JP2020533964A - 二本鎖コンカテマーdnaを使用したセルフリータンパク質発現 - Google Patents
二本鎖コンカテマーdnaを使用したセルフリータンパク質発現 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020533964A JP2020533964A JP2020507608A JP2020507608A JP2020533964A JP 2020533964 A JP2020533964 A JP 2020533964A JP 2020507608 A JP2020507608 A JP 2020507608A JP 2020507608 A JP2020507608 A JP 2020507608A JP 2020533964 A JP2020533964 A JP 2020533964A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- double
- sequence
- stranded concatemer
- stranded
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 157
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 136
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 title claims abstract description 114
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 258
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims abstract description 93
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 60
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 52
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 52
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 52
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 113
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 96
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 91
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 56
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 51
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 51
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 42
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 42
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 40
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 claims description 31
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 18
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 claims description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 13
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims description 12
- 239000012212 insulator Substances 0.000 claims description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 9
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 6
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 5
- NOLHIMIFXOBLFF-KVQBGUIXSA-N (2r,3s,5r)-5-(2,6-diaminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol Chemical compound C12=NC(N)=NC(N)=C2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NOLHIMIFXOBLFF-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 4
- PISWNSOQFZRVJK-XLPZGREQSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methyl-2-sulfanylidenepyrimidin-4-one Chemical compound S=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 PISWNSOQFZRVJK-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 4
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 claims 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 252
- 239000000047 product Substances 0.000 description 129
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 74
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 56
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 23
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 21
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 16
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 16
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 16
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 16
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 15
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 13
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 13
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 12
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 12
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- -1 glycosylamine compound Chemical class 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 10
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 9
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 8
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 7
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 6
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 6
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 6
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 6
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 4
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 4
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 3
- 108010007577 Exodeoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 3
- 102100029075 Exonuclease 1 Human genes 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 3
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiothreitol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 101710176276 SSB protein Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 101710126859 Single-stranded DNA-binding protein Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical group 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 2
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000009712 regulation of translation Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical class [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical group NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710116602 DNA-Binding protein G5P Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100029100 Hematopoietic prostaglandin D synthase Human genes 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182474 N-glycoside Natural products 0.000 description 1
- 101100395023 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) his-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 108700011066 PreScission Protease Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 101710162453 Replication factor A Proteins 0.000 description 1
- 101710176758 Replication protein A 70 kDa DNA-binding subunit Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N Xylose Natural products O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000012443 analytical study Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 150000002243 furanoses Chemical group 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 108700024542 myc Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000307 polymer substrate Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N ribothymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010517 secondary reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 238000006177 thiolation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000013715 transcription antitermination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。2017年6月16日に作製された前記ASCIIコピーの名称は、316478-1_SL.txtであり、サイズは5,663バイトである。
RCA産物DNAの生成
RCA産物DNAは、RCA反応により、環状DNA鋳型(プラスミド陽性対照、例えば、pCFE-GFP、又は最小限の発現配列を有するDNAミニサークルのいずれか)から生成した。プラスミド陽性対照であるpCFE-GFPは、1-Step Human Coupled IVTキットの一部として購入した。この精製されたプラスミドは、脳心筋炎ウイルス(EMCV)の内部リボソーム進入部位(IRES)を含み、TurboGFPタンパク質をコードする。
EGFPの最小限の発現配列は、インシリコで設計し、インビトロで合成した。最小限の発現配列は、主にT7プロモーター及び+1配列(結果として生じるmRNAの5'非翻訳領域の最初のリボース位置)に続いて、EGFPコード領域に融合したIRES配列を含有した。T7プレプロモーター配列、T7 phi10プロモーターステムループ、翻訳増強エレメント(TEE)、リボソーム結合配列、リボソーム結合を増強するためのインスレーター配列、リボソーム開始を増強するためのインスレーター配列、T7転写終結配列、ポリアデニル化配列、ペプチドリーダー配列、又はプロテアーゼ切断部位を含む、様々な追加の非コーディングパラメーター及びコーディングパラメーターが最小限の発現配列の設計中に含まれた。最小限の発現配列は、コドン使用のために更に最適化され得る。代表的な最小限の発現配列は、配列番号5(Table 3(表3))として表にされている。配列番号5の最小限の発現配列は、T7プロモーター、EMVC IRES、翻訳開始コドン、EMVCポリタンパク質ORFの翻訳されたN末端(コドン最適化されたEGFPに融合している)、翻訳終止コドン、ポリA束及びT7転写ターミネーター配列を逐次的に含む。
環状DNA鋳型(例えば、プラスミド又はDNAミニサークル)のRCAは、インプットDNA配列のタンデム反復を有する高分子量の超分岐状コンカテマーを生じる。水、反応緩衝液、プライマー、及びDNAポリメラーゼ酵素を含むRCA試薬は、環状DNA鋳型(プラスミド又はミニサークル)又はdNTPを添加する前に30℃で60分間、予め清澄化して、オフターゲット増幅を最小限にした。一部の実施形態では、エキソヌクレアーゼ耐性プライマー及びヌクレオチドを含むプライマー-ヌクレオチドミックスを、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、及び一本鎖DNA結合タンパク質(SSBタンパク質)の組合せとともに、プライマー-ヌクレオチドミックスをインキュベートすることにより混入物除去した。一部の実施形態では、鎖置換型DNAポリメラーゼを含有する酵素ミックスを、場合によりエキソヌクレアーゼの存在下で二価カチオン(例えば、Mg2+)とともにインキュベートすることにより混入物除去した(使用されるDNAポリメラーゼが非プルーフリーディングDNAポリメラーゼを含む場合)。続いて、混入物除去した酵素及びプライマー-ヌクレオチドのミックスを使用して、環状DNA鋳型の増幅を実施した。例えば、200ngのPhi29 DNAポリメラーゼを含有するポリメラーゼ溶液を、15mM KCl、20mM MgCl2、0.01%Tween-20及び1mM TCEPを含有する5μLの50mM HEPES緩衝液(pH=8.0)中で0.1単位のエキソヌクレアーゼIIIとともにインキュベートした。インキュベーションを、30℃で約60分間又は4℃で12時間実施した。混入物除去したPhi29 DNAポリメラーゼ溶液を氷浴に移し、次に、エキソヌクレアーゼIIIを事前に不活性化することなく、標的RCAアッセイに使用した。
真核生物セルフリー抽出物中のプラスミドDNAから生成されたRCA産物DNAの発現
1-Step Human Coupled IVTキットは、脳心筋炎ウイルス(EMCV)の内部リボソーム進入部位(IRES)を含有し、TurboGFPタンパク質をコードする陽性対照ベクターとしてpCFE-GFPを含む。IRES配列のRNAフォールディングは、翻訳効率の調節に著しく影響を与えることが公知であるため、1-Stepインビトロでの転写翻訳(IVTT)キット内の成分は、EMCV IRES活性に最適化されている。
DNAミニサークルから生成されたRCA産物DNAを使用したセルフリータンパク質発現
実施例2からのデータ(図1)は、HeLa細胞溶解物を使用するIVTTアッセイの鋳型としてRCA産物DNAを使用した場合、最適なタンパク質発現のために、プラスミドDNAと比較して、4〜8倍低い濃度のRCA産物DNAが必要であることを示した。この観察は、IVTT反応用のDNAミニサークルから生成されたRCA産物DNAを使用することにより更に確立された。DNAミニサークル鋳型から生成されたRCA産物DNAを調製し、IVTTによるタンパク質発現の比較に利用した。実施例1に記載されるように、EGFPタンパク質をコードするDNA配列(配列番号5)をライゲーションしてミニサークルを形成し、チオ化dATPの存在下でATプライマーを使用してRCAにより増幅した。RCA産物DNAを逐次希釈して、様々な濃度のRCA産物DNAの試料を生成した。様々な濃度のRCA産物DNAを25μLの1-Step Human Coupled IVT反応混合物に添加し、300rpmで穏やかに振とうしながらEppendorf ThermoMixerにおいて30℃で6時間インキュベートした。セルフリーEGFPタンパク質である生成されたIVTT産物を、蛍光分析前に4℃で一晩、フォールディングした。約4μLのIVTT産物をSDS-PAGEで分離し(図3)、488nmのTyphoon variable-mode Imager (GE Healthcare社)を使用して、天然蛍光タンパク質をゲルで検出した。図4は、約125ngのRCA産物DNAがHeLa細胞溶解物中のEGFPの最大のセルフリー発現をもたらしたことを示し、これは、プラスミドDNA鋳型から生成されたRCA産物DNAを使用する実施例2の結果と一致する。図4に示されるように、RCA産物DNA発現収量のうちでガウス分布が観察された。結果として、図4は、ほぼ同等の量のタンパク質が、0.5〜1マイクログラムのインプットRCA DNAから、及び8〜16ナノグラムのインプットRCA DNAから生成されたことを示す。更に、図4は、インプットRCA DNAの量(0.5マイクログラム及び16ナノグラムのインプット等)間の差が96%を超える場合でさえ、セルフリータンパク質発現がほぼ同じであることを示す。対照の目的で、TurboGFPタンパク質を1マイクログラムのpCFE-GFPプラスミドから合成し(キットの製造業者の指示による)、相対的な蛍光出力を比較した。要約すると、図3及び図4は、環状鋳型(図2のDNAミニサークル構築物)から生成されたRCA産物DNAの必要量が、真核生物セルフリー溶解物における所望のタンパク質発現のためのプラスミドDNAの必要量よりも4〜8倍低いことを示す。
DNAミニサークルから生成された磁気ビーズコンジュゲートRCA産物DNAからのセルフリー発現
実施例3からのDNAミニサークル配列(配列番号5)から生成されたビオチン化RCA産物DNAを、ストレプトアビジンビーズにコンジュゲートし、HeLa細胞抽出物におけるインビトロでの転写及び翻訳に使用した。DNAミニサークル(配列番号5)を、ビオチン化ヘキサマープライマー(配列番号7)又は非ビオチン化ATヘキサマー(配列番号6)プライマーを使用してRCAによって増幅し、結果として生じる増幅産物をPicoGreenアッセイによって定量化した。一部の実施形態では、結果として生じる粗製RCA産物を、MICROCON遠心フィルターを使用して予め精製して、ビーズコンジュゲーションの前に過剰なビオチン化ヘキサマープライマーを除去した。粗製又は精製RCA産物DNAをストレプトアビジンビーズと混合して、ビーズのマイクロリットルあたり約24ng又は50ngのRCA産物DNAを捕捉できるようにした。ストレプトアビジンビーズにコンジュゲートしたRCA産物DNAの相対量を、ストレプトアビジンビーズをPstIで消化し、PicoGreenアッセイにより放出されたDNA量を定量化することにより確認した。代表的なビーズ調製プロトコールの定量結果をTable 3(表4)に提示する。収集するために磁石を使用してPBS中でビーズを徹底的に洗浄した後、一定量(2.8μL)のビーズを1-Step Human Coupled IVT反応(25μL)に移し、セルフリーEGFP翻訳を、SDS-PAGEゲルにおける天然蛍光により比較した(図5)。EGFP蛍光を、488nm Typhoon variable-mode Imagerを使用して(ゲル内で)画像化した。図5は、IVTT反応混合物の1マイクロリットルあたり5ngの推定される鋳型濃度でビオチン-ストレプトアビジンカップリングによりストレプトアビジンビーズに捕捉した場合、DNAミニサークルから生成されたRCA産物DNAから蛍光EGFPが効果的に産生されたことを示す。ビオチン化RCA産物DNAは、いかなる中間体精製も必要とせずに、ストレプトアビジンビーズに効果的にカップリングした。予期した通り、非ビオチン化ATプライマーとともにインキュベートしたビーズを使用しても、セルフリーEGFP発現はほとんど観察されないか又は全く観察されなかった。過剰なヘキサマープライマーを除去するためのMICROCONフィルターの使用は、粗製調製プロセス(図5、レーン2を参照されたい)と比較して、より高い非特異的発現に寄与した(図5、レーン3を参照されたい)。対照の目的で、TurboGFPを1マイクログラムのpCFE-GFPプラスミドDNAから合成し(キットの製造業者の指示による)、相対的な蛍光出力を比較した。
Claims (27)
- インビトロでの転写及び翻訳のための方法であって、
二本鎖コンカテマーDNAを真核生物セルフリー発現系と接触させる工程であって、二本鎖コンカテマーDNAが複数のタンデム反復配列を含み、複数のタンデム反復配列の各々が、プロモーターを含む発現配列、キャップ非依存性翻訳エレメント(CITE)、及びオープンリーディングフレームを含む、工程;並びに
真核生物セルフリー発現系において二本鎖コンカテマーDNAからインビトロでタンパク質を発現させる工程
を含み、真核生物セルフリー発現系における二本鎖コンカテマーDNAの最終濃度が約0.1ng/μL〜約35ng/μLの範囲である、方法。 - 真核生物セルフリー発現系における二本鎖コンカテマーDNAの最終濃度が、約0.5ng/μL〜約20ng/μLの範囲である、請求項1に記載の方法。
- 真核生物セルフリー発現系における二本鎖コンカテマーDNAの最終濃度が、約2ng/μL〜約10ng/μLの範囲である、請求項1又は2に記載の方法。
- 真核生物セルフリー発現系における二本鎖コンカテマーDNAの最終濃度が、約3ng/μL〜約7ng/μLの範囲である、請求項1、2又は3に記載の方法。
- キャップ非依存性翻訳エレメント(CITE)が、内部リボソーム進入部位(IRES)、翻訳増強エレメント(TEE)、又はそれらの組合せを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- オープンリーディングフレームが、翻訳を増強するためのコドン最適化配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- オープンリーディングフレームが、発現タンパク質の精製のためのタグ配列、増強したリボソーム認識のためのIRESに由来するアミノ末端ペプチド融合配列、又はそれらの組合せを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 発現配列が、ポリA配列、転写終結配列、インスレーター配列、又はそれらの組合せを更に含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 二本鎖コンカテマーDNAを真核生物セルフリー発現系と接触させる前に、二本鎖コンカテマーDNAを基材に固定する工程を更に含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- インビトロでタンパク質を発現させた後、真核生物セルフリー発現系から基材固定化二本鎖コンカテマーDNAを回収し、回収された基材固定化二本鎖コンカテマーDNAを、続くインビトロでの転写及び翻訳反応に再使用する工程を更に含む、請求項9に記載の方法。
- 二本鎖コンカテマーDNAが、ローリングサークル増幅(RCA)産物DNAである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 二本鎖コンカテマーDNAが、ビオチン化ヌクレオチド、ホスホロチオエート化ヌクレオチド、イノシン含有ヌクレオチド、ロックド核酸(LNA)ヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)ヌクレオチド、2-アミノ-デオキシアデノシン、2-チオ-デオキシチミジン、ポリカチオンヌクレオチド又はそれらの組合せを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- インビトロでの転写及び翻訳のための方法であって、
DNAミニサークルを用意する工程、
DNAミニサークルのローリングサークル増幅を介して二本鎖コンカテマーDNAを生成する工程;及び
生成された二本鎖コンカテマーDNAをインビトロで真核生物セルフリー発現系と接触させて、転写及び翻訳を介して二本鎖コンカテマーDNAからタンパク質を発現させる工程
を含み、真核生物セルフリー発現系における二本鎖コンカテマーDNAの最終濃度が約0.1ng/μL〜35ng/μLの範囲である、方法。 - DNAミニサークルが、プロモーター、キャップ非依存性翻訳エレメント、及びオープンリーディングフレームから本質的になる最小限の発現配列から本質的になる、請求項13に記載の方法。
- 最小限の発現配列が、宿主細胞内におけるプラスミドの増幅に必要とされる任意外来配列を欠いている、請求項14に記載の方法。
- キャップ非依存性翻訳エレメント(CITE)が、内部リボソーム進入部位(IRES)、翻訳増強エレメント(TEE)、又はそれらの組合せを含む、請求項13又は14に記載の方法。
- 最小限の発現配列が、更にインスレーター配列、ポリA配列、転写終結配列、又はそれらの組合せから本質的になる、請求項14、15又は16に記載の方法。
- オープンリーディングフレームが、翻訳を増強するためのコドン最適化配列、発現タンパク質の精製のためのタグ配列、増強したリボソーム認識のためのIRESに由来するアミノ末端ペプチド融合配列又はそれらの組合せを含む、請求項14〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 真核生物セルフリー発現系における二本鎖コンカテマーDNAの最終濃度が、約0.5〜20ng/μLの範囲である、請求項13〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 真核生物セルフリー発現系における二本鎖コンカテマーDNAの最終濃度が、約3ng/μL〜約7ng/μLの範囲である、請求項13〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 二本鎖コンカテマーDNAが、修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はそれらの組合せを含む、請求項13〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 二本鎖コンカテマーDNAが、ホスホロチオエート化ヌクレオチド、ビオチン化ヌクレオチド、イノシン含有ヌクレオチド、ロックド核酸(LNA)ヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)ヌクレオチド、2-アミノ-デオキシアデノシン、2-チオ-デオキシチミジン、ポリカチオンヌクレオチド又はそれらの組合せを含む、請求項13〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 二本鎖コンカテマーDNAを真核生物セルフリー発現系と接触させる前に、二本鎖コンカテマーDNAを基材に固定する工程を更に含む、請求項13〜22のいずれか一項に記載の方法。
- インビトロでタンパク質を発現させた後、真核生物セルフリー発現系から基材固定化二本鎖コンカテマーDNAを回収し、回収された基材固定化二本鎖コンカテマーDNAを、続くインビトロでの転写及び翻訳反応に再使用する工程を更に含む、請求項23に記載の方法。
- ローリングサークル増幅が、約10μM〜約10mMの範囲の最終濃度のデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)及び任意のアルファ-チオdNTPを使用して実施される、請求項13〜24のいずれか一項に記載の方法。
- ローリングサークル増幅が、ヌクレオチド類似体を含むランダムプライマー混合物を使用して実施される、請求項13〜25のいずれか一項に記載の方法。
- ランダムプライマー混合物が、配列+N+N(atN)(atN)(atN)*N(配列番号6)又は5'-ビオチン-NNNN*N*N(配列番号7)を有する、請求項26に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2023007508A JP2023052556A (ja) | 2017-08-11 | 2023-01-20 | 二本鎖コンカテマーdnaを使用したセルフリータンパク質発現 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US15/631,510 | 2017-08-11 | ||
US15/631,510 US11001868B2 (en) | 2017-08-11 | 2017-08-11 | Cell-free protein expression using double-stranded concatameric DNA |
PCT/EP2018/071229 WO2019030155A1 (en) | 2017-08-11 | 2018-08-06 | CELLULAR EXPRESSION OF PROTEINS USING DOUBLE STRANDED CONCATEMARY DNA |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023007508A Division JP2023052556A (ja) | 2017-08-11 | 2023-01-20 | 二本鎖コンカテマーdnaを使用したセルフリータンパク質発現 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020533964A true JP2020533964A (ja) | 2020-11-26 |
JP7258361B2 JP7258361B2 (ja) | 2023-04-17 |
Family
ID=63143138
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020507608A Active JP7258361B2 (ja) | 2017-08-11 | 2018-08-06 | 二本鎖コンカテマーdnaを使用したセルフリータンパク質発現 |
JP2023007508A Pending JP2023052556A (ja) | 2017-08-11 | 2023-01-20 | 二本鎖コンカテマーdnaを使用したセルフリータンパク質発現 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023007508A Pending JP2023052556A (ja) | 2017-08-11 | 2023-01-20 | 二本鎖コンカテマーdnaを使用したセルフリータンパク質発現 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11001868B2 (ja) |
EP (1) | EP3665286B1 (ja) |
JP (2) | JP7258361B2 (ja) |
KR (1) | KR102664617B1 (ja) |
CN (1) | CN110997922B (ja) |
AU (1) | AU2018314605A1 (ja) |
ES (1) | ES2960381T3 (ja) |
WO (1) | WO2019030155A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10077459B2 (en) | 2016-05-04 | 2018-09-18 | General Electric Company | Cell-free protein expression using rolling circle amplification product |
CA3104859A1 (en) * | 2018-07-03 | 2020-01-09 | Leidos, Inc. | Materials and methods for cell-free expression of vaccine epitope concatemers |
US20200392554A1 (en) * | 2019-06-13 | 2020-12-17 | General Electric Company | Expression of products from nucleic acid concatemers |
AU2020373280A1 (en) | 2019-10-30 | 2022-05-05 | Progeneer, Inc. | Programmed DNA-driven self-assembled RNA hydrogel |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005065694A (ja) * | 2003-08-05 | 2005-03-17 | Shimadzu Corp | Dna固定化方法、タンパク質合成方法、プロテインチップ作成方法及びキット |
US20050260653A1 (en) * | 2004-04-14 | 2005-11-24 | Joshua Labaer | Nucleic-acid programmable protein arrays |
JP2008522628A (ja) * | 2004-12-11 | 2008-07-03 | サイトジェニックス, インコーポレイテッド | 高品質核酸のセルフリー生合成及びその使用 |
JP2015507930A (ja) * | 2012-02-15 | 2015-03-16 | ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ | 非特異的核酸増幅を低減するための方法及びキット |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE551431T1 (de) * | 2001-05-14 | 2012-04-15 | Henry Hongjun Ji | Neues verfahren zur klonierung von sequenzen variabler domänen des immunologischen genrepertoires |
US7405062B2 (en) | 2002-05-14 | 2008-07-29 | San Diego Antibody | Method for cloning variable domain sequences of immunological gene repertoire |
AU2003301883A1 (en) * | 2002-10-30 | 2004-06-07 | University Of Tennessee Research Foundation | Modified luciferase nucleic acids and methods of use |
US7351563B2 (en) * | 2005-06-10 | 2008-04-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Cell-free extracts and synthesis of active hydrogenase |
US20080124707A1 (en) * | 2006-06-09 | 2008-05-29 | Agency For Science, Technology And Research | Nucleic acid concatenation |
WO2009060857A1 (ja) | 2007-11-05 | 2009-05-14 | Riken | 膜タンパク質の製造方法 |
US8715732B2 (en) | 2009-01-05 | 2014-05-06 | Cornell University | Nucleic acid hydrogel via rolling circle amplification |
SG177395A1 (en) * | 2009-07-07 | 2012-02-28 | Agency Science Tech & Res | Methods of identifying a pair of binding partners |
US9528137B2 (en) * | 2013-03-15 | 2016-12-27 | Northwestern University | Methods for cell-free protein synthesis |
US10011830B2 (en) | 2013-05-19 | 2018-07-03 | The Board of Trustee of theLeland Stanford junior University | Devices and methods for display of encoded peptides, polypeptides, and proteins on DNA |
AU2015273933B2 (en) * | 2014-06-10 | 2021-02-11 | CureVac Manufacturing GmbH | Methods and means for enhancing RNA production |
US20170204152A1 (en) * | 2014-07-16 | 2017-07-20 | Moderna Therapeutics, Inc. | Chimeric polynucleotides |
GB201415789D0 (en) | 2014-09-05 | 2014-10-22 | Touchlight Genetics Ltd | Synthesis of DNA |
CN105177110A (zh) * | 2015-09-11 | 2015-12-23 | 中国科学院微生物研究所 | 核酸的检测方法 |
US10077459B2 (en) | 2016-05-04 | 2018-09-18 | General Electric Company | Cell-free protein expression using rolling circle amplification product |
US20200392554A1 (en) * | 2019-06-13 | 2020-12-17 | General Electric Company | Expression of products from nucleic acid concatemers |
CN114540444B (zh) * | 2022-04-23 | 2022-08-09 | 江苏申基生物科技有限公司 | 一种加帽组合物及其制备方法和体外转录反应体系 |
-
2017
- 2017-08-11 US US15/631,510 patent/US11001868B2/en active Active
-
2018
- 2018-08-06 EP EP18752135.6A patent/EP3665286B1/en active Active
- 2018-08-06 CN CN201880051940.XA patent/CN110997922B/zh active Active
- 2018-08-06 JP JP2020507608A patent/JP7258361B2/ja active Active
- 2018-08-06 ES ES18752135T patent/ES2960381T3/es active Active
- 2018-08-06 WO PCT/EP2018/071229 patent/WO2019030155A1/en unknown
- 2018-08-06 AU AU2018314605A patent/AU2018314605A1/en active Pending
- 2018-08-06 KR KR1020207006671A patent/KR102664617B1/ko active IP Right Grant
-
2023
- 2023-01-20 JP JP2023007508A patent/JP2023052556A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005065694A (ja) * | 2003-08-05 | 2005-03-17 | Shimadzu Corp | Dna固定化方法、タンパク質合成方法、プロテインチップ作成方法及びキット |
US20050260653A1 (en) * | 2004-04-14 | 2005-11-24 | Joshua Labaer | Nucleic-acid programmable protein arrays |
JP2008522628A (ja) * | 2004-12-11 | 2008-07-03 | サイトジェニックス, インコーポレイテッド | 高品質核酸のセルフリー生合成及びその使用 |
JP2015507930A (ja) * | 2012-02-15 | 2015-03-16 | ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ | 非特異的核酸増幅を低減するための方法及びキット |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
GAGOSKI, D. ET AL.: ""Gateway-compatible vectors for high-throughput protein expression in pro- and eukaryotic cell-free", J. BIOTECHNOL., vol. 195, JPN6022020689, 2015, pages 1 - 7, ISSN: 0004877117 * |
MUREEV, S. ET AL.: ""Species-independent translational leaders facilitate cell-free expression"", NAT. BIOTECHNOL., vol. 27, JPN6022020690, 2009, pages 747 - 752, XP037923829, ISSN: 0004877118, DOI: 10.1038/nbt.1556 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20190048379A1 (en) | 2019-02-14 |
JP7258361B2 (ja) | 2023-04-17 |
ES2960381T3 (es) | 2024-03-04 |
EP3665286A1 (en) | 2020-06-17 |
US11001868B2 (en) | 2021-05-11 |
KR102664617B1 (ko) | 2024-05-10 |
EP3665286B1 (en) | 2023-09-13 |
WO2019030155A1 (en) | 2019-02-14 |
CN110997922A (zh) | 2020-04-10 |
CN110997922B (zh) | 2024-04-16 |
AU2018314605A1 (en) | 2020-02-06 |
KR20200036925A (ko) | 2020-04-07 |
JP2023052556A (ja) | 2023-04-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7058839B2 (ja) | ローリングサークル増幅産物を使用した無細胞タンパク質発現 | |
US9487775B2 (en) | Method for the synthesis of a bifunctional complex | |
JP7258361B2 (ja) | 二本鎖コンカテマーdnaを使用したセルフリータンパク質発現 | |
US20060115850A1 (en) | Method for the synthesis of DNA fragments | |
EP1073730A1 (en) | Use of a ribozyme to join nucleic acids and peptides | |
JP2024028959A (ja) | 不連続な複数の鋳型から相補的DNA(cDNA)を順序だてて連続的に合成するための組成物およびその方法 | |
EP2687603A1 (en) | T7 promoter variants and methods of using the same | |
WO2022261281A1 (en) | Target initiation and amplification of long dna with nuclease and replisome enzymes | |
CN115552029A (zh) | 用于快速rna-腺苷酸化和rna测序的组合物和方法 | |
US20220002719A1 (en) | Oligonucleotide-mediated sense codon reassignment | |
WO2024140987A1 (en) | Rna circularization | |
JP7016511B2 (ja) | 核酸合成法 | |
WO2023014222A1 (en) | Argonaute-based nucleic acid detection system | |
EP4182448A1 (en) | Thermostable ligase with reduced sequence bias |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210706 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20220215 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20220215 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20220525 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220530 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220830 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20220920 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230120 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20230120 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20230127 |
|
C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20230130 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230306 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230329 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7258361 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |