JP2015507930A - 非特異的核酸増幅を低減するための方法及びキット - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の主題をより明白かつ簡明に記載し指摘するために、以下の説明及び添付の特許請求の範囲で使用する特定の用語に対して以下の定義を提供する。本明細書を通じて、特定の用語の例示は非限定例として考えるべきである。
MDAの速さと感度の改良
ヘキサマー配列NNNN*N*N及び75mMのKClと共に標準のGenomiPhi(商標)キットを用いるか、又は「クリーン化」GenomiPhi(例えば、米国特許出願公開第2009/0155859号参照)、GenomiPhi SD(例えば、米国特許第7993839号参照)、又はGenomiPhi AT処方を利用して増幅反応を実施した。小量のSYBRグリーンIを増幅混合物に加え、Bacillus subtilis染色体DNAの希釈系列を用いるTecanプレートリーダーで蛍光増大を経時的にモニターすることにより、リアルタイム増幅を実施した。鋳型なしの対照も分析した(NTC)。
2−アミノ−dAと2−チオ−dTを含有するオリゴヌクレオチドはMDAのカバレージと全体の増幅偏りを改良する
指示された処方の標準GenomiPhi(商標)反応又はMDA反応を100pgのB.subtilis投入DNAで実施した。反応における総増幅はおよそ20000倍であった。増幅されたDNAを処理してライブラリーとし、51ヌクレオチドの読み取り長さでIllumina GA全ゲノム配列決定にかけた。各試料について800−1000万の読み取り値をB.subtilis参照ゲノムに対してマッピングした。図4Aは、ゲノムの長さ全体にわたってカバレージレベルをマップに表したヒストグラムである。相対標準偏差を式:カバレージ標準偏差/平均カバレージ*100により計算した。カバレージギャップの数及びそれらギャップの平均長さも示す。図4Bは、処方を比較する棒グラフである。
2−アミノ−dAと2−チオ−dTを含有するオリゴヌクレオチドはMDA配列偏りを改良する
実施例3に記載した増幅反応について、ゲノムの各100塩基対ウィンドウに対してカバレージレベルを決定した。ウィンドウのGC含量を、そのGC含量を有するウィンドウの部分カバレージに対してプロットした。結果を図5に示す。これらの結果は、アミノ−A/チオ−T及びLNAヌクレオチドを増幅プライマーに含ませると、増大した代表的な増幅及び低下した増幅偏りの両方を提供することを示している。
GenomiPhi AT処方を用いた単一の細菌細胞の増幅
改良されたGenomiPhi AT処方を用いて増幅反応を実施した。小量のSYBRグリーンIを増幅混合物に加え、Tecanプレートリーダーで蛍光増大を経時的にモニターすることによりリアルタイム増幅を実施した。E.coli細胞を、10mM Tris、pH7.5、100mM NaCl、及び0.1mM EDTAを含有する緩衝液で希釈し、FM1−43FX染料(Invitrogen)で染色し、384−ウェルプレートのウェルにスポットし、倒立Fluorescent顕微鏡(Nikon)を用いて細胞をカウントした。1μlの0.2M NaOH、0.015%Tween−20を添加することにより細胞を溶解し、室温で10分インキュベートし、0.5μlの0.4M HCl、0.6M Tris、pH7.5の添加により中和した。この混合物に増幅試薬を加え、反応を指示された時間30℃でインキュベートした。鋳型なしの対照も分析した(NTC)。結果は図6Aにまとめて示す。
Claims (20)
- a)核酸鋳型を用意し、
b)DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、並びに3’末端及び5’末端を有するプライマーを含む核酸鋳型を接触させ、ここで、プライマーは(i)プライマーの融解温度(Tm)を増大させるヌクレオチドアナログと(ii)プライマー−ダイマーの形成を防止するヌクレオチドアナログを含んでおり、
c)核酸鋳型を増幅する
ことを含む、核酸を増幅する方法。 - 核酸鋳型の増幅が等温条件下で行われる、請求項1記載の方法。
- 核酸鋳型の増幅が高いストリンジェンシー条件下で行われる、請求項1記載の方法。
- DNAポリメラーゼがphi29DNAポリメラーゼである、請求項1記載の方法。
- プライマーがランダムプライマーである、請求項1記載の方法。
- プライマーがチオエート化されている、請求項1記載の方法。
- プライマー内の1つのヌクレオチドアナログがヌクレオチド塩基に先行するロックド核酸(LNA)であり、プライマー内へのLNAヌクレオチド塩基の組み込みによりプライマーのTmが増大する、請求項1記載の方法。
- LNAヌクレオチド塩基がプライマーの3’末端に位置していない、請求項7記載の方法。
- プライマー内の1つのヌクレオチドアナログが2−アミノ−デオキシアデノシン(2−アミノ−dA)であり、2−アミノ−dAの組み込みによりプライマーのTmが増大する、請求項1記載の方法。
- プライマーがさらにヌクレオチドアナログ2−チオ−デオキシチミジン(2−チオ−dT)を含み、プライマー内のヌクレオチドアナログ2−アミノ−dA及びヌクレオチドアナログ2−チオ−dTの組み込みによりプライマー−ダイマーの形成が防止される、請求項9記載の方法。
- プライマーかさらに、ヌクレオチド塩基に先行するLNAを含む、請求項10記載の方法。
- プライマーがヘキサマーである、請求項1記載の方法。
- ヘキサマーが(atN)(atN)(atN)(atN)(atN)*Nの一般構造を有しており、ここで、(atN)は5’末端であり、*Nはヘキサマーの3’末端ヌクレオチドであり、「N」はデオキシアデノシン(dA)、デオキシシチジン(dC)、デオキシグアノシン(dG)、又はデオキシチミジン(dT)を表し、「+」はヌクレオチド塩基に先行するLNAを示し、(atN)は2−アミノ−dA、dC、dG、及び2−チオ−dTのランダム混合物を表し、「*」はホスホロチオエート結合を表す、請求項12記載の方法。
- 核酸鋳型の増幅がローリングサークル増幅法(RCA)又は多重置換増幅法(MDA)からなる、請求項1記載の方法。
- 方法により、痕跡量の核酸の増幅が可能である、請求項1記載の方法。
- (a)DNAポリメラーゼ、
(b)デオキシリボヌクレオシド三リン酸、並びに
(c)3’末端及び5’末端を有するプライマーであって、(i)プライマーの融解温度(Tm)を増大させるヌクレオチドアナログ及び(ii)プライマー−ダイマーの形成を防止するヌクレオチドアナログを含む、前記プライマー
を含む、核酸を増幅するためのキット。 - DNAポリメラーゼがphi29DNAポリメラーゼである、請求項16記載のキット。
- プライマーがヘキサマーである、請求項16記載のキット。
- ヘキサマーが(atN)(atN)(atN)(atN)(atN)*Nの一般構造を有しており、ここで、ヘキサマーの5’末端が(atN)であり、ヘキサマーの3’末端が*Nであり、「N」はdA、dC、dG、又はdTを表し、(atN)は2−アミノ−dA、dC、dG、及び2−チオ−dTのランダム混合物を表し、「*」はホスホロチオエート結合を表す、請求項18記載のキット。
- プライマーがヌクレオチドアナログ2−アミノ−dA及びヌクレオチドアナログ2−チオ−dTを含む、請求項18記載のキット。
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