CN114277103A - 一种基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法，本发明涉及分子生物学领域，涉及核酸扩增以及生物检测领域，包括以下步骤；将单链DNA进行硫代修饰，再进行环化；使单链环状DNA与包含DNA聚合酶、分子拥挤剂、脱氧核糖核苷三磷酸和具有3'末端和5'末端的引物的反应溶液接触；经由滚环扩增来扩增所述单链环状DNA以形成扩增的DNA产物，包括六聚体随机引物设计、快速检测体系配制、一管式扩增检测方法，本发明引物设计为非特异性引物，六聚体随机引物理论上能够结合环型模板的任意位点，从而相比传统的滚环扩增检测具有超高扩增效率，对扩增靶标的选择性广，本方法可为常规核酸检测提供技术方法，具有广泛的潜在应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，涉及核酸扩增以及生物检测领域，具体为一种基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法。
背景技术
滚环扩增技术是一种简单的恒温DNA扩增技术，在DNA聚合酶(Phi29)的催化下通过扩增闭合环状模板产生成千上万的重复序列。相较于变温核酸扩增技术如聚合酶链式反应，RCA不需要昂贵的变温仪器，更适合现场检测。RCA借鉴了微生物种环状DNA复制方式。以phi29DNA聚合酶，在30-37℃左右进行扩增。普通RCA的过程为：引物与环状DNA模板结合后延伸，生成含有大量目的基因的DNA单链。在此基础上，近年来还发展出了多种改进技术，如多位点同时进行扩增的多引物RCA、使用两条引物提高扩增效率的指数RCA，RCA在应用上也十分广泛，通过RCA扩增产物与互补的寡核苷酸结合，包括荧光染料、电化学标签、生物素、抗体、酶和纳米粒子。
尽管RCA扩增在DNA、RNA检测领域应用十分广泛。但在扩增效率方面仍然不足，且往往需要特异性引物触发扩增反应，无法满足使用者需要，使用随机引物结合phi29DNA聚合酶对环状DNA模板扩增，可以10-30分钟内达到凝胶可见的扩增量，扩增2h，RCA扩增产物能够达到絮凝胶状。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法，具备了通过设置引物设计为非特异性引物，六聚体随机引物理论上能够结合环型模板的任意位点，从而引发高效的扩增反应，并且灵敏度高以及对样本的要求低的效果，解决了RCA扩增虽然在DNA、RNA检测领域应用十分广泛，RCA扩增在扩增效率方面仍然不足，且往往需要特异性引物触发扩增反应，无法满足使用者需要的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法，包括以下步骤：
步骤S1：将单链DNA进行硫代修饰，然后将单链DNA进行环化，得到硫代修饰的单链环状DNA；
步骤S2：使单链环状DNA与包含DNA聚合酶、分子拥挤剂、脱氧核糖核苷三磷酸和具有3'末端和5'末端的引物的反应溶液接触；
步骤S3：经由滚环扩增来扩增所述单链环状DNA以形成扩增的DNA产物，滚环扩增温度为30℃，扩增时间为1小时。
可选的，所述步骤S2中引物是六聚体，所述六聚体具有(atN)(atN)(atN)(atN)(atN)*N的通用结构，其中(atN)为所述六聚体的5'端核苷酸且*N为所述六聚体的3'端核苷酸，且其中“N”代表脱氧腺苷(dA)、脱氧胞苷(dC)、脱氧鸟苷(dG)或脱氧胸苷(dT)，(atN)代表2-氨基-dA、dC、dG和2-硫-dT的随机混合物，且“*”代表硫代磷酸酯键。
可选的，所述步骤S2中分子拥挤剂选自PEG400、PEG2000、PEG6000、PEG8000或其组合，所述DNA聚合酶为Phi29DNA聚合酶。
可选的，所述步骤S1中所述单链环状DNA的浓度为5～50nM，所述单链DNA的长度为30～90nt。
可选的，所述步骤S3中滚环扩增包括一种含硫修饰的六聚体随机引物SEQIDNO.1，RCA反应buffer组成：10mMTris-HCl，2mMMgCl2，2mM(NH4)2SO4，0.8mMDTT，2mMdNTP，4mg/mlBSA，2uM6Ns(pH7.5@25℃)。
可选的，还包括一种环化、扩增、检测一管式的高效检测方法，包括不同的buffer成份配制，PH，环化、扩增和检测的时间。
可选的，包括一体化的bufferMix体系2×OnepotbufferMix：10mMTris-HCl，2mMMgCl2，2mM(NH4)2SO4，0.8mMDTT，2mMdNTP，4mg/mlBSA，2uM6Ns，120μlMATP(pH7.5@25℃)；所述一体化检测时间为1.5h；所述扩增的程序为step1：37℃，1min；step2：37℃，30s；step3：37℃，30s(收集一次荧光信号)，gotostep2，循环数为90，阴性对照为无菌超二纯水。
可选的，所述步骤S2中对单链环状DNA进行变性处理，变性处理的体系中含有浓度为0.05mM的EDTA；变性处理包括将单链环状DNA加热到95℃保持3分钟，然后降温到4℃并保持。
可选的，所述步骤S3中在滚环扩增结束后，用BamH1-HF内切核酸酶在37℃处理扩增产物1小时。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
一、本发明相比传统的滚环扩增技术具有灵敏度高，扩增高效，以及对样本的要求低，特别在对低拷贝数和痕量样本具有重要意义。
二、本发明通过设置引物设计为非特异性引物，六聚体随机引物理论上能够结合环型模板的任意位点，从而引发高效的扩增反应。
三、本发明通过对单链环状DNA进行变性处理，变性处理过程中的高温可保证初始模板DNA的充分释放，降温过程可让随机引物和环状DNA模板退火结合。
附图说明
图1为本发明六聚体滚环扩增示意图；
图2为本发明APACE检测引物探针序列表；
图3为本发明实施例中MCRCA扩增和6NRCA扩增产物比对；1表示MCRCA，2表示6NRCA，3阳性，4表示ddH2O；
图4为本发明MCRCA和6NRCA扩增产物荧光检测图；
图5为本发明一管式滚环扩增结合CRISPR-FnCpf1检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下列实施实例中，具体实验条件按照本领域内参考文献或者试剂盒使用说明书进行，所用仪器和耗材，若无特别说明生产厂家者，可根据自身实验室条件按市售渠道获得。
请参阅图1至图5，本实施例中提供一种基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法，包括以下步骤：
步骤S1：将单链DNA进行硫代修饰，然后将单链DNA进行环化，得到硫代修饰的单链环状DNA；
步骤S2：使单链环状DNA与包含DNA聚合酶、分子拥挤剂、脱氧核糖核苷三磷酸和具有3'末端和5'末端的引物的反应溶液接触；
步骤S3：经由滚环扩增来扩增所述单链环状DNA以形成扩增的DNA产物，滚环扩增温度为30℃，扩增时间为1小时。
进一步的，步骤S2中引物是六聚体，所述六聚体具有(atN)(atN)(atN)(atN)(atN)*N的通用结构，其中(atN)为所述六聚体的5'端核苷酸且*N为所述六聚体的3'端核苷酸，且其中“N”代表脱氧腺苷(dA)、脱氧胞苷(dC)、脱氧鸟苷(dG)或脱氧胸苷(dT)，(atN)代表2-氨基-dA、dC、dG和2-硫-dT的随机混合物，且“*”代表硫代磷酸酯键，其中2-氨基-脱氧腺苷的并入提高引物的解链温度，和核苷酸类似物2-硫代-脱氧胸苷，其中在所述引物中核苷酸类似物2-氨基-脱氧腺苷和核苷酸类似物2-硫代-脱氧胸苷的并入防止引物二聚体形成。
进一步的，步骤S2中分子拥挤剂选自PEG400、PEG2000、PEG6000、PEG8000或其组合，所述DNA聚合酶为Phi29DNA聚合酶，具体的Phi29DNA聚合酶能够利用噬菌体Φ29DNA聚合酶，高度扩增DNA，首先随机引物在多个位点与模板DNA退火，接下来Phi29DNA聚合酶在DNA的多个位点同时起始复制，它沿着DNA模板合成DNA，同时取代模板的互补链，被置换的互补链又成为新的模板来进行扩增，从而获得大量高分子量的DNA。
进一步的，步骤S1中所述单链环状DNA的浓度为5～50nM，所述单链DNA的长度为30～90nt。
进一步的，步骤S3中滚环扩增包括一种含硫修饰的六聚体随机引物SEQIDNO.1，RCA反应buffer组成：10mMTris-HCl，2mMMgCl2，2mM(NH4)2SO4，0.8mMDTT，2mMdNTP，4mg/mlBSA，2uM6Ns(pH7.5@25℃)。
进一步的，还包括一种环化、扩增、检测一管式的高效检测方法，包括不同的buffer成份配制，PH，环化、扩增和检测的时间。
进一步的，包括一体化的bufferMix体系2×OnepotbufferMix：10mMTris-HCl，2mMMgCl2，2mM(NH4)2SO4，0.8mMDTT，2mMdNTP，4mg/mlBSA，2uM6Ns，120μlMATP(pH7.5@25℃)；所述一体化检测时间为1.5h；所述扩增的程序为step1：37℃，1min；step2：37℃，30s；step3：37℃，30s(收集一次荧光信号)，gotostep2，循环数为90，阴性对照为无菌超二纯水。
进一步的，步骤S2中对单链环状DNA进行变性处理，变性处理的体系中含有浓度为0.05mM的EDTA；变性处理包括将单链环状DNA加热到95℃保持3分钟，然后降温到4℃并保持，具体的通过对单链环状DNA进行变性处理，变性处理过程中的高温可保证初始模板DNA的充分释放，降温过程可让随机引物和环状DNA模板退火结合。
进一步的，步骤S3中在滚环扩增结束后，用BamH1-HF内切核酸酶在37℃处理扩增产物1小时，通过用BamH1-HF内切核酸酶扩增产物进行处理，BamH1-HF内切核酸酶用于DNA基因组物理图谱的组建；基因的定位和基因分离；DNA分子碱基序列分析，可以提高扩增产物防御能力。
本实施例采用的实验试剂和仪器如下：
仪器：7900HTFastReal-TimeRCR***。
耗材：CRISPR-FnCpf1核酸酶，T4DNAligase，Phi29polymerase，6N(s)，Probe1，Pobe2，定量PCR封口膜(购于BIO-RAD),MCRCA商业化试剂盒(iCloud公示)。
1、T4DNA环化
用TEbuffer稀释上述ssDNA环化靶标模板和锁匙探针至浓度各为10μM，采用无DNAase/RNAse去离子水稀释特异性和非特异性探针至浓度为10μM。锁匙探针的DNA模板用量为20pmol，ssDNA靶标为20pmol，T4DNAligase20U，2μl1×T4DNAligasebuffer，成环温度为37℃，时间为30min。
2、Phi29DNA随机引物扩增
扩增体系中含有一种含硫修饰的六聚体随机引物SEQIDNO.1，该引物能够结合环化产物中任意位点进行指数级扩增，RCA扩增温度为30℃、时间为1h，扩增的产物电泳检测结果如图1所示。
3、荧光检测
取1μl上述扩增的产物用于CRISPR-Cpf1体外剪切反应，体系如下：1μlFnCpf1(1000ng/μl)，1μlcrRNA(100ng/μl)，1μl扩增产物，2μlNEBbuffer2.1，1μlProbe1，1μlProbe2，13μlddH2O，荧光检测采用7900HTFastReal-TimeRCR***，程序设置如下：step1：37℃，1min；step2：37℃，30s；step3：37℃，30s(收集一次荧光信号)，gotostep2，循环数为90，阴性对照为无菌超二纯水。
4、分析检测结果
在结果判定的过程中，如果有扩增曲线，且荧光产量>10000都属于含有模板底物的检测，如果荧光产量>5000，且小于10000，这考虑是模板浓度太低，或者探针浓度低等原因，应考虑增加模板或者浓度，增加样本到合适浓度重复实验即可，如果阴性对照的荧光产量较高>5000表明阴性背景值太高，应从新制备阴性。
通过将滚环扩增与CRISPR-FnCpf1检测相结合，通过对RNA模板的测试，实现了以RNA为模板的DNA成环，得到了检测SARS-CoV-2E基因靶点的特异性探针，具体的，本发明利用了滚环扩增方法，和CRISPR-FnCpf1体外检测体系，通过特异的锁匙探针设计，鉴定了不同冠状病毒的特异性。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法，包括以下步骤：
步骤S1：将单链DNA进行硫代修饰，然后将单链DNA进行环化，得到硫代修饰的单链环状DNA；
步骤S2：使单链环状DNA与包含DNA聚合酶、分子拥挤剂、脱氧核糖核苷三磷酸和具有3'末端和5'末端的引物的反应溶液接触；
步骤S3：经由滚环扩增来扩增所述单链环状DNA以形成扩增的DNA产物，滚环扩增温度为30℃，扩增时间为1小时。
2.根据权利要求1所述的基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法，其特征在于：所述步骤S2中引物是六聚体，所述六聚体具有(atN)(atN)(atN)(atN)(atN)*N的通用结构，其中(atN)为所述六聚体的5'端核苷酸且*N为所述六聚体的3'端核苷酸，且其中“N”代表脱氧腺苷(dA)、脱氧胞苷(dC)、脱氧鸟苷(dG)或脱氧胸苷(dT)，(atN)代表2-氨基-dA、dC、dG和2-硫-dT的随机混合物，且“*”代表硫代磷酸酯键。
3.根据权利要求1所述的基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法，其特征在于：所述步骤S2中分子拥挤剂选自PEG400、PEG2000、PEG6000、PEG8000或其组合，所述DNA聚合酶为Phi29DNA聚合酶。
4.根据权利要求1所述的基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法，其特征在于：所述步骤S1中所述单链环状DNA的浓度为5～50nM，所述单链DNA的长度为30～90nt。
5.根据权利要求1所述的基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法，其特征在于：所述步骤S3中滚环扩增包括一种含硫修饰的六聚体随机引物SEQIDNO.1，RCA反应buffer组成：10mMTris-HCl，2mMMgCl2，2mM(NH4)2SO4，0.8mMDTT，2mMdNTP，4mg/mlBSA，2uM6Ns(pH7.5@25℃)。
6.根据权利要求1所述的基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法，其特征在于：还包括一种环化、扩增、检测一管式的高效检测方法，包括不同的buffer成份配制，PH，环化、扩增和检测的时间。
7.根据权利要求6所述的环化、扩增、检测一管式的高效检测方法，其特征在于：包括一体化的bufferMix体系2×OnepotbufferMix：10mMTris-HCl，2mMMgCl2，2mM(NH4)2SO4，0.8mMDTT，2mMdNTP，4mg/mlBSA，2uM6Ns，120μlMATP(pH7.5@25℃)；所述一体化检测时间为1.5h；所述扩增的程序为step1：37℃，1min；step2：37℃，30s；step3：37℃，30s(收集一次荧光信号)，gotostep2，循环数为90，阴性对照为无菌超二纯水。
8.根据权利要求1所述的基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法，其特征在于：所述步骤S2中对单链环状DNA进行变性处理，变性处理的体系中含有浓度为0.05mM的EDTA；变性处理包括将单链环状DNA加热到95℃保持3分钟，然后降温到4℃并保持。
9.根据权利要求1所述的基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法，其特征在于：所述步骤S3中在滚环扩增结束后，用BamH1-HF内切核酸酶在37℃处理扩增产物1小时。
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