FR3129407A1 - Methode de detection de la presence d’un pathogene et determination de ses caracteristiques en sante humaine et animale - Google Patents
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Abstract
L’invention a trait au domaine du diagnostic pour la détection des pathogènes en santé humaine et animale. Plus particulièrement, elle concerne une méthode de détection de la présence d’un pathogène et de détermination de ses caractéristiques de virulence et de résistance aux traitements pour une prise en charge adaptée. Elle concerne également un kit de diagnostic prêt-à-l’emploi pour la mise en œuvre de la méthode.
Description
L’invention a trait au domaine du diagnostic pour la détection des pathogènes en santé humaine et animale. Plus particulièrement, elle concerne une méthode de détection de la présence d’un pathogène et de détermination de ses caractéristiques de virulence et de résistance aux traitements pour une prise en charge adaptée. Elle concerne également un kit de diagnostic prêt-à-l’emploi pour la mise en œuvre de la méthode.
Domaine de l’invention
Le fait de pouvoir diagnostiquer simplement et rapidement la présence d’un pathogène en santé humaine ou animale constitue un enjeu de santé publique majeur. Les besoins sont soutenus par l’apparition de nouvelles infections comme celle provoquée par le SARS-Cov2.
Les outils de diagnostic sont des aides précieuses pour l’identification des maladies infectieuses mais également pour leur suivi : propagation, apparition de nouveaux variants, évolution des variants,
L’état de l’art enseigne de nombreuses méthodes de détection de la présence de pathogènes utilisant la méthode de PCR. Cependant la fiabilité de ces méthodes peut être incertaine en fonction de la méthode de détection employée. En effet, lors de la réalisation d’une méthode classique de PCR, des polymères peuvent se former, résultant d’un mauvais appariement des séquences d’amorces et des séquences de l’ADN ciblées. La formation de ces polymères, notamment de dimères, joue un rôle déterminant dans la fiabilité des résultats obtenus lors de la révélation des séquences amplifiées. La présence de polymérisations entraine en effet de faux positifs, notamment si la révélation se fait sur bandelette immunologique. La neutralisation de ces polymères est donc essentielle à l’obtention de résultats fiables.
Pour limiter la formation de ces polymères, l’état de la technique propose différentes solutions.
Le document WO2006112818A2 décrit un procédé réduisant la formation de dimères en ajoutant des nucléo-bases modifiées à l‘extrémité 3’ des amorces. Le document prévoit des polynucléotides comprenant au moins une pyrimidine nucléo-base modifiée et pas plus de 4 nucléotides à l'extrémité 3’ du polynucléotide.
Le document EP2814976 B1 propose un procédé permettant de réduire la formation non spécifique d’acide nucléique dimérique ou polymérique dans lequel la 2-amino-désoxyadénosine (2-amino-dA), la 2-thio-désoxythymidine (2-thio-dT) ou d'autres analogues nucléotidiques d'intérêt sont incorporés dans les hexamères aléatoires utilisés pour l'amplification de l’acide nucléique cible.
Bien que fonctionnelles, les méthodes connues de l’état de la technique sont imparfaites. En effet, elles proposent la conception d’amorces spécifiques Single Nucleotide Polymorphism (SNP) par une méthode PCR avec des ajouts de nucléo-bases, ce qui est plus complexe, un certain niveau de technicité et requiert plus de temps.
Une des méthodes de détection déjà connue de l‘état de la technique, est celle utilisant l’amplification par recombinase polymérase qui permet de mettre en évidence la présence d’un marqueur spécifique caractérisant un bio-agresseur d’un végétal (aussi connue sous le nom de Flashdiag). Cette méthode se caractérise par : le prélèvement d’un morceau de feuille présentant un symptôme, l’extraction de l’ADN de l’échantillon par des étapes de broyages et de filtrations, l’échantillon est ensuite placé dans un tube contenant les sondes et les amorces nécessaires à la détection et le mélange subit une amplification par recombinase polymérase, enfin, pour la révélation des résultats, une bandelette immunologique est placée dans le tube de mix, avec les réactifs de PCR dont des amorces 3’ et 5’ ADN spécifiques.
Il existe un réel besoin de disposer de nouveaux outils de diagnostic destinés au domaine de la santé qui permettent des détections rapides, fiables, qui soient faciles d’utilisation et accessibles au plus grand nombre afin de démocratiser cet usage.
L’invention concerne une méthode de diagnostic de la présence d’au moins un pathogène infectant l’homme ou l’animal. Elle permet également de déterminer les caractéristiques d’intéret associées aux pathogènes détectés telles qu’une variation génétique associée à une modification du comportement du pathogène, une résistance à un traitement, une multi-résistance.
La méthode selon l’invention comprend la mise à disposition d’un échantillon biologique provenant d’un individu suspecté d’être infecté, l’extraction de l’ADN ou ARN dudit échantillon, l’amplification par PCR ou RT-PCR de séquences d’ADN ou ARN du pathogène pour déterminer i) la présence de ce dernier grâce à un couple d’amorces spécifiques permettant d’amplifier une séquence caractéristique de ce pathogène, ii) la présence éventuelle d’au moins une variation génétique associée à une modification du comportement du pathogène, ou responsable d’une résistance à un traitement, cette amplification étant réalisée en présence d’ADN interférents complémentaires des parties des amorces capables de former entre elles des polymères afin d’éviter la formation de bandes aspécifiques sur les bandelettes immunologique responsables de faux-positifs ; la révélation de la présence dudit pathogène et éventuellement d’une résistance de ce dernier est réalisée sur des bandelettes immunologiques (par exemple de type nitrocellulosique DAS-ELISA). Dans un mode de réalisation préféré de l’invention, une enzyme de restriction est ajoutée à l’échantillon après extraction et avant amplification de sorte à éliminer la copie sauvage du codon correspondant au codon portant la mutation recherchée pour éviter l’amplification de séquences non spécifiques qui donneraient des faux-positifs.
L’invention concerne également un kit de détection de la présence d’un pathogène et de détermination de ses caractéristiques d’intérêt adapté à une utilisation hors laboratoire (sur le terrain, par exemple en milieu naturel) mais utilisable également au laboratoire, en particulier dans les laboratoires de disposant pas de matériel dédié au diagnostic moléculaire.
Avantage de l’invention
La présente invention répond à un besoin du monde médical en proposant une méthode de diagnostic rapide, fiable et facile d’interprétation permettant de mettre en évidence à la fois la présence d’un pathogène et de caractériser ce dernier quant l’existence d’une variation génétique associée à une modification du comportement du pathogène ou d’une résistance à un traitement. Cette méthode est basée sur une amplification par PCR quantitative pouvant être réalisée grâce un dispositif portatif de type « point-of-care » et une détection sur bandelettes immunologiques.
L’amplification par PCR permet une détermination rapide et efficace d’un pathogène et d’une mutation/ variation génétique d’intérêt. L’extrait d’ADN ou ARN de l’échantillon est directement introduit dans un mélange contenant les amorces spécifiques du pathogène et d’autres spécifiques d’autres mutations d’intérêt et l’ensemble est soumis à une étape d’amplification par PCR ou RT-PCR suivie de la révélation des résultats grâce à une bandelette immunologique. Les résultats sont obtenus par détectionviades anticorps fixés sur la bandelette d’un marqueur antigénique fixé à l’extrémité des amorces amplifiées. Cette méthode ne requiert aucune sonde ADN ou ARN et permet un enchainement des étapes simple et rapide.
Lors d’une PCR, les amorces utilisées dans le mélange peuvent former des polymères. En règle générale et en lecture sur gel, cela n’induit qu’une perte d’efficacité du système, plus ou moins importante en fonction du polymère formé. Par contre, lorsque la technologie utilise la révélation sur bandelette immunologique, cela induit, en plus, la formation de « faux positifs ». En effet, la bandelette est capable de repérer un polymère, si celui-ci possède bien les deux marqueurs antigéniques nécessaires à chaque extrémité du dimère ou polymère formé. Dans ce cas, une bande s’allumera alors que l’échantillon est négatif.
Ainsi, pour éviter l’apparition de faux-positifs et augmenter la fiabilité de la méthode, les inventeurs ont mis en évidence, de manière inattendue, que l’ajout d’ADN interférents agit significativement sur la formation de polymères entre amorces, évitant ainsi l’apparition de bandes aspécifiques responsables de faux-positifs. Contrairement à ce que l’art antérieur enseigne, l’ADN interférent ajouté n’est pas lié ici à une amorce.
Grâce à l’utilisation d’ADN interférents, il est possible d’augmenter le nombre d’amorces présentes dans les mélange, tout en étant capable d’éviter l’apparition de faux positifs. Ainsi, l’invention propose de détecter simultanément 4 marqueurs dans une même réaction PCR en utilisant deux bandes de révélation pour 2 marqueurs chacune.
Afin d’augmenter encore la robustesse et la fiabilité requises pour une application de la méthode au diagnotic médical, les inventeurs ont ajouté une étape d’élimination des séquences sauvages susceptibles d’être amplifiées de manière aspécifique en coupant ces dernières au niveau du codon sauvage correspondant au codon comprenant la mutation recherchée, grâce à l’usage d’enzymes de restriction. Les enzymes de restriction utilisées sont spécifiques du codon sauvage correspondant au codon muté portant la mutation recherchée.
La combinaison de l’utilisation d’une part d’enzymes de restriction et d’autre part d’ADN interférents, telles que décrites précédemment produit un résultat sur bandelettes pour lequel la fiabilité est très élevée, ce qui est attendu dans le domaine de la santé.
Cette technologie donne donc accès à un outil de diagnostic - de terrain - performant et fiable pour une prise en charge efficace et ciblée de patients.
Le kit selon l’invention est d’utilisation facile et rapide, le résultat étant disponible en moins d’une heure. De plus, le kit a été conçu pour permettre une utilisation par des personnes sans aucune expérience de laboratoire, sans équipement de protection particulier et sans risque pour l’environnement ou le manipulateur (sans composant toxique). Le résultat est présenté sous forme de bandelettes, il est simple à interpréter (point of care quick diagnostic).
Au niveau du service médical rendu, la méthode selon l’invention et les kits associés permettent donc :
- De détecter la présence d’un ou plusieurs pathogènes,
- De déterminer les caractéristiques d’intérêt des pathogènes en vue d’un traitement, en particulier l’existance de résistances médicamenteuses ou multiresistance médicamenteuse,
- De détecter l’apparition d’un variant ou d’une de résistance en cours d’une infection,
- De mettre en place un suivi de l’évolution d’une infection au niveau d’un individu ou d’une population.
La présente invention est applicable au niveau médical tant chez l’homme que chez l’animal. Elle est adaptée à un usage en milieu naturel (diagnostic de terrain), mais également en laboratoire, notamment lorsque celui-ci ne dispose que d’équipement rudimentaire. La mise à disposition de la méthode sous forme d’un kit rend accessible la réalisation de diagnostic dans les cabinets de médecins généralistes et dans les pharmacies.
DESCRIPTION DETAILLE DE L’INVENTION
Un premier objet de l’invention concerne une méthode de diagnostic de la présence d’un pathogène dans un échantillon biologique provenant d’un individu suspecté d’être infecté comprenant les étapes de :
a. Mise à disposition dudit échantillon
b. Extraction de l’ADN ou ARN dudit échantillon
c. Amplification par PCR ou RT-PCR des séquences desdits ADN ou ARN du pathogène pour déterminer la présence dudit pathogène grâce à un couple d’amorces spécifiques permettant d’amplifier une séquence caractéristique dudit pathogène
d. Révélation sur bandelette immunologique de la présence dudit pathogène
dans laquelle l’étape d’amplification se fait en présence d’ADN interférents complémentaires des parties des amorces capables de former entre elles des polymères afin d’éviter la formation de bandes aspécifiques sur les bandelettes immunologiques responsables de faux-positifs.
Cette méthode permet de déterminer si l’individu suspecté d’être infecté par un pathogène l’est effectivement ou s’il s’agit d’une autre pathologie. Elle permet également de déterminer si le pathogène en question possède une résistance à un traitement médicamenteux connu ou s’il porte une autre mutation ponctuelle/ variation génétique associée à une modification du comportement du pathogène afin d’orienter la prise en charge.
Grâce à plusieurs couples d’amorces qui sont spécifiques du ou des pathogènes et/ou d’autres couples d’amorces spécifiques des principales mutations responsables d’une ou plusieurs résistances aux médicaments ou caractéristiques de variant connu, cette méthode propose un diagnostic complet.
La présence d’ADN interférents pendant l’étape d’amplification permet de réduire le nombre de faux-positifs lors de la révélation sur bandelette. Dans un mode de réalisation préféré de l’invention, l’ADN extrait est traité par mise en contact avec une enzyme de restriction avant amplification. Cette enzyme est choisie de sorte à couper l’ADN génomique, spécifiquement au niveau d’un codon sauvage (le codon muté étant la cible recherchée) avant de réaliser la PCR ciblant spécifiquement le codon muté (SNP). Grâce à cette étape, seule la séquence recherchée est amplifiée et l’on empêche les amplifications non spécifiques ; par conséquent l’obtention de faux-positifs est évitée. Cette diminution des faux-positifs est cruciale pour des applications vétérinaires et médicales.
Les enzymes de restriction étant spécifiques de l’ADN, la méthode comprenant une étape d’utilisation de telles enzymes sera de préférence mise en œuvre à partir l’ADN génomique. Il est toutefois possible d’adapter cette méthode afin de détecter la présence ou les caractéristiques d’un pathogène à partir d’ARN. Dans ce cas particulier, une étape de conversion de l’ARN en ADNc par RT-PCR sera requise avant l’étape de digestion enzymatique. L’homme du métier connait la méthode de RT-PCR. D’autre part, il sait choisir les enzymes de restriction adaptées aux séqeunces que l’on souhaite ne pas être amplifiées (c’est-à-dire les séquences sauvages à éliminer).
L’étape de digestion enzymatique se fait après extraction de l’ADN et peut se faire dans un appareil PCR portatif (point-of-care). En effet, ceci nécessite juste d’ajouter une étape (incubation à une température donnée pendant un temps donné en fonction de l’enzyme utilisée, en général entre 20 et 30 min maximum) au début du programme de PCR d’amplification des mutations visées. L’enzyme de restriction étant ensuite inactivée en tout début des cycles PCR (par une montée en température à 95°C).
Dans un mode de réalisation préféré de l’invention, cette méthode permet de détecter, en plus de la présence d’un premier pathogène, la présence d’au moins un autre pathogène et / ou de déterminer au moins une caractéristique associée à au moins l’un des pathogènes choisie parmi une variation génétique associée à une modification du comportement du pathogène, une résistance à un traitement, une multi-résistance.
Ainsi, la méthode permet d’obtenir simultanément jusqu’à 4 résultats associés à la détection et/ou la caractérisation d’un ou plusieurs pathogènes à partir d’une même réaction d‘amplification. Dans un tel mode de réalisation, la révélation sera effectuée à l’aide de deux bandes qui seront toutes deux imprégnées dans le même mélange de réaction d’amplification.
On entend par « pathogène » au sens de l’invention, tout agent biologiquement actif responsable de symptômes chez l’homme ou l’animal, tel que des virus à ADN simple ou double brin, des bactéries ou des champignons.
On entend par « ADN interférent », des petites séquences d’ADN complémentaires d’une partie d’une amorce. Cette partie d’amorce identifiée peut, lors d’un mauvais appariement durant l’amplification, former des polymères avec les autres amorces. Cela crée alors faux-positifs lors de la révélation des résultats sur les bandelettes. Grâce à une complémentarité totale à la partie d’amorce correspondante, la séquence d’ADN interférent va entrer en compétition avec les autres amorces et empêcher la formation de polymères en évitant des appariement entre elles. Ces séquences sont courtes, généralement inférieures à 15 nucléotides, par exemple de l’ordre d’une dizaine de nucléotides. La concentration de ces ADN interférents et le ratio ADN interférents / amorces doivent être adaptés afin de ne pas nuir à l’efficacité de la PCR.
Par « variation génétique associée à une modification du comportement du pathogène » au sens de l’invention, on entend une mutation ponctuelle ou SNP, qui induit modifie la virulence (capacité infectieuse, aggressivité).
Par « caractéristiques d’intérêt » d’un pathogène, on entend toute caractéristique permettant d’orienter, d’adapter un traitement ou de suivre l’évolution d’une infection au niveau d’un individu ou d’une population. Les caractéristiques d’intérêt comprennent les variations génétiques associées à une modification du comportement du pathogène, mais aussi les caractéristiques de résistance ou multirésistance à un médicament ou cocktail médicamenteux.
Dans un mode de réalisation préféré, le format duplex, c’est-à-dire quatre résultats (2 bandes) sur une même bandelette, la détection sur bandelette se fait grâce à :
- La présence d’anticorps fixés sur la bandelette et formant deux bandes distinctes, chaque bande étant constituée d’anticorps spécifiques d’un marqueur antigénique particulier
- la présence d’un marqueur antigénique spécifique à l’extrémité 5’ de l’une des amorces sens ou antisens et la présence d’un marqueur antigénique commun à tous les couples d’amorces à l’extrémité 5’ de l’autre amorce, lesdits marqueurs étant reconnus par un anticorps spécifique d’une des bandes de la bandelette
- des anticorps capables de se fixer au marqueur antigénique commun à tous les couples d’amorces et porteurs d’un système de révélation.
Dans un mode de réalisation particulier, deux bandes d’une bandelette permettent de révéler respectivement (i) la présence d’un premier pathogène dans l’échantillon, et (ii) la présence d’un second pathogène ou l’existence d’une résistance de ce dernier aux médicaments ou d’une autre caractéristique d’intérêt.
Il est possible d’utiliser une deuxième bandelette avec un deuxieme mélange d’amplification pour révéler deux ou plus autres marqueurs choisis parmi la présence d’un second pathogène ou l’existence d’une résistance de ce dernier aux médicaments ou d’une autre caractéristique d’intérêt.
La révélation sur bandelette permet d’obtenir simultanément deux ou plus résultats disposés sur deux bandes, la troisième bande étant une bande de contrôle attestant que la migration s’est faite correctement. Les deux bandes « résultats » peuvent donner une information simple (par exemple : présence ou non d’un pathogène) ou complexe (résistance à un médicament sans permettre de distinguer parmi plusieurs résistances révélées simultanément par la bandelette). Différents marqueurs peuvent ainsi être combinés sur une même bande donnant un résultat global.
Les marqueurs antigéniques peuvent être choisis parmi les marqueurs bien connus de l’homme du métier tels que la biotine, la digoxigénine, FAM…. Alternativement, le système de révélation peut se baser sur des ligands tels que le système biotine-steptavidine.
Un deuxième objet de l’invention concerne un kit de détection de la présence d’un pathogène ou de ses caractéristiques d’intérêt adapté à une utilisation sur le terrain comprenant :
- Un mélange réactionnel PCR lyophilisé comprenant :
- un couple d’amorces spécifiques permettant d’amplifier une séquence caractéristique dudit pathogène
- des ADN interférents complémentaires des parties des amorces capables de former entre elles des polymères
- une enzyme d’amplification polymérase
- au moins une enzyme de restriction capable de couper l’ADN dudit pathogène spécifiquement au niveau d’au moins un codon sauvage correspondant au codon portant au moins une des mutations recherchées
- Au moins une bandelette de révélation immunologique permettant de révéler la présence dudit pathogène.
Afin de fournir un diagnostic plus complet, dans un mode de réalisation préféré de l’invention le kit comprend également au moins un autre couple d’amorces permettant soit de détecter la présence d’un autre pathogène, soit de déterminer au moins une caractéristique d’intérêt associée à un pathogène choisie parmi une variation génétique associée à une modification du comportement du pathogène, une résistance à un traitement, une multi-résistance.
Dans un mode de réalisation particulier, le kit permet de détecter la présence d’un pathogène et la caractérisation d’une variation génétique associée à une modification du comportement du pathogène, une résistance à un traitement, une multi-résistance ; dans ce kit, le mélange PCR comprend en plus du couple d’amorces spécifiques permettant d’amplifier une séquence caractéristique dudit pathogène et des ADN interférents, un ou plusieurs couples d’amorces spécifiques permettant d’amplifier au moins une mutation responsable d’une modification du comportement du pathogène, une résistance à un traitement ou une multi-résistance. Dans cette configuration, la bandelette comprend une bande contrôle de migration et deux bandes distinctes formées par la fixation d’anticorps spécifiques d’un marqueur antigénique particulier à savoir respectivement :
- un anticorps/ligand spécifique d’un marqueur antigénique situé à l’extrémité 5’ d’une des amorces permettant l’amplification d’une séquence spécifique du pathogène,
- un anticorps/ligand spécifique d’un marqueur antigénique situé à l’extrémité 5’ d’une des amorces permettant l’amplification d’une séquence spécifique d’une caractéristique d’intérêt
- un anticorps spécifique d’un marqueur antigénique commun aux extrémités 3’ des différents produits d’amplification permettant de révéler les bandes.
La révélation des bandes repose sur la présence d’un marqueur à l’extrémité 3’ de chaque produit d’amplification. Ce marqueur présent en 3’ des amorces est amplifié avec la séquence d’intérêt et se retrouve en position 3’ du produit d’amplification.
Le kit peut comprendre 1 bandelette immunologique à utiliser pour révéler 2 ou plus résultats à partir d’une même amplification. Au délà de deux résultats, pluieurs marqueurs sont associés sur une même bande. Ces résulats sont choisis parmi la détection de la présence d’au moins un pathogène et la détermination d’au moins une caractéristique d’intérêt associée à un pathogène. Ce type de kit comprenant plusieurs marqueurs est performant et très informatif pour l’utilisateur, tout en ayant un cout limité du fait que ces résulats sont obtenus en une seule opération. L’utilisation des ADN interférents est particulièrement cruciale pour éviter l’apparition de faux-positifs liés à la complexité du mélange PCR (nombre élevé d’amorces). De plus, l’utilisation d’enzymes de restriction spécifiques des codons sauvages correspondant aux codons portant les mutations recherchées permet d’optimiser l’élimination de faux-positifs.
La bandelette de révélation, au format duplex, comprend trois bandes distinctes formées par la fixation d’anticorps spécifiques d’un marqueur antigénique particulier à savoir respectivement :
- un anticorps/ligand spécifique d’un marqueur antigénique situé à l’extrémité 5’ d’une des amorces permettant l’amplification d’une séquence spécifique du pathogène
- un anticorps/ligand spécifique d’un marqueur antigénique situé à l’extrémité 5’ d’une des amorces permettant l’amplification d’une séquence spécifique d’une résistance ou une multi-résistance à un traitement ou d’une autre caractéristique d’intérêt.
- un anticorps spécifique d’un marqueur antigénique situé à l’extrémité 3’ des différents produits d’amplification permettant de révéler les bandes.
L’invention concerne également une méthode de détection sur le terrain de la présence d’un pathogène dans un échantillon biologique provenant d’un individu suspecté d’être infecté et éventuellement la présence d’un autre pathogène ou de détermination d’une caractéristique d’intérêt d’un pathogène mettant en œuvre un kit tel que défini précédemment, et comprenant les étapes suivantes :
A) Mise à disposition d’un échantillon biologique susceptible de contenir un pathogène,
B) Extraction de l’ADN ou ARN à partir dudit échantillon
C) Introduction de l’ADN extrait dans un tube contenant ledit mélange PCR lyophilisé et au moins une enzyme de restriction.
D) Réalisation d’une amplification par PCR
E) Introduction d’une ou deux bandelette(s) immunologique(s) pour imprégnation dans le tube contenant les amplicons pour révéler si le pathogène est présent et éventuellement si un second pathogène est présent ou si le pathogène présente une caractéristique d’intérêt.
Dans un mode de réalisation préféré de l’invention, cette méthode de diagnostic comprend une étape supplémentaire de digestion de l’ADN par un enzyme de restriction spécifique des codons des séquences sauvages correspondant au codon de la séquence mutée recherchée pour éliminer les faux-positifs.
Cette méthode de diagnostic peut se décliner à façon en fonction des besoins médicaux. Dans le domaine médical, quelques exemples de maladies d’intérêt sont la maladie de Lyme, le covid-19, et toute autre maladie d’origine virale, bactérienne ou fongique. Dans le domaine vétérinaire, on peut citer à titre d’exemple non limitatif la peste porcine.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Exemple de mise en oeuvre de la méthode hors santé: application à la détection et caractérisation de souches du pathogène
Zymo-septoria tritici
avec révélation de deux marqueurs
La présente invention est illustrée à l’aide de l’exemple qui suit qui présente un mode de mise œuvre qui, bien que hors du champ de l’invention, décrit les principes de la méthode pour la détection et caractérisation de souches du pathogèneZymo-septoria tritici.
Une représentation synthétique des étapes de la méthode est présentée à la .
L’amplification des séquences spécifiques du pathogèneZymo-Septoria triticichez les céréales à pailles telles que le blé tendre, l’orge et le blé dur, est réalisée par la méthode de PCR. L’homme du métier connait cette méthode. Les éléments spécifiques développés dans le cadre de la présente invention sont les amorces et les ADN interférents décrites ci-après.
Pour l’amplification du pathogèneZymo-Septoria tritici:
- Amorce sens SEP_F1 : 5'- [5' Digoxigenin] GCCTTCCTACCCCACCATGT -3' (SEQ ID NO.1)
- Amorce anti-sens SEP_R1 : 5'- [5’ 6-FAM] CCTGAATCGCGCATCGTTA -3' (SEQ ID NO.2)
Pour l’amplification d’une mutation induisant une résistance aux fongicides de type MDR:
- Amorce sens MDR1 non spécifique pour la multi-résistance : 5'- [5’BiotinTEG]TACGAGACGAGAAAAAGACAG -3' (SEQ ID NO.3)
- Amorce anti-sens MDR2 spécifique de la multirésistance I : 5'- [5’ 6-FAM]GTCCTAATCGGGTAAAAGA -3' (SEQ ID NO.4)
- Amorce anti-sens MDR3 spécifique de la multirésistance II : 5'- [5’ 6-FAM]CCCCTAAGGTCAAAGAA -3' (SEQ ID NO.5)
- Amorce anti-sens MDR4 spécifique de la multirésistance III : 5'- [5’ 6-FAM] GGTAGGCTTGGCACTC -3' (SEQ ID NO.6)
Pour l’ajout des ADN interférents :
- iADN 1 5'- GGGTAGGA -3' (SEQ ID NO.7)
- iADN 2 5'- ACGATGCG -3' (SEQ ID NO.8)
La composition du mélange PCR est détaillé au Tableau 1.
Tableau 1: Mélange PCR pour la détection deZymo-Septoria triticiet d’une résistance MDR chez ce pathogène
La méthode est mise en œuvre en suivant le protocole suivant à partir d’un kit selon l’invention:
- - Prélèvement d’un échantillon de feuille présentant un symptôme d’infection
2 - Extraction de l’ADN
3 - Réhydratation du culot lyophilisé du mélange PCR avec un tampon de réhydratation et ajout de l’extrait d’ADN de l’échantillon
4 - Amplification des séquences par PCR ; pour cette étape, une machine Jeulin® fonctionnant sur batterie (9 tubes ou 16 tubes selon le modèle) a été utilisée. Elle peut être utilisée à proximité du champ.
Le programme de la PCR utilisé est le suivant :
95°C 3 minutes
95°C 3 secondes
60°C 20 secondes x 40 cycles
5 - Révélation du résultat sur bandelette de nitrocellulose sur laquelle sont fixés des anticorps/ligands capables de reconnaitre les marqueurs antigéniques situés aux extrémités des amorces amplifiées par imprégnation de la bandelette avec le mélange obtenu.
Le principe de révélation du résultat sur bandelette est illustrée à la .
EXEMPLE 2:Exemple de mise en oeuvre de la méthode hors santé : Application à la détection et caractérisation de souches du pathogène Fusarium avec révélation de 4 marqueurs en utilisant 2 bandelettes
Cet exemple illustre l’application de la méthode à la détection simultanée de 4 marqueurs. Bien que cet exemple ne soit pas dans le champ de la présente invention, il présente les principes de la méthode dans un mode de réalisation particulier de révélation simultanée de 4 marqueurs.
En pratique, on introduit 1 bandelette dans le tube de réaction PCR pour révéler 2 marqueurs par bandelette ; il s’agit d’un format quadruplex. Il peut être utilisé pour répondre à la problématque suivante :
- Sur le blé et le maïs lesFusariumsont très fréquents et provoquent des dégâts très importants sur le feuillage, les racines entrainant des verses importantes. De plus, cesFusarium ssp.produisent des mycotoxines dont certaines sont léthales pour l’homme et les animaux quand leurs teneurs dans les aliments dépassent certaines limites (effets cumulatifs dans les tissus comme le foie par exemple, les tissus nerveux, etc. ;
- CesFusariumproduisent des mycotoxines de type Trichothécènes (desoxynivalenol = DON, Nivalénol, T2 et HT2, des Zéaralénone, Fumonisine, etc..).
En présence deFusariumdans un champ de blé, il est possible de caractériser les souches pour leurs résistances à certains fongicides et simultanément connaître le type de mycotoxines qu’elles peuvent produire. Avec 4 marqueurs à disposition, il est possible de:
o utiliser 2 marqueurs pour les résistances aux fongicides (TSR et MDR ou équivalent) et 2 marqueurs pour les types de mycotoxines les plus toxiques comme le DON et Zéaralénone par exemple.
o Si les 2 marqueurs de résistances aux fongicides indiquent que l’on peut efficacement éliminer cefusarium, la récolte sera utilisable en alimentation même si les marqueurs mycotoxines sont positifs ;
o Si les deux marqueurs de résistance aux fongicides indiquent que l’on ne peut pas efficacement éliminer cefusariumla récolte sera utilisable en alimentation même si les marqueurs mycotoxines sont négatifs ; par contre, il faudra détruire la récolte si un des marqueurs mycotoxine est positif.
EXEMPLE 3 : Exemple d’une application en santé animale – Application au diagnostic de la peste porcine
La méthode selon l’invention peut être appliquée au diagnostic de la peste porcine qui est causée par différents virus chez les porcs et les sangliers.
Une première forme de peste est la peste porcine africaine qui affecte les porcs, mais aussi les sangliers, les phacochères, les potamochères et les tiques. L’agent estAsfivirus, un grand virus à ADN double-brin qui se réplique dans le cytoplasme des cellules infectées.
Une deuxième forme est la peste porcine européenne, dite la peste porcineclassique, autre maladie virale contagieuse qui touche les suidés (dont le porc domestique et le sanglier qui en seraient les seuls« réservoirs sauvages connus»), sans être transmissible à l'homme. Son vecteur est un virus à ARN de la famille des Flaviviridés, du genrePestivirus(même genre que le virus responsable de l'hépatite C).
L’intérêt de de la technologie portable, kits Piéton Flashdiag® (type Point-of-care), pour la détection de ces différents virus à ADN et ARN, serait de pouvoir non seulement détecter les virus infectants, sur les animaux, en plein air ou d’élevage, mais aussi leurs variants, principalement dus à des mutations de type une seule paire de base (SNP‘s), phénotypiquement différents, avec des caractéristiques d’agressivité et de capacités infectieuses différentes.
Les kits piéton utilisables sur site, peuvent aussi permettre de faire des tests de surface et d’air (ex : covid-19) pour détecter de tels virus dans l’environnement direct des porcs, en particulier, en conditions d’élevages confinées et/ou d’engraissement.
EXEMPLE 4 : Exemple d’une application en santé humaine – Application au diagnostic de la maladie de Lyme
La maladie de Lyme est une infection humaine dont le principal vecteur de transmission de l’agent infectieux est le tique, présent dans les hautes herbes, pâturages, pelouses récréatives, sous-bois et autres habitats naturels. Transmise par piqûre de tiques duresIxodes, c'est une maladie bactérienne, due à une borrélie.
L'expression « borréliose de Lyme » désigne souvent la « maladie de Lyme européenne », due à une plus grande diversité de borrélies (principalementBorrelia garinii,B. afzelii… ouB. burgdorferiau sens large).
La maladie de Lyme est caractérisée par une grande diversité (génétique, épidémiologique, clinique et diagnostique) car multiviscérale (pouvant affecter divers organes) et multi systémique, pouvant toucher divers systèmes avec donc des manifestations cliniques polymorphes (cutanée, rhumatologique et neurologique). Elle est en expansion, devenue la plus fréquente des maladies vectorielles.
L’intérêt de la technologie portable, kits Piéton Flashdiag® (type point-of care), pour détecter ces différentes bactéries vectrices de la maladie de Lyme, serait de pouvoir non seulement détecter les bactéries infectantes, sur les tiques, en plein air, sur les chiens domestiques ou errants, mais aussi leurs variants, principalement dus à des mutations de type une seule paire de base (SNP), phénotypiquement différents, avec des caractéristiques d’agressivité et de capacités infectieuses différentes.
La détection et la caractérisation des bactéries variantes portées par les personnes infectées est essentielle pour pouvoir administrer les antibiotiques les plus adaptés pour éradiquer les bactéries en cause.
Ainsi les kits Piéton Flashdiag®, pourraient être utiles aux médecins généralistes, aux pharmaciens et en environnements hospitaliers pour un meilleur suivi de cette pathologie en expansion en France, en Europe et aux USA.
Ces tests pratiqués, en amont, sur les tiques vecteurs, et en aval, après infections des humains, peuvent rendent plus fiable le suivi des variants pour cette pathologie.
En conclusion, pour ces 2 exemples d’applications vétérinaire et médicale, les concepts et technologies appliquées aux ADN et ARN dans le domaine végétal (Exemples 1 et 2) sont, sans aucun doute, facilement transposables aux applications sur les mammifères.
L’utilisation combinée des ADN interférents et des enzymes dites de restriction qui réduit l’obtention de faux positifs dans l’approche globale de notre technologie est un gage certain d’une meilleure fiabilité, de sensibilité particulièrement recherché dans les domaines vétérinaire et médical.
Claims (10)
- Méthode de diagnostic de la présence d’un pathogène dans un échantillon biologique provenant d’un individu suspecté d’être infecté comprenant les étapes de :
a. Mise à disposition dudit échantillon
b. Extraction de l’ADN ou ARN dudit échantillon
c. Amplification par PCR desdits séquences d’ADN ou ARN du pathogène pour déterminer la présence dudit pathogène grâce à un couple d’amorces spécifiques permettant d’amplifier une séquence caractéristique dudit pathogène
d. Révélation sur bandelette immunologique de la présence dudit pathogène
dans laquelle l’étape d’amplification se fait en présence d’ADN interférents complémentaires des parties des amorces capables de former entre elles des polymères afin d’éviter la formation de bandes aspécifiques sur les bandelettes immunologiques responsables de faux-positifs. - Méthode selon la revendication 1 comprenant en outre l’ajout d’une enzyme de restriction entre l’étape b. d’extraction et l’étape c. d’amplification, cette enzyme étant capable de couper l’ADN dudit pathogène spécifiquement au niveau d’un codon sauvage correspondant à un codon portant une mutation recherchée.
- Méthode selon l’une des revendications 1 ou 2 permettant en outre de détecter la présence d’au moins un autre pathogène et / ou de déterminer au moins une caractéristique associée à au moins l’un des pathogènes choisie parmi une variation génétique associée à une modification du comportement du pathogène, une résistance à un traitement, une multi-résistance.
- Méthode selon l’une des revendications précédentes permettant d’obtenir simultanément plusieurs résultats associés à la détection et/ou la caractérisation d’un ou plusieurs pathogènes en utilisant une bandelette.
- Méthode selon l’une des revendications précédentes dans laquelle le pathogène à détecter est un virus, une bactérie ou un champignon.
- Kit de détection de la présence d’un pathogène adapté à une utilisation sur le terrain comprenant :
o Un mélange réactionnel PCR lyophilisé comprenant :
- un couple d’amorces spécifiques permettant d’amplifier une séquence caractéristique dudit pathogène
- des ADN interférents complémentaires des parties des amorces capables de former entre elles des polymères
- une enzyme d’amplification polymérase
- une enzyme de restriction capable de couper l’ADN dudit pathogène spécifiquement au niveau du codon sauvage correspondant à un codon portant une mutation recherchée
o Au moins une bandelette de révélation immunologique permettant de révéler la présence dudit pathogène. - Kit selon la revendication 6 dans lequel ledit mélange PCR comprend en outre au moins un autre couple d’amorces permettant (i) soit de détecter la présence d’un autre pathogène, (ii) soit de déterminer au moins une caractéristique d’intérêt associée à un pathogène choisie parmi une variation génétique associée à une modification du comportement du pathogène, une résistance à un traitement, une multi-résistance.
- Kit selon la revendication 7 permettant de détecter la présence d’un pathogène et de déterminer une caractéristique associée à ce pathogène dans lequel :
- Le mélange PCR comprend en outre un ou plusieurs couples d’amorces spécifiques permettant d’amplifier au moins une mutation associée à une caractéristique d’intérêt chez le pathogène
- La bandelette comprend une bande contrôle et deux bandes distinctes formées par la fixation d’anticorps spécifiques d’un marqueur antigénique particulier à savoir respectivement :
o un anticorps/ligand spécifique d’un marqueur antigénique situé à l’extrémité 5’ d’une des amorces permettant l’amplification d’une séquence spécifique du pathogène,
o un anticorps/ligand spécifique d’un marqueur antigénique situé à l’extrémité 5’ d’une des amorces permettant l’amplification d’une séquence spécifique d’une caractéristique,
o un anticorps spécifique d’un marqueur antigénique commun aux extrémités 3’ des différents produits d’amplification permettant de révéler les bandes. - Kit selon l’une des revendications 6 à 8, comprenant 1 bandelette immunologique pour révéler simultanément plusieurs résultats à partir d’une même amplification, lesdits résultats étant choisis parmi la détection de la présence d’au moins un pathogène et la détermination au moins une caractéristique associée à un pathogène choisie parmi une variation génétique associée à une modification du comportement du pathogène, une résistance à un traitement, une multi-résistance.
- Méthode de diagnostic de la présence d’un pathogène dans un échantillon biologique d’un individu suspecté d’être infecté, et de détermination éventuelle de la présence d’un autre pathogène ou d’une caractéristique d’intérêt adaptée au diagnostic de terrain, mettant en œuvre un kit tel que défini à l’une des revendications 6 à 9, et comprenant les étapes suivantes :
A) Mise à disposition d’un échantillon biologique susceptible de contenir un pathogène,
B) Extraction de l’ADN à partir dudit échantillon
C) Introduction de l’ADN extrait dans un tube contenant ledit mélange PCR lyophilisé et au moins un enzyme de restriction
D) Réalisation d’une amplification par PCR
E) Introduction d’une ou deux bandelette(s) immunologique(s) pour imprégnation dans le tube contenant les amplicons pour révéler si le pathogène est présent et éventuellement s’il présente une caractéristique d’intérêt.
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