FR3110602A1 - Methode de detection sur le terrain de la presence et de la mutliresistance d’un bio-agresseur, notamment dezymo-septoria tritici,dans des culturescerealieres - Google Patents
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Abstract
L’invention a trait au domaine du diagnostic pour le suivi des souches ou races de bio-agresseurs (champignons, bactéries, virus et insectes). Plus particulièrement, elle concerne une méthode de détection et de caractérisation, directement sur le terrain, de la présence d’une souche/race d’un bio-agresseur et de ses caractéristiques concernant ses types de résistance. Elle concerne également un kit de diagnostic terrain, dit « Piéton-Alerte », prêt-à-l’emploi pour la mise en œuvre de la méthode. Elle est appliquée, en particulier, à la détection et caractérisation des souches du champignon Zymo-Septoria tritici, responsable de la Septoriose du blé qui peut détruire plus de 30% des récoltes des céréales à pailles telles que le blé tendre, l’orge et le blé dur.
Description
L’invention a trait au domaine du diagnostic pour le suivi des souches ou races de bio-agresseurs (champignons, bactéries, virus et insectes). Plus particulièrement, elle concerne une méthode de détection et de caractérisation, directement sur le terrain, de la présence d’une souche/race d’un bio-agresseur et de ses caractéristiques concernant ses types de résistance, TSR et MDR, aux pesticides (modes d’action), ses caractéristiques de virulence par rapport aux plantes hôtes, etc.
Elle concerne également un kit de diagnostic terrain, dit « Piéton-Alerte », prêt-à-l’emploi pour la mise en œuvre de la méthode. Elle est appliquée, en particulier, à la détection et caractérisation des souches du champignonZymo-Septoria tritici,responsable de la Septoriose du blé qui peut détruire plus de 30% des récoltes des céréales à pailles telles que le blé dur, le blé tendre et l’orge.
Domaine de l’invention
La présente invention a trait au domaine du diagnostic de terrain appliqué à la détection et la caractérisation des souches de bio-agresseurs concernant leurs résistances aux pesticides. En particulier, elle concerne la caractérisation du champignon des blésZymo-Septoria tritici. Ce pathogène est responsable de la maladie dite « Septoriose ». Cette maladie, affectant principalement les blés, se rencontre dans toutes les zones de culture des blés à travers le monde. C’est en effet l’une des maladies foliaires la plus préjudiciable de ces cultures, entraînant des pertes de rendement conséquentes (jusqu’à 40 qx/ha).
La septoriose est la première maladie foliaire des blés en France, elle est présente tous les ans. Elle se manifeste par des tâches dites « septoriennes » et peut entrainer une perte de rendement de l’ordre de 30 à 50%.
La septoriose se propage lors de pluies ou d’humidité ambiante. Les pycnides, haploïdes issues d’une mitose, se gorgent d’eau et gonflent. Les pycnides expulsent alors des spores, aussi haploïdes, sous forme de gelée sporifère transparente appelée « cirrhe ». Les spores sont ensuite disséminées par les éclaboussures de pluies. La septoriose peut-être difficile à déceler, notamment car les tâches symptomatiques de la maladie peuvent être assimilées à de simple tâches physiologiques sans évolution. Ainsi, la détermination rapide et fiable de la présence du pathogène est primordial pour permettre un traitement efficace des céréales.
Pour lutter contre cette infection, il est généralement employé des antifongiques de la famille des Qol (Quinone outside Inhibitors), des DMI (Demethylase Inhibitors) plus couramment nommés Triazoles, ou encore des SDHI (Succinate DesHydrogenase Inhibitors).
Cependant, du fait du mode d’action uni-site des antifongiques couramment utilisés et de la pression induite par l’utilisation massive de ces fongicides, des résistances sont apparues chezZymo-Septoria tritici,ce sont des résistances liées à la cible ou « Target-Site Resistance » (TSR).
D’autres types de résistances, dites non liées à la cible, sont également apparues, mettant alors en jeu des mécanismes génétiques indépendants ; on les regroupe sous le nom de « résistance multi-drogues » ou MDR et affectent tous les modes d’action des fongicides utilisés en diminuant drastiquement leurs éfficacités. La MDR affecte, aussi, l’efficacité de nombreux traitements dans le secteur clinique (anticancéreux, antibiotiques, antifongiques), mais également en agriculture. Dans le cas des champignons phytopathogènes, elle diminue l’efficacité de plusieurs modes d’action fongicides, nécessitant l’utilisation de doses plus fortes. La MDR est due à la surexpression de transporteurs membranaires qui expulsent les molécules toxiques des cellules. Chez le champignon responsable de la septoriose du blé,Zymo-Septoria tritici, trois types d’inserts dans le promoteur du gèneMFS1(Major Facilitator Superfamily gene 1) codant un transporteur de la famille des MFS, sont à l’origine de phénotypes MDR chez des isolats du champignon de la Septoriose.
Ce phénomène est particulièrement préoccupant dans le contexte actuel visant à réduire les intrants - dont les pesticides (ex. plan EcoPhyto II). Avec une fréquence moyenne de 26% d’isolats multirésistants dans les populations françaises deZ. triticien 2019 (A-S. Walker, com. pers.), l’application de doses réduites de fongicides peut s’avérer non seulement peu efficace, mais de surcroit favoriser la survie et donc sélectionner les isolats multirésistants. Le développement d’outils permettant d’étudier l’évolution des fréquences des résistances du type TSR et MDR au champ en fonction des traitements appliqués est essentiel.
Dans ce contexte, il est primordial de diagnostiquer rapidement une atteinte des végétaux à la septoriose liée aux résistances TSR et/ou MDR.
L’état de l’art enseigne de nombreuses méthodes de détection utilisant la méthode de PCR quantitative. Cependant la fiabilité de ces méthodes peut être incertaine en fonction de la méthode de détection employée. En effet, lors de la réalisation d’une méthode classique de PCR, des polymères peuvent se former, résultant d’un mauvais appariement des séquences d’amorces et des séquences de l’ADN ciblées. La formation de ces polymères, notamment de dimères, joue un rôle déterminant dans la fiabilité des résultats obtenus lors de la révélation des séquences amplifiées. La présence de polymérisations entraine en effet de faux positifs, notamment si la révélation se fait sur bandelette immunologique. La neutralisation de ces polymères est donc essentielle à l’obtention de résultats fiables.
Pour limiter la formation de ces polymères, l’état de la technique propose différentes solutions.
Le document WO2006112818A2 décrit un procédé réduisant la formation de dimères en ajoutant des nucléo-bases modifiées à l‘extrémité 3’ des amorces. Le document prévoit des polynucléotides comprenant au moins une pyrimidine nucléo-base modifiée et pas plus de 4 nucléotides à l'extrémité 3’ du polynucléotide.
Le document EP2814976 B1 propose un procédé permettant de réduire la formation non spécifique d’acide nucléique dimérique ou polymérique dans lequel la 2-amino-désoxyadénosine (2-amino-dA), la 2-thio-désoxythymidine (2-thio-dT) ou d'autres analogues nucléotidiques d'intérêt sont incorporés dans les hexamères aléatoires utilisés pour l'amplification du nucléique cible acide.
Bien que fonctionnelles, les méthodes connues de l’état de la technique sont imparfaites. En effet, elles proposent la conception d’amorces spécifiques Single Nucleotid Polymorphism (SNP) par une méthode PCR avec des ajouts de nucléo-bases, ce qui est plus complexe, demande plus de technicité et requiert plus de temps.
Une des méthodes de détection déjà connue de l‘état de la technique, est celle utilisant l’amplification par recombinase polymérase qui permet de mettre en évidence la présence d’un marqueur spécifique caractérisant un bio-agresseur (aussi connue sous le nom de Flashdiag). Cette méthode se caractérise par : le prélèvement d’un morceau de feuille présentant un symptôme, l’extraction de l’ADN ou l’ARN de l’échantillon par des étapes de broyages et de filtrations, l’échantillon est ensuite placé dans un tube contenant les sondes et les amorces nécessaires à la détection et le mélange subit une amplification par recombinase polymérase, enfin, le tube est placé dans une cassette de type U-star pour la révélation du résultat grâce à des sondes ADN spécifiques.
Il existe un réel besoin de disposer d’un outil de diagnostic de terrain permettant de détecter rapidement la présence d’un bio-agresseur et d’identifier, par exemple ses résistances aux pesticides pour orienter le choix du ou des traitement(s) à appliquer.
L’invention concerne une méthode de détection sur le terrain, c’est-à-dire hors laboratoire, directement à proximité du champ, de la présence d’un bio-agresseur. Elle permet également de déterminer la résistance de bio-agresseurs aux traitements pesticides, plus particulièrement la détection des résistances TSR et/ou MDR, pour suivre son évolution au champ. Plus particulièrement, l’invention concerne la détection d’une infection des céréales à pailles (orge, blé dur, blé tendre) par l’agent pathogèneZymo-Septoria tritici.
La méthode selon l’invention comprend le prélèvement d’un échantillon de feuille du végétal suspecté d’être infecté, ou d’insectes vecteurs de parasites ou d’adventices (mauvaises herbes) présentes dans la culture, l’extraction de l’ADN ou ARN dudit échantillon, l’amplification par PCR ou RT-PCR de séquences d’ADN ou ARN du bio-agresseur pour déterminer i) la présence de ce dernier grâce à un couple d’amorces spécifiques permettant d’amplifier une séquence caractéristique dudit agresseur, ii) la présence éventuelle d’au moins une mutation responsable d’une résistance à un traitement phytopharmaceutique, cette amplification étant réalisée en présence d’ADN interférents complémentaires des parties des amorces capables de former entre elles des polymères afin d’éviter la formation de bandes aspécifiques sur les bandelettes immunologique responsables de faux-positifs ; la révélation de la présence dudit agresseur et éventuellement d’une résistance de ce dernier est réalisée sur des bandelettes immunologiques (par exemple de type nitrocellulosique DAS-Elisa).
L’invention concerne également un kit de détection de la présence d’un bio-agresseur et de sa résistance aux traitements pesticides, adapté à une utilisation de terrain, en particulier pour la détection des souches du pathogèneZymo-Septoria triticiet leurs résistances aux traitements antifongiques.
Avantage de l’invention
La présente invention répond au besoin du monde agricole en proposant une méthode de détection rapide permettant de mettre en évidence à la fois la présence d’un bio-agresseur et à la fois les multirésistance de ce dernier aux traitements phytopharmaceutiques grâce à une amplification par PCR quantitative et détection sur bandelettes immunologiques. Plus particulièrement, cette méthode s’applique à la détection du pathogèneZymo-Septoria tritici.
L’amplification par PCR permet une détermination rapide et efficace d’un bio-agresseur et d’une mutation, notamment de celle induisant une multi-résistance. L’extrait d’ADN ou ARN de l’échantillon est directement introduit dans un mélange contenant les amorces spécifiques de l’agresseur et d’autres spécifiques aux mutations responsables des résistances et l’ensemble est soumis à une étape d’amplification par PCR suivie de la révélation des résultats grâce à une bandelette immunologique. Les résultats sont obtenus par détectionviades anticorps fixés sur la bandelette d’un marqueur antigénique fixé à l’extrémité des amorces amplifiées. Cette méthode ne requiert aucune sonde ADN ou ARN et permet un enchainement des étapes simple et rapide.
Lors d’une PCR, les amorces utilisées dans le mélange peuvent former des polymères. En règle générale et en lecture sur gel, cela n’induit qu’une perte d’efficacité du système, plus ou moins importante en fonction du polymère formé. Par contre, lorsque la technologie utilise la révélation sur bandelette immunologique, cela induit, en plus, la formation de « faux positifs ». En effet, la bandelette est capable de repérer un polymère, si celui-ci possède bien les deux marqueurs antigéniques nécessaires à chaque extrémité du dimère ou polymère formé. Dans ce cas, une bande s’allumera alors que l’échantillon est négatif.
Ainsi, pour éviter l’apparition de faux positifs et augmenter la fiabilité de la méthode, les inventeurs ont mis en évidence, de manière inattendue, que l’ajout d’ADN interférents agit significativement sur la formation de polymères entre amorces, évitant ainsi l’apparition de bandes aspécifiques responsables de faux-positifs. Contrairement à ce que l’art antérieur enseigne, l’ADN interférent ajouté n’est pas lié ici à une amorce. La méthode est donc robuste et fiable.
Grâce à l’utiisation d’ADN interférents, il est possible d’augmenter le nombre d’amorces présentes dans les mélange, tout en étant capable d’éviter l’apparition de faux positifs. Ainsi, l’invention propose de détecter simultanément 4 marqueurs dans une même réaction PCR en utilisant deux bandes de révélation pour 2 marqueurs chacune. Cette technologie donne donc accès à un outil de diagnostic de terrain performant pour une prise de décision appropriée.
Le kit selon l’invention est d’utilisation facile et rapide, le résultat étant disponible en moins d’une heure. De plus, le kit a été conçu pour permettre une utilisation par des personnes sans aucune expérience de laboratoire, sans équipement de protection particulier et sans risque pour l’environnement ou le manipulateur (sans composant toxique). Le résultat est présenté sous forme de bandelettes, il est simple à interpréter (point of care quick diagnostic).
DESCRIPTION DETAILLE DE L’INVENTION
Un premier objet de l’invention concerne une méthode de détection de terrain de la présence d’un bio-agresseur d’une culture comprenant les étapes de :
- Prélèvement d’un échantillon de feuille du végétal suspecté d’être infecté, ou d’insectes vecteurs de parasites, ou d’adventices présentes dans la culture
- Extraction de l’ADN ou ARN dudit échantillon
- Amplification par PCR desdites séquences d’ADN ou ARN du bio-agresseur pour déterminer la présence dudit bioagresseur grâce à un couple d’amorces spécifiques permettant d’amplifier une séquence caractéristique dudit bioagresseur.
- Révélation sur bandelette immunologique de la présence dudit bio-agresseur
dans laquelle l’étape d’amplification se fait en présence d’ADN interférents complémentaires des parties des amorces capables de former entre elles des polymères afin d’éviter la formation de bandes aspécifiques sur les bandelettes immunologique responsables de faux-positifs.
Cette méthode permet de déterminer si le végétal suspecté par l’agriculteur d’une attaque par un bio-agresseur l’est effectivement ou s’il s’agit d’une autre pathologie ou d’un problème physiologique de la plante. Elle permet également de déterminer si le bio-agresseur en question possède une résistance à un traitement phytopharmaceutique. Grâce à plusieurs couples d’amorces qui sont spécifiques du bio-agresseur et d’autres spécifiques des principales mutations responsables d’une ou plusieurs résistances aux traitements phytosanitaires, cette méthode propose un diagnostic complet.
Dans un mode de réalisation préféré de l’invention, cette méthode permet de détecter, en plus de la présence d’un premier bio-agresseur, la présence d’au moins un autre bio-agresseur et / ou de déterminer au moins une caractéristique associée à un bio-agresseur choisie parmi une résistance à un pesticide liée à la cible, une résistance multi-drogue, une résistance à la chaleur, une résistance à la sécheresse ou à l’humidité.
Ainsi, la méthode permet d’obtenir simultanément jusqu’à 4 résultats associés à la détection et/ou la caractérisation d’un ou plusieurs bio-agresseurs à partir d’une même réaction d‘amplification. Dans un tel mode de réalisation, la révélation sera effectuée à l’aide de deux bandes qui seront toutes deux imprégnées dans le même mélange de réaction d’amplification.
On entend par « bio-agresseur » au sens de l’invention, tout agent biologiquement actif responsable de dégâts sur les végétaux, tels que des virus, des bactéries, des champignons ou des insectes. Cette notion inclut aussi les adventices qui « polluent » les cultures et diminuent les rendements. L’insecte peut être le bio-agresseur ou être le vecteur du bio-agresseur.
On entend par « traitement phytopharmaceutique » ou « pesticide », toute préparation destinée à protéger les végétaux et les produits de culture de la nuisance d’un bio-agresseur en les détruisant, ou en utilisant des répulsifs dans le cas des insectes.
On entend par « ADN interférent », des petites séquences d’ADN complémentaires d’une partie d’une amorce. Cette partie d’amorce identifiée peut, lors d’un mauvais appariement durant l’amplification, former des polymères avec les autres amorces. Cela crée alors une lecture faux positifs des résultats sur les bandelettes. Grâce à cette complémentarité totale à la partie d’amorce correspondante, la séquence d’ADN interférent va entrer en compétition avec les autres amorces et empêcher la formation de polymères en évitant des appariement entre elles. Ces séquences sont courtes, généralement inférieures à 15 nucléotides, par exemple de l’ordre d’une dizaine de nucléotides. La concentration de ces ADN interférents et le ratio ADN interférents / amorces doit être adaptée afin de ne pas nuir à l’efficacité de la PCR.
Dans un mode de réalisation préféré, le format duplex, c’est-à-dire deux résultats (2 bandes) sur une même bandelette, la détection sur bandelette se fait grâce à :
- La présence d’anticorps fixés sur la bandelette et formant trois bandes distinctes, chaque bande étant constituée d’anticorps spécifiques d’un marqueur antigénique particulier
- la présence d’un marqueur antigénique spécifique à l’extrémité 5’ de l’une des amorces sens ou antisens et la présence d’un marqueur antigénique commun à tous les couples d’amorces à l’extrémité 5’ de l’autre amorce, lesdits marqueurs étant reconnus par un anticorps spécifique d’une des bandes de la bandelette
- des anticorps capables de se fixer au marqueur antigénique commun à tous les couples d’amorces et porteurs d’un système de révélation.
Dans un mode de réalisation particulier, la méthode comprend deux des trois bandes permettant de révéler respectivement la présence du bio-agresseur dans l’échantillon, l’existence d’une résistance de ce dernier aux pesticides et la troisième est un contrôle de la fonctionnalité du système de révélation.
Les marqueurs antigéniques peuvent être choisis parmi les marqueurs bien connus de l’homme du métier tels que la biotine, la digoxigénine, FAM….
Dans un mode de réalisation préféré, la méthode de détection selon l’invention est appliquée à la détection de la multi-résistance aux anti-fongiques (aussi appelée « Multi-Drug-Resistence » ou MDR) du pathogèneZymo-Septoria tritici,responsable de la Septoriose, notamment sur des céréales à pailles telles que le blé tendre, le blé dur et l’orge ; l’amplification PCR met en œuvre un mélange comprenant les séquences suivantes :
- Un couple d’amorces spécifiques permettant de détecter la présence dudit bio-agresseur comprenant les séquences SEQ ID NO.1 et SEQ NO ID.2
- Un couple d’amorces permettant la détection d’une multi-résistance comprenant une amorce de séquence SEQ ID NO.3 non spécifique de la multirésistance et une amorce choisie parmi :
- une amorce de séquence SEQ ID NO.4 spécifique de la multi-résistance I ;
- une amorce de séquence SEQ ID NO.5 spécifique de la multi-résistance II ;
- une amorce de séquence SEQ ID NO.6 spécifique de la multi-résistance III ;
- Deux ADN interférents de séquences SEQ ID NO.7 et SEQ ID NO.8.
La multi-résistance I, II et III du pathogèneZymo-Septoria triticiest déterminée respectivement grâce aux séquences suivantes :
- séquence SEQ ID NO.4
- séquence SEQ ID NO.5
- séquence SEQ ID NO.6
en association chacune avec l’amorce de séquence SEQ ID NO.3.
Cette méthode permet de déterminer sur des céréales à pailles, telles que le blé tendre l’orge et le blé dur, la présence du pathogèneZymo-Septoria triticiet de déterminer si ce pathogène possède une multi-résistance induite par une mutation. Les ADN interférents de séquences SEQ ID NO.7 et SEQ ID NO.8 d’ADN permettent de neutraliser la formation de polymères, responsables de la perte d’efficacité de la méthode PCR lors de la lecture sur gel des résultats et l’apparition de faux positif lors de lecture des résultats sur bandelette.
Un deuxième objet de l’invention concerne un kit de détection de la présence d’un bio-agresseur adapté à une utilisation sur le terrain comprenant :
- Un mélange réactionnel PCR lyophilisé comprenant :
- un couple d’amorces spécifiques permettant d’amplifier une séquence caractéristique dudit bio-agresseur
- des ADN interférents complémentaires des parties des amorces capables de former entre elles des polymères
- une enzyme d’amplification polymérase
- Au moins une bandelette de révélation immunologique permettant de révéler la présence dudit bioagresseur
Afin de fournir un diagnostic plus complet, dans un mode de réalisation préféré de l’invention le kit comprend également au moins un autre couple d’amorces permettant soit de détecter la présence d’un autre bio-agresseur, soit de déterminer au moins une caractéristique associée à un bio-agresseur choisie parmi une résistance à un pesticide liée à la cible, une résistance multi-drogue, une résistance à la chaleur, une résistance à la sécheresse ou à l’humidité.
Dans un mode de réalisation particulier, le kit permet de détecter la présence d’un bio-agresseur et la caractérisation d’une résistance de ce bio-agresseur à un pesticide ; dans ce kit, le mélange PCR comprend en plus du couple d’amorces spécifiques permettant d’amplifier une séquence caractéristique dudit bio-agresseur et des ADN intreférents, un ou plusieurs couples d’amorces spécifiques permettant d’amplifier au moins une mutation responsable d’une résistance à un pesticide chez le bio-agresseur. Dans cette configuration, la bandelette comprend trois bandes distinctes formées par la fixation d’anticorps spécifiques d’un marqueur antigénique particulier à savoir respectivement :
- un anticorps spécifique d’un marqueur antigénique situé à l’extrémité 5’ d’une des amorces permettant l’amplification d’une séquence spécifique du bio-agresseur,
- un anticorps spécifique d’un marqueur antigénique situé à l’extrémité 5’ d’une des amorces permettant l’amplification d’une séquence spécifique d’une résistance
- un anticorps spécifique d’un marqueur antigénique commun à tous les couples d’amorces permettant de révéler les bandes.
Le kit peut comprendre 2 bandelettes immunologiques à utiliser simultanément pour révéler 4 résultats à partir d’une même amplification. Ces résulats sont choisis parmi la détection de la présence d’au moins un bio-agresseur et la détermination d’au moins une caractéristique associée à un bio-agresseur choisie parmi une résistance à un pesticide liée à la cible, une résistance multi-drogue, une résistance à la chaleur, une résistance à la sécheresse ou à l’humidité. Ce type de kit comprenant 4 marqueurs est performant et très informatif pour l’utilisateur, tout en ayant un cout limité du fait que ces 4 résulats sont obtenus en une seule opération. L’utilisation des ADN interférents est particulièrement cruciale pour éviter l’apparition de faux-positifs liés à la complexité du mélange PCR (nombre élevé d’amorces).
Dans un mode de réalisation partuculièrement préféré, le kit est appliqué à la détection de la résistance multi-drogues du champignonZymo-Septoria triticiresponsable de la Septoriose, notamment chez les céréales à pailles telles que le blé tendre, l’orge et le blé dur, dans lequel ledit mélange PCR lyophilisé comprend :
- Les amorces permettant de détecter la présence dudit pathogène sont de séquence SEQ ID NO.1 et SEQ NO ID.2
- Les amorces permettant la détection de la multi-résistance comprennent une amorce de séquence SEQ ID NO.3 non spécifique de la multi-résistance et une amorce choisie parmi :
- une amorce de séquence SEQ ID NO.4 spécifique de la multi-résistance I ;
- une amorce de séquence SEQ ID NO.5 spécifique de la multi-résistance II ;
- une amorce de séquence SEQ ID NO.6 spécifique de la multi-résistance III ;
- Les ADN interférents sont de séquences SEQ ID NO.7 et SEQ ID NO.8
La bandelette de révélation, au format duplex, comprend trois bandes distinctes formées par la fixation d’anticorps spécifiques d’un marqueur antigénique particulier à savoir respectivement :
- un anticorps spécifique d’un marqueur antigénique situé à l’extrémité 5’ d’une des amorces permettant l’amplification d’une séquence spécifique deZymo-Septoria tritici,
- un anticorps spécifique d’un marqueur antigénique situé à l’extrémité 5’ d’une des amorces permettant l’amplification d’une séquence spécifique d’une résistance aux pesticides, en particulier une milti-résistance
- un anticorps spécifique d’un marqueur antigénique commun à tous les couples d’amorces permettant de révéler les bandes.
L’invention concerne également une méthode de détection sur le terrain de la présence d’un bio-agresseur dans une culture et éventuellement d’une de ses résistances d’intérêt mettant en œuvre un kit tel que défini précédemment, et comprenant les étapes suivantes :
A) Prélèvement d’un échantillon de feuille suspectée d’être infectée, ou d’insectes vecteutrs de parasites, ou d’adventices présentes dans la culture
B) Extraction de l’ADN ou ARN à partir dudit échantillon
C) Introduction de l’ADN ou ARN extrait dans un tube contenant le mélange PCR lyophilisé tel que défini précédemment
D) Réalisation d’une amplification par PCR (entre 30 et 40 cycles)
E) Introduction d’une ou deux bandelette immunologique pour imprégnation dans le tube contenant les amplicons pour révéler si le bio- agresseur est présent et evnetuellement s’il présente une résistance d’intérêt.
Les résistances d’intéret sont notamment une résistance à un pesticide liée à la cible, une résistance multi-drogue, une résistance à la chaleur, une résistance à la sécheresse ou à l’humidité.
Dans un mode de réalisation préféré, format duplex, cette méthode est appliquée à la détection de la présence du pathogèneZymo-Septoria triticiet à sa résistance aux fongicides.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Détection et caractérisation de souches du pathogène
Zymo-septoria tritici
avec révélation de deux marqueurs
La présente invention est illustrée à l’aide de l’exemple qui suit et présente un mode de réalisation particulier de l’invention à savoir l’application de la méthode de la détection et caractérisation de souches du pathogèneZymo-septoria tritici.
Une représentation synthétique des étapes de la méthode est présentée à la Figure 1.
L’amplification des séquences spécifiques du pathogèneZymo-Septoria triticichez les céréales à pailles telles que le blé tendre, l’orge et le blé dur, est réalisée par la méthode de PCR. L’homme du métier connait cette méthode. Les éléments spécifiques développés dans le cadre de la présente invention sont les amorces et les ADN interférents décrites ci-après.
Pour l’amplification du pathogèneZymo-Septoria tritici:
- Amorce sens SEP_F1 : 5'- [5' Digoxigenin] GCCTTCCTACCCCACCATGT -3' (SEQ ID NO.1)
- Amorce anti-sens SEP_R1 : 5'- [5’ 6-FAM] CCTGAATCGCGCATCGTTA -3' (SEQ ID NO.2)
Pour l’amplification d’une mutation induisant une résistance aux fongicides de type MDR:
- Amorce sens MDR1 non spécifique pour la multi-résistance : 5'- [5’BiotinTEG]TACGAGACGAGAAAAAGACAG -3' (SEQ ID NO.3)
- Amorce anti-sens MDR2 spécifique de la multirésistance I : 5'- [5’ 6-FAM]GTCCTAATCGGGTAAAAGA -3' (SEQ ID NO.4)
- Amorce anti-sens MDR3 spécifique de la multirésistance II : 5'- [5’ 6-FAM]CCCCTAAGGTCAAAGAA -3' (SEQ ID NO.5)
- Amorce anti-sens MDR4 spécifique de la multirésistance III : 5'- [5’ 6-FAM] GGTAGGCTTGGCACTC -3' (SEQ ID NO.6)
Pour l’ajout des ADN interférents :
- iADN 1 5'- GGGTAGGA -3' (SEQ ID NO.7)
- iADN 2 5'- ACGATGCG -3' (SEQ ID NO.8)
La composition du mélange PCR est détaillé au Tableau 1.
| Réactif | Volume |
| Taq Promega GoTaq | 5µl |
| SEP_F | 0,25µl à 5µM |
| SEP_R | 0,25µl à 5µM |
| MDR1_F | 0,3µl à 5µM |
| MDR2_R | 0,3µl à 5µM |
| MDR3_R | 0,3µl à 5µM |
| MDR4_R | 0,3µl à 5µM |
| iADN 1 | 0,4µl à 20µM |
| iADN 2 | 0,4µl à 20µM |
Tableau 1: Mélange PCR pour la détection deZymo-Septoria triticiet d’une résistance MDR chez ce pathogène
La méthode est mise en œuvre en suivant le protocole suivant à partir d’un kit selon l’invention:
- - Prélèvement d’un échantillon de feuille présentant un symptôme d’infection
2 - Extraction de l’ADN
3 - Réhydratation du culot lyophilisé du mélange PCR avec un tampon de réhydratation et ajout de l’extrait d’ADN de l’échantillon
4 - Amplification des séquences par PCR ; pour cette étape, une machine Jeulin® fonctionnant sur batterie (9 tubes) a été utilisée. Elle peut être utilisée à proximité du champ.
Le programme de la PCR utilisé est le suivant :
95°C 3 minutes
95°C 3 secondes
60°C 20 secondes x 40 cycles
5 - Révélation du résultat sur bandelette de nitrocellulose sur laquelle sont fixés des anticorps capables de reconnaitre les marqueurs antigéniques situés aux extrémités des amorces amplifiées par imprégnation de la bandelette avec le mélange obtenu.
Le principe de révélation du résultat sur bandelette est illustrée à la Figure 2.
EXEMPLE 2:Détection et caractérisation de souches du pathogène Fusarium avec révélation de 4 marqueurs en utilisant 2 bandelettes
Cet exemple illustre l’application de la méthode à la détection simultanée de 4 marqueurs pour répondre à une problématique complexe à l’aide d’un test simple, rapide et peu coûteux, utilisable à proximité des champs.
En pratique, on introduit 2 bandelettes dans le même tube issu de la même réaction PCR pour reveler 4 marqueurs ; il s’agit d’un format quadruplex. Il peut être utilisé pour répondre à la problématque suivante :
- Sur le blé et le maïs lesFusariumsont très fréquents et provoquent des dégâts très importants sur le feuillage, les racines entrainant des verses importantes. De plus, cesFusarium ssp.produisent des mycotoxines dont certaines sont léthales pour l’homme et les animaux quand leurs teneurs dans les aliments dépassent certaines limites (effets cumulatifs dans les tissus comme le foie par exemple, les tissus nerveux, etc. ;
- CesFusariumproduisent des mycotoxines de type Trichothécènes (desoxynivalenol = DON, Nivalénol, T2 et HT2, des Zéaralénone, Fumonisine, etc..).
En présence deFusariumdans un champ de blé, il est possible de caractériser les souches pour leurs résistances à certains fongicides et simultanément connaître le type de mycotoxines qu’elles peuvent produire. Avec 4 marqueurs à disposition, il est possible de:
o utiliser 2 marqueurs pour les résistances aux fongicides (TSR et MDR ou équivalent) et 2 marqueurs pour les types de mycotoxines les plus toxiques comme le DON et Zéaralénone par exemple.
o Si les 2 marqueurs de résistances aux fongicides indiquent que l’on peut efficacement éliminer cefusarium, la récolte sera utilisable en alimentation même si les marqueurs mycotoxines sont positifs ;
o Si les deux marqueurs de résistance aux fongicides indiquent que l’on ne peut pas efficacement éliminer cefusariumla récolte sera utilisable en alimentation même si les marqueurs mycotoxines sont négatifs ; par contre, il faudra détruire la récolte si un des marqueurs mycotoxine est positif.
Claims (10)
- Méthode de détection sur le terrain de la présence d’un bio-agresseur d’une culture comprenant les étapes de :
a. Prélèvement d’un échantillon de feuille du végétal suspecté d’être infecté, ou d’insectes vecteurs de parasites, ou d’adventices présentes dans la culture
b. Extraction de l’ADN ou ARN dudit échantillon
c. Amplification par PCR desdits séquences d’ADN ou ARN du bio-agresseur pour déterminer la présence dudit bioagresseur grâce à un couple d’amorces spécifiques permettant d’amplifier une séquence caractéristique dudit bioagresseur
d. Révélation sur bandelette immunologique de la présence dudit bio-agresseur
dans laquelle l’étape d’amplification se fait en présence d’ADN interférents complémentaires des parties des amorces capables de former entre elles des polymères afin d’éviter la formation de bandes aspécifiques sur les bandelettes immunologiques responsables de faux-positifs. - Méthode selon la revendication 1 permettant en outre de détecter la présence d’au moins un autre bio-agresseur et / ou de déterminer au moins une caractéristique associée à un bio-agresseur choisie parmi une résistance à un pesticide liée à la cible, une résistance multi-drogue, une résistance à la chaleur, une résistance à la sécheresse ou à l’humidité.
- Méthode selon l’une des revendications 1 ou 2 permettant d’obtenir simultanément jusqu’à 4 résultats associés à la détection et/ou la caractérisation d’un ou plusieurs bio-agresseurs en utilisant deux bandelettes dans le même test.
- Méthode selon l’une des revendications précédentes dans laquelle le bio-agresseur à détecter est le champignonZymo-Septoria tritici, responsable de la Septoriose, notamment sur des céréales à pailles telles que le blé tendre, l’orge et blé dur et dans laquelle l’amplification PCR est mise en œuvre en utilisant un mélange comprenant les séquences suivantes :
- Un couple d’amorces spécifiques permettant de détecter la présence dudit champignon comprenant les séquences SEQ ID NO.1 et SEQ NO ID.2
- Un couple d’amorces permettant la détection d’une résistance multi-drogue comprenant une amorce de séquence SEQ ID NO.3 non spécifique de la multirésistance et une amorce choisie parmi :
- une amorce de séquence SEQ ID NO.4 spécifique de la multi-résistance I ;
- une amorce de séquence SEQ ID NO.5 spécifique de la multi-résistance II ;
- une amorce de séquence SEQ ID NO.6 spécifique de la multi-résistance III ;
- Deux ADN interférents de séquences SEQ ID NO.7 et SEQ ID NO.8. - Kit de détection de la présence d’un bio-agresseur adapté à une utilisation sur le terrain comprenant :
o Un mélange réactionnel PCR lyophilisé comprenant :
- un couple d’amorces spécifiques permettant d’amplifier une séquence caractéristique dudit bio-agresseur
- des ADN interférents complémentaires des parties des amorces capables de former entre elles des polymères
- une enzyme d’amplification polymérase
o Au moins une bandelette de révélation immunologique permettant de révéler la présence dudit bioagresseur. - Kit selon la revendication 5 dans lequel ledit mélange PCR comprend en outre au moins un autre couple d’amorces permettant soit de détecter la présence d’un autre bio-agresseur, soit de de déterminer au moins une caractéristique associée à un bio-agresseur choisie parmi une résistance à un pesticide liée à la cible, une résistance multi-drogue, une résistance à la chaleur, une résistance à la sécheresse ou à l’humidité.
- Kit selon la revendication 6 permettant de détecter la présence d’un bio-agresseur et la caractérisation d’une résistance de ce bio-agresseur à un pesticide dans lequel :
- Le mélange PCR comprend en outre un ou plusieurs couples d’amorces spécifiques permettant d’amplifier au moins une mutation responsable d’une résistance à un pesticide chez le bio-agresseur
- La bandelette comprend trois bandes distinctes formées par la fixation d’anticorps spécifiques d’un marqueur antigénique particulier à savoir respectivement :
o un anticorps spécifique d’un marqueur antigénique situé à l’extrémité 5’ d’une des amorces permettant l’amplification d’une séquence spécifique du bio-agresseur,
o un anticorps spécifique d’un marqueur antigénique situé à l’extrémité 5’ d’une des amorces permettant l’amplification d’une séquence spécifique d’une résistance
o un anticorps spécifique d’un marqueur antigénique commun à tous les couples d’amorces permettant de révéler les bandes. - Kit selon l’une des revendications 5 à 7, comprenant 2 bandelettes immunologiques pour révéler simultanément 4 résultats à partir d’une même amplification, lesdits résultats étant choisis parmi la détection de la présence d’au moins un bio-agresseur et la détermination au moins une caractéristique associée à un bio-agresseur choisie parmi une résistance à un pesticide liée à la cible, une résistance multi-drogue, une résistance à la chaleur, une résistance à la sécheresse ou à l’humidité.
- Kit selon l’une des revendications 5 à 8 appliqué à la détection de la résistance multi-drogues du champignon Zymo-Septoria tritici responsable de la Septoriose, notamment chez les céréales à pailles telles que le blé tendre, l’orge et le blé dur, dans lequel ledit mélange PCR lyophilisé comprend :
- Les amorces permettant de détecter la présence dudit pathogène sont de séquence SEQ ID NO.1 et SEQ NO ID.2
- Les amorces permettant la détection de la multi-résistance comprennent une amorce de séquence SEQ ID NO.3 non spécifique de la multi-résistance et une amorce choisie parmi :
• une amorce de séquence SEQ ID NO.4 spécifique de la multi-résistance I ;
• une amorce de séquence SEQ ID NO.5 spécifique de la multi-résistance II ;
• une amorce de séquence SEQ ID NO.6 spécifique de la multi-résistance III ;
- Les ADN interférents sont de séquences SEQ ID NO.7 et SEQ ID NO.8 - Méthode de détection de terrain de la présence d’un bio-agresseur dans une culture et éventuellement d’une de ses résistances d’intérêt mettant en œuvre un kit tel que défini à l’une des revendications 5 à 9, et comprenant les étapes suivantes :
A) Prélèvement d’un échantillon de feuille suspectée d’être infectée, ou d’insectes vecteurs de parasites, ou d’adventice présentes dans la culture
B) Extraction de l’ADN ou ARN à partir dudit échantillon
C) Introduction de l’ADN ou ARN extrait dans un tube contenant ledit mélange PCR lyophilisé
D) Réalisation d’une amplification par PCR
E) Introduction d’une ou deux bandelette(s) immunologique(s) pour imprégnation dans le tube contenant les amplicons pour révéler si le bio-agresseur est présent et éventuellement s’il présente une résistance d’intérêt.
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|---|---|---|---|
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