液、および０．６ｕＬ（２３単位／ウェル）のＩＬ−６の作業用の原液を、十分に混合した。
この培地を、各プレートから除去し、１００ｕＬの誘発培地を添加した。
幾つかのプレートは、ｂＤＮＡおよびＴａｑＭａｎアッセイで用いるために、１６〜１８時間、３７℃で、５％ ＣＯ２にてインキュベートし、他のプレートは、ＥＬＩＳＡアッセイで用いるために、４４〜４６時間インキュベートした。
図１Ａおよび１Ｂは、ＳＡＡが、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方において検出することができることを示す。ＩＬ−１βとＩＬ−６との組み合わせは、ＴａｑＭａｎアッセイによって測定した、１６〜１８時間後、ＳＡＡのｍＲＮＡレベルの１２〜１４倍の増加をもたらし、４４時間後、ＥＬＩＳＡによって測定した、ＳＡＡタンパク質レベルの８倍の増加をもたらした。
ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０試薬系（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を用いたヒトＳＡＡ−ｂＤＮＡアッセイ ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０ｂＤＮＡアッセイは、ＳＡＡのＲＮＡレベルを測定するために使用した。全てのｂＤＮＡプローブセットは、Ｐａｎｏｍｉｃｓ社から入手した。ヒト特異的なＳＡＡのプローブセットは、ＳＡＡ−１およびＳＡＡ２の転写物の両方を検出するために設計した。ヒトＧＡＰＤＨは、対照ハウスキーピング遺伝子として使用し、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅキット（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）は、アッセイを駆動させるために使用した。
ｂＤＮＡの１日目 新たな溶解混合物（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）の希釈液は、３７℃で混合物をインキュベートし、次いで、緩やかに旋回させることによって、どんな沈殿物も再溶解させることによって調製した。次いで、１：２の希釈液を調製した（１容量の溶解混合物＋２容量のヌクレアーゼ不含水）。次いで、１０ｕＬ／ｍＬのプロテイナーゼＫ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を、希釈液に添加した。
誘発させてから１８時間後、まず、細胞から浮遊物を除去し、次いで、２００ｕＬの希釈した溶解混合物に加えてプロテイナーゼＫを添加することによって、細胞を溶解させ、標的ＲＮＡを放出させた。該プレートは、アルミニウム製のテープで密閉し、５５℃で、３０〜４０分間インキュベートした。
培養した細胞から標的ＲＮＡを捕捉するために、プレートは、４℃の貯蔵所から取り出し、室温まで完全に加温するまで卓上に静置した。密閉したアルミホイル製の小袋を、捕捉プレートから取り出し、８０ｕＬ／ウェルの細胞溶解物は、ＳＡＡ分析ウェルのために調製し、一方、８０ｕＬ／ウェルの１：２０で希釈された溶解物（１：２の希釈された溶解混合物）は、ＧＡＰＤＨ分析のために調製した。
作業用のプローブの混合は、別個の管（１．６２６ｕＬのヌクレアーゼ欠失のＨ２Ｏ＋８８７ｕＬの溶解混合物＋１３４ｕＬの遮断薬＋４０ｕＬの２．０のプローブセット＝２．６８８ｕＬ／プレート）中で、ＳＡＡ分析およびＧＡＰＤＨ分析のために調製した。２０ｕＬ／ウェルの作業用のプローブ混合物を添加し、該プレートは、とても強固に密閉した。該プレートは、ハイブリダイゼーションのために、終夜５５℃でインキュベートした。
ｂＤＮＡの２日目 １回の洗浄緩衝液は、１．５ｍＬの洗浄緩衝液の構成成分１および２．５ｍＬの洗浄緩衝液の構成成分２を、４９６ｍＬのヌクレアーゼ不含水に添加することによって調製した。
２．０予備増幅剤での作業用の試薬は、２．０予備増幅剤を解凍し、ほんの少しの間遠心分離を行うことによって調製し、管の底部で含有物を収集した。１１μＬの２．０予備増幅剤を、１１ｍＬの増幅剤／標識プローブ希釈液に添加し、この溶液を反転させて混合した。本試薬は、使用可能になるまで室温で保持した。
２．０予備増幅剤での作業用の試薬は、２．０増幅剤を解凍し、次いで、ほんの少しの間遠心分離を行うことによって調製し、管の底部で含有物を収集した。１１μＬの２．０増幅剤を、１１ｍＬの増幅剤／標識プローブ希釈液に添加し、この溶液を反転させて混合した。また、この試薬は、使用可能になるまで室温で保持した。
２．０標識プローブでの作業用の試薬は、２．０標識プローブを解凍し、次いで、ほんの少しの間遠心分離を行うことによって調製し、管の底部で含有物を収集した。１１μＬの２．０標識プローブを、１１ｍＬの増幅剤／標識プローブ希釈液に添加し、この溶液を反転させて混合した。また、この試薬は、使用可能になるまで室温で保持した。
２．０基質は、４℃で貯蔵所から取り出され、使用するまで室温まで加温した。
２００ｕＬ／ウェルの１回の洗浄緩衝液を、捕捉プレートに添加し、該捕捉プレートを、適切な容器上で反転させ、含有物を強制的に排出させる。反転したプレートは、清潔な紙タオル上で乾燥するまで堅固に軽くたたき、３００μＬ／ウェルの１回の洗浄液を用いて２回以上、洗浄を繰り返した。該プレートは、２４０ｘｇで、１分間、室温で遠心分離を行った。
２．０予備増幅剤のハイブリダイゼーションのために、１００ｕＬ／ウェルの予備増幅剤の作業用試薬を、プレートに添加し、プレートを硬固に密閉した。次いで、該プレートは、５５℃で１時間インキュベートした。該プレートは、予備増幅した後、３回洗浄した。
２．０増幅剤（Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）のハイブリダイゼーションのために、１００ｕＬ／ウェルの増幅器での作業用試薬１００ｕＬ／ウェルをプレートに添加した。該プレートは、とても硬固に密閉し、次いで、５５℃で１時間インキュベートした。該プレートは、増幅した後、３回洗浄した。
標識プローブのハイブリダイゼーションのために、１００ｕＬ／ウェルの標識プローブでの作業用試薬を、プレートに添加し、プレートをとても硬固に密閉した。該プレートは、５０℃で１時間インキュベートした。該プレートは、標識化した後、３回洗浄した。
シグナル検出のために、１００ｕＬの２．０基質を、各ウェルに添加し、該プレートは、５〜１５分後、照度計で読み取った。
ヒトＳＡＡ−ＴａｑＭａｎ遺伝子の発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｖｓｔｅｍｓ） Ｔａｑｍａｎアッセイは、ＳＡＡ−ＲＮＡを測定するために使用した。Ｔａｑｍａｎアッセイに使用した全てのＴａｑｍａｎプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＡＢＩ ７９００ ＨＴおよび７０００サイクラーは、アッセイプレートの処理および読み取りのために使用した。ＲＴ ＰＣＲ対照は、逆転写ステップで使用されるＲＮＡのいかなる非特異的な増幅またはＤＮＡ汚染を確認するために起動するべきではない。
主（ｍａｓｔｅｒ）混合物は、１０μＬのＰＣＲ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＢＩ）、６μＬのヌクレアーゼ不含水、ＳＡＡ１およびＳＡＡ２（Ｈｓ００７６１９４０＿ｓ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の両方を検出するために設計された１μＬのＳＡＡプローブ、ならびに１μＬの１８s内因性対照プローブおよび２ｕＬのＲＴ ｃＤＮＡの両方を混合する／合計２０ｕＬの反応物に対して、後で添加することによって調製した。
１８μＬの主混合物は、各ウェルにアリコートし、次いで、２μＬのｃＤＮＡ ＲＴ産物を添加し、上下にピペットすることによって混合した。該プレートは、ＡＢ光学テープを用いて密閉し、リアルタイムＰＣＲ装置で処理した。読み取りは、ＡＢＩ ７９００ ＨＴリアルタイムＰＣＲ装置で行われ、その後、データを分析し、評価した。
ヒトＳＡＡ−ＥＬＩＳＡキットアッセイ（Ａｂａｚｙｍｅ．ＬＬＣ Ｃａｔ ＃ＥＬ１００１５）。ヒトＳＡＡ−ＥＬＩＳＡアッセイは、細胞培地の浮遊物中のヒト血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タンパク質を判定するために使用した。キット試薬は、使用する前に室温に到達させた。ＳＡＡ標準は、２．０ｍＬのＣａｌｉｂｒａｔｏｒ Ｄｉｌｕｅｎｔ ＩＩ（８０ｎｇ／ｍＬ）で再構成し、該溶液は、希釈液を作製する前に、少なくとも１５分間、緩やかに撹拌させた。
原液は、アッセイの範囲内（２．５ｎｇ／ｍＬ〜８０ｎｇ／ｍＬ）で、２倍の連続希釈シリーズを生成するために使用した。不希釈ＳＡＡ標準は、高度の基準（８０ｎｇ／ｍＬ）として機能し、Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ Ｄｉｌｕｅｎｔは、ゼロとして機能した。
ｓｉＲＮＡおよび、、ＩＬ１ｂ＋ＩＬ−６によって１日後および４６日後に誘発されたＳＡＡで処理された細胞からの上清試料を、、使用し、上清は、１：３で希釈した。
１回の洗浄緩衝液（１：１９の希釈された水、または脱イオン水）を、調製した。基質Ａおよび基質Ｂを、使用する１５分前に、等量で一緒に混合した（７ｍＬの各／プレートで計１４ｍＬ必要）。
本アッセイを行うために、１００μＬの標準または試料を、ＳＡＡに特異的な モノクローナル抗体で予め被覆されたマイクロタイタープレートの適切なウェルに添加した。該プレートは、被覆され、室温で１時間インキュベートした。該プレートは、１回の洗浄緩衝液（３５０ｕＬ／ウェル）で、５回洗浄した。次いで、１００μＬのＨＲＰ−結合−ＳＡＡに特異的なポリクローナル抗体を、各ウェルに添加した。該プレートは、被覆され、室温で１時間インキュベートし、洗浄手順を５回繰り返した。１００μＬのＴＭＢ（３，３’５，５’テトラメチル−ベンジジン）基質溶液を、各ウェルに添加した。次いで、該プレートは、被覆され、室温で１５分間インキュベートした。ＳＡＡおよび酵素−基質の反応は、色の変化を示す。
１００μＬの停止溶液（硫酸）を各ウェルに添加し、十分混合することによって、該酵素−基質の反応を、終了させた。４５０±２ｎｍでの光度密度（Ｏ．Ｄ．）は、分光光度計（マイクロタイタープレート）リーダーを用いて、３０分以内測定した。
表２中のＳＡＡの２’−Ｏｍｅ複合体ＲＮＡは、合成し、各鎖には、隣接した３’ｄＴ分子を接続するリン酸塩結合が含まれた。
Figure 0005529142
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図２および３は、上記の、候補ＳＡＡのｓｉＲＮＡの投与後のＨｅｐ３Ｂ細胞内のＳＡＡのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを示す。試験したｓｉＲＮＡのうちの１３個は９０％超のｍＲＮＡレベルの阻害を示し、３０個のｓｉＲＮＡは、８０％超の阻害を示し、６０個のｓｉＲＮＡは、５０％超の阻害を示した。７８個の候補ｓｉＲＮＡのうちの３０個以上は、タンパク質レベルを９５％超軽減した。
７８個のｓｉＲＮＡのうちの３２個を、用量反応およびＰＢＭＣサイトカインの特徴付けのために選択した。選択は、ヒトのみの活性、ヒト／カニクイザルの活性、ヒト／マウスの活性、およびヒト／マウス／カニクイザルの活性で、二重鎖をアッセイするために、単回用量反応実験における活性、および種にわたる交差反応性に基づいた。選択したｓｉＲＮＡに対する用量反応曲線を図４Ａ〜４Ｇに示す。
インビトロモデルにおける、ＳＡＡ−ｓｉＲＮＡのＩＣ５０の１回目の結果
最も有力なＳＡＡのｓｉＲＮＡを同定するために、３２個のＳＡＡのｓｉＲＮＡのＩＣ５０は、２０ｎＭ〜５０ｆＭ（５倍の連続希釈）の範囲の濃度で、インビトロモデルにおいてスクリーニングした。ＳＡＡ−ｓｉＲＮＡを、ＬＦ−Ｍａｘを用いて、Ｈｅｐ３Ｂにおいてリバーストランスフェクションした。２４時間後、ＳＡＡ遺伝子の発現を、混合したＩＬ−１βおよびＩＬ６サイトカインを添加することによって誘発した。誘発した１８時間後、ＳＡＡのｓｉＲＮＡ活性を、ｂＤＮＡ２．０を用いて、非特異的対照（ＢＬＯＣＫ−ＩＴ）と比較して、ＳＡＡのｍＲＮＡレベルを測定することによって分析した。１回目のスクリーニングの結果を、下表４に示す。
Figure 0005529142
Figure 0005529142
インビトロモデルにおける、ＳＡＡ−ｓｉＲＮＡのＩＣ５０の２回目の結果
有力なＳＡＡのｓｉＲＮＡを同定するために、３２個のＳＡＡのｓｉＲＮＡのＩＣ５０が、２０ｎＭ〜５０ｆＭ（５倍の連続希釈）の範囲の濃度で、インビトロモデルにおいてスクリーニングした。ＳＡＡ−ｓｉＲＮＡを、ＬＦ−Ｍａｘを用いて、Ｈｅｐ３Ｂにおいてリバーストランスフェクションした。２４時間後、ＳＡＡを、混合したＩＬ−１βおよびＩＬ６サイトカインを添加することによって誘発した。誘発した１８時間後、ＳＡＡのｓｉＲＮＡ活性を、ｂＤＮＡ２．０を用いて、非特異的対照（ＡＤ−１９５５）と比較して、ＳＡＡのｍＲＮＡレベルを測定することによって分析した。２回目のスクリーニングの結果を下表５に示す。表５の影付きのｓｉＲＮＡは、血清の安定性アッセイ、マウスにおけるインビボ有効性研究、およびオフターゲットの有効性のためのさらなる分析のために選択した。選択は、交差反応のそれぞれのクラスにおける、ＩＣ５０の最大値に基づいて行なった。すなわち、ヒト／カニクイザルは、このクラスの分子が、大きなＩＣ５０を有しており、ＮＨＰにおける前臨床試験を可能にするであろうと考えられるため、リード分子を産生するために最も有力であるように、より重量のあるものを加重した。
Figure 0005529142
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実施例４：ＳＡＡのｓｉＲＮＡを試験するためのインビボマウスモデル
ＳＡＡのｓｉＲＮＡを試験するためのインビボマウスモデルを構築した。マウス（ｎ＝５）は、０日目に５０ｕｇの濃度で、リポ多糖類（ＬＰＳ）を腹腔内に（ｉ．ｐ．）注射した。マウスは、ＬＰＳ注射する３日前およびＬＰＳ注射してから１日目に採血し、相対的なマウスのＳＡＡ ＯＤレベルを測定した。
図５は、ＳＡＡレベルが、ＬＰＳを注射する前のＳＡＡレベルと比較して、ＬＰＳを注射してから２４時間後に試験した全てのマウスにおいて増加したことを示す。同様のＳＡＡの上方調節は、１０ｕｇのＬＰＳを腹腔内に注射することにより達成された（データは示さず）。
ＳＡＡのｓｉＲＮＡが、インビボにおけるＳＡＡレベルを下方調節することができるかどうかを試験するために、ＬＰＳ（１０ｕｇ 腹腔内）を注射してから６時間後、ｓｉＲＮＡをマウスに投与した。試験したｓｉＲＮＡは、ＬＮＰ０１に製剤化した１８４４５（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＬＮＰ０１に製剤化した１８３７９（１０ｍｇ／ｋｇ）、およびＳＮＡＬＰに製剤化した１８４４５（２ｍｇ／ｋｇ）であった。対照群は、ＰＢＳおよびＬＮＰ０１に製剤化した１９５５対照ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）を含んだ。マウスは、ｓｉＲＮＡの投与から２４時間後に採血し、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＳＡＡレベルを測定した。
ＳＮＡＬＰ製剤は以下の通りである。約７：１の脂質：ｓｉＲＮＡ比を有するＤＬｉｎＤＭＡ／ＤＰＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ｃＤＭＡ（５７．１／７．１／３４．４／１．４）。
ＬＮＰ０１製剤は以下の通りである。４２：４８：１０モル比を有するＮＤ９８／コレステロール／ＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６。
図６は、ＬＮＰ０１−１８４４５およびＳＮＡＬＰ−１８４４５が、対照群と比較して、ＳＡＡレベルが有意に下方調節されたことを示す。
表２に記載されるように、１８４４５の各鎖の配列は以下の通りである。
Figure 0005529142
本発明において、例えば、以下のセンスまたはアンチセンス鎖の少なくとも１５個のヌクレオチドを含む、代替のｄｓＲＮＡが含まれる。
Figure 0005529142
実施例５．ＳＡＡのｓｉＲＮＡを試験するための動物モデル
内因性マウスモデルは、ヒトＳＡＡの発現停止を試験するには適していない。したがって、ＳＡＡのｓｉＲＮＡは、プラスミドからおよび／またはアデノウイルスからのヒトＳＡＡ１またはＳＡＡ２を発現するマウスにおいて試験することができる。
ｈＳＡＡ１を発現するアデノウイルスは、ｈＳＡＡ１の発現を駆動するためのＣＭＶ前初期プロモーターおよびエンハンサーで改変した（Ｈｏｓａｉ ｅｔ ａｌ．，ＪＬＲ １９９９）。マウスは、前採血し、次いで、４−１２ｘ１０９ ｐｆｕ／マウスを投与した。次いで、マウスは、０日目にウイルス投与してから４、８、１１、１５、および２２日目に採血した。図７は、ｈＳＡＡ１の発現が、ウイルスの単回注射から約２週間、持続することができることを示す。
また、流体力学的注射は、マウスにおけるヒトＳＡＡ遺伝子を発現するために使用した（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．，１４８：１，Ｊｕｌｙ ２００８，ｐ．６０−６６、およびＨｅｒｗｅｉｊｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．，３：３，２００１，ｐ．２８０−２９１）。コンストラクトは、マウスにおける、肝細胞に特異的なｈＳＡＡ１の発現のために設計した（図８）。マウス（ｎ＝３）は、約２ｍｌの食塩水中の５０ｕｇのコンストラクトのプラスミドを、尾静脈を介して、約１０秒間、注射した。流体力学的注射後のマウスにおけるｈＳＡＡ１の発現を図９に示す。
また、導入遺伝子からのヒトＳＡＡ１またはＳＡＡ２を発現するマウスにおける、ｓｉＲＮＡも試験することができる。トランスジェニックマウスは、長期間、ヒトＳＡＡ遺伝子を構造的に発現することができる。ｈＳＡＡ１の導入遺伝子の発現のために設計されたコンストラクトを図１０に示す（Ｐｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｍａｇｎｕｓｏｎ，Ｇｅｎｅｓｉｓ，２０００ Ｆｅｂ．；２６（２）：１４９−１５０．）。
内因性ＳＡＡの発現を用いて非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデルにおける、ｓｉＲＮＡを試験することができる。ＮＨＰのＳＡＡのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを検出するための試薬は、有効であり、次いで、休止および疾病状態にあるＳＡＡの循環レベルは、候補ｓｉＲＮＡを投与する前に測定する。
実施例６．ヒトにおけるＳＡＡの発現の阻害
ヒト対象は、病態を治療するために、単回用量後の長期間、ＳＡＡ遺伝子の発現を阻害するためにＳＡＡ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡにより治療される。
治療を必要とする対象を選択または同定する。該対象は、ＡＡアミロイドーシス、関節リウマチ、腫瘍、乾癬性関節炎、慢性若年性関節炎、強直性脊椎炎、ベーチェット症候群、ライター症候群、成人スティル病、炎症性腸疾患、遺伝性周期性発熱、結核、骨髄炎、気管支拡張症、ハンセン病、腎盂腎炎、褥瘡性潰瘍、ウィップル病、集簇性座瘡、一般変異型免疫不全症 低／無ガンマグロブリン血症、嚢胞性線維症、肝臓癌、腎臓癌、キャッスルマン病、ホジキン病、成人有毛細胞白血病、ワルデンストレーム病、腫瘍、慢性感染症、慢性炎症性疾患、慢性関節炎、慢性敗血症、周期性発熱症候群、家族性地中海熱、またはクローン病に罹患し得る。
該対象の同定は、臨床的状況において、または他の場所、例えば、対象自身が自己試験キットの使用を通して対象の自宅で、発生し得る。
ゼロ時点で、好適な第１の用量の抗ＳＡＡのｓｉＲＮＡを対象に皮下投与する。該ｄｓＲＮＡは、本明細書に記載の通り製剤化する。第１の用量後、しばらくしてから、例えば、７日、１４日、および２１日後、例えば、体温または１種もしくは複数種の炎症バイオマーカーを測定することによって、対象の病態を評価する。この測定には、前記対象におけるＳＡＡの発現、および／またはＳＡＡのｍＲＮＡの成功したｓｉＲＮＡ標的の産物の測定を伴ってもよい。また、他の関連する基準を測定してもよい。用量の回数および強度は、対象の必要性に従って調整する。
治療後、対象の体温および／または炎症バイオマーカーは、治療前に既存のレベル、または同様に罹患するが、無治療である対象において測定されたレベルと比較して低下する。
他の実施形態は、特許請求の範囲内にある。

Claims (27)

  1. 血清アミロイドＡ (SAA) 遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸 (dsRNA)であって、該 dsRNAは、センス鎖および、相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含み、該相補性の領域は30 塩基対未満の長さであり、該センス鎖は、配列番号312、配列番号194、配列番号284、配列番号262、配列番号216、または配列番号180に相補的な少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、二本鎖リボ核酸(dsRNA)。
  2. センス鎖が、配列番号311、配列番号193、配列番号283、 配列番号261、配列番号215、または配列番号179の少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、請求項1のdsRNA。
  3. アンチセンス鎖が、配列番号312、配列番号194、配列番号284、配列番号262、配列番号216、または配列番号180の少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、請求項1または2のdsRNA。
  4. センス鎖が、配列番号155、配列番号37、配列番号127、配列番号95、配列番号105、配列番号59、配列番号23、または配列番号193の15個以上の連続するヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれかのdsRNA。
  5. アンチセンス鎖が、配列番号156、配列番号38、配列番号128、配列番号96、配列番号106、配列番号60、または配列番号24の15個以上の連続するヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれかのdsRNA。
  6. センス鎖が、配列番号311、配列番号155、配列番号37、配列番号127、配列番号95、配列番号105、配列番号59、配列番号23、配列番号193、配列番号283、配列番号261、配列番号215、または配列番号179からなり、かつ、アンチセンス鎖が、配列番号312、配列番号156、配列番号38、配列番号128、配列番号96、配列番号106、配列番号60、配列番号24、配列番号194、配列番号284、配列番号262、配列番号216、または配列番号180からなる、請求項１〜５のいずれかのdsRNA。
  7. dsRNAが、18445、18397、18379、18420、18431、または18326である請求項１〜６のいずれかのdsRNA。
  8. dsRNAが、18445からなる、請求項１〜７のいずれかのdsRNA。
  9. 該センス鎖または該アンチセンス鎖からの少なくとも１個のヌクレオチドが修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜８のいずれかのdsRNA。
  10. 該修飾ヌクレオチドが、以下からなる群から選択される請求項9のdsRNA: ２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチド。
  11. 該修飾ヌクレオチドが、以下からなる群から選択される請求項9または10のdsRNA：２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基。
  12. 前記相補性の領域が、少なくとも15ヌクレオチド長である、請求項１〜５または９〜１１のいずれかに記載のdsRNA。
  13. 前記相補性の領域は、１９〜２１ヌクレオチド長である、請求項１〜５または９〜１２のいずれかに記載のdsRNA。
  14. 前記dsRNAは、リガンドと複合体化している、請求項１〜１３のいずれかに記載のdsRNA。
  15. 前記dsRNAは、脂質製剤に製剤化されている、請求項１〜１４のいずれかに記載のdsRNA。
  16. 前記dsRNAは、ＬＮＰ製剤、ＬＮＰ０１製剤、ＬＩＰＩＤ Ａ−ＳＮＡＬＰ製剤、またはＳＮＡＬＰ製剤に製剤化されている、請求項１〜15のいずれかに記載のdsRNA。
  17. 前記dsRNAは、オーバーハングを含む、請求項１〜５または９〜１６のいずれかに記載のdsRNA。
  18. 前記dsRNAは、ｄＴｄＴオーバーハングを含む、請求項１〜５または９〜１７のいずれかに記載のdsRNA。
  19. 前記dsRNAは、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の３’末端に２つのｄＴｄＴオーバーハングを含む、請求項１〜５または９〜１８のいずれかに記載のdsRNA。
  20. 前記センス鎖は、２１ヌクレオチド長である、請求項１〜５または９〜１９のいずれかに記載のdsRNA。
  21. 前記アンチセンス鎖は、２１ヌクレオチド長である、請求項１〜５または９〜２０のいずれかに記載のdsRNA。
  22. 請求項１〜２１のいずれかに記載のdsRNAを含む細胞。
  23. 請求項１〜２１のいずれかに記載のdsRNAを含む、SAA 遺伝子の発現を阻害するための、医薬組成物。
  24. 細胞におけるSAA発現をインビトロで阻害する方法であって、以下の工程を含む方法:
    (a)請求項１〜２１のいずれかに記載のdsRNAをインビトロで細胞に導入する工程;および、
    (b) SAA 遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るために十分な時間、工程（ａ）において産生された前記細胞を維持し、それによって、前記細胞内の前記ＳＡＡ遺伝子の発現を阻害する工程。
  25. SAAの発現に関連する障害の治療を必要とするヒトにおいて、SAAの発現に関連する障害を治療するための医薬組成物であって、請求項１〜２１のいずれかに記載の治療上有効な量のdsRNAを含む、医薬組成物。
  26. 請求項１〜２１のいずれかのdsRNAの少なくとも１本の鎖をコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
  27. 請求項26のベクターを含む細胞。
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