KR20240046323A - 암에 대한 병용 요법에 있어서 cd40 및 cd137에 대한 다중특이 결합제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 종양의 진행을 감소 또는 예방하거나 암을 치료하기 위해 체크포인트 억제제와 함께 인간 CD40 및 인간 CD137에 결합하는 결합제를 사용하는 병용 요법에 관한 것이다.

Description

암에 대한 병용 요법에서 CD40 및 CD137에 대한 다중특이 결합제
본 발명은 종양의 진행을 감소 또는 예방하거나 암을 치료하기 위해 체크포인트 억제제와 함께 인간 CD40 및 인간 CD137에 결합하는 결합제를 사용하는 병용 요법에 관한 것이다.
CD40은 종양괴사인자(TNF) 수용체(TNFR) 계열의 구성원이며 다양한 세포 유형에서 발견되는 공동자극 단백질로 알려져 있다. CD40은 수지상 세포(DC), B 세포 및 대식세포를 포함한 항원 제시 세포(APC)에 의해 구성적으로 발현된다. 이는 또한 내피 세포, 혈소판, 평활근 세포, 섬유아세포 및 상피 세포에 의해 발현될 수 있다. 정상 세포에서 광범위하게 발현되는 것과 마찬가지로 CD40은 광범위한 종양 세포에서도 발현된다.
공동자극 신호(CD80 및/또는 CD86으로부터)와 함께 항원 특이적 CD4+ T 세포에 대한 MHC 클래스 II 분자의 맥락에서 펩타이드 항원의 제시는 CD4+ T 세포의 활성화 및 DC 라이센싱 인자 CD40 리간드(CD40L) 및 림포톡신-α1β2(LTα1β2)의 상향-조절을 야기한다. 활성화된 항원-특이 CD4+ T 세포에서 CD40L 및 LT LTα1β2의 발현은 CD40 및 LTβ 수용체(LTβR)를 통한 신호전달을 유도하고, 이는 DC가 CD8+ T 세포 반응을 유도하도록 허용한다. CD40 신호전달은 인터루킨-12(IL-12)의 생성과 CD70, CD86, 4-1BB 리간드(4-1BBL), OX40 리간드(OX40L) 및 GITR 리간드(GITRL)의 상향 조절을 가져오는 반면, LTβR 신호전달은 유형 I 인터페론(IFN)의 생성으로 이어진다. 핵 인자 카파B(NF-κB)의 활동을 제어하는 신호전달 시스템은 사실상 모든 TNFR 수퍼패밀리 구성원에 반응한다. 병원체 관련 분자 패턴(PAMP) 및 손상 관련 분자 패턴(DAMP)도 이러한 현상에 영향을 미친다. MHC 클래스 I 제한 펩타이드에 의한 CD8+ T 세포의 프라이밍은 CD27, 4-1BB, OX40 및 글루코코르티코이드 유발 TNFR 관련 단백질(GITR)의 상향조절을 초래한다. IL-12 및 I형 IFN과 조합된 동족 TNF 수퍼패밀리 리간드에 의한 CD8+ T 세포의 이들 수용체의 자극은 강력한 CD8+ T 세포 활성화, 증식 및 이펙터 기능뿐만 아니라 CD8+ T 세포 메모리의 형성 및 유지를 초래한다. CD40 항체는 다음의 여러가지 작용을 발휘할 수 있다; 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC), 보체 의존성 세포 독성(CDC) 또는 항체 의존성 세포 매개 식세포작용(ADCP)을 유도하여 CD40 발현 종양 세포 사멸, 직접적인 세포 사멸 또는 성장 정지를 유도하는 세포 신호전달뿐만 아니라 종양 세포의 CD40 발현과 무관하게 APC의 허가를 통해 항암 면역 반응을 자극. CD40에 결합하는 항체는 APC의 CD40을 유발하여 이펙터 세포독성 T 림프구(CTL)를 프라이밍하고 이들 세포에 의한 IL-2 방출을 유도하고 간접적으로 NK 세포를 활성화할 수 있다. CD40을 자극하는 항체는 선행 기술에 개시되어 있으며, 인간 IgG2 항체인 CP-870,893(WO 03/040170); 인간화 IgG1 항체인 다세투주맙(WO 00/075348) 및 키메라 IgG1 항체인 Chi Lob 7/4(US 2009/0074711). 또한, 길항적 CD40 항체인 인간 IgG1 항체인 루카투무맙(WO 02/028481)이 개시되었다.
CD137(4-1BB)은 또한 TNFR 계열의 구성원이다. CD137은 CD8+ 및 CD4+ T 세포, 조절 T 세포(Tregs), 자연살해 T 세포(NK(T) 세포), B 세포 및 호중구에 대한 공동자극 분자이다. T 세포에서 CD137은 구성적으로 발현되지 않지만 T 세포 수용체(TCR) 활성화 시 유도된다(예컨대 종양 침윤 림프구(TIL))(Gros et al., J. Clin Invest 2014;124(5):2246 -59)). 천연 리간드 4-1BBL 또는 작용제 항체를 통한 자극은 TRAF-2 및 TRAF-1을 어댑터로 사용하여 신호전달을 유도한다. CD137에 의한 초기 신호전달에는 궁극적으로 핵 인자(NF)-κB 및 미토겐 활성화 단백질(MAP)-키나제 경로의 활성화를 초래하는 K-63 폴리-유비퀴틴화 반응이 관여된다. 신호전달은 T 세포 공동자극, 증식, 사이토카인 생산, 성숙 및 CD8+ T 세포 생존의 연장을 증가시킨다. CD137에 대한 작용성 항체는 다양한 전임상 모델에서 T 세포에 의한 항종양 제어를 촉진하는 것으로 나타났다(Murillo et al., Clin Cancer Res 2008;14(21):6895-906). CD137을 자극하는 항체는 T 세포의 생존과 증식을 유도하여 항종양 면역 반응을 향상시킬 수 있다. CD137을 자극하는 항체는 선행 기술에 개시되어 있으며, 여기에는 인간 IgG4 항체인 우렐루맙(AU 2004279877) 및 인간 IgG2 항체인 유토밀루맙(Fisher et al., 2012, Cancer I mMunol. I mMunother. 61:1721-1733)이 포함된다.
Westwood JA, et al., Leukemia Research 38 (2014), 948-954는 "Combination anti-CD137 and anti-CD40 antibody therapy in murine myc-driven hematological cancers"를 개시하고 있다. WO 2018/011421은 인간 CD40에 결합하고 인간 CD137에 결합하는 이중특이 항체와 같은 결합제를 제공한다. 이러한 이중특이 항체는 항원 제시 세포(APC) 상의 CD40을 활성화된 T 세포 상의 4-1BB와 교차결합시킴으로써 고형 종양의 치료에 유용한 두 세포 유형 모두에서 조건부 자극 및 공동자극 활성을 유도한다.
PD-1, CTLA4, PD-L1, TIM-3, KIR 또는 LAG-3은 면역 체계를 조절하고 자가 관용을 가능하게 하는 억제성 체크포인트 분자이다. 동시에 억제성 체크포인트 분자는 암 면역요법의 이상적인 표적이다.
종양 배출 림프절과 종양 미세환경 내에서 4-1BB는 높은 수준의 프로그램화된 세포 사멸 1(PD-1)을 포함하는 다중 TCR 유도성 분자의 공동 발현을 특징으로 하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 서브세트에 의해 발현된다(Gros et al., J. Clin Invest 2014;124(5):2246-59; Seifert et al., Cancers (Basel) 12; Simoni et al., Nature 557: 575-579). T 세포에서 PD-1의 상향조절은 T 세포 탈진에 기여하고 그의 리간드 프로그램화된 세포 사멸 1 리간드 1(PD-L1)에 결합 시 T 세포 활성화를 감소시킬 수 있다(Yu et al., Eur J Pharmacol 881 : 173240). PD-L1 발현은 종종 종양 세포, 특히 염증이 있는 종양에서 상향조절된다(Teng, et al., Cancer Res 75: 2139-2145). 이로써, 종양 세포는 활성화된 T 세포에 억제 신호를 제공하여 이를 통해 T 세포 매개 세포독성을 회피할 수 있다. PD-1/PD-L1 억제 축을 차단하는 항체는 T 세포 기능을 회복할 수 있다(Boussiotis et al., N Engl J Med 375: 1767-1778; Chen et al., Nature 541: 321-330).
그러나, 이러한 기술 발전에도 불구하고, 종양의 진행을 예방하거나 암을 치료하기 위한 개선된 치료법에 대한 상당한 필요성이 존재한다.
본 발명자들은 놀랍게도 (i) 인간 CD40에 결합하고 인간 CD137에 결합하는 결합제를 이용한 자극과 (ii) 체크포인트 억제(특히 PD-1/PD-L1 축의 억제)의 조합이 면역 반응을 증폭시킨다는 것을 발견하였다.
따라서, 첫 번째 측면에서, 본 발명은 대상체에서 종양의 진행을 감소 또는 예방하거나 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 결합제를 제공하며, 여기서, 상기 방법은 체크포인트 억제제의 투여 전, 투여와 동시, 또는 투여 후에 상기 대상체에게 결합제를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 결합제는 CD40에 결합하는 제1 결합 영역과 CD137에 결합하는 제2 결합 영역을 포함한다.
두 번째 측면에서, 본 발명은 (i) CD40에 결합하는 제1 결합 영역 및 CD137에 결합하는 제2 결합 영역을 포함하는 결합제, (ii) 체크포인트 억제제, 및 선택적으로 (iii) 하나 이상의 추가 치료제를 포함하는 키트를 제공한다.
세 번째 측면에서, 본 발명은 대상체에서 종양의 진행을 감소 또는 예방하거나 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 두 번째 측면의 키트를 제공한다.
네 번째 측면에서, 본 발명은 체크포인트 억제제의 투여 전, 투여와 동시, 또는 투여 후에 상기 대상체에게 결합제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양의 진행을 감소 또는 예방하거나 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 결합제는 CD40에 결합하는 제1 결합 영역 및 CD137에 결합하는 제2 결합 영역을 포함한다.
도 1은 CD40x4-1BB 이중특이적 항체의 예상되는 작용 방식을 도식적으로 나타낸 것이다. CD40은 항원 제시 세포(APC)뿐만 아니라 종양 세포에서도 발현된다. 4-1BB(CD137)는 활성화된 T 세포에서 발현된다. DuoBody-CD40x4-1BB(GEN1042/BNT312)는 항원 제시 세포(APC)의 CD40을 활성화된 T 세포의 4-1BB와 교차결합시켜 두 세포 유형을 조건부로 자극하는 이중특이 항체이다. 이로써 CD40x4-1BB 이중특이적 항체는 DC 라이센스, T 세포 클론 확장, 사이토카인 생산, T 세포 생존 및 T 세포 및 NK 세포 매개 세포독성을 향상시킬 수 있다.
도 2는 성숙한 수지상 세포(mDC) 및 정제된 CD8+ T 세포의 혼합 림프구 반응(MLR)에서 펨브롤리주맙과 조합된 bsIgG1-CD40x4-1BB에 의해 유도된 IFNγ 생산을 보여준다. 정제된 CD8+ T 세포를 bsIgG1-CD40×4-1BB(0.001 - 30 μg/mL), 펨브롤리주맙(0.1 - 30 μg/mL)의 단독 또는 조합 존재 하에 5일 동안 동종이계(allogeneic) LPS-성숙 DC와 공동 배양하였다. IFNγ 분비를 ELISA로 분석하였다. 표시된 데이터는 세 번의 실험에 포함된 5개의 기증자 쌍 중 하나의 대표적인 기증자 쌍의 중복 웰의 평균 IFNγ ± 표준 편차(SD)이다. 그래프 내의 수평선들은 위에서 아래로 펨브롤리주맙이 없는 10 μg/mL bsIgG1-CD40×4-1BB에 대한 IFNγ 생산(중단선), bsIgG1-CD40×4-1BB가 없는 10 μg/mL 펨브롤리주맙(중단선, 점선), 미처리 경우(얇은 실선)를 나타낸다.
도 3은 성숙한 수지상 세포(mDC) 및 정제된 CD8+ T 세포의 혼합 림프구 반응(MLR)에서 펨브롤리주맙과 조합된 bsIgG1-CD40x4-1BB에 의해 유도된 IFNγ 생산을 보여준다. 정제된 CD8+ T 세포를 bsIgG1-CD40×4-1BB(0.001 - 30 μg/mL), 펨브롤리주맙(0.1 - 30 μg/mL)의 단독 또는 조합 존재 하에 5일 동안 동종이계 LPS-성숙 DC와 공동 배양하였다. IFNγ 분비를 ELISA로 분석하였다. 표시된 데이터는 세 가지 실험에서 중복 웰의 평균 IFNγ ± 표준 편차(SD)이다. 각 개별 그래프는 5개의 기증자 쌍 중 하나를 나타낸다.
도 4는 성숙한 수지상 세포(mDC) 및 정제된 CD8+ T 세포의 혼합 림프구 반응(MLR)에서 펨브롤리주맙과 조합된 DuoBody-CD40x4-1BB에 의해 유도된 IFNγ 생산을 보여준다. 정제된 CD8+ T 세포를 DuoBody-CD40×4-1BB(0.001 - 30 μg/mL), 펨브롤리주맙(0.1 - 100 μg/mL)의 단독 또는 대조군 항체 bsIgG1-CD40×ctrl, bsIgG1-ctrl×4-1BB, IgG1-ctrl-FEAL(모두 30 μg/mL) 또는 IgG4 이소형 대조군(100 μg/mL)과의 조합 존재 하에, 동종이계 LPS-성숙 DC와 5일 동안 공동 배양하였다. IFNγ 분비를 ELISA로 분석하였다. 표시된 데이터는 한 기증자 쌍(n=1)의 중복 웰의 평균 IFNγ ± 표준 편차(SD)이다.
도 5는 성숙한 수지상 세포(mDC)와 정제된 CD8+ T-의 혼합 림프구 반응(MLR)에서 DuoBody-CD40x4-1BB 또는 bsIgG1-CD40x4-1BB 단독 또는 펨브롤리주맙과의 조합에 의해 유도된 IFNγ 생산을 보여준다. 정제된 CD8+ T 세포를 DuoBody-CD40×4-1BB(0.001 - 30 μg/mL), bsIgG1-CD40×4-1BB(0.001 - 30 μg/mL)의 단독 또는 펨브롤리주맙(1 μg/mL)과의 조합 존재 하에 동종이계 LPS-성숙 DC와 5일 동안 공동 배양하였다. 30 μg/mL IgG1-ctrl-FEAL의 추가 단독요법 대조군 치료가 평가되었다. IFNγ 분비를 ELISA로 분석하였다. 표시된 데이터는 한 기증자 쌍(n=1)의 중복 웰의 평균 IFNγ ± 표준 편차(SD)이다.
도 6은 성숙한 수지상 세포(mDC) 및 정제된 CD8+ T-세포의 혼합 림프구 반응(MLR)에서 인하우스 유래된 니볼루맙과 조합된 bsIgG1-CD40x4-1BB에 의해 유도된 IFNγ 생산을 나타낸다. 정제된 CD8+ T 세포를 bsIgG1-CD40×4-1BB(0.001 - 10 μg/mL), 니볼루맙(α-PD-1; 0.0005 - 5 μg/mL) 단독 또는 조합의 존재 하에 동종이계 LPS-성숙 DC와 5일 동안 공동 배양하였다. IFNγ 분비를 ELISA로 분석했하였다. 표시된 데이터는 한 기증자 쌍의 중복 웰의 평균 IFNγ ± 표준 편차(SD)이다.
도 7은 동종 혼합 림프구 반응(MLR) 분석에서 DuoBody-CD40x4-1BB와 조합된 IgG1-PD1에 의해 유도된 IFNγ 분비를 보여준다. 동종이계 인간 성숙 수지상 세포(mDC)와 CD8+ T 세포의 두 가지 독특한 기증자 쌍을 IgG1-PD1(0.001 - 100 μg/mL), DuoBody-CD40×4-1BB(0.001 - 30 μg/mL), 또는 IgG1-PD1과 DuoBody-CD40×4-1BB의 조합의 존재 하에 5일 동안 공동 배양하였다. IgG1-ctrl-FERR (100 μg/mL), bsIgG1-CD40Хctrl (30 μg/mL), bsIgG1-ctrlХ4-1BB (30　 μg/mL), 및 IgG1-ctrl-FEAL (30 μg/mL)을 대조군으로서 포함시켰다. IFNγ 분비는 IFNγ- 특이적 AlphaLISA 면역검정을 사용하여 상등액에서 분석되었다. 표시된 데이터는 1 μg/mL IgG1-PD1의 한 가지 대표 농도로 처리된 2개의 독특한 동종이계 기증자 쌍의 평균 IFNγ 수준 ± 평균의 표준 오차(SEM)이다.
도 8은 동종 혼합 림프구 반응 (MLR) 분석에서 IgG1-PD1과 DuoBody-CD40x4-1BB의 조합에 의해 유도된 IFNγ 분비에 대한 시너지 분석을 보여준다. 동종이계 MLR 분석에서 7x7의 용량-반응 매트릭스에서 IgG1-PD1 및 DuoBody-CD40x4-1BB 처리 조합의 시너지 효과는 기증자 쌍 1(A) 및 2(B)에 대한 Bliss 및 최고 단일 제제(HSA) 시너지 점수 모델을 사용하여 결정되었다. ≥ 10의 점수는 시너지 효과를 나타낸다.
도 9는 항원 특이적 T 세포 자극 분석에서 DuoBody-CD40x4-1BB와 조합된 IgG1-PD1에 의한 CD8+ T 세포 증식의 강화를 보여준다. 인간 CD8+ T 세포는 클라우딘 6(CLDN6) 특이적 T 세포 수용체(TCR)를 인코딩하는 RNA와 프로그램화된 세포사멸 단백질 1(PD-1)을 인코딩하는 RNA로 전기천공되었으며 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)로 표지되었다. 그런 다음 T 세포를 0.8 μg/mL IgG1-PD1, 펨브롤리주맙 또는 IgG1-ctrl-FERR의 단독 또는 표시된 농도의 DuoBody-CD40×4-1BB와의 조합의 존재 하에 CLDN6으로 전기천공된 미성숙 수지상 세포(iDC)와 공동 배양하였다. T 세포의 CFSE 희석은 4일 후에 유동 세포 계측법으로 분석되었으며 확장 지수를 계산하는 데 사용되었다. 두 번의 독립적인 실험에서 평가된 4명의 기증자 중 한 명의 대표 기증자의 데이터가 표시된다. 오차 막대는 중복 웰의 표준 편차(SD)를 나타낸다. 점선은 모의 전기천공된(즉, CLDN6을 발현하지 않음) iDC와 공동 배양된 CD8+ T 세포의 확장 지수를 나타낸다.
도 10은 항원 특이적 CD8+ T 세포 자극 후 DuoBody-CD40x4-1BB와 조합된 IgG1-PD1에 의한 사이토카인 분비의 향상을 보여준다. 클라우딘 6(CLDN6)-특이적 T 세포 수용체(TCR) 및 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1(PD-1)을 발현하는 인간 CD8+ T 세포를 0.8 μg/mL IgG1-PD1, 펨브롤리주맙 또는 IgG1-ctrl-FERR의 단독 또는 표시된 농도의 DuoBody-CD40×4-1BB와의 조합의 존재 하에, 도 9에서와 같이 CLDN6 발현 iDC와 공동 배양하였다. 배양 상등액의 사이토카인 농도는 4일 후에 결정되었다. 두 번의 독립적인 실험에서 평가된 4명의 기증자 중 한 명의 대표 기증자의 데이터가 표시된다. 오차 막대는 중복 웰의 표준 편차(SD)를 나타낸다.
도 11은 다양한 종의 PD-1에 대한 IgG1-PD1의 결합을 보여준다. 다양한 종의 PD-1로 일시적으로 형질감염된 CHO-S 세포를 IgG1-PD1, 펨브롤리주맙, 또는 비결합 대조군 항체 IgG1-ctrl-FERR 및 IgG4-ctrl과 함께 배양하고 유세포 분석기를 사용하여 결합을 분석하였다. IgG1-PD1과 함께 배양된 형질감염되지 않은 CHO-S 세포는 음성 대조군으로 포함되었다. A-B. 표시된 데이터는 4개의 실험 중 하나의 대표적인 실험에서 얻은 중복 웰의 기하 평균 형광 강도(gMFI) ± SD이다. C-D. 표시된 데이터는 두 번의 실험 중 하나의 대표적인 실험에서 얻은 중복 웰의 gMFI ± SD이다. E. 표시된 데이터는 4개의 실험 중 하나의 대표적인 실험에서 얻은 중복 웰의 기하 평균 형광 강도(gMFI) ± SD이다. 약어: gMFI = 기하 평균 형광 강도; PD-1 = 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1; PE = R-피코에리트린.
도 12는 IgG1-PD1과 PD-L1 및 PD-L2의 인간 PD-1에 대한 경쟁적 결합을 보여준다. 인간 PD-1로 일시적으로 형질감염된 CHO-S 세포를 IgG1-PD1 또는 펨브롤리주맙의 존재 하에 1 μg/mL 비오티닐화 재조합 인간 PD-L1(A) 또는 PD-L2(B)와 함께 인큐베이션하였다. IgG1-ctrl-FERR은 음성 대조군으로 포함되었다. 세포를 스트렙타비딘-알로피코시아닌으로 염색하고, 비오티닐화된 PD-L1 또는 PD-L2에 결합하는 세포의 백분율을 유세포 분석기를 사용하여 스트렙타비딘-알로피코시아닌+ 세포의 백분율을 측정하여 구하였다. 무항체 대조군과 형질감염되지 않은 샘플에서 스트렙타비딘-알로피코시아닌+ 세포의 백분율은 파선으로 표시된다. 표시된 데이터는 세 가지 개별 실험 중 하나의 대표적인 실험의 단일 반복에서 나온 것이다. 약어: Ab = 항체; CHO-S = 차이니즈 햄스터 난소, 현탁액; Ctrl = 대조군; FERR = L234F/L235E/G236R-K409R; PD -1 = 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1; PD-L1 = 프로그램화된 세포 사멸 1 리간드 1; PD-L2 = 프로그램화된 세포 사멸 1 리간드 2.
도 13은 IgG1 PD1에 의한 PD-1/PD-L1 체크포인트의 기능적 억제를 보여준다. PD-1/PD-L1 축의 차단은 세포 기반 생물발광 PD-1/PD-L1 차단 리포터 분석을 사용하여 테스트되었다. 표시된 데이터는 5개(펨브롤리주맙 및 IgG1-PD1), 3개(IgG1-ctrl-FERR) 또는 2개(니볼루맙) 실험 중 하나의 대표적인 실험에서 중복 웰의 평균 발광 ± SD이다. 약어: FERR = L234F/L235E/G236R-K409R; PD1 = 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1; PD-L1 = 프로그램화된 세포 사멸 1 리간드 1; RLU = 상대광 단위; SD = 표준편차.
도 14는 항원-특이적 T-세포 증식 분석에서 IgG1-PD1에 의한 CD8+ T-세포 증식의 향상을 보여준다. 인간 CD8 + T 세포를 CLDN6-특이적 TCR을 인코딩하는 RNA 및 PD-1을 인코딩하는 RNA로 전기천공하고 CFSE로 표지하였다. 그런 다음 T 세포를 IgG1-PD1, 펨브롤리주맙, 니볼루맙 또는 IgG1-ctrl-FERR의 존재하에 CLDN6-인코딩 RNA로 전기천공된 iDC와 공동 배양하였다. T 세포의 CFSE 희석은 4일 후에 유동 세포 계측법으로 분석되었으며 확장 지수를 계산하는 데 사용되었다. 세 번의 독립적인 실험에서 평가된 4명의 기증자 중 한 명의 대표 기증자(26268_B)의 데이터가 표시된다. 오차 막대는 중복 웰의 SD를 나타낸다. GraphPad Prism을 사용하여 4-매개변수 로그 맞춤으로 곡선을 맞추었다. 약어: CFSE = 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르; FERR = L234F/L235E/G236R-K409R; PD1 = 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1; SD = 표준편차.
도 15는 동종이계 MLR 검정에서 IgG1-PD1-유도된 IFNγ 분비를 보여준다. 동종이계 인간 mDC와 CD8+ T 세포의 세 가지 독특한 기증자 쌍을 IgG1-PD1 또는 펨브롤리주맙의 존재 하에 5일 동안 공동배양하였다. IgG1-ctrl-FERR 및 IgG4 이소형 대조군이 음성 대조군으로 포함되었다. IFNγ 분비는 IFNγ- 특이적 면역분석법을 사용하여 상등액에서 분석되었다. 표시된 데이터는 3개의 고유한 독특한 동종이계 기증자 쌍에 대한 평균(SEM) 농도의 평균 ± 표준 오차이다. 약어: FERR = L234F/L235E/G236R-K409R; IFN = 인터페론; IgG = 면역글로불린 G; mDC = 성숙한 수지상 세포; MLR = 혼합 림프구 반응; SEM = 평균의 표준 오차.
도 16은 동종이계 MLR 검정에서 IgG1-PD1-유도된 사이토카인 분비를 보여준다. 동종이계 인간 mDC 및 CD8+ T 세포의 3개의 독특한 기증자 쌍을 1 μg/mL IgG1-PD1 또는 펨브롤리주맙의 존재 하에 5일 동안 공동배양하였다. IgG1-ctrl-FERR은 음성 대조군으로 포함되었다. Luminex를 사용하여 상등액에서 사이토카인 분비를 분석하였다. (A) 사이토카인 수준은 처리되지 않은 공동배양에서 측정된 사이토카인 수준에 대한 평균 배수 변화로 표시된다. (B) 3가지 고유한 동종 기증자 쌍의 사이토카인 생산 수준이 표시되어 있으며, 수평선은 평균, 상한 및 하한을 나타낸다. 약어: FC = 배수 변화; FERR = L234F/L235E/G236R-K409R; GM-CSF = 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자; IgG=면역글로불린 G; IL = 인터루킨; MCP-1 = 단핵구 화학유인물질 단백질 1; mDC = 성숙한 수지상 세포; MLR = 혼합 림프구 반응; TNF = 종양 괴사 인자.
도 17은 막 결합된 IgG1-PD1에 대한 C1q 결합을 보여준다. 자극된 인간 CD8+ T 세포를 사용하여 C1q와 IgG1-PD1의 결합을 분석하였다. IgG1-PD1, IgG1 -ctrl-FERR, IgG1-ctrl 또는 양성 대조군 항체 IgG1-CD52-E430G(불활성 돌연변이가 없고 6량체화 강화 돌연변이가 있음)와 함께 배양한 후, C1q 공급원으로서 인간 혈청과 함께 세포를 배양하였다. C1q의 결합은 FITC -접합된 토끼 항-C1q 항체를 사용하여 검출되었다. 표시된 데이터는 세 번의 비교 가능한 실험에서 7명의 기증자 중 한 명의 대표 기증자로부터 얻은 중복 웰의 기하 평균 형광 강도(gMFI) ± 표준 편차(SD)이다. 약어: FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; gMFI = 기하 평균 형광 강도; PE = R-피코에리트로시아닌.
도 18은 IgG1-PD1의 FcγR 결합을 보여준다. 고정된 인간 재조합 FcγR 구축물에 대한 IgG1-PD1의 결합을 적격 분석(n=1)의 SPR에 의해 다음과 같이 분석되었다: IgG1-PD1의 FcγRIa (A), FcγRIIa-H131 (B), FcγRIIa-R131 (C), FcγRIIb (D), FcγRIIIa-F158 (E), 및 FcγRIIIa-V158 (F) 결합. 항체 IgG1-ctrl(FER 불활성 돌연변이 없음)은 결합에 대한 양성 대조군으로 포함되었다. 약어: ctrl = 대조군; FcγR = Fc 감마 수용체; IgG = 면역글로불린 G; PD-1 = 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1; RU = 공명 단위.
도 19는 IgG1-PD1 및 몇몇 다른 항PD-1 항체의 FcγR 결합을 보여준다. 고정된 인간 재조합 FcγR 구축물에 대한 IgG1-PD1, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 도스탈리맙 및 세미플리맙의 결합은 다음과 같이 분석되었다. SPR(n=3). 시험 항체의 FcγRIa (A), FcγRIIa-H131 (B), FcγRIIa-R131 (C), FcγRIIb (D), FcγRIIIa-F158 (E), 및 FcγRIIIa-V158 (F) 결합. IgG1-ctrl 및 IgG4-ctrl 항체는 야생형 Fc 영역과 IgG1 및 IgG4 분자의 FcγR 결합에 대한 양성 대조군으로서 포함되었다. 세 가지 개별 실험의 결합 반응 ± SD가 표시된다. 약어: ctrl = 대조군; FcγR = Fc 감마 수용체; IgG = 면역글로불린 G; PD-1 = 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1; RU = 공명 단위.
도 20은 IgG1-PD1 및 몇몇 다른 항 -PD-1 항체의 FcγRIa 결합을 보여준다. 인간 FcγRIa를 일시적으로 발현하는 CHO-S 세포에 대한 IgG1-PD1, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 도스탈리맙, 및 세미플리맙의 결합을 유세포 분석법으로 분석하였다. IgG1-ctrl 및 IgG1-ctrl-FERR은 각각 양성 및 음성 대조군으로 포함되었다. 약어: ctrl = 대조군; FcγR = Fc 감마 수용체; FERR = L234F/L235E/G236R-K409R; huIgG = 인간 면역글로불린 G; PD-1 = 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1; PE = R-피코에리트린.
도 21은 마우스 혈장 샘플의 전체 인간 IgG를 보여준다. 마우스에게 t=0에서 1 또는 10 mg/kg IgG1-PD1을 정맥 주사하고 주사 후 10분, 4시간, 1일, 2일, 8일, 14일 및 21일에 혈장 샘플을 채취하였다. 혈장 샘플의 총 huIgG는 각 마우스에 대해 ECLIA에 의해 결정되었다. 데이터는 3마리 개별 마우스의 평균 huIgG 농도 ± SD 로 표시된다. 파선은 인간의 IgG 제거에 기초한 2구획 모델에 의해 예측된 야생형(wt) huIgG의 혈장 농도를 나타낸다(Bleeker et al., 2001, Blood. 98(10):3136-42). 점선은 LLOQ 및 ULOQ를 나타낸다. 약어: huIgG = 인간 IgG; IgG = 면역글로불린 G; LLOQ = 정량 하한; PD-1 = 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1; SD = 표준편차; ULOQ = 정량 상한.
도 22는 인간 PD-1 녹인(knock-in) 마우스에서의 IgG1-PD1의 항종양 활성을 보여준다. MC38 결장암 동계(syngeneic) 종양 모델은 hPD-1 KI 마우스에 SC 이식을 통해 확립되었다. 마우스에게 0.5, 2 또는 10 mg/kg IgG1-PD1 또는 펨브롤리주맙 또는 10 mg/kg IgG1-ctrl-FERR 2QW×3(그룹당 9마리의 마우스)을 투여하였다. (A) 그룹이 완료된 마지막 시점까지 각 그룹의 평균 종양 크기 ± SEM. (B) 모든 그룹이 완료된 마지막 날(제11일)의 다양한 그룹의 종양 크기. 표시된 데이터는 각 치료 그룹의 개별 마우스의 종양 크기뿐만 아니라 치료 그룹당 평균 종양 크기 ± SEM이다. Mann-Whitney 분석을 사용하여 치료 그룹의 종양 크기를 IgG1-ctrl-FERR 치료 그룹과 비교하였다(*p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001). C. 종양 크기가 500 mM3 미만인 마우스의 백분율로 정의되는 무진행 생존율을 Kaplan-Meier 곡선으로 나타내었다. 이 분석에서는 종양 크기가 500 mM3를 초과하기 전인 16일째에 원인 불명의 이유로 사망한 것으로 발견된 2 mg/kg IgG1-PD1 그룹에서 한 마리의 마우스를 배제하였다. 약어: 2QW×3 = 3주 동안 주당 2회; Ctrl = 대조군; FERR = L234F/L235E/G236R/K409R 돌연변이; IgG = 면역글로불린 G; KI = 녹인; PD-1 = 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1; SC = 피하; SEM = 평균의 표준 오차.
도 23은 성숙한 수지상 세포(mDC)와 정제된 CD8+ T 세포의 혼합 림프구 반응(MLR)에서 아테졸리주맙, 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙과 조합된 DuoBody-CD40x4-1BB에 의해 유도된 IFNγ (A), GM-CSF (B), TNFα (C), IL-2 (D) 및 IL-6 (E)의 분비를 보여준다. 정제된 CD8+ T 세포를 DuoBody-CD40×4-1BB(0.001 - 30 μg/mL), 아테졸리주맙(1 μg/mL), 니볼루맙(1 μg/mL) 또는 존재 하에 동종 LPS-성숙 DC와 공동 배양하였다. 펨브롤리주맙 (1 μg/mL) 단독의 존재 하, 또는 DuoBody-CD40×4-1BB과 아테졸리주맙, 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙과의 조합의 존재 하에 동종이계 LPS 성숙 DC와 함께 5일 동안 공동 배양하였다. 무처리 공동 배양체(No Tx), 또는 bsIgG1-CD40×ctrl(30 μg/mL), bsIgG1-ctrl×4-1BB(30 μg/mL) 또는 IgG1-ctrl-FEAL(30 μg/mL)로 처리된 공동배양체를 대조군으로서 포함시켰다. IFNγ의 분비는 ELISA로 분석하였고, GM-CSF, TNFα, IL-2 및 IL-6의 분비는 Luminex로 분석하였다. 표시된 데이터는 한 실험에서 테스트된 4개 쌍 중 하나의 대표적인 기증자 쌍의 중복 웰의 평균 + 표준 편차(SD)이다.
도 24는 시험관내에서 T 세포 증식에 대한 항PD-(L)1 항체와 조합된 DuoBody-CD40x4-1BB의 효과를 보여준다. 인간 CD8+ T 세포를 PD-1을 인코딩하는 RNA와 함께 CLDN6-특이적 TCR을 인코딩하는 RNA로 전기천공하고 CFSE로 표지하였다. 그런 다음 T 세포를 DuoBody-CD40×4-1BB(0.2, 0.0067 또는 0.0022 μg/mL) 및 항PD-1 항체 IgG1-PD1(0.8 μg/mL), 펨브롤리주맙 (0.8 μg/mL) 또는 니볼루맙(1.6 μg/mL), 항PD-L1 항체 아테졸리주맙(0.4 μg/mL) 또는 음성 대조군 항체 IgG1-ctrl- FERR(0.8 μg/mL)의 존재 또는 부재 하에 CLDN6-인코딩 RNA로 전기천공된 iDC와 4일 동안 공동 배양하였다. T 세포의 CFSE 희석을 유세포 분석으로 분석하고 확장 지수를 계산하는 데 사용하였다. 테스트한 기증자 4명 중 대표 기증자 1명의 데이터가 표시된다. 오차 막대는 중복 웰의 SD를 나타낸다. 점선은 항체 처리 없이 iDC와 공동 배양된 CD8+ T 세포의 확장 지수를 나타낸다. CFSE = 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르; CLDN6 = 클라우딘-6; iDC = 미성숙 수지상 세포; PD-(L)1 = 프로그램화된 세포 사멸 단백질(리간드) 1; SD = 표준편차; TCR = T 세포 수용체.　
도 25는 시험관내에서 사이토카인 분비에 대한 항PD-(L)1 항체와 조합된 DuoBody-CD40x4-1BB의 효과를 보여준다. CLDN6-특이적 TCR 및 PD-1을 발현하는 인간 CD8+ T 세포를 DuoBody-CD40×4-1BB(0.2, 0.0067 또는 0.0022 μg/mL) 및 항PD-1 항체 IgG1-PD1(0.8 μg/mL), 펨브롤리주맙(0.8 μg/mL) 또는 니볼루맙(1.6 μg/mL), 항PD-L1 항체 아테졸리주맙(0.4 μg/mL), 또는 음성 대조군 항체 IgG1-ctrl-FERR(0.8 μg/mL)의 존재 하에 도 24에서와 같이 4일 동안 CLDN6-발현 iDC와 공동 배양하였다. 사이토카인 농도는 다중화된 ECLIA에 의해 상등액에서 측정되었다. 테스트한 기증자 4명 중 대표 기증자 1명의 데이터가 표시된다. 오차 막대는 중복 웰의 SD를 나타낸다. CLDN6 = 클라우딘-6; ECLIA = 전기화학발광 면역분석; GM-CSF = 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자; iDC = 미성숙 수지상 세포; IFN = 인터페론; IL = 인터루킨; PD-(L)1 = 프로그램화된 세포 사멸 단백질(리간드) 1; SD = 표준편차; TCR = T 세포 수용체; TNF = 종양 괴사 인자.
도 26은 시험관내에서 T 세포 증식에 대한 항PD-(L)1 항체와 조합된 DuoBody-CD40x4-1BB의 효과를 보여준다. CellTrace Violet으로 표지된 인간 PBMC를 DuoBody-CD40×4-1BB(0.2 μg/mL) 및 항PD-1 항체인 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙 또는 항PD-L1 항체 아테졸리주맙(모두 0.05, 0.5 또는 5 μg/mL)의 단독 또는 조합 존재하에, 또는 음성 대조군 항체 IgG1-ctrl-FEAL(0.2 μg/mL)의 존재 하에 4일 동안 항-CD3 항체(0.09 μg/mL)으로 자극하였다. CD8+(도 A) 및 CD4+ T(도 B) 세포의 CellTrace Violet 희석을 유세포 분석으로 분석하고 확장 지수를 계산하는 데 사용하였다. 테스트한 3명의 기증자 중 한 명의 대표 기증자의 데이터가 표시된다. 오차 막대는 3중 웰의 SD를 나타낸다. 점선은 IgG1-ctrl-FEAL로 처리된 세포의 확장 지수를 나타낸다. 파선은 단일 제제 DuoBody-CD40×4-1BB로 처리된 세포의 확장 지수를 나타낸다. PD-(L)1 = 프로그램화된 세포 사멸 단백질(리간드) 1; PBMC = 말초 혈액 단핵 세포; SD = 표준편차.
도 27은 두 라운드의 CD3/CD28 자극 후 CD3+ T 세포의 탈진된 것과 같은 표현형(exhausted-like phenotype)의 특징을 보여준다. (A) 시험관내에서 탈진된 CD3+ T 세포에 대한 LAG3의 발현을 유세포 분석법으로 측정하였다. 표시된 데이터는 배경 형광(ΔMFI)에 대해 보정된 중앙 형광 강도이다. (B) 시험관내에서 탈진된 CD3+ T 세포를 처리 없이 또는 1 μg/mL 펨브롤리주맙의 존재 하에 동종 이계 LPS-성숙 DC와 공동 배양하였다. IFNγ의 분비는 AlphaLISA 로 분석하고 IL-2의 분비는 MSD 멀티플렉스로 분석하였다. 표시된 데이터는 두 번의 실험에서 테스트된 두 쌍 중 하나의 대표적인 기증자 쌍의 중복 웰의 평균 + 표준 편차(SD)이다.
도 28은 성숙한 수지상 세포(mDC) 및 시험관내 탈진된 CD3+ T 세포(Tex)의 혼합 림프구 반응(MLR)에서 펨브롤리주맙과 조합된 DuoBody-CD40x4-1BB에 의해 유도된 IFNγ(A) 및 IL-2(B)의 분비를 나타낸다. Tex를 DuoBody-CD40×4-1BB(0.001 - 30 μg/mL) 또는 펨브롤리주맙(1 μg/mL)의 단독 또는 조합 존재 하에 5일 동안 동종이계 LPS-성숙 DC와 공동 배양하였다. 무처리(No Tx) 또는 bsIgG1-CD40×ctrl(30 μg/mL), bsIgG1-ctrl×4-1BB(30 μg/mL) 또는 IgG1-ctrl-FEAL(30 μg/mL)로 처리된 공동 배양체를 대조군으로서 포함시켰다. IFNγ의 분비는 AlphaLISA 로 분석하고 IL-2의 분비는 MSD 멀티플렉스로 분석하였다. 표시된 데이터는 두 번의 실험에서 테스트된 두 개의 기증자 쌍 중 하나의 대표적인 기증자 쌍의 중복 웰의 평균 + 표준 편차(SD)이다.
본 개시내용이 아래에 더 자세히 추가로 기술되어 있지만, 본 개시내용은 본원에 기술된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약이 다양할 수 있으므로 이에 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 목적으로 사용된 것이며, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 본 개시의 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해하여야 한다. 다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
이하에서, 본 개시의 구성요소들이 더 상세히 설명될 것이다. 이들 요소는 특정 구현예와 함께 나열되어 있지만, 추가적인 구현예를 생성하기 위해 임의의 방식으로, 임의의 개수로 결합될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 다양하게 설명된 예와 바람직한 구현예는 본 개시 내용을 명시적으로 설명된 구현예에만 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다. 이러한 설명은 명시적으로 설명된 구현예를 임의의 수의 개시된 및/또는 바람직한 요소와 결합하는 구현예를 지원하고 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 출원에 기술된 모든 요소의 임의의 순열 및 조합은 문맥상 달리 나타내지 않는 한 본 출원의 설명에 개시된 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 본원에 사용된 결합제의 바람직한 구현예에서 제1 중쇄는 SEQ ID NO: 26 또는 34 [IgG1-Fc_FEAR]에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되며, 본원에 사용된 결합제의 또 다른 바람직한 구현예에서 제2 중쇄는 SEQ ID NO: 25 또는 33 [IgG1-Fc_FEAL]에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 구성되며, 본 명세서에서 사용된 결합제의 추가의 바람직한 구현예에서 제1 중쇄는 SEQ ID NO: 26 또는 34 [IgG1-Fc_FEAR]에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 구성되거나 이로 구성되고, 제2 중쇄는 SEQ ID NO: 25 또는 33 [IgG1-Fc_FEAL]에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 본질적으로 구성되거나 구성된다.
좋기로는, 본 명세서에서 사용되는 용어는 문헌 ["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Reco mMendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)]에 기재된 바와 같이 정의된다.
본 개시내용의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 해당 분야의 문헌에 설명되어 있는 통상적인 화학, 생화학, 세포 생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기술을 사용gks이다 (예를 들어, Organikum, Deutscher Verlag der Wissenschaften, Berlin 1990; Streitwieser/Heathcook, "Organische Chemie", VCH, 1990; Beyer/Walter, Lehrbuch der Organischen Chemie", S. Hirzel Verlag Stuttgart, 1988; Carey/Sundberg, Organische Chemie", VCH, 1995; March, "Advanced Organic Chemistry", John Wiley & Sons, 1985; Rφmpp Chemie Lexikon, Falbe/Regitz (Hrsg.), Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1989; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989 참조).
본 명세서에 기술된 모든 방법은 본 명세서에 달리 명시되지 않거나 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 임의의 그리고 모든 예 또는 예시적인 언어(예를 들어, "와 같은")의 사용은 단지 본 개시내용을 더 잘 설명하기 위한 것이며 달리 청구된 본 개시내용의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 명세서에서 값의 범위를 언급하는 것은 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 참조하는 약칭 방법의 역할을 하도록 의도된 것이다. 본 명세서에 달리 명시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 마치 본 명세서에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 여러 문서가 인용되어 있다. 위 또는 아래에 인용된 각 문서(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조사의 사양, 지침 등 포함)는 그 전체가 참조로 포함된다. 본 문서의 어떠한 내용도 본 발명이 이전 발명으로 인해 그러한 개시에 앞서는 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
정의
이하에, 본 개시의 모든 측면에 적용되는 정의를 제공한다. 다음 용어들은 달리 명시하지 않는 한 다음과 같은 의미를 갖는다. 정의되지 않은 용어는 해당 분야에서 인식되는 의미를 갖는다.
본 명세서와 이어지는 청구범위에서, 달리 요구되지 않는 한, "포함한다" 라는 단어와 "포함하다" 및 "포함하는" 등의 파생어는 명시된 구성원, 정수 또는 단계 또는 그룹을 포함하는 한편, 그 밖의 다른 구성원, 정수 또는 단계 또는 그룹을 배제하지 않는다. "본질적으로 구성되는"이라는 용어는 본질적인 의미를 갖는 다른 구성원, 정수 또는 단계를 제외하는 것을 의미한다. "포함하는"이라는 용어는 "본질적으로 구성되는"이라는 용어를 포함하며, 이는 다시 "구성되는"이라는 용어를 포함한다. 따라서, 본 출원의 각 경우에, "포함하는"이라는 용어는 "본질적으로 구성되는" 또는 "구성되는"이라는 용어로 대체될 수 있다. 마찬가지로, 본 출원의 각 경우에, "본질적으로 구성되는"이라는 용어는 "구성되는"이라는 용어로 대체될 수 있다.
"a", "an" 및 "the" 및 유사한 용어는, 본 개시내용을 기술하는 맥락에서(특히 청구범위의 맥락에서) 본원에 달리 표시되거나 또는 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한, 단수 및 복수를 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본 명세서에서 값의 범위를 언급하는 것은 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 참조하는 약칭 방법의 역할을 하도록 의도된 것이다. 본 명세서에 달리 명시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 마치 본 명세서에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 경우, "및/또는"은 서로의 유무에 관계없이 두 개의 지정된 특징 또는 구성 요소 각각을 특정하게 개시하는 것으로 간주된다. 예를 들어, "X 및/또는 Y"는 (i) X, (ii) Y, (iii) X 및 Y 각각에 대한 특정 개시로 간주되며, 이는 이들 각각이 본 명세서에서 개별적으로 설명되는 것과 같다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "약"은 해당 특징의 기술적 효과를 여전히 보장하기 위해 통상의 기술자가 이해할 수 있는 정확도의 간격을 의미한다. 이 용어는 일반적으로 표시된 숫자 값과의 편차가 ±5%, ±4%, ±3%, ±2%, ±1%, ±0.9%, ±0.8%, ±0.7%, ±0.6%, ±0.5%, ±0.4%, ±0.3%, ±0.2%, ±0.1%, ±0.05%, 및 예컨대 ±0.01%임을 가리킨다. 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 주어진 기술적 효과에 대한 수치의 구체적인 편차는 기술적 효과의 성격에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 자연적 또는 생물학적 기술적 효과는 일반적으로 인공적 또는 공학적 기술적 효과보다 그러한 편차가 더 클 수 있다.
본 개시내용의 맥락에서 용어 "결합제(binding agent)"는 원하는 항원에 결합할 수 있는 임의의 제제를 지칭한다. 본 개시내용의 특정 구현예에서, 결합제는 항체, 항체 단편, 또는 그의 구조물이다. 결합제는 또한 합성, 변형 또는 비천연 발생 부분, 특히 비펩타이드 부분을 포함할 수 있다. 이러한 모이어티는 예를 들어 원하는 항원 결합 기능 또는 항체 또는 항체 단편과 같은 영역을 연결할 수 있다. 일 구현예에서, 결합제는 항원-결합 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 합성 구조물이다.
본 명세서에 사용된 "면역 체크포인트"는 면역 체계의 조절인자, 특히 항원의 T 세포 수용체 인식의 진폭과 품질을 조절하는 공동자극 및 억제 신호를 의미한다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트는 억제 신호이다. 특정 구현예에서, 억제 신호는 PD-1과 PD-L1 및/또는 PD-L2 사이의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 억제 신호는 CD28 결합을 대체하는 CTLA-4와 CD80 또는 CD86 사이의 상호작용이다. 특정 구현예에서 억제 신호는 LAG-3과 MHC 클래스 II 분자 사이의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 억제 신호는 TIM-3과 갈렉틴 9, PtdSer, H mgB1 및 CEACAM1과 같은 그의 리간드 중 하나 이상 사이의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 억제 신호는 하나 또는 여러 KIR과 이들의 리간드 사이의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 억제 신호는 TIGIT와 그의 리간드 중 하나 이상, PVR, PVRL2 및 PVRL3 사이의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 억제 신호는 CD94/NKG2A와 HLA E 사이의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 억제 신호는 VISTA와 그의 결합 파트너(들) 사이의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 억제 신호는 하나 이상의 Siglecs와 이들의 리간드 사이의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 억제 신호는 GARP와 하나 이상의 그의 리간드 사이의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 억제 신호는 CD47과 SIRPα 사이의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 억제 신호는 PVRIG와 PVRL2 사이의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 억제 신호는 CSF1R과 CSF1 사이의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 억제 신호는 BTLA와 HVEM 사이의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 억제 신호는 아데노신성 경로의 일부, 예를 들어 CD39 및 CD73에 의해 생성된 A2AR 및/또는 A2BR과 아데노신 사이의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 억제 신호는 B7-H3과 그의 수용체 및/또는 B7-H4와 그의 수용체 사이의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 억제 신호는 IDO, CD20, NOX 또는 TDO에 의해 매개된다.
용어 "체크포인트 억제제"(CPI) 및 "면역 체크포인트(ICP) 억제제"는 본원에서 동의어로 사용된다. 이들 용어는 특히 면역 체크포인트의 억제 신호를 억제하는 면역 체크포인트를 억제하는 결합제와 같은 분자와 같이, 하나 이상의 체크포인트 단백질을 전체적으로 또는 부분적으로 감소, 억제, 방해하거나 음성적으로 조절하거나 또는 하나 이상의 체크포인트 단백질의 발현을 전체적으로 또는 부분적으로 감소, 억제, 방해하거나 음성적으로 조절하는 결합제와 같은 분자를 의미한다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 하나 이상의 체크포인트 단백질에 결합한다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 체크포인트 단백질을 조절하는 하나 이상의 분자에 결합한다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 예를 들어 DNA- 또는 RNA 수준에서 하나 이상의 체크포인트 단백질의 전구체에 결합한다. 본 개시내용에 따른 체크포인트 억제제로서 기능하는 임의의 제제가 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "부분적으로"는 예를 들어 체크포인트 단백질의 억제 수준의 경우 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 수준을 의미한다.
일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 면역 체크포인트의 억제 신호를 억제하는 임의의 결합제와 같은 임의의 화합물일 수 있으며, 여기서 억제 신호는 PD-1과 PD-L1 및/또는 PD-L2 사이의 상호작용; CD28 결합을 대체하기 위한 CTLA-4와 CD80 또는 CD86 사이의 상호작용; LAG-3과 MHC 클래스 II 분자 사이의 상호작용; TIM-3과 갈렉틴 9, PtdSer, H mgB1 및 CEACAM1과 같은 하나 이상의 그의 리간드 사이의 상호작용; 하나 또는 여러 KIR과 그의 리간드 간의 상호 작용; TIGIT와 하나 이상의 그의 리간드인 PVR, PVRL2 및 PVRL3 사이의 상호작용; CD94/NKG2A와 HLA E 사이의 상호작용 -; VISTA와 바인딩 파트너 간의 상호 작용 하나 이상의 Siglec과 이들의 리간드 사이의 상호작용; GARP와 그의 리간드 중 하나 이상 사이의 상호작용; CD47과 SIRPα 사이의 상호작용; PVRIG와 PVRL2 사이의 상호작용; CSF1R과 CSF1 사이의 상호작용; BTLA와 HVEM 간의 상호 작용; 아데노신성 경로의 일부, 예를 들어 CD39 및 CD73에 의해 생성되는 A2AR 및/또는 A2BR과 아데노신 사이의 상호작용; B7-H3과 그의 수용체 및/또는 B7-H4와 그의 수용체 사이의 상호작용; IDO, CD20, NOX 또는 TDO에 의해 매개되는 억제 신호로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 PD-1 억제제, PD-L1 억제제, PD-L2 억제제, CTLA-4 억제제, TIM-3 억제제, KIR 억제제, LAG-3 억제제, TIGIT 억제제, VISTA 억제제 및 GARP 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종이다. 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 PD-1 차단 항체, CTLA4 차단 항체, PD-L1 차단 항체, PD-L2 차단 항체, TIM-3 차단 항체, KIR 차단 항체, LAG-3 차단 항체, TIGIT 차단 항체, VISTA 차단 항체, 또는 GARP 차단 항체와 같은 차단 항체일 수 있다. PD-1 차단 항체의 예에는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 세미플리맙 및 스파탈리주맙이 포함된다. CTLA4 차단 항체의 예에는 이필리무맙 및 트레멜리무맙이 포함된다. PD-L1 차단 항체의 예에는 아테졸리주맙, 더발루맙, 아벨루맙이 포함된다.
일 구현예에서, 항PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 43의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 44의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일 구현예에서, 항PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 다음:
(i) SEQ ID NO: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1;
(ii) SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및
(iii) SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
을 포함하고, 여기서 경쇄 가변 영역은 다음:
(i) SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
(ii) SEQ ID NO: 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및
(iii) SEQ ID NO: 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
을 포함한다.
본원에 기재된 항PD-1 항체의 일 구현예에서, 중쇄 가변 도메인은 SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용하기에 적합한 면역 체크포인트 억제제는 억제 신호의 길항제, 예를 들어 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, B7-H3 또는 B7-H4를 표적으로 하는 항체이다. 이들 리간드 및 수용체는 문헌 [Pardoll, D., Nature. 12: 252-264, 2012]에서 검토된다. 본 개시내용에 따라 표적화될 수 있는 추가 면역 체크포인트 단백질이 본원에 기재되어 있다.
"면역글로불린"이라는 용어는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 단백질, 좋기로는 항체 또는 B 세포 수용체(BCR)와 같은 항원 수용체에 관한 것이다. 면역글로불린은 특징적인 면역글로불린(Ig) 접힘을 갖는 구조적 도메인, 즉 면역글로불린 도메인을 특징으로 한다. 이 용어는 수용성 면역글로불린뿐만 아니라 막 결합 면역글로불린도 포함한다. 막 결합 면역글로불린은 표면 면역글로불린 또는 막 면역글로불린이라고도 하며 일반적으로 BCR의 일부이다. 가용성 면역글로불린은 일반적으로 항체라 칭해진다.
면역글로불린의 구조는 잘 특성화되어 있다. 예를 들어, 문헌[Fundamental I mMunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))] 참조. 간략하게, 면역글로불린은 일반적으로 여러 사슬, 전형적으로 이황화 결합을 통해 연결된 두 개의 동일한 중쇄와 두 개의 동일한 경쇄를 포함한다. 이들 사슬은 주로 면역글로불린 또는 영역, 예컨대 VL 또는 VL (가변 경쇄) 도메인/영역, CL 또는 CL (불변 경쇄) 도메인/영역, VH 또는 VH 가변 중쇄) 도메인/영역, 및 CH 또는 CH (불변 중쇄) 도메인/영역 CH1 (CH1), CH2 (CH2), CH3 (CH3), 및 CH4 (CH4)로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 일반적으로 CH1, CH2 및 CH3의 세 가지 도메인으로 구성된다. 힌지 영역은 중쇄의 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이의 영역으로 유연성이 매우 높다. 힌지 영역의 이황화 결합은 IgG 분자의 두 중쇄 사이의 상호작용의 일부이다. 각 경쇄는 일반적으로 VL과 CL로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 일반적으로 CL이라는 하나의 도메인으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 더 보존된 영역이 산재되어 있는 초가변 영역(또는 서열 및/또는 구조적으로 정의된 루프의 형태에서 초가변이 있을 수 있는 초가변 영역)으로 더 세분될 수 있으며, 보다 보존된 영역, 즉 프레임워크 영역(FR)이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)이라고도 한다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 다음의 순서로 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4(또한 문헌 (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987) 참조). 달리 언급되거나 문맥상 모순되지 않는 한, 본 명세서의 CDR 서열은 DomainGapAlign (Lefranc MP., Nucleic Acids Research 1999;27:209-212 and Ehrenmann F., Kaas Q. and Lefranc M.-P. Nucleic Acids Res., 38, D301-307 (2010)을 이용하는 IMGT 규칙에 따라 식별된다: 또한 인터넷 주소 www.i mgt.org 참조. 달리 명시하지 않거나 문맥상 모순되지 않는 한, 본 개시내용의 불변 영역에서 아미노산 위치에 대한 언급은 EU 넘버링(Edelman et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1969 May;63(1):78-85; Kabat et al., Sequences of Proteins of I mMunological Interest, Fifth Edition. 1991 NIH Publication No. 91-3242)에 따른다.
포유류 면역글로불린 중쇄에는 5가지 유형, 즉 α, δ, ε, γ, 및 μ가 있으며 이는 서로 다른 클래스의 항체, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 설명한다. 가용성 면역글로불린의 중쇄와 달리, 막 또는 표면 면역글로불린의 중쇄는 카르복시 말단에 막관통 도메인과 짧은 세포질 도메인을 포함한다. 포유동물에는 두 가지 유형의 경쇄, 즉 람다 및 카파가 있다. 면역글로불린 사슬은 가변 영역과 불변 영역을 포함한다. 불변 영역은 본질적으로 면역글로불린의 다양한 이소형 내에서 보존되며, 가변 부분은 매우 다양하며 항원 인식을 설명한다.
용어 "아미노산" 및 "아미노산 잔기"는 본원에서 호환적으로 사용될 수 있으며, 제한하는 것으로 이해되어서는 아니된다. 아미노산은 각 아미노산에 특정한 측쇄(R 그룹)와 함께 아민(-NH2) 및 카르복실(COOH) 작용기를 포함하는 유기 화합물이다. 본 개시내용의 맥락에서, 아미노산은 구조 및 화학적 특징에 기초하여 분류될 수 있다. 따라서 아미노산의 종류는 다음 표 중 하나 또는 둘 다에 반영될 수 있다.
본 개시내용의 목적을 위해, 아미노산 서열(펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드)의 "변이체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 첨가 변이체, 아미노산 결실 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. "변이체"라는 용어는 모든 돌연변이체, 스플라이스 변이체, 번역 후 변형된 변이체, 배열, 이소형, 대립유전자 변이체, 종 변이체 및 종 상동체, 특히 자연적으로 발생하는 것들을 포함한다. "변이체"라는 용어는 특히 아미노산 서열의 단편을 포함한다.
아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에 단일 또는 2개 이상의 아미노산이 삽입되는 것을 포함한다. 삽입을 갖는 아미노산 서열 변이체의 경우, 하나 이상의 아미노산 잔기가 아미노산 서열의 특정 부위에 삽입되지만, 생성된 산물에 대한 적절한 스크리닝을 통해 무작위 삽입도 가능하다.
아미노산 첨가 변이체는 하나 이상의 아미노산, 예를 들어 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50개 이상의 아미노산의 아미노- 및/또는 카르복시-말단 융합을 포함한다.
아미노산 결실 변이체는 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개 이상의 아미노산을 제거하는 것과 같이 서열로부터 하나 이상의 아미노산을 제거하는 것을 특징으로 한다. 결실은 단백질의 어느 위치에나 있을 수 있다. 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단 끝에서 결실을 포함하는 아미노산 결실 변이체는 N-말단 및/또는 C-말단 절단(truncation) 변이체라고도 한다.
아미노산 치환 변이체는 서열에서 적어도 하나의 잔기가 제거되고 그 자리에 다른 잔기가 삽입되는 것을 특징으로 한다. 한 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 것은 보존적 또는 비보존적 치환으로 분류될 수 있다. 상동성 단백질 또는 펩타이드 사이에 보존되지 않는 아미노산 서열의 위치에 변형이 있는 것 및/또는 아미노산을 유사한 특성을 갖는 다른 것으로 대체하는 것이 바람직하다. 좋기로는, 펩타이드 및 단백질 변이체의 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉 유사하게 하전되거나 하전되지 않은 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 측쇄와 관련된 아미노산 패밀리 중 하나의 치환을 포함한다. 본 개시내용의 맥락에서, "보존적 치환"은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특징을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것이며, 예를 들어 하나의 아미노산 잔기를 동일한 부류의 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것이다. 위의 두 표 중 하나에 정의되어 있다. 예를 들어 류신은 둘 다 지방족 분지형 소수성이므로 이소류신으로 대체될 수 있다. 유사하게, 아스파르트산은 둘 다 작고 음으로 하전된 잔기이기 때문에 글루탐산으로 대체될 수 있다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 일반적으로 산성(아스파르트산염, 글루타메이트), 염기성(리신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성(알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판) 및 비하전 극성(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신) 아미노산의 네 가지 계열로 나눌 수 있다. 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 때때로 함께 방향족 아미노산으로 분류된다. 일 구현예에서, 보존적 아미노산 치환은 다음 그룹 내의 치환을 포함한다:
- 글리신, 알라닌;
- 발린, 이소류신, 류신;
- 아스파르트산, 글루타민산;
- 아스파라긴, 글루타민;
- 세린, 트레오닌;
- 리신, 아르기닌; 그리고
- 페닐알라닌, 티로신.
본 명세서에서 용어 "..위치에 해당하는 아미노산" 및 이와 유사한 표현은 인간 IgG1 중쇄 내의 아미노산 위치 번호를 의미한다. 다른 면역글로불린의 상응하는 아미노산 위치는 인간 IgG1과의 정렬을 통해 찾을 수 있다. 따라서, 다른 서열의 아미노산 또는 세그먼트에 "상응하는" 하나의 서열의 아미노산 또는 세그먼트는 ALIGN, ClustalW 또는 이와 유사한 표준 서열 정렬 프로그램을 사용하여 다른 아미노산 또는 세그먼트와 정렬되는 것이다. 기본 설정이며 인간 IgG1 중쇄와 50% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 동일성을 갖는다. 서열 내의 서열 또는 세그먼트를 정렬하여 서열 내의 상응하는 위치를 아미노산 위치에 결정하는 방법은 본 개시내용에 따라 당업계에 널리 공지된 것으로 간주된다.
본 개시내용의 맥락에서 용어 "항체"(Ab)는 전형적인 생리학적 조건 하에서, 좋기로는 상당한 기간의 반감기 동안, 예를 들어, 적어도 약 30분, 적어도 약 45분, 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 12시간, 약 24시간 이상, 약 48시간 이상, 약 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 이상 등, 또는 기타 기능적으로 관련된 임의의 정의된 기간(예컨대 항원에 대한 항체 결합과 관련된 생리학적 반응을 유도, 촉진, 향상 및/또는 조절하기에 충분한 시간 및/또는 항체가 이펙터 활성을 모집하기에 충분한 시간) 동안, 항원(특히 항원 상의 에피토프)에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 면역글로불린 분자, 면역글로불린 분자의 단편, 또는 이들 중 어느 하나의 유도체를 지칭한다. 특히, 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질을 의미한다. "항체"라는 용어에는 모노클로날 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 및 이들의 조합이 포함된다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH)과 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL)과 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. 가변 영역 및 불변 영역은 또한 본원에서 각각 가변 도메인 및 불변 도메인으로도 지칭된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성 영역, 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 영역으로 더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되며, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로 배열된다. VH의 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3(또는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3으로 명명되고, VL의 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3(또는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)으로 명명된다. 중쇄와 경쇄의 가변 영역에는 항원과 상호작용하는 결합 도메인이 포함되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역(CH) 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하며, 여기서 CH는 다시 불변 도메인 CH1, 힌지 영역, 및 불변 도메인 CH2 및 CH3(아미노-말단에서 카르복시 말단으로 다음 순서대로 배열됨: CH1, CH2, CH3)으로 더 세분될 수 있다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예컨대 이펙터 세포) 및 C1q와 같은 보체 시스템의 구성요소를 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 온전한 면역글로불린일 수 있으며 온전한 면역글로불린의 면역활성 부분일 수 있다. 항체는 일반적으로 면역글로불린 분자의 사량체이다. 항체는 예를 들어 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, Fv, Fab 및 F(ab)2 뿐만 아니라 단일 사슬 항체 및 인간화 항체를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다.
면역글로불린 분자의 중쇄와 경쇄의 가변 영역에는 항원과 상호작용하는 결합 도메인이 포함되어 있다. 본원에 사용된 용어 "결합제"와 "항원-결합 영역"은 호환적으로 사용되며, 항원과 상호작용하고 VH 영역 및 VL 영역 둘 다를 포함하는 영역을 의미한다. 본원에 사용된 항체는 단일특이 항체뿐만 아니라 다수, 예를 들어 2개 이상, 예를 들어 3개 이상의 상이한 항원-결합 영역을 포함하는 다중특이 항체를 포함한다.
전술한 바와 같이, 달리 언급되지 않거나 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한, 본원에서 항체라는 용어는 항원 결합 단편인, 즉 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편을 포함한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. "항체"라는 용어 내에 포함되는 항원 결합 단편의 예에는 (i) Fab' 또는 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편, 또는 WO 2007/059782(Genmab)에 설명된 1가 항체; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 이황화물 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) 본질적으로 VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 본질적으로 구성된 Fv 단편; (v) 본질적으로 VH 도메인으로 구성되고 도메인 항체라고도 칭해지는 dAb 단편(Ward et al., Nature 341, 544 546 (1989))(Holt et al; Trends Biotechnol. 2003 Nov;21(11):484-90); (vi) 카멜리드 또는 나노바디 분자(Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan; 5 (1):111-24); 및 (vii) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 더욱이, Fv 단편의 두 도메인인 VL과 VH는 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 이들을 VL과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단일 사슬 항체 또는 단일 사슬 Fv(scFv)로 알려짐, 예를 들어 Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) and Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) 참조)를 형성하는 단일 단백질로서 만드는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 이용하여 연결될 수 있다. 이러한 단일 사슬 항체는 달리 명시되지 않거나 문맥에 의해 명확하게 표시되지 않는 한 용어 항체 내에 포함된다. 이러한 단편은 일반적으로 항체의 의미에 포함되지만, 이들은 총체적으로 그리고 각각 독립적으로 본 개시 내용의 독특한 특징이며, 서로 다른 생물학적 특성 및 유용성을 나타낸다. 본 개시내용과 관련하여 이들 및 다른 유용한 항체 단편뿐만 아니라 이러한 단편의 이중특이적 형식이 본원에서 추가로 논의된다. 또한 용어 항체에는 달리 명시되지 않는 한 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체(mAb), 키메라 항체 및 인간화 항체와 같은 항체 유사 폴리펩타이드, 및 효소 절단, 펩타이드 합성 및 재조합 기술과 같은 공지 기술에 의해 제공되는, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편(항원 결합 단편)도 포함된다는 점을 이해하여야 한다.
생성된 항체는 모든 이소형을 가질 수 있다. 본원에 사용된 용어 "이소형(isotype)"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 면역글로불린 부류(예를 들어 IgG(예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgD, IgA(예컨대 IgA1, IgA2), IgE, IgM 또는 IgY)를 의미한다. 특정 이소형, 예를 들어 IgG1이 본원에 언급되는 경우, 이 용어는 특정 이소형 서열, 예를 들어 특정 IgG1 서열에 제한되지 않지만, 항체가 서열에 있어서 다른 이소형보다 그 이소형, 예를 들어 IgG1에 더 가깝다는 것을 나타내는 데 사용된다. 따라서, 예를 들어 본원에 개시된 IgG1 항체는 불변 영역의 변이를 포함하여 자연 발생 IgG1 항체의 서열 변이체일 수 있다.
IgG 항체는 알로타입(Jefferis and Lefranc 2009. mAbs Vol 1 Issue 4 1-7에서 검토됨)이라 불리는 다중 다형성 변이체로 존재할 수 있으며, 이들 모두는 본원의 일부 구현예에서 사용하기에 적합하다. 인간 집단의 일반적인 동종이계 변이체는 문자 a, f, n, z 또는 이들의 조합으로 지정된 것이다. 본원의 임의의 구현예에서, 항체는 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 중쇄 Fc 영역을 포함할 수 있다. 추가 구현예에서, 인간 IgG Fc 영역은 인간 IgG1을 포함한다.
본 개시내용의 맥락에서 용어 "다중특이 항체"는 상이한 항체 서열에 의해 정의되는 적어도 2개의 상이한 항원-결합 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 상기 상이한 항원 결합 영역은 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 결합한다. 그러나, 바람직한 구현예에서, 상기 상이한 항원 결합 영역은 상이한 표적 항원에 결합한다. 일 구현예에서, 다중특이 항체는 "이중특이 항체" 또는 "bs"이다. 이중특이 항체와 같은 다중특이 항체는 본 명세서에서 아래에 기술된 임의의 이중특이적 또는 다중특이 항체 형식을 포함하는 임의의 형식일 수 있다.
항체와 관련하여 사용되는 용어 "전장"은 항체가 단편이 아니지만 자연에서 해당 이소형에 대해 일반적으로 발견되는 특정 이소형의 모든 도메인, 예컨대 VH, CH1, CH2, IgG1 항체에 대한 CH3, 힌지, VL 및 CL 도메인을 함유함을 가리킨다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 배선 면역글로불린 서열 및 인간 면역글로불린 불변 도메인으로부터 유래된 가변 및 프레임워크 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 본 명세서에 개시된 인간 항체는 인간 생식계열(germline) 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이, 삽입 또는 결실)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 다른 비인간 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 접목된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항체"는 가변 영역이 비인간 종(예를 들어 설치류로부터 유래)으로부터 유래되고 불변 영역이 인간과 같은 다른 종으로부터 유래된 항체를 의미한다. 키메라 항체는 항체 공학에 의해 생성될 수 있다. "항체 공학"은 다양한 종류의 항체 변형에 일반적으로 사용되는 용어이며, 항체 공학 과정은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 특히, 키메라 항체는 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ch. 15]에 설명된 표준 DNA 기술을 이용하여 생성가능하다. 따라서, 키메라 항체는 유전적으로 또는 효소적으로 조작된 재조합 항체일 수 있다. 키메라 항체를 생성하는 것은 통상의 기술자의 지식 범위 내에 있으므로, 키메라 항체의 생성은 본원에 기술된 방법 이외의 다른 방법에 의해 수행될 수 있다. 인간의 치료 용도를 위한 키메라 모노클로날 항체는 비인간 항체, 예를 들어 설치류 항체의 예상되는 항체 면역원성을 감소시키기 위해 개발되었다. 이는 일반적으로 관심 항원에 특이적인 비인간(예컨대 쥐 또는 토끼) 가변 영역과 인간 불변 항체 중쇄 및 경쇄 도메인을 포함할 수 있다. 키메라 항체와 관련하여 사용된 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 아래에 설명된 바와 같이 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 모두의 CDR 및 프레임워크 영역을 포함하는 영역을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "인간화 항체"는 인간 항체 불변 도메인 및 인간 가변 도메인에 대한 높은 수준의 서열 상동성을 포함하도록 변형된 비인간 가변 도메인을 함유하는 유전적으로 조작된 비인간 항체를 지칭한다. 이는 함께 항원 결합 부위를 형성하는 6개의 비인간 항체 상보성 결정 영역(CDR)을 상동성 인간 수용체 프레임워크 영역(FR)에 이식함으로써 달성될 수 있다(WO 92/22653 및 EP 0 629 240 참조).). 모 항체의 결합 친화도 및 특이성을 완전히 재구성하기 위해서는 모 항체(즉, 비인간 항체)의 프레임워크 잔기를 인간 프레임워크 영역으로 치환(역돌연변이)해야 할 수 있다. 구조적 상동성 모델링은 항체의 결합 특성에 중요한 프레임워크 영역의 아미노산 잔기를 식별하는 데 도움이 될 수 있다. 따라서, 인간화 항체는 비인간 CDR 서열, 주로 비인간 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 아미노산 역돌연변이를 선택적으로 포함하는 인간 프레임워크 영역, 및 완전 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 선택적으로, 반드시 역돌연변이는 아닌 추가적인 아미노산 변형을 적용하여 선호도 및 생화학적 특성과 같은 바람직한 특성을 갖는 인간화 항체를 얻을 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 또 다른 단백질, 예를 들어 모 단백질로부터 유래된" 단백질은 그 단백질의 하나 이상의 아미노산 서열이 다른 단백질 또는 모 단백질의 하나 이상의 아미노산 서열과 동일하거나 유사함을 의미한다. 예를 들어, 다른 항체 또는 모 항체, 결합 팔, 항원 결합 영역 또는 불변 영역으로부터 유래된 항체, 결합 팔, 항원 결합 영역, 불변 영역 등에서, 하나 이상의 아미노산 서열은 다른 항체 또는 모 항체, 결합 팔, 항원 결합 영역 또는 불변 영역과 동일하거나 유사하다. 이러한 하나 이상의 아미노산 서열의 예에는 VH 및 VL CDR 및/또는 프레임워크 영역, VH, VL, CL, 힌지 또는 CH 영역 중 하나 이상 또는 전부가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 예를 들어, 인간화 항체는 본원에서 비인간 모 항체 "로부터 유래된" 것으로 기술될 수 있으며, 이는 적어도 VL 및 VH CDR 서열이 상기 비인간 모 항체의 VH 및 VL CDR 서열과 동일하거나 유사함을 의미한다. 키메라 항체는 비인간 모 항체 "로부터 유래된" 것으로 본원에서 기술될 수 있으며, 이는 일반적으로 VH 및 VL 서열이 비인간 모 항체의 서열과 동일하거나 유사할 수 있음을 의미한다. 또 다른 예는 특정 모 항체 "로부터 유래된" 것으로 본원에서 설명될 수 있는 결합 팔 또는 항원 결합 영역이며, 이는 상기 결합 팔 또는 항원 결합 영역이 동일하거나 유사한 VH 및/또는 VL CDR 또는 상기 모 항체의 결합 팔 또는 항원 결합 영역에 대한 VH 및/또는 VL 서열을 일반적으로 포함한다는 것을 의미한다. 그러나 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이, CDR, 불변 영역 또는 항체, 결합 팔, 항원-결합 영역 등의 다른 곳에서 돌연변이와 같은 아미노산 변형이 이루어져 원하는 특성을 도입할 수 있다. 제1 또는 모 단백질로부터 유래된 하나 이상의 서열과 관련하여 사용될 때, "유사한" 아미노산 서열은 좋기로는 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다.
비인간 항체는 마우스, 토끼, 닭, 기니피그, 라마 및 염소와 같은 다양한 종에서 생성될 수 있다.
모노클로날 항체는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어 Kohler 및 Milstein, Nature 256: 495 (1975)의 표준 체세포 혼성화 기술을 포함한 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하기 위한 다른 기술, 예를 들어 B-림프구의 바이러스 또는 발암성 형질전환 또는 항체 유전자 라이브러리를 사용한 파지 디스플레이 기술이 사용될 수 있으며, 이러한 방법은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
그러한 비인간 종에서의 하이브리도마 생산은 매우 잘 확립된 절차이다. 융합을 위해 면역화된 동물/비인간 종의 비장세포를 분리하기 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너(예컨대 쥐 골수종 세포) 및 융합 절차도 알려져 있다.
본 명세서에서 문맥상 모순되지 않는 한, 용어 "Fab-아암" 또는 "아암(arm)"은 하나의 중쇄-경쇄 쌍을 의미하며 본 명세서에서 "반분자(half molecules)"와 호환적으로 사용된다.
"항원 결합 영역을 포함하는 결합 팔"이라는 용어는 항원 결합 영역을 포함하는 항체 분자 또는 단편을 의미한다. 따라서, 결합 팔은 예를 들어 6개의 VH 및 VL CDR 서열, VH 및 VL 서열, Fab 또는 Fab' 단편, 또는 Fab-아암을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 경우, 문맥과 모순되지 않는 한, 용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 2개의 Fc 서열로 구성된 항체 영역을 지칭하며, 여기서 상기 Fc 서열은 적어도 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 사용된 용어 "Fc 영역"은 항체의 N-말단에서 C-말단 방향으로 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 영역을 의미한다. 항체의 Fc 영역은 면역계의 다양한 세포(예컨대 이펙터 세포) 및 보체 시스템의 구성요소를 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 개시내용의 맥락에서, 다중특이 항체를 비롯한 항체와 관련하여 사용되는 "Fc-매개 이펙터 기능을 더 적은 정도로 유도한다"는 표현은 항체가 Fc-매개 이펙터 기능(특히 IgG Fc 수용체(Fcga mMaR, FcγR) 결합, C1q 결합, ADCC 또는 CDC의 목록으로부터 선택됨)을, (i) 상기 항체와 동일한 CDR 서열, 특히 동일한 제1 및 제2 항원-결합 영역, 및 (ii) 인간 IgG1 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 인간 IgG1 항체에 비해 더 적은 정도로 유도함을 의미한다.
Fc-매개 이펙터 기능은 FcγR에 대한 결합, C1q에 대한 결합, 또는 FcγR을 통한 Fc-매개 가교의 유도에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "힌지 영역"은 면역글로불린 중쇄의 힌지 영역을 의미한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 힌지 영역은 Kabat(Kabat, EA et al., Sequences of Proteins of I mMunological Interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH 간행물 No. 91-3242, pp 662,680,689(1991))에 제시된 EU 넘버링에 따른 아미노산 216-230에 해당한다. 그러나 힌지 영역은 또한 본원에 기술된 임의의 다른 서브타입일 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "CH1 영역" 또는 "CH1 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 CH1 영역을 의미한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH1 영역은 Kabat(상기 문헌)에 제시된 EU 넘버링에 따른 아미노산 118-215에 해당한다. 그러나 CH1 영역은 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 다른 서브타입일 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "CH2 영역" 또는 "CH2 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 CH2 영역을 의미한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH2 영역은 Kabat(상기 문헌)에 제시된 EU 넘버링에 따른 아미노산 231-340에 해당한다. 그러나 CH2 영역은 본 명세서에 기술된 임의의 다른 서브타입일 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "CH3 영역" 또는 "CH3 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 CH3 영역을 의미한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH3 영역은 Kabat(상기 문헌)에 제시된 EU 넘버링에 따른 아미노산 341-447에 해당한다. 그러나 CH3 영역은 본 명세서에 기술된 임의의 다른 서브타입일 수도 있다.
용어 "1가 항체"는 본 개시내용의 맥락에서 항체 분자가 항원의 단일 분자에 결합할 수 있으므로 항원 가교가 불가능함을 의미한다.
"CD40 항체" 또는 "항-CD40 항체"는 항원 CD40에 특이적으로 결합하는, 전술한 항체이다.
"CD137 항체" 또는 "항-CD137 항체"는 항원 CD137에 특이적으로 결합하는 전술한 항체이다.
"CD40xCD137 항체" 또는 "항-CD40xCD137 항체"는 하나는 항원 CD40에 특이적으로 결합하고 다른 하나는 항원 CD137에 특이적으로 결합하는, 2개의 서로 다른 항원 결합 영역을 포함하는 이중특이 항체이다.
본원에 사용된 용어 "결합하는" 또는 "결합할 수 있는"은 미리 결정된 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합과 관련하여 예를 들어, Bio-Layer Interferometry(BLI)를 사용하여 측정할 때, 또는 예를 들어, 항원을 리간드로 사용하고 항체를 분석물로 사용하여 BIAcore 3000 기기에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술을 사용하여 측정시, 일반적으로 약 10-7 M 이하, 예컨대 약 10-8 M 이하, 예컨대 약 10-9 M 이하, 약 10-10 M 이하, 또는 약 10-11 M 이하의 KD에 해당하는 친화도를 갖는 결합이다. 항체는 미리 결정된 항원 또는 밀접히 관련된 항원 이외의 비특이적 항원(예컨대 BSA, 카제인)에 대한 결합에 대한 KD보다 적어도 10배, 예컨대 적어도 100배, 예컨대 적어도 1,000배, 예컨대 적어도 10,000배, 예컨대 적어도 100,000배 더 낮은 KD에 해당하는 친화도로 미리 결정된 항원에 결합한다. 친화도가 더 높은 양은 항체의 KD에 따라 달라지므로, 항체의 KD가 매우 낮으면 (즉, 즉, 항체가 매우 특이적임), 그 항원에 대한 친화도가 비특이적 항원에 대한 친화도보다 낮은 정도는 적어도 10,000배일 수 있다.
본원에서 용어 "kd"(sec-1)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 의미한다. 상기 값은 koff 값으로도 지칭된다.
본원에서 용어 "KD" (M)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭한다.
두 항체가 동일한 항원과 동일한 에피토프에 결합하는 경우 그 두 항체는 "동일한 특이성"을 갖는다. 검사 대상 항체가 특정 항원 결합 항체와 동일한 에피토프를 인식하는지, 즉 동일한 에피토프에 결합하는지 여부는 통상의 기술자에게 잘 알려진 다양한 방법으로 검사할 수 있다.
항체 간의 경쟁은 교차 차단 분석을 통해 감지할 수 있다. 예를 들어, 경쟁적 ELISA 분석이 교차 차단 분석으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적 항원은 미세역가 플레이트의 웰에 코팅될 수 있고, 항원 결합 항체 및 후보 경쟁 시험 항체가 첨가될 수 있다. 웰 내의 항원에 결합된 항원 결합 항체의 양은 동일한 에피토프에 결합하기 위해 경쟁하는 후보 경쟁 시험 항체의 결합 능력과 간접적으로 상관관계가 있다. 구체적으로, 경쟁하는 후보 항체의 동일한 에피토프에 대한 친화도가 클수록 항원이 코팅된 웰에 결합하는 항원 결합 항체의 양은 적어진다. 웰에 결합된 항원 결합 항체의 양은 검출 가능하거나 측정 가능한 표지 물질로 항체를 표지함으로써 측정할 수 있다.
항원에 대한 결합을 위해 다른 항체, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체, 또는 또 다른 항체, 예를 들어 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 항원에 대해 특이성을 갖는 항체와 경쟁하는 항체 본원에 기술된 영역은 본원에 기술된 상기 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 변이체, 예를 들어 CDR의 변형 및/또는 본원에 기술된 특정 정도의 동일성을 포함하는 항체일 수 있다.
본 명세서에 사용된 "단리된 다중특이 항체"는 항원 특이성을 달리하는 다른 항체가 실질적으로 없는 다중특이 항체를 의미하는 것으로 의도된다(예를 들어, CD40 및 CD137에 특이적으로 결합하는 단리된 이중특이 항체는 CD40 또는 CD137에 특이적으로 결합하는 단일특이 항체가 실질적으로 없다).
본 명세서에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 의미한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성과 친화성을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 용어 "제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용"은 제1-CH3/제2-CH3 이종이량체 항체에서 제1 CH3 영역과 제2 CH3 영역 사이의 상호작용을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "제1 및 제2 CH3 영역의 동종이량체 상호작용"은
제1-CH3/제1-CH3 동종이량체 항체에서 제1 CH3 영역과 또 다른 제1 CH3 영역 사이의 상호작용 및 제2-CH3/제2-CH3 동종이량체 항체에서 제2 CH3 영역과 또 다른 제2 CH3 영역 사이의 상호작용을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "동종이량체 항체"는 2개의 제1 Fab-암 또는 반분자를 포함하는 항체를 지칭하며, 여기서 상기 Fab-암 또는 반분자의 아미노산 서열은 동일하다.
본원에 사용된 용어 "이종이량체 항체"는 제1 및 제2 Fab-암 또는 절반 분자를 포함하는 항체를 지칭하며, 여기서 상기 제1 및 제2 Fab-암 또는 절반 분자의 아미노산 서열은 상이하다. 특히, 상기 제1 및 제2 Fab-아암/반분자의 CH3 영역, 항원 결합 영역, 또는 CH3 영역과 항원 결합 영역은 상이하다.
"환원 조건" 또는 "환원 환경"이라는 용어는 항체 힌지 영역의 시스테인 잔기와 같은 기질이 산화되기보다는 환원되기 쉬운 조건 또는 환경을 의미한다.
본 개시내용은 또한 예의 이중특이 항체의 VL 영역, VH 영역, 또는 하나 이상의 CDR의 기능적 변이체를 포함하는 이중특이 항체와 같은 다중특이 항체를 기술한다. 이중특이 항체와 관련하여 사용되는 VL, VH 또는 CDR의 기능적 변이체는 또한 이중특이 항체의 각 항원 결합 영역이 모 이중특이 항체의 친화도 및/또는 특이성/선택성의 적어도 상당한 비율(적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상)을 유지하도록 하며, 일부 경우에 이러한 이중특이 항체는 모 이중특이 항체보다 더 큰 친화성, 선택성 및/또는 특이성과 연관될 수 있다.
이러한 기능적 변이체는 일반적으로 모 이중특이 항체에 대해 상당한 서열 동일성을 유지한다. 두 서열 간의 동일성 백분율은 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 간격 수 및 각 간격의 길이를 고려하여 서열이 공유하는 동일한 위치 수의 함수이다(즉, 상동성 % = 동일한 위치 수/위치 총 수 x 100). 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 예를 들어, PAM120 중량 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 포함된 E. Meyers 및 W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988) 의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970) 알고리즘을 이용하여 구할 수 있다.
본 개시내용의 맥락에서, 달리 나타내지 않는 한, 다음 표기법이 돌연변이를 기술하기 위해 사용된다: i) 주어진 위치에서 아미노산의 치환은 예를 들어 K409R로 기록되며 이는 단백질의 위치 409에서 아르기닌에 의한 리신의 치환을 의미한다; ii) 특정 변이체의 경우 아미노산 잔기를 나타내는 특정한 3개 또는 1개의 문자 코드, 예컨대 Xaa 및 X 코드가 사용된다. 따라서, 위치 409에서 리신을 아르기닌으로 치환하는 것은 K409R로 표기되고, 위치 409에서 임의의 아미노산 잔기로 리신을 치환하는 것은 K409X로 표기된다. 위치 409에서 리신이 결실된 경우에는 K409*로 표시된다.
예시적인 변이체에는 주로 보존적 치환에 의해 모 서열의 VH 및/또는 VL 및/또는 CDR과 다른 것들이 포함되며; 예를 들어, 변이체에서 치환 중 12개(예컨대 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개)는 보존적 아미노산 잔기 치환이다.
본 개시내용의 맥락에서, 보존적 치환은 표 2 및 3에 정의된 바와 같은 아미노산 부류 내의 치환에 의해 정의될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "CD40"은 리간드 TNFSF5/CD40L에 대한 수용체인 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 5(TNFRSF5)로도 지칭되는 CD40을 의미한다. CD40은 대식세포와 B 세포에서 ERK를 활성화하는 TRAF6 및 MAP3K8 매개 신호를 변환하여 B 세포에 의한 면역글로불린 분비를 유도하는 것으로 알려져 있다. CD40에 사용되는 다른 동의어에는 B세포 표면 항원 CD40, Bp50, CD40L 수용체 및 CDw40이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 일 구현예에서, CD40은 UniProt 수탁번호 P25942를 갖는 인간 CD40이다. 인간 CD40의 서열은 SEQ ID NO: 35에도 제시되어 있다. SEQ ID NO: 35의 아미노산 1-20은 인간 CD40의 신호 펩타이드에 상응하고; SEQ ID NO: 35의 아미노산 21-193은 인간 CD40의 세포외 도메인에 상응하며; 단백질의 나머지, 즉, SEQ ID NO: 35의 아미노산 194-215 및 216-277은 각각 막관통 도메인과 세포질 도메인이다.
본원에 사용된 용어 "CD137"은 리간드 TNFSF9/4-1BBL에 대한 수용체인 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 9(TNFRSF9)로도 지칭되는 CD137(4-1BB)을 의미한다. CD137(4-1BB)은 T 세포 활성화에 관여하는 것으로 여겨진다. CD137의 다른 동의어에는 4-1BB 리간드 수용체, CDw137, T 세포 항원 4-1BB 상동체 및 T 세포 항원 ILA가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 일 구현예에서, CD137(4-1BB)은 UniProt 수탁번호 Q07011을 갖는 인간 CD137(4-1BB)이다. 인간 CD137의 서열은 SEQ ID NO: 37에도 제시되어 있다. SEQ ID NO: 37의 아미노산 1-23은 인간 CD137의 신호 펩타이드에 상응하고; SEQ ID NO: 37의 아미노산 24-186은 인간 CD137의 세포외 도메인에 상응하고; 단백질의 나머지 부분, 즉 SEQ ID NO: 37의 아미노산 187-213 및 214-255는 각각 막관통 도메인과 세포질 도메인이다.
"프로그램화된 사멸-1(PD-1)" 수용체는 CD28 계열에 속하는 면역억제 수용체를 의미한다. PD-1(CD279로도 알려짐)은 생체내에서 이전에 활성화된 T 세포에서 주로 발현되며 두 개의 리간드인 PD-L1(B7-H1 또는 CD274로도 알려짐)과 PD-L2(B7-DC 또는 CD273로도 알려짐)에 결합한다. 본원에 사용된 용어 "PD-1"은 인간 PD-1(hPD-1), hPD-1의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 및 hPD-1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 인간 PD-1의 서열은 또한 SEQ ID NO: 39에 제시되어 있다. "프로그램화된 사멸 리간드-1(PD-L1)"은 PD-1에 결합 시 T 세포 활성화 및 사이토카인 분비를 하향조절하는 PD-1에 대한 2개의 세포 표면 당단백질 리간드 중 하나이다(다른 하나는 PD-L2). 본 명세서에 사용된 용어 "PD-L1"은 인간 PD-L1(hPD-L1), hPD-L1의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 예를 들어 마카크(시노몰구스 원숭이), 아프리카 코끼리, 멧돼지 및 마우스 PD-L1(예를 들어 각각 Genbank 수탁 번호 NP_054862.1, XP_005581836, XP_003413533, XP_005665023 및 NP_068693 참조) 및 hPD-L1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 인간 PD-L1의 서열은 또한 SEQ ID NO: 40에 나타나 있으며, 여기서 아미노산 1-18은 신호 펩타이드인 것으로 예측된다. 마카크(시노몰구스 원숭이) PD-L1의 서열도 SEQ ID NO: 41에 나타나 있으며, 여기서 아미노산 1-18은 신호 펩타이드인 것으로 예측된다. 본원에 사용된 용어 "PD-L2"는 인간 PD-L2(hPD-L2), hPD-L2의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 및 hPD-L2와 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. PD-1의 리간드(PD-L1 및 PD-L2)는 수지상 세포 또는 대식세포와 같은 항원 제시 세포 및 기타 면역 세포의 표면에서 발현된다. PD-1이 PD-L1 또는 PD-L2에 결합하면 T 세포 활성화가 하향조절된다. PD-L1 및/또는 PD-L2를 발현하는 암세포는 PD-1을 발현하는 T 세포를 차단(스위치 오프)하여 항암 면역 반응을 억제할 수 있다. PD-1과 그의 리간드 사이의 상호작용은 종양 침윤 림프구의 감소, T 세포 수용체 매개 증식의 감소 및 암세포에 의한 면역 회피를 초래한다. 면역 억제는 PD-1과 PD-L1의 국소 상호작용을 억제함으로써 역전될 수 있으며, PD-1과 PD-L2의 상호작용도 차단되면 그 효과는 상가(additive)된다.
"세포독성 T 림프구 관련 항원-4(CTLA-4)"(CD152라고도 알려짐)는 T 세포 표면 분자이며 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이다. 이 단백질은 CD80(B7-1) 및 CD86(B7-2)에 결합하여 면역 체계를 하향 조절한다. 본원에 사용된 용어 "CTLA-4"는 인간 CTLA-4(hCTLA-4), hCTLA-4의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 및 hCTLA-4와 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. CTLA-4는 CD80 및 CD86에 대한 결합 친화력이 훨씬 더 높은 자극성 체크포인트 단백질 CD28의 상동체이다. CTLA4는 활성화된 T 세포의 표면에서 발현되며, 그의 리간드는 전문 항원 제시 세포의 표면에서 발현된다. CTLA 4가 그의 리간드에 결합하면 CD28의 공동자극 신호가 방지되고 억제 신호가 생성된다. 따라서 CTLA-4는 T 세포 활성화를 하향조절한다. 인간 CTLA-4의 서열은 SEQ ID NO: 42에도 제시되어 있다.
"Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체"(TIGIT, WUCAM 또는 Vstm3으로도 알려짐)는 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포의 면역 수용체이며 DC, 대식세포 등의 PVR(CD155)에 결합하며, PVRL2 (CD112; nectin-2) 및 PVRL3 (CD113; 넥틴-3)은 T 세포 매개 면역을 조절한다. 본원에 사용된 용어 "TIGIT"는 인간 TIGIT(hTIGIT), hTIGIT의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 및 hTIGIT와 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "PVR"은 인간 PVR(hPVR), hPVR의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 및 hPVR과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "PVRL2"는 인간 PVRL2(hPVRL2), hPVRL2의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 및 hPVRL2와 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "PVRL3"은 인간 PVRL3(hPVRL3), hPVRL3의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 및 hPVRL3과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다.
"B 및 T 림프구 감쇠제"(BTLA, CD272로도 알려짐)는 Th1에서는 발현되지만 Th2 세포에서는 발현되지 않는 TNFR 패밀리 구성원이다. BTLA 발현은 T 세포의 활성화 동안 유도되며 특히 CD8+ T 세포의 표면에서 발현된다. 본 명세서에 사용된 용어 "BTLA"는 인간 BTLA(hBTLA), hBTLA의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 그리고 hBTLA와 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. BTLA 발현은 인간 CD8+ T 세포가 이펙터 세포 표현형으로 분화되는 동안 점진적으로 하향조절된다. 종양 특이적 인간 CD8+ T 세포는 높은 수준의 BTLA를 발현한다. BTLA는 "헤르페스바이러스 진입 매개체"(HVEM, TNFRSF14 또는 CD270으로도 알려져 있음)에 결합하고 T 세포 억제에 관여한다. 본원에 사용된 용어 "HVEM"은 인간 HVEM(hHVEM), hHVEM의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 및 hHVEM과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. BTLA-HVEM 복합체는 T 세포 면역 반응을 음성적으로 조절한다.
"킬러 세포 면역글로불린 유사 수용체"(KIR)는 건강한 세포와 질병에 걸린 세포 사이의 분화에 관여하는 NK T 세포 및 NK 세포의 MHC 클래스 I 분자에 대한 수용체이다. KIR은 인간 백혈구 항원(HLA) A, B 및 C에 결합하여 정상적인 면역 세포 활성화를 억제한다. 본원에 사용된 용어 "KIR"은 인간 KIR(hKIR), hKIR의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 및 hKIR과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "HLA"는 HLA의 변이체, 이소형, 종 상동체, 그리고 HLA와 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 KIR은 특히 KIR2DL1, KIR2DL2 및/또는 KIR2DL3을 의미한다.
"림프구 활성화 유전자-3(LAG-3)"(CD223으로도 알려짐)은 MHC 클래스 II 분자에 결합하여 림프구 활성을 억제하는 것과 관련된 억제 수용체이다. 이 수용체는 Treg 세포의 기능을 향상시키고 CD8+ 이펙터 T 세포 기능을 억제하여 면역 반응을 억제한다. LAG-3은 활성화된 T 세포, NK 세포, B 세포 및 DC에서 발현된다. 본원에 사용된 용어 "LAG-3"은 인간 LAG-3(hLAG-3), hLAG-3의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 및 적어도 한 개의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다.
"T 세포막 단백질-3(TIM-3)"(HAVcr-2로도 알려짐)은 Th1 세포 반응을 억제하여 림프구 활성을 억제하는 데 관여하는 억제 수용체이다. 그의 리간드는 다양한 유형의 암에서 상향조절되는 갈렉틴 9(GAL9)이다. 다른 TIM-3 리간드로는 포스파티딜 세린(PtdSer), 고이동성 그룹 단백질 1(H mgB1) 및 암배아 항원 관련 세포 접착 분자 1(CEACAM1)이 포함된다. 본 명세서에 사용된 용어 "TIM-3"은 인간 TIM3(hTIM-3), hTIM-3의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 그리고 적어도 한 개의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "GAL9"는 인간 GAL9(hGAL9), hGAL9의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 그리고 적어도 한 개의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 " PdtSer "는 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체 및 변이체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "H mgB1"은 인간 H mgB1(hH mgB1), hH mgB1의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 그리고 적어도 한 개의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "CEACAM1"은 인간 CEACAM1(hCEACAM1), hCEACAM1의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 그리고 적어도 한 개의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다.
"CD94/NKG2A"는 자연 살해 세포 및 CD8+ T 세포의 표면에서 주로 발현되는 억제 수용체이다. 본 명세서에 사용된 용어 "CD94/NKG2A"는 인간 CD94/NKG2A(hCD94/NKG2A), hCD94/NKG2A의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 및 적어도 한 개의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. CD94/NKG2A 수용체는 CD94와 NKG2A를 포함하는 이종이량체이다. 이는 아마도 HLA-E와 같은 리간드에 결합하여 NK 세포 활성화 및 CD8+ T 세포 기능을 억제한다. CD94/NKG2A는 자연살해세포(NK 세포), 자연살해 T 세포(NK-T 세포) 및 T 세포(α/β 및 γ/δ)의 사이토카인 방출과 세포독성 반응을 제한한다. NKG2A는 종양 침윤 세포에서 자주 발현되며 HLA-E는 여러 암에서 과발현된다.
"인돌아민 2,3-디옥시게나제"(IDO)는 면역억제 특성을 지닌 트립토판 이화효소이다. 본 명세서에 사용된 용어 "IDO"는 인간 IDO(hIDO), hIDO의 변이체, 이소형, 종 상동체, 및 적어도 한 개의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. IDO는 트립토판 분해에서 키누레닌으로의 전환을 촉매하는 속도 제한 효소이다. 따라서 IDO는 필수 아미노산의 탈진에 관여한다. 이것은 T 및 NK 세포의 억제, Tregs 및 골수 유래 억제 세포의 생성 및 활성화, 종양 혈관 신생 촉진에 관여하는 것으로 알려져 있다. IDO는 많은 암에서 과발현되며 종양 세포의 면역체계 탈출을 촉진하고 국소 염증에 의해 유도될 때 만성 종양 진행을 촉진하는 것으로 나타났다.
본 명세서에 사용된 "아데노신성 경로" 또는 "아데노신 신호전달 경로"에서 ATP는 엑토뉴클레오티다제 CD39 및 CD73에 의해 아데노신으로 전환되어 억제성 아데노신 수용체 "아데노신 A2A 수용체"(A2AR, ADORA2A라고도 함) 및 "아데노신 A2B 수용체"(A2BR, ADORA2B라고도 함) 중 하나 이상에 의한 아데노신 결합을 통해 억제성 신호전달을 초래한다. 아데노신은 면역억제 특성을 지닌 뉴클레오사이드이며 종양 미세환경에 고농도로 존재하여 면역세포 침윤, 세포독성 및 사이토카인 생산을 제한한다. 따라서 아데노신 신호전달은 숙주 면역 체계 소거를 피하기 위한 암세포의 전략이다. A2AR 및 A2BR을 통한 아데노신 신호전달은 종양 미세환경에 일반적으로 존재하는 높은 아데노신 농도에 의해 활성화되는 암 치료의 중요한 체크포인트이다. CD39, CD73, A2AR 및 A2BR은 T 세포, 불변 자연 살해 세포, B 세포, 혈소판, 비만 세포 및 호산구를 포함한 대부분의 면역 세포에서 발현된다. A2AR 및 A2BR을 통한 아데노신 신호전달은 면역 세포의 T 세포 수용체 매개 활성화를 방해하여 Treg 수를 증가 시키고 DC 및 이펙터 T 세포의 활성화를 감소시킨다. 본 명세서에 사용된 용어 "CD39"는 인간 CD39(hCD39), hCD39의 변이체, 이소형, 종 상동체, 및 적어도 한 개의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "CD73"은 인간 CD73(hCD73), hCD73의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 및 적어도 한 개의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "A2AR"은 인간 A2AR(hA2AR), hA2AR의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 그리고 적어도 한 개의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "A2BR"은 인간 A2BR(hA2BR), hA2BR의 변이체, 이소형, 종 상동체, 및 적어도 한 개의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다.
"T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제"(VISTA, C10orf54로도 알려짐)는 PD-L1과 상동성을 갖지만 조혈 구획으로 제한된 독특한 발현 패턴을 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는 "VISTA"라는 용어는 인간 VISTA(hVISTA), hVISTA의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 그리고 적어도 한 개의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. VISTA는 T 세포 억제를 유도하고 종양 내 백혈구에 의해 발현된다.
"시알산 결합 면역글로불린 유형 렉틴"(Siglec) 패밀리 구성원은 시알산을 인식하고 "자기(self)"와 "비자기(non-self)"를 구별하는 데 관여한다. 본 명세서에 사용된 용어 "Siglecs"는 인간 Siglecs (hSiglecs), hSiglecs의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 및 하나 이상의 hSiglecs와 적어도 한 개의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 인간 게놈에는 Siglec-2, Siglec-3, Siglec-7 및 Siglec-9를 포함하되 이에 국한되지 않는 14개의 Siglec이 포함되어 있으며 그 중 일부는 면역억제에 관여한다. Siglec 수용체는 시알산을 함유한 글리칸과 결합하지만, 시알산 잔기의 결합 위치화학 및 공간 분포에 대한 인식이 다르다. 가족 구성원 역시 뚜렷한 표현 패턴을 가지고 있다. 광범위한 악성 종양은 하나 이상의 Siglecs를 과발현한다.
"CD20"은 B 세포와 T 세포의 표면에 발현되는 항원이다. CD20의 높은 발현은 B 세포 림프종, 모세포 백혈병, B 세포 만성 림프구성 백혈병 및 흑색종 암 줄기세포와 같은 암에서 발견될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "CD20"은 인간 CD20(hCD20), hCD20의 변이체, 이소형, 종 상동체, 및 적어도 한 개의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다.
"당단백질 A 반복 우세"(GARP)는 면역 관용과 환자의 면역 체계를 벗어나는 종양의 능력에 있어서 중요한 역할을 한다. 본 명세서에 사용된 용어 "GARP"는 인간 GARP(hGARP), hGARP의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 그리고 적어도 한 개의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. GARP는 말초 혈액의 Treg와 종양 부위의 종양 침윤 T 세포를 포함한 림프구에서 발현된다. 이는 아마도 잠재적인 "변형 성장 인자 β"(TGF-β)에 결합하는 듯 하다. Tregs 세포에서 GARP 신호 전달이 중단되면 내성이 감소하고 Tregs가 장으로 이동하는 것을 억제하며 세포 독성 T 세포의 증식이 증가한다.
"CD47"은 리간드 "신호 조절 단백질 알파"(SIRPα)에 결합하는 막관통 단백질이다. 본원에 사용된 용어 "CD47"은 인간 CD47(hCD47), hCD47의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 및 hCD47과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "SIRPα"는 인간 SIRPα(hSIRPα), hSIRPα의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 그리고 hSIRPα와 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. CD47 신호전달은 세포자멸사, 증식, 부착 및 이동을 포함한 다양한 세포 과정에 관여한다. CD47은 많은 암에서 과발현되어 대식세포에 "나를 먹지 마세요" 신호를 보내는 역할을 한다. 억제성 항CD47 또는 항SIRPα 항체를 통해 CD47 신호전달을 차단하면 암세포의 대식세포 식균작용이 가능해지고 암 특이적 T 림프구의 활성화가 촉진된다.
"폴리오바이러스 수용체 관련 면역글로불린 도메인 함유"(PVRIG, CD112R로도 알려져 있음)는 "폴리오바이러스 수용체 관련 2"(PVRL2)에 결합한다. PVRIG 및 PVRL2는 여러 암에서 과발현된다. PVRIG 발현은 또한 TIGIT 및 PD-1 발현을 유도하고 PVRL2 및 PVR(TIGIT 리간드)은 여러 암에서 공동 과발현된다. PVRIG 신호 전달 경로를 차단하면 T 세포 기능과 CD8+ T 세포 반응이 증가하여 면역 억제가 감소하고 인터페론 반응이 증가한다. 본원에 사용된 용어 "PVRIG"는 인간 PVRIG(hPVRIG), hPVRIG의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 및 hPVRIG와 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 "PVRL2"는 위에서 정의된 hPVRL2를 포함한다.
"콜로니 자극 인자 1" (CSF1) 경로는 본 개시내용에 따라 표적화될 수 있는 또 다른 체크포인트이다. CSF1R은 CSF1에 결합하는 골수성 성장 인자 수용체이다. CSF1R 신호전달의 차단은 대식세포 반응을 기능적으로 재프로그램화하여 항원 제시 및 항종양 T 세포 반응을 향상시킬 수 있다. 본원에 사용된 용어 "CSF1R"은 인간 CSF1R(hCSF1R), hCSF1R의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 및 hCSF1R과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "CSF1"은 인간 CSF1(hCSF1), hCSF1의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 및 hCSF1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다.
"니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 포스페이트 NADPH 산화효소"는 면역억제 활성 산소종(ROS)을 생성하는 골수 세포 효소의 NOX 패밀리 효소를 의미한다. 5가지 NOX 효소(NOX1 내지 NOX5)가 암 발생 및 면역억제에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 상승된 ROS 수준이 거의 모든 암에서 감지되었으며 종양 발달 및 진행의 여러 측면을 촉진한다. NOX 생성 ROS는 NK 및 T 세포 기능을 약화시키고 골수 세포에서 NOX를 억제하면 인접한 NK 세포 및 T 세포의 항종양 기능이 향상된다. 본 명세서에 사용된 용어 "NOX"는 인간 NOX(hNOX), hNOX의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 그리고 hNOX와 적어도 한 개의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다.
본 개시내용에 따라 표적화될 수 있는 또 다른 면역 체크포인트는 "트립토판-2,3-디옥시게나제"(TDO)에 의해 매개되는 신호이다. TDO는 트립토판 분해에서 IDO에 대한 대체 경로를 나타내며 면역 억제에 관여한다. 종양 세포는 IDO 대신 TDO를 통해 트립토판을 분해할 수 있으므로 TDO는 체크포인트 차단의 추가 표적이 될 수 있다. 실제로, 여러 암 세포주가 TDO를 상향 조절하는 것으로 밝혀졌으며 TDO는 IDO 억제를 보완할 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "TDO"는 인간 TDO(hTDO), hTDO의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 그리고 hTDO와 적어도 한 개의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다.
많은 면역 체크포인트는 위에서 설명한 것과 같은 특정 수용체와 리간드 쌍 사이의 상호 작용에 의해 조절된다. 따라서 면역 체크포인트 단백질은 면역 체크포인트 신호 전달을 매개한다. 예를 들어, 체크포인트 단백질은 T 세포 활성화, T 세포 증식 및/또는 T 세포 기능을 직접적으로 또는 간접적으로 조절한다. 암세포는 종종 면역 체계의 공격으로부터 자신을 보호하기 위해 이러한 체크포인트 경로를 이용한다. 따라서 체크포인트 단백질의 기능은 일반적으로 T 세포 활성화, T 세포 증식 및/또는 T 세포 기능의 조절이다. 따라서 면역 체크포인트 단백질은 자가 관용과 생리학적 면역 반응의 지속 기간 및 진폭을 조절하고 유지한다. 많은 면역 체크포인트 단백질은 B7:CD28 패밀리 또는 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 슈퍼 계열에 속하며 특정 리간드에 결합하여 세포질 도메인에 모집되는 신호 분자를 활성화한다(Suzuki et al., 2016, Jap J Clin Onc, 46:191-203).
용어 "기능장애"는 항원 자극에 대한 면역 반응성이 감소된 상태에 있는 면역 세포를 의미한다. 기능장애에는 항원 인식에 반응하지 않는 것과 항원 인식을 증식, 사이토카인 생산(예컨대 IL-2) 및/또는 표적 세포 사멸과 같은 하류 T 세포 이펙터 기능으로 변환하는 능력의 장애가 포함된다.
본 명세서에 사용된 용어 "무반응"은 T 세포 수용체(TCR)를 통해 전달되는 신호가 불완전하거나 불충분하여 항원 자극에 반응하지 않는 상태를 의미한다. T 세포 무반응은 또한 공동자극 없이 항원으로 자극할 때 발생할 수 있으며, 그 결과 세포는 공동자극 상황에서도 항원에 의한 후속 활성화에 불응하게 된다. 무응답 상태는 종종 IL-2의 존재로 인해 무시될 수 있다. 무반응성 T 세포는 클론 확장을 겪거나 이펙터 기능을 획득하지 않는다.
용어 "탈진"은 많은 만성 감염 및 암 중에 발생하는 지속적인 TCR 신호전달로부터 발생하는 T 세포 기능장애의 상태로서 T 세포 탈진과 같은 면역 세포 탈진을 의미한다. 이는 불완전하거나 결함이 있는 신호 전달을 통해 발생하는 것이 아니라 지속적인 신호 전달로 인해 발생한다는 점에서 무반응과 구별된다. 탈진은 이펙터 기능 저하, 억제 수용체의 지속적인 발현, 기능적 이펙터 또는 기억 T 세포와는 다른 전사 상태로 정의된다. 탈진은 질병(예컨대 감염 및 종양)의 최적 제어를 방해한다. 탈진은 외인성 음성 조절 경로(예컨대 면역조절 사이토카인)뿐만 아니라 세포 내인성 음성 조절 경로(본 명세서에 기술된 바와 같은 억제성 면역 체크포인트 경로) 모두로 인해 발생할 수 있다.
"T 세포 기능 향상"은 T 세포가 지속되거나 증폭된 생물학적 기능을 갖도록 유도, 유발 또는 자극하거나, 탈진되거나 비활성인 T 세포를 재생 또는 재활성화하는 것을 의미한다. T 세포 기능 강화의 예에는 개입 전의 수준에 비해 CD8+ T 세포로부터의 γ-인터페론 분비 증가, 증식 증가, 항원 반응성 증가 (예컨대 종양 제거)가 포함된다. 일 구현예에서, 향상 수준은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200% 또는 그 이상이다. 이러한 향상을 측정하는 방식은 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "억제성 핵산" 또는 "억제성 핵산 분자"는 하나 이상의 체크포인트 단백질을 전체적으로 또는 부분적으로 감소, 억제, 방해하거나 음성적으로 조절하는 DNA 또는 RNA와 같은 핵산 분자를 의미한다. 억제성 핵산 분자에는 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, 안티센스 DNA 또는 RNA 분자, 및 앱타머(예컨대 DNA 또는 RNA 앱타머)가 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 단백질 발현, 특히 본 명세서에 기술된 체크포인트 단백질과 같은 체크포인트 단백질의 발현을 감소시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 올리고뉴클레오타이드는 짧은 DNA 또는 RNA 분자로, 일반적으로 2 내지 50개의 뉴클레오타이드로 구성된다. 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 체크포인트 억제제 올리고뉴클레오타이드는 안티센스-올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
안티센스-올리고뉴클레오타이드는 주어진 서열, 특히 체크포인트 단백질의 핵산 서열(또는 그의 단편)의 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 또는 RNA 분자이다. 안티센스 RNA는 전형적으로 mRNA에 결합함으로써 체크포인트 단백질을 인코딩하는 mRNA와 같은 mRNA의 단백질 번역을 방지하는 데 사용된다. 안티센스 DNA는 일반적으로 특정 상보적(암호화 또는 비암호화) RNA를 표적으로 삼는 데 사용된다. 결합이 발생하면 이러한 DNA/RNA 하이브리드는 효소 RNase H에 의해 분해될 수 있다. 또한 모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 척추동물의 유전자 녹다운에 사용될 수 있다. 예를 들어, Kryczek et al., 2006(J Exp Med, 203:871-81)은 대식세포에서 B7-H4 발현을 특이적으로 차단하는 B7-H4 특이적 모르폴리노를 설계하여 T 세포 증식을 증가시키고 종양 관련 항원(TAA) 특이적 T 세포로 마우스의 종양 크기를 감소시켰다.
용어 "siRNA" 또는 "소형 간섭 RNA" 또는 "소형 억제 RNA"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 체크포인트 단백질을 코딩하는 유전자와 같은 특정 유전자의 발현을 방해하는 전형적인 20-25개 길이의 염기쌍을 갖는 이중 가닥 RNA 분자를 지칭한다. 일 구현예에서, siRNA는 mRNA를 방해하여 번역, 예를 들어 면역 체크포인트 단백질의 번역을 차단한다. 외인성 siRNA의 형질감염은 유전자 녹다운을 위해 사용될 수 있지만, 그 효과는 특히 빠르게 분열하는 세포에서 일시적일 수 있다. 안정적인 형질감염은 예를 들어 RNA 변형에 의해 또는 발현 벡터를 사용하여 달성될 수 있다. siRNA를 이용한 세포의 안정한 형질감염을 위한 유용한 변형 및 벡터는 당업계에 공지되어 있다. siRNA 서열은 또한 두 가닥 사이에 짧은 루프를 도입하여 "작은 헤어핀 RNA" 또는 "shRNA"를 생성하도록 변형될 수 있다. shRNA는 Dicer에 의해 기능성 siRNA로 가공될 수 있다. shRNA는 상대적으로 낮은 분해율과 회전율(turnover)을 가지고 있다. 따라서, 면역 체크포인트 억제제는 shRNA일 수 있다.
용어 "압타머"는 일반적으로 폴리펩타이드와 같은 표적 분자에 결합할 수 있는 25-70개 뉴클레오타이드 길이의 DNA 또는 RNA와 같은 단일 가닥 핵산 분자를 의미한다. 일 구현예에서, 압타머는 본 명세서에 기술된 면역 체크포인트 단백질과 같은 면역 체크포인트 단백질에 결합한다. 예를 들어, 본 개시내용에 따른 압타머는 면역 체크포인트 단백질 또는 폴리펩타이드, 또는 면역 체크포인트 단백질 또는 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 신호 전달 경로의 분자에 특이적으로 결합할 수 있다. 압타머의 생성 및 치료 용도는 당해 분야에 잘 알려져 있다(예를 들어 US 5,475,096 참조).
용어 " 소분자 억제제 " 또는 "소분자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 전술한 하나 이상의 체크포인트 단백질을 전체적으로 또는 부분적으로 감소, 억제, 방해하거나 음성적으로 조절하는 일반적으로 최대 1000 달톤의 저분자량 유기 화합물을 의미한다. 이러한 소분자 억제제는 일반적으로 유기화학으로 합성되지만 식물, 곰팡이, 미생물과 같은 천연 공급원에서 분리될 수도 있다. 분자량이 작기 때문에 소분자 억제제가 세포막을 통해 빠르게 확산될 수 있다. 예를 들어, 당업계에 공지된 다양한 A2AR 길항제는 500 달톤 미만의 분자량을 갖는 유기 화합물이다.
"세포 기반 치료법" 이라는 용어는 질병 또는 장애(예컨대 암 질환)를 치료할 목적으로 면역 체크포인트 억제제를 발현하는 세포(예컨대 T 림프구, 수지상 세포 또는 줄기세포)를 대상체에게 이식하는 것을 의미한다.
시험관내 또는 생체내에서 암성 또는 과증식성 세포에서 선택적으로 복제하여 성장을 늦추거나 사멸을 유도할 수 있는 반면, 정상 세포에는 효과가 없거나 최소인 바이러스를 의미한다. 면역 체크포인트 억제제 전달을 위한 종양용해 바이러스는 siRNA, shRNA, 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 DNA 또는 RNA, 압타머, 항체 또는 그의 단편 또는 가용성 면역 체크포인트 단백질 또는 융합체와 같은 억제 핵산 분자인 면역 체크포인트 억제제를 코딩할 수 있는 발현 카세트를 포함한다. 종양용해 바이러스는 좋기로는 복제 능력이 있고 발현 카세트는 바이러스 프로모터, 예를 들어 합성 초기/후기 폭스바이러스 프로모터의 제어 하에 있다. 예시적인 종양용해 바이러스에는 수포성 구내염 바이러스(VSV), 랍도바이러스(예컨대 Seneca Valley 바이러스와 같은 피코나바이러스; SVV-001), 콕사키바이러스, 파보바이러스, 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 단순 포진 바이러스(HSV; OncoVEX GMCSF), 레트로바이러스(예를 들어, 인플루엔자 바이러스), 홍역 바이러스, 레오바이러스, 신비스 바이러스, WO 2017/209053에 예시적으로 설명된 우두 바이러스(코펜하겐, 웨스턴 리저브, 와이어스 계통 포함) 및 아데노바이러스 (예컨대 델타-24, 델타-24-RGD, ICOVIR-5, ICOVIR-7, Onyx-015, ColoAd1, H101, AD5/3-D24-GMCSF)가 포함된다. 가용성 형태의 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 재조합 종양용해 바이러스의 생성 및 그의 사용 방법은 WO 2018/022831에 개시되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 종양용해 바이러스는 약독화 바이러스로 사용될 수 있다.
"치료 사이클"는 본원에서 약력학으로 인해 추가된 결합제의 별도 투여량의 효과 내에서 기간, 즉 대상체의 신체가 투여된 입찰제로부터 본질적으로 제거된 후의 기간으로 정의된다. 예를 들어 2-12시간 또는 같은 날과 같이 2-24 몇 시간 내에 짧은 시간 내에 여러 번 소량을 투여하는 것은 더 큰 단일 용량과 동일할 수 있다.
본 맥락에서, "치료", "치료하는" 또는 "치료적 개입"이라는 용어는 질병 또는 장애와 같은 상태를 퇴치할 목적으로 대상체를 관리하고 돌보는 것과 관련된다. 이 용어는 증상이나 합병증을 완화시키고, 질병, 장애 또는 상태의 진행을 지연시키며, 증상 및 합병증을 완화 또는 경감시키고/시키거나, 질병, 장애 또는 상태를 치료 또는 제거하고 상태를 예방하기 위해 치료적 유효량의 화합물을 투여하는 것과 같이, 대상체가 앓고 있는 주어진 상태를 치료하는 모든 스펙트럼의 처치를 포함하는 것으로 의도되며, 여기서 예방은 질병,상태 또는 장애와 싸우기 위한 목적으로 개체를 관리하고 돌보는 것으로 이해되어야 하며, 증상이나 합병증의 발병을 예방하기 위해 활성 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, "치료"는 증상 또는 질병 상태를 완화, 개선, 정지 또는 근절(치유)할 목적으로 본 개시내용의 치료 활성 결합제, 예컨대 치료 활성 항체의 유효량을 투여하는 것을 의미한다.
본 개시내용의 결합제를 사용한 치료에 대한 내성, 반응 실패 및/또는 재발은 고형 종양에서의 반응 평가 기준; 버전 1.1(RECIST 기준 v1.1)에 따라 결정될 수 있다. RECIST 기준은 아래 표에 명시되어 있다(LD: 가장 긴 치수).
"최상의 전체 반응(best overall response)"은 치료 시작부터 질병 진행/재발까지 기록된 최고 반응이다(치료 시작 이후 기록된 가장 작은 측정치가 PD에 대한 기준으로 사용된다). CR 또는 PR 단계의 대상체는 객관적인 반응을 보이는 것으로 간주된다. CR, PR 또는 SD 단계의 대상체는 질병 통제 상태에 있는 것으로 간주된다. NE가 있는 대상체는 무응답자로 간주된다. 최상의 전체 반응은 치료 시작부터 질병 진행/재발까지 기록된 최상의 반응이다(치료 시작 이후 기록된 가장 작은 측정값이 PD에 대한 기준으로 사용된다). CR, PR 또는 SD가 있는 대상체는 질병 통제 상태에 있는 것으로 간주된다. NE가 있는 대상체는 무응답자로 간주된다.
"반응 기간(DOR)"은 확인된 최상의 전체 반응이 CR 또는 PR인 대상체에게만 적용되며, 객관적인 종양 반응(CR 또는 PR)이 처음 기록된 시점부터 기저 암으로 인해 첫 번째 PD 날짜 또는 다음으로 인한 사망 날짜까지의 시간으로 정의된다.
"무진행 생존(PFS)"은 사이클 1의 제1일부터 최초로 기록된 질병 진행 또는 어떤 원인으로 인한 사망까지의 일수로 정의된다.
"전체 생존(OS)"은 사이클 1의 제1일부터 어떤 원인으로 인한 사망까지의 일수로 정의된다. 대상체가 사망한 것으로 알려지지 않은 경우 OS는 대상체가 살아 있다고 알려진 가장 늦은 날짜(기준일 또는 그 이전)에 검열된다.
본 개시내용의 맥락에서, 용어 "치료 요법"은 건강을 개선하고 유지하도록 고안된 구조화된 치료 계획을 지칭한다.
"유효량" 또는 "치료 유효량"이라는 용어는 원하는 치료 결과를 달성하는 데 필요한 투여량 및 기간 동안 효과적인 양을 의미한다. 다중특이 항체 또는 모노클로날 항체 등의 항체와 같은 결합제의 치료 유효량은 개체의 질병 상태, 연령, 성별, 및 체중에 따라, 그리고 개체가 원하는 반응을 이끌어내는 결합제의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 치료 유효량은 또한 결합제 또는 그의 단편의 임의의 독성 또는 해로운 효과보다 치료적으로 유익한 효과가 더 큰 양이다. 환자의 반응이 초기 용량으로 불충분한 경우, 더 높은 용량(또는 더 국소화된 다른 투여 경로를 통해 효과적으로 더 높은 용량)을 사용할 수 있다. 환자에게 원치 않는 부작용이 발생한 경우, 더 낮은 용량(또는 더 국소화된 다른 투여 경로를 통해 효과적으로 더 낮은 용량)을 사용할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "암"은 비정상적으로 조절된 세포 성장, 증식, 분화, 유착 및/또는 이동을 특징으로 하는 질병을 포함한다. "암세포"는 빠르고 제어되지 않는 세포 증식에 의해 성장하고 새로운 성장을 시작한 자극이 중단된 후에도 계속해서 성장하는 비정상 세포를 의미한다.
본 개시내용에 따른 용어 "암"은 백혈병, 정상피종, 흑색종, 육종, 골수종, 기형종, 림프종, 중피종, 신경모세포종, 신경교종, 직장암, 자궁내막암, 신장암, 신장암, 요로상피암, 부신암, 부신피질암, 갑상선암, 혈액암, 피부암, 뇌암, 자궁경부암, 장암, 간암, 결장암, 위암, 장암, 두경부암, 위장암, 림프절암, 식도암, 대장암, 췌장암, 이비인후과(ENT)암, 유방암, 전립선암, 음경암, 자궁암, 난소암, 폐암 및 이들의 전이를 포함한다. 이의 예로는 폐 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 결장 암종, 신장 세포 암종, 자궁 경부 암종, 또는 상기 기재된 암 유형 또는 종양의 전이를 들 수 있다.
본 개시내용에 따른 용어 "암"은 또한 암 전이를 포함한다. "전이"란 암세포가 원래 위치에서 신체의 다른 부위로 퍼지는 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정으로서, 원발 종양으로부터의 악성 세포 분리, 세포외 기질 침입, 내피 기저막의 침투에 따른 체강과 혈관으로의 유입, 및 혈액에 의한 운반, 표적 장기의 침윤에 의한다. 마지막으로, 표적 부위에서 새로운 종양, 즉 2차 종양 또는 전이성 종양의 성장은 혈관신생에 따라 달라진다. 종양 세포나 구성 요소가 남아서 전이 가능성이 발생할 수 있기 때문에 원발 종양을 제거한 후에도 종양 전이가 자주 발생한다. 일 구현예에서, 본 개시내용에 따른 용어 "전이"는 원발성 종양 및 국부 림프절계로부터 멀리 떨어진 전이와 관련된 "원거리 전이"에 관한 것이다.
본 명세서에 사용된 "감소하다", "억제하다", "간섭하다" 및 "음성적으로 조절하다"와 같은 용어는 예를 들어 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 또는 약 75% 이상의 수준의 전체적인 감소를 일으키는 능력을 의미한다. "억제하다" 라는 용어 또는 유사한 문구는 완전한 또는 본질적으로 완전한 억제, 즉 0으로의 감소 또는 본질적으로 0으로의 감소를 포함한다.
일 구현예에서 "증가하다" 또는 "증강하다"와 같은 용어는 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 100%의 증가 또는 증강을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "생리적 pH"는 약 7.5의 pH를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "중량%"는 중량 백분율을 의미하며, 이는 물질의 양을 그램(g) 단위로 측정하는 농도 단위로, 그램(g)으로 나타낸 전체 조성물의 총 중량에 대한 그램(g) 단위의 물질의 양을 측정한 농도 단위이다.
"동결"이라는 용어는 일반적으로 열을 제거하여 액체를 응고시키는 것과 관련이 있다.
"동결건조" 또는 "냉동건조"라는 용어는 물질을 동결시킨 후 주변 압력을 감소시켜(예를 들어, 15 Pa 미만, 예를 들어 10 Pa 미만, 5 Pa 미만 또는 1 Pa 이하) 물질 내의 동결된 매체가 고체상에서 기체상으로 직접 승화되도록 하는 것을 의미한다. 따라서, "동결건조" 및 "냉동건조"라는 용어는 본 명세서에서 호환적으로 사용된다.
본 개시내용의 맥락에서 용어 "재조합"은 "유전공학을 통해 제조된"을 의미한다. 일 구현예에서, 본 개시내용의 맥락에서 "재조합 개체"는 자연적으로 발생하지 않는다.
본 명세서에서 사용된 "자연 발생"이라는 용어는 물체가 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 유기체(바이러스 포함)에 존재하고 자연의 근원으로부터 분리될 수 있으며 실험실에서 사람이 의도적으로 변형하지 않은 펩타이드 또는 핵산은 자연적으로 발생한 것이다. "자연에서 발견된"이라는 용어는 "자연에 존재하는"을 의미하며 알려진 물체뿐만 아니라 아직 발견되지 않았거나 자연에서 분리되지 않았지만 장래에 자연 자원으로부터 발견되거나 분리될 수 있는 물체도 포함한다.
본 개시내용에 따르면, 용어 "펩타이드"는 올리고- 및 폴리펩타이드를 포함하며, 약 2개 이상, 약 3개 이상, 약 4개 이상, 약 6개 이상, 약 8개 이상, 약 10개 이상, 약 13개 이상, 약 16개 이상, 약 20개 이상, 최대 약 50개, 약 100개 또는 약 150개까지의 연속 아미노산이 펩타이드 결합을 통해 서로 연결된 물질을 의미한다. "단백질"이라는 용어는 큰 펩타이드, 특히 약 151개 이상의 아미노산을 갖는 펩타이드를 의미하지만, "펩타이드" 및 "단백질"이라는 용어는 본원에서 일반적으로 동의어로 사용된다.
"치료 단백질"은 치료 유효량으로 대상체에게 제공될 때 대상체의 상태 또는 질병 상태에 대해 긍정적이거나 유리한 효과를 갖는다. 일 구현예에서, 치료적 단백질은 치유적 또는 고식적 특성을 가지며, 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상의 호전, 경감, 경감, 역전, 발병 지연 또는 중증도를 낮추기 위해 투여될 수 있다. 치료용 단백질은 예방적 특성을 가질 수 있으며 질병의 발병을 지연시키거나 그러한 질병 또는 병리학적 상태의 중증도를 완화시키는 데 사용될 수 있다. "치료 단백질"이라는 용어는 전체 단백질 또는 펩타이드를 포함하며, 또한 이의 치료 활성 단편을 의미할 수도 있다. 이는 또한 단백질의 치료적으로 활성인 변이체를 포함할 수 있다. 치료 활성 단백질의 예에는 백신접종을 위한 항원 및 사이토카인과 같은 면역자극제가 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
"일부"라는 용어는 분획(fraction)을 의미한다. 아미노산 서열 또는 단백질과 같은 특정 구조와 관련하여, 그의 "일부"라는 용어는 상기 구조의 연속적이거나 불연속적인 부분을 나타낼 수 있다.
"부분" 및 "단편"이라는 용어는 본 명세서에서 호환적으로 사용되며 연속적인 요소를 지칭한다. 예를 들어, 아미노산 서열이나 단백질과 같은 구조의 한 부분은 상기 구조의 연속적인 요소를 의미한다. 조성물의 맥락에서 사용될 때, 용어 "부분"은 조성물의 일부를 의미한다. 예를 들어, 조성물의 한 부분은 상기 조성물의 0.1% 내지 99.9%(예컨대 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 50%, 90% 또는 99%) 중 임의의 일부일 수 있다.
아미노산 서열(펩타이드 또는 단백질)과 관련하여 "단편"은 아미노산 서열의 한 부분, 즉. N-말단 및/또는 C-말단에서 단축된 아미노산 서열을 나타내는 서열이다. C-말단이 단축된 단편(N-말단 단편)은 예를 들어 오픈 리딩 프레임의 3'-말단이 결여된 절단된 오픈 리딩 프레임을 번역함으로써 얻을 수 있다. N-말단이 단축된 단편(C-말단 단편)은 예를 들어, 절단된 오픈 리딩 프레임이 번역을 시작하는 역할을 하는 시작 코돈을 포함하는 한, 오픈 리딩 프레임의 5'-말단이 결여된 절단된 오픈 리딩 프레임을 번역함으로써 얻을 수 있다. 아미노산 서열의 단편은 예를 들어 아미노산 서열로부터의 아미노산 잔기의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%를 포함한다. 아미노산 서열의 단편은 좋기로는 아미노산 서열로부터의 적어도 6개, 특히 적어도 8개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 50개, 또는 적어도 100개의 연속적인 아미노산을 포함한다.
본 개시내용에 따르면, 펩타이드 또는 단백질의 일부 또는 단편은 좋기로는 그것이 유래된 펩타이드 또는 단백질의 적어도 하나의 기능적 특성을 갖는다. 이러한 기능적 특성에는 약리학적 활성, 다른 펩타이드 또는 단백질과의 상호작용, 효소 활성, 항체와의 상호작용 및 핵산의 선택적 결합이 포함된다. 예를 들어, 펩타이드 또는 단백질의 약리학적 활성 단편은 그 단편이 유래된 펩타이드 또는 단백질의 약리학적 활성 중 적어도 하나를 갖는다. 펩타이드 또는 단백질의 일부 또는 단편은 좋기로는 그 펩타이드 또는 단백질 적어도 6개, 특히 적어도 8개, 적어도 10개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개 또는 적어도 50개의 연속적인 아미노의 서열을 포함한다. 펩타이드 또는 단백질의 부분 또는 단편은 좋기로는 그 펩타이드 또는 단백질의 8개 이하, 특히 10개 이하, 12개 이하, 15개 이하, 20개 이하, 30개 이하 또는 55개 이하의 연속 아미노산의 서열을 포함한다.
본 명세서에서 "변이체"는 적어도 하나의 아미노산 변형으로 인해 모 아미노산 서열과 다른 아미노산 서열을 의미한다. 모 아미노산 서열은 자연 발생 또는 야생형(WT) 아미노산 서열일 수 있거나, 야생형 아미노산 서열의 변형된 버전일 수 있다. 좋기로는, 변이체 아미노산 서열은 모 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형, 예를 들어 1 내지 약 20개의 아미노산 변형, 좋기로는 모 서열과 비교하여 1 내지 약 10개 또는 1 내지 약 5개의 아미노산 변형을 갖는다.
본 명세서에서 "야생형", "WT" 또는 "천연"은 대립유전자 변이를 포함하여 자연에서 발견되는 아미노산 서열을 의미한다. 야생형 아미노산 서열, 펩타이드 또는 단백질은 의도적으로 변형되지 않은 아미노산 서열을 갖는다.
좋기로는 주어진 아미노산 서열과 상기 주어진 아미노산 서열의 변이체인 아미노산 서열 사이의 유사성, 좋기로는 동일성의 정도는 적어도 약 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다. 유사성 또는 동일성의 정도는 좋기로는 참조 아미노산 서열 전체 길이의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 아미노산 영역에 대해 제공된다. 예를 들어, 참조 아미노산 서열이 200개의 아미노산으로 구성되는 경우, 유사성 또는 동일성의 정도는 일부 구현예에서 좋기로는 적어도 약 20, 적어도 약 40, 적어도 약 60, 적어도 약 80, 적어도 약 100, 적어도 약 120개, 적어도 약 140개, 적어도 약 160개, 적어도 약 180개, 또는 약 200개의 연속 아미노산이다. 일부 구현예에서, 유사성 또는 동일성의 정도는 참조 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 제공된다. 서열 유사성, 좋기로는 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 도구, 좋기로는 최상의 서열 정렬을 사용하여, 예를 들어 Align을 사용하여 표준 설정, 좋기로는 EMBOSS:needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5를 사용하는 정렬을 이용하여 수행될 수 있다.
"서열 유사성"은 동일하거나 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 비율을 나타낸다. 두 아미노산 서열 간의 "서열 동일성"은 서열 간에 동일한 아미노산의 백분율을 나타낸다. 2개의 핵산 서열 간의 "서열 동일성"은 서열 간에 동일한 뉴클레오타이드의 백분율을 나타낸다.
"동일한(%)" 및 "동일성(%)" 또는 유사한 용어는 특히 비교될 서열 간의 최적 정렬에서 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 백분율을 지칭하도록 의도된다. 상기 백분율은 순전히 통계적이며, 두 서열 사이의 차이는 비교할 서열의 전체 길이에 걸쳐 무작위로 분포될 수 있지만 반드시 그런 것은 아니다. 두 서열의 비교는 일반적으로 해당 서열의 국소 영역을 식별하기 위해 세그먼트 또는 "비교 창"에 대해 최적 정렬 후 서열을 비교함으로써 수행된다. 비교를 위한 최적의 정렬은 수동으로 수행되거나 Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482의 로컬 상동성 알고리즘의 도움을 받아, 또는 Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443의 로컬 상동성 알고리즘의 도움을 받아, 또는 Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 2444의 유사성 검사 알고리즘의 도움을 받아, 또는 상기 알고리즘들(GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)을 이용하는 컴퓨터 프로그램의 보조 하에 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 두 서열의 동일성 백분율은 미국 국립 생명공학 정보 센터(NCBI: United States National Center for Biotechnology Information) 웹사이트(예를 들어, blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에서 이용가능한 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 결정 된다. 일부 구현예에서, NCBI 웹사이트의 BLASTN 알고리즘에 사용되는 알고리즘 매개변수는 다음을 포함한다: (i) 10으로 설정된 예상 역치 (ii) 28로 설정된 단어 크기; (iii) 0으로 설정된 쿼리 범위의 최대 일치 항목; (iv) 1, -2로 설정된 일치/불일치 점수; (v) 선형으로 설정된 갭 코스트; 및 (vi) 사용되는 낮은 복잡도 영역에 대한 필터. 일부 구현예에서, NCBI 웹사이트의 BLASTP 알고리즘에 사용되는 알고리즘 매개변수는 다음을 포함한다: (i) 10으로 설정된 예상 역치; (ii) 3으로 설정된 단어 크기; (iii) 0으로 설정된 쿼리 범위의 최대 일치 항목; (iv) BLOSUM62로 설정된 매트릭스; (v) 존재: 11 확장: 1로 설정된 갭 코스트; (vi) 조건부 구성 점수 매트릭스 조정.
동일성 백분율은 비교할 서열이 상응하는 동일한 위치의 수를 결정하고, 이 수를 비교되는 위치의 수(예를 들어 참조 서열의 위치 수)로 나눈 다음 이 결과에 100을 곱하여 얻는다.
일부 구현예에서, 유사성 또는 동일성의 정도는 적어도 참조 서열의 전체 길이의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 영역에 대해 제공된다. 예를 들어, 참조 아미노산 서열이 200개의 아미노산 잔기로 구성되는 경우, 동일성 정도는 적어도 약 100, 적어도 약 120, 적어도 약 140, 적어도 약 160, 적어도 약 180, 또는 약 200 아미노산 잔기, 일부 구현예에서 연속 아미노산 잔기에 대해 제공된다. 일부 구현예에서, 참조 서열의 전체 길이에 대해 유사성 또는 동일성의 정도가 제공된다.
상동성 아미노산 서열은 본 개시내용에 따라 아미노산 잔기의 적어도 40%, 특히 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 및 좋기로는 적어도 95%, 적어도 98 또는 적어도 99%이다.
본원에 기술된 아미노산 서열 변이체는 예를 들어 재조합 DNA 조작에 의해 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 치환, 부가, 삽입 또는 결실을 갖는 펩타이드 또는 단백질을 제조하기 위한 DNA 서열의 조작은 예컨대 문헌[Sambrook et al. (1989)]에 상세히 설명되어 있다. 또한, 본원에 기술된 펩타이드 및 아미노산 변이체는 예를 들어 고체상 합성 및 유사한 방법과 같은 공지된 펩타이드 합성 기술의 도움으로 용이하게 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 아미노산 서열(펩타이드 또는 단백질)의 단편 또는 변이체는 좋기로는 "기능적 단편" 또는 "기능적 변이체"이다. 아미노산 서열의 "기능적 단편" 또는 "기능적 변이체"라는 용어는 그것이 유래된 아미노산 서열과 동일하거나 유사한 하나 이상의 기능적 특성을 나타내는 임의의 단편 또는 변이체에 관한 것으로, 즉, 기능적으로 동등한 것이다. 항원 또는 항원성 서열과 관련하여, 하나의 특정 기능은 단편 또는 변이체가 유래된 아미노산 서열에 의해 표시되는 하나 이상의 면역원성 활성이다. 본원에 사용된 용어 "기능적 단편" 또는 "기능적 변이체"는 특히 모 분자 또는 모 서열의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산에 의해 변경된 아미노산 서열을 포함하면서 예를 들어 면역 반응을 유도하는 것과 같은, 모 분자 또는 서열의 기능 중 하나 이상을 여전히 수행할 수 있는 변이체 분자 또는 서열을 지칭한다. 일 구현예에서, 모 분자 또는 서열의 아미노산 서열의 변형은 그 분자 또는 서열의 특성에 유의미한 영향을 미치거나 변경하지 않는다. 다른 구현예에서, 기능적 단편 또는 기능적 변이체의 기능은 감소될 수 있지만 여전히 유의하게 존재할 수 있다. 예를 들어 기능적 변이체의 면역원성은 또는 모 분자 또는 서열의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%일 수 있다. 그러나, 다른 구현예에서, 기능적 단편 또는 기능적 변이체의 면역원성은 모 분자 또는 서열에 비해 증강될 수 있다.
지정된 아미노산 서열(펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드)로부터 "유래된" 아미노산 서열(펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드)이라 함은 첫 번째 아미노산 서열의 기원을 의미한다. 좋기로는, 특정 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열은 해당 특정 서열 또는 이의 단편과 동일하거나, 본질적으로 동일하거나 상동성인 아미노산 서열을 갖는다. 특정 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열은 그 특정 서열의 변이체 또는 이의 단편일 수 있다. 예를 들어, 당업자는 본원에서 사용하기에 적합한 항원은 천연 서열의 원하는 활성을 유지하면서 이들이 유래된 자연 발생 또는 천연 서열과 서열이 달라지도록 변경될 수 있음을 이해할 것이다.
"단리된"이란 자연 상태에서 변경되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩타이드는 "단리"된 것이 아니지만, 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩타이드는 "단리"된 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어 숙주 세포와 같은 비천연 환경에 존재할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 개시내용에 사용된 결합제는 실질적으로 정제된 형태이다.
"유전적 변형" 또는 간단히 "변형"이라는 용어에는 핵산으로 세포를 형질감염시키는 것이 포함된다. "형질감염"이라는 용어는 핵산, 특히 RNA를 세포 내로 도입하는 것과 관련이 있다. 본 개시내용의 목적상, 용어 "형질감염"은 또한 세포 내로 핵산의 도입 또는 그러한 세포에 의한 핵산의 흡수를 포함하며, 여기서 세포는 대상체, 예를 들어 환자에 존재할 수 있다. 따라서, 본 개시내용에 따르면, 본원에 기술된 핵산의 형질감염을 위한 세포는 시험관내 또는 생체내에 존재할 수 있고, 예를 들어 그 세포는 환자의 장기, 조직 및/또는 유기체의 일부를 형성할 수 있다. 본 개시내용에 따르면, 형질감염은 일시적이거나 안정적일 수 있다. 일부 형질감염 적용의 경우, 형질감염된 유전 물질이 일시적으로만 발현된다면 충분하다. RNA는 세포 내로 형질감염되어 인코딩된 단백질을 일시적으로 발현할 수 있다. 형질감염 과정에서 도입된 핵산은 일반적으로 핵 게놈에 통합되지 않으므로 외래 핵산은 유사분열을 통해 희석되거나 분해된다. 핵산의 에피솜 증폭을 허용하는 세포는 희석 속도를 크게 감소시킨다. 형질감염된 핵산이 실제로 세포 및 그 딸세포의 게놈에 남아 있기를 원한다면 안정적인 형질감염이 이루어져야 한다. 이러한 안정적인 형질감염은 바이러스 기반 시스템 또는 형질감염을 위한 트랜스포존 기반 시스템을 사용하여 달성할 수 있다. 일반적으로 항원을 코딩하는 핵산은 세포 내로 일시적으로 형질감염된다. RNA는 세포 내로 형질감염되어 인코딩된 단백질을 일시적으로 발현할 수 있다.
본 개시내용에 따르면, 펩타이드 또는 단백질의 유사체는 그것이 유래된 상기 펩타이드 또는 단백질의 변형된 형태이며, 상기 펩타이드 또는 단백질의 적어도 하나의 기능적 특성을 갖는다. 예를 들어, 펩타이드 또는 단백질의 약리학적 활성 유사체는 유사체가 유래된 펩타이드 또는 단백질의 약리학적 활성 중 적어도 하나를 갖는다. 이러한 변형에는 임의의 화학적 변형이 포함되며, 탄수화물, 지질 및/또는 단백질 또는 펩타이드와 같은 단백질 또는 펩타이드와 연관된 임의의 분자의 단일 또는 다중 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함한다. 일 구현예에서, 단백질 또는 펩타이드의 "유사체"에는 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 팔미토일화, 미리스토일화, 이소프레닐화, 지질화, 알킬화, 유도체화, 보호/차단기의 도입, 항체 또는 다른 세포 리간드로의 단백질분해 절단 또는 결합으로부터 발생하는 변형된 형태가 포함된다. "유사체"라는 용어는 또한 상기 단백질 및 펩타이드의 모든 기능적 화학적 등가물까지 확장된다.
본원에 사용된 "활성화" 또는 "자극"은 검출 가능한 세포 증식을 유도할 만큼 충분히 자극된 T 세포와 같은 면역 이펙터 세포의 상태를 지칭한다. 활성화는 또한 신호전달 경로의 개시, 사이토카인 생성 유도 및 검출 가능한 이펙터 기능과 연관될 수 있다. "활성화된 면역 이펙터 세포"라는 용어는 무엇보다도 세포 분열을 겪고 있는 면역 이펙터 세포를 의미한다.
"프라이밍"이라는 용어는 T 세포와 같은 면역 이펙터 세포가 그의 특정 항원과 처음 접촉하여 이펙터 T 세포와 같은 이펙터 세포로 분화를 일으키는 과정을 의미한다.
"클론 확장" 또는 "확장"이라는 용어는 특정 개체가 증식되는 과정을 의미한다. 본 개시내용의 맥락에서, 상기 용어는 좋기로는 면역 이펙터 세포가 항원에 의해 자극되어 증식하고, 상기 항원을 인식하는 특정 면역 이펙터 세포가 증폭되는 면역학적 반응의 맥락에서 사용된다. 좋기로는, 클론 확장은 면역 이펙터 세포의 분화를 유도한다.
본 개시내용에 따른 "항원"은 면역 반응을 유도할 모든 물질 및/또는 세포 반응과 같은 면역 메커니즘 또는 면역 반응이 지시되는 모든 물질을 포함한다. 이는 또한 항원이 항원 펩타이드로 가공되고 면역 반응 또는 면역 메커니즘이 특히 MHC 분자의 맥락에서 제시되는 경우 하나 이상의 항원 펩타이드에 대해 지시되는 상황을 포함한다. 특히, "항원"은 항체 또는 T-림프구(T-세포)와 특이적으로 반응하는 임의의 물질, 좋기로는 펩타이드 또는 단백질과 관련된다. 본 개시내용에 따르면, 용어 "항원"은 T 세포 에피토프와 같은 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 임의의 분자를 포함한다. 좋기로는, 본 개시내용의 맥락에서 항원은 선택적으로 처리 후에 면역 반응을 유도하는 분자이고, 좋기로는 항원(항원을 발현하는 세포 포함)에 특이적인 것이 바람직하다. 일 구현예에서, 항원은 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 또는 그러한 항원으로부터 유래된 에피토프와 같은 질병 관련 항원이다.
본 개시내용에 따르면, 면역 반응의 후보인 임의의 적합한 항원이 사용될 수 있으며, 여기서 면역 반응은 체액성 면역 반응뿐만 아니라 세포성 면역 반응일 수도 있다. 본 개시내용의 일부 구현예의 맥락에서, 항원은 좋기로는 MHC 분자의 맥락에서 세포, 좋기로는 항원 제시 세포에 의해 제시되며, 이는 항원에 대한 면역 반응을 초래한다. 항원은 좋기로는 자연 발생 항원에 상응하거나 그로부터 유래된 생성물이다. 이러한 자연 발생 항원은 알레르겐, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충 및 기타 감염성 물질 및 병원체를 포함하거나 그로부터 유래될 수 있으며, 항원은 종양 항원일 수도 있다. 본 개시 내용에 따르면, 항원은 자연 발생 생성물, 예를 들어 바이러스 단백질 또는 이의 일부에 해당할 수 있다.
"질병 관련 항원"이라는 용어는 질병과 관련된 모든 항원을 지칭하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 질병 관련 항원은 숙주의 면역 체계를 자극하여 질병에 대한 세포성 항원 특이적 면역 반응 및/또는 체액성 항체 반응을 일으키는 에피토프를 포함하는 분자이다. 질병 관련 항원에는 병원체 관련 항원, 즉 미생물에 의한 감염과 관련된 항원, 일반적으로 미생물 항원(예컨대 박테리아 또는 바이러스 항원), 또는 암, 일반적으로 종양과 관련된 항원(예컨대 종양 항원)이 포함된다.
바람직한 일 구현예에서, 항원은 종양 항원, 즉 종양 세포의 일부, 특히 주로 세포내에서 발생하거나 종양 세포의 표면 항원으로서 발생하는 항원이다. 다른 구현예에서, 항원은 병원체 관련 항원, 즉 병원체, 예를 들어 바이러스, 박테리아, 단세포 유기체 또는 기생충으로부터 유래된 항원, 예를 들어 바이러스 리보핵단백질 또는 외피 단백질과 같은 바이러스 항원이다. 특히, 항원은 특히 T 세포 수용체의 활성 조절을 통해 면역계 세포, 좋기로는 CD4+ 및 CD8+ 림프구의 조절, 특히 활성화를 초래하는 MHC 분자로 제시되어야 한다.
"종양 항원"이라는 용어는 세포질, 세포 표면 또는 세포핵으로부터 유래될 수 있는 암세포의 구성성분을 의미한다. 특히 이는 세포 내에서 생성되거나 종양 세포의 표면 항원으로 생성되는 항원을 의미한다. 예를 들어, 종양 항원에는 암배아 항원, α1-태아단백질, 이소페리틴, 및 태아 설포당단백질, α2-H-철단백질 및 γ-태아단백질뿐만 아니라 다양한 바이러스 종양 항원이 포함된다. 본 개시내용에 따르면, 종양 항원은 종양의 유형 및/또는 발현 수준과 관련하여 특징적인 것 뿐 아니라 종양 또는 암뿐만 아니라 종양 또는 암 세포에 특징적인 임의의 항원을 포함하는 것이 바람직하다
"바이러스 항원"이라는 용어는 항원 특성, 즉 개체에서 면역 반응을 유발할 수 있는 모든 바이러스 성분을 의미한다. 바이러스 항원은 바이러스 리보핵단백질 또는 외피 단백질일 수 있다.
"박테리아 항원"이라는 용어는 항원 특성을 갖는, 즉 어떤 개체에서 면역 반응을 유발할 수 있는 임의의 박테리아 성분을 가리킨다. 박테리아 항원은 박테리아의 세포벽 또는 세포질막에서 유래될 수 있다.
용어 "에피토프"는 항원과 같은 분자 내 항원 결정기, 즉, 면역계에 의해 인식되는 분자 부분 또는 단편, 예를 들어 특히 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 항체 T 세포 또는 B 세포에 의해 인식되는 부분을 의미한다. 일 구현예에서, "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 의미한다. 에피토프는 일반적으로 아미노산이나 당 측쇄와 같은 분자의 표면 그룹으로 구성되며 일반적으로 특정 3차원 구조적 특성과 특정 전하 특성을 갖는다. 형태적 에피토프와 비구조적 에피토프는 변성 용매 존재 시 전자에 대한 결합이 손실되지만 후자에 대한 결합은 손실되지 않는다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에 직접적으로 관여하는 아미노산 잔기 및 결합에 직접적으로 관여하지 않는 다른 아미노산 잔기, 예를 들어 특이적인 항원 결합 펩타이드에 의해 효과적으로 차단되거나 덮이는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(달리 말해서, 그 아미노산 잔기는 특이적으로 항원 결합 펩타이드의 풋프린트 내에 있음).
단백질의 에피토프는 좋기로는 상기 단백질의 연속 또는 불연속 부분을 포함하고, 좋기로는 약 5 내지 약 100, 좋기로는 약 5 내지 약 50, 더욱 좋기로는 약 8 내지 약 0, 가장 좋기로는 약 10 내지 약 25개 아미노산 길이인 것이 바람직하고, 예를 들어, 에피토프의 길이는 좋기로는 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 아미노산일 수 있다. 본 개시내용의 맥락에서 에피토프는 T 세포 에피토프인 것이 특히 바람직하다.
"에피토프", "항원의 단편", "면역원성 펩타이드" 및 "항원 펩타이드"와 같은 용어는 본 명세서에서 호환적으로 사용되며 좋기로는 항원 또는 그 항원을 발현하거나 포함하고, 좋기로는 제시하는 세포에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 불완전하게 표현(incomplete representation)한 것이다. 좋기로는, 이 용어는 항원의 면역원성 부분에 관한 것이다. 좋기로는, 이는 특히 MHC 분자의 맥락에서 제시되는 경우 T 세포 수용체에 의해 인식되는(즉, 특이적으로 결합되는) 항원의 일부이다. 특정 바람직한 면역원성 부분은 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 결합한다. "에피토프"라는 용어는 면역계에 의해 인식되는 항원과 같은 분자의 일부 또는 단편을 의미한다. 예를 들어, 에피토프는 T 세포, B 세포 또는 항체에 의해 인식될 수 있다. 항원의 에피토프는 항원의 연속적이거나 불연속적인 부분을 포함할 수 있고, 약 5 내지 약 100개, 예를 들어 약 5 내지 약 50개, 더욱 좋기로는 약 8 내지 약 30개, 가장 좋기로는 약 8 내지 약 25개 아미노산 길이일 수 있으며, 예를 들어 에피토프는 좋기로는 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 아미노산 길이일 수 있다. 일 구현예에서, 에피토프의 길이는 약 10 내지 약 25개 아미노산이다. "에피토프"라는 용어에는 T 세포 에피토프가 포함된다.
"T 세포 에피토프"라는 용어는 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때 T 세포에 의해 인식되는 단백질의 일부 또는 단편을 의미한다. "주요 조직적합성 복합체"라는 용어 및 약어 "MHC"는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 포함하며 모든 척추동물에 존재하는 유전자 복합체와 관련된다. MHC 단백질 또는 분자는 면역 반응에서 림프구와 항원 제시 세포 또는 질병에 걸린 세포 사이의 신호전달에 중요하며, 여기서 MHC 단백질 또는 분자는 펩타이드 에피토프와 결합하여 T 세포의 T 세포 수용체에 의한 인식을 위해 이를 제시한다. MHC에 의해 인코딩된 단백질은 세포 표면에서 발현되며, T 세포에 대해 자가 항원(세포 자체의 펩타이드 단편)과 비자가 항원(예컨대 침입하는 미생물의 단편)을 모두 표시한다. 클래스 I MHC/펩타이드 복합체의 경우, 결합 펩타이드의 길이는 일반적으로 약 8 내지 약 10개의 아미노산이지만 더 길거나 더 짧은 펩타이드도 효과적일 수 있다. 클래스 II MHC/펩타이드 복합체의 경우, 결합 펩타이드의 길이는 전형적으로 약 10 내지 약 25개 아미노산 길이이고 특히 약 13 내지 약 18개 아미노산 길이인 반면, 더 길거나 더 짧은 펩타이드가 효과적일 수도 있다.
펩타이드 및 단백질 항원은 2개 내지 100개 아미노산, 예를 들어 5개 아미노산, 10개 아미노산, 15개 아미노산, 20개 아미노산, 25개 아미노산, 30개 아미노산, 35개 아미노산, 40개 아미노산, 45개 아미노산 또는 50개 아미노산 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 50개 초과의 아미노산일 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 100개 초과의 아미노산일 수 있다.
펩타이드 또는 단백질 항원은 펩타이드 또는 단백질에 대한 항체 및 T 세포 반응을 발생시키는 면역계의 능력을 유도하거나 증가시킬 수 있는 임의의 펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
일 구현예에서, 백신 항원, 즉 대상체에 접종하여 면역 반응을 유도하는 항원은 면역 이펙터 세포에 의해 인식된다. 좋기로는, 면역 이펙터 세포에 의해 인식되는 경우 백신 항원은 적절한 보조자극 신호의 존재 하에 백신 항원을 인식하는 항원 수용체를 보유하는 면역 이펙터 세포의 자극, 프라이밍 및/또는 확장을 유도할 수 있다. 본 개시내용의 구현예의 맥락에서, 백신 항원은 좋기로는 세포, 좋기로는 항원 제시 세포의 표면 상에 제시되거나 존재한다. 일 구현예에서, 항원은 질병에 걸린 세포(예컨대 종양 세포 또는 감염된 세포)에 의해 제시된다. 일 구현예에서, 항원 수용체는 MHC와 관련하여 제시된 항원의 에피토프에 결합하는 TCR이다. 일 구현예에서, T 세포에 의해 발현되고/되거나 T 세포 상에 존재하는 경우 TCR이 항원 제시 세포와 같은 세포에 의해 제시되는 항원에 결합하면 상기 T 세포의 자극, 프라이밍 및/또는 확장이 발생한다. 일 구현예에서, TCR(T 세포에 의해 발현되고/되거나 T 세포 상에 존재하는 경우)이 질병 세포에 제시된 항원에 결합하면, 그 질병 세포의 세포용해 및/또는 세포사멸이 발생하고, 여기서 상기 T 세포는 좋기로는 세포독성 인자, 예를 들어 퍼포린 및 그랜자임을 방출한다.
일 구현예에서, 항원 수용체는 항원의 에피토프에 결합하는 항체 또는 B 세포 수용체이다. 일 구현예에서, 항체 또는 B 세포 수용체는 항원의 천연 에피토프에 결합한다.
"세포 표면에 발현된" 또는 "세포 표면과 회합된(associated with the cell surface)"이라는 용어는 항원과 같은 분자가 세포의 원형질막과 회합되어 위치하며, 분자의 적어도 한 부분이 세포외 공간을 향하고 있음을 의미한다. 상기 세포의 외부로부터, 예를 들어 세포 외부에 위치한 항체에 의해 접근 가능하다. 이러한 맥락에서, 부분은 좋기로는 적어도 4개, 좋기로는 적어도 8개, 좋기로는 적어도 12개, 더욱 좋기로는 적어도 20개의 아미노산이다. 회합은 직접적이거나 간접적일 수 있다. 예를 들어, 회합은 하나 이상의 막관통 도메인, 하나 이상의 지질 앵커에 의해 또는 임의의 다른 단백질, 지질, 당류 또는 세포의 원형질막 외부 리플렛에서 발견될 수 있는 다른 구조와의 상호작용에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 세포 표면과 회합된 분자는 세포외 부분을 갖는 막관통 단백질일 수 있거나, 막관통 단백질인 다른 단백질과 상호작용하여 세포 표면과 회합된 단백질일 수 있다.
"세포 표면" 또는 "세포의 표면"은 당업계에서의 일반적인 의미에 따라 사용되며, 따라서 단백질 및 기타 분자에 의해 결합될 수 있는 세포 외부를 포함한다. 항원이 세포의 표면에 위치하고 예를 들어 세포에 첨가된 항원-특이적 항체에 의해 결합될 수 있는 경우 항원은 세포의 표면에서 발현된다.
본 개시내용의 맥락에서 용어 "세포외 부분" 또는 "엑소도메인"은 세포의 세포외 공간을 향하고 좋기로는 상기 세포의 외부로부터, 예컨대 그 세포의 외부에 위치한 항체 등의 분자와의 결합에 의해 접근가능한 단백질과 같은 분자 부분을 지칭한다. 좋기로는, 이 용어는 하나 이상의 세포외 루프 또는 도메인 또는 이의 단편을 지칭한다.
용어 "T 세포" 및 "T 림프구"는 본원에서 호환적으로 사용되며, 세포용해성 T 세포를 포함하는 T 보조 세포(CD4+ T 세포) 및 세포독성 T 세포(CTL, CD8+ T 세포)를 포함한다. "항원 특이 T 세포"라는 용어 또는 이와 유사한 용어는 특히 MHC 분자 관점상 항원 제시 세포 또는 암세포와 같은 질병에 걸린 세포의 표면에 제시될 때 T 세포가 표적화되는 항원을 인식하고, 좋기로는 T 세포의 이펙터 기능을 발휘하는 T 세포에 관한 것이다. T 세포가 항원을 발현하는 표적 세포를 죽이는 경우, T 세포는 항원에 특이적인 것으로 간주된다. T 세포 특이성은 예를 들어 크롬 방출 분석 또는 증식 분석 내에서 다양한 표준 기술 중 하나를 사용하여 평가할 수 있다. 별법으로, 림포카인(예컨대 인터페론-γ)의 합성을 측정할 수 있다. 본 개시내용의 특정 구현예에서, RNA(특히 mRNA)는 적어도 하나의 에피토프를 인코딩한다.
"표적"이라는 용어는 세포성 면역 반응과 같은 면역 반응의 표적이 되는 세포 또는 조직과 같은 물질을 의미한다. 표적에는 항원 또는 항원 에피토프, 즉 항원으로부터 유래된 펩타이드 단편을 제시하는 세포가 포함된다. 일 구현예에서, 표적 세포는 항원을 발현하고 좋기로는 클래스 I MHC를 갖는 상기 항원을 제시하는 세포이다.
"항원 가공"은 항원을 상기 항원의 단편인 가공 산물로 분해(예를 들어, 단백질을 펩타이드로 분해)하고 이들 단편 중 하나 이상을 세포, 좋기로는 특정 T 세포에 대한 항원 제시 세포의 제시를 위해 MHC 분자와 회합(예를 들어 결합을 통해)시키는 것을 의미한다.
"항원 반응성 CTL"은 항원 제시 세포의 표면에 클래스 I MHC와 함께 제시되는 항원 또는 상기 항원으로부터 유래된 펩타이드에 반응하는 CD8+ T 세포를 의미한다.
본 개시내용에 따르면, CTL 반응성은 지속적인 칼슘 흐름, 세포 분열, IFN- γ 및 TNF-α와 같은 사이토카인의 생성, CD44 및 CD69와 같은 활성화 마커의 상향 조절 및 종양 항원 발현 표적 세포의 특이적 세포용해 사멸을 포함할 수 있다. CTL 반응성은 또한 CTL 반응성을 정확하게 나타내는 인공 리포터를 사용하여 결정될 수도 있다.
용어 "면역 반응" 및 "면역 반응"은 본원에서 그들의 통상적인 의미로 호환적으로 사용되고 항원에 대한 통합된 신체 반응을 지칭하며, 좋기로는 세포성 면역 반응, 체액성 면역 반응, 또는 둘 다를 지칭한다. 본 개시내용에 따르면, 항원, 세포 또는 조직과 같은 제제에 관한 용어 "에 대한 면역 반응" 또는 "에 대한 면역 반응"은 제제에 대한 세포 반응과 같은 면역 반응에 관한 것이다. 면역 반응은 하나 이상의 항원에 대한 항체 개발 및 항원 특이적 T-림프구, 좋기로는 CD4+ 및 CD8+ T-림프구, 더욱 좋기로는 CD8+ T-림프구의 확장으로 구성된 그룹에서 선택되는 하나 이상의 반응을 포함할 수 있다. 이는 시험관내 다양한 증식 또는 사이토카인 생산 테스트에서 검출될 수 있다.
본 개시내용과 관련하여 용어 "면역 반응을 유도하는" 및 "면역 반응을 유도하는" 및 이와 유사한 용어는 면역 반응의 유도, 좋기로는 세포성 면역 반응, 체액성 면역 반응, 또는 둘 모두의 유도를 지칭한다. 면역 반응은 보호적/예방적/예방적 및/또는 치료적일 수 있다. 면역 반응은 임의의 면역원 또는 항원 또는 항원 펩타이드에 대한 것일 수 있으며, 좋기로는 종양 관련 항원 또는 병원체 관련 항원(예를 들어, 바이러스 (예컨대 인플루엔자 바이러스(A, B 또는 C), CMV 또는 RSV)))의 항원에 대한 것일 수 있다. 이러한 맥락에서 "유도하는"이라 함은 유도 전에 특정 항원이나 병원체에 대한 면역 반응이 없었음을 의미할 수 있지만, 유도 전과 유도 후에는 특정 항원이나 병원체에 대해 일정 수준의 면역 반응이 있음을 의미일 수도 있다. 따라서, 본 맥락에서 "면역 반응을 유도하는"이라 함은 "면역 반응을 강화하는"도 포함된다. 좋기로는, 개체에서 면역 반응을 유도한 후, 상기 개체는 감염성 질환 또는 암성 질환과 같은 질병의 발병으로부터 보호되거나 면역 반응을 유도함으로써 질병 상태가 개선된다.
"세포성 면역 반응", "세포성 반응", "세포 매개 면역" 또는 이와 유사한 용어는 항원의 발현 및/또는 클래스 I 또는 클래스 II MHC의 항원 제시를 특징으로 하는 세포에 대한 세포성 반응을 포함하는 의미이다. 세포 반응은 "헬퍼" 또는 "킬러" 역할을 하는 T 세포 또는 T 림프구라고 불리는 세포와 관련이 있다. 헬퍼 T 세포(CD4+ T 세포라고도 함)는 면역 반응을 조절하여 중심적인 역할을 하고, 킬러 세포(세포독성 T 세포, 세포용해성 T 세포, CD8+ T 세포 또는 CTL이라고도 함)는 질병에 걸린 세포와 같은 세포를 죽인다.
"체액성 면역 반응"이라는 용어는 항체가 물질 및 유기체에 반응하여 생성되어 궁극적으로 중화 및/또는 제거되는 살아있는 유기체에서의 과정을 의미한다. 항체 반응의 특이성은 단일 특이성의 항원과 결합하는 막-회합 수용체를 통해 T 및/또는 B 세포에 의해 매개된다. 적절한 항원과의 결합 및 다양한 다른 활성화 신호를 받은 후 B 림프구는 분열하여 기억 B 세포와 항체 분비 형질 세포 클론을 생성하며, 이들 각각은 그의 항원 수용체에 의해 인식되는 것과 동일한 항원 에피토프를 인식하는 항체를 생성한다. 기억 B 림프구는 특정 항원에 의해 활성화될 때까지 휴면 상태를 유지한다. 이 림프구는 기억의 세포적 기반을 제공하고 특정 항원에 다시 노출될 때 항체 반응의 결과적인 증가를 제공한다.
"백신접종" 및 "면역화"라는 용어는 치료적 또는 예방적 이유로 개체를 치료하는 과정을 설명하며 하나 이상의 면역원(들), 항원(들) 또는 이의 유도체를 특히, 본원에 설명된 바와 같이, 이를 코딩하는 RNA(특히 mRNA) 형태로, 개체에게 투여하여, 상기 하나 이상의 면역원(들) 또는 항원(들) 또는 상기 하나 이상의 면역원(들) 또는 항원의 제시를 특징으로 하는 세포에 대한 면역 반응을 자극하는 하는 것과 관련된다.
"항원 제시를 특징으로 하는 세포" 또는 "항원을 제시하는 세포" 또는 "항원 제시 세포의 표면에 항원을 제시하는 MHC 분자" 또는 이와 유사한 표현은 질병에 걸린 세포, 특히 종양 세포 또는 감염된 세포, 또는 MHC 분자, 좋기로는 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 분자, 가장 좋기로는 MHC 클래스 I과 관련하여 직접적으로 또는 프로세싱 후에 항원 또는 항원 펩타이드를 제시하는 항원 제시 세포 분자와 같은 세포를 의미한다.
본 개시내용의 맥락에서, 용어 "전사"는 DNA 서열의 유전자 코드가 RNA(특히 mRNA)로 전사되는 과정에 관한 것이다. 이어서, RNA(특히 mRNA)는 펩타이드나 단백질로 번역될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "발현"은 특정 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 번역으로 정의된다. RNA와 관련하여 용어 "발현" 또는 "번역"은 mRNA 가닥이 아미노산 서열의 조립을 지시하여 펩타이드 또는 단백질을 만드는 세포의 리보솜 과정과 관련된다.
" 선택적" 또는 "선택적으로"라는 용어는 이후에 설명되는 사건, 상황 또는 조건이 발생할 수도 있고 발생하지 않을 수도 있다는 것을 의미하며, 그 설명에는 상기 사건, 상황 또는 조건이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우가 포함된다는 의미이다.
본 명세서에 사용된 "내인성(endogenous)"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 생성되거나 유기체 내부에서 생성된 임의의 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합"은 호환적으로 사용된다. 이 용어는 둘 이상의 요소나 구성 요소 또는 영역을 함께 결합하는 것을 의미한다.
"질병"(본 명세서에서 "장애"라고도 함)이라는 용어는 개체의 신체에 영향을 미치는 비정상적인 상태를 의미한다. 질병은 종종 특정 증상 및 징후와 관련된 의학적 상태로 해석된다. 질병은 감염성 질환 등 원래 외부 요인에 의해 발생할 수도 있고, 자가면역질환 등 내부 기능 장애로 인해 발생할 수도 있다. 인간의 경우 "질병"은 개체에게 통증, 기능 장애, 괴로움, 사회적 문제 또는 사망을 유발하거나 개체와 접촉하는 사람들에게 유사한 문제를 유발하는 모든 상태를 지칭하기 위해 더 광범위하게 사용되는 경우가 많다. 더 넓은 의미에서는 부상, 장애, 장애, 증후군, 감염, 단리된 증상, 비정상적인 행동, 구조와 기능의 비정형적 변형이 포함되는 경우도 있지만, 다른 맥락과 다른 목적에서는 이들은 구별 가능한 범주로 간주될 수 있다. 질병은 일반적으로 개체에게 신체적으로 영향을 미칠 뿐만 아니라 감정적으로도 영향을 미는데, 이는 많은 질병에 걸린 채로 생활하면 삶에 대한 관점과 성격이 바뀔 수 있기 때문이다.
"치료적 치료"라는 용어는 건강 상태를 개선하고/하거나 개체의 수명을 연장(증가)시키는 모든 치료와 관련된다. 상기 치료법은 개체의 질병을 제거하거나, 개체의 질병 발병을 중단 또는 지연시키거나, 개체의 질병 발병을 억제하거나 늦추거나, 개체에서 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키고/시키거나, 현재 질병을 앓고 있거나 이전에 질병을 앓았던 개체에서 질병의 재발을 감소시킬 수 있다.
"예방적 치료(prophylactic treatment)" 또는 "예방적 치료(preventive treatment)"라는 용어는 개체에게 질병이 발생하는 것을 예방하기 위한 모든 치료와 관련된다. "예방적 치료" 용어는 본원에서 호환적으로 사용된다. 마찬가지로, 종양 또는 암의 진행과 같은 질병의 진행과 관련하여 용어 "예방 방법"은 개체에서 질병이 진행되는 것을 방지하기 위한 임의의 방법에 관한 것이다.
"개체" 및 "대상체"라는 용어는 본 명세서에서 호환적으로 사용된다. 이는 질병이나 장애(예컨대 암, 전염병)에 시달릴 수 있거나 걸리기 쉬우나, 질병이나 장애가 있거나 없을 수 있고, 예방접종과 같은 예방적 개입을 필요로 하거나 또는 단백질 대체와 같은 개입이 필요할 수 있는, 인간 또는 다른 포유동물(예컨대 마우스, 쥐, 토끼, 개, 카탈로그, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류) 또는 포유동물이 아닌 동물, 에컨대 새(닭), 물고기 또는 그 밖의 동물 종을 가리킨다. 많은 구현예에서, 개체는 인간이다. 달리 명시하지 않는 한, "개체" 및 "대상체"라는 용어는 특정 연령을 의미하지 않으며, 따라서 성인, 노인, 어린이 및 신생아를 포함한다. 본 개시내용의 구현예에서, "개체" 또는 "대상체"는 "환자"이다.
"환자"라는 용어는 치료를 위한 개체 또는 대상체, 특히 질병에 걸린 개체 또는 대상체를 의미한다.
본 발명의 측면 및 구현예
첫 번째 측면에서, 본 개시내용은 대상체에서 종양의 진행을 감소 또는 예방하거나 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 결합제를 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체에게 체크포인트 억제제를 투여하기 전, 투여와 동시 또는 투여 후에 결합제를 투여하는 것을 포함하되, 여기서 결합제는 CD40에 결합하는 제1 결합 영역 및 CD137에 결합하는 제2 결합 영역을 포함하는 것이다.
본 개시내용에서 입증된 바와 같이, (i) 인간 CD40에 결합하고 인간 CD137에 결합하는 결합제를 이용한 자극 및 (ii) 체크포인트 억제(특히 PD-1/PD-L1 축의 억제)의 조합은 면역 반응을 증폭시킨다. 어떠한 이론에도 얽매이지 않고, 이 놀라운 발견의 이면에 있는 합리적 근거는 다음과 같을 수 있다: CD137은 PD-1+ 세포에서 공동발현된다. 따라서 PD-L1/PD-1 신호의 차단과 CD137을 통한 공동자극은 시너지 효과를 발휘하여 T 세포 이펙터 기능을 향상시키고 반응 기간을 향상시킬 수 있다. CD40 및 CD137의 조건부 활성화를 통해 CD40 및 CD137을 표적으로 하는 결합제는 향상된 T 세포 프라이밍, 사이토카인 및 케모카인 생산, 항원 경험 T 세포의 확장 및 생존을 통해 강력한 항종양 활성을 유도한다. PD-(L)1 경로는 프라이밍 동안뿐만 아니라 지속적인 항원 노출 동안 활성화될 것으로 예상되며, 이는 CD40 및 CD137을 표적으로 하는 결합제에 의해 유도되는 면역 반응의 크기를 감소시킬 수 있다.
CD40 및 CD137에 결합하는 결합제
일 구현예에서, CD40은 인간 CD40, 특히 SEQ ID NO: 36에 제시된 서열을 포함하는 인간 CD40이다. 일 구현예에서, CD137은 인간 CD137, 특히 SEQ ID NO: 38에 제시된 서열을 포함하는 인간 CD137이다. 일 구현예에서, CD40은 인간 CD40이고 CD137은 인간 CD137이다. 일 구현예에서, CD40은 SEQ ID NO: 36에 제시된 서열을 포함하는 인간 CD40이고, CD137은 SEQ ID NO: 38에 제시된 서열을 포함하는 인간 CD137이다.
첫 번째 측면에 따른 결합제의 일 구현예에서,
a) 인간 CD40에 결합하는 제1 결합 영역은 SEQ ID NO: 7 또는 9의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 SEQ ID NO: 8 또는 10의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고;
b) 인간 CD137에 결합하는 제2 항원 결합 영역은 SEQ ID NO: 17 또는 19의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 SEQ ID NO: 18 또는 20의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
첫 번째 측면에 따른 결합제의 일 구현예에서,
a) 인간 CD40에 결합하는 제1 결합 영역은 각각 SEQ ID NO: 1, 2, 및 3에 제시된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 각각 SEQ ID NO: 4, 5, 및 6에 제시된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고;
b) 인간 CD137에 결합하는 제2 항원 결합 영역은 각각 SEQ ID NO: 11, 12, 및 13에 제시된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 각각 SEQ ID NO: 14, 15, 및 16에 제시된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
첫 번째 측면에 따른 결합제의 일 구현예에서,
a) 인간 CD40에 결합하는 제1 결합 영역은 SEQ ID NO: 7 또는 9에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 8 또는 10에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 영역을 포함하고;
b) 인간 CD137에 결합하는 제2 결합 영역은 SEQ ID NO: 17 또는 19에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 18 또는 20에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 영역을 포함한다.
첫 번째 측면에 따른 결합제의 일 구현예에서,
a) 인간 CD40에 결합하는 제1 결합 영역은 SEQ ID NO: 7 또는 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 8 또는 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고;
b) 인간 CD137에 결합하는 제2 결합 영역은 SEQ ID NO: 17 또는 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 18 또는 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
첫 번째 측면에 따른 결합제의 일 구현예에서,
a) 인간 CD40에 결합하는 제1 결합 영역은 SEQ ID NO: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 영역을 포함하고;
b) 인간 CD137에 결합하는 제2 결합 영역은 SEQ ID NO: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 영역을 포함한다.
결합제는 특히 다중특이 항체, 예를 들어 이중특이 항체와 같은 항체일 수 있다. 또한, 결합제는 전장 항체 또는 항체 단편의 형식일 수 있다.
결합제가 인간 항체 또는 인간화 항체인 것이 더욱 바람직하다.
각각의 가변 영역은 3개의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)과 4개의 프레임워크 영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 포함할 수 있다.
상보성 결정 영역(CDR) 및 프레임워크 영역(FR)은 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열될 수 있다.
첫 번째 측면의 일 구현예에서, 결합제는 다음을 포함한다:
i) 상기 제1 중쇄 가변 영역(VH) 및 제1 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하는 폴리펩타이드, 및
ii) 상기 제2 중쇄 가변 영역(VH) 및 제2 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하는 폴리펩타이드.
첫 번째 측면의 일 구현예에서, 결합제는 다음을 포함한다:
i) 상기 제1 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고 제1 경쇄 불변 영역(CL)을 추가로 포함하는 폴리펩타이드, 및
ii) 상기 제2 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고 제2 경쇄 불변 영역(CL)을 추가로 포함하는 폴리펩타이드.
첫 번째 측면의 일 구현예에서, 결합제는 제1 결합 팔 및 제2 결합 팔을 포함하는 항체이고, 여기서 제1 결합 팔은:
i) 상기 제1 중쇄 가변 영역(VH) 및 상기 제1 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하는 폴리펩타이드, 및
ii) 상기 제1 경쇄 가변 영역(VL) 및 상기 제1 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하고,
두 번째 결합 팔은:
iii) 상기 제2 중쇄 가변 영역(VH) 및 상기 제2 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하는 폴리펩타이드, 및
iv) 상기 제2 경쇄 가변 영역(VL) 및 상기 제2 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
첫 번째 측면의 일 구현예에서, 결합제는 i) CD40에 결합할 수 있는 상기 항원-결합 영역을 포함하는 제1 중쇄 및 경쇄로서, 상기 제1 중쇄는 제1 중쇄 불변 영역을 포함하고 상기 제1 경쇄는 제1 경쇄 불변 영역을 포함하는 것인 제1 중쇄 및 경쇄; 및 ii) CD137에 결합할 수 있는 상기 항원 결합 영역을 포함하는 제2 중쇄 및 경쇄로서, 상기 제2 중쇄는 제2 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 제2 경쇄는 제2 경쇄 불변 영역을 포함하는 것인 제2 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
제1 및 제2 중쇄 불변 영역(CH) 각각은 불변 중쇄 1(CH1) 영역, 힌지 영역, 불변 중쇄 2(CH2) 영역 및 불변 중쇄 3(CH3) 영역 중 하나 이상, 좋기로는 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함할 수 있다.
제1 및 제2 중쇄 불변 영역(CH) 각각은 CH3 영역을 포함할 수 있으며, 여기서 2개의 CH3 영역은 비대칭 돌연변이를 포함한다. 비대칭 돌연변이는 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열이 동일하지 않은 위치에 아미노산 치환을 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 상기 제1 및 제2 CH3 영역 중 하나는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 405에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함하고, 상기 제1 및 제2 CH3 영역 중 다른 하나는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 409에 상응하는 위치에 돌연변이를 함유한다
상기 제1 중쇄 불변 영역(CH)에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407, 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 하나가 치환되었을 수 있고, 상기 제2 중쇄 불변 영역(CH)에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407, 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 하나가 치환되었을 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 중쇄와 제2 중쇄는 동일한 위치에서 치환되지 않는다(즉, 제1 중쇄와 제2 중쇄는 비대칭 돌연변이를 함유한다).
첫 번째 측면에 따른 결합제의 일 구현예에서,
(i) EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 F405에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제1 중쇄 불변 영역(CH)에서 L이고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제2 중쇄 불변 영역(CH)에서 R이거나, 또는 (ii) EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 K409에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제1 중쇄에서 R이고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제2 중쇄에서 L이다.
첫 번째 측면의 일 구현예에서, 결합제는 동일한 제1 및 제2 항원 결합 영역 및 인간 IgG1 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 2개의 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하는 또 다른 항체에 비해 Fc 매개 이펙터 기능을 더 적은 정도로 유도한다.
첫 번째 측면에 따른 결합제의 특정한 일 구현예에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 불변 영역(CH)은, 항체가 변형되지 않은 제1 및 제2 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하는 것을 제외하고 동일한 항체에 비해, Fc 매개 이펙터 기능을 더 적은 정도로 유도하도록 변형된다. 특히, 상기 변형되지 않은 제1 및 제2 중쇄 불변 영역(CH) 각각 또는 두 가지 모두는 SEQ ID NO: 21 또는 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 본질적으로 구성될 수 있다.
Fc-매개 이펙터 기능은 결합제의 Fcγ 수용체에 대한 결합, C1q에 대한 결합, 또는 Fcγ 수용체의 Fc-매개 가교 유도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 특히, Fc-매개 이펙터 기능은 C1q에 대한 결합제의 결합을 측정함으로써 결정될 수 있다.
결합제의 제1 및 제2 중쇄 불변 영역은 야생형 항체와 비교하여 상기 항체에 대한 C1q의 결합이 감소되도록, 좋기로는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100% 감소되도록 변형되었을 수 있고, 여기서 C1q 결합은 ELISA에 의해 결정되는 것이 바람직하다.
첫 번째 측면에 따른 결합제의 제1 구현예에서,상기 제1 및 제2 중쇄 불변 영역(CH) 중 적어도 하나에서, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, D265, N297, 및 P331에 상응하는 위치 중 하나 이상의 아미노산은 각각 L, L, D, N 및 P가 아니다.
첫 번째 측면에 따른 결합제의 일 구현예에서, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치는 상기 제1 중쇄 및 제2 중쇄에서 각각 F 및 E일 수 있다.
특히, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235 및 D265에 상응하는 위치는 상기 제1 및 제2 중쇄 불변 영역(HC)에서 각각 F, E 및 A일 수 있다.
첫 번째 측면에 따른 결합제의 일 구현예에서, 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 둘 다의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치는 각각 F 및 E이고, 여기서 (i) 제1 중쇄 불변 영역의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 중 F405에 상응하는 위치는 L이고, 제2 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 중 K409에 상응하는 위치는 R 이며, 또는 (ii) 제1 중쇄 불변 영역의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 중 K409에 상응하는 위치는 R이고, 제2 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 중 F405에 상응하는 위치는 L이다.
첫 번째 측면에 따른 결합제의 일 구현예에서, 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 둘 다의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 L234, L235 및 D265에 상응하는 위치는 각각 F, E 및 A이고, 여기서 (i) 제1 중쇄 불변 영역의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 중 F405에 상응하는 위치는 L이고, 제2 중쇄 불변 영역의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 중 K409에 상응하는 위치는 제2 중쇄 불변 영역은 R이거나, 또는 (ii) 제1 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내 K409에 상응하는 위치는 R이고, 제2 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내 F405에 상응하는 위치는 L이다.
첫 번째 측면에 따른 결합제의 일 구현예에서, 상기 제1 및/또는 제2 중쇄의 불변 영역은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다:
a) SEQ ID NO: 21 또는 SEQ ID NO: 29 [IgG1-FC]에 제시된 서열;
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 10개의 치환, 예를 들어 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열.
첫 번째 측면에 따른 결합제의 일 구현예에서, 상기 제1 중쇄 또는 제2 중쇄, 예컨대 제2 중쇄의 불변 영역은
a) SEQ ID NO: 22 또는 SEQ ID NO: 30에 제시된 서열 [IgG1-F405L];
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 9개의 치환, 예컨대 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 또는 구성된다.
첫 번째 측면에 따른 결합제의 일 구현예에서, 상기 제1 중쇄 또는 제2 중쇄, 예컨대 제1 중쇄의 불변 영역은
a) SEQ ID NO: 23 또는 31 [IgG1-F409R]에 제시된 서열;
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 10개의 치환, 최대 9개의 치환, 예컨대 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개의 치환, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 또는 구성된다.
첫 번째 측면에 따른 결합제의 일 구현예에서, 상기 제1 중쇄 및/또는 제2 중쇄의 불변 영역은
a) SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 32 [IgG1-Fc_FEA]에 제시된 서열;
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 7개의 치환, 예를 들어 최대 6개의 치환, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 또는 구성된다.
첫 번째 측면에 따른 결합제의 일 구현예에서, 상기 제1 중쇄 및/또는 제2 중쇄, 예컨대 제2 중쇄의 불변 영역은
a) SEQ ID NO: 25 또는 SEQ ID NO: 33 [IgG1-Fc_FEAL]에 제시된 서열;
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 6개의 치환, 예를 들어 최대 5개의 치환, 최대 4개의 치환, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 또는 구성된다.
첫 번째 측면에 따른 결합제의 일 구현예에서, 상기 제1 중쇄 및/또는 제2 중쇄, 예컨대 제2 중쇄의 불변 영역은
a) SEQ ID NO: 26 또는 SEQ ID NO: 34 [IgG1-Fc_FEAR]에 제시된 서열;
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 6개의 치환, 예를 들어 최대 5개의 치환, 최대 4개의 치환, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 또는 구성된다.
첫 번째 측면의 일 구현예에서, 결합제는 카파(κ) 경쇄 불변 영역을 포함한다.
첫 번째 측면의 일 구현예에서, 결합제는 람다(λ) 경쇄 불변 영역을 포함한다.
첫 번째 측면에 따른 결합제의 일 구현예에서, 제1 경쇄 불변 영역은 카파(κ) 경쇄 불변 영역 또는 람다(λ) 경쇄 불변 영역이다.
첫 번째 측면에 따른 결합제의 일 구현예에서, 제2 경쇄 불변 영역은 람다(λ) 경쇄 불변 영역 또는 카파(κ) 경쇄 불변 영역이다.
첫 번째 측면에 따른 결합제의 일 구현예에서, 제1 경쇄 불변 영역은 카파(κ) 경쇄 불변 영역이고, 제2 경쇄 불변 영역은 람다(λ) 경쇄 불변 영역이거나 또는 제1 경쇄 불변 영역은 람다(λ) 경쇄 불변 영역이고 제2 경쇄 불변 영역은 카파(κ) 경쇄 불변 영역이다.
첫 번째 측면에 따른 결합제의 일 구현예에서, 카파(κ) 경쇄는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다:
a) SEQ ID NO: 27에 제시된 서열;
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 10개의 치환, 예컨대 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개의 치환, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열.
첫 번째 측면에 따른 결합제의 일 구현예에서, 람다(λ) 경쇄는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
a) SEQ ID NO: 28에 제시된 서열;
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 10개의 치환, 예컨대 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개의 치환, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열.
첫 번째 측면에 따른 결합제(특히 항체)는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택되는 이소형을 갖는다. 특히, 결합제는 전장 IgG1 항체일 수 있다. 첫 번째 측면의 바람직한 구현예에서, 결합제(특히, 항체)는 IgG1m(f) 알로타입이다.
좋기로는, 결합제는 적합한 양으로 투여되며, 즉, 예를 들어 각 용량 및/또는 치료 사이클에서 투여되는 결합제의 양은 다른 세포에서 발현되는 CD137에 결합할 때 세포내 신호전달을 유도할 수 있다. 따라서, 본 개시내용에 따른 적합한 양의 결합제는 2개의 상이한 세포를 트랜스-활성화할 수 있다. 인간에서 CD40은 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포(APC)를 포함한 여러 세포에서 발현되는 반면, CD137은 T 세포 및 기타 세포에서 발현된다. 따라서, 본 개시내용에 따른 적합한 양의 CD40 및 CD137에 결합하는 결합제는 이들 수용체를 발현하는 APC 및 T 세포에 동시에 결합할 수 있다. 결합제는 따라서 (i) 수용체 결합에 의해 APC와 T 세포 사이의 세포-대-세포 상호작용을 중재하고 (ii) CD40과 CD137을 동시에 활성화할 수 있으며, 이는 주로 가교에 의해 유도되고 세포-대-세포 상호작용에 따른 수용체 클러스터링이며 단일특이적 2가 모항체의 작용 활성에 반드시 의존하지는 않으나, 특정 이론에 구애되는 것은 아니다. 따라서, 이들 트랜스-활성화 결합제는 APC:T 세포 상호작용의 맥락에서 공동자극 활성을 발휘하고, 종양 세포에 대한 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 따라서 이러한 작용 메커니즘은 활성화된 APC에 의한 항원 제시를 통한 자연적인 T 세포 활성화를 반영할 수 있으며, 이는 APC에 의한 다양한 종양 특이적 항원의 T 세포 제시를 허용한다. 공동자극 활성은 (i) 임의의 T 세포와는 대조적으로 특정 T 세포(즉, APC와 접촉하는 세포)만 활성화되도록 하는 것; (ii) 활성화된 APC 및 CD137 유발을 통한 강력한 공동 자극에 의한 소진된 T 세포의 재활성화; (iii) 활성화된 APC에 의한 항원 제시를 유도하고 동시에 CD137을 유발함으로써 T 세포를 프라이밍하는 것 중 하나 이상을 제공할 수 있다.
각각의 용량 및/또는 치료 사이클에서 투여되는 결합제의 양은 특히 상기 결합제의 5% 초과, 좋기로는 10% 초과, 더욱 좋기로는 15% 초과, 훨씬 더 좋기로는 20% 초과, 심지어는 더욱 좋기로는 25% 초과, 훨씬 더 좋기로는 30% 초과, 더욱 더 좋기로는 35% 초과, 더욱 더 좋기로는 40% 초과, 더욱 더 좋기로는 45% 초과, 가장 좋기로는 50% 초과의 양이 CD40과 CD137 모두에 결합하는 범위일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 예를 들어 각 용량 및/또는 각 치료 사이클에 투여되는 결합제의 양은 다음과 같다.
a) 총 약 0.01 - 2.5(예컨대 약 0.04 - 2.5) mg/kg 체중 또는 약 1 - 200(예컨대 약 3 - 200) mg; 및/또는
b) 약 0.07 x 10-9 - 16.9 x 10-9 (예컨대 약 0.25 x 10-9 - 16.9 x 10-9) mol/kg 체중 또는 약 8 x 10-9 - 1350 x 10-9 (예컨대 총 약 20 x 10-9 - 1350 x 10-9) mol.
일부 구현예에서, 예를 들어 각 용량 및/또는 각 치료 사이클에서 투여되는 결합제의 양은 다음과 같다.
a) 총 약 0.62 - 1.88(예컨대 약 1.0 - 1.5) mg/kg 체중 또는 약 50 - 150(예컨대 약 80 - 120) mg; 및/또는
b) 약 4.1 x 10-9 - 12.7 x 10-9 (예컨대 약 6.7 x 10-9 - 10.1 x 10-9) mol/kg 체중 또는 약 335 x 10-9 - 1020 x 10-9 (예컨대 총 약 535 x 10 -9 - 810 x 10-9) mol.
이들 구현예에 따르면, mg/kg으로 정의된 용량은 결합제가 투여된 대상체의 평균 체중이 80kg임을 기준으로 균일 용량으로 전환될 수 있고, 그 반대도 가능하다.
결합제는 당업계에 공지된 임의의 방식 및 경로에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 결합제는 비경구, 특히 정맥내와 같이 전신 투여된다.
결합제는 본원에 기술된 임의의 적합한 약제학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 결합제는 주입 형태로 투여된다.
결합제는 체크포인트 억제제 투여 전, 투여와 동시, 또는 투여 후에 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 결합제는 체크포인트 억제제 투여 전에 투여된다. 예를 들어, 결합제 투여 종료와 체크포인트 억제제 투여 시작 사이의 간격은 적어도 약 10분, 예를 들어 적어도 약 15분, 적어도 약 20분, 적어도 약 25분, 적어도 약 30분, 적어도 약 35분, 적어도 약 40분, 적어도 약 45분, 적어도 약 50분, 적어도 약 55분, 적어도 약 60분, 적어도 약 90분, 또는 적어도 약 120분, 및 최대 약 14일 (최대 약 2주), 예를 들어 최대 약 13일, 최대 약 12일, 최대 약 11일, 최대 약 10일, 최대 약 9일, 최대 약 8일, 최대 약 7일 (최대 약 1주), 최대 약 6일, 최대 약 5일, 최대 약 4일, 최대 약 3일, 최대 약 2일, 최대 약 1일(최대 약 24시간), 최대 약 18시간, 최대 약 12시간, 최대 약 6시간, 최대 약 5시간, 최대 약 4시간, 최대 약 3시간, 최대 약 2.5시간, 또는 최대 약 2시간일 수 있다.
일 구현예에서, 결합제는 체크포인트 억제제 투여 후에 투여된다. 예를 들어, 체크포인트 억제제 투여 종료와 결합제 투여 시작 사이의 간격은 적어도 약 10분, 예를 들어 적어도 약 15분, 적어도 약 20분, 적어도 약 25분, 적어도 약 30분, 적어도 약 35분, 적어도 약 40분, 적어도 약 45분, 적어도 약 50분, 적어도 약 55분, 적어도 약 60분, 적어도 약 90분, 또는 적어도 약 120분, 및 최대 약 14일 (최대 약 2주), 예를 들어 최대 약 13일, 최대 약 12일, 최대 약 11일, 최대 약 10일, 최대 약 9일, 최대 약 8일, 최대 약 7일 (최대 약 1주)), 최대 약 6일, 최대 약 5일, 최대 약 4일, 최대 약 3일, 최대 약 2일, 최대 약 1일(최대 약 24시간), 최대 약 18시간, 최대 약 12시간, 최대 약 6시간, 최대 약 5시간, 최대 약 4시간, 최대 약 3시간, 최대 약 2.5시간, 또는 최대 약 2시간일 수 있다.
일 구현예에서, 결합제는 체크포인트 억제제와 동시에 투여된다. 예를 들어, 결합제 및 체크포인트 억제제는 두 약물을 모두 포함하는 조성물을 사용하여 투여될 수 있다. 대안적으로, 결합제는 대상체의 한 말단에 투여될 수 있고, 체크포인트 억제제는 대상체의 다른 말단에 투여될 수 있다.
체크포인트 억제제
일 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용하기에 적합한 면역 체크포인트 억제제는 억제 신호의 길항제, 예를 들어 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, 또는 TIM-3을 표적으로 하는 항체이다. 이들 리간드 및 수용체는 문헌 [Pardoll, D., Nature. 12: 252-264, 2012]에서 검토된다. 본 개시내용에 따라 표적화될 수 있는 추가 면역 체크포인트 단백질이 본원에 기재되어 있다.
일 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 면역 체크포인트와 연관된 억제 신호를 예방한다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 면역 체크포인트와 관련된 억제 신호전달을 방해하거나 억제하는 항체 또는 그의 단편이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 억제 신호전달을 방해하거나 억제하는 소분자 억제제이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 억제 신호전달을 방해하거나 억제하는 펩타이드 기반 억제제이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 억제성 신호전달을 방해하거나 억제하는 억제성 핵산 분자이다.
본원에 기재된 바와 같은 억제성 면역 체크포인트 신호전달의 억제 또는 차단은 면역억제를 예방하거나 역전시키고, 암세포에 대한 T 세포 면역의 확립 또는 강화를 초래한다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 면역 체크포인트 신호전달의 억제는 면역계의 기능장애를 감소시키거나 억제한다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 면역 체크포인트 신호전달의 억제는 기능장애가 있는 면역 세포의 기능장애가 덜 일어나도록 한다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 면역 체크포인트 신호전달의 억제는 기능장애가 있는 T 세포의 기능장애가 덜 일어나도록 한다.
일 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 체크포인트 차단제 단백질 사이의 상호작용, 예를 들어 PD-1과 PD-L1 또는 PD-L2 사이의 상호작용; CTLA-4와 CD80 또는 CD86 사이의 상호작용; LAG-3과 하나 이상의 그의 리간드 사이의 상호작용; 하나 이상의 KIR과 각각의 리간드의 상호작용; TIM-3과 하나 이상의 그의 리간드(예컨대 Galectin-9, PtdSer, H mgB1 및 CEACAM1)의 상호작용; TIGIT과 그의 하나 이상의 리간드(예컨대 PVR, PVRL2 및 PVRL3)와의 상호작용; VISTA와 하나 이상의 그의결합 파트너와의 상호 작용; GARP와 하나 이상의 그의 리간드의 상호작용; CD39 및/또는 CD73을 통한 억제 신호전달 및/또는 A2AR 및/또는 A2BR과 아데노신의 상호작용; B7-H3과 그 수용체 및/또는 B7-H4와 그 수용체의 상호작용; BTLA와 그의 리간드 HVEM의 상호작용; CD94/NKG2A와 HLA-E의 상호작용; 하나 이상의 Siglec과 각각의 리간드의 상호작용; CD20 신호전달; CD47과 SIRPα의 상호작용, PVRIG와 PVRL2의 상호작용; CSF1R과 CSF1의 상호작용; NOX 신호전달; 및/또는 IDO 및/또는 TDO 신호전달을 방지한다.
면역 체크포인트 억제제는 항체, 그의 항원 결합 단편, 또는 필요한 특이성의 항원 결합 단편을 갖는 항체 부분을 포함하는 그의 구조물일 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 본원에 기술된 바와 같다. 면역 체크포인트 억제제인 항체 또는 그의 항원 결합 단편에는 특히 면역 체크포인트 수용체 또는 면역 체크포인트 수용체 리간드와 같은 면역 체크포인트 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 포함된다. 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 본원에 기술된 바와 같이 추가 모이어티에 접합될 수 있다. 특히, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 키메라화 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체이다. 좋기로는, 면역 체크포인트 억제제 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 면역 체크포인트 수용체 또는 면역 체크포인트 수용체 리간드의 길항제이다.
바람직한 일 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제인 항체는 단리된 항체이다.
일 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 체크포인트 차단제 단백질 사이의 상호작용을 방지하는 항체, 그의 단편 또는 구조물, 예를 들어 PD-1과 PD-L1 또는 PD-L2 사이의 상호작용을 방지하는 항체 또는 그의 단편; CTLA-4와 CD80 또는 CD86 사이의 상호작용을 방지하는 항체, 그의 단편 또는 구조물; LAG-3과 그의 리간드 사이의 상호작용을 방지하는 항체, 그의 단편 또는 구조물; TIM-3과 그의 리간드인 갈렉틴-9, PtdSer, H mgB1 및 CEACAM1 중 하나 이상과의 상호작용을 방지하는 항체, 그의 단편 또는 구조물; 하나 이상의 KIR과 각각의 리간드의 상호작용을 방지하는 항체, 그의 단편 또는 구조물; TIGIT와 그의 리간드 PVR, PVRL2 및 PVRL3 중 하나 이상과의 상호작용을 방지하는 항체, 그의 단편 또는 구조물; VISTA와 하나 이상의 결합 파트너의 상호작용을 방지하는 항체, 그의 단편 또는 구조물; GARP와 하나 이상의 리간드의 상호작용을 방지하는 항체, 그의 단편 또는 구조물; CD39 및/또는 CD73을 통한 억제 신호전달 및/또는 A2AR 및/또는 A2BR과 아데노신의 상호작용을 방지하는 항체, 그의 단편 또는 구조물; B7-H3과 그 수용체 및/또는 B7-H4와 그 수용체의 상호작용을 방지하는 항체, 그의 단편 또는 구조물; BTLA와 그의 리간드 HVEM의 상호작용을 방지하는 항체, 그의 단편 또는 구조물; LAG-3과 그의 리간드 중 하나 이상과의 상호작용을 방지하는 항체, 그의 단편 또는 구조물; CD94/NKG2A와 HLA-E의 상호작용을 방지하는 항체, 그의 단편 또는 구조물; 하나 이상의 Siglecs와 이들 각각의 리간드의 상호작용을 방지하는 항체, 그의 단편 또는 구조물; CD20 신호전달을 방지하는 항체, 그의 단편 또는 구조물; CD47과 SIRPα의 상호작용을 방지하는 항체, 그의 단편 또는 구조물; PVRIG와 PVRL2의 상호작용을 방지하는 항체, 그의 단편 또는 구조물; CSF1R과 CSF1의 상호작용을 방지하는 항체, 그의 단편 또는 구조물; NOX 신호전달을 방지하는 항체, 그의 단편 또는 구조물; 및/또는 IDO 및/또는 TDO 신호전달을 방지하는 항체, 그의 단편 또는 구조물이다.
면역 체크포인트 억제제는 억제성 핵산 분자, 예를 들어 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, 안티센스 DNA 또는 RNA 분자, 및 앱타머(예컨대 DNA 또는 RNA 앱타머), 특히 안티센스-올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 일 구현예에서, siRNA인 면역 체크포인트 억제제는 mRNA를 방해하여 번역, 예를 들어 면역 체크포인트 단백질의 번역을 차단한다.
체크포인트 억제제는 또한 분자(또는 그의 변이체) 자체의 가용성 형태, 예를 들어 가용성 PD-L1 또는 PD-L1 융합체의 형태일 수 있다.
본 개시내용과 관련하여, 하나 이상의 체크포인트 억제제가 사용될 수 있으며, 여기서 하나 이상의 체크포인트 억제제는 별개의 체크포인트 경로 또는 동일한 체크포인트 경로를 표적으로 한다. 좋기로는, 하나 이상의 체크포인트 억제제는 별개의 체크포인트 억제제이다. 좋기로는, 두 개 이상의 별개의 체크포인트 억제제가 사용되고, 특히 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 별개의 체크포인트 억제제가 사용되며, 바람직하게는 2, 3, 4 또는 5개의 별개의 체크포인트 억제제가 사용되고, 더욱 바람직하게는 2, 3 또는 4개의 별개의 체크포인트 억제제가 사용되며, 훨씬 더 바람직하게는 2 또는 3개의 별개의 체크포인트 억제제가 사용되고, 가장 바람직하게는 2개의 별개의 체크포인트 억제제가 사용된다.
일 구현예에서, 억제성 면역조절인자(면역 체크포인트 차단제)는 PD-1/PD-L1 또는 PD-1/PD-L2 신호전달 경로의 성분이다. 따라서, 본 개시내용의 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 PD-1 신호전달 경로의 억제제이다. 특정 구현예에서, PD-1 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 PD-1 억제제이다. 특정 구현예에서, PD-1 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 PD-1 리간드 억제제, 예컨대 PD-L1 억제제 또는 PD-L2 억제제이다. 바람직한 일 구현예에서, PD-1 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 PD-1 수용체와 그의 리간드 PD-L1 및/또는 PD-L2 중 하나 이상과의 사이의 상호작용을 방해하거나 억제하는 항체, 그의 항원-결합 부분 또는 그의 구조물이다. PD-1에 결합하고 PD-1과 그의 리간드 중 하나 이상 사이의 상호작용을 방해하거나 억제하는 항체는 당업계에 공지되어 있다. 특정 구현예에서, 항체, 그의 항원 결합 부분 또는 그의 구조물은 PD-1에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 항체, 그의 항원 결합 부분 또는 그의 구조물은 PD-L1에 특이적으로 결합하고 PD-1과의 상호작용을 방해하거나 억제하여 면역 활성을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 항체, 그의 항원 결합 부분 또는 그의 구조물은 PD-L2에 특이적으로 결합하고 PD-1과의 상호작용을 방해하거나 억제하여 면역 활성을 증가시킨다.
일 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 CTLA-4 신호전달 경로의 성분이다. 따라서, 본 개시내용의 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 CTLA-4 신호전달 경로의 억제제이다. 특정 구현예에서, CTLA-4 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 CTLA-4 억제제이다. 특정 구현예에서, CTLA-4 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 CTLA-4 리간드 억제제이다.
일 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 TIGIT 신호전달 경로의 성분이다. 따라서, 본 개시내용의 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 TIGIT 신호전달 경로의 억제제이다. 특정 구현예에서, TIGIT 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 TIGIT 억제제이다. 특정 구현예에서, TIGIT 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 TIGIT 리간드 억제제이다.
일 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 B7 패밀리 신호전달 경로의 성분이다. 특정 구현예에서, B7 패밀리 구성원은 B7-H3 및 B7-H4이다. 본 개시내용의 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 B7-H3 및/또는 B7-4의 억제제이다. B7 패밀리에는 정의된 수용체가 없지만 이들 리간드는 종양 세포 또는 종양 침윤 세포에서 상향 조절된다. 전임상 마우스 모델은 이러한 리간드의 차단이 항종양 면역을 강화할 수 있음을 보여주었다.
일 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 BTLA 신호전달 경로의 성분이다. 따라서, 본 개시내용의 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 BTLA 신호전달 경로의 억제제이다. 특정 구현예에서, BTLA 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 BTLA 억제제이다. 특정 구현예에서, BTLA 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 HVEM 억제제이다.
일 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 하나 이상의 KIR 신호전달 경로의 성분이다. 따라서, 본 개시내용의 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 하나 이상의 KIR 신호전달 경로의 억제제이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 KIR 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 KIR 억제제이다. 특정 구현예에서, 체크포인트 억제제 하나 이상의 KIR 신호전달 경로는 KIR 리간드 억제제이다. 예를 들어, 본 개시내용에 따른 KIR 억제제는 KIR2DL1, KIR2DL2 및/또는 KIR2DL3에 결합하는 항-KIR 항체일 수 있다.
일 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 LAG-3 신호전달 경로의 성분이다. 따라서, 본 개시내용의 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 LAG-3 신호전달의 억제제이다. 특정 구현예에서, LAG-3 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 LAG-3 억제제이다. 특정 구현예에서, LAG-3 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 LAG-3 리간드 억제제이다.
일 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 TIM-3 신호전달 경로의 성분이다. 따라서, 본 개시내용의 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 TIM-3 신호전달 경로의 억제제이다. 특정 구현예에서, TIM-3 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 TIM-3 억제제이다. 특정 구현예에서, TIM-3 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 TIM-3 리간드 억제제이다.
일 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 CD94/NKG2A 신호전달 경로의 성분이다. 따라서, 본 개시내용의 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 CD94/NKG2A 신호전달 경로의 억제제이다. 특정 구현예에서, CD94/NKG2A 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 CD94/NKG2A 억제제이다. 특정 구현예에서, CD94/NKG2A 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 CD94/NKG2A 리간드 억제제이다.
일 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 IDO 신호전달 경로의 성분이다. 따라서, 본 개시내용의 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 IDO 신호전달 경로의 억제제, 예를 들어 IDO 억제제이다.
일 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 아데노신 신호전달 경로의 성분이다. 따라서, 본 개시내용의 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 아데노신 신호전달 경로의 억제제이다. 특정 구현예에서, 아데노신 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 CD39 억제제이다. 특정 구현예에서, 아데노신 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 CD73 억제제이다. 특정 구현예에서, 아데노신 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 A2AR 억제제이다. 특정 구현예에서, 아데노신 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 A2BR 억제제이다.
일 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 VISTA 신호전달 경로의 성분이다. 따라서, 본 개시내용의 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 VISTA 신호전달 경로의 억제제이다. 특정 구현예에서, VISTA 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 VISTA 억제제이다.
일 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 하나 이상의 Siglec 신호전달 경로의 성분이다. 따라서, 본 개시내용의 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 하나 이상의 Siglec 신호전달 경로의 억제제이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 Siglec 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 Siglec 억제제이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 Siglec 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 Siglec 리간드 억제제이다.
일 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 CD20 신호전달 경로의 성분이다. 따라서, 본 개시내용의 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 CD20 신호전달 경로의 억제제이다. 특정 구현예에서, CD20 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 CD20 억제제이다.
특정 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 GARP 신호전달 경로의 성분이다. 따라서, 본 개시내용의 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 GARP 신호전달 경로의 억제제이다. 특정 구현예에서, GARP 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 GARP 억제제이다.
일 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 CD47 신호전달 경로의 성분이다. 따라서, 본 개시내용의 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 CD47 신호전달 경로의 억제제이다. 특정 구현예에서, CD47 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 CD47 억제제이다. 특정 구현예에서, CD47 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 SIRPα 억제제이다.
특정 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 PVRIG 신호전달 경로의 성분이다. 따라서, 본 개시내용의 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 PVRIG 신호전달 경로의 억제제이다. 특정 구현예에서, PVRIG 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 PVRIG 억제제이다. 특정 구현예에서, PVRIG 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 PVRIG 리간드 억제제이다.
특정 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 CSF1R 신호전달 경로의 성분이다. 따라서, 본 개시내용의 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 CSF1R 신호전달 경로의 억제제이다. 특정 구현예에서, CSF1R 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 CSF1R 억제제이다. 특정 구현예에서, CSF1R 신호전달 경로의 체크포인트 억제제는 CSF1 억제제이다.
특정 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 NOX 신호전달 경로의 성분이다. 따라서, 본 개시내용의 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 NOX 신호전달 경로의 억제제, 예를 들어 NOX 억제제이다.
특정 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 TDO 신호전달 경로의 성분이다. 따라서, 본 개시내용의 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 TDO 신호전달 경로의 억제제, 예를 들어 TDO 억제제이다.
예시적인 PD-1 억제제에는 BGB-A317(BeiGene; US 8,735,553, WO 2015/35606 및 US 2015/0079109 참조), 람브롤리주맙(예를 들어, WO2008/156712에 hPD109A 및 그의 인간화 유도체 h409A1, h409A16 및 h409A17로 개시됨), AB137132(Abcam), EH12.2H7 및 RMP1-14(#BE0146; Bioxcell Lifesciences Pvt. LTD.), MIH4(Affymetrix eBioscience), 니볼루맙(OPDIVO, BMS-936558; Bristol Myers Squibb; 미국 특허 번호 8,008,449; WO 2013/173223; WO 2006/121168 참조), 펨브롤리주맙(KEYTRUDA; MK-3475; Merck; WO 2008/156712 참조), 피딜리주맙(CT-011; CureTech; Hardy et al, 1994, Cancer Res., 54(22):5793-6 및 WO 2009/101611 참조), PDR001(Novartis; WO 2015/112900 참조), MEDI0680(AMP-514; AstraZeneca; WO 2012/145493 참조), TSR -042(WO 2014/179664 참조), 세미플리맙(REGN-2810; Regeneron; H4H7798N; US 2015/0203579 및 WO 2015/112800 참조), JS001(TAIZHOU JUNSHI PHARMA; Si-Yang Liu et al., 2007, J. Hematol. Oncol. 70:136 참조), AMP-224(GSK-2661380; Li et al., 2016, Int J Mol Sci 17(7):1151 및 WO 2010/027827 및 WO 2011/066342 참조), PF-06801591(Pfizer), 티슬레리주맙(BGB-A317; BeiGene; WO 2015/35606, 미국 특허 번호 9,834,606 및 US 2015/0079109 참조), BI 754091, SHR-1210(WO2015/085847 참조) 및 WO 2006/121168에 설명된 항체 17D8, 2D3, 4H1, 4A11, 7D3 및 5F4, INCSHR1210(Jiangsu Hengrui Medicine, SHR-1210이라고도 함, WO 2015/085847 참조), TSR-042(Tesaro Biopharmaceutical; ANB011로도 알려져 있음; W02014/179664 참조), GLS-010(Wuxi/Harbin Gloria Pharmaceuticals; WBP3055로도 알려짐; Si-Yang et al., 2017, J. Hematol. Oncol. 70: 136 참조), STI-1110(Sorrento Therapeutics; WO 2014/194302 참조), AGEN2034(Agenus; WO 2017/040790 참조), mgA012(Macrogenics; WO 2017/19846 참조), IBI308(Innovent; WO 2017/024465, WO 2017/025016, WO 2017/132825 및 WO 2017/133540 참조), 세트랠리맙 (JNJ-63723283; JNJ-3283; Calvo et al., J. Clin. Oncol. 36, no. 5_suppl (2018) 58 참조), 제놀림주맙(CBT-501; Patel et al., J. I mMunoer. Cancer, 2017, 5(Suppl 2):P242 참조), 사산리맙(PF-06801591; Youssef et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. Ann. Meeting 2017; Cancer Res 2017;77(13 Suppl):Abstract 참조), 토리팔리맙(JS-001; US 2016/0272708 참조), 캄렐리주맙(SHR-1210; INCSHR-1210; US 2016/376367; Huang et al., Clin. Cancer Res. 2018; 24(6):1296-1304 참조), 스파탈리주맙(PDR001; WO 2017/106656; Naing et al., J. Clin. Oncol. 34, no. 15_suppl (2016) 3060-3060 참조), BCD-100(JSC BIOCAD, Russia; WO 2018/103017 참조), 발스틸리맙(AGEN2034; WO 2017/040790 참조), 신틸리맙(IBI-308; WO 2017/024465 및 WO 2017/133540 참조), 에자벤리맙(BI-754091; US 2017/334995; Johnson et al., J Clin. Oncol. 36, no. 5_suppl (2018) 212-212 참조), 짐베렐리맙(GLS-010; WO 2017/025051 참조), LZM-009(US 2017/210806 참조), AK-103(WO 2017/ 071625, WO 2017/166804, 및 WO 2018/036472 참조), 레티판리맙( mgA-012; WO 2017/019846 참조), Sym-021(WO 2017/055547 참조), CS1003(CN107840887 참조), 본원에 개시된 항PD1-항체 IgG1-PD1(즉, SEQ ID NO: 43에 정의된 VH 서열, SEQ ID NO: 44에 정의된 VL 서열, SEQ ID NO: 61에 정의된 Fc 서열, 및 SEQ ID NO: 27에 정의된 카파 서열을 포함함), 예컨대 US 7,488,802, US 8,008,449, US 8,168,757, WO 03/042402, WO 2010/089411(항PD-L1 항체를 추가로 개시함), WO 2010/036959, WO 2011/159877(TIM-3에 대한 항체를 추가로 개시함), WO 2011/082400, WO 2011/161699, WO 2009/014708, WO 03/099196, WO 2009/114335, WO 2012/145493 (PD-L1에 대한 항체를 추가로 개시함), WO 2015/035606, WO 2014/055648 (further disclosing 항-KIR 항체를 추가로 개시함), US 2018/0185482 (항PD-L1 및 항-TIGIT 항체를 추가로 개시함), US 8,008,449, US 8,779,105, US 6,808,710, US 8,168,757, US 2016/0272708, 및 US 8,354,509에 설명된 바와 같은 항PD-1 항체, 예를 들어 Shaabani et al., 2018, Expert Op Ther Pat., 28(9):665-678 및 Sasikumar and Ramachandra, 2018, BioDrugs, 32(5):481-497에 개시된 PD-1 신호전달 경로에 대한 소분자 길항제, 예를 들어 WO 2019/000146 및 WO 2018/103501에 개시된 PD-1에 대한 siRNA, WO 2018/222711에 개시된 가용성 PD-1 단백질 및 예를 들어 WO 2018/022831에 개시된 바와 같은 PD-1의 가용성 형태를 포함하는 종양용해 바이러스가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
특정 구현예에서, PD-1 억제제는 니볼루맙(OPDIVO; BMS-936558), 펨브롤리주맙(KEYTRUDA; MK-3475), 피딜리주맙(CT-011), PDR001, MEDI0680(AMP-514), TSR-042, REGN2810, JS001, AMP-224(GSK-2661380), PF-06801591, BGB-A317, BI 754091 또는 SHR-1210이다. 일 구현예에서, PD-1 억제제는 본원에 개시된 바와 같은 IgG1-PD1이다.
특정 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 니볼루맙, Amp-514, 티슬레리주맙, 세미플리맙, TSR-042, JNJ-63723283, CBT-501, PF-06801591, JS-001, 캄렐리주맙, PDR001, BCD-100, AGEN2034, IBI-308, BI-754091, GLS-010, LZM-009, AK-103, mgA-012, Sym-021, CS1003 및 IgG1-PD1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 항PD-1 항체 또는 항원 결합 단편의 상보성 결정인자(CDR)과 같은, 전술한 항PD-1 항체 또는 항원 결합 단편 중 하나의 CDR을 포함하는 항PD-1 항체 또는 항원 결합 단편이다.
일부 구현예에서, 항PD-1 항체의 CDR은 Kabat 넘버링 체계를 사용하여 묘사된다(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of I mMunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NTH Publication No. 91-3242).
특정 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 예를 들어, 니볼루맙, Amp-514, 티슬레리주맙, 세미플리맙, TSR-042, JNJ-63723283, CBT-501, PF-06801591, JS-001, 캄렐리주맙, PDR001, BCD-100, AGEN2034, IBI-308, BI-754091, GLS-010, LZM-009, AK-103, mgA-012, Sym-021, CS1003 및 IgG1-PD1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 항PD-1 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과 같은, 전술한 항PD-1 항체 또는 항원 결합 단편 중 하나의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항PD-1 항체 또는 항원 결합 단편이다.
특정 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 니볼루맙, Amp-514, 티슬레리주맙, 세미플리맙, TSR-042, JNJ-63723283, CBT-501, PF-06801591, JS-001, 캄렐리주맙, PDR001, BCD-100, AGEN2034, IBI-308, BI-754091, GLS-010, LZM-009, AK-103, mgA-012, Sym-021, CS1003, IgG1-PD1으로 이루어진 군으로부터 선택된 항PD-1 항체 또는 항원 결합 단편이다.
본 개시내용의 항PD-1 항체는 좋기로는 모노클로날 항체, 다중특이 항체, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 및 상기 중 어느 하나의 PD-1 결합 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항PD-1 항체는 PD-1(예를 들어, 인간 PD-1)에 특이적으로 결합한다. 본 개시내용의 면역글로불린 분자는 임의의 이소형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 면역글로불린 분자의 서브클래스일 수 있다.
본 개시내용의 특정 구현예에서, 항PD-1 항체는 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 단편(예를 들어, 인간 항원-결합 단편)이고, 비제한적인 예로서 Fab, Fab' and F(ab')2, Fd, 단일 사슬 Fvs (scFv), 단일 사슬 항체, 이황화 결합 Fv (sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편을 포함한다. 단일 사슬 항체를 포함한 항원 결합 단편은 가변 영역(들)을 단독으로 포함하거나 힌지 영역, CH1, CH2, CH3 및 CL 도메인의 전체 또는 일부와 조합하여 포함할 수 있다. 또한 본 개시내용에는 가변 영역(들)과 힌지 영역, CH1, CH2, CH3 및 CL 도메인의 임의의 조합을 포함하는 항원 결합 단편이 포함된다. 일부 구현예에서, 항PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간, 쥐(예를 들어, 마우스 및 래트), 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말 또는 닭이다.
본원에 개시된 항PD-1 항체는 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적이거나 더 큰 다중특이성을 가질 수 있다. 다중특이 항체는 PD-1의 다양한 에피토프에 특이적일 수 있거나 PD-1과 이종 단백질 모두에 특이적일 수 있다. 예를 들어, PCT 공개 WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., 1991, J. I mMunol. 147:60 69; U.S. Pat. Nos. 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; Kostelny et al., 1992, J. I mMunol. 148:1547 1553 참조.
본원에 개시된 항PD-1 항체는 이들이 포함하는 특정 CDR의 관점에서 기재되거나 특정될 수 있다. 주어진 CDR 또는 FR의 정확한 아미노산 서열 경계는 예컨대 문헌 [Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of I mMunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" 넘버링 체계); Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 ("Chothia" 넘버링 체계); MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol. Biol. 262, 732-745." ("Contact" 넘버링 체계); Lefranc MP et al., "IMGT unique numbering for i mMunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev Comp I mMunol, 2003; 27(1):55-77 ("IMGT" 넘버링 체계); Honegger A and Plueckthun A, "Yet another 넘버링 체계 for i mMunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 2001;309(3):657-70, ("Aho" 넘버링 체계); and Martin et al., "Modeling antibody hypervariable loops: a combined algorithm," PNAS, 1989, 86(23):9268-9272, ("AbM" 넘버링 체계)]에 설명된 임의의 공지된 넘버링 체계를 이용하여 쉽게 결정될 수 있다. 주어진 CDR의 경계는 식별에 사용되는 체계에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 주어진 항체 또는 그의 영역(예를 들어, 그의 가변 영역)의 CDR 또는 개별적으로 특정된 CDR(예컨대 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)은 전술한 방식 중 임의의 방식에 의해 정의된 하나의(또는 특이적) CDR을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 특정 CDR(예컨대 CDR-H3)이 주어진 VH 또는 VL 영역 아미노산 서열에 상응하는 CDR의 아미노산 서열을 함유한다고 언급된 경우, 이러한 CDR은 전술한 임의의 방식에 의해 정의된 바와 같은 가변 영역 내의 상응하는 CDR(예를 들어, CDR-H3)의 서열을 갖는 것으로 이해된다. 특정 CDR 또는 CDR들의 식별을 위한 방식은 Kabat, Chothia, AbM 또는 IMGT 방법에 의해 정의된 CDR과 같이 지정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 CDR 서열 내 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[ Lefranc, M. P. et al., Dev. Comp. I mMunol., 2003, 27, 55-77]에 설명된 바와 같다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 항PD-1 항체는 항체 니볼루맙의 CDR을 포함한다(WO 2006/121168 참조). 일부 구현예에서, 항체 니볼루맙의 CDR은 Kabat 넘버링 체계를 사용하여 묘사된다(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of I mMunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NTH Publication No. 91-3242). 본 발명은 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항PD-1 항체 또는 그의 유도체를 포괄하며, 상기 가변 도메인은 (a) 3개의 CDR 세트(여기서 상기 CDR 세트는 모노클로날 항체 니볼루맙으로부터 유래됨), 및 (b) 4개의 프레임워크 영역 세트(여기서 상기 프레임워크 영역 세트는 모노클로날 항체 니볼루맙의 프레임워크 영역 세트와 다르고, 상기 항PD-1 항체 또는 그의 유도체는 PD-1에 결합함)를 포함한다. 특정 구현예에서, 항PD-1 항체는 니볼루맙이다.
본원에 개시된 항PD-1 항체는 또한 PD-1(예를 들어, 인간 PD-1)에 대한 결합 친화도의 관점에서 기재되거나 특정될 수 있다. 바람직한 결합 친화도는 5x10-2 M, 10-2 M, 5x10-3 M, 10-3 M, 5x10-4 M, 10-4 M, 5x10-5 M, 10-5 M, 5x10-6 M, 10-6 M, 5x10-7 M, 10-7 M, 5x10-8 M, 10-8M, 5x10-9 M, 10-9 M, 5x10-10 M, 10-10 M, 5x10-11 M, 10-11 M, 5x10-12 M, 10-12 M, 5x10-13 M, 10-13 M, 5x10-14 M, 10-14 M, 5x10-15 M, 또는 10-15 M 미만의 해리 상수 또는 Kd를 갖는 것들이 포함된다.
항PD-1 항체는 또한 변형된, 즉 공유 부착이 항체가 PD-1에 결합하는 것을 방해하지 않도록 항체에 대한 임의 유형의 분자의 공유 부착에 의해 변형된 유도체 및 구축물을 포함한다. 예를 들어, 항PD-1 항체 유도체에는 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, PEG화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질과의 연결 등애 의해 변형된 항체가 포함될 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 수많은 화학적 변형 중 임의의 것이 공지된 기술, 예컨대 비제한적인 예로서 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 대사 합성 등에 의해 수행가능하다. 추가적으로, 유도체 또는 구조물 하나 이상의 비고전적 아미노산을 함유할 수 있다.
예시적인 PD-1 리간드 억제제는 PD-L1 억제제 및 PD-L2 억제제이며, 비제한적인 예로서 MEDI4736(두라발루맙; AstraZeneca; WO 2011/066389 참조), MSB-0010718C(US 2014/0341917 참조), YW243.55.S70(WO 2010/077634 및 US 8,217,149의 SEQ ID NO: 20 참조), MIH1 (Affymetrix eBioscience; cf. EP 3 230 319), MDX-1105 (Roche/Genentech; WO2013019906 및 US 8,217,149 참조) STI-1014 (Sorrento; W02013/181634 참조), CK-301 (Checkpoint Therapeutics), KN035 (3D Med/Alphamab; Zhang et al., 2017, Cell Discov. 3:17004 참조), 아테졸리주맙 (TECENTRIQ; RG7446; MPDL3280A; R05541267; US 9,724,413 참조), BMS-936559 (Bristol Myers Squibb; US 7,943,743, WO 2013/173223 참조), 아벨루맙(바벤치오; cf. US 2014/0341917), LY3300054 (Eli Lilly Co.), CX-072 (Proclaim-CX-072; CytomX라고도 칭함; WO2016/149201 참조), FAZ053, KN035 (WO2017020801 및 WO2017020802 참조), MDX-1105 ( US 2015/0320859 참조)와 같은 항PD-L1 항체, US 7,943,743, including 3G10, 12A4 (BMS-936559라고도 칭함), 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7, 및 13G4를 비롯한, US 7,943,743에 개시된 항PD-L1 항체, WO 2010/077634, US 8,217,149, WO 2010/036959, WO 2010/077634, WO 2011/066342, US 8,217,149, US 7,943,743, WO 2010/089411, US 7,635,757, US 8,217,149, US 2009/0317368, WO 2011/066389, WO2017/034916, WO2017/020291, WO2017/020858, WO2017/020801, WO2016/111645, WO2016/197367, WO2016/061142, WO2016/149201, WO2016/000619, WO2016/160792, WO2016/022630, WO2016/007235, WO2015/ 179654, WO2015/173267, WO2015/181342, WO2015/109124, WO 2018/222711, WO2015/112805, WO2015/061668, WO2014/159562, WO2014/165082, WO2014/100079에 설명된 항PD-L1 항체를 들 수 있다.
특정 구현예에서, PD-L1 억제제는 아테졸리주맙(TECENTRIQ; RG7446; MPDL3280A; R05541267; US 9,724,413 참조)이다.
특정 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 상기 기재된 항PD-L1 항체 또는 항원-결합 단편 중 하나의 상보성 결정 영역(CDR), 예를 들어 아테졸리주맙 또는 그의 항원 결합 단편의 CDR을 포함하는 항PD-L1 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
일부 구현예에서, 항PD-L1 항체의 CDR은 Kabat 넘버링 체계를 사용하여 묘사된다(Kabat, EA, et al. (1991) Sequences of Proteins of I mMunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NTH 공개 번호 91-3242).
특정 구현예에서, 억제성 면역조절인자는 상기 기재된 항PD-L1 항체 또는 항원-결합 단편 중 하나의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항PD-L1 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 예를 들어 아테졸리주맙의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 또는 그의 항원 결합 단편이다.
본 개시내용의 항PD-L1 항체는 좋기로는 모노클로날 항체, 다중특이 항체, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 및 상기 중 어느 하나의 PD-L1 결합 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항PD-L1 항체는 PD-L1(예를 들어, 인간 PD-L1)에 특이적으로 결합한다. 본 개시내용의 면역글로불린 분자는 임의의 이소형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 면역글로불린 분자의 서브클래스일 수 있다.
본 개시내용의 특정 구현예에서, 항PD-L1 항체는 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 단편(예를 들어, 인간 항원-결합 단편)이고, 비제한적인 예로서 Fab, Fab' and F(ab')2, Fd, 단일 사슬 Fvs (scFv), 단일 사슬 항체, 이황화 결합 Fv (sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편을 포함한다. 단일 사슬 항체를 포함한 항원 결합 단편은 가변 영역(들)을 단독으로 포함하거나 힌지 영역, CH1, CH2, CH3 및 CL 도메인의 전체 또는 일부와 조합하여 포함할 수 있다. 또한 본 개시내용에는 가변 영역(들)과 힌지 영역, CH1, CH2, CH3 및 CL 도메인의 임의의 조합을 포함하는 항원 결합 단편이 포함된다. 일부 구현예에서, 항PD-L1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간, 쥐(예를 들어, 마우스 및 래트), 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말 또는 닭이다.
본원에 개시된 항PD-L1 항체는 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적이거나 더 큰 다중특이성을 가질 수 있다. 다중특이 항체는 PD-L1의 다양한 에피토프에 특이적일 수 있거나 PD-L1과 이종 단백질 모두에 특이적일 수 있다. 예를 들어, PCT 공개 WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., 1991, J. I mMunol. 147:60 69; U.S. Pat. Nos. 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; Kostelny et al., 1992, J. I mMunol. 148:1547 1553 참조.
본원에 개시된 항PD-L1 항체는 이들이 포함하는 특정 CDR의 관점에서 기재되거나 특정될 수 있다. 주어진 CDR 또는 FR의 정확한 아미노산 서열 경계는 예컨대 문헌 [Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of I mMunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" 넘버링 체계); Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 ("Chothia" 넘버링 체계); MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol. Biol. 262, 732-745." ("Contact" 넘버링 체계); Lefranc MP et al., "IMGT unique numbering for i mMunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev Comp I mMunol, 2003; 27(1):55-77 ("IMGT" 넘버링 체계); Honegger A and Plueckthun A, "Yet another 넘버링 체계 for i mMunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 2001;309(3):657-70, ("Aho" 넘버링 체계); and Martin et al., "Modeling antibody hypervariable loops: a combined algorithm," PNAS, 1989, 86(23):9268-9272, ("AbM" 넘버링 체계)]에 설명된 임의의 공지된 넘버링 체계를 이용하여 쉽게 결정될 수 있다. 주어진 CDR의 경계는 식별에 사용되는 체계에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 주어진 항체 또는 그의 영역(예를 들어, 그의 가변 영역)의 CDR 또는 개별적으로 특정된 CDR(예컨대 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)은 전술한 방식 중 임의의 방식에 의해 정의된 하나의(또는 특이적) CDR을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 특정 CDR(예컨대 CDR-H3)이 주어진 VH 또는 VL 영역 아미노산 서열에 상응하는 CDR의 아미노산 서열을 함유한다고 언급된 경우, 이러한 CDR은 전술한 임의의 방식에 의해 정의된 바와 같은 가변 영역 내의 상응하는 CDR(예를 들어, CDR-H3)의 서열을 갖는 것으로 이해된다. 특정 CDR 또는 CDR들의 식별을 위한 방식은 Kabat, Chothia, AbM 또는 IMGT 방법에 의해 정의된 CDR과 같이 지정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항PD-L1 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 CDR 서열 내 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[ Lefranc, M. P. et al., Dev. Comp. I mMunol., 2003, 27, 55-77]에 설명된 바와 같다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 항PD-L1 항체는 항체 아테졸리주맙의 CDR을 포함한다(US 9,724,413 참조). 일부 구현예에서, 항체 아테졸리주맙의 CDR은 Kabat 넘버링 체계를 사용하여 묘사된다(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of I mMunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NTH Publication No. 91-3242). 본 발명은 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항PD-L1 항체 또는 그의 유도체를 포괄하며, 상기 가변 도메인은 (a) 3개의 CDR 세트(여기서 상기 CDR 세트는 모노클로날 항체 아테졸리주맙으로부터 유래됨), 및 (b) 4개의 프레임워크 영역 세트(여기서 상기 프레임워크 영역 세트는 모노클로날 항체 아테졸리주맙의 프레임워크 영역 세트와 다르고, 상기 항PD-L1 항체 또는 그의 유도체는 PD-L1에 결합함)를 포함한다. 특정 구현예에서, 항PD-L1 항체는 아테졸리주맙이다.
본원에 개시된 항PD-L1 항체는 또한 PD-L1(예를 들어, 인간 PD-L1)에 대한 결합 친화도의 관점에서 기재되거나 특정될 수 있다. 바람직한 결합 친화도는 5x10-2 M, 10-2 M, 5x10-3 M, 10-3 M, 5x10-4 M, 10-4 M, 5x10-5 M, 10-5 M, 5x10-6 M, 10-6 M, 5x10-7 M, 10-7 M, 5x10-8 M, 10-8M, 5x10-9 M, 10-9 M, 5x10-10 M, 10-10 M, 5x10-11 M, 10-11 M, 5x10-12 M, 10-12 M, 5x10-13 M, 10-13 M, 5x10-14 M, 10-14 M, 5x10-15 M, 또는 10-15 M 미만의 해리 상수 또는 Kd를 갖는 것들이 포함된다.
항PD-L1 항체는 또한 변형된, 즉 공유 부착이 항체가 PD-L1에 결합하는 것을 방해하지 않도록 항체에 대한 임의 유형의 분자의 공유 부착에 의해 변형된 유도체 및 구축물을 포함한다. 예를 들어, 항PD-L1 항체 유도체에는 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, PEG화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질과의 연결 등애 의해 변형된 항체가 포함될 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 수많은 화학적 변형 중 임의의 것이 공지된 기술, 예컨대 비제한적인 예로서 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 대사 합성 등에 의해 수행가능하다. 추가적으로, 유도체 또는 구조물 하나 이상의 비고전적 아미노산을 함유할 수 있다.
예시적인 CTLA-4 억제제에는 모노클로날 항체 이필리무맙(Yervoy; Bristol Myers Squibb) 및 트레멜리무맙(Pfizer/ Medl mMune), 트레빌리주맙, AGEN-1884(Agenus) 및 ATOR-1015, WO 2001/014424, US 2005/0201994, EP 1212422, US 5,811,097, US 5,855,887, US 6,051,227, US 6,682,736, US 6,984,720, WO 01/14424, WO 00/37504, US 2002/0039581, US 2002/086014, WO 98/42752, US 6,207,156, US 5,977,318, US 7,109,003, 및 US 7,132,281에 개시된 항-CTLA4 항체, CTLA-4 ECD에 융합된 IgG 1의 Fe 영역을 포함하는 우성 음성 단백질 아바타셉트(Orencia; EP 2 855 533 참조) 및 벨라타셉트(Nulojix WO 2014/207748 참조), 아바타셉트에 비해 CTLA-4 ECD에서 2개의 아미노산 치환을 갖는 2세대 고친화도 CTLA-4-Ig 변이체, 가용성 CTLA-4 폴리펩타이드, 예를 들어 RG2077 및 CTLA4-IgG4m(US 6,750,334 참조), 항-CTLA-4 앱타머 및 CTLA-4에 대한 siRNA(예를 들어 US 2015/203848에 개시됨)가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 예시적인 CTLA-4 리간드 억제제는 문헌 [Pile et al., 2015 (Encyclopedia of Infla mMatory Diseases, M. Parnham (ed.), doi: 10.1007/978-3-0348-0620-6_20)]에 기재되어 있다.
TIGIT 신호전달 경로의 예시적인 체크포인트 억제제의 비제한적인 예로는 항-TIGIT 항체, 예컨대 BMS-986207, COM902(CGEN-15137; Compugen), AB154(Arcus Biosciences) 또는 에티길리맙(OMP-313M32; OncoMed Pharmaceuticals), 또는 WO2017/059095에 개시된 항체, 특히 "MAB10", US 2018/0185482, WO 2015/009856, 및 US 2019/0077864에 개시된 항체를 들 수 있다.
B7-H3의 예시적인 체크포인트 억제제에는 Fc 최적화된 모노클로날 항체 에노블리투주맙( mgA271; Macrogenics; US 2012/0294796 참조) 및 항-B7-H3 항체 mgD009(Macrogens) 및 피딜리주맙(US 7,332,582 참조)이 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
예시적인 B7-H4 억제제에는 Dangaj et al., 2013(Cancer Research 73:4820-9) 및 Smith et al., 2014(Gynecol Oncol, 134:181-189), WO 2013/025779(예를 들어, SEQ ID NO: 3 및 4에 의해 인코딩된 2D1, SEQ ID NO: 37 및 39에 의해 인코딩된 2H9, 및 SEQ ID NO: 41 및 43에 의해 인코딩된 2E11) 및 WO 2013/067492(예를 들어, 항체 SEQ ID NO: 1-8로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 항체), 예를 들어 Kryczek et al., 2006(J Exp Med, 203:871-81)에 의해 기술된 바와 같은 모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 예컨대 US 2012/0177645에 개시된 것과 같은 B7-H4의 가용성 재조합 형태가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 BTLA 억제제에는 Crawford and Wherry, 2009 (J Leukocyte Biol 86:5-8), WO 2011/014438에 기술된 항-BTLA 항체(예를 들어, 4C7 또는 SEQ ID NO: 8 및 15 및/또는 SEQ ID NO: 11 및 18에 따른 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체), WO 2014/183885(예를 들어, CNCM I-4752 번호로 기탁된 항체) 및 US 2018/155428에 설명된 항BTLA 항체가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
KIR 신호전달의 예시적인 억제제에는 모노클로날 항체 리릴루맙(1-7F9; IPH2102; US 8,709,411 참조), IPH4102(Innate Pharma; Marie-Cardine et al., 2014, Cancer 74(21): 6060-70 참조), 예를 들어 US 2018/208652, US 2018/117147, US 2015/344576, WO 2005/003168, WO 2005/009465, WO 2006/072625, WO 2006/072626, WO 2007/042573, WO 2008/084106(예를 들어, SEQ ID NO: 2 및 3에 따른 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체), WO 2010/065939, WO 2012/071411, WO 2012/160448 및 WO 2014/055648에 설명된 바와 같은 항-KIR 항체가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 LAG-3 억제제에는 항-LAG-3 항체 BMS-986016 (Bristol­Myers Squibb; see WO 2014/008218 및 WO 2015/116539), 25F7 (US2011/0150892 참조), IMP731 (WO 2008/132601 참조), H5L7BW (cf. WO2014140180), MK-4280 (28G-10; Merck; see WO 2016/028672), REGN3767 (Regneron/Sanofi), BAP050 (WO 2017/019894 참조), IMP-701 (LAG-525; Novartis) Sym022 (Symphogen), TSR-033 (Tesaro), mgD013 (MacroGenics사가 개발한, LAG-3 및 PD-1을 표적으로 하는 이중특이 DART 항체), BI754111 (Boehringer Ingelheim), FS118 (F-star사가 개발한, LAG-3 및 PD-1을 표적으로 하는 이중특이 DART 항체), GSK2831781 (GSK) 및 WO 2009/044273, WO 2008/132601, WO 2015/042246, EP 2 320 940, US 2019/169294, US 2019/169292, WO 2016/028672, WO 2016/126858, WO 2016/200782, WO 2015/200119, WO 2017/220569, WO 2017/087589, WO 2017/219995, WO 2017/019846, WO 2017/106129, WO 2017/062888, WO 2018/071500, WO 2017/087901, US 2017/0260271, WO 2017/198741, WO2017/220555, WO2017/015560, WO2017/025498, WO2017/149143, WO 2018/069500, WO2018/083087, WO2018/034227 WO2014/140180에 개시된 항체, LAG-3 길항제 단백질 AVA-017 (Avacta), 가용성 LAG-3 융합 단백질 IMP321 (에프틸라기모드 알파; 임뮤텝; EP 2 205 257 및 Brignone et al., 2007, J. I mMunol., 179: 4202-4211 참조), 및 WO 2018/222711에 개시된 가용성 LAG-3 단백질이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 TIM-3 억제제에는 TIM-3을 표적으로 하는 항체, 예컨대 F38-2E2(BioLegend), 코볼리맙(TSR-022; Tesaro), LY3321367(Eli Lilly), MBG453(Novartis) 및 예를 들어 문헌에 개시된 항체가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다., WO 2013/006490, WO 2018/085469(예를 들어, SEQ ID NO: 3 및 4에 따른 핵산 서열에 의해 코딩된 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 항체), WO 2018/106588, WO 2018/106529(예를 들어, SEQ ID NO: 8-11에 따른 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 항체)가 포함되나 이에 국한되지 않는다.
예시적인 TIM-3 리간드 억제제에는 CEACAM1 억제제, 예컨대 항-CEACAM1 항체 CM10(cCAM Biotherapeutics; WO 2013/054331 참조), WO 2015/075725에 개시된 항체(예를 들어, CM-24, 26H7, 5F4, TEC-11, 12-140-4, 4/3/17, COL-4, F36-54, 34B1, YG-C28F2, D14HD11, M8.7.7, D11-AD11, HEA81, B l. l, CLB-gran-10, F34-187, T84.1, B6.2, B 1.13, YG-C94G7, 12-140-5, scFv DIATHIS1, TET-2; cCAM Biotherapeutics), Watt et al., 2001(Blood98: 1469-1479) 및 WO 2010/12557에 기술된 항체, 및 바비툭시맙(Peregrine)과 같은 PtdSer 억제제가 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 CD94/NKG2A 억제제에는 모날리주맙(IPH2201; Innate Pharma) 및 US 9,422,368(예를 들어, 인간화 Z199; EP 2 628 753 참조), EP 3 193 929 및 WO2016/ 032334(예를 들어, 인간화 Z270; EP 2 628 753 참조)이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 IDO 억제제에는 엑시구아민 A, 에파카도스타트(INCB024360; InCyte; US 9,624,185 참조), 인독시모드 (Newlink Genetics; CAS#: 110117-83-4), NLG919(Newlink Genetics/Genentech; CAS#: 1402836-58-1), GDC-0919 (Newlink Genetics/Genentech; CAS#: 1402836-58-1), F001287 (Flexus Biosciences/BMS; CAS#: 2221034-29-1), KHK2455 (Cheong et al., 2018, Expert 오핀 거기 Pat. 28(4):317-330), PF-06840003(WO 2016/181348 참조), 나복시모드(RG6078, GDC-0919, NLG919; CAS#: 1402837-78-8), 린로도스타트(BMS-986205; Bristol-Myers) Suibb; CAS#: 1923833-60-6), 소분자, 에컨대 1-메틸-트립토판, 피롤리딘-2,5-디온 유도체(WO 2015/173764 참조) 및 Sheridan, 2015, Nat Biotechnol 33:321-322에 의해 개시된 IDO 억제제와 같은 소분자가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 CD39 억제제에는 A001485(Arcus Biosciences), PSB 069(CAS#: 78510-31-3) 및 항-CD39 모노클로날 항체 IPH5201(Innate Pharma; Perrot et al., 2019, Cell Reports 8: 2411-2425.E9 참조)이 포함되나 이에 국한되지 않는다
예시적인 CD73 억제제에는 CPI-006(Corvus Pharmaceuticals), MEDI9447(MedI mMune; WO2016075099 참조), IPH5301(Innate Pharma; Perrot et al., 2019, Cell Reports 8:2411-2425.E9 참조)과 같은 항-CD73 항체, WO2018/110555에 기술된 항-CD73 항체, 소분자 억제제 PBS 12379(Tocris Bioscience; CAS#: 1802226-78-3), A000830, A001190 및 A001421(Arcus Biosciences; Becker et al., 2018, Cancer Research 78(13 Supplement):3691-3691, doi: 10.1158/1538-7445.AM2018-3691), CB-708(Calithera Biosciences) 및 Allard et al. 2018 (I mMunol Rev., 276(1):121-144)에 의해 기술된 퓨린 세포독성 뉴클레오사이드 유사체 기반 디포스포네이트가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 A2AR 억제제에는 이스트라데필린 (KW-6002; CAS#: 155270-99-8), PBF-509(Palobiopharma), 시포라데난트 (CPI-444: Corvus Pharma/Genentech; CAS#: 1202402-40-1), ST1535([2부틸-9-메틸-8-(2H-1,2,3-트리아졸 2-일)-9H-퓨린-6-자일라민]; CAS#: 496955-42-1), ST4206(Stasi et al., 2015, Europ J Pharm 761:353-361; CAS#: 1246018-36-9 참조), 토자데난트 (SYN115; CAS#: 870070-55-6), V81444(WO 2002 참조) /055082), 프렐라데난트(SCH420814; Merck; CAS#: 377727-87-2), 비파데난트(BIIB014; CAS#: 442908-10-3), ST1535(CAS#: 496955-42-1), SCH412348(CAS# : 377727-26-9), SCH442416 (Axon 2283; Axon Medchem; CAS#: 316173-57-6), ZM241385 (4-(2-(7-아미노-2-(2-푸릴)-(1,2),4)트리아졸로(2,3-a)-(1,3,5)트리아진-5-일-아미노)에틸)페놀; Cas#: 139180-30-6), AZD4635 (AstraZeneca), AB928(이중 A2AR/A2BR 소분자 억제제; Arcus Biosciences) 및 SCH58261(Popoli et al., 2000, Neuropsychopharm 22:522-529; CAS#: 160098-96-4 참조)가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 A2BR 억제제에는 AB928(이중 A2AR/A2BR 소분자 억제제, Arcus Biosciences), MRS 1706(CAS#: 264622-53-9), GS6201(CAS#: 752222-83-6) 및 PBS 1115(CAS 번호: 152529-79-8)가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. .
예시적인 VISTA 억제제에는 JNJ-61610588(온바틸리맙; Janssen Biotech)과 같은 항-VISTA 항체 및 소분자 억제제 CA-170(항PD-L1/L2 및 항-VISTA 소분자; CAS#: 1673534-76-3)이 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
예시적인 Siglec 억제제에는 US 2019/023786 및 WO 2018/027203에 개시된 항-Sigle-7 항체(예를 들어, SEQ ID NO: 1에 따른 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 15에 따른 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체), 항-Siglec-2 항체 이노투주맙 오조가미신 (Besponsa; US 8,153,768 및 US 9,642,918 참조), 항-Siglec-3 항체 젬투주맙 오조가미신 (Mylotarg; US 9,359,442 참조) 또는 US 2019/062427, US 2019/023786, WO 2019/011855, WO 2019/011852(예를 들어, SEQ ID NO: 171-176, 또는 3 및 4, 또는 5 및 6, 또는 7 및 8, 또는 9 및 10, 또는 11 및 12, 또는 13 및 14, 또는 15 및 16, 또는 17 및 18, 또는 19 및 20, 또는 21 및 22, 또는 23 및 24, 또는 25 및 26에 따른 CDR을 포함하는 항체), US 2017/306014 및 EP 3 146 979에 설명된 항-Siglec-9가 포함되나 이에 국한되지 않는다.
예시적인 CD20 억제제에는 항-CD20 항체, 예컨대 리툭시맙(RITUXAN; IDEC-102; IDEC-C2B8; US 5,843,439 참조), ABP 798(리툭시맙 바이오시밀러), 오파투무맙(2F2; WO2004/035607 참조), 오비누투주맙, 오크렐리주맙(2h7; WO 2004/056312 참조), 이브리투모맙 티욱세탄(Zevalin), 토시투모맙, 유블리툭시맙(LFB-R603; LFB Biotechnologies) 및 US 2018/0036306에 개시된 항체(예를 들어, SEQ ID NO: 1-3 및 4-6, 또는 7 및 8, 또는 9 및 10에 따른 경쇄 및 중쇄를 포함하는 항체)가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 GARP 억제제에는 ARGX-115(arGEN-X) 및 US 2019/127483, US 2019/016811, US 2018/327511, US 2016/251438, EP 3 253 796에 개시된 항체 및 그의 생산 방법이 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
예시적인 CD47 억제제에는 항-CD47 항체, 예를 들어 HuF9-G4(Stanford University/Forty Seven), CC-90002/INBRX-103(Celgene/ Inhibrx), SRF231(Surface Oncology), IBI188(Innovent Biologics), AO-176(Arch Oncology), TG-1801(NI-1701; CD47 및 CD19를 표적으로 하는 이중특이 모노클로날 항체; Novi mMune /TG Therapeutics) 및 NI-1801(CD47 및 메조텔린을 표적으로 하는 이중특이 모노클로날 항체; Novi mMune), 및 ALX148과 같은 CD47 융합 단백질(ALX Oncology; Kauder et al., 2019, PLoS One, doi :10.1371/journal.pone.0201832 참조)이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 SIRPα 억제제에는 OSE-172(Boehringer Ingelheim/OSE), FSI-189(Forty Seven)와 같은 항-SIRPα 항체, TTI-621 및 TTI-662(Trillium Therapeutics; WO 2014/094122 참조)와 같은 항-SIRPα 융합 단백질이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 PVRIG 억제제에는 항-PVRIG 항체, 에컨대 COM701(CGEN-15029), 예를 들어 WO 2018/033798(예를 들어, CHA.7.518.1H4(S241P), CHA.7.538.1.2.H4(S241P), CPA.9.086H4(S241P), CPA.9.083H4(S241P), CHA.9.547.7.H4(S241P), CHA.9.547.13.H4(S241P) 및 WO 2018/033798의 SEQ ID NO: 5에 따른 가변 중쇄 도메인 및 SEQ ID NO: 10에 따른 가변 경쇄 도메인을 포함하는 항체, 또는 WO 2018/033798의 SEQ ID NO: 9에 따른 중쇄 및 SEQ ID NO: 14에 따른 경쇄를 포함하는 항체: WO 2018/033798은 항-TIGIT 항체 및 항-TIGIT와 항-PVRIG 항체와의 병용 요법을 추가로 개시하고 있음), WO2016134333, WO2018017864(예를 들어, SEQ ID NO: 11에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 SEQ ID NO: 5-7에 따른 중쇄 및/또는 SEQ ID NO: 12에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 SEQ ID NO: 8-10에 따른 경쇄를 포함하는 항체, 또는 SEQ ID NO: 13및/또는 14 또는 SEQ ID NO: 24 및/또는 29에 의해 인코딩된 항체, 또는 WO 2018/017864에 개시된 또 다른 항체) 및 WO 2016/134335에 개시된 항-PVRIG 항체 및 융합 펩타이드가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 CSF1R 억제제에는 항-CSF1R 항체 카비랄리주맙 (FPA008; FivePrime; WO 2011/140249, WO 2013/169264 및 WO 2014/036357 참조), IMC-CS4(EiiLilly), 에막투주맙(R05509554; Roche), RG7155(WO 2011/70024, WO 2011/107553, WO 2011/131407, WO 2013/87699, WO 2013/119716, WO 2013/132044) 및 소분자 억제제 BLZ945(CAS#: 953769-46-5) 및 펙시다르티닙 (PLX3397, Selleckchem, CAS#: 1029044-16-3)이 포함되나 이에 국한되지 않는다.
예시적인 CSF1 억제제에는 EP 1 223 980 및 Weir et al., 1996 (J Bone Mineral Res 11: 1474-1481), WO 2014/132072에 개시된 항-CSF1 항체, 및 WO 2001/030381에 개시된 바와 같은 안티센스 DNA 및 RNA가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 NOX 억제제에는 소분자 ML171(Gianni et al., 2010, ACS Chem Biol 5(10):981-93, NOS31 (Yamamoto et al., 2018, Biol Pharm Bull. 41(3):419-426)과 같은 NOX1 억제제, 소분자 세플렌 (히스타민 디히드로클로라이드; CAS#: 56-92-8), BJ-1301(Gautam et al., 2017, Mol Cancer Ther 16(10): 2144-2156; CAS#: 1287234-48-3) 및 Lu et al., 2017, Biochem Pharmacol 143:25-38에 의해 기술된 억제제와 같은 NOX2 억제제: 소분자 억제제 VAS2870(Altenhoefer et al., 2012, Cell Mol Life Sciences 69(14):2327-2343), 디페닐렌 요오도늄(CAS#: 244-54-2) 및 GKT137831(CAS#: 1218942-37-0; Tang et al., 2018, 19(10):578-585 참조)과 같은 NOX4 억제제가 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 TDO 억제제에는 4-(인돌-3-일)-피라졸 유도체(US 9,126,984 및 US 2016/0263087 참조), 3-인돌 치환된 유도체(WO 2015/140717, WO 2017/025868, WO 2016/147144), 3-(인돌-3-일)-피리딘 유도체(US 2015/0225367 및 WO 2015/121812 참조), 이중 IDO/TDO 길항제, 예를 들어 WO 2015/150097에 개시된 소분자 이중 IDO/TDO 억제제, WO 2015/082499, WO 2016/026772, WO 2016/071283, WO 2016/071293, WO 2017/007700, 및 소분자 억제제 CB548 (Kim, C, et al., 2018, Annals Oncol 29 (suppl_8): viii400-viii441)이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
본 개시내용에 따르면, 면역 체크포인트 억제제는 억제 체크포인트 단백질의 억제제이지만 좋기로는 자극 체크포인트 단백질의 억제제는 아니다.
바람직한 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 본원에 기재된 억제성 면역 체크포인트 신호전달 경로 중 하나, 특히, PD-1 경로(PD-1과 하나 이상의 리간드(예컨대 PD-L1 및/또는 PD-L2)의 상호작용), CTLA-4 경로(CTLA-4와 하나 이상의 그의 리간드 예컨대 CD80 또는 CD86)의 상호작용), TIM-3 경로(TIM-3과 하나 이상의 그의 리간드(예컨대 Galectin-9, PtdSer, H mgB1 및 CEACAM1)의 상호작용), KIR 경로(예컨대 KIR과 하나 이상의 리간드의 상호작용), LAG-3 경로(LAG-3과 하나 이상의 그의 리간드의 상호작용), TIGIT 경로(TIGIT와 하나 이상의 그의 리간드(예컨대 PVR, PVRL2 및 PVRL3)의 상호작용), VISTA 경로(VISTA와 하나 이상의 그의 리간드의 상호작용) 및 GARP 경로(GARP와 하나 이상의 그의 리간드의 상호작용)으로 이루어진 군으로부터 선택된 억제성 면역 체크포인트 신호전달 경로 중 하나를 방해하거나 억제하는 항체, 특히 길항성 또는 차단 항체이다. 바람직한 일 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1 경로(PD-1과 그의 하나 이상의 리간드(예컨대 PD-L1 및/또는 PD-L2)의 상호작용), CTLA-4 경로(CTLA-4와 그의 하나 이상의 리간드(예컨대 CD80 또는 CD86)의 상호작용)로 이루어진 군으로부터 선택된 억제성 면역 체크포인트 신호전달 경로 중 하나를 방해하거나 억제하는 항체, 특히 길항성 또는 차단 항체이다. 바람직한 일 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1 경로(PD-1과 그의 하나 이상의 리간드(예컨대 PD-L1 및/또는 PD-L2)의 상호작용)를 방해 또는 억제하는 항체, 특히 길항성 또는차단 항체이다. 바람직한 일 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 방해하거나 억제하는 항체, 특히 길항제 또는 차단 항체이다.
체크포인트 억제제는 면역 체크포인트 억제제, 예를 들어 억제 핵산 분자 또는 항체 또는 그의 단편을 인코딩하는 DNA 또는 RNA 분자와 같은 핵산의 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 항체는 본원에 기술된 바와 같이 발현 벡터에 인코딩되어 전달될 수 있다. 핵산 분자는 그 자체로, 예를 들어 플라스미드 또는 mRNA 분자의 형태로 전달될 수 있거나 전달 비히클, 예를 들어 리포좀, 리포플렉스 또는 핵산 지질 입자와 복합체화될 수 있다. 체크포인트 억제제는 또한 그 체크포인트 억제제를 인코딩하는 발현 카세트를 포함하는 종양용해 바이러스를 통해 투여될 수도 있다. 체크포인트 억제제는 또한 체크포인트 억제제를 발현할 수 있는 내인성 또는 동종 세포의 투여에 의해, 예를 들어 세포 기반 치료법의 형태로 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 세포 기반 치료법은 유전적으로 조작된 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 본원에 기술된 바와 같은 면역 체크포인트 억제제를 발현한다. 일 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 siRNA, shRNA, 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 DNA 또는 RNA, 앱타머, 항체 또는 그의 단편 또는 가용성 면역 체크포인트 단백질 또는 융합체와 같은 억제 핵산 분자인 면역 체크포인트 억제제를 발현한다. 유전자 조작된 세포는 또한 T 세포 기능을 향상시키는 추가 제제를 발현할 수도 있다. 이러한 제제는 해당 분야에 알려져 있다. 면역 체크포인트 신호전달의 억제에 사용하기 위한 세포 기반 치료법은 예를 들어 WO 2018/222711에 개시되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
좋기로는, 체크포인트 억제제는 적합한 양으로 투여되는데, 즉 예를 들어 각 용량 및/또는 치료 사이클에서 투여되는 체크포인트 억제제의 양이 하나 이상의 체크포인트 단백질을 전체적으로 또는 부분적으로 감소, 억제, 방해하거나 음성적으로 조절할 수 있도록 하는 양, 또는 하나 이상의 체크포인트 단백질의 발현을 전체적으로 또는 부분적으로 감소, 억제, 방해하거나 음성적으로 조절할 수 있게 하는 양으로 투여된다. 따라서, 본 개시내용에 따른 적합한 양의 체크포인트 억제제는 하나 이상의 체크포인트 단백질을 전체적으로 또는 부분적으로 감소, 억제, 간섭 또는 음성적으로 조절할 수 있거나 또는 하나 이상의 체크포인트 단백질의 발현을 전체적으로 또는 부분적으로 감소, 억제, 간섭 또는 음성적으로 조절할 수 있다. 따라서 체크포인트 억제제는 좋기로는 면역 체크포인트와 관련된 억제 신호를 방지하여 면역 억제를 예방하거나 역전시키고 암세포에 대한 T 세포 면역의 확립 또는 강화를 초래한다.
각 용량 및/또는 치료 사이클에서 투여되는 체크포인트 억제제의 양은 특히 상기 체크포인트 단백질의 5% 초과, 좋기로는 10% 초과, 더욱 좋기로는 15% 초과, 훨씬 더 좋기로는 20% 초과, 심지어는 5% 초과, 좋기로는 10% 초과, 더욱 좋기로는 20% 초과, 더더욱 좋기로는 25% 초과, 더욱 좋기로는 30% 초과, 더욱 더 좋기로는 35% 초과, 더욱 더 좋기로는 40% 초과, 더욱 더 좋기로는 45% 초과, 가장 좋기로는 50% 초과가 상기 체크포인트 억제제가 결합하는 범위일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 예를 들어 각 용량 및/또는 각 치료 사이클에서 투여되는 체크포인트 억제제의 양은 다음과 같다.
a) 총 약 100 - 200 mg; 및/또는
b) 총 약 0.20 x 10-9 - 1350 x 10-9 mol.
체크포인트 억제제는 당업계에 공지된 임의의 방식 및 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식과 경로는 사용되는 체크포인트 억제제의 유형에 따라 달라진다. 바람직한 구현예에서, 체크포인트 억제제는 비경구, 특히 정맥내와 같이 전신 투여된다.
체크포인트 억제제는 본원에 기술된 임의의 적합한 약학 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 체크포인트 억제제는 주입 형태로 투여된다.
추가 치료제
결합제 및 체크포인트 억제제 외에, 본 개시내용의 첫 번째 측면에 따른 치료 요법은 대상체에게 하나 이상의 추가 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 하나 이상의 추가 치료제는 하나 이상의 화학요법제, 특히 본원에 기재된 바와 같은 종양 또는 암의 치료에 일반적으로 사용되는 화학요법제를 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 화학요법제는 백금 기반 화합물(예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴), 탁산 기반 화합물(예컨대 파클리탁셀 및 nab-파클리탁셀), 뉴클레오사이드 유사체(예컨대 5-플루오로우라실 및 젬시타빈) 및 이들의 조합(예를 들어, 시스플라틴/카보플라틴 + 5-플루오로우라실 또는 nab-파클리탁셀 + 젬시타빈)을 포함한다.
치료 대상 및 종양 또는 암
본 개시내용에 따라 치료될 대상체는 좋기로는 인간 대상체이다.
치료될 종양 또는 암은 임의의 종양 또는 암일 수 있다. 종양/암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병, 예컨대 골암, 혈액암, 폐암, 간암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 항문 부위의 암, 위암, 대장암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 성 및 생식 기관의 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 방광암, 신장암, 신세포 암종, 신장 골반 암종, 중추 신경계(CNS)의 신생물, 신경외배엽암, 척추 축 종양, 신경교종, 수막종 및 뇌하수체 선종이 포함되지만 이에 국한되지 않는다..
일 구현예에서, 치료될 종양 또는 암은 비-중추신경계(CNS) 종양 또는 암, 예컨대 비-CNS 악성 종양이다.
좋기로는, 종양 또는 암은 흑색종, 난소암, 폐암(예를 들어, 비소세포폐암(NSCLC)), 대장암, 두경부암, 위암, 유방암, 신장암, 요로상피암, 방광암, 식도암, 췌장암, 간암, 흉선종 및 흉선암종, 뇌암, 신경교종, 부신피질암종, 갑상선암, 기타 피부암, 육종, 다발성 골수종, 백혈병, 림프종, 골수이형성증후군, 자궁내막암, 전립선암, 음경암, 자궁경부암, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 메르켈 세포 암종 및 중피종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 더욱 좋기로는, 종양 또는 암은 흑색종, 폐암, 대장암, 췌장암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 일 구현예에서, 치료될 종양 또는 암은 고형 종양 또는 암이다. 일 구현예에서, 치료될 종양 또는 암은 비-CNS 고형 종양 또는 암, 예컨대 비-CNS 고형 악성 종양이다.
종양 또는 암은 특히 흑색종일 수 있다. 피부 흑색종은 17번째로 흔한 악성 종양으로, 추정 연령 표준화 발생률은 100,000명당 3.4명이다. 2020년에는 전 세계적으로 약 324,635명의 새로운 피부 흑색종 사례가 발생하고 57,043명이 사망한 것으로 추산된다(GLOBOCAN, 2020). 지역 또는 원거리 질병이 있는 환자의 5년 생존 결과는 각각 약 66%와 27%이다(SEER, 2018). 제1선(1L) 치료에서는 표적 치료법과 면역체크포인트(ICP) 억제제가 진행성 또는 전이성 흑색종의 단독 또는 병용 치료에 승인되었다. 향상된 결과는 프로그램화된 세포사멸 단백질 1(PD-1)과 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA-4) 억제제와 같은 병용 요법과 관련이 있지만 환자는 더 빈번하고 심각한 면역 관련 부작용(irAE)을 경험한다(NCCN, 2021c). 효능을 강화하고 독성을 제한하는 것을 목표로 하는 새로운 조합 접근법은 기존 표준 치료(SOC)를 개선할 수 있는 기회를 제공한다. 표적 치료나 면역요법으로 진행된 진행성 또는 전이성 흑색종 환자는 일반적으로 중간 정도의 반응률로 세포독성 치료를 받다. 따라서 제2선 치료(2L) 및 이후(2L+) 치료에서도 충족되지 않은 의료 수요가 높다(NCCN, 2021c).
종양 또는 암이 흑색종인 일 구현예에서, 종양 또는 암은 눈(포도막) 또는 점막 흑색종이 아니다. 일 구현예에서, 종양 또는 암은 피부 또는 말단 흑색종이다.
종양 또는 암이 흑색종인 일 구현예에서, 흑색종은 절제 불가능한 흑색종, 특히 절제 불가능한 III기 또는 IV기 흑색종이다(좋기로는 미국 암 합동위원회(AJCC; 버전 8)의 병기 결정 시스템에 따름).
일 구현예에서, 종양 또는 암이 흑색종인 경우, 대상체는 절제 불가능 또는 전이성 흑색종에 대한 사전 전신 항암 치료를 받지 않았다. 즉, 첫 번째 측면에 따른 치료 전에 대상체는 절제 불가능 또는 전이성 흑색종에 대한 전신 항암 치료를 받지 않았다.
종양 또는 암이 흑색종인 일 구현예에서, 대상체는 국소 표준 시험(좋기로는 FDA 승인 시험)에 따라 공지된 종양 BRAF 돌연변이 상태를 갖는다. 그러한 대상체, 특히 BRAF V600E 돌연변이 흑색종을 갖는 대상체의 경우, 다음 기준 중 하나 이상(좋기로는 모두)이 충족되는 것이 바람직하다: (i) 락테이트 탈수소 효소 < 정상의 국소 상한선; (ii) 조사자의 판단에 따라 임상적으로 유의한 종양 관련 증상이 없음; (iii) 조사자의 판단에 따라 빠르게 진행되는 전이성 흑색종이 없음.
종양 또는 암이 흑색종인 일 구현예에서, 대상체는 면역 체크포인트(ICP) 억제제를 사용한 사전 치료를 받지 않았으며, 즉, 첫 번째 측면에 따른 치료 전에 대상체는 ICP 억제제를 사용한 치료를 받지 않았다(즉, 대상체는 ICP 억제제에 대해 경험이 없다(CPI-경험 없음/CPI-naive).
종양 또는 암은 특히 대장암일 수 있다. 대장암(CRC)은 남성에서 세 번째로 흔히 진단되는 암이고 여성에서는 두 번째로 많이 진단되는 암이다. 2020년 전 세계적으로 약 1,931,590명의 새로운 CRC 사례와 935,173명의 사망자가 발생한 것으로 추산된다(GLOBOCAN, 2020). 미국의 5년 상대 생존율은 진단 시 국소 질환이 있는 환자의 경우 71%, 진단 시 원격 질환이 있는 환자의 경우 14%이다(SEER, 2018). 진행성 또는 전이성 질환에 권장되는 초기 치료 옵션은 환자가 집중 치료 대상인지 여부에 따라 다르다. 보다 집중적인 초기 치료 옵션에는 5-FU/류코보린과 옥살리플라틴(FOLFOX), 5-FU/류코보린과 이리노테칸(FOLFIRI), 카페시타빈과 옥살리플라틴, 및 5-FU, 옥살리플라틴 및 이리노테칸(FOLFOXIRI)이 포함된다. 생물학적 제제(예컨대 베바시주맙, 세툭시맙, 파니투무맙)를 추가하는 것도 이러한 요법 중 일부와 함께 선택할 수 있다(NCCN, 2021a). 베바시주맙 및 세툭시맙과 같은 표적 약물의 승인으로 전이성 CRC 환자의 결과가 개선되었지만 현재 승인된 모든 표적 약물은 VEGF 경로 또는 EGFR 경로를 표적으로 한다. 따라서 특히 종양에 RAS(KRAS, NRAS) 또는 BRAF 돌연변이가 있는 환자와, 이용가능한 치료 옵션 후에 질병이 진행된 환자의 경우, 새로운 작용 기전(MoA)을 갖는 새로운 제제에 대한 필요성이 여전히 남아 있다.
종양 또는 암이 CRC인 일 구현예에서, 대상체는 면역 체크포인트(ICP) 억제제를 사용한 사전 치료를 받지 않았으며, 즉, 첫 번째 측면에 따른 치료 전에 대상체는 ICP 억제제를 사용한 치료를 받지 않았다.
종양 또는 암은 특히 폐암일 수 있다. 폐암은 편평 또는 비편평 NSCLC와 같은 비소세포폐암(NSCLC)일 수 있다. 폐암은 연령 표준화 발병률이 100,000명당 22.4명으로 추정되는 두 번째로 흔한 악성 종양이며 남성과 여성 모두에서 암 사망의 주요 원인이다(Kantar, 2021). 2020년 전 세계적으로 약 2,206,771명의 새로운 폐암 사례와 1,796,144명의 사망자가 발생한 것으로 추산된다(GLOBOCAN, 2020). 비소세포폐암(NSCLC)은 전체 사례의 85~90%를 차지하며, 질병의 모든 단계에서 5년 생존율은 약 18%이고, 전이성 질환의 경우 3.5%에 불과한다(Jemal et al., 2011) (Kantar, 2021; SEER, 2018). 제1선 치료에서 치료는 일반적으로 분자 및 바이오마커 분석과 종양의 조직학에 따라 면역요법과 결합된 백금 기반 화학요법 또는 표적 요법으로 구성된다(NCCN, 2021d). 최근에는 PD-1 및 프로그램 사멸 리간드 1(PD-L1) 억제제의 출현으로 운전자 돌연변이가 없는 환자(비편평 인구의 약 62% 및 편평 인구의 77%)에 대한 결과가 개선되었다(Kantar, 2021).). 종양에 특정 발암성 돌연변이가 없거나 체크포인트 억제제(CPI) 옵션에 대한 바이오마커가 발현되지 않는 환자에게는 더 많은 치료 대안이 필요하다. 대응을 강화하기 위한 보완적 접근법과 새로운 조합을 통해 이 인구 집단의 충족되지 않은 요구 사항을 더욱 해결할 수 있다. 2선 치료의 환자의 경우, SOC는 이전에 받은 치료법에 따라 백금 기반 화학요법, CPI 단독요법 또는 라무시루맙 유무에 관계없이 도세탁셀로 제한된다. 3선(3L) 치료의 환자에게는 화학요법 단독요법이 표준이다. 이 집단에서 독성을 제한하고 잠재적으로 효능을 향상시키기 위해서는 새로운 치료법이 필요하다(NCCN, 2021d).
종양 또는 암이 폐암인 일 구현예에서, 이 종양 또는 암은 비소세포폐암(NSCLC), 예를 들어 편평 또는 비편평 NSCLC이다.
일 구현예에서, 종양 또는 암은 표피 성장 인자(EGFR)-감작 돌연변이 및/또는 역형성 림프종(ALK) 전위/ROS1 재배열을 갖지 않는다. 주로 편평 조직학의 종양이 있는 것으로 알려진 대상체의 경우, 이것이 국소 SOC에 따른다면 EGFR 돌연변이 및 ALK 전위에 대한 분자 테스트는 필요하지 않다.
종양 또는 암이 폐암, 특히 NSCLC인 일 구현예에서, 종양 또는 암은 암 세포를 포함하고, PD-L1은 암 세포의 ≥ 1%에서 발현된다. 이러한 발현은 국소 SOC 시험(좋기로는 FDA 승인 시험)에 의해 결정되거나 중앙 실험실에서 결정되는 면역조직화학(IHC)과 같은 통상의 기술자에게 공지된 임의의 수단 및 방법에 의해 결정될 수 있다.
종양 또는 암이 폐암인 일 구현예에서, 대상체는 진행성 또는 전이성 질환에 대한 1차 요법으로 이전에 전신 항암 요법을 실시하지 않은 채 IV기 전이성 또는 재발성 NSCLC(AJCC 버전 8)로 조직학적으로 확인된 진단을 받은 대상체이다.
종양 또는 암이 폐암인 일 구현예에서, 대상체는 면역 체크포인트(ICP) 억제제를 사용한 사전 치료를 받지 않았으며, 즉, 첫 번째 측면에 따른 치료 전에 대상체는 ICP 억제제를 사용한 치료를 받지 않았다.
종양 또는 암은 특히 두경부암일 수 있다. 전 세계적으로 매년 600,000건이 넘는 두경부 편평 세포 암종(HNSCC)이 진단된다. 2020년에는 미국에서 같은 기간 동안 약 65,630명의 새로운 구강암, 인두암, 후두암 발병 사례가 발생하고 약 14,500명의 사망자가 발생할 것으로 예상된다(NCCN, 2021b). 담배 사용, 알코올 사용 및 인간 유두종 바이러스(HPV) 감염은 HNSCC 발생 위험을 증가시킨다. 국소 HPV 양성 HNSCC 환자는 HPV 음성 질환 환자에 비해 치료 결과가 향상되었다. 재발성 또는 전이성 HNSCC 환자의 경우, 펨브롤리주맙/백금(시스플라틴 또는 카보플라틴)/5-FU 및 펨브롤리주맙 단독요법(PD-L1 통합 양성 점수[CPS] ≥ 20 또는 ≥ 1인 환자의 경우)이 1L 요법이 권장된다. 그러나 평균 전체 생존 기간(mOS)은 15개월 미만이다(NCCN, 2021b). 따라서 HNSCC는 여전히 충족되지 않은 의학적 수요가 높은 분야로 남아 있으며 새로운 치료 접근법으로 결과를 개선할 수 있는 추가 기회가 존재한다.
일 구현예에서, 종양 또는 암은 두경부암이고, 종양 또는 암은 편평 세포 암종(HNSCC)이다.
종양 또는 암이 두경부암인 일 구현예에서, 조직 학적으로 또는 세포학적으로 확인된 재발성 또는 전이성 HNSCC는 국소 요법에 의해 치료 불가능한 것으로 간주된다.
종양 또는 암이 두경부암인 일 구현예에서, 대상체는 재발성 또는 전이성 환경에서 이전에 전신 요법을 투여받은 적이 없다. 국소 진행성 질환에 대한 복합 치료의 일부로 제공되는 경우 동의서 서명 전 6개월 이상 전에 완료된 전신 치료는 허용된다.
종양 또는 암이 두경부암인 일 구현예에서, 적합한 원발성 종양 위치는 구인두, 구강, 하인두 및 후두이다.
종양 또는 암이 두경부암인 일 구현예에서, 대상체는 비 인두의 원발성 종양 부위(임의의 조직학)를 갖지 않는다.
일 구현예에서, 종양 또는 암이 두경부암인 경우, 대상체는 종양 PD-L1 IHC 결합 양성 점수(CPS) ≥ 1을 갖는다(이는 현지(FDA 승인 테스트 선호) 또는 중앙 실험실 테스트(확장 단계에서는 중앙 테스트가 의무화됨)에 의해 결정될 수 있다).
종양 또는 암이 구인두암인 일 구현예에서, 대상체는 인유두종바이러스(HPV) p16 시험 결과를 갖는다(좋기로는 국소 SOC별로 이용 가능함). 구강암, 하인두암, 후두암은 일반적으로 이러한 종양 위치가 HPV 음성으로 간주되기 때문에 p16 IHC에 의한 HPV 검사를 받을 필요가 없다.
일 구현예에서, 종양 또는 암이 두경부암인 경우, 대상체는 면역 체크포인트(ICP) 억제제로 치료를 받지 않았다. 즉, 첫 번째 측면에 따른 치료 전에 대상체는 ICP 억제제로 치료를 받지 않았다.
종양 또는 암은 특히 췌장관 선암종일 수 있다. 췌관 선암종(PDAC)은 미국에서 암 관련 사망의 세 번째 주요 원인이다. 2021년 미국에서는 약 60,430명의 새로운 췌장암 사례와 48,220명의 사망자가 발생할 것으로 추정된다(Siegal, 2021). 진단 당시 전이성 질환이 있는 환자의 예후는 mOS가 1년 미만으로 암울하다. FOLFOXIRI 및 젬시타빈 단독 또는 알부민 결합 파클리탁셀과의 병용 요법은 이 환경에서 1L 치료법으로 사용되는 주된 전신 치료 요법이지만, 이리노테칸 리포솜 주사(5-FU 및 류코보린과 병용), 베바시주맙 또는 엘로티닙 및 FOLFOX와 같은 다른 요법들도 2L+ 치료제로 활용될 수 있다(NCCN, 2021e). 이 환경에서 이용 가능한 치료법의 증가에도 불구하고, 현재의 화학요법과 결합 양식의 심각한 독성과 생존 혜택의 부족은 임상 시험이 새로 진단된 말기 질환 환자에게 중요한 선택임을 나타낸다.
일 구현예에서, 종양 또는 암은 췌장암이고, 종양 또는 암은 췌장 내분비암이 아니다.
일 구현예에서, 종양 또는 암은 췌장암이고, 종양 또는 암은 췌장관 선암종(PDAC)이다.
종양 또는 암이 췌장암인 일 구현예에서, 대상체는 방사선요법, 수술, 화학요법 또는 조사 요법에 의한 전이성 질환의 사전 치료를 받은 적이 없다. 즉, 첫 번째 측면에 따른 치료 전에 대상체는 이전에 방사선요법, 수술, 화학요법 또는 조사 요법을 통한 전이성 질환 치료 받은 적이 없다.
종양 또는 암이 췌장암인 일 구현예에서, 대상체는 체크포인트 억제제를 사용한 사전 치료를 받지 않았으며, 즉, 첫 번째 측면에 따른 치료 전에 대상체는 ICP 억제제를 사용한 치료를 받지 않았다.
종양 또는 암이 췌장암인 일 구현예에서, 종양 또는 암은 BRCA 1/2 또는 PALB2 돌연변이와 같은 실행 가능한 유전자 변경을 갖지 않는다.
치료 요법
결합제 및 체크포인트 억제제는 정맥내, 동맥내, 피하, 피내, 근육내, 결절내 또는 종양내와 같은 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있다.
첫 번째 측면의 일 구현예에서, 결합제는 특히 전신 투여에 의해 대상체에게 투여된다. 좋기로는, 결합제는 정맥 주사 또는 주입에 의해 대상에게 투여된다. 일 구현예에서, 결합제는 적어도 1회 치료 사이클로 투여된다.
일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 특히 전신 투여에 의해 대상체에게 투여된다. 좋기로는, 체크포인트 억제제는 정맥 주사 또는 주입에 의해 대상체에게 투여된다. 일 구현예에서, 체크포인트 억제제는 적어도 1회 치료 사이클로 투여된다.
일 구현예에서, 결합제 및 체크포인트 억제제는 특히 전신 투여에 의해 대상체에게 투여된다. 좋기로는, 결합제 및 체크포인트 억제제는 정맥 주사 또는 주입에 의해 대상체에게 투여된다. 일 구현예에서, 결합제 및 체크포인트 억제제는 적어도 1회 치료 사이클로 투여된다.
일 구현예에서, 각각의 치료 사이클은 약 2주(14일), 3주(21일) 또는 4주(28일), 좋기로는 3주(21일)이다.
특정 구현예에서, 각각의 용량은 2주마다(1Q2W), 3주마다(1Q3W) 또는 4주마다(1Q4W), 좋기로는 3주마다(1Q3W) 투여되거나 주입된다.
일부 구현예에서, 1회 용량 또는 각각의 용량은 각 치료 사이클의 제1일에 투여되거나 주입된다. 예를 들어, 결합제 1회 용량과 체크포인트 억제제 1회 용량이 각 치료 사이클의 제1일에 투여될 수 있다.
각 용량은 최소 30분에 걸쳐 투여되거나 주입될 수 있다. 예를 들어 최소 60분, 최소 90분, 최소 120분 또는 최소 240분 이상이다.
결합제 및 체크포인트 억제제는 동시에 투여될 수 있다. 대안적인 바람직한 구현예에서, 결합제 및 체크포인트 억제제는 별도로 투여된다.
일 구현예에서, 방법은 대상체에게 하나 이상의 추가 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하고, 하나 이상의 추가 치료제는 좋기로는 하나 이상의 화학요법제, 예컨대 백금계 화합물(예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴), 탁산계 화합물(예컨대 파클리탁셀 및 nab-파클리탁셀), 뉴클레오사이드 유사체(예컨대 5-플루오로우라실 및 젬시타빈), 및 이들의 조합(예컨대 시스플라틴/카보플라틴 + 5-플루오로우라실 또는 nab-파클리탁셀 + 젬시타빈)을 포함한다. 이러한 구현예에서, 하나 이상의 추가 치료제는 적어도 하나의 치료 사이클로 투여되는 것이 바람직하며, 여기서 각 치료 사이클은 좋기로는 3주(21일)이다. 예를 들어, 하나 이상의 추가 치료제의 1회 용량은 적어도 1차 치료 사이클 동안 적어도 매 3주마다(1Q3W), 예를 들어 적어도 1차 치료 사이클 동안 매 3주마다 2회(2Q3W) 투여된다. 일 구현예에서, 하나 이상의 추가 치료제의 1회 용량은 적어도 1차 치료 사이클의 적어도 1일에, 예를 들어 적어도 1차 치료 사이클의 제1일 및 제8일에 투여된다.
결합제, 체크포인트 억제제 및 존재하는 경우 하나 이상의 추가 치료제는 임의의 적합한 형태(예를 들어, 그대로)로 투여될 수 있다. 그러나, 결합제, 체크포인트 억제제, 및 존재하는 경우 하나 이상의 추가 치료제는 본원에 기술된 임의의 적합한 약학적 조성물의 형태로 투여되는 것이 바람직하다. 일 구현예에서, 적어도 결합제 및 체크포인트 억제제는 별도의 약제학적 조성물(즉, 결합제에 대한 하나의 약제학적 조성물 및 체크포인트 억제제에 대한 하나의 약제학적 조성물), 좋기로는 결합제, 체크포인트 억제제의 형태로 투여되며, 존재하는 경우, 하나 이상의 추가 치료제는 별도의 약제학적 조성물의 형태로 투여된다(즉, 결합제에 대해 하나의 약제학적 조성물, 체크포인트 억제제에 대해 하나의 약제학적 조성물, 및 하나 이상의 추가 치료제에 대해 적어도 하나의 약제학적 조성물).
조성물 또는 약제학적 조성물은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995]에 개시된 것과 같은 통상적인 기술에 따라 공지된 보조제를 포함하여 약제학적 조성물에 적합한 담체, 부형제 및/또는 희석제뿐만 아니라 임의의 다른 성분과 함께 제제화될 수 있다. 공지된 보조제 및 부형제뿐만 아니라 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제는 결합제 및/또는 체크포인트 억제제 및/또는 체크포인트 억제제에 적합하거나, 또는 존재하는 경우 하나 이상의 추가 치료제 및 선택된 투여 방식에 적합하여야 한다. 약제학적 조성물의 담체 및 기타 성분에 대한 적합성은 선택된 화합물 또는 약제학적 조성물의 원하는 생물학적 특성에 대한 유의한 부정적 영향의 부재에 기초하여 결정된다(예를 들어, 항원 결합 시 실질적인 영향 미만[10% 이하의 상대적 억제, 5% 또는 상대적 억제 감소 등]).
조성물, 특히 결합제의 약제학적 조성물, 체크포인트 억제제의 약제학적 조성물, 및 존재하는 경우 하나 이상의 추가 치료제의 적어도 하나의 약제학적 조성물은 희석제, 충전제, 염, 완충제, 세제(예를 들어, Tween-20 또는 Tween-80과 같은 비이온성 세제), 안정화제(예를 들어, 당 또는 무단백질 아미노산), 방부제, 가용화제, 및/또는 약제학적 조성물에 포함되기에 적합한 기타 물질을 포함할 수 있다.
치료 용도를 위한 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제는 약학 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A.R Gennaro 편집. 1985)에 기재되어 있다.
약학적 담체, 부형제 또는 희석제는 의도된 투여 경로 및 표준 약학 관행과 관련하여 선택될 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체에는 활성 화합물, 특히 결합제, 체크포인트 억제제 및/또는 존재하는 경우 본원에 사용된 하나 이상의 추가 치료제와 생리학적으로 상용가능한(compatible), 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아 및 항진균제, 등장화제, 항산화제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. .
조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예 에는 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 에탄올, 덱스트로스, 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 올리브유, 옥수수유, 땅콩유, 면실유 및 참기름과 같은 식물성 오일, 카르복시메틸 셀룰로스 콜로이드 용액, 트라가칸스 검 및 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르 및/또는 다양한 완충제. 다른 담체는 제약 분야에 잘 알려져 있다.
약학적으로 허용되는 담체에는 멸균 수용액 또는 분산액과 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, (약제학적) 조성물에서의 그의 사용이 고려된다.
본 명세서에 사용된 용어 "부형제"는 본 발명의 (약제학적) 조성물에 존재할 수 있지만 활성 성분은 아닌 물질을 의미한다. 부형제의 예에는 담체, 결합제, 희석제, 윤활제, 증점제, 표면활성제, 방부제, 안정제, 유화제, 완충제, 향미제 또는 착색제가 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
"희석제"라는 용어는 희석제 및/또는 희석제와 관련된다. 또한, "희석제"라는 용어는 유체, 액체 또는 고체 현탁액 및/또는 혼합 매체 중 하나 이상을 포함한다. 적합한 희석제의 예로는 에탄올, 글리세롤 및 물이 있다.
(약제학적) 조성물은 또한 약학적으로 허용되는 항산화제, 예를 들어 (1) 수용성 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 시스테인 염산염, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 유용성 항산화제, 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등도 포함할 수 있다.
(약제학적) 조성물은 또한 등장화제, 예를 들어 당, 다가알코올, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 또는 염화나트륨을 조성물에 포함할 수 있다.
(약제학적) 조성물은 보존제, 습윤제, 유화제, 분산제, 보존제 또는 완충제와 같이 선택된 투여 경로에 적합한 하나 이상의 보조제를 함유할 수도 있으며, 이는 보존 기간 또는 효과를 향상시킬 수 있다. 구성. 본원에 사용된 조성물은 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제제와 같이 빠른 방출로부터 화합물을 보호할 담체와 함께 제조될 수 있다. 이러한 담체에는 젤라틴, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 디스테아레이트, 생분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토 에스테르 및 폴리락트산이 단독으로 또는 왁스와 함께, 또는 업계에 잘 알려진 기타 물질과 함께 포함될 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978] 참조.
"약학적으로 허용되는 염"은 예를 들어 염산, 황산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 아세트산, 벤조산, 구연산, 타르타르산, 탄산 또는 인산과 같은 약학적으로 허용되는 산을 사용하여 형성될 수 있는 산부가염을 포함한다. 또한, 적합한 약학적으로 허용되는 염에는 알칼리 금속 염(예를 들어, 나트륨 또는 칼륨 염); 알칼리 토금속 염(예를 들어, 칼슘 또는 마그네슘 염); 암모늄(NH4 +); 및 적합한 유기 리간드(예를 들어, 할로겐화물, 수산화물, 카르복실산염, 황산염, 인산염, 질산염, 알킬 술포네이트 및 아릴 술포네이트와 같은 반대 음이온을 사용하여 형성된 4차 암모늄 및 아민 양이온)로 형성된 염을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염의 예시적인 예에는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠술포네이트, 벤조에이트, 중탄산염, 중황산염, 중타르산염, 붕산염, 브롬화물, 부티레이트, 칼슘 에데테이트, 캠포레이트, 캠포설페이트, 캄실레이트, 탄산염, 염화물, 구연산염, 클라불라네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 이염산염, 도데실황산염, 에데테이트, 에디실레이트, 에스톨레이트, 에실레이트, 에탄술포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 갈락테이트, 갈락투로네이트, 글루셉테이트, 글루코헵토네이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 글리세로인산염, 글리콜릴라르사닐레이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 헥실레조르시네이트, 히드라바민, 브롬화수소산염, 염산염, 요오드화수소산염, 2-히드록시에탄술포네이트, 히드록시나프토에이트, 요오드화물, 이소부티레이트, 이소티오네이트, 락테이트, 락토비오네이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 만델레이트, 메실레이트, 메탄술포네이트, 메틸설페이트, 뮤케이트, 2-나프탈렌설포네이트, 나프실레이트, 니코티네이트, 질산염, N-메틸글루카민 암모늄염, 올리에이트, 옥살레이트, 파모에이트(에보네이트), 팔미테이트, 판토테네이트, 펙틴테이트, 과황산염, 3-페닐프로피오네이트, 인산염/이인산염, 프탈레이트, 피크레이트, 피발레이트, 폴리갈락투로네이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 설페이트, 수베레이트, 숙시네이트, 탄네이트, 타르트레이트, 테오클레이트, 토실레이트, 트리에티오다이드, 운데카노에이트, 발레레이트 등(예를 들어, SM Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm 참조). Sci., 66, pp. 1-19(1977))이 포함된다. 약학적으로 허용되지 않는 염도 약학적으로 허용되는 염을 제조하는데 사용될 수 있으며, 본 발명에 포함된다.
일 구현예에서, 본원에 사용된 결합제, 체크포인트 억제제, 및 존재하는 경우 하나 이상의 추가 치료제는 생체내에서 적절한 분포를 보장하도록 제제화될 수 있다. 비경구 투여를 위한 약제학적으로 허용되는 담체에는 멸균 수용액 또는 분산액과 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 조성물에서의 그의 사용이 고려된다. 다른 활성 또는 치료 화합물도 조성물에 혼입될 수 있다.
주사용 약학 조성물은 일반적으로 제조 및 보관 조건 하에서 멸균되고 안정하여야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물, 올리브와 같은 식물성 오일 및 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르를 포함하는 수성 또는 비수성 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용을 통해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 설탕, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨과 같은 다가알코올을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 이루어질 수 있다. 멸균 주사용 용액은 필요에 따라 위에서 열거한 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼합한 후 멸균 정밀여과를 수행하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 예를 들어 위에 열거된 필수 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사용 용액 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법의 예로는 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 추가 원하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조(freeze-drying 또는lyophilization)가 있다.
멸균 주사용 용액은 필요에 따라 위에 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼합한 후 멸균 정밀여과를 수행하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 위에 열거된 것 중 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사용 용액 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법의 예로는 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 및 원하는 임의의 추가 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조(freeze-drying 또는lyophilization)가 있다.
두 번째 측면에서, 본 발명은 (i) CD40에 결합하는 제1 결합 영역 및 CD137에 결합하는 제2 결합 영역을 포함하는 결합제, (ii) 체크포인트 억제제, 및 선택적으로 (iii) 하나 이상의 추가 치료제를 포함하는 키트를 제공한다. 첫 번째 측면(특히 결합제, 체크포인트 억제제 및 선택적인 하나 이상의 추가 치료제와 관련하여)과 관련하여 본 명세서에 개시된 구현예는 두 번째 측면의 키트에도 적용된다. 일 구현예에서, 키트는 적어도 2개의 용기를 포함하며, 그 중 하나는 결합제(그대로 또는 (약제학적) 조성물의 형태로)를 함유하고, 두 번째 용기는 체크포인트 억제제(그대로 또는 (약제학적) 조성물의 형태로)제제의 형태)를 함유한다. 키트가 하나 이상의 추가 치료제를 포함하는 경우, 키트는 적어도 3개의 용기, 결합제(그대로 또는 (약제학적) 조성물의 형태로)를 함유하는 용기, 체크포인트 억제제(그대로 또는 (약제학적) 조성물의 형태로)를 함유하는 용기, 및 하나 이상의 추가 치료제(그대로 또는 (약제학적) 조성물의 형태로)를 함유하는 적어도 제3의 용기를 포함하는 것이 바람직하다.
세 번째 측면에서, 본 발명은 대상체에서 종양의 진행을 감소 또는 예방하거나 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 두 번째 측면의 키트를 제공한다. 첫 번째 측면(특히 결합제, 체크포인트 억제제, 선택적인 하나 이상의 추가 치료제, 치료 요법, 특정 종양/암 및 대상체에 관한) 및/또는 두 번째 측면과 관련하여 본 명세서에 개시된 구현예 측면은 세 번째 측면을 사용하기 위한 키트에도 적용된다.
네 번째 측면에서, 본 발명은 체크포인트 억제제의 투여 전, 투여와 동시, 또는 투여 후에 상기 대상체에게 결합제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양의 진행을 감소 또는 예방하거나 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 결합제는 CD40에 결합하는 제1 결합 영역 및 CD137에 결합하는 제2 결합 영역을 포함한다. 첫 번째 측면(특히 결합제, 체크포인트 억제제, 선택적인 하나 이상의 추가 치료제, 치료 요법, 특정 종양/암 및 대상체와 관련하여)과 관련하여 본원에 개시된 구현예는 또한 네 번째 측면의 방법에도 적용된다.
추가 측면에서, 본 발명은 대상체에서 종양의 진행을 감소 또는 예방하거나 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 체크포인트 억제제를 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체에게 결합제 억제제를 투여하기 전, 동시에 또는 투여 후에 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 포함하되, 여기서 결합제는 CD40에 결합하는 제1 결합 영역 및 CD137에 결합하는 제2 결합 영역을 포함하는 것이다. 첫 번째 측면(특히 결합제, 체크포인트 억제제, 선택적인 하나 이상의 추가 치료제, 치료 요법, 특정 종양/암 및 대상체와 관련하여)과 관련하여 본 명세서에 개시된 구현예는 이 추가 측면의 사용을 위한 체크포인트 억제제에도 적용된다.
본원에 언급된 문서 및 연구지의 인용은 전술한 내용이 관련 선행 기술임을 인정하려는 의도가 아니다. 이 문서의 내용에 대한 모든 진술은 출원인이 이용할 수 있는 정보를 기반으로 하며 이 문서 내용의 정확성을 인정하는 것이 아니다.
본 발명의 설명(다음 실시예 포함)은 당업자가 다양한 구현예를 만들고 사용할 수 있도록 제공된다. 특정 장치, 기술 및 적용에 대한 설명은 예시로서만 제공된다. 본 명세서에 설명된 실시예에 대한 다양한 수정은 당업자에게 쉽게 명백할 것이며, 본 명세서에 정의된 일반 원리는 다양한 구현예의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다른 실시예 및 애플리케이션에 적용될 수 있다. 따라서, 다양한 구현예는 본 명세서에 설명되고 도시된 예에 제한되도록 의도되지 않고, 청구범위와 일치하는 범위에 따라야 한다.
항목별 클레임
1. 대상체에서 종양의 진행을 감소 또는 예방하거나 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 결합제로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 결합제를 체크포인트 억제제의 투여 전, 투여와 동시, 또는 투여 후에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 결합제는 CD40에 결합하는 제1 결합 영역 및 CD137에 결합하는 제2 결합 영역을 포함하는 것인, 결합제.
2. 항목 1에 있어서, CD40이 인간 CD40, 특히 SEQ ID NO: 36에 제시된 서열을 포함하는 인간 CD40이고/이거나 CD137이 인간 CD137, 특히 SEQ ID NO: 38에 제시된 서열을 포함하는 인간 CD137인, 결합제.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, 체크포인트 억제제가 PD-1 억제제, PD-L1 억제제, PD-L2 억제제, CTLA-4 억제제, TIM-3 억제제, KIR 억제제, LAG-3 억제제, TIGIT 억제제, VISTA 억제제 및 GARP 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 결합제.
4. 항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 있어서, 체크포인트 억제제가 항체, 예컨대 PD-1 차단 항체, 특히 펨브롤리주맙인, 결합제.
4a. 항목 1 내지 4 중 어느 한 항목에 있어서, 체크포인트 억제제는 니볼루맙, Amp-514, 티슬레리주맙, 세미플리맙, TSR-042, JNJ-63723283, CBT-501, PF-06801591, JS-001, 캄렐리주맙, PDR001, BCD-100, AGEN2034, IBI-308, BI-754091, GLS-010, LZM-009, AK-103, mgA-012, Sym-021 및 CS1003으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 항PD-1 항체 또는 항원 결합 단편의 상보성 결정 영역(CDR)과 같은, 본원에 설명된 항PD-1 항체 또는 항원 결합 단편 중 하나의 CDR을 포함하는 항PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, 결합제.
4b. 항목 1 내지 4a 중 어느 한 항목에 있어서, 체크포인트 억제제는 니볼루맙, Amp-514, 티슬레리주맙, 세미플리맙, TSR-042, JNJ-63723283, CBT-501, PF-06801591, JS-001, 캄렐리주맙, PDR001, BCD-100, AGEN2034, IBI-308, BI-754091, GLS-010, LZM-009, AK-103, mgA-012, Sym-021, CS1003, 및 IgG1-PD1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 항PD-1 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과 같은, 본원에 설명된 항PD-1 항체 또는 항원 결합 단편 중 하나의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, 결합제.
4b1. 항목 1 내지 4a 중 어느 한 항목에 있어서, 체크포인트 억제제는 SEQ ID NO: 43에 정의된 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 44에 정의된 경쇄 가변 영역을 포함하는 항PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, 결합제.
4c. 항목 1 내지 4b 중 어느 한 항목에 있어서, 체크포인트 억제제는 니볼루맙, Amp-514, 티슬레리주맙, 세미플리맙, TSR-042, JNJ-63723283, CBT-501, PF-06801591, JS-001, 캄렐리주맙, PDR001, BCD-100, AGEN2034, IBI-308, BI-754091, GLS-010, LZM-009, AK-103, mgA-012, Sym-021, CS1003, and IgG1-PD1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편인, 결합제.
4c1. 항목 1 내지 4b1 중 어느 한 항목에 있어서, 체크포인트 억제제는 항PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고, 여기서 항PD-1 항체는 SEQ ID NO: 43에 정의된 VH 서열, SEQ ID NO: 44에 정의된 VL 서열, SEQ ID NO: 61에 정의된 Fc 서열, 및 선택적으로 SEQ ID NO: 27에 정의된 카파 서열을 포함하는, 결합제.
4d. 항목 1 내지 4 중 어느 한 항목에 있어서, 체크포인트 억제제는 아테졸리주맙 또는 그의 항원 결합 단편과 같은 본원에 기술된 항PD-L1 항체 또는 항원 결합 단편 중 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, 결합제.
4e. 항목 1 내지 4 및 4d 중 어느 한 항목에 있어서, 체크포인트 억제제는 아테졸리주맙 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과 같은, 본원에 기술된 항PD-L1 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, 결합제.
5. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 결합제 및 체크포인트 억제제 중 하나 또는 둘 모두는 전신으로, 좋기로는 정맥내로 투여되는, 결합제.
6. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
a) 제1 결합 영역은 SEQ ID NO: 7 또는 9의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 SEQ ID NO: 8 또는 10의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고; 및
b) 제2 항원 결합 영역은 SEQ ID NO: 17 또는 19의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 SEQ ID NO: 18 또는 20의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 결합제.
7. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
a) 제1 결합 영역은 각각 SEQ ID NO: 1, 2, 및 3에 제시된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 각각 SEQ ID NO: 4, 5, 및 6에 제시된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고; 및
b) 제2 항원 결합 영역은 각각 SEQ ID NO: 11, 12 및 13에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 각각 SEQ ID NO: 14, 15, 및 16에 제시된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 결합제.
8. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
a) 제1 결합 영역은 SEQ ID NO: 7 또는 9에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 8 또는 10에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고;
b) 제2 결합 영역은 제1 결합 영역은 SEQ ID NO: 17 또는 19에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 25 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 18 또는 20에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 결합제.
9. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
a) 제1 결합 영역은 SEQ ID NO: 7 또는 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 8 또는 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 영역을 포함하고; 및
b) 제2 결합 영역은 SEQ ID NO: 17 또는 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 18 또는 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 영역을 포함하는, 결합제.
10. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
a) 제1 결합 영역은 SEQ ID NO: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 영역을 포함하고; 및
b) 제2 결합 영역은 SEQ ID NO: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 영역을 포함하는, 결합제.
11. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 결합제는 이중특이 항체와 같은 다중특이 항체인, 결합제.
12. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 결합제는 전장 항체 또는 항체 단편의 형식인, 결합제.
13. 항목 6-12 중 어느 한 항목에 있어서, 각 가변 영역은 3개의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3) 및 4개의 프레임워크 영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 포함하는, 결합제.
14. 항목 13에 있어서, 상기 상보성 결정 영역 및 상기 프레임워크 영역은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열되는, 결합제.
15. 항목 6-14 중 어느 한 항목에 있어서,
i) 상기 제1 중쇄 가변 영역(VH) 및 제1 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하거나, 이로 구성되거나, 본질적으로 구성되는 폴리펩타이드, 및
ii) 상기 제2 중쇄 가변 영역(VH) 및 제2 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하거나, 이로 구성되거나, 본질적으로 구성되는 폴리펩타이드
를 포함하는, 결합제.
16. 항목 6-15 중 어느 한 항목에 있어서,
i) 상기 제1 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고 제1 경쇄 불변 영역(CL)을 추가로 포함하는 폴리펩타이드, 및
ii) 상기 제2 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고 제2 경쇄 불변 영역(CL)을 추가로 포함하는 폴리펩타이드
를 포함하는, 결합제.
17. 항목 6-16 중 어느 한 항목에 있어서, 결합제는 제1 결합 팔 및 제2 결합 팔을 포함하는 항체이고, 여기서 제1 결합 팔은
i) 상기 제1 중쇄 가변 영역(VH) 및 제1 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하는 폴리펩타이드, 및
ii) 상기 제1 경쇄 가변 영역(VL) 및 제1 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하고; 제2 결합 팔은
iii) 상기 제2 중쇄 가변 영역(VH) 및 제2 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하는 폴리펩타이드, 및
iv) 상기 제2 경쇄 가변 영역(VL) 및 제2 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 결합제.
18. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
i) CD40에 결합할 수 있는 상기 항원 결합 영역을 포함하는 제1 중쇄 및 경쇄, 및
ii) CD137에 결합할 수 있는 상기 항원 결합 영역을 포함하는 제2 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 결합제.
19. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 결합제는:
i) CD40에 결합할 수 있는 상기 항원 결합 영역을 포함하는 제1 중쇄 및 경쇄(제1 중쇄는 제1 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제1 경쇄는 제1 경쇄 불변 영역을 포함함); 및
ii) CD137에 결합할 수 있는 상기 항원 결합 영역을 포함하는 제2 중쇄 및 경쇄(제2 중쇄는 제2 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 경쇄는 제2 경쇄 불변 영역을 포함함)를 포함하는, 결합제.
20. 항목 15-19 중 어느 한 항목에 있어서, 제1 및 제2 중쇄 불변 영역(CH) 각각은 불변 중쇄 1(CH1) 영역, 힌지 영역, 불변 중쇄 2(CH2) 영역 및 불변 중쇄 3(CH3) 영역 중 하나 이상, 좋기로는 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는, 결합제.
21. 항목 15-20 중 어느 한 항목에 있어서, 제1 및 제2 중쇄 불변 영역(CH) 각각은 CH3 영역을 포함하고, 여기서 2개의 CH3 영역은 비대칭 돌연변이를 포함하는, 결합제.
22. 항목 15-21 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 중쇄 불변 영역(CH)에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407, 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 대응하는 위치의 적어도 하나의 아미노산이 치환되고, 상기 제2 중쇄 불변 영역(CH)에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407, 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 대응하는 위치의 적어도 하나의 아미노산이 치환되며, 여기서 상기 제1 중쇄와 상기 제2 중쇄는 동일한 위치에서 치환되지 않은 것인, 결합제.
23. 항목 22에 있어서,
(i) EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 F405에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제1 중쇄 불변 영역(CH)에서 L이고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 F409에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제2 중쇄 불변 영역(CH)에서 R이며, 또는 (ii) EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 K409에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제1 중쇄에서 R이고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 F405에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제2 중쇄에서 L인, 결합제.
24. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 결합제는 동일한 제1 및 제2 항원 결합 영역 및 인간 IgG1 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 2개의 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하는 또 다른 항체에 비해 Fc 매개 이펙터 기능을 더 적은 정도로 유도하는, 결합제.
25. 항목 24에 있어서, 상기 제1 및 제2 중쇄 불변 영역(CH)은 항체가 변형되지 않은 제1 및 제2 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하는 것을 제외하고 동일한 항체에 비해, 더 적은 정도로 Fc-매개 이펙터 기능을 유도하도록 변형되는, 결합제.
26. 항목 25에 있어서, 상기 변형되지 않은 제1 및 제2 중쇄 불변 영역(CH) 각각은 SEQ ID NO: 21 또는 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 결합제.
27. 항목 25 또는 26에 있어서, 상기 Fc-매개 이펙터 기능은 Fcγ 수용체에 대한 결합, C1q에 대한 결합, 또는 Fcγ 수용체의 Fe-매개 가교결합의 유도에 의해 측정되는, 결합제.
28. 항목 27에 있어서, 상기 Fc-매개 이펙터 기능은 C1q에 대한 결합에 의해 측정되는, 결합제.
29. 항목 24-28 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및 제2 중쇄 불변 영역은 상기 항체에 대한 C1q의 결합이 야생형 항체에 비해, 좋기로는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100% 감소되도록 변형된 것이고, 여기서 C1q 결합은 좋기로는 ELISA에 의해 결정되는 것인, 결합제.
30. 항목 15-29 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및 제2 중쇄 불변 영역(CH) 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, D265, N297 및 P331에 상응하는 위치의 하나 이상의 아미노산 은 각각 L, L, D, N 및 P가 아닌, 결합제.
31. 항목 30에 있어서, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치는 상기 제1 중쇄 및 제2 중쇄에서 각각 F 및 E인, 결합제.
32. 항목 30 또는 31에 있어서, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235 및 D265에 상응하는 위치는 상기 제1 및 제2 중쇄 불변 영역(HC)에서 각각 F, E 및 A인, 결합제.
33. 항목 30-32 중 어느 한 항목에 있어서, 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 두 가지 모두의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치는 각각 F 및 E이고, 여기서 (i) 제1 중쇄 불변 영역의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치는 L이고, 제2 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치는 R이며, 또는 (ii) 제1 중쇄 불변 영역의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치는 R이고, 제2 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치는 L인, 결합제.
34. 항목 30-33 중 어느 한 항목에 있어서, 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 두 가지 모두의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235 및 D265에 상응하는 위치는 각각 F, E, 및 A이고, 여기서 (i) 제1 중쇄 불변 영역의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치는 L이고, 제2 중쇄 불변 영역의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치는 R이며, 또는 (ii) 제1 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치는 R이고, 제2 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치는 L인, 결합제.
35. 항목 15-34 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 중쇄의 불변 영역은:
a) SEQ ID NO: 21 또는 29 [IgG1-FC]에 제시된 서열;
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 10개의 치환, 예를 들어 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 또는 구성되는, 결합제.
36. 항목 15-34 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 또는 제2 중쇄, 예컨대 제2 중쇄의 불변 영역은:
a) SEQ ID NO: 22 또는 30에 제시된 서열 [IgG1-F405L];
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 9개의 치환, 예컨대 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 또는 구성되는, 결합제.
37. 항목 15-34 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 또는 제2 중쇄, 예컨대 제1 중쇄의 불변 영역은:
a) SEQ ID NO: 23 또는 31 [IgG1-F409R]에 제시된 서열;
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 10개의 치환, 최대 9개의 치환, 예컨대 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개의 치환, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 또는 구성되는, 결합제.
38. 항목 15-34 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 중쇄의 불변 영역은:
a) SEQ ID NO: 24 또는 32 [IgG1-Fc_FEA]에 제시된 서열;
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 7개의 치환, 예를 들어 최대 6개의 치환, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 또는 구성되는, 결합제.
39. 항목 15-38 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 중쇄, 예컨대 제2 중쇄의 불변 영역은:
*a) SEQ ID NO: 25 또는 33 [IgG1-Fc_FEAL]에 제시된 서열;
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 6개의 치환, 예를 들어 최대 5개의 치환, 최대 4개의 치환, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 또는 구성되는, 결합제.
40. 항목 15-39 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 중쇄, 예컨대 제1 중쇄의 불변 영역은:
*a) SEQ ID NO: 26 또는 34 [IgG1-Fc_FEAR]에 제시된 서열;
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 6개의 치환, 예를 들어 최대 5개의 치환, 최대 4개의 치환, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 또는 구성되는, 결합제.
41. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 결합제는 카파(κ) 경쇄 불변 영역을 포함하는, 결합제.
42. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 결합제는 람다(λ) 경쇄 불변 영역을 포함하는, 결합제.
43. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 경쇄 불변 영역은 카파(κ) 경쇄 불변 영역 또는 람다(λ) 경쇄 불변 영역인, 결합제.
44. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제2 경쇄 불변 영역은 람다(λ) 경쇄 불변 영역 또는 카파(κ) 경쇄 불변 영역인, 결합제.
45. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 경쇄 불변 영역은 카파(κ) 경쇄 불변 영역이고, 상기 제2 경쇄 불변 영역은 람다(λ) 경쇄 불변 영역이거나 또는 상기 제1 경쇄 불변 영역은 람다(λ) 경쇄 불변 영역이고, 상기 제2 경쇄 불변 영역은 카파(κ) 경쇄 불변 영역인, 결합제.
46. 항목 41-45 중 어느 한 항목에 있어서, 카파(κ) 경쇄는
a) SEQ ID NO: 27에 제시된 서열,
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단으로부터 시작하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 10개의 치환, 예를 들어 최대 9개의 치환, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개의 치환, 최대 3개, 최대 2개의 치환 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 결합제.
47. 항목 42-46 중 어느 한 항목에 있어서, 람다(λ) 경쇄는:
a) SEQ ID NO: 28에 제시된 서열,
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단으로부터 시작하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 N-로부터 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열 a)에 정의된 서열의 말단 또는 C-말단; 그리고
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 10개의 치환, 예를 들어 최대 9개의 치환, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개의 치환, 최대 3개, 최대 2개의 치환 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 결합제.
48. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 결합제는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택되는 이소형인, 결합제.
49. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 결합제는 전장 IgG1 항체인, 결합제.
50. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 결합제는 IgG1m(f) 동종이형의 항체인, 결합제.
51. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 대상체는 인간 대상체인, 결합제.
52. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서,, 종양 또는 암은 고형 종양 또는 암인, 결합제.
53. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 종양 또는 암은 흑색종, 난소암, 폐암(예를 들어, 비소세포폐암(NSCLC)), 대장암, 두경부암, 위암, 유방암, 신장암, 요로상피암, 방광암, 식도암, 췌장암, 간암, 흉선종 및 흉선암종, 뇌암, 신경교종, 부신피질암종, 갑상선암, 기타 피부암, 육종, 다발성 골수종, 백혈병, 림프종, 골수이형성증후군, 자궁내막암, 전립선암, 음경암, 자궁경부암, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 메르켈 세포 암종 및 중피종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 결합제.
54. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 종양 또는 암은 흑색종, 폐암, 대장암, 췌장암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 결합제.
55. 항목 53 또는 54에 있어서, 종양 또는 암은 흑색종, 예컨대 피부 흑색종 또는 말단 흑색종인, 결합제.
56. 항목 55에 있어서, 흑색종은 절제 불가능한 흑색종, 특히 절제 불가능한 III기 또는 IV기 흑색종인, 결합제.
57. 항목 55 또는 56에 있어서, 대상체는 체크포인트 억제제를 사용한 사전 치료를 받은 적이 없는 대상체인, 결합제.
58. 항목 55-57 중 어느 한 항목에 있어서, 대상체는 절제 불가능한 흑색종 또는 전이성 흑색종에 대한 전신 항암 치료를 사전에 받은 적이 없는, 결합제.
59. 항목 53 또는 54에 있어서, 종양 또는 암은 폐암, 특히 비소세포폐암(NSCLC), 예를 들어 편평 또는 비-편평 NSCLC인, 결합제.
60. 항목 59에 있어서, 폐암, 특히 NSCLC는 표피 성장 인자(EGFR)-감작 돌연변이 및/또는 역형성 림프종(ALK) 전위/ROS1 재배열을 갖지 않는, 결합제.
61. 항목 59 또는 60에 있어서, 폐암, 특히 NSCL는가 암 세포를 포함하고 PD-L1은 암 세포의 ≥1%에서 발현되는, 결합제.
62. 항목 59-61 중 어느 한 항목에 있어서, 대상체는 체크포인트 억제제를 사용한 사전 치료를 받지 않은 대상체인, 결합제.
63. 항목 53 또는 54에 있어서, 종양 또는 암은 두경부암, 특히 두경부 편평 세포 암종(HNSCC)인, 결합제.
64. 항목 63에 있어서, 대상체는 체크포인트 억제제를 사용한 사전 치료를 받은 적이 없는 대상체인, 결합제.
65. 항목 53 또는 54에 있어서, 종양 또는 암은 췌장암, 특히 췌장관 선암종(PDAC)인, 결합제.
66. 항목 65에 있어서, 대상체는 방사선요법, 수술, 화학요법 또는 조사 요법에 의한 전이성 질환의 사전 치료를 받은 적이 대상체인, 결합제.
67. 항목 65 또는 66에 있어서, 대상체는 체크포인트 억제제를 사용한 사전 치료를 받은 적이 없는 대상체인, 결합제.
68. 항목 53 또는 54에 있어서, 종양 또는 암은 대장암인, 결합제.
69. 항목 68에 있어서, 대상체는 체크포인트 억제제를 사용한 사전 치료를 받은 적이 없는 대상체인, 결합제.
70. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 결합제 및 체크포인트 억제제는 적어도 하나의 치료 사이클로 투여되고, 각 치료 사이클은 3주(21일)인, 결합제.
71. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 1회 용량의 결합제와 1회 용량의 체크포인트 억제제는 매 3주마다(1Q3W) 투여되는, 결합제.
72. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 1회 용량의 결합제와 1회 용량의 체크포인트 억제제는 각 치료 사이클의 제1일에 투여되는, 결합제.
73. 선행하는 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 방법은 상기 대상체에게 하나 이상의 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 결합제.
74. 항목 73에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제는 하나 이상의 화학요법제, 예컨대 백금계 화합물(예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴), 탁산계 화합물(예를 들어, 파클리탁셀 및 nab-파클리탁셀), 뉴클레오사이드 유사체(예컨대 5-플루오로우라실 및 젬시타빈), 및 이들의 조합(예컨대 시스플라틴/카보플라틴 + 5-플루오로우라실 또는 nab-파클리탁셀 + 젬시타빈)을 포함하는, 결합제.
75. 항목 73 또는 74에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제는 적어도 하나의 치료 사이클로 투여되고, 각 치료 사이클은 3주(21일)인, 결합제.
76. 항목 73-75 중 어느 한 항목에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제의 1회 용량은 적어도 1차 치료 사이클 동안 적어도 매 3주마다 1회(1Q3W), 예컨대 적어도 첫 번째 치료 사이클 동안 매 3주마다 2회(2Q3W) 투여되는 것인, 결합제.
77. 항목 73 내지 76 중 어느 한 항목에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제의 1회 용량은 적어도 1차 치료 사이클의 적어도 제1일에, 예컨대 적어도 1차 치료 사이클의 제1일과 제8일에 투여되는, 결합제.
78. ( i) CD40에 결합하는 제1 결합 영역 및 CD137에 결합하는 제2 결합 영역을 포함하는 결합제, (ii) 체크포인트 억제제, 및 선택적으로 (iii) 하나 이상의 추가 치료제를 포함하는, 키트.
79. 항목 78에 있어서, 결합제 및/또는 체크포인트 억제제 및/또는 하나 이상의 추가 치료제는 항목 1-50 및 74 중 어느 한 항목에 정의된 바와 같은, 키트.
80. 항목 78 또는 79에 있어서, 결합제, 체크포인트 억제제, 및 존재하는 경우 하나 이상의 추가 치료제는 전신 투여용, 특히 주사 또는 주입, 예컨대 정맥 주사 또는 주입용인, 키트.
81. 항목 78-80 중 어느 한 항목에 있어서, 대상체에서 종양의 진행을 감소 또는 예방하거나 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 키트.
82. 항목 81에 있어서, 종양 또는 암 및/또는 대상체 및/또는 방법은 항목 51-77 중 어느 한 항목에 정의된 바와 같은, 키트.
83. 대상체에서 종양의 진행을 감소 또는 예방하거나 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 체크포인트 억제제의 투여 전, 투여와 동시, 또는 투여 후에 결합제를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 결합제는 CD40에 결합하는 제1 결합 영역 및 CD137에 결합하는 제2 결합 영역을 포함하는, 방법.
84. 항목 83에 있어서, 종양 또는 암 및/또는 대상체 및/또는 방법 및/또는 결합제 및/또는 체크포인트 억제제는 항목 1-77 중 어느 한 항목에 정의된 바와 같은, 방법.
본 개시내용의 추가 측면이 본 명세서에 개시된다.
실시예
실시예 1: 동종이계 MLR 검정에서 IFNγ 분비에 대한 펨브롤리주맙과 조합된 bsIgG1-CD40x4-1BB 및 DuoBody-CD40x4-1BB의 효과
bsIgG1-CD40×4-1BB(Fc 활성) 또는 DuoBody-CD40×4-1BB(Fc 비활성)와 펨브롤리주맙의 조합이 단일 림프구 반응(MLR) 분석에서 단일 제제 활성에 비해 사이토카인 생산을 강화시킬 수 있는지 분석하기 위해, 인간 성숙 수지상 세포(mDC) 및 CD8+ T 세포의 5 가지 독특한 동종이계 쌍을 bsIgG1-CD40Х4-1BB 단독, DuoBody-CD40×4-1BB 단독, 펨브롤리주맙 단독 또는 bsIgG1-CD40Х4-1BB와 펨브롤리주맙의 조합, 또는 DuoBody-CD40×4-1BB와 펨브롤리주맙의 존재 하에 공동 배양하였다. 인터페론(IFN) γ 분비는 IFNγ-특이적 면역검정을 사용하여 공동배양물의 상등액에서 평가되었다.
방법
건강한 기증자의 단핵구 및 T 세포
CD14+ 단핵구 및 정제된 CD8+ T 세포는 Precision Medicine 또는 BioIVT에서 입수하였다. MLR 분석에는 동종이계 기증자 쌍이 사용되었다.
단핵구를 미성숙 수지상 세포로 분화
인간 CD14+ 단핵구는 건강한 기증자로부터 얻었다(상기 참조). 미성숙 수지상 세포(iDC)로의 분화를 위해, 1 - 1.5 x 106 개 단핵구/mL를, 10% 열 불활성화 소 태아 혈청(FBS; Gibco, 카탈로그 번호 16140071), 100 ng/mL 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF; BioLegend, 카탈로그 번호 766106) 및 300 ng/mL 인터루킨-4(IL-4; BioLegend, 카탈로그 번호 766206)가 T25 배양 플라스크(Falcon, 카탈로그 번호 353108)에 보충된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 완전 배지(ATCC 개질 포뮬러; ThermoFisher, 카탈로그 번호 A1049101)에서 37℃에서 6일 동안 배양하였다. 이 6일 동안 한 번, 배지를 보충제가 포함된 새로운 배지로 교체하였다.
iDC의 성숙
iDC를 성숙시키기 위해, 비부착성 세포를 수집하여 세포를 수확하고, 계수하고, 1 - 1.5 x 106 세포/mL로, 10% FBS, 100 ng/mL GM-CSF, 300 ng/mL IL-4 및 1x가 보충된 RPMI 1640 완전 배지에서 지질다당류(LPS; ThermoFisher, 카탈로그 번호 00-4976-93)와 함께 인큐베이션한 다음 37℃에서 혼합 림프구 반응(MLR) 분석을 개시하였다.
혼합 림프구 반응(MLR)
MLR 분석 시작 하루 전에, 건강한 동종이계 기증자로부터 얻은 정제된 CD8+ T 세포를 해동하였다. 세포를 10% FBS 및 10 ng/mL IL-2(BioLegend, 카탈로그 번호 589106)가 보충된 RPMI 1640 완전 배지에 1 x 106 세포/mL로 재현탁시키고 37℃에서 O/N 인큐베이션하였다.
다음날, LPS-성숙 수지상 세포(mDCs, Maturation of iDCs 참조) 및 동종이계의 정제된 CD8+ T 세포를 수확하고 AIM-V 배지(ThermoFisher, 카탈로그 번호 12055091)에 4 x 105 세포/mL 및 4 × 106 세포/mL로 각각 재현탁하였다.
공동 배양에서 20,000개의 mDC를 DuoBody-CD40Х4-1BB (0.001 - 30 μg/mL) 단독 또는 펨브롤리주맙 (0.1 - 30 μg/mL 또는 0.1 - 100 μg/mL; 임상 제품 펨브롤리주맙의 비임상/ 연구 등급 버전; Selleckchem, 카탈로그 번호 A2005)과의 조합, bsIgG1-CD40×4-1BB (0.001 - 30 μg/mL) 단독 또는 펨브롤리주맙(0.1 - 30 μg/mL)과의 조합, 펨브롤리주맙(0.1 - 30 μg/mL 또는 0.1 - 100 μg/mL), bsIgG1-CD40Хctrl (30 μg/mL), bsIgG1-ctrlХ4-1BB (30 μg/mL), IgG4 (100 μg/mL; Biolegend, cat. no. 403702), IgG1-ctrl-FEAL (30 μg/mL) 또는 IgG1-ctrl (0.001 - 30 μg/mL)의 존재 하에, 96웰 둥근 바닥 플레이트(Falcon, 카탈로그 번호 353227)의 AIM-V 배지 내 37℃에서 인큐베이션하였다. 5일 후, 플레이트를 500 x g에서 5분 동안 원심분리하고 상등액을 조심스럽게 각 웰에서 새로운 96웰 둥근 바닥 플레이트로 옮겼다.
MLR 분석에서 수집된 상등액을 제조사의 지침에 따라 Envision 기기에서 Alpha Lisa IFNγ 키트(Perkin Elmer, 카탈로그 번호 AL217)를 사용하여 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)으로 인터페론(IFN)γ 수준을 분석하였다.
항체
아래 나열된 항체는 IgG1,κ로 표현되었다. 해당되는 경우 GeneArt에서 유전자 합성을 통해 특정 돌연변이가 도입되었다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 상등액으로부터 항체를 정제하였다. 이중특이적 항체(DuoBody 분자)는 제어된 Fab-아암(arm) 교환에 의해 획득되었다(WO2011/131746). 간단히 말하면, CH3 도메인에 단일 일치점 돌연변이를 갖는 두 개의 모항체(하나는 F405L, 다른 하나는 K409R[EU 넘버링(Kabat, NIH 공개번호 91-3242, 5판, National Institutes of Public Health, Bethesda, MD, USA. 662, 680, 689)])를 별도로 제조, 혼합하고 제어된 환원 조건에 적용하였다. 환원은 분자의 사슬 간 이황화 결합을 분해하는 반면, 일치하는 CH3 도메인(F405L 및 K409R 포함)은 Fab 팔의 이종이량체화와 이중특이 분자의 형성을 유도한다. 이황화 결합의 후속 재산화는 일반 IgG1 구조를 갖는 매우 순수한 이중특이 항체 제제를 생성한다. IgG 농도는 280 nm에서의 흡광도로 측정되었다. 정제된 항체를 4℃에서 보관하였다.
결과
첫 번째 실험에서 BsIgG1-CD40×4-1BB는 5개 기증자 쌍의 IgG1-ctrl과 비교하여 정제된 CD8+ T 세포 및 동종이계 mDC의 공동 배양에서 IFNγ 분비를 증강시켰다 (도 2 및 3, 표 6 참조). bsIgG1-CD40×4-1BB 및 펨브롤리주맙에 대한 동시 노출은 bsIgG1-CD40×4-1BB 단독에 비해 IFNγ의 1.89 내지 2.73배 증가를 유도하였고 (도 2, 표 7), 펨브롤리주맙 단독에 비해 2.14 내지 3.09배 증가를 유도하였다(도 2, 표 8). 가장 높은 IFNγ 농도는 bsIgG1-CD40x4-1BB와 > 1 μg/mL 펨브롤리주맙의 조합으로 처리할 때 관찰되었다.
두 번째 실험에서 DuoBody-CD40×4-1BB는 IgG1-ctrl-FEAL 및 1가 대조군 항체 bsIgG1-CD40×ctrl 또는 bsIgG1-ctrl×4-1BB와 비교하여 정제된 CD8+ T 세포와 동종이계 mDC의 공동 배양에서 IFNγ 분비를 향상시켰다(도 4). DuoBody-CD40×4-1BB와 펨브롤리주맙에 대한 동시 노출은 테스트된 모든 농도에서 DuoBody-CD40×4-1BB 단독과 펨브롤리주맙 단독에 비해 IFNγ의 증가를 유도하였다(도 4). DuoBody-CD40×4-1BB를 0.1, 1, 10 또는 100 μg/mL 펨브롤리주맙과 조합했을 때 비슷한 수준의 IFNγ가 관찰되었다(도 4). DuoBody-CD40×4-1BB와 bsIgG1-CD40×4-1BB를 비교할 때, 두 이중특이 항체 모두 단독으로 또는 1 μg/mL 펨브롤리주맙과 조합시 비슷한 수준의 IFNγ를 유도하였다 (도 5).
결론
종합적으로, 이들 결과는 DuoBody-CD40×4-1BB 또는 bsIgG1-CD40×4-1BB를 펨브롤리주맙과 조합하면 성숙 DC/CD8+ T 세포 MLR 분석에서 IFNγ 분비를 증강시킨다는 것을 나타낸다. 이 데이터는 CD40 및 4-1BB 공동자극과 조합하여 PD-1/PD-L1 축의 표적화를 통해 면역 반응의 크기가 증폭될 수 있음을 시사한다.
실시예 2: 임상시험 설계
시험 설계
이는 고형 악성 종양이 있는 대상체를 대상으로 한 GEN1042의 인간 최초, 공개 라벨, 다기관 1/2상 시험이다. 임상시험은 GEN1042 단독요법 용량 증량(1a상), GEN1042 단독요법 확장(2a상), 병용요법 안전성 실행(1b상), 병용요법 확장(2상)의 4개 부분으로 구성된다.
단독요법(1a상)에 대한 용량 증량에서는 비중추신경계(CNS) 고형 악성 종양이 있는 대상체를 대상으로 GEN1042를 평가하여 MTD 또는 최대 투여 용량 및/또는 RP2D를 구한다. 1b상 안전성 실행에서는 아래에 자세히 설명되는 바와 같이, 선택된 종양 유형에서 1가지 이상의 치료법과 병용하여 용량 증량을 통해 GEN1042 단독요법 RP2D를 평가한다. 안전성 실행 중에 결정된 GEN1042의 RP2D는 2상에서 추가로 평가된다.
치료 일정
병용 요법을 위한 안전성 실행 - 1b상
"3+3" 설계는 1상 종양학 연구에 일반적이다. 이 시험의 조합 안전성 실행 부분은 "3+3" 설계를 따르므로 3명의 대상체에게 투여된 GEN1042 +/- 펨브롤리주맙 +/- 화학요법의 각 용량의 안전성을 평가한 후 추가 대상체를 동일항 용량 또는 다음 용량으로 치료한다. 대상체는 무작위로 배정되지 않는다; 이들은 대상체가 시험에 참여할 준비가 되었을 때 충원되는 코호트에 배정된다.
세부적으로, 안전성 조합 코호트는 GEN1042 + 펨브롤리주맙 또는 GEN1042 + 화학요법 +/- 펨브롤리주맙을 투여받게 된다. 1b상 등록은 용량 증량 부분(1a상)에서 GEN1042 단독요법의 RP2D가 결정된 이후부터 시작된다.
조합 안전성 실행 중에 세 가지 병렬 요법이 계획된다:
1. GEN1042 + 펨브롤리주맙 Q3W; PD, 과도한 독성, 동의 철회 또는 최대 35사이클(총 2년)까지 치료 지속
Figure pct00016
NSCLC(CPI-나이브, PD-L1 발현, 현지 실험실 테스트당 TPS ≥1%)
Figure pct00017
HNSCC(CPI-나이브, PD-L1 발현, 현지 실험실 테스트당 CPS ≥1)
Figure pct00018
흑색종(PD-L1 발현 여부에 관계없이 CPI-나이브)
2. 6 사이클 동안 GEN1042 + 펨브롤리주맙 + 시스-/카보플라틴 + 5-FU Q3W, 이어서 GEN1042 + 펨브롤리주맙 Q3W; PD, 과도한 독성, 동의 철회 또는 최대 추가 29 사이클(총 2년)까지 치료 지속
Figure pct00019
HNSCC(CPI-나이브, PD-L1 발현, 현지 실험실 테스트당 CPS ≥1)
3. PDAC(PD-L1 발현과 무관):
Figure pct00020
요법 3a: 총 8 사이클 동안 GEN1042 Q3W+ 젬시타빈 + nab-파클리탁셀 2Q3W
Figure pct00021
요법 3b: 8 사이클 동안 GEN1042 + 펨브롤리주맙 Q3W + 젬시타빈 + nab-파클리탁셀 2Q3W, 이어서 PD, 과도한 독성, 동의 철회 또는 최대 추가 27사이클(총 2년)까지 GEN1042 + 펨브롤리주맙 Q3W 치료 지속
상기 각각의 안전성 병용 요법은 3+3 용량 감소(dose de-escalation) 설계에 따라 평가될 것이다. 3-6명의 대상체로 구성된 코호트는 단계적으로 용량 감소 티어에 입력된다. GEN1042의 시작 용량은 요법 1, 2, 3a의 경우 100 mg 1Q3W(DL1)이다. 다음 용량 수준은 GEN1042 60 mg(DL2)이 될 것이다. 요법 3a를 통해 결정된 GEN1042의 용량은 요법 3b의 시작 용량이 된다. SOC 실행 후에는 승인된 용량의 펨브롤리주맙과 화학요법이 사용된다.
Figure pct00022
각 요법은 전술한 치료법(들)과 병용하여 요법 1, 2, 3a에 대해 1a상 RP2D GEN1042 용량(100 mg 1Q3W)을 사용하거나, 또는 요법 3b에 대해 요법 3a의 안전하고 허용 가능한 용량을 사용하여, 3명의 대상체를 대상으로 시작하여 테스트된다.
Figure pct00023
코호트의 3명의 대상체 중 어느 누구도 DLT를 경험하지 않으면 해당 요법은 안전한 것으로 간주되며 이 요법은 확장 아암에서 추가로 테스트된다.
Figure pct00024
처음 세 명의 대상체 중 한 명이 DLT를 경험하는 경우, 추가 세 명의 대상체가 동일한 용량 수준으로 치료된다. 6명의 대상체 중 최대 1명이 DLT를 경험한 경우, 해당 요법은 확장 아암으로 진행해도 안전한 것으로 간주된다.
Figure pct00025
3 내지 6명의 대상체로 구성된 코호트 중 적어도 2명의 대상체가 DLT를 경험하는 경우(즉, 해당 용량 수준에서 DLT를 경험한 대상체 ≥33%), 다음으로 낮은 용량 수준, 예를 들어 GEN1042 60 mg으로 용량을 줄인다.
Figure pct00026
요법 3의 목표는 펨브롤리주맙, 젬시타빈 및 nab-파클리탁셀과 조합 사용되는 GEN1042의 안전하고 허용가능한 용량을 확인하는 것이다.
용량 증량 부분에서 안전한 것으로 간주되는 최고 용량 수준(예컨대 300 mg, 30 mg 등) 미만의 용량도 조사자와 의뢰자 간의 합의에 따라 확장 아암에서 테스트될 수 있다. 허용 가능한 용량이 확인되지 않은 경우 안전성 실행 및 관련 확장 아암이 종료된다.
DLT는 각 대상체가 DLT 관찰 기간, 즉 각각 GEN1042 + 펨브롤리주맙의 경우 1 사이클(21일) 또는 GEN1042 + 화학요법 +/- 펨브롤리주맙의 경우 2 사이클(21일)을 완료한 후 평가된다. 병용 요법에 대한 GEN1042의 RP2D 결정은 DLT와 전반적인 안전성 프로파일, 항종양 활성, PK 및 가능한 경우 바이오마커 데이터를 고려하여 데이터 전체를 기반으로 결정된다.
확장 부문 - 병용 요법 코호트 - 2단계
병용요법 확장의 경우 1b상 병용 안전성 실행에서 결정된 선택된 RP2D GEN1042 용량을 아래와 같은 하나 이상의 치료제와 병용투여하게 된다. 병용 요법은 1L 치료 설정으로 투여된다. 4개 적응증에 5개 평행 암이 계획되어 있다.
병용요법 확장의 경우 아래 순서대로 치료가 진행된다: 펨브롤리주맙 주입을 먼저 투여한 뒤 GEN1042 투여, 이어서 SOC 화학요법 순으로 투여한다. 대상체 및 기관의 편의에 따라 약물 간 간격은 병용 용법의 모든 구성 요소의 시작 시간이 적절히 기록되는 한, 30분 내지 2시간(식사 시간, 짧은 산책, 주입 관련 반응 관리(IRR) 등) 범위일 수 있다.
이중특이 항-CD40 항-4-1BB(이하 GEN1042 또는 DuoBody-CD40x4-1BB로 지칭함)는 표 1에 기술된 인간화 VH 및 VL 서열, 인간 카파 경쇄 및 인간 IgG1 중쇄를 사용하여 생산되었다. CD40 결합 팔은 L234F, L235E, D265A 및 F405L(FEAL) 아미노산 돌연변이를 함유하는 인간 IgG1 중쇄를 사용하여 생산되었으며, 여기서 아미노산 위치 번호는 EU 넘버링(SEQ ID NO: 33에 상응)에 따른 것이다. CD137 결합 팔은 L234F, L235E, D265A 및 K409R(FEAR) 아미노산 돌연변이를 함유하는 인간 IgG1 중쇄를 사용하여 생산되었으며, 여기서 아미노산 위치 번호는 EU 넘버링(SEQ ID NO: 34에 상응)에 따른 것이다.
이중특이 IgG1 항체는 통제된 환원 조건 하에서 Fab-arm-교환에 의해 생성되었다. 이 방법의 기본은 WO2011/131746에 설명된 대로 특정 분석 조건 하에서 이종이량체의 형성을 촉진하는 상보적인 CH3 도메인을 사용하는 것이다. F405L 및 K409R(EU 넘버링) 돌연변이를 관련 항체에 도입하여 상보적인 CH3 도메인과 항체 쌍을 생성하였다.
이중특이 항체를 생성하기 위해, 각 항체의 최종 농도가 0.5 mg/ml인 2개의 모 상보성 항체를 75 mM 2-머캅토에틸아민-HCl(2-MEA)과 함께 31℃에서 5시간 동안 총 부피 100μL PBS에서 배양하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 스핀 컬럼(Microcon centrifugalfilters, 30k, Millipore)을 이용하여 환원제인 2-MEA를 제거하여 환원반응을 정지시켰다.
병용 요법의 포함 기준
대상체는 18세 이상이어야 하고; RECIST 1.1에 따라 측정 가능한 질병이 있으며; 기대 수명은 ≥ 3개월이고; ECOG(Eastern Cooperative Oncology Group) 성과 상태가 0-1이며; 적절한 장기, 골수, 간, 응고 및 신장 기능을 갖고; 항PD-1, 항PD-L1 또는 항프로그램화된 사멸 리간드 2 제제 또는 다른 자극성 또는 공동 억제 T 세포 수용체(예컨대 CTLA-4, OX-40, CD40 또는 4-1BB)에 대한 제제로 사전에 치료를 받은 적이 없어야 한다. 각 코호트에 대한 추가 기준은 다음과 같다.
● 흑색종
a. 미국 암 연합 위원회(AJCC: American Joint Co mMittee on Cancer, 버전 8) 병기 결정 시스템에 따라 조직학적으로 확인된 절제 불가능한 III기 또는 IV기 흑색종. 원발성 안구 또는 점막 흑색종은 제외된다.
b. 절제 불가능한 흑색종 또는 전이성 흑색종에 대한 전신 항암 치료는 사전에 수행된 바 없음.
c. 현지 표준 테스트(좋기로는 FDA 승인 테스트)에 따라 종양 BRAF 돌연변이 상태가 알려진 경우.
d. BRAF V600E 돌연변이 흑색종 환자의 경우 다음의 추가 기준을 충족해야 한다.
i. 젖산탈수소효소 < 국소 정상 상한치
ii. 조사자의 판단에 따라 임상적으로 유의한 종양 관련 증상이 없음
iii. 조사자의 판단에 따라 빠르게 진행되는 전이성 흑색종이 없음
● NSCLC
a. 진행성 또는 전이성 질환에 대한 1차 치료법으로 이전에 전신 항암 치료를 실시한 적이 없고, 조직학적으로 확인된 IV기 전이성 또는 재발성 NSCLC(AJCC 버전 8) 진단을 받은 상태임.
b. 종양에는 실행 가능한 EGFR 활성화 돌연변이 또는 ALK 전위가 없다. 주로 편평 조직학의 종양이 있는 것으로 알려진 대상체의 경우, 이것이 국소 SOC에 따른다면 EGFR 돌연변이 및 ALK 전위에 대한 분자 테스트는 필요하지 않다.
c. 종양은 국소 SOC 테스트(좋기로는 FDA 승인 테스트) 또는 중앙 실험실에서 결정된 면역조직화학(IHC)으로 평가했을 때 종양 세포의 ≥1%(TPS ≥1%)에서 PD-L1 발현을 나타낸다. 확장 단계에서는 중앙 실험실 테스트가 의무화된다.
● HNSCC
a. 국소 치료법으로는 치료가 불가능한 것으로 간주되는, 조직학적 또는 세포학적으로 확인된 재발성 또는 전이성 HNSCC.
b. 대상체는 재발성 또는 전이성 환경에서 이전에 전신 치료를 받은 적이 없어야 한다. 국소 진행성 질환에 대한 복합 치료의 일부로 제공되는 경우 동의서 서명 전 6개월 이상 전에 완료된 전신 치료는 허용된다.
c. 적합한 원발 종양 위치는 구인두, 구강, 하인두 및 후두이다.
d. 대상체는 비인두의 원발성 종양 부위(모든 조직학)를 갖고 있어서는 안 된다.
e. 종양 PD-L1 IHC CPS가 국소당 1개 이상(FDA 승인 테스트 선호) 또는 중앙 실험실 테스트(확장 단계에서는 중앙 테스트가 필수)여야 한다.
f. 구인두 질환이 있는 참가자의 경우 현지 SOC별로 인유두종바이러스(HPV) p16 테스트 결과를 확인할 수 있다. 참고: 구강암, 하인두암, 후두암은 일반적으로 이러한 종양 위치가 HPV 음성으로 간주되므로 p16 IHC에 의한 HPV 검사를 받을 필요가 없다.
● PDAC
a. 조직학적 또는 세포학적으로 확인된 전이성 췌장 선암종. 췌장 내분비암은 제외된다.
b. BRCA 1/2 또는 PALB2 돌연변이와 같은 실행 가능한 유전자 변경이 없다.
c. 이전에 방사선 요법, 수술, 화학 요법 또는 전이성 질환 치료를 위한 연구 요법을 받은 적이 없다.
d. 대상체가 보조/신보조 요법 및/또는 국소 진행성 질환에 대한 요법(방사선 요법과 병용 또는 비전이성 췌장암에 대한 화학 요법)을 받은 경우, 모든 독성은 기준선 또는 1등급 이하로 회복되어야 한다.
결과
1/2상 GCT1042-01 시험의 단일요법 용량 증량 부분에서 표준 치료 요법을 모두 소진한 전이성 또는 절제 불가능한 비중추신경계(CNS) 고형 종양을 가진 대상체 50명을 0.1 mg 내지 400 mg Q3W 범위의 용량으로 치료하였다. 용량 증량 부분에서 치료를 받은 대상체 50명 중 2명은 RECIST v1.1에 따라 확인된 부분 반응(4.0%)을 나타냈으며, 여기에는 신경내분비 폐암종 환자 1명과 흑색종 환자 1명이 포함되었다. 질병 통제는 대상체의 50%에서 달성되었다. 질병 통제는 RECIST v1.1에 따라 완전, 부분 및 안정 질병의 전반적 반응이 가장 좋은 것으로 정의되었다.
용량 증량 부분 이후, 사전 치료를 많이 받은 체크포인트 후 억제제(CPI) NSCLC 및 흑색종 대상체에 대한 추가 평가를 위해 100 mg Q3W가 선택되었다. 치료받은 22명의 CPI 이후(post-CPI) NSCLC 대상자 중 9명(40.9%)이 안정 질환에 대한 최상의 반응을 달성하였다. CPI 이후 NSCLC 코호트에서 확증 또는 부분 반응을 경험한 대상체는 없었으며, RECIST v1.1에 따라 6명의 대상체(27.3%)는 반응을 평가할 수 없었다. 22년 5월 21일 데이터 마감 시점에, GEN1042 Q3W 100 mg으로 치료받은 CPI 이후 흑색종 단독요법 확장 코호트 중 대상체 1명의 반응을 평가할 수 있었다. 대상체는 안정 질병에 대한 최상의 전반적 반응을 달성하였다.
용량 증량 부분 이후, GEN1042 100 mg Q3W를 펨브롤리주맙 200 mg Q3W와 조합하여 연구하였다. 2022년 5월 21일 데이터 마감 기준으로, 전이성 질환에 대한 이전 전신 항암 치료 경험이 없는, 전이성 흑색종, NSCLC 또는 HNSCC 환자 총 10명이 시험에 등록되었다. 치료받은 모든 대상체의 RECIST v1.1에 따른 객관적 반응률(ORR)은 40%(4/10)였다. 2명의 대상체는 완전 반응을 경험하였고, 2명의 대상체는 부분 반응을 경험하였다. 질병 통제는 대상체의 70%에서 달성되었으며 RECIST v1.1에 따라 완전, 부분 및 안정 질병의 최상의 전반적 반응을 갖는 것으로 정의되었다.
실시예 3: 동종이계 MLR 검정에서 IFNγ 분비에 대한 니볼루맙과 조합된 bsIgG1-CD40x4-1BB의 효과
bsIgG1-CD40x4-1BB(Fc 활성)와 니볼루맙의 조합이 단일 제제 활성과 비교하여 사이토카인 생산의 강화를 초래할 수 있는지 분석하기 위해, 인간의 성숙한 수지상 세포(mDC) 및 CD8+ T 세포의 동종이계 한 쌍의 공동배양물을 bsIgG1-CD40x4-1BB 단독, 니볼루맙 단독 또는 두 항체의 조합 존재 하에 배양하는 동종이계 MLR 분석을 수행하였다. IFNγ 분비는 IFNγ-특이적 면역검정을 사용하여 공동배양물의 상등액에서 평가되었다.
방법
건강한 기증자의 단핵구 및 T 세포
CD14+ 단핵구 및 정제된 CD8+ T 세포룰 Precision Medicine 또는 BioIVT에서 입수하였다. MLR 분석에는 동종이계 기증자 쌍이 사용되었다.
단핵구를 미성숙 수지상 세포로 분화
인간 CD14+ 단핵구는 건강한 기증자로부터 얻었다. 미성숙 수지상 세포(iDC)로의 분화를 위해, 1 - 1.5 x 106 개 단핵구/mL를, 10% 열 불활성화 소 태아 혈청(FBS; Gibco, 카탈로그 번호 16140071), 100 ng/mL 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF; BioLegend, 카탈로그 번호 766106) 및 300 ng/mL 인터루킨-4(IL-4; BioLegend, 카탈로그 번호 766206)가 T25 배양 플라스크(Falcon, 카탈로그 번호 353108)에 보충된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 완전 배지(ATCC 개질 포뮬러; ThermoFisher, 카탈로그 번호 A1049101)에서 37℃에서 6일 동안 배양하였다. 이 6일 동안 한 번, 배지를 보충제가 포함된 새로운 배지로 교체하였다.
iDC의 성숙
iDC를 성숙시키기 위해, 비부착성 세포를 수집하여 세포를 수확하고, 계수하고, 1 - 1.5 x 106 세포/mL로, 10% FBS, 100 ng/mL GM-CSF, 300 ng/mL IL-4 및 1x가 보충된 RPMI 1640 완전 배지에서 지질다당류(LPS; ThermoFisher, 카탈로그 번호 00-4976-93)와 함께 인큐베이션한 다음 37℃에서 혼합 림프구 반응(MLR) 분석을 개시하였다.
혼합 림프구 반응(MLR)
MLR 분석 시작 하루 전에, 건강한 동종이계 기증자로부터 얻은 정제된 CD8+ T 세포를 해동하였다. 세포를 10% FBS 및 10 ng/mL IL-2(BioLegend, 카탈로그 번호 589106)가 보충된 RPMI 1640 완전 배지에 1 x 106 세포/mL로 재현탁시키고 37℃에서 O/N 인큐베이션하였다.
다음날, LPS-성숙 수지상 세포(mDCs, Maturation of iDCs 참조) 및 동종이계의 정제된 CD8+ T 세포를 수확하고 AIM-V 배지(ThermoFisher, 카탈로그 번호 12055091)에 4 x 105 세포/mL 및 4 × 106 세포/mL로 각각 재현탁하였다.
공동배양물에서, 20,000개의 mDC를 bsIgG1-CD40×4-1BB(0.001 - 10 μg/mL) 단독 또는 니볼루맙 MDX-1106(0.0005 - 5 μg/mL) 및 IgG1-ctrl (0.001 - 10 μg/mL)과의 조합의 존재하에, 96웰 둥근 바닥 플레이트(Falcon, 카탈로그 번호 353227)의 AIM-V 배지 내 37℃에서 인큐베이션하였다. 5일 후, 플레이트를 500 x g에서 5분 동안 원심분리하고 상등액을 조심스럽게 각 웰에서 새로운 96웰 둥근 바닥 플레이트로 옮겼다.
MLR 분석에서 수집된 상등액을 제조사의 지침에 따라 Envision 기기에서 Alpha Lisa IFNγ 키트(Perkin Elmer, 카탈로그 번호 AL217)를 사용하여 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)으로 인터페론(IFN)γ 수준을 분석하였다.
결과
BsIgG1-CD40×4-1BB는 IgG1-ctrl과 비교하여 정제된 CD8+ T 세포와 동종이계 mDC의 공동배양에서 IFNγ 분비를 향상시켰다 (도 6 참조). bsIgG1-CD40×4-1BB 및 0.05-5 μg/mL 니볼루맙(IgG1-PD1-MDX1106-FEAL, α-PD1)에 대한 동시 노출은 bsIgG1-CD40×4-1BB 단독 또는 니볼루맙 단독에 비해 IFNγ의 용량 의존적 증가를 유도하였다 (도 6).
결론　
이 데이터는 항PD1 항체를 CD40 및 4-1BB 공동자극과 조합 사용함으로써 PD-1/PD-L1 축의 표적화를 통해 면역 반응의 규모가 증폭될 수 있음을 시사한다.
실시예 4: 동종이계 MLR 분석에서 IFNγ 분비에 대한 IgG1-PD1과 조합된 DuoBody-CD40x4-1BB의 효과
DuoBody-CD40×4-1BB와 IgG1-PD1(IgG1 이소타입의 Fc 불활성 항PD-1 모노클로날 항체)의 조합이 단일 제제 활성에 비해 혼합 림프구 반응(MLR) 분석에서 사이토카인 생산을 강화시킬 수 있는지 분석하기 위해, 인간 성숙 수지상 세포(mDC)와 CD8+ T 세포의 두 가지 독특한 동종이계 쌍을 DuoBody-CD40×4-1BB 단독, IgG1-PD1 단독 또는 두 항체의 조합 존재 하에 공동 배양하였다. IFNγ 분비는 IFNγ- 특이적 면역검정을 사용하여 공동배양물의 상등액에서 평가되었다.
방법
건강한 기증자의 단핵구 및 T 세포
CD14+ 단핵구 및 정제도니 CD8+ T 세포를 BioIVT에서 얻었다. MLR 검정을 위해 두 개의 고유한 동종 기증자 쌍이 사용되었다.
단핵구를 미성숙 수지상 세포로 분화
인간 CD14+ 단핵구는 건강한 기증자로부터 얻었다. 미성숙 수지상 세포(iDC)로의 분화를 위해, 1 - 1.5 x 106 개 단핵구/mL를, 10% 열 불활성화 소 태아 혈청(FBS; Gibco, 카탈로그 번호 16140071), 100 ng/mL 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF; BioLegend, 카탈로그 번호 766106) 및 300 ng/mL 인터루킨-4(IL-4; BioLegend, 카탈로그 번호 766206)가 T25 배양 플라스크(Falcon, 카탈로그 번호 353108)에 보충된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 완전 배지(ATCC 개질 포뮬러; ThermoFisher, 카탈로그 번호 A1049101)에서 37℃에서 6일 동안 배양하였다. 4일 후, 배지를 새로운 배지와 보충제로 교체하였다.
iDC를 mDC로 분화
MLR 분석을 시작하기 전에, 비부착성 세포를 수집하여 iDC를 수확하고 10% FBS, 100 ng/mL GM-CSF, 300 ng/mL IL-4 및 5μg / mL 지질다당류(LPS; ThermoFisher, 카탈로그 번호 00-4976-93)가 보충된 RPMI 1640 완전 배지에서 37℃에서 24시간 동안 1 - 1.5 x 106 세포/mL로 배양하여 성숙한 DC(mDC)로 분화시켰다.
혼합 림프구 반응(MLR)
MLR 분석 시작 하루 전에, 건강한 동종이계 기증자로부터 얻은 정제된 CD8+ T 세포를 해동하였다. 세포를 10% FBS 및 10 ng/mL IL-2(BioLegend, 카탈로그 번호 589106)가 보충된 RPMI 1640 완전 배지에 1 x 106 세포/mL로 재현탁시키고 37℃에서 O/N 인큐베이션하였다.
다음날, LPS-성숙 수지상 세포(mDCs, Maturation of iDCs 참조) 및 동종이계의 정제된 CD8+ T 세포를 수확하고 AIM-V 배지(ThermoFisher, 카탈로그 번호 12055091)에 4 x 105 세포/mL 및 4 × 106 세포/mL로 각각 재현탁하였다.
공동배양물은 1:10의 DC:T 세포 비율로 접종되었으며(이는 200,000개의 동종이계 정제된 CD8+ T 세포와 함께 배양된 20,000개의 mDC에 해당함), 단일 제제로서 IgG1-PD1(0.001 - 100 μg/mL), 단일 제제로서 DuoBody-CD40×4-1BB(0.001 - 30 μg/mL), 또는 96웰 둥근 바닥 플레이트(Falcon, 카탈로그 번호 353227) 내 AIM-V 배지에서 7×7 조합의 용량-반응 매트릭스에 대응하게 조합된 두 제제 모두의 존재 하에, 37℃에서 5일 동안 배양하였다. IgG1-ctrl-FERR(100 μg/mL), bsIgG1-CD40×ctrl(30 μg/mL), bsIgG1-ctrl×4-1BB(30 μg/mL) 및 IgG1-ctrl-FEAL(30 μg/mL)로 처리된 공동배양물이 대조군으로서 포함되었다. 5일 후, 플레이트를 500 x g에서 5분 동안 원심분리하고 상등액을 조심스럽게 각 웰에서 새로운 96웰 둥근 바닥 플레이트로 옮겼다.
MLR 분석에서 수집된 상등액을 제조사의 지침에 따라 Envision 기기에서 Alpha Lisa IFNγ 키트(Perkin Elmer, 카탈로그 번호 AL217)를 사용하여 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)으로 IFNγ 수준을 분석하였다.
시너지 분석
시너지 분석에서 데이터는 각 기증자 쌍에 대해 별도로 처리되었다. 각 처리 조건에서 IFNγ(μg/mL)의 농도는 대조군 값(무처리 대조군 웰)을 빼서 정규화하고 분석(IFNγ 유도)에서 최대 값의 백분율로 표시하였다. IFNγ 유도 값은 두 번의 반복 실험의 평균을 나타낸다. 결합된 두 항체 간의 상호작용은 R(v 4.1.0)에서 SynergyFinder 패키지(v 3.2.2; Zheng et al., 2021 bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.06.01.446564)를 사용하여 분석하였다. 시너지 효과는 2개의 참조 모델(시너지 점수 모델): 최고 단일 제제(HSA; Berenbaum, 1989 Pharmacol Rev. 41: 93-141) 및 Bliss(Bliss, 1939 Annals of Applied Biol. 26:585-615)에 의해 계산된 예상 효과에 대한 관찰된 효과의 초과로 규정하였다.
결과 및 결론
DuoBody-CD40x4-1BB 또는 IgG1-PD1 단독 처리는 MLR 분석에서 IFNγ의 분비를 향상시켰다; DuoBody-CD40×4-1BB와 1μg/mL IgG1-PD1의 조합은 단일 제제 활성에 비해 IFNγ 분비를 더욱 증강시켰다(도 7). 두 개의 고유 기증자 쌍 모두에 대해 DuoBody-CD40×4-1BB 및 IgG1-PD1을 사용한 조합 치료는 Bliss 및 HSA 시너지 점수 모델을 사용하여 결정된 대로 다양한 농도 조합에 걸쳐 시너지 효과를 가져왔다(도 8).
실시예 5: T 세포 증식 및 사이토카인 분비를 증강시키는 DuoBody-CD40x4-1BB와 조합된 IgG1-PD1의 능력을 결정하기 위한 항원-특이 자극 분석
T 세포 증식 및 사이토카인 생산에 대한 DuoBody-CD40x4-1BB 및 IgG1-PD1의 조합 효과를 단일 제제 활성과 비교하여 확인하기 위해, PD-1 과발현 인간 CD8+ T 세포 및 동족 항원 발현 미성숙 수지상 세포(iDC)의 공동배양물을 사용하여 항원-특이 자극 분석을 수행하였다.
방법
세포 단리 및 단핵구의 미성숙 수지상 세포로의 분화
HLA-A*02+ 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 건강한 기증자(Transfusionszentrale, University Hospital, Mainz, Germany) 로부터 입수하였다. 제조사의 지침에 따라 항-CD14 MicroBeads (Miltenyi; 카탈로그 번호 130-050-201)를 사용하여 자기 활성화 세포 분류(MACS) 기술을 통해 PBMC로부터 단핵구를 분리하였다. 말초 혈액 림프구(PBL, CD14 음성 분획)를 T 세포 분리를 위해 냉동보존하였다. iDC로의 분화를 위해 5% 풀링된 인간 혈청(One Lambda Inc., 카탈로그 번호 A25761), 1 mM 피루브산 나트륨(Life Technologies GmbH, 카탈로그 번호 11360-039), 1x 비필수 아미노산(Life Technologies GmbH, 카탈로그 번호 11140-035), 200 ng/mL 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF; Miltenyi, 카탈로그 번호 130-093-868) 및 200 ng/mL 인터루킨-4(IL-4; Miltenyi, 카탈로그 번호 130-093-924)이 포함된 RPMI 1640(Life Technologies GmbH, 카탈로그 번호 61870-010)에서 1 x 106 단핵구/mL를 5일 동안 배양하였다. 3일째에는 배지의 절반을 보충제가 포함된 새로운 배지로 교체하였다. 비부착성 세포를 수집하여 iDC를 수확하고 2 mM EDTA가 포함된 Dulbecco 인산염 완충 식염수(DPBS)와 함께 37℃에서 10분간 배양하여 부착성 세포를 분리하였다. DPBS로 세척한 후 iDC를 향후 항원 특이적 T 세포 분석에 사용하기 위해 10% DMSO(AppliChem GmbH, 카탈로그 번호 A3672,0050)가 포함된 FBS(Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호 F7524)에서 냉동보존하였다.
iDC 및 CD8+ T 세포의 전기천공 및 CFSE 표지
항원 특이적 CD8+ T 세포 자극 분석을 시작하기 하루 전에, 동일한 기증자의 냉동 PBL 및 iDC를 해동하였다. CD8+ T 세포는 제조사의 지침에 따라 항-CD8 MicroBeads (Miltenyi, 카탈로그 번호 130-045-201)를 사용하여 MACS 기술에 의해 PBL로부터 분리되었다. 약 10 x 106 내지 15 x 106 CD8+ T 세포를 250μL X-Vivo15 배지(Lonza, 카탈로그 번호 BE02-060Q)에서 10μg의 인간 클라우딘-6(CLDN6; HLA-A*02 제한, WO 2015150327 A1에 설명됨)에 특이적인 쥐 TCR의 알파 및 베타 사슬을 인코딩하는 시험관내 전사된(IVT)-RNA 및 인간 PD-1(UniProt Q15116)을 인코딩하는 10μg IVT-RNA으로 전기천공하였다. 세포를 4 mm-전기천공 큐벳(VWR International GmbH, 카탈로그 번호 732-0023)으로 옮기고 BTX ECM® 830 전기천공 시스템(BTX; 500V, 3ms 펄스)을 사용하여 전기천공하였다. 전기천공 직후, 세포를 5% 풀링된 인간 혈청을 함유하는 새로운 IMDM GlutaMAX 배지(Life Technologies GmbH, 카탈로그 번호 319800-030)로 옮기고 37℃, 5% CO2에서 적어도 1시간 동안 방치하였다. 제조사의 지침에 따라 PBS 중 0.8 μM 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE; Life Technologies GmbH, 카탈로그 번호 V12883)를 사용하여 T 세포를 표지하고 5% 인간 AB 혈청이 보충된 IMDM 배지에서 밤새 인큐베이션하였다.
최대 5 x 106개의 해동된 iDC를 위에서 설명한 전기천공 시스템(300V, 12ms 펄스)을 사용하여 250μL X-Vivo15 배지에서 전장 인간 CLDN6(WO 2015150327 A1)을 인코딩하는 2μg IVT-RNA로 전기천공 하고, 5% 풀링된 인간 혈청이 보충된 IMDM 배지에서 밤새 배양하였다.
다음날 세포를 수확하였다. iDC에서 CLDN6의 세포 표면 발현뿐만 아니라 T 세포에서 CLDN6-특이적 TCR 및 PD-1의 세포 표면 발현을 유세포 분석법으로 확인하였다. 이를 위해 iDC를 형광 표지된 CLDN6 특이적 항체(비상업적, 자체 생산)로 염색하였다. T 세포는 브릴리언트 바이올렛(BV)421-접합 항-마우스 TCR-β 사슬 항체(Becton Dickinson GmbH, 카탈로그 번호 562839) 및 알로피코시아닌(APC)-접합 항-인간 PD-1 항체(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 17-2799-42)로 염색하였다.
항원 특이적 시험관내 T 세포 자극 분석
전기천공된 iDC를 IgG1-PD1(0.8 μg/mL), 펨브롤리주맙(Keytruda®, Merck Sharp & Dohme GmbH, PZN 10749897)(0.8μg), 또는 음성 대조군 항체 IgG1-ctrl-FERR(0.8 μg/mL) 단독 또는 DuoBody-CD40×4-1BB(0.0022, 0.0067 또는 0.2 μg/mL)와의 조합의 존재 하에, 96웰 둥근 바닥 플레이트 내 5% 풀링된 인간 혈청을 함유하는 IMDM 배지에서, 전기천공된 CFSE 표지 T 세포와 함께 1:10의 비율로 배양하였다. 배양 4일 후, 세포를 APC-접합 항-인간 CD8 항체로 염색하였다. BD FACSCelesta™ 유세포 분석기(Becton Dickinson GmbH)를 사용하여 CD8+ T 세포에서 CFSE 희석의 유세포 분석을 통해 T 세포 증식을 평가하였다.
유세포 분석 데이터를 FlowJo 소프트웨어 버전 10.7.1을 사용하여 분석하였다. FlowJo의 증식 모델링 도구를 사용하여 CD8+ T 세포의 CFSE 표지 희석을 평가하고 통합 공식을 사용하여 확장 지수를 계산하였다.
사이토카인 농도의 결정
4일 후 T 세포/iDC 공동배양물에서 수집한 상등액 중 사이토카인 농도를 제조사의 프로토콜에 따라 10종의 인간 사이토카인 (GM-CSF, IL-2, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, 인터페론 [IFN]γ, IFNγ-유도성 단백질 [IP]-10 [C-X-C 모티프 케모카인 리간드 10으로도 알려짐], 대식세포 화학유인 단백질[MCP]1, 및 종양 괴사 인자[TNF]α; Meso Scale Discovery, cat. No. K15067L-2) 패널 검출을 위해 맞춤형 U-Plex 바이오마커 그룹 1(인간) 분석을 사용하여 다중 전기화학발광 면역분석법으로 구하였다.
결과
IgG1-PD1과 DuoBody-CD40×4-1BB의 병용 치료는 비결합 대조군 항체 IgG1-ctrl-FERR과 결합된 DuoBody-CD40×4-1BB에 비해, 그리고 단일 요법으로서 IgG1-PD1에 비해, CD8+ T 세포 증식을 증강시켰다(도 9). 두 가지 단일 제제 치료 모두에 비해, 고농도의 DuoBody-CD40x4-1BB(0.2 μg/mL)를 병용 치료에서 사용한 경우 증식이 증가한 것으로 나타났다. IgG1-PD1과 저농도(0.0022 μg/mL) 또는 중간 농도 (0.0067 μg/mL)의 DuoBody-CD40x4-1BB의 조합은 IgG1-PD1 단독에 비해 증식에 대한 영향이 최소화되거나 전혀 없었다. 펨브롤리주맙과 고농도의 DuoBody-CD40×4-1BB의 병용 치료도 단일 제제로서의 두 화합물에 비해 증식을 향상시켰다.
IgG1-PD1과 DuoBody-CD40×4-1BB의 병용 치료는 IgG1-ctrl과 병용된 DuoBody-CD40×4-1BB에 비해, 그리고 단일 요법으로서 IgG1-PD1에 비해, 전염증성 사이토카인 GM-CSF, IFNγ, IL-13 및 TNFα의 분비를 향상시켰다(도 10). 두 가지 단일 제제 치료에 비해, 고농도의 DuoBody-CD40×4-1BB(0.2 μg/mL)를 병용 치료에 사용한 경우 사이토카인 분비가 증가한 것으로 나타났다. IgG1-PD1과 낮은 농도(0.0022 μg/mL) 또는 중간 농도(0.0067 μg/mL)의 DuoBody-CD40×4-1BB와의 조합은 IgG1-PD1 단독에 비해 사이토카인 분비에 최소한의 영향을 미치거나 전혀 영향을 미치지 않았다. 펨브롤리주맙과 고농도의 DuoBody-CD40×4-1BB의 병용 치료 역시도 단일제제인 두 화합물에 비해 사이토카인 분비를 향상시켰다. 시험된 다른 사이토카인의 분비는 단일 제제 치료에 비해 일관되게 향상되지 않았거나, 향상되지 않았다.
실시예 6: IgG1-PD1의 생성 및 스크리닝 물질
PD-1 및 FcγR 구조물
다양한 전장 PD-1 변이체를 인코딩하는 플라스미드를 생성하였다: 인간(호모 사피엔스; UniProtKB ID: Q15116), 시노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스; UniProtKB ID: B0LAJ3), 개(카니스 파밀리아리스; UniProtKB ID: E2RPS2), 토끼(오릭톨라구스 쿠닝쿨루스; UniProtKB ID: G1SUF0), 돼지(수스 스크로파; UniProtKB ID: A0A287A1C3), 쥐(라투스 노르베지쿠스; UniProtKB ID: D3ZIN8) 및 마우스(무스 무스쿨루스; UniProtKB ID: Q02242), 및 인간 FcγRIa를 인코딩하는 플라스미드 (UniProt KB ID: P12314).
전장 PD-1 또는 FcγR 변이체를 일시적으로 발현하는 CHO-S 세포주의 생성
CHO-S 세포(현탁 성장에 적합한 CHO 세포의 서브클론, ThermoFisher Scientific, 카탈로그 번호 R800-07)를 제조사 지침에 따라 FreeStyleTM MAX Reagent (ThermoFisher Scientific, cat. no. 16447100) 및 OptiPRO ™ 무혈청 배지(ThermoFisher Scientific, 카탈로그 번호 12309019)를 사용하여 PD-1 또는 FcγR 플라스미드로 형질감염시켰다.
항체 변이체 생산
IgG1-PD1
3마리의 뉴질랜드 백색 토끼를 재조합 인간 His-태그된 PD-1 단백질(R&D Systems, 카탈로그 번호 8986-PD)로 면역화시켰다. 혈액의 단일 B 세포를 분류하고 인간 PD-1 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 세포성 인간 PD-1 결합 분석 및 인간 PD-1/PD-L1 차단 생물검정에 의해, 상등액을 PD-1 특이적 항체 생산에 대해 스크리닝하였다. 스크리닝 양성 B 세포로부터 RNA를 추출하고 서열분석을 수행하였다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 유전자 합성하여 돌연변이 L234A 및 L235A(LALA)를 포함하는 인간 면역글로불린 불변 부분(IgG1/κ)의 N-말단에 클로닝하여(여기서 아미노산 위치 번호는 EU 넘버링(SEQ ID NO: 70)에 따름) Fcγ 수용체와의 상호작용을 최소화한다.
293-무형질감염 시약 (Novagen /Merck)을 사용하여 HEK293-FreeStyle 세포의 일시적인 형질감염을 Tecan Freedom Evo 장치로 실행하였다. 생성된 키메라 항체는 플레이트 자동샘플러가 장착된 Dionex Ultimate 3000 HPLC에서 단백질-A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 세포 상등액으로부터 정제되었다. 정제된 항체는 추가 분석, 특히 인간 PD-1 ELISA, 세포성 인간 PD-1 결합 검정, 인간 PD-1/PD-L1 차단 생물검정 및 T 세포 증식 검정에 의한 재시험에 사용되었다. 키메라 토끼 항체 MAB-19-0202 (SEQ ID NO: 71 및 72)가 가장 성능이 좋은 클론으로 확인되었으며 후속적으로 인간화시켰다.
키메라 PD-1 항체 MAB-19-0202의 가변 영역 서열을 다음 표에 나타내었다. 표 14는 중쇄의 가변영역을 나타내고, 표 15는 경쇄의 가변영역을 나타낸다. 두 경우 모두 Kabat 넘버링에 따라 프레임 영역(FR)과 상보성 결정 영역(CDR)이 정의된다. 밑줄 친 아미노산은 IMGT 넘버링에 따른 CDR을 나타낸다. 굵은 글자는 Kabat 및IMGT 넘버링의 교차점을 나타낸다.
재조합 인간화 서열의 항체 ID에 대한 인간화 경쇄 및 중쇄의 할당을 표 16에 나타내었다. 인간화 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 서열은 표 17 및 18에 기재되어 있다. 표 17은 중쇄의 가변 영역을 나타내고, 표 18은 경쇄의 가변 영역을 보여준다. 두 경우 모두 Kabat 넘버링에 따라 프레임 영역(FR)과 상보성 결정 영역(CDR)이 정의된다. 밑줄 친 아미노산은 IMGT 넘버링에 따른 CDR을 나타낸다.
MAB-19-0618의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 서열을 유전자 합성하고 결찰 독립적 클로닝(LIC)에 의해, Fc-침묵 돌연변이 L234F, L235E 및 G236R(FER)을 함유하는 인간 IgG1m(f) 중쇄 불변 도메인(여기서 아미노산 위치 번호는 EU 넘버링에 따름)(SEQ ID NO: 61) 및 인간 카파 경쇄 불변 도메인(SEQ ID NO: 27)을 인코딩하는 코돈 최적화된 서열을 갖는 발현 벡터로 클로닝하였다. 생성된 항체를 IgG1-PD1로 지칭한다.
GS Xceed® 발현 시스템(Lonza)을 사용하여 IgG1-PD1을 발현하는 안정적인 세포주를 생성하였다. IgG1-PD1의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 서열을 각각 Lonza Biologics plc에 의해 발현 벡터 pXC-18.4 및 pXC -Kappa(글루타민 합성효소[GS] 유전자 함유)에 클로닝하였다. 다음으로, 중쇄 벡터의 완전한 발현 카세트를 경쇄 벡터에 연결하여 IgG1-PD1의 중쇄 및 경쇄 두 가지 모두를 인코딩하는 이중 유전자 벡터(DGV)를 구축하였다. 이 DGV의 DNA를 제한효소 PvuI-HF(New England Biolabs, R3150L) 로 선형화하고 CHOK1SV® GS-KO® 세포의 안정적인 형질감염을 위해 사용하였다. 기능적 특성화를 위해 IgG1-PD1을 정제하였다.
IgG1-CD52-E430G
CAMPATH-1H, CD52-특이 항체와 동일한 항원-결합 도메인 및 Fc 도메인(SEQ ID NO: 73)에 E430G 육량체화-강화 돌연변이(WO 2013/004842 A2)가 있는 인간 IgG1 항체를, C1q 결합 실험에서 양성 대조군으로 사용하였다(Crowe et al., 1992 Clin Exp Immunol. 87(1):105-110) (SEQ ID NO. 74 및 75).
대조군 항체
HIV1 gp120-특이적 항체인 b12와 동일한 항원 결합 도메인을 갖는 인간 IgG1 항체를 여러 실험에서 음성 대조군으로 사용하였다(Barbas et al., J Mol Biol. 1993 Apr 5;230(3):812-2). b12의 VH 및 VL 도메인(SEQ ID NO: 59 및 60)을 드 노보 유전자 합성(GeneArt Gene Synesis; ThermoFisher Scientific, Germany)에 의해 제조하고, 인간 IgG1m(f) 알로타입의 인간 IgG1 중쇄 불변 영역(즉, CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역)(SEQ ID NO: 29) 또는 그의 변이체(L234F/L235E/G236R 돌연변이 및 본 연구와 관련하여 기능적으로 무관한 추가적인 K409R 돌연변이를 함유함, FERR 돌연변이로 약칭됨)(SEQ ID NO: 62)를 함유하거나, 또는 인간 카파 경쇄(LC)의 불변 영역(SEQ ID NO: 27)을 함유하는 발현 벡터 내로, 선택된 결합 도메인에 따라 적절하게 클로닝하였다. 생산 세포주에서 중쇄 및 경쇄 발현 벡터를 형질감염시켜 항체를 얻고 이를 기능적 특성화를 위해 정제하였다.
실시예 7: 다양한 종으로부터의 PD-1에 대한 IgG1-PD1의 결합
비임상 독성 연구에 일반적으로 사용되는 종의 PD-1에 대한 IgG1-PD1의 결합을 다양한 동물 종의 PD-1을 일시적으로 발현하는 CHO-S 세포를 사용하는 유세포 분석에 의해 평가하였다.
CHO-S 세포(5 x 104 세포/웰)를 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 접종하였다. IgG1-PD1, IgG1-ctrl-FERR 및 펨브롤리주맙의 항체 희석액(1.7 Х 10-4 - 30 μg/mL 또는 5.6　Х　10-5　-　10　μg/mL, 3배 희석)을 Genmab (GMB) 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충액(0.1%[w/v] 소 혈청 알부민[BSA: Roche, cat. no. 10735086001] 및 0.02% [w/v] 아지드화 나트륨 [NaN3, bioWORLD, 카탈로그 번호 41920044-3]이 보충된 인산염 완충 식염수[PBS; Lonza, 카탈로그 번호 BE17-517Q, 증류수에서 1 x PBS로 희석)]에서 제조하였다. 펨브롤리주맙에 대한 IgG4 이소형 대조군(BioLegend, 카탈로그 번호 403702)은 테스트된 최고 농도(30 μg/mL 또는 10 μg/mL)에만 포함되었다. 세포를 원심분리하고, 상등액을 제거하고, 세포를 50 μL의 항체 희석액에서 30분 동안 4℃에서 배양하였다. 세포를 GMB FACS 완충액으로 2회 세척하고 50μL 2차 항체 R-피코에리트린(PE)-접합 염소-항-인간 IgG F(ab')2 (Jackson I mMunoResearch, 카탈로그 번호 109-116-098; GMB FACS 완충액으로 1:500으로 희석)와 함께, 4℃에서 30분간, 차광 상태로 인큐베이션하였다. 세포를 GMB FACS 완충액으로 2회 세척하고, 2 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA; Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호 03690) 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 생존 마커(1:5,000; BD Pharmingen, cat. no. 564907)가 보충된 GMB FACS 완충액에 재현탁시켰다. 생존 가능한 세포(DAPI 제외로 식별됨)에 대한 항체 결합을 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 Intellicyt® iQue PLUS Screener (Intellicyt Corporation)로 유세포 분석하였다. GraphPad Prism에서 비선형 회귀 분석(4개 매개변수 용량-반응 곡선 적합)을 사용하여 결합 곡선을 분석하였다.
다양한 종의 PD-1에 대한 IgG1-PD1의 결합은 세포 표면에서 인간, 시노몰구스 원숭이, 개, 토끼, 돼지, 래트 또는 마우스 PD-1 단백질을 발현하도록 일시적으로 형질감염된 CHO-S 세포를 사용하여 유세포 분석법으로 평가하였다. 인간 및 사이노몰구스 원숭이 PD-1에 대해 IgG1-PD1의 용량 의존적 결합이 관찰되었다(도 11A-B). 펨브롤리주맙은 비슷한 결합을 보여주었다. 실질적으로 감소된 IgG1-PD1의 교차 반응성, 및 가장 높은 농도에서만 설치류 PD-1(마우스, 래트; 도 11C-D)에서 관찰되었으며 독성학 연구에서 자주 사용되는 다른 종(토끼, 개, 돼지; 도 11E)의 PD-1에 대한 결합은 관찰되지 않았다. 형질감염되지 않은 대조군 세포에서는 IgG1-PD1 결합이 관찰되지 않았으며(도 11E), 음성 대조군으로 포함된 IgG1-ctrl-FERR의 결합도 테스트된 종 중 임의의 PD-1에 대해 관찰되지 않았다(도 11).
결론적으로, IgG1-PD1은 막 발현 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD-1에 대해 비슷한 결합을 나타냈고, 마우스, 래트, 토끼, 개 및 돼지 PD-1에 대해서는 결합이 현저히 낮거나 전혀 없는 것으로 나타났다.
실시예 8: 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD-1에 대한 결합
Biacore 8K SPR 시스템을 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)으로 분석하였다. C-말단 His-태그가 있는 재조합 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD-1 세포외 도메인(ECD)은 Sino Biological(각각 카탈로그 번호 HPLC 10377-H08H 및 90311-C08H)에서 구입하였다.
Biacore 시리즈 S 센서 칩 CM5(Cytiva, 카탈로그 번호 29149603)는 제조사의 지침에 따라 아민 커플링 및 Human Antibody Capture Kit, Type 2(Cytiva, 카탈로그 번호 BR100050 및 BR100839)를 사용하여 항 Fc 항체로 공유 코팅되었다.
이어서, HBS-EP+ 완충액(Cytiva, 카탈로그 번호 BR100669; 증류수에 1X로 희석됨[B Braun, 카탈로그 번호 00182479E])에 희석된 IgG1-PD1(2nM), 니볼루맙(Bristol-Myers Squibb, lot no. ABP6534; 1.25 nM) 및 펨브롤리주맙(Merck Sharp & Dohme, lot. no. T019263; 1.25 nM)을, 유속 10μL/분으로 25℃에서 60초 동안 표면에 포획시켰다. 이로 인해 약 50개의 공명 단위(RU) 수준이 포획되었다.
HBS-EP+ 완충액의 3회 시작 주기 후, 인간 또는 시노몰구스 원숭이 PD-1 ECD 샘플(0.19 - 200nM, HBS-EP+ 완충액에서 2배 희석, 12 사이클)을 주입하여 결합 곡선을 생성하였다. 항체 코팅 표면(활성 표면)에서 분석된 각 샘플은 배경 보정에 사용된 항체가 없는 평행 유동 셀(기준 표면)에서도 분석되었다.
각 사이클의 마지막에, 10 mM 글리신-HCl pH 1.5(Cytiva, 카탈로그 번호 BR100354)를 사용하여 표면을 재생하였다. 데이터는 Biacore Insight Evaluation 소프트웨어(Cytiva)에서 미리 정의된 "포획을 사용한 다중 사이클 동역학" 평가 방법을 사용하여 분석되었다. 인간 또는 시노몰구스 원숭이 PD-1(200nM)의 농도가 가장 높은 샘플은 데이터의 더 나은 곡선 맞춤을 허용하기 위해 분석에서 제외되었다.
고정화된 IgG1-PD1은 1.45 ± 0.05 nM의 결합 친화도(K D)로 인간 PD-1 ECD에 결합하였다(표 19). 니볼루맙 및 펨브롤리주맙은 IgG1-PD1의 K D에 필적하는 결합 친화도로, 즉 낮은 나노몰 범위(각각 4.43 ± 0.08 nM 및 3.59 ± 0.10 nM)의 K D 값으로 인간 PD-1 ECD에 결합하였다(표 19).
고정화된 IgG1-PD1은 2.74 ± 0.58 nM의 K D로 시노몰구스 원숭이 PD-1 ECD에 결합했으며 (표 20), 이는 인간 PD-1에 대한 IgG1-PD1의 친화도에 필적한다. 니볼루맙과 펨브롤리주맙은 시노몰구스 원숭이 PD-1 ECD에 대해 IgG1-PD1의 시노몰구스 원숭이 PD-1 ECD에 대한 K D에 필적하고 볼루맙과 펨브롤리주맙의 인간 PD-1 ECD에 대한 K D와에 필적하는 결합 친화도, 즉, 낮은 나노몰 범위(각각 2.93 ± 0.58 nM 및 0.90 ± 0.06 nM)의 KD 값으로 결합하였다(표 20).
실시예 9: PD-1 리간드 결합 및 PD-1/PD-L1 신호전달에 대한 IgG1-PD1의 효과
IgG1-PD1이 고전적인 면역 체크포인트 억제제로 기능하는지 확인하기 위해, PD-1 리간드 결합 및 PD-1 체크포인트 기능을 방해하는 IgG1-PD1의 능력을 시험관내에서 평가하였다.
재조합 인간 PD-L1 및 PD-L2와 막 발현 인간 PD-1에 대한 IgG1-PD1의 경쟁적 결합을 유세포 분석법으로 평가하였다. 인간 PD-1로 일시적으로 형질감염된 CHO-S 세포(실시예 6 참조; 5 x 104 세포/웰)를 둥근 바닥 96-웰 플레이트(Greiner, 카탈로그 번호 650180)의 웰에 첨가하고, 펠렛화하고, 얼음 위에 놓았다. PBS(Cytiva, 카탈로그 번호 SH3A3830.03)에 희석된 비오틴화된 재조합 인간 PD-L1(R&D Systems, 카탈로그 번호 AVI156) 또는 PD-L2(R&D Systems, 카탈로그 번호 AVI1224)를 세포에 첨가하고(최종 농도: 1μg / mL), 그 직후 PBS에 희석된 농도 범위의 IgG1-PD1, 펨브롤리주맙(MSD, 로트 번호 T019263 및 T036998) 또는 IgG1-ctrl-FERR을 첨가하였다(최종 농도: 3배 희석 단계에서 30μg/mL - 0.5 ng/mL). 이어서, 세포를 실온에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 50 μL 스트렙타비딘-알로피코시아닌(R&D Systems, 카탈로그 번호 F0050, PBS에서 1:20으로 희석)과 함께 30분 동안 4℃에서 배양하고 차광하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 20μL GMB FACS 완충액에 재현탁시켰다. 스트렙타비딘-알로피코시아닌 결합은 Intellicyt ®FlowJo 소프트웨어를 사용하여 iQue Screener PLUS(Sartorius)에서 유세포 분석으로 분석하였다.
PD-1과 PD-L1의 기능적 상호작용에 대한 IgG1-PD1의 효과는 본질적으로 제조사의 설명에 따라 생물발광 세포 기반 PD-1/PD-L1 차단 리포터 분석(Promega, 카탈로그 번호 J1255)을 사용하여 구하였다. 간략히 설명하면, PD-L1 aAPC /CHO-K1 세포 및 PD-1 이펙터 세포의 공동배양물을 연속 희석된 IgG1-PD1, 펨브롤리주맙(MSD, 로트 번호 10749880 또는 T019263), 니볼루맙(Bristol-Myers Squibb, 로트 번호 11024601) 또는 IgG1-ctrl-FERR(최종 분석 농도: 3배 희석에서 15 - 0.0008 μg/mL 또는 5배 희석에서 10 - 0.0032μg / mL)와 함께, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 재구성된 Bio-Glo™와 함께 실온에서 5 - 30분 동안 배양한 후 Infinite® F200 PRO Reader(Tecan) 또는 EnVision Multilabel Plate Reader(PerkinElmer)를 사용하여 발광(상대 광 단위[RLU])을 측정하였다.
용량-반응 곡선은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀 분석(4개 매개변수 용량-반응 곡선 적합)으로 분석하고 최대(억제) 효과의 50%가 관찰되는 농도(EC50/IC50)를 적합 곡선에서 도출하였다.
IgG1-PD1은 용량 의존적 방식으로 인간 PD-L1 및 PD-L2와 막 발현 인간 PD-1의 결합을 방해했으며(도 12), IC50 값은 PD-L1 결합 억제의 경우 2.059 ± 0.653 μg/mL(13.9 ± 4.4 nM), 그리고 PD-L2 결합 억제의 경우 1.659 ± 0.721 μg/mL (11.2 ± 4.9 nM), 즉 나노몰 범위 였다 (표 21). 펨브롤리주맙은 유사한 강도, 즉 나노몰 범위의 IC50 값으로 PD-L1 및 PD-L2 결합 억제를 나타냈다.
PD-1/PD-L1 축의 기능적 차단은 세포 기반 생물발광 PD-1/PD-L1 차단 리포터 분석을 사용하여 테스트되었다. 인간 PD-1을 발현하고 NFAT-RE 구동 루시퍼라제를 보유하는 리포터 Jurkat T 세포와 인간 PD-L1 및 항원 독립적인 TCR 활성화제를 발현하는 PD-L1 aAPC/CHOK1 세포의 공동배양물을, 연속 희석 농도의 IgG1-PD1, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙의 존재 및 부재 하에서 배양하였다. IgG1-ctrl-FERR은 음성 대조군으로 포함되었다. PD-1/PD-L1 상호작용의 차단은 PD1/PDL1 매개 억제 신호의 방출을 초래하여 TCR 활성화 및 NFAT-RE 매개 루시퍼라제 발현(발광 측정)을 유도한다. IgG1-PD1은 PD-1+ 리포터 T 세포에서 TCR 신호전달의 용량 의존적 증가를 유도하였다 (도 13). EC50은 0.165 ± 0.056 μg/mL(1.12 ± 0.38 nM; 표 22)였다. 펨브롤리주맙은 0.129 ± 0.051 μg/mL (0.86 ± 0.34 nM)의 EC50 으로, 즉 필적할 만한 강도로 PD-1 매개 TCR 신호 억제를 유사하게 완화하였다. 니볼루맙은 0.479 ± 0.198 μg/mL (3.28 ± 1.36 nM)의 EC50 으로, 즉 약간 더 낮은 강도로 TCR 신호전달의 억제를 완화하였다.
요약하면, IgG1-PD1은 PD-1 리간드 결합을 차단하고 PD-1 면역 체크포인트 기능을 방해함으로써 시험관내에서 고전적인 면역 체크포인트 억제제 역할을 한다.
실시예 10: 활성화된 T 세포의 증식을 향상시키는 IgG1-PD1의 능력을 결정하기 위한 항원 특이적 증식 분석
T-세포 증식을 향상시키는 IgG1-PD1의 능력을 결정하기 위해, PD-1-과발현 인간 CD8 + T 세포를 사용하여 항원-특이적 증식 분석을 수행하였다.
HLA-A*02+ 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 건강한 기증자(Transfusionszentrale, University Hospital, Mainz, Germany) 로부터 입수하였다. 제조사의 지침에 따라 항-CD14 MicroBeads (Miltenyi; 카탈로그 번호 130-050-201)를 사용하여 자기 활성화 세포 분류(MACS) 기술을 통해 PBMC로부터 단핵구를 분리하였다. 말초 혈액 림프구(PBL, CD14 음성 분획)를 T 세포 분리를 위해 냉동보존하였다. 미성숙 DC(iDC)로의 분화를 위해 5% 풀링된 인간 혈청(One Lambda Inc., 카탈로그 번호 A25761), 1 mM 피루브산 나트륨(Life Technologies GmbH, 카탈로그 번호 11360-039), 1x 비필수 아미노산(Life Technologies GmbH, 카탈로그 번호 11140-035), 100 IU/mL 페니실린-스트렙토마이신 (Life Technologies GmbH, cat. no. 15140-122), 100 ng/mL 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF; Miltenyi, 카탈로그 번호 130-093-868) 및 50 ng/mL 인터루킨-4(IL-4; Miltenyi, 카탈로그 번호 130-093-924)이 포함된 RPMI 1640(Life Technologies GmbH, 카탈로그 번호 61870-010)에서 1 x 106 단핵구/mL를 5일 동안 배양하였다. 이 5일 동안 한 번, 배지의 절반을 새로운 배지로 교체하였다. 비부착성 세포를 수집하여 iDC를 수확하고 2 mM EDTA가 포함된 Dulbecco 인산염 완충 식염수(DPBS)와 함께 37℃에서 10분간 배양하여 부착성 세포를 분리하였다. DPBS로 세척한 후 iDC를 향후 항원 특이적 T 세포 분석에 사용하기 위해 10% DMSO(AppliChem GmbH, 카탈로그 번호 A3672,0050) 및 10% 인간 알부민(CSL Behring, PZN 00504775)이 포함된 RPMI 1640에 냉동보존하였다.
항원 특이적 CD8+ T 세포 증식 검정을 시작하기 하루 전에, 동일한 기증자로부터의 동결된 PBL 및 iDC를 해동시켰다. 제조사의 지침에 따라 항-CD8 MicroBeads (Miltenyi, 카탈로그 번호 130-045-201)를 사용하여 MACS 기술에 의해 CD8+ T 세포를 PBL로부터 분리하였다. 약 10×106 내지 15×106개의 CD8+ T 세포를 250 μL X-Vivo15 배지 (Lonza, cat. no. BE02-060Q)에서, 인간 클라우딘-6(CLDN6; HLA-A*02 제한, WO 2015/150327 A1에 설명됨)에 특이적인 쥐의 TCRdml 알파 및 베타 사슬을 인코딩하는 시험관내 번역된 10μg의 (IVT)-RNA 및 PD-1(UniProt Q15116)을 인코딩하는 10μg IVT-RNA로 전기천공하였다. 세포를 4 mm 전기천공 큐벳(VWR International GmbH, 카탈로그 번호 732-0023)으로 옮기고 BTX ECM® 830 전기천공 시스템(BTX; 500V, 1x3ms 펄스)을 사용하여 전기천공하였다. 전기천공 직후, 세포를 5% 풀링된 인간 혈청을 함유하는 새로운 IMDM GlutaMAX 배지(Life Technologies GmbH, 카탈로그 번호 319800-030)로 옮기고 37℃, 5% CO2에서 적어도 1시간 동안 방치하였다. 제조사의 지침에 따라 PBS 중 1.6 μM 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE; Life Technologies GmbH, 카탈로그 번호 V12883)를 사용하여 T 세포를 표지하고 5% 인간 AB 혈청이 보충된 IMDM 배지에서 밤새 인큐베이션하였다.
최대 5 x 106개의 해동된 iDC를 위에서 설명한 전기천공 시스템(300V, 1x12 ms 펄스)을 사용하여 250μL X-Vivo15 배지에서 전장 인간 CLDN6(WO 2015/150327 A1)을 인코딩하는 2μg IVT-RNA로 전기천공하고, 5% 풀링된 인간 혈청이 보충된 IMDM 배지에서 밤새 인큐베이션하였다.
다음날 세포를 수확하였다. iDC에서 CLDN6의 세포 표면 발현뿐만 아니라 T 세포에서 CLDN6-특이적 TCR 및 PD-1의 세포 표면 발현을 유세포 분석법으로 확인하였다. 이를 위해 iDC를 DyLight650이 결합된 CLDN6 특이 항체(비상업적, 자체 생산)로 염색하였다. T 세포는 브릴리언트 바이올렛(BV)421-접합 항-마우스 TCR-β 사슬 항체(Becton Dickinson GmbH, 카탈로그 번호 562839) 및 알로피코시아닌(APC)-접합 항-인간 PD-1 항체(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 17-2799-42)로 염색하였다.
전기천공된 iDC를 96웰 둥근 바닥 플레이트 내 5% 풀링된 인간 혈청을 함유한 IMDM 배지에서 4배 연속 희석(0.00005~0.8μg/mL 범위)의 IgG1-PD1, 펨브롤리주맙(Keytruda®, MSD Sharp & Dohme GmbH, PZN 10749897) 또는 니볼루맙(Opdivo®, Bristol-174; Myers Squibb, PZN 11024601)의 존재 하에 1:10의 비율로 전기천공된 CFSE 표지 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 음성 대조군 항체 IgG1-ctrl-FERR은 0.8μg/ mL의 단일 농도로 사용되었다. 4일 배양 후, 세포를 APC-접합 항-인간 CD8 항체로 염색하였다. T 세포 증식은 BD FACSCelesta™ 유세포 분석기(Becton Dickinson GmbH)를 사용하여 CD8+ T 세포에서 CFSE 희석의 유세포 분석에 의해 평가되었다.
유세포 분석 데이터는 FlowJo 소프트웨어 버전 10.7.1을 사용하여 분석되었다. FlowJo의 증식 모델링 도구를 사용하여 CD8+ T 세포의 CFSE 표지 희석을 평가하고 통합 공식을 사용하여 확장 지수를 계산하였다. 4-매개변수 로그 맞춤을 사용하여 GraphPad Prism 버전 9(GraphPad Software, Inc.)에서 용량-반응 곡선을 생성하였다. GraphPad Prism 버전 9를 사용한 Friedman의 테스트와 Dunn의 다중 비교 테스트를 통해 통계적 유의성을 구하였다.
CD8+ T 세포의 항원-특이적 증식은 IgG1-PD1에 의해 용량 의존적 방식으로 강화되었으며(도 14), EC50 값은 피코몰 범위(표 23)였다. 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙을 사용한 치료도 용량 의존적으로 T 세포 증식을 향상시켰다. 펨브롤리주맙의 평균 EC50은 IgG1-PD1과 비슷한 반면, 니볼루맙의 EC50은 IgG1-PD1보다 상당히 높았다(P=0.0267).
실시예 11: 동종이계 MLR 검정에서 사이토카인 분비에 대한 IgG1-PD1의 효과
혼합 림프구 반응(MLR) 분석에서 사이토카인 분비를 향상시키는 IgG1-PD1의 능력을 조사하기 위해, 인간 성숙 수지상 세포(mDC)와 CD8+ T 세포의 3개의 독특한 동종이계 쌍을 IgG1-PD1의 존재 하에 공동배양하였다. IFNγ의 수준은 IFNγ- 특이적 면역분석법을 사용하여 측정한 반면, 단핵구 화학유인 단백질-1(MCP-1), GM-CSF, 인터루킨(IL)-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL12-p40, IL-15, IL-17α 및 종양 괴사 인자(TNFα)는 맞춤형 Luminex 다중 면역분석법을 사용하여 구하였다.
인간 CD14+ 단핵구는 건강한 기증자(BioIVT)로부터 얻었다. 미성숙 수지상 세포(iDC)로의 분화를 위해 단핵구를 10% 열 불활성화 소 태아 혈청(FBS, Gibco, 카탈로그 번호 16140071), 100 ng/mL GM-CSF 및 300 ng/mL IL-4(BioLegend, 카탈로그 번호 766206))이 보충된 RPMI-1640 완전 배지(ATCC 변형 포뮬러, Thermo Fisher, 카탈로그 번호 A1049101)에서 37℃에서 6일 동안 배양하였다. 4일째에는 배지를 보충제가 포함된 새로운 배지로 교체하였다. iDC를 성숙시키기 위해 MLR 분석 시작 전 24시간 동안, 세포를 10% FBS, 100 ng/mL GM-CSF, 300 ng/mL IL-4 및 5 μg/mL 지질다당류(LPS; Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 00 4976 93)이 보충된 RPMI-1640 완전 배지에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 이와 동시에, 동종이계의 건강한 기증자(BioIVT)로부터 얻은 정제된 CD8+ T 세포를 해동하고 37℃ O/N에서 10% FBS 및 10 ng/mL IL-2(BioLegend, 카탈로그 번호 589106)가 보충된 RPMI-1640 완전 배지에서 배양하였다.
다음날, LPS-성숙 수지상 세포(mDC) 및 동종이계 CD8 + T 세포를 수확하고 이들을 미리 예열된 AIM-V 배지(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 12055091)에 각각 4 x 105 세포/mL 및 4 × 106 세포/mL로 재현탁하였다. mDC (20,000개 세포/웰)를 항체 농도 범위(0.001 - 30 μg/mL)의 IgG1-PD1, IgG1-ctrl-FERR 또는 펨브롤리주맙(MSD, 카탈로그 번호 T019263)의 존재 하에 또는 30 μg/mL IgG4 이소형 대조군(BioLegend, 카탈로그 번호 403702)의 존재 하에, 37℃에서 96웰 둥근 바닥 플레이트의 AIM-V 배지에서 동종이계의 나이브 CD8+ T 세포(200,000개 세포/웰)와 함께 배양하였다.
5일 후, 무세포 상등액을 각 웰에서 새로운 96웰 플레이트로 옮기고 사이토카인 농도를 추가로 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
IFNγ 수준은 제조사의 지침에 따라 Envision 기기에서 IFNγ 특이적 면역검정(Alpha Lisa IFNγ 키트; Perkin Elmer, 카탈로그 번호 AL217)을 사용하여 결정되었다.
MCP-1, GM-CSF, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL12-p40, IL-15, IL-17α 및 TNF의 수준을 Human TH17 Magnetic Bead Panel(MILLIPLEX®)을 기반으로 하는 맞춤형 Luminex® 다중 면역분석법(Millipore, 주문 번호 SPR1526)을 사용하여 구하였다. 간략히 설명하면, 무세포 상등액을 해동시키고, 1X 세척 완충액으로 미리 세척한 384웰 플레이트(Greiner Bio-One, 카탈로그 번호 781096)의 웰 내의 10μL 분석 완충액에 각 샘플 10μL를 첨가하였다. 동시에, 분석 완충액 중 표품 또는 대조군 10μL를 웰에 첨가한 후, 분석 배지 10μL를 첨가하였다. 서로 다른 사이토카인에 대한 자성 비드를 혼합하고 Bead Diluent에 1X 농도로 희석한 후 10 μL의 혼합 비드를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 4℃에서 O/N 진탕하면서 배양하였다. 웰을 60μL 1X 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 이어서, 10 μL의 맞춤형 검출 항체를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 배양하였다. 다음으로, 10 μL의 스트렙타비딘-PE를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고 실온에서 진탕하면서 30분 동안 배양하였다. 위에서 설명한 대로 웰을 60μL 1X 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 실온에서 5분 동안 진탕하여 비드를 75μL Luminex Sheath Fluid에 재현탁시켰다. 샘플은 Luminex FlexMap 3D 시스템에서 실행되었다.
MLR 분석의 시작과 끝에서 CD8+ T 세포에서 PD-1의 발현과 mDC에서 PD-L1의 발현을 PE-Cy7-접합 항PD-1(BioLegend, 카탈로그 번호 329918; 1:20), 알로피코시아닌-접합 항PD-L1(BioLegend, 카탈로그 번호 329708; 1:80), BUV496-접합 항-CD3(BD Biosciences, 카탈로그 번호 612940; 1:20) 및 BUV395-접합 항-CD8(BD Biosciences, 카탈로그 번호 563795; 1:20)을 사용하여 유세포 분석으로 확인하였다.
IgG1-PD1은 용량 의존적 방식으로 IFNγ의 분비를 지속적으로 향상시켰다(도 15). IgG1-PD1은 또한 MCP-1, GM-CSF, IL-2, IL-6, IL-12p40, IL-17α, IL-10 및 TNFα의 분비를 향상시켰다 (도 16). 펨브롤리주맙은 사이토카인 분비에 비슷한 효과를 나타냈다.
실시예 12: IgG1-PD1에 대한 C1q 결합 평가
불변 중쇄 영역에 FER Fc-침묵 돌연변이를 보유하는 IgG1-PD1에 대한 보체 단백질 C1q의 결합을 활성화된 인간 CD8 + T 세포를 사용하여 평가하였다. 양성 대조군으로서, IgG1-CD52-E430G가 포함되었는데, 이는 CD52 항체 CAMPATH-1H를 기반으로 하는 VH 및 VL 도메인을 갖고 세포 표면에 결합될 때 C1q에 효율적으로 결합하는 것으로 알려진 Fc 강화 백본을 갖는다. 비결합 음성 대조군 항체로는 IgG1-ctrl-FERR 및 IgG1-ctrl이 포함되었다.
RosetteSep™ Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail(Stemcell Technologies, 카탈로그 번호 15023C.2)을 사용하는 음성 선택 또는 CD8 MicroBeads (Miltenyi Biotec, cat. no. 130-045-201) 및 LS 컬럼 (Miltenyi Biotec, cat. no. 130-042-401)을 사용하는 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 통한 양성 선택에 의해, 건강한 지원자(Sanquin)로부터 얻은 연막(buffy coat)으로부터 인간 CD8+ T 세포를 정제(농축)하되, 모두 제조사 지침에 따랐다. 정제된 T 세포를 T 세포 배지(철분 함유 10% 열 불활성화 기증자 소 혈청 [DBSI; Gibco, 카탈로그 번호 20731-030] 및 페니실린/스트렙토마이신 [pen/strep; Lonza, 카탈로그 번호 DE17-603E]이 보충되고, 25 mM HEPES 및 L-글루타민[Lonza, 카탈로그 번호 BE12-115F]를 갖는 Roswell Park Memorial Institute [RPMI]-1640 배지)에 재현탁시켰다.
항-CD3/CD28 비드(Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28; ThermoFisher Scientific, 카탈로그 번호 11132D)를 PBS로 세척하고 T 세포 배지에 재현탁시켰다. 비드를 농축된 인간 CD8+ T 세포에 1:1 비율로 첨가 하고 37℃, 5% CO2에서 48 시간 배양하였다. 다음으로, 자석을 이용하여 비드를 제거하고, 세포를 PBS로 2회 세척한 후 다시 계수하였다.
활성화된 CD8+ T 세포에서의 PD-1 발현은 IgG1-PD1(30 μg/mL) 및 R-피코에리트린(PE)-접합 염소-항-인간 IgG F(ab')2(GMB FACS 완충액에 1:200으로 희석됨; Jackson I mMunoResearch, 카탈로그 번호 109-116-098), 또는 상업용 PE-접합 PD-1 항체(BioLegend, 카탈로그 번호 329906; 1:50 희석)를 사용하여 유세포 분석으로 확인하였다.
활성화된 CD8+ T 세포를 둥근 바닥 96웰 플레이트(30,000 또는 50,000개 세포/웰)에 접종하고, 펠릿화한 다음, 30μL 분석 배지(25 mM HEPES 및 L-글루타민을 함유하고 0.1% [w/v] 소 혈청 알부민 분획 V [BSA; Roche, 카탈로그 번호 10735086001] 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640)에 재현탁 하였다. 이어서, 50 μL의 IgG1-PD1, IgG1-ctrl-FERR, IgG1-CD52-E430G 또는 IgG1-ctrl(분석 배지의 3배 희석 단계에서 최종 농도 1.7 × 10-4 - 30 μg/mL))를 각 웰에 첨가하고 항체가 세포에 결합할 수 있도록 37℃에서 15분 동안 배양하였다.
C1q 공급원인 인간 혈청(20μL/웰; Sanquin, lot 20L15-02)을 최종 농도 20%로 첨가하였다. 세포를 얼음 위에서 45분간 배양한 후 차가운 GMB FACS 완충액으로 2회 세척하고 알로피코시아닌-접합 마우스-항-CD8(BD Biosciences, 카탈로그 번호 555369; GMB FACS 완충액에서 1:50 희석)의 존재 또는 부재 하에, 50μL 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-접합된 토끼 항-인간 C1q(최종 농도 20μg/mL [DAKO, 카탈로그 번호 F0254]; GMB FACS 완충액에서 1:75 희석)와 함께 4℃ 암실에서 30분간 인큐베이션하였다. 세포를 차가운 GMB FACS 완충액으로 2회 세척하고, 2 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA; Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호 03690) 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 생존 염료(1:5,000; BD Pharmingen, 카탈로그 번호 564907)이 보충된 20μL의 GMB FACS 완충액에 재현탁시켰다. 생존 가능한 세포(DAPI 배제에 의해 확인됨)에 대한 C1q 결합은 IntelliCyt® iQue Screener PLUS(Sartorius) 또는 iQue3(Sartorius)에서 유세포 분석으로 분석되었다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀 분석(가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응)을 사용하여 결합 곡선을 분석하였다.
용량 의존적 C1q 결합이 막 결합 IgG1-CD52-E430G에 대해 관찰된 반면, 막 결합 IgG1-PD1 또는 비결합 대조군 항체에 대해서는 C1q 결합이 관찰되지 않았다(도 17).
이러한 결과는 IgG1-PD1의 기능적으로 불활성인 백본이 C1q에 결합하지 않음을 나타낸다.
실시예 13: SPR에 의해 측정된 Fcγ 수용체에 대한 IgG1-PD1의 결합
고정된 FcγRs (FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIIIa)에 대한 IgG1-PD1의 결합을 SPR에 의해 시험관내에서 평가하였다. FcγRIIa (H131 및 R131) 및 FcγRIIIa (V158 및 F158)에 대해 두 다형성 변이체가 모두 포함되었다. FcγR 결합에 대한 양성 대조군으로서 야생형 Fc 영역을 갖는 IgG1-ctrl이 포함되었다.
첫 번째 실험에서는 고정된 인간 재조합 FcγR 변이체(Fc γ RIa, FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIIIa)에 대한 IgG1-PD1 또는 IgG1-ctrl의 결합을 Biacore 8K SPR 시스템을 사용하여 분석하였다. 두 번째 세트의 실험에서는 동일한 방법을 사용하여 IgG1-PD1, 니볼루맙(Bristol-Meyers Squibb, lot no. ABP6534), 펨브롤리주맙(Merck Sharp & Dohme, lot no. U013442), 도스탈리맙(GlaxoSmithKline, lot. no. 1822049), 세미플리맙(Regeneron, lot no. 1F006A), IgG1-ctrl 또는 IgG4-ctrl의 결합을 분석하였다.
Biacore 시리즈 S 센서 칩 CM5(Cytiva, 카탈로그 번호 29104988)를 제조사의 지침에 따라 아민-커플링 및 His 포획 키트(Cytiva, 카탈로그 번호 BR100050 및 카탈로그 번호 29234602)를 사용하여 항히스티딘(His) 항체로 공유적으로 코팅하였다. HBS-EP+ (Cytiva, cat. no. BR100669)에 희석된 FcγRIa, FcγRIIa (H131 및 R131), FcγRIIb 및 FcγRIIIa (V158 및 F158)(각각 SinoBiological, cat. no. 10256-H08S-B, 10374-H08H1, 10374-H27H, 10259-H27H, 10389-H27H1, 및 10389-H27H)는 10 μL/min의 유속과 60초의 접촉 시간으로 Anti-His 코팅된 센서 칩의 표면에 포획되어 약 350 - 600 공명 단위(RU)의 포획 수준을 얻었다.
HBS-EP+ 완충액의 3회 시작 주기 후, 시험 항체(IgG1-PD1, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 도스탈리맙, 세미플리맙, IgG1-ctrl 또는 IgG4-ctrl)를 표 24에 표시된 항체 범위를 사용하여 주입하여 결합 곡선을 생성하였다. 포획된 FcγRs가 있는 표면(활성 표면)에서 분석된 각 샘플은 배경 보정에 사용된 포획된 FcγRs가 없는 평행 유동 셀(기준 표면)에서도 분석되었다. HBS-EP+를 (모의) 분석물질로 포함하는 세 번째 시작 주기를 다른 센서그램에서 빼서 이중 참조 데이터를 생성하였다.
각 사이클의 마지막에, 10 mM 글리신-HCl pH 1.5(Cytiva, 카탈로그 번호 BR100354)를 사용하여 표면을 재생하였다. 센서그램은 Biacore Insight Evaluation 소프트웨어(Cytiva)를 사용하여 생성되었으며 4가지-매개변수 로지스틱 핏이 종료점 측정(결합 정체 대 대 캡처 후 기준선)에 적용되었다. 첫 번째 실험의 데이터(n=1; 적격 SPR 분석)가 도 18에; 두 번째 실험 세트(n=3)의 데이터는 도 19에 나타내었다.
첫 번째 실험의 결과는 모든 FcγR에 대한 IgG1-ctrl의 결합을 나타낸 반면, FcγRIa, FcγRIIa (H131 및 R131), FcγRIIb 및 FcγRIIIa (V158 및 F158)에 대한 IgG1-PD1의 결합은 관찰되지 않았다(도 18).
두 번째 실험 세트의 결과는 IgG1-PD1에 대한 FcγR 결합이 없음을 확인하였다(도 19). 테스트된 IgG4-ctrl 및 기타 항PD-1 항체(니볼루맙, 펨브롤리주맙, 도스탈리맙 및 세미플리맙; 모두 IgG4 서브클래스)는 FcγRIa, FcγRIIa-H131, FcγRIIa-R131 및 FcγRIIb에 대한 명확한 결합을 입증했으며 FcγRIIIa-F158 및 FcγRIIIa-V158에 대하여는 최소 내지 매우 최소(very minimal) 결합을 나타내었다.
이들 데이터는 IgG1-PD1의 Fc 도메인에 대한 FcγR 결합의 결여를 확인해 주며, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 도스탈리맙 및 세미플리맙에 대한 FcγR 결합을 입증한다. 종합하면, 이들 데이터는 IgG1-PD1의 Fc 도메인이 FcγR 매개 이펙터 기능(ADCC, ADCP)을 유도할 수 없음을 시사한다.
실시예 14: 유세포 분석법에 의해 측정된 FcγRIa가 발현된 세포 표면에 대한 IgG1-PD1의 결합
인간 세포 표면 발현된 FcγRIa에 대한 IgG1-PD1, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 도스탈리맙 및 세미플리맙의 결합을 유세포 분석법을 사용하여 분석하였다.
FcγRIa는 일시적으로 형질감염된 CHO-S 세포에서 발현되었고, 세포 표면 발현은 FITC-접합 항-FcγRI 항체(BioLegend, 카탈로그 번호 305006; 1:25)를 사용하여 유세포 분석에 의해 확인되었다. 형질감염된 CHO-S 세포에 대한 항PD-1 항체의 결합을 실시예 7에 설명된 대로 평가하였다. 간단히 설명하면, IgG1-PD1, 니볼루맙(Bristol-Meyers Squibb, lot no. ABP6534), 펨브롤리주맙(Merck Sharp & Dohme, lot no. U013442), 도스탈리맙(GlaxoSmithKline, lot. no. 1822049), 세미플리맙(Regeneron, lot no. 1F006A), IgG1-ctrl 및 IgG1-ctrl-FERR의 항첵 희석액(최종 농도: 1.69　Х　10-4　-　10　μg/mL, 3배 희석)을 GMB FACS 완충액에서 제조하였다. 세포를 원심분리하고 상등액을 제거한 후 세포(50μL 중 30,000개 세포)를 50μL의 항체 희석액과 함께 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 GMB FACS 완충액으로 2회 세척하고 50 μL 2차 항체(PE-접합 염소-항-인간 IgG F(ab')2; 1:500)와 함께 4℃에서 30분 동안 배양하고 차광하였다. 세포를 GMB FACS 완충액으로 2회 세척하고 2 mM EDTA 및 DAPI 생존 마커(1:5,000)가 보충된 GMB FACS 완충액에 재현탁시켰다.
PE 양성, DAPI 음성 세포에 대한 게이팅을 통해 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 Intellicyt iQue PLUS Screener(Intellicyt Corporation)에서 유동 세포측정법으로 생존 세포에 대한 항체 결합을 분하였다. GraphPad Prism에서 비선형 회귀 분석(4개 매개변수 용량-반응 곡선 적합)을 사용하여 결합 곡선을 분석하였다.
유세포분석 결합 분석에서 양성 대조군 항체 IgG1-ctrl(야생형 Fc 영역 포함)은 FcγRIa를 일시적으로 발현하는 세포에 대한 결합을 나타낸 반면, 음성 대조군 항체 IgG1-ctrl-FERR(FER 불활성 돌연변이를 포함하는 Fc 영역을 포함하고, 부가적으로, 본 연구와 관련하여 기능적으로 관련이 없는 추가 K409R 돌연변이를 포함)의 경우에는 결합이 관찰되지 않았다 (도 20). IgG1-PD1의 경우 결합이 관찰되지 않았지만, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 세미플리맙 및 도스탈리맙에서는 농도 의존적 결합이 관찰되었다.
이들 데이터는 IgG1-PD1의 Fc 도메인에 대한 FcγRIa 결합의 결여를 확인하고 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 도스탈리맙 및 세미플리맙에 대한 FcγRIa 결합을 입증한다. 종합하면, 이들 데이터는 IgG1-PD1의 Fc 도메인이 FcγRIa 매개 이펙터 기능을 유도할 수 없음을 시사한다.
실시예 15: IgG1-PD1에 의한 신생아 Fc 수용체에 대한 결합
신생아 Fc 수용체(FcRn)는 IgG가 분해되지 않도록 보호하여 IgG의 긴 혈장 반감기를 제공한다. IgG는 산성(pH 6.0) 엔도솜 환경에서 FcRn에 결합하지만 중성 pH(pH 7.4)에서는 FcRn으로부터 해리된다. FcRn에 대한 항체의 이러한 pH 의존적 결합은 FcRn과 함께 항체의 재활용을 유발하여 세포내 항체 분해를 방지하므로 해당 항체의 생체내 약동학에 대한 지표이다. 고정된 FcRn에 대한 IgG1-PD1의 결합은 표면 플라스몬 공명(SPR)을 통해 pH 6.0 및 pH 7.4에서 시험관내에서 평가되었다.
고정된 인간 FcRn에 대한 IgG1-PD1의 결합을 Biacore 8K SPR 시스템을 사용하여 분석하였다. Biacore 시리즈 S 센서 칩 CM5(Cytiva, 카탈로그 번호 29104988)을 아민 커플링 및 His 포획 키트(Cytiva, 카탈로그 번호 BR100050 및 카탈로그 번호 29234602)를 제조사 지침에 따라 사용하여 항히스티딘(His) 항체로 공유 코팅하였다. PBS-P+ 완충액 pH 7.4(Cytiva, 카탈로그 번호 28995084) 또는 pH가 6.0으로 조정된 PBS-P+ 완충액(염산(Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호 07102])에서 5 nM 코팅 농도로 희석된 FcRn (SinoBiological, cat. no. CT071-H27H-B)을 유속 10μL/분, 및 접촉 시간 60초로 Anti-His 코팅 센서 칩 표면에 포획하였다. 이로 인해 약 50RU의 수준이 캡처되었다. pH 6.0 또는 pH 7.4 PBS-P+ 완충액의 3회 시작 사이클 후, 시험 항체(pH 6.0 또는 pH 7.4 PBS-P+ 완충액 중 6.25 - 100 nM IgG1-PD1의 2배 희석 시리즈, 펨브롤리주맙(MSD, lot. no. T019263) 또는 니볼루맙(Bristol-Myers Squibb(로트 번호 ABP6534)를 주입하여 결합 곡선을 생성하였다. FcRn이 포획된 표면(활성 표면)에서 분석된 각 샘플을, FcRn이 포획되지 않은 평행 유동 셀(기준 표면)에서도 분석하고, 이를 배경 보정에 사용하였다. HBS-EP+를 (모의) 분석물질로 포함하는 세 번째 시작 사이클을 다른 센서그램에서 빼서 이중 참조 데이터를 생성하였다. 각 사이클의 마지막에, 10 mM 글리신 HCl pH 1.5(Cytiva, 카탈로그 번호 BR100354)를 사용하여 표면을 재생하였다. 데이터는 Biacore Insight Evaluation 소프트웨어(Cytiva)에서 미리 정의된 "포획을 사용한 다중 사이클 동역학" 평가 방법을 사용하여 분석되었다. 데이터는 기술적 복제에 대한 세 가지 개별 실험을 기반으로 한다.
pH 6.0에서, IgG1-PD1은 50 nM의 평균 친화도(K D)로 FcRn에 결합했으며 (표 25), 이는 야생형 Fc 영역을 갖는 IgG1-ctrl 항체에 필적한다(야생형 IgG1 분자에 대해 문헌 상 광범위한 친화도가 보고됨; 동일한 분석 설정을 사용한 이전 인하우스 실험에서 12개 데이터 포인트에 걸쳐 IgG1-ctrl의 경우 34 nM의 평균 K DK D가 측정되었다). 펨브롤리주맙과 니볼루맙의 친화도는 대략 2배 더 낮았다(K D는 각각 116 nM 및 133 nM). pH 7.4에서는 FcRn 결합이 관찰되지 않았다 (표시되지 않음). 종합하면, 이들 결과는 IgG1-PD1 Fc 영역의 FER 불활성 돌연변이가 FcRn 결합에 영향을 미치지 않음을 입증하고 IgG1-PD1이 생체내에서 전형적인 IgG 약동학적 특성을 유지할 것임을 시사한다.
실시예 16: 표적 결합 부재하의 IgG1-PD1의 약동학적 분석
IgG1-PD1의 약동학적 특성을 마우스에서 분석하였다. PD-1은 주로 활성화된 B 및 T 세포에서 발현되므로 성숙한 B 및 T 세포가 결여된 비종양 보유 SCID 마우스에서는 그의 발현이 제한될 것으로 예상된다. 또한, IgG1-PD1은 마우스 PD-1을 일시적으로 과발현하는 세포에 대해 실질적으로 감소된 교차 반응성을 나타낸다(실시예 7). 따라서, 비종양 보유 SCID 마우스에서 IgG1-PD1의 약동학(PK) 특성은 표적 결합이 없을 때 IgG1-PD1의 PK 특성을 반영할 것으로 예상된다.
본 연구에서 마우스는 중앙 실험 동물 시설(네덜란드 위트레흐트)에 수용되었다. 모든 마우스는 음식과 물이 자유롭게 제공되는 개별적으로 환기되는 우리에 수용되었다. 모든 실험은 지침(2010/63/EU)에서 번역된 네덜란드 동물 보호법(WoD)을 준수했으며 네덜란드 동물 실험 중앙 위원회 및 지역 윤리 위원회의 승인을 받았다. 그룹당 3마리의 마우스를 사용하여 SCID 마우스(C.B-17/IcrHan®Hsd-Prkdcscid,　Envigo)에 1 또는 10 mg/kg IgG1-PD1을 정맥주사하였다. 항체 투여 후 10분, 4시간, 1일, 2일, 8일, 14일 및 21일에 복재 정맥 또는 볼 정맥에서 혈액 샘플(40 μL)을 수집하였다. 혈액을 K2-에틸렌디아민테트라아세트산이 들어 있는 바이알에 수집하고 항체 농도가 측정될 때까지 -65℃에서 보관하였다.
총 인간 IgG(hIgG) 전기화학발광 면역검정(ECLIA)에 의해 특정 hIgG 농도를 결정하였다. Meso Scale Discovery(MSD) 표준 플레이트(96웰 MULTI-ARRAY 플레이트, 카탈로그 번호 L15XA-3)를 PBS(Lonza, 카탈로그 번호 BE17-156Q)에 희석된 마우스 항-hIgG 포획 항체(IgG2a mM-1015-6A05)로 2-8℃에서 16-24시간 동안 코팅하였다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 PBS-Tween(PBS-T; 0.05%(w/v) Tween-20이 보충된 PBS[Sigma, 카탈로그 번호 P1379])로 플레이트를 세척한 후 비어 있는 표면을 실온에서 60±5분간 차단한 후(3%(w/v) Blocker-A[MSD, 카탈로그 번호 R93AA-1]가 보충된 PBS-T) PBS-T로 세척한다. 마우스 혈장 샘플은 처음에 분석 완충액(1%(w/v) Blocker-A가 보충된 PBS-T)에서 50배(2% 마우스 혈장)로 희석되었다. 참조 곡선을 생성하기 위해 IgG1-PD1(주사에 사용된 물질과 동일한 배치)을 Calibrator Diluent(2% 마우스 혈장 [K2 EDTA, 풀링 혈장, BIOIVT, 카탈로그 번호 MSE00PLK2PNN](분석 완충액 내))에 희석하였다(측정 범위: 0.156 - 20.0 μg/mL, 앵커 포인트: 0.0781 및 40.0 μg/mL). 샘플에 존재하는 예상되는 광범위한 항체 농도를 수용하기 위해 샘플을 샘플 희석제(분석 완충액 중 2% 마우스 혈장)에서 1:10 또는 1:50으로 추가로 희석하였다. 코팅되고 차단된 플레이트를 50 μL 희석된 마우스 샘플, 참조 곡선 및 적절한 품질 관리 샘플(참조 곡선의 범위를 포괄하는 IgG1-PD1이 첨가된 풀링된 마우스 혈장)과 함께 실온에서 90±5분 동안 인큐베이션하였다. PBS-T로 세척한 후, 플레이트를 SULFO-TAG-접합 마우스 항-hIgG 검출 항체 IgG2amm-1015-4A01과 함께 실온에서 90±5분 동안 인큐베이션하였다. PBS-T로 세척한 후 고정된 항체는 판독 완충액(MSD GOLD 판독 완충액, 카탈로그 번호 R92TG-2)을 추가하고 MSD Sector S600 플레이트 판독기를 사용하여 ~620nm에서 발광을 측정하여 시각화하였다. 분석 데이터 처리는 SoftMax Pro GxP 소프트웨어 v7.1을 사용하여 수행되었다. 실행 정량 하한(LLOQ) 아래 또는 정량 상한(ULOQ) 위의 외삽은 허용하지 않았다.
표적 결합이 없는 IgG1-PD1의 혈장 제거 프로파일은 인간의 IgG1 제거에 기초한 2구획 모델에 의해 예측된 SCID 마우스의 야생형 인간 IgG1 항체의 제거 프로파일과 유사하였다(Bleeker et al., 2001)., Blood.98(10):3136-42) (도 21). 임상적 관찰은 나타나지 않았으며 체중 감소도 관찰되지 않았다.
결론적으로, 이들 데이터는 IgG1-PD1의 PK 특성이 표적 결합이 없는 정상 인간 IgG 항체의 특성과 유사하다는 것을 나타낸다.
실시예 17: 인간 PD-1 녹인(knock-in) 마우스에서의 IgG1-PD1의 항종양 활성
IgG1-PD1은 마우스 PD-1을 일시적으로 과발현하는 세포에 대해 제한된 결합만을 나타낸다(실시예 7). 따라서 생체내에서 IgG1-PD1의 항종양 활성을 평가하기 위해 마우스 PD-1 유전자 유전자좌에서 인간 PD-1 세포외 도메인(ECD)을 발현하도록 조작된 C57BL/6 마우스(hPD-1 녹인[KI] 마우스)를 사용하였다.
모든 동물 실험은 Crown Bioscience Inc.에서 수행되었으며 실행 전에 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았다. 실험 동물 관리 평가 및 인증 협회(AAALAC)의 규정에 정의된 모범 동물 관리 기준에 따라 동물을 사육하고 취급하였다. C57BL/6 배경의 7-9주령 암컷 동형접합성(homozygous) 인간 PD-1 녹인 마우스(hPD-1 KI 마우스; Beijing Biocytogen Co., Ltd; C57BL/6-Pdcd1tm1(PDCD1)/Bcgen, 재고 번호 110003)에게, 동계 MC38 결장암 세포(1 x 106 세포)를 오른쪽 아래 옆구리에 피하(SC) 주사하였다. 종양 성장은 캘리퍼를 사용하여 평가하였고(무작위화 후 주당 3회) 종양 크기(mm3)는 캘리퍼 측정으로부터 다음과 같이 계산하였다. 종양 크기 = 0.5 ×(길이 × 너비2), 여기서 길이는 가장 긴 종양 치수이고, 너비는 길이에 대해 수직 방향의 가장 긴 종양 치수이다. 종양이 대략 60 mm3의 평균 크기에 도달했을 때 (0일로 표시됨) 종양 크기와 무게를 기준으로 마우스를 무작위화하였다(그룹당 9마리의 마우스). 치료 시작 시, 마우스에게 0.5, 2 또는 10 mg/kg IgG1-PD1 또는 펨브롤리주맙(Merck by Crown Bioscience Inc.에서 구입, lot no. T042260) 또는 10 mg/kg 이소형 대조군 항체 IgG1-ctrl-FERR를 정맥주사하였다. 후속 용량은 복강내(IP)로 투여되었다. 3주 동안 매주 2회 투여하는 투여 요법(2QW×3)을 사용하였다. 동물의 질병률과 사망률을 매일 모니터링하고 다른 임상 관찰을 위해 정기적으로 모니터링하였다. 종양 크기가 1,500 mm3를 초과하거나 동물이 다른 인도적 종말점에 도달하면 개별 마우스에 대한 실험을 종료하였다.
그룹 간의 무진행 생존율을 비교하기 위해 개별 종양 성장 그래프에 곡선 맞춤을 적용하여 각 마우스에 대해 500 mm3의 종양 크기를 초과하는 진행일을 설정하였다. 이 날짜 값은 Kaplan-Meier 생존 곡선에 표시되었으며 SPSS 소프트웨어를 사용하여 개별 곡선 간의 Mantel-Cox 분석을 수행하는 데 사용되었다. 모든 그룹이 여전히 손상되지 않은 마지막 날(즉, 연구에서 첫 번째 종양 관련 사망이 발생할 때까지, 즉 11일차) 비모수적 Mann-Whitney 분석(GraphPad Prism)을 사용하여 그룹 간 종양 크기의 차이를 비교하였다. P-값은 중앙값 차이의 95% 신뢰 구간(Hodges Lehmann)을 포함하는 중앙값(그룹당)과 함께 표시된다.
마우스에서는 질병의 징후가 나타나지 않았지만 두 마리의 마우스가 죽은 채 발견되었다(2 mg/kg IgG1-PD1 그룹에서 한 마리, 2 mg/kg 펨브롤리주맙 치료 그룹에서 한 마리). 이들 사망의 원인은 밝혀지지 않았다.
IgG1-PD1 및 펨브롤리주맙을 사용한 치료는 테스트된 모든 용량에서 종양 성장을 억제하였다(도 22A). 모든 치료 그룹이 완료된 마지막 날인 11일차에, IgG1-PD1 또는 펨브롤리주맙으로 처리된 마우스의 종양은 10 mg/kg IgG1-ctrl-FERR로 처리된 마우스의 종양보다 테스트된 모든 용량에서 유의하게 더 작았다(도 22B). 또한, 10 mg/kg에서 IgG1-PD1로 처리한 쥐의 종양 크기는 동등한 용량의 펨브롤리주맙으로 처리한 쥐의 종양 크기보다 유의하게 작았다(Mann-Whitney 테스트, p=0.0188).
IgG1-PD1 또는 펨브롤리주맙에 의한 치료는 10 mg/kg IgG1-ctrl-FERR로 치료된 마우스와 비교하여 테스트된 모든 용량에서 무진행 생존(PFS)을 유의하게 증가시켰다(도 22C). 10 mg/kg에서 IgG1-PD1로 치료된 마우스의 무진행 생존 기간은 펨브롤리주맙으로 치료한 마우스에 비해 유의하게 연장되었다(PFS 10 mg/kg IgG1-PD1 중앙값: 20.56일, PFS 10 mg/kg 펨브롤리주맙 중앙값: 13.94일, P-값 = 0.0021).
결론적으로, IgG1-PD1은 MC38 종양 보유 hPD-1 KI 마우스에서 강력한 항종양 활성을 나타냈다.
실시예 18: 동종이계 MLR 분석에서 사이토카인 분비에 미치는 항PD-(L)1 항체와 조합된 DuoBody-CD40x4-1BB의 효과
DuoBody-CD40×4-1BB와 아테졸리주맙, 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙의 조합이 혼합 림프구 반응(MLR) 분석에서 단일 제제 활성과 비교하여 사이토카인 생산을 강화할 수 있는지 분석하기 위해, 인간 성숙 수지상 세포(mDC) 및 CD8+ T 세포의 4가지 독특한 동종이계 쌍을 DuoBody-CD40×4-1BB 단독, 아테졸리주맙 단독, 니볼루맙 단독, 펨브롤리주맙 단독, 또는 DuoBody-CD40×4-1BB와 아테졸리주맙의 조합, DuoBody-CD40×4-1BB와 니볼루맙의 조합 또는 DuoBody-CD40×4-1BB와 펨브롤리주맙의 존재 하에서 공동 배양하였다. IFNγ-특이적 면역검정 및 Luminex 사이토카인 패널을 사용하여 공동배양물의 상등액에서 사이토카인 분비를 평가하였다.
방법
건강한 기증자의 단핵구 및 T 세포
CD14+ 단핵구 및 정제된 CD8+ T 세포를 BioIVT에서 입수하였다. 4개의 독특한 동종이계 기증자 쌍이 MLR 분석에 사용되었다.
단핵구를 미성숙 수지상 세포로 분화
인간 CD14+ 단핵구를 건강한 기증자로부터 얻었다. 미성숙 수지상 세포(iDC)로의 분화를 위해, 1 - 1.5 x 106 단핵구/mL를 T25 배양 플라스크(Falcon, 카탈로그 번호 353108) 내, 10% 열 불활성화 소 태아 혈청(FBS; Gibco, 카탈로그 번호 16140071), 100 ng/mL 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF; BioLegend, 카탈로그 번호 766106) 및 300 ng/mL 인터루킨-4(IL-4; BioLegend, 카탈로그 번호 766206)가 보충된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 완전 배지(ATCC 변형 포뮬러; ThermoFisher, 카탈로그 번호 A1049101)에서 37℃에서, 6일 동안 배양하였다. 4일 후, 배지를 새로운 배지와 보충제로 교체하였다.
iDC를 mDC로 분화
MLR 분석을 시작하기 전에, 비부착성 세포를 수집하여 iDC를 수확하고 10% FBS, 100 ng/mL GM-CSF, 300 ng/mL IL-4 및 5 μg/mL 지질다당류(LPS; ThermoFisher, 카탈로그 번호 00-4976-93)가 보충된 RPMI 1640 완전 배지에서 1 - 1.5 x 106 세포/mL로 37℃에서 24시간 배양하여 성숙한 DC(mDC)로 분화시켰다..
혼합 림프구 반응(MLR)
MLR 분석 시작 하루 전, 건강한 동종이계 기증자로부터 얻은 정제된 CD8+ T 세포를 해동하고 10% FBS 및 10 ng/mL IL-2(BioLegend, 카탈로그 번호 589106)가 보충된 RPMI 1640 완전 배지에 1 x 106 세포/mL로 재현탁하고 37℃에서 O/N 배양하였다.
다음날, LPS-성숙 수지상 세포(mDCs, Maturation of iDCs to mDCs 참조) 및 정제된 동종이계 CD8+ T 세포를 수확하고 AIM-V 배지(ThermoFisher, 카탈로그 번호 12055091)에 각각 4 Х 105 세포/mL 및 4 Х 106 세포/mL로 재현탁하였다. 공동배양물을 1:10의 DC:T 세포 비율로 접종하고(이는 200,000개의 정제된 동종이계 CD8+ T 세포와 함께 배양된 20,000개의 mDC에 해당함), 96웰 둥근 바닥 플레이트(Falcon, 카탈로그 번호 353227)의 AIM-V 배지에서, 단일 제제로서 아테졸리주맙(1 μg/mL, 임상 제품 아테졸리주맙의 비임상/연구 등급 버젼; Selleckchem, 카탈로그 번호 A2004), 니볼루맙(1 μg/mL; 임상 제품 니볼루맙의 비임상/연구 등급 버전; Selleckchem, 카탈로그 번호 A2002), 펨브롤리주맙(1 μg/mL, 임상 제품 펨브롤리주맙의 비임상/연구 등급 버전; Selleckchem, 카탈로그 번호 A2005) 또는 DuoBody-CD40×4-1BB(0.001 - 30 μg/mL), 또는 DuoBody-CD40× 4-1BB과 아테졸리주맙, 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙과의 조합의 존재 하에 37℃에서 5일간 배양하였다. bsIgG1-CD40×ctrl(30 μg/mL), bsIgG1-ctrl×4-1BB(30 μg/mL) 또는 IgG1-ctrl-FEAL(30 μg/mL)로 처리된 공동배양물을 대조군으로 포함시켰다. 5일 후, 플레이트를 500 xg에서 5분 동안 원심분리하고 상등액을 조심스럽게 각 웰에서 새로운 96웰 둥근 바닥 플레이트로 옮겼다.
MLR 분석에서 수집된 상등액을 제조사의 지침에 따라 Envision 기기에서 Alpha Lisa IFNγ 키트(Perkin Elmer, 카탈로그 번호 AL217)를 사용하여 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)으로 IFNγ 수준을 분석하였다.
MLR 분석에서 수집된 상등액을, 맞춤형 Milliplex Chemokine Magnetic Bead Panel(Millipore Sigma, 카탈로그 번호 HCYTOMAG-60K-08, Lot 3730985)을 사용하여 Luminex FLEXMAP 3D® 시스템에서 제조사 지침에 따라, 인터루킨(IL)-10, IL-12p40, IL-15, IL -17a, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-23, IL-5, IL-6, IL-8, 종양 괴사 인자(TNF)α, 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 단핵구 화학유인 단백질-1(MCP-1) 및 그랜자임 B에 대해 분석하였다.
결과 및 결론
DuoBody-CD40×4-1BB, 아테졸리주맙, 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙 단독 처리는 MLR 분석에서 IFNγ, GM-CSF, TNFα, IL-2 및 IL-6의 분비를 향상시켰다. ≥ 0.1 μg/mL DuoBody-CD40×4-1BB와 1 μg/mL 아테졸리주맙, 1 μg/mL 니볼루맙 또는 1 μg/mL 펨브롤리주맙의 조합은 단일 제제 활성에 비해, IFNγ, GM-CSF, TNFα, IL-2 및 IL-6의 분비를 더욱 강화 하였다(도 23). DuoBody-CD40×4-1BB를 아테졸리주맙, 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙과 조합시키자 IFNγ, GM-CSF 및 IL-6의 수준이 동일한 정도로 증가하였다. TNFα 및 IL-2 분비는 DuoBody-CD40×4-1BB와 펨브롤리주맙을 병용한 후 가장 높았다. 이러한 데이터는 CD40 및 4-1BB 공동자극과 함께 PD-1/PD-L1 축의 표적화를 통해 면역 반응의 크기가 증폭될 수 있음을 시사한다.
실시예 19: T 세포 증식 및 사이토카인 분비를 향상시키는 항PD-(L)1 항체와 조합된 DuoBody-CD40x4-1BB의 능력을 결정하기 위한 항원 특이적 자극 검정
T 세포 증식 및 사이토카인 생산에 대한 DuoBody-CD40x4-1BB 및 항-PD-(L)1 항체의 조합 효과를 단일 제제 활성과 비교하여 확인하기 위해, PD-1을 과발현하는 인간 CD8+ T 세포 및 동족 항원을 발현하는 미성숙 수지상 세포(iDC)의 공동배양물을 사용하여 항원 특이적 자극 분석을 수행하였다.
방법
세포 단리 및 단핵구의 iDC로의 분화
HLA-A*02+ 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 건강한 기증자(Transfusionszentrale, University Hospital, Mainz, Germany) 로부터 입수하였다. 제조사의 지침에 따라 항-CD14 MicroBeads (Miltenyi; 카탈로그 번호 130-050-201)를 사용하여 자기 활성화 세포 분류(MACS) 기술을 통해 PBMC로부터 단핵구를 분리하였다. 말초 혈액 림프구(PBL, CD14 음성 분획)를 T 세포 분리를 위해 냉동보존하였다. iDC로의 분화를 위해 5% 풀링된 인간 혈청(One Lambda Inc., 카탈로그 번호 A25761), 1 mM 피루브산 나트륨(Life Technologies GmbH, 카탈로그 번호 11360-039), 1x 비필수 아미노산(Life Technologies GmbH, 카탈로그 번호 11140-035), 200 ng/mL 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF; Miltenyi, 카탈로그 번호 130-093-868) 및 200 ng/mL 인터루킨-4(IL-4; Miltenyi, 카탈로그 번호 130-093-924)이 포함된 RPMI 1640(Life Technologies GmbH, 카탈로그 번호 61870-010)에서 1 x 106 단핵구/mL를 5일 동안 배양하였다. 3일째에는 배지의 절반을 보충제가 포함된 새로운 배지로 교체하였다. 비부착성 세포를 수집하여 iDC를 수확하고 2 mM EDTA가 포함된 Dulbecco 인산염 완충 식염수(DPBS)와 함께 37℃에서 10분간 배양하여 부착성 세포를 분리하였다. DPBS로 세척한 후 iDC를 향후 항원 특이적 T 세포 분석에 사용하기 위해 10% DMSO(AppliChem GmbH, 카탈로그 번호 A3672,0050)가 포함된 FBS(Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호 F7524)에 냉동보존하였다.
iDC 및 CD8+ T 세포의 전기천공 및 CFSE 표지
항원 특이적 CD8+ T 세포 자극 분석을 시작하기 하루 전에, 동일한 기증자의 냉동 PBL 및 iDC를 해동하였다. CD8+ T 세포는 제조사의 지침에 따라 항-CD8 MicroBeads (Miltenyi, 카탈로그 번호 130-045-201)를 사용하여 MACS 기술에 의해 PBL로부터 분리되었다. 약 10 x 106 ~ 15 x 106 CD8+ T 세포를 250μL X-Vivo15 배지(Lonza, 카탈로그 번호 BE02-060Q)에서, 인간 클라우딘-6(CLDN6; HLA-A*02 제한됨; WO 2015/150327 A1에 설명됨)에 특이적인 쥐 TCR의 알파 및 베타 사슬을 암호화하는 시험관내 전사(IVT)-RNA 10μg 및 인간 PD-1(UniProt Q15116)을 인코딩하는 IVT-RNA 10μg으로 각각 전기천공하였다. 세포를 4 mm-전기천공 큐벳(VWR International GmbH, 카탈로그 번호 732-0023)으로 옮기고 BTX ECM® 830 전기천공 시스템(BTX; 500V, 3ms 펄스)을 사용하여 전기천공하였다. 전기천공 직후, 세포를 5% 풀링된 인간 혈청을 함유하는 새로운 IMDM GlutaMAX 배지(Life Technologies GmbH, 카탈로그 번호 319800-030)로 옮기고 37℃, 5% CO2에서 적어도 1시간 동안 방치하였다. 제조사의 지침에 따라 PBS 중 0.8 μM 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE; Life Technologies GmbH, 카탈로그 번호 V12883)를 사용하여 T 세포를 표지하고 5% 풀링된 인간 혈청이 보충된 IMDM 배지에서 밤새 인큐베이션하였다.
최대 5 x 106개의 해동된 iDC를 위에서 설명한 전기천공 시스템(300V, 12 ms 펄스)을 사용하여 250μL X-Vivo15 배지에서 전장 인간 CLDN6(WO 2015/150327 A1)을 인코딩하는 2μg IVT-RNA로 전기천공하고 5% 풀링된 인간 혈청이 보충된 IMDM 배지에서 밤새 배양하였다.
다음날 세포를 수확하였다. iDC에서 CLDN6의 세포 표면 발현뿐만 아니라 T 세포에서 CLDN6-특이적 TCR 및 PD-1의 세포 표면 발현을 유세포 분석법으로 확인하였다. 이를 위해 iDC를 형광 표지된 CLDN6 특이적 항체(비상업적, 자체 생산)로 염색하였다. T 세포는 브릴리언트 바이올렛(BV)421-접합 항-마우스 TCR-β 사슬 항체(Becton Dickinson GmbH, 카탈로그 번호 562839) 및 알로피코시아닌(APC)-접합 항-인간 PD-1 항체(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 17-2799-42)로 염색하였다.
항원 특이적 시험관내 T 세포 자극 분석
전기천공된 iDC를 DuoBody-CD40x4-1BB(0.0022, 0.0067 또는 0.2 μg/mL) 단독, 또는 항PD-1 항체인 펨브롤리주맙(Keytruda®, Merck Sharp & Dohme GmbH, PZN 10749897)(0.8 μg/mL), 니볼루맙(Opdivo®, Bristol-Myers-Squib GmbH, PZN 11024601)(1.6 μg/mL) 또는 IgG1-PD1(0.8 μg/mL), 항PD-L1 항체 아테졸리주맙(Tecentriq®, Roche Pharma AG, PZN 11306050)(0.4 μg/mL), 또는 음성 대조군 항체 IgG1-ctrl-FERR(0.8 μg/mL)와의 조합의 존재 하에, 96웰 둥근 바닥 플레이트(VWR International GmbH, 카탈로그 번호 734-1797) 내 5% 풀링된 인간 혈청(One Lambda Inc., 카탈로그 번호 A25761)을 함유하는 IMDM 배지(Life Technologies GmbH, 카탈로그 번호 31980030)에서, 1:10의 비율로 전기천공된 CFSE 표지 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 배양 4일 후, 세포를 APC-접합 항-인간 CD8 항체로 염색하였다. BD FACSCelesta™ 유세포 분석기(Becton Dickinson GmbH)를 사용하여 CD8+ T 세포에서 CFSE 희석의 유세포 분석을 통해 T 세포 증식을 평가하였다.
FlowJo 소프트웨어 버전 10.7.1을 사용하여 유세포분석 데이터를 분석하였다. FlowJo의 증식 모델링 도구를 사용하여 CD8+ T 세포의 CFSE 표지 희석을 평가 하고 통합 공식을 사용하여 확장 지수를 계산하였다.
사이토카인 농도의 결정
4일 후 T 세포/iDC 공동배양물에서 수집한 상등액 중 사이토카인 농도를 제조사의 프로토콜에 따라 10종의 인간 사이토카인 (GM-CSF, IL-2, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IFNγ, IFNγ-유도성 단백질 [IP]-10 [C-X-C 모티프 케모카인 리간드 10으로도 알려짐], 대식세포 화학유인 단백질[MCP]1, 및 TNFα; Meso Scale Discovery, cat. No. K15067L-2) 패널 검출을 위해 맞춤형 U-Plex 바이오마커 그룹 1(인간) 분석을 사용하여 다중 전기화학발광 면역분석법으로 구하였다
결과 및 결론
DuoBody-CD40×4-1BB와 항PD-(L)1 항체의 병용 치료는 비결합 대조군 항체 IgG1-ctrl-FERR과 결합된 DuoBody-CD40×4-1BB에 비해, 그리고 단일 요법으로서 항PD-(L)1 항체에 비해, CD8+ T 세포 증식을 증강시켰다(도 24). 두 가지 단일 제제 치료 모두에 비해, 고농도의 DuoBody-CD40x4-1BB(0.2 μg/mL)를 병용 치료에서 사용한 경우 증식이 증가한 것으로 나타났다. 항PD-(L)1 항체와 저농도(0.0022 μg/mL) 또는 중간 농도 (0.0067 μg/mL)의 DuoBody-CD40x4-1BB의 조합은 항PD-(L)1 항체 단독에 비해 증식에 대한 영향이 최소화되거나 전혀 없었다.
DuoBody-CD40×4-1BB와 항PD-(L)1 항체의 병용 치료는 IgG1-ctrl과 병용된 DuoBody-CD40×4-1BB에 비해, 그리고 단일 요법으로서 항PD-(L)1 항체에 비해, 전염증성 사이토카인 GM-CSF, IFNγ, IL-13 및 TNFα의 분비를 향상시켰다(도 25). 두 가지 단일 제제 치료에 비해, 고농도의 DuoBody-CD40×4-1BB(0.2 μg/mL)를 병용 치료에 사용한 경우 사이토카인 분비가 증가한 것으로 나타났다. 항PD-(L)1 항체와 낮은 농도(0.0022 μg/mL) 또는 중간 농도(0.0067 μg/mL)의 DuoBody-CD40×4-1BB와의 조합은 항PD-(L)1 항체 단독에 비해 사이토카인 분비에 최소한의 영향을 미치거나 전혀 영향을 미치지 않았다. 시험된 다른 사이토카인의 분비는 단일 제제 치료에 비해 일관되게 향상되지 않았거나, 향상되지 않았다.
실시예 20: 항PD-(L)1 항체와 조합된 DuoBody-CD40x4-1BB의 T 세포 증식을 향상시키는 능력을 결정하기 위한 폴리클로날 자극 분석
단일 제제 활성과 비교하여 T 세포 증식에 미치는 DuoBody-CD40x4-1BB 및 항PD-(L)1 항체의 조합 효과를 확인하기 위해, 항CD3 항체로 자극된 PBMC 배양물을 사용하여 폴리클로날 자극 분석을 수행하였다.
방법
폴리클로날 시험관내 T 세포 자극 분석
PBMC는 건강한 기증자(독일 마인츠 대학병원 Transfusionszentrale)로부터 입수하였다. PBMC를 제조사의 지침에 따라 PBS에 용해된 2.5μM CellTraceTM Violet(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 C34557)을 사용하여 표지하였다.
PBMC는 DuoBody-CD40×4-1BB(0.2 μg/mL) 단독 또는 항PD-1 항체인 펨브롤리주맙(Keytruda®, Merck Sharp & Dohme GmbH, PZN 10749897) 또는 니볼루맙(Opdivo®, Bristol-Myers-Squib GmbH, PZN 11024601), 또는 항PD-L1 항체인 아테졸리주맙(Tecentriq®, Roche Pharma AG, PZN 11306050)(모두 0.0, 0.5 및 5 μg/mL로 사용됨)과의 조합의 존재 하에, 96웰 둥근 바닥 플레이트(VWR International GmbH, 카탈로그 번호 734-1797) 내, 5% 풀링 인간 혈청(One Lambda Inc. 카탈로그 번호 A25761)을 함유하는 IMDM 배지(Life Technologies GmbH, 카탈로그 번호 31980030)에서 0.09 μg/mL의 항-CD3 항체(클론 UCHT1, R&D 시스템, 카탈로그 번호 MAB100-500)와 함께,배양되었다. 비결합 항체 IgG1-ctrl-FEAL(0.2 μg/mL)이 음성 대조군으로 포함되었다. 배양 4일 후, 세포를 APC-접합 항-인간 CD8(Becton Dickinson GmbH, 카탈로그 번호 640584) 및 PE-접합 항-인간 CD4(TONBO Biosciences, 카탈로그 번호 50-0049) 항체로 염색하였다. T 세포 증식은 BD FACSCelesta™ 유세포 분석기(Becton Dickinson GmbH)를 사용하여 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서 CellTrace TM Violet 희석의 유세포 분석을 통해 평가하였다.
결과
DuoBody-CD40×4-1BB 및 항PD-(L)1 항체의 병용 치료는 단일 요법으로서 DuoBody-CD40×4-1BB 및 항PD-(L)1 항체와 비교하여 CD8+ 및 CD4+ T 세포 증식을 증강시켰다(도 26). 단일 제제 활성의 증강은 테스트된 모든 농도의 항PD-(L)1 항체에서 관찰되었다.
실시 예 21: LPS-성숙 수지상 세포 및 시험관내 탈진 T 세포의 동종이계 MLR 검정에서 사이토카인 분비에 미치는 펨브롤리주맙과 조합된 DuoBody-CD40x4-1BB의 효과
DuoBody-CD40×4-1BB와 펨브롤리주맙의 조합이 혼합 림프구 반응(MLR) 분석에서 T 세포 탈진을 역전시킬 수 있는지 분석하기 위해, 인간 성숙 수지상 세포(mDC)와 시험관내 탈진 T 세포(Tex)의 두 가지 독특한 동종이계 쌍을, DuoBody-CD40x4-1BB 단독, 펨브롤리주맙 단독, 또는 두 항체의 조합 존재 하에 공동배양하였다. Tex에 대한 억제 수용체의 발현은 유동 세포측정법에 의해 결정되었으며 인터페론(IFN) γ 및 인터루킨(IL)-2의 분비는 공동배양물의 상등액에서 평가되었다.
방법
건강한 기증자의 단핵구 및 T 세포
CD14+ 단핵구 및 정제된 CD3+ T 세포를 BioIVT에서 얻었다. MLR 검정을 위해 두 개의 독특한 동종이계 기증자 쌍이 사용되었다.
단핵구를 미성숙 수지상 세포로 분화
인간 CD14+ 단핵구는 건강한 기증자로부터 얻었다. 미성숙 수지상 세포(iDC)로의 분화를 위해, 1 - 1.5 x 106 단핵구/mL를 T25 배양 플라스크(Falcon, 카탈로그 번호 353108) 내, 10% 열 불활성화 소 태아 혈청(FBS; Gibco, 카탈로그 번호 16140071), 100 ng/mL 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF; BioLegend, 카탈로그 번호 766106) 및 300 ng/mL IL-4(BioLegend, 카탈로그 번호 766206)가 보충된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 완전 배지(ATCC 변형 포뮬러; ThermoFisher, 카탈로그 번호 A1049101)에서 37℃에서 6일 동안 배양하였다. 4일 후, 배지를 새로운 배지와 보충제로 교체하였다.
iDC를 mDC 로 분화
MLR 분석을 시작하기 전에, 비부착성 세포를 수집하여 iDC를 수확하고 10% FBS, 100 ng/mL GM-CSF, 300 ng/mL IL-4 및 5μg/mL 지질다당류(LPS; ThermoFisher, 카탈로그 번호 00-4976-93)가 보충된 RPMI 1640 완전 배지에서 37℃, 24 시간 동안 1 - 1.5 x 106 세포/mL를 배양하여 mDC로 분화시켰다.
T 세포의 탈진
건강한 기증자로부터 얻은 정제된 CD3+ T 세포를 해동하고 5% FBS 및 10 ng/mL IL-2 (BioLegend, 카탈로그 번호 589106)이 보충된 AIM-V 배지(ThermoFisher, cat. no. 12055091)에서 1 Х 106 세포/mL로 재현탁하였다. 탈진된 유사 표현형을 갖는 T 세포를 유도하기 위해 세포를 Dynabeads™ Human T Activator CD3/CD28(Gibco, 카탈로그 번호 11161D)을 사용하여 1:1의 비드:세포 비율로 48시간 37℃ 및 5% CO2에서 2회 자극하였다. 2회 자극 후 탈진된 CD3+ T 세포(Tex)를 24시간 동안 휴지시켰다.
자극되지 않은 대조군으로서, 건강한 기증자로부터 얻은 정제된 CD3+ T 세포를 MLR 분석 시작 하루 전에 해동하고, 10% FBS 및 10 ng/mL IL-2가 보충된 RPMI 1640 완전 배지에 1 x 106 세포/mL로 재현탁하고 37℃에서 O/N 인큐베이션하였다. MLR 분석 전에, 자극되지 않은 T 세포 및 Tex의 분취량을 유세포 분석을 위해 수집하였다.
유세포 분석
Tex의 억제 수용체에 대한 유세포 분석을 위해 세포를 400xg에서 5분 동안 펠렛화하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척한 다음 다시 펠렛화하고 LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain (ThermoFisher Scientific, cat. no. L10119, diluted 1:500)가 보충된 1mL PBS에 재현탁한 다음 4℃ 암실에서 20분 동안 배양하였다. 다음으로, 세포를 세척하고, 펠릿화하고, 5% 인간 혈청(Sigma, 카탈로그 번호 H4522)을 함유하는 FACS 완충액(0.5% 소 혈청 알부민[BSA, Sigma, cat. A9576] 및 2 mM 에틸렌디아민테트라아세트산[EDTA, Invitrogen, 카탈로그 번호 15575-038])이 보충된 둘베코 포스페이트 완충 염수 [DPBS, Gibco, cat. no. 14190136])에서 8 Х 106 세포/mL 로 재현탁하였다. 이어서, 200,000개의 세포를 포함하는 25μL를 Brilliant Stain Buffer Plus(BD Horizon, 카탈로그 번호 566385)가 보충된 FACS 완충액 중 PE-표지된 항-인간 LAG3(Biolegend, 카탈로그 번호 369306, 1:60 희석)과 함께 150μL 염색 혼합물이 포함된 새로운 96웰 플레이트로 옮기고 실온의 암실에서 20분 동안 배양하였다. 세포를 펠렛화하고, FACS 완충액을 사용하여 세척하고, 100μL 고정 완충액(Biolegend, 카탈로그 번호 420801)에 재현탁시키고, 암실에서 4℃에서 15분 동안 배양하였다. 세포를 다시 펠릿화하고, 세척하고, 100μL FACS 완충액에 재현탁시켰다. 샘플을 Cytek® Aurora 유세포 분석기(Cytek Biosciences)에서 분석하였다.
MLR 분석
mDC (iDC에서 mDC로의 성숙 참조)를 수확하고 AIM-V 배지에 4 x 105 세포/mL로 재현탁하였다. Tex 및 자극되지 않은 CD3+ T 세포(T 세포의 탈진 참조)를 수확하고 AIM-V 배지에 4 x 106 세포/ mL로 재현탁하였다. mDC와 Tex의 공동배양물에 80,000 또는 200,000 Tex와 함께 배양된 20,000 mDC에 해당하는 1:4 또는 1:10의 DC:T 세포 비율로 접종하고, 단일 제제로서 펨브롤리주맙(1 μg/mL; 임상 제품 펨브롤리주맙의 비임상/연구 등급 버전; Selleckchem, 카탈로그 번호 A2005) 또는 DuoBody-CD40×4-1BB(0.001 - 30 μg/mL)를, 또는 두 제제의 조합의 존재 하에, 혼합 96웰 둥근 바닥 플레이트(Falcon, 카탈로그 번호 353227) 내 AIM-V 배지에서 37℃에서 5일 동안 배양하였다. bsIgG1-CD40×ctrl(30 μg/mL), bsIgG1-ctrl×4-1BB(30 μg/mL) 또는 IgG1-ctrl-FEAL(30 μg/mL)로 처리된 공동배양물을 대조군으로 포함시켰다. 동시에, 200,000개의 T 세포와 함께 배양된 20,000개의 mDC에 대응하는, 1:10의 DC:T 세포 비율로 mDC와 자극되지 않은 CD3+ T 세포의 공동배양물을 1μg / mL 펨브롤리주맙 존재 또는 부재 하에 배양하였다. 5일 후, 플레이트를 500 xg에서 5분 동안 원심분리하고 상등액을 조심스럽게 각 웰에서 새로운 96웰 둥근 바닥 플레이트로 옮겼다.
제조사 지침에 따라, AlphaLISA IFNγ 키트(Perkin Elmer, 카탈로그 번호 AL217)를 사용하여 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)으로 수집된 상등액을 IFNγ 수준에 대해 분석하였다. 수집된 상등액은 제조사 지침에 따라 V-Plex Pro 염증성 패널 1 인간 키트(MSD, 카탈로그 번호 K15049D)를 사용하여 Meso Sector S 600(Meso Scale Discovery [MSD], 카탈로그 번호 R31QQ-3)에서 IL-2에 대해 분석하였다.
결과 및 결론
CD3/CD28 비드로 2회 자극 후, T 세포는 억제 수용체 LAG3을 발현하고 이중 항-CD3 및 항-CD28 자극에 대해 반응성이 저하되었는데, 이는 자극되지 않은 CD3+ T 세포에 비해, mDC 및 Tex의 MLR 분석에서 IFNγ 및 IL-2의 분비 감소로 입증되었다 (도 27). 단일 제제로서 펨브롤리주맙 또는 DuoBody-CD40x4-1BB를 사용한 치료는 각각 IFNγ 또는 IL-2 분비를 부분적으로 구제하였다. ≥ 0.1 μg/mL DuoBody-CD40×4-1BB와 1 μg/mL 펨브롤리주맙의 조합은 mDC : Tex MLR 분석에서 단일 제제 활성과 비교하여 IFNγ의 분비를 추가로 증강시켰다(도 28). 이러한 데이터는 탈진된 T 세포에 의한 사이토카인 분비의 손실이 CD40 및 4-1BB 공동자극과 함께 PD-1/PD-L1 축의 표적화를 통해 부분적으로 역전될 수 있음을 시사한다.

Claims (84)

1. 대상체에서 종양의 진행을 감소 또는 예방하거나 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 결합제로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 결합제를 체크포인트 억제제의 투여 전, 투여와 동시, 또는 투여 후에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 결합제는 CD40에 결합하는 제1 결합 영역 및 CD137에 결합하는 제2 결합 영역을 포함하는 것인, 결합제.
청구항 1에 있어서, CD40이 인간 CD40, 특히 SEQ ID NO: 36에 제시된 서열을 포함하는 인간 CD40이고/이거나 CD137이 인간 CD137, 특히 SEQ ID NO: 38에 제시된 서열을 포함하는 인간 CD137인, 결합제.
청구항 1 또는 2에 있어서, 체크포인트 억제제가 PD-1 억제제, PD-L1 억제제, PD-L2 억제제, CTLA-4 억제제, TIM-3 억제제, KIR 억제제, LAG-3 억제제, TIGIT 억제제, VISTA 억제제 및 GARP 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 결합제.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 청구항에 있어서, 체크포인트 억제제가 항체, 예컨대 PD-1 차단 항체, 특히 펨브롤리주맙인, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서, 결합제 및 체크포인트 억제제 중 하나 또는 둘 모두는 전신으로, 좋기로는 정맥내로 투여되는, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서,
a) 제1 결합 영역은 SEQ ID NO: 7 또는 9의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 SEQ ID NO: 8 또는 10의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고; 및
b) 제2 항원 결합 영역은 SEQ ID NO: 17 또는 19의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 SEQ ID NO: 18 또는 20의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서,
a) 제1 결합 영역은 각각 SEQ ID NO: 1, 2, 및 3에 제시된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 각각 SEQ ID NO: 4, 5, 및 6에 제시된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고; 및
b) 제2 항원 결합 영역은 각각 SEQ ID NO: 11, 12 및 13에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 각각 SEQ ID NO: 14, 15, 및 16에 제시된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 결합제.

8. 선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서,
a) 제1 결합 영역은 SEQ ID NO: 7 또는 9에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 8 또는 10에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고;
b) 제2 결합 영역은 제1 결합 영역은 SEQ ID NO: 17 또는 19에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 25 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 18 또는 20에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서,
a) 제1 결합 영역은 SEQ ID NO: 7 또는 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 8 또는 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 영역을 포함하고; 및
b) 제2 결합 영역은 SEQ ID NO: 17 또는 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 18 또는 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 영역을 포함하는, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서,
a) 제1 결합 영역은 SEQ ID NO: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 영역을 포함하고; 및
b) 제2 결합 영역은 SEQ ID NO: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 영역을 포함하는, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서, 결합제는 이중특이 항체와 같은 다중특이 항체인, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서, 결합제는 전장 항체 또는 항체 단편의 형식인, 결합제.
청구항 6-12 중 어느 한 청구항에 있어서, 각 가변 영역은 3개의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3) 및 4개의 프레임워크 영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 포함하는, 결합제.
청구항 13에 있어서, 상기 상보성 결정 영역 및 상기 프레임워크 영역은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열되는, 결합제.
청구항 6-14 중 어느 한 청구항에 있어서,
i) 상기 제1 중쇄 가변 영역(VH) 및 제1 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하거나, 이로 구성되거나, 본질적으로 구성되는 폴리펩타이드, 및
ii) 상기 제2 중쇄 가변 영역(VH) 및 제2 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하거나, 이로 구성되거나, 본질적으로 구성되는 폴리펩타이드
를 포함하는, 결합제.
청구항 6-15 중 어느 한 청구항에 있어서,
i) 상기 제1 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고 제1 경쇄 불변 영역(CL)을 추가로 포함하는 폴리펩타이드, 및
ii) 상기 제2 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고 제2 경쇄 불변 영역(CL)을 추가로 포함하는 폴리펩타이드
를 포함하는, 결합제.
청구항 6-16 중 어느 한 청구항에 있어서, 결합제는 제1 결합 팔 및 제2 결합 팔을 포함하는 항체이고, 여기서 제1 결합 팔은
i) 상기 제1 중쇄 가변 영역(VH) 및 제1 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하는 폴리펩타이드, 및
ii) 상기 제1 경쇄 가변 영역(VL) 및 제1 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하고; 제2 결합 팔은
iii) 상기 제2 중쇄 가변 영역(VH) 및 제2 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하는 폴리펩타이드, 및
iv) 상기 제2 경쇄 가변 영역(VL) 및 제2 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서,
i) CD40에 결합할 수 있는 상기 항원 결합 영역을 포함하는 제1 중쇄 및 경쇄, 및
ii) CD137에 결합할 수 있는 상기 항원 결합 영역을 포함하는 제2 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 결합제는:
i) CD40에 결합할 수 있는 상기 항원 결합 영역을 포함하는 제1 중쇄 및 경쇄(제1 중쇄는 제1 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제1 경쇄는 제1 경쇄 불변 영역을 포함함); 및
ii) CD137에 결합할 수 있는 상기 항원 결합 영역을 포함하는 제2 중쇄 및 경쇄(제2 중쇄는 제2 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 경쇄는 제2 경쇄 불변 영역을 포함함)를 포함하는, 결합제.
청구항 15-19 중 어느 한 청구항에 있어서, 제1 및 제2 중쇄 불변 영역(CH) 각각은 불변 중쇄 1(CH1) 영역, 힌지 영역, 불변 중쇄 2(CH2) 영역 및 불변 중쇄 3(CH3) 영역 중 하나 이상, 좋기로는 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는, 결합제.
청구항 15-20 중 어느 한 청구항에 있어서, 제1 및 제2 중쇄 불변 영역(CH) 각각은 CH3 영역을 포함하고, 여기서 2개의 CH3 영역은 비대칭 돌연변이를 포함하는, 결합제.
청구항 15-21 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 제1 중쇄 불변 영역(CH)에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407, 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 대응하는 위치의 적어도 하나의 아미노산이 치환되고, 상기 제2 중쇄 불변 영역(CH)에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407, 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 대응하는 위치의 적어도 하나의 아미노산이 치환되며, 여기서 상기 제1 중쇄와 상기 제2 중쇄는 동일한 위치에서 치환되지 않은 것인, 결합제.
청구항 22에 있어서,
(i) EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 F405에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제1 중쇄 불변 영역(CH)에서 L이고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 F409에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제2 중쇄 불변 영역(CH)에서 R이며, 또는 (ii) EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 K409에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제1 중쇄에서 R이고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 F405에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제2 중쇄에서 L인, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 결합제는 동일한 제1 및 제2 항원 결합 영역 및 인간 IgG1 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 2개의 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하는 또 다른 항체에 비해 Fc 매개 이펙터 기능을 더 적은 정도로 유도하는, 결합제.
청구항 24에 있어서, 상기 제1 및 제2 중쇄 불변 영역(CH)은 항체가 변형되지 않은 제1 및 제2 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하는 것을 제외하고 동일한 항체에 비해, 더 적은 정도로 Fc-매개 이펙터 기능을 유도하도록 변형되는, 결합제.
청구항 25에 있어서, 상기 변형되지 않은 제1 및 제2 중쇄 불변 영역(CH) 각각은 SEQ ID NO: 21 또는 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 결합제.
청구항 25 또는 26에 있어서, 상기 Fc-매개 이펙터 기능은 Fcγ 수용체에 대한 결합, C1q에 대한 결합, 또는 Fcγ 수용체의 Fe-매개 가교결합의 유도에 의해 측정되는, 결합제.
청구항 27에 있어서, 상기 Fc-매개 이펙터 기능은 C1q에 대한 결합에 의해 측정되는, 결합제.
청구항 24-28 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 제1 및 제2 중쇄 불변 영역은 상기 항체에 대한 C1q의 결합이 야생형 항체에 비해, 좋기로는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100% 감소되도록 변형된 것이고, 여기서 C1q 결합은 좋기로는 ELISA에 의해 결정되는 것인, 결합제.
청구항 15-29 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 제1 및 제2 중쇄 불변 영역(CH) 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, D265, N297 및 P331에 상응하는 위치의 하나 이상의 아미노산 은 각각 L, L, D, N 및 P가 아닌, 결합제.
청구항 30에 있어서, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치는 상기 제1 중쇄 및 제2 중쇄에서 각각 F 및 E인, 결합제.
청구항 30 또는 31에 있어서, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235 및 D265에 상응하는 위치는 상기 제1 및 제2 중쇄 불변 영역(HC)에서 각각 F, E 및 A인, 결합제.
청구항 30-32 중 어느 한 청구항에 있어서, 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 두 가지 모두의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치는 각각 F 및 E이고, 여기서 (i) 제1 중쇄 불변 영역의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치는 L이고, 제2 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치는 R이며, 또는 (ii) 제1 중쇄 불변 영역의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치는 R이고, 제2 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치는 L인, 결합제.
청구항 30-33 중 어느 한 청구항에 있어서, 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 두 가지 모두의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235 및 D265에 상응하는 위치는 각각 F, E, 및 A이고, 여기서 (i) 제1 중쇄 불변 영역의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치는 L이고, 제2 중쇄 불변 영역의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치는 R이며, 또는 (ii) 제1 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치는 R이고, 제2 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치는 L인, 결합제.
청구항 15-34 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 중쇄의 불변 영역은:
a) SEQ ID NO: 21 또는 29 [IgG1-FC]에 제시된 서열;
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 10개의 치환, 예를 들어 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 또는 구성되는, 결합제.
청구항 15-34 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 중쇄, 예컨대 제2 중쇄의 불변 영역은:
a) SEQ ID NO: 22 또는 30에 제시된 서열 [IgG1-F405L];
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 9개의 치환, 예컨대 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 또는 구성되는, 결합제.
청구항 15-34 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 중쇄, 예컨대 제1 중쇄의 불변 영역은:
a) SEQ ID NO: 23 또는 31 [IgG1-F409R]에 제시된 서열;
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 10개의 치환, 최대 9개의 치환, 예컨대 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개의 치환, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 또는 구성되는, 결합제.
청구항 15-34 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 중쇄의 불변 영역은:
a) SEQ ID NO: 24 또는 32 [IgG1-Fc_FEA]에 제시된 서열;
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 7개의 치환, 예를 들어 최대 6개의 치환, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 또는 구성되는, 결합제.
청구항 15-38 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 중쇄, 예컨대 제2 중쇄의 불변 영역은:
a) SEQ ID NO: 25 또는 33 [IgG1-Fc_FEAL]에 제시된 서열;
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 6개의 치환, 예를 들어 최대 5개의 치환, 최대 4개의 치환, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 또는 구성되는, 결합제.
청구항 15-39 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 중쇄, 예컨대 제1 중쇄의 불변 영역은:
*a) SEQ ID NO: 26 또는 34 [IgG1-Fc_FEAR]에 제시된 서열;
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 6개의 치환, 예를 들어 최대 5개의 치환, 최대 4개의 치환, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 또는 구성되는, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 결합제는 카파(κ) 경쇄 불변 영역을 포함하는, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 결합제는 람다(λ) 경쇄 불변 영역을 포함하는, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 제1 경쇄 불변 영역은 카파(κ) 경쇄 불변 영역 또는 람다(λ) 경쇄 불변 영역인, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 제2 경쇄 불변 영역은 람다(λ) 경쇄 불변 영역 또는 카파(κ) 경쇄 불변 영역인, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 제1 경쇄 불변 영역은 카파(κ) 경쇄 불변 영역이고, 상기 제2 경쇄 불변 영역은 람다(λ) 경쇄 불변 영역이거나 또는 상기 제1 경쇄 불변 영역은 람다(λ) 경쇄 불변 영역이고, 상기 제2 경쇄 불변 영역은 카파(κ) 경쇄 불변 영역인, 결합제.
청구항 41-45 중 어느 한 청구항에 있어서, 카파(κ) 경쇄는
a) SEQ ID NO: 27에 제시된 서열,
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단으로부터 시작하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 10개의 치환, 예를 들어 최대 9개의 치환, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개의 치환, 최대 3개, 최대 2개의 치환 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 결합제.
청구항 42-46 중 어느 한 청구항에 있어서, 람다(λ) 경쇄는:
a) SEQ ID NO: 28에 제시된 서열,
b) a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 a)에 정의된 서열의 N-말단 또는 C-말단으로부터 시작하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열; 및
a)의 서열의 하위 서열, 예를 들어 N-로부터 시작하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실된 하위 서열 a)에 정의된 서열의 말단 또는 C-말단; 그리고
c) 서열 a) 또는 b)에 정의된 아미노산 서열과 비교하여 최대 10개의 치환, 예를 들어 최대 9개의 치환, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개의 치환, 최대 3개, 최대 2개의 치환 또는 최대 1개의 치환을 갖는 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서, 결합제는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택되는 이소형인, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서, 결합제는 전장 IgG1 항체인, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서, 결합제는 IgG1m(f) 동종이형의 항체인, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서, 대상체는 인간 대상체인, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서,, 종양 또는 암은 고형 종양 또는 암인, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서, 종양 또는 암은 흑색종, 난소암, 폐암(예를 들어, 비소세포폐암(NSCLC)), 대장암, 두경부암, 위암, 유방암, 신장암, 요로상피암, 방광암, 식도암, 췌장암, 간암, 흉선종 및 흉선암종, 뇌암, 신경교종, 부신피질암종, 갑상선암, 기타 피부암, 육종, 다발성 골수종, 백혈병, 림프종, 골수이형성증후군, 자궁내막암, 전립선암, 음경암, 자궁경부암, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 메르켈 세포 암종 및 중피종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서, 종양 또는 암은 흑색종, 폐암, 대장암, 췌장암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 결합제.
청구항 53 또는 54에 있어서, 종양 또는 암은 흑색종, 예컨대 피부 흑색종 또는 말단 흑색종인, 결합제.
청구항 55에 있어서, 흑색종은 절제 불가능한 흑색종, 특히 절제 불가능한 III기 또는 IV기 흑색종인, 결합제.
청구항 55 또는 56에 있어서, 대상체는 체크포인트 억제제를 사용한 사전 치료를 받은 적이 없는 대상체인, 결합제.
청구항 55-57 중 어느 한 청구항에 있어서, 대상체는 절제 불가능한 흑색종 또는 전이성 흑색종에 대한 전신 항암 치료를 사전에 받은 적이 없는, 결합제.
청구항 53 또는 54에 있어서, 종양 또는 암은 폐암, 특히 비소세포폐암(NSCLC), 예를 들어 편평 또는 비-편평 NSCLC인, 결합제.
청구항 59에 있어서, 폐암, 특히 NSCLC는 표피 성장 인자(EGFR)-감작 돌연변이 및/또는 역형성 림프종(ALK) 전위/ROS1 재배열을 갖지 않는, 결합제.
청구항 59 또는 60에 있어서, 폐암, 특히 NSCL는가 암 세포를 포함하고 PD-L1은 암 세포의 ≥1%에서 발현되는, 결합제.
청구항 59-61 중 어느 한 청구항에 있어서, 대상체는 체크포인트 억제제를 사용한 사전 치료를 받지 않은 대상체인, 결합제.
청구항 53 또는 54에 있어서, 종양 또는 암은 두경부암, 특히 두경부 편평 세포 암종(HNSCC)인, 결합제.
청구항 63에 있어서, 대상체는 체크포인트 억제제를 사용한 사전 치료를 받은 적이 없는 대상체인, 결합제.
청구항 53 또는 54에 있어서, 종양 또는 암은 췌장암, 특히 췌장관 선암종(PDAC)인, 결합제.
청구항 65에 있어서, 대상체는 방사선요법, 수술, 화학요법 또는 조사 요법에 의한 전이성 질환의 사전 치료를 받은 적이 대상체인, 결합제.
청구항 65 또는 66에 있어서, 대상체는 체크포인트 억제제를 사용한 사전 치료를 받은 적이 없는 대상체인, 결합제.
청구항 53 또는 54에 있어서, 종양 또는 암은 대장암인, 결합제.
청구항 68에 있어서, 대상체는 체크포인트 억제제를 사용한 사전 치료를 받은 적이 없는 대상체인, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서, 결합제 및 체크포인트 억제제는 적어도 하나의 치료 사이클로 투여되고, 각 치료 사이클은 3주(21일)인, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서, 1회 용량의 결합제와 1회 용량의 체크포인트 억제제는 매 3주마다(1Q3W) 투여되는, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서, 1회 용량의 결합제와 1회 용량의 체크포인트 억제제는 각 치료 사이클의 제1일에 투여되는, 결합제.
선행하는 청구항 중 어느 한 청구항에 있어서, 방법은 상기 대상체에게 하나 이상의 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 결합제.
청구항 73에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제는 하나 이상의 화학요법제, 예컨대 백금계 화합물(예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴), 탁산계 화합물(예를 들어, 파클리탁셀 및 nab-파클리탁셀), 뉴클레오사이드 유사체(예컨대 5-플루오로우라실 및 젬시타빈), 및 이들의 조합(예컨대 시스플라틴/카보플라틴 + 5-플루오로우라실 또는 nab-파클리탁셀 + 젬시타빈)을 포함하는, 결합제.
청구항 73 또는 74에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제는 적어도 하나의 치료 사이클로 투여되고, 각 치료 사이클은 3주(21일)인, 결합제.
청구항 73-75 중 어느 한 청구항에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제의 1회 용량은 적어도 1차 치료 사이클 동안 적어도 매 3주마다 1회(1Q3W), 예컨대 적어도 첫 번째 치료 사이클 동안 매 3주마다 2회(2Q3W) 투여되는 것인, 결합제.
청구항 73 내지 76 중 어느 한 청구항에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제의 1회 용량은 적어도 1차 치료 사이클의 적어도 제1일에, 예컨대 적어도 1차 치료 사이클의 제1일과 제8일에 투여되는, 결합제.
(i) CD40에 결합하는 제1 결합 영역 및 CD137에 결합하는 제2 결합 영역을 포함하는 결합제, (ii) 체크포인트 억제제, 및 선택적으로 (iii) 하나 이상의 추가 치료제를 포함하는, 키트.
청구항 78에 있어서, 결합제 및/또는 체크포인트 억제제 및/또는 하나 이상의 추가 치료제는 청구항 1-50 및 74 중 어느 한 청구항에 정의된 바와 같은, 키트.
청구항 78 또는 79에 있어서, 결합제, 체크포인트 억제제, 및 존재하는 경우 하나 이상의 추가 치료제는 전신 투여용, 특히 주사 또는 주입, 예컨대 정맥 주사 또는 주입용인, 키트.
청구항 78-80 중 어느 한 청구항에 있어서, 대상체에서 종양의 진행을 감소 또는 예방하거나 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 키트.
청구항 81에 있어서, 종양 또는 암 및/또는 대상체 및/또는 방법은 청구항 51-77 중 어느 한 청구항에 정의된 바와 같은, 키트.
대상체에서 종양의 진행을 감소 또는 예방하거나 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 체크포인트 억제제의 투여 전, 투여와 동시, 또는 투여 후에 결합제를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 결합제는 CD40에 결합하는 제1 결합 영역 및 CD137에 결합하는 제2 결합 영역을 포함하는, 방법.
청구항 83에 있어서, 종양 또는 암 및/또는 대상체 및/또는 방법 및/또는 결합제 및/또는 체크포인트 억제제는 청구항 1-77 중 어느 한 청구항에 정의된 바와 같은, 방법.
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