JP2012533738A - 抗体ベースのアレイを使用する胃癌療法のための薬物選択 - Google Patents
抗体ベースのアレイを使用する胃癌療法のための薬物選択 Download PDFInfo
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Abstract
Description
(a)単離癌細胞から生成される細胞抽出物中のHER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR、PDGFR及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;並びに
(b)工程(a)において決定された1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルに基づき、胃癌の治療に好適な抗癌薬を選択すること
を含む方法を提供する。
(a)抗癌薬の投与後又は抗癌薬とのインキュベーション前に癌細胞を単離すること;
(b)単離された細胞を溶解させて細胞抽出物を生成すること;
(c)細胞抽出物中のHER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR、PDGFR及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;並びに
(d)工程(c)において決定された1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを、抗癌薬の非存在下で作成された1種以上の分析物の参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較して抗癌薬が胃癌の治療に好適か不適かを決定すること
を含む方法を提供する。
(a)抗癌薬の投与後又は抗癌薬とのインキュベーション前に癌細胞を単離すること;
(b)単離された細胞を溶解させて細胞抽出物を生成すること;
(c)細胞抽出物中のHER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR、PDGFR及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;
(d)工程(c)において決定された1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを、抗癌薬の非存在下で作成された1種以上の分析物の参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較すること;並びに
(e)1種以上の分析物について決定された発現レベル及び/又は活性化レベルが参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較して変化(例えば、実質的に減少)した場合、抗癌薬が胃癌の治療に好適であることを示すこと
を含む方法を提供する。
(a)単離癌細胞から生成される細胞抽出物中のHER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR、PDGFR及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;並びに
(b)工程(a)において決定された1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルに基づき、抗癌薬による治療に対する胃癌の応答を同定すること
を含む方法を提供する。
(a)抗癌薬の投与後又は抗癌薬とのインキュベーション前に癌細胞を単離すること;
(b)単離された細胞を溶解させて細胞抽出物を生成すること;
(c)細胞抽出物中のHER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR、PDGFR及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;並びに
(d)工程(c)において決定された1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを、抗癌薬の非存在下で作成された1種以上の分析物の参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較して胃癌が抗癌薬による治療に対して応答性か非応答性かを同定すること
を含む方法を提供する。
(a)抗癌薬の投与後又は抗癌薬とのインキュベーション前に癌細胞を単離すること;
(b)単離された細胞を溶解させて細胞抽出物を生成すること;
(c)細胞抽出物中のHER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR、PDGFR及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;
(d)工程(c)において決定された1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを、抗癌薬の非存在下で作成された1種以上の分析物の参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較すること;並びに
(e)1種以上の分析物について決定された発現レベル及び/又は活性化レベルが参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較して変化(例えば、実質的に減少)した場合、胃癌が抗癌薬による治療に対して応答性であることを示すこと
を含む方法を提供する。
(a)単離癌細胞から生成される細胞抽出物中のHER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR、PDGFR及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;並びに
(b)工程(a)において決定された1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルに基づき、抗癌薬による治療に対する胃癌を有する対象の応答を予測すること
を含む方法を提供する。
(a)抗癌薬の投与後又は抗癌薬とのインキュベーション前に癌細胞を単離すること;
(b)単離された細胞を溶解させて細胞抽出物を生成すること;
(c)細胞抽出物中のHER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR、PDGFR及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;並びに
(d)工程(c)において決定された1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを、抗癌薬の非存在下で作成された1種以上の分析物の参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較して胃癌を有する対象が抗癌薬による治療に対して応答する可能性を予測すること
を含む方法を提供する。
(a)抗癌薬の投与後又は抗癌薬とのインキュベーション前に癌細胞を単離すること;
(b)単離された細胞を溶解させて細胞抽出物を生成すること;
(c)細胞抽出物中のHER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR、PDGFR及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;
(d)工程(c)において決定された1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを、抗癌薬の非存在下で作成された1種以上の分析物の参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較して対象が抗癌薬による治療に対して応答する可能性を予測すること;並びに
(e)1種以上の分析物について決定された発現レベル及び/又は活性化レベルが参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較して変化(例えば、実質的に減少)した場合、胃癌を有する対象が抗癌薬による治療に対して応答する可能性が高いことを示すこと
を含む方法を提供する。
上記のとおり、細胞増殖に関与するシグナル伝達経路の活性化及び細胞死に関与する経路の不活性化は、多数の異なるタイプの癌を特徴付ける分子的特性の非限定的な例である。多くの場合、特定のシグナル伝達経路及びこれらの構成因子の活性は、所与のタイプの癌についての分子シグニチャーとして機能することができる。このような活性化された構成因子は、治療介入に有用な標的を更に提供することができる。従って、治療前、治療中及び治療後の癌細胞内での特定のシグナル伝達系の活性レベルに関する知見は、採用すべき適切な治療経過を選択するために使用することができる高度に関連する情報を医師に提供する。更に、治療が進行するにつれて癌細胞内で活性になるシグナル伝達経路の継続的追跡は、例えば、同一又は別のシグナル伝達経路のいずれかを活性化する更なる異常を通して癌細胞が治療に対して耐性になった場合、医師に特定の治療過程を継続すること又は別の治療ラインに切り替えることを促す、医師に治療の効力に関する追加の情報を提供することができる。
本明細書において使用される以下の用語は、他に記載のない限り、これらに与えられた意味を有する。
本発明は、アッセイ、例えば、本明細書に記載の特異的マルチプレックスハイスループット近接アッセイにより固形腫瘍の腫瘍組織に由来する腫瘍細胞又は循環細胞におけるシグナル伝達経路の構成因子の状態(例えば、発現及び/又は活性化レベル)を検出するための組成物及び方法を提供する。本発明はまた、1種以上の脱調節されたシグナル伝達経路を下方調節又は活動停止させるために適切な治療を選択するための組成物及び方法を提供する。従って、本発明のある実施態様は、所与の患者の腫瘍(例えば、胃腫瘍)における全及び活性化シグナル伝達タンパク質の回収により提供される特定の分子シグニチャーに基づいてパーソナライズされた治療の設計を促進するために使用することができる。
(a)単離癌細胞から生成される細胞抽出物中のHER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR、PDGFR及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;並びに
(b)工程(a)において決定された1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルに基づき、胃癌の治療に好適な抗癌薬を選択すること
を含む方法を提供する。
(a)抗癌薬の投与後又は抗癌薬とのインキュベーション前に癌細胞を単離すること;
(b)単離された細胞を溶解させて細胞抽出物を生成すること;
(c)細胞抽出物中のHER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR、PDGFR及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;並びに
(d)工程(c)において決定された1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを、抗癌薬の非存在下で作成された1種以上の分析物の参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較して抗癌薬が胃癌の治療に好適か不適かを決定すること
を含む方法を提供する。
(a)胃癌の試料から得られた癌細胞を抗癌薬と接触させること;
(b)単離された細胞を溶解させて細胞抽出物を生成すること;
(c)細胞抽出物中のHER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR、PDGFR及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;
(d)工程(c)において決定された1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを、抗癌薬の非存在下で作成された1種以上の分析物の参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較すること;並びに
(e)1種以上の分析物について工程(c)において決定された発現レベル及び/又は活性化レベルが参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較して変化(例えば、実質的に減少)した場合、抗癌薬が胃癌の治療に好適であること(例えば、胃腫瘍は、抗癌薬に対する応答の可能性の増加を有する)を示すこと
を含む方法を提供する。
(i)細胞抽出物を捕捉抗体(例えば、1種以上のHER2及び/又はc−Metシグナリング経路構成因子に特異的な捕捉抗体)の1種又は複数の希釈系列とインキュベートして(例えば、接触させて)複数の捕捉された分析物を形成すること(捕捉抗体は、固体担体上に拘束されている)(例えば、細胞抽出物中に存在する分析物を、分析物及び捕捉抗体を含む捕捉された分析物の複合体に転換すること);
(ii)複数の捕捉された分析物を、対応する分析物に特異的な1種又は複数の第1及び第2の活性化状態非依存性抗体(例えば、1種以上のHER2及び/又はc−Metシグナリング経路構成因子に特異的な第1及び第2の活性化状態非依存性抗体)を含む検出抗体とインキュベートして(例えば、接触させて)複数の検出可能な捕捉された分析物を形成すること(例えば、捕捉された分析物の複合体を、捕捉された分析物及び検出抗体を含む検出可能な捕捉された分析物の複合体に転換すること);
(第1の活性化状態非依存性抗体は、促進部分により標識されており、第2の活性化状態非依存性抗体は、シグナル増幅ペアの第1のメンバーにより標識されており、促進部分は、シグナル増幅ペアの第1のメンバーにチャネリングし、これと反応する酸化剤を発生させる);
(iii)複数の検出可能な捕捉された分析物を、シグナル増幅ペアの第2のメンバーとインキュベートして(例えば、接触させて)増幅されたシグナルを発生させること;並びに
(iv)シグナル増幅ペアの第1及び第2のメンバーから発生した増幅されたシグナルを検出すること
を含む。
(i)細胞抽出物を完全長受容体(例えば、完全長HER2)の細胞外ドメイン(ECD)結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートする(例えば、接触させる)こと;
(ii)複数のビーズを細胞抽出物から除去し、これにより完全長受容体(例えば、完全長HER2)を除去して完全長受容体(例えば、完全長HER2)を欠く細胞抽出物を形成すること(例えば、細胞抽出物を、特定の完全長受容体又は完全長受容体のファミリーを欠く細胞抽出物に転換すること);
(iii)完全長受容体(例えば、完全長HER2)を欠く細胞抽出物を、完全長受容体(例えば、完全長HER2)の細胞内ドメイン(ICD)結合領域に特異的な1種又は複数の捕捉抗体とインキュベートして(例えば、接触させて)複数の捕捉されたトランケート化受容体を形成すること(捕捉抗体は、固体担体上に拘束されている)(例えば、完全長受容体枯渇細胞抽出物中に存在するトランケート化受容体を、トランケート化受容体及び捕捉抗体の複合体に転換すること);
(iv)複数の捕捉されたトランケート化受容体を、完全長受容体(例えば、完全長HER2)のICD結合領域に特異的な1種又は複数の第1及び第2の活性化状態非依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉されたトランケート化受容体を形成すること(例えば、捕捉されたトランケート化受容体の複合体を、捕捉されたトランケート化受容体及び検出抗体を含む検出可能な捕捉されたトランケート化受容体の複合体に転換すること)、
(第1の活性化状態非依存性抗体は、促進部分により標識されており、第2の活性化状態非依存性抗体は、シグナル増幅ペアの第1のメンバーにより標識されており、促進部分は、シグナル増幅ペアの第1のメンバーにチャネリングし、これと反応する酸化剤を発生させる);
(v)複数の検出可能な捕捉されたトランケート化受容体を、シグナル増幅ペアの第2のメンバーとインキュベートして(例えば、接触させて)増幅されたシグナルを発生させること;並びに
(vi)シグナル増幅ペアの第1及び第2のメンバーから発生した増幅されたシグナルを検出すること
を含む。
(i)細胞抽出物を捕捉抗体(例えば、1種以上のHER2及び/又はc−Metシグナリング経路構成因子に特異的な捕捉抗体)の希釈系列とインキュベートして(例えば、接触させて)複数の捕捉された分析物を形成すること(捕捉抗体は、固体担体上に拘束されている)(例えば、細胞抽出物中に存在する分析物を、分析物及び捕捉抗体を含む捕捉された分析物の複合体に転換すること);
(ii)複数の捕捉された分析物を、対応する分析物に特異的な活性化状態非依存性抗体(例えば、1種以上のHER2及び/又はc−Metシグナリング経路構成因子に特異的な活性化状態非依存性抗体)及び対応する分析物に特異的な活性化状態依存性抗体(例えば、例えば、1種以上のHER2及び/又はc−Metシグナリング経路構成因子に特異的な活性化状態依存性抗体)を含む検出抗体とインキュベートして(例えば、接触させて)複数の検出可能な捕捉された分析物を形成すること(例えば、捕捉された分析物の複合体を、捕捉された分析物及び検出抗体を含む検出可能な捕捉された分析物の複合体に変換させること);
(活性化状態非依存性抗体は、促進部分により標識されており、活性化状態依存性抗体は、シグナル増幅ペアの第1のメンバーにより標識されており、促進部分は、シグナル増幅ペアの第1のメンバーにチャネリングし、これと反応する酸化剤を発生させる);
(iii)複数の検出可能な捕捉された分析物を、シグナル増幅ペアの第2のメンバーとインキュベートして(例えば、接触させて)増幅されたシグナルを発生させること;並びに
(iv)シグナル増幅ペアの第1及び第2のメンバーから発生した増幅されたシグナルを検出すること
を含む。
(i)細胞抽出物を完全長受容体(例えば、完全長HER2)の細胞外ドメイン(ECD)結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートする(例えば、接触させる)こと;
(ii)複数のビーズを細胞抽出物から除去し、これにより完全長受容体(例えば、完全長HER2)を除去して完全長受容体(例えば、完全長HER2)を欠く細胞抽出物を形成すること(例えば、細胞抽出物を、特定の完全長受容体又は完全長受容体のファミリーを欠く細胞抽出物に転換すること);
(iii)完全長受容体(例えば、完全長HER2)を欠く細胞抽出物を、完全長受容体(例えば、完全長HER2)の細胞内ドメイン(ICD)結合領域に特異的な複数の捕捉抗体とインキュベートして(例えば、接触させて)複数の捕捉されたトランケート化受容体を形成すること(捕捉抗体は、固体担体上に拘束されている)(例えば、完全長受容体枯渇細胞抽出物中に存在するトランケート化受容体を、トランケート化受容体及び捕捉抗体の複合体に転換すること);
(iv)複数の捕捉されたトランケート化受容体を、完全長受容体(例えば、完全長HER2)のICD結合領域に特異的な活性化状態非依存性抗体及び活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして(例えば、接触させて)複数の検出可能な捕捉されたトランケート化受容体を形成すること(例えば、捕捉されたトランケート化受容体の複合体を、捕捉されたトランケート化受容体及び検出抗体を含む検出可能な捕捉されたトランケート化受容体の複合体に転換すること)
(活性化状態非依存性抗体は、促進部分により標識されており、活性化状態依存性抗体は、シグナル増幅ペアの第1のメンバーにより標識されており、促進部分は、シグナル増幅ペアの第1のメンバーにチャネリングし、これと反応する酸化剤を発生させる);
(v)複数の検出可能な捕捉されたトランケート化受容体を、シグナル増幅ペアの第2のメンバーとインキュベートして(例えば、接触させて)増幅されたシグナルを発生させること;並びに
(vi)シグナル増幅ペアの第1及び第2のメンバーから発生した増幅されたシグナルを検出すること
を含む。
(a)単離癌細胞から生成される細胞抽出物中のHER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR、PDGFR及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;並びに
(b)工程(a)において決定された1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルに基づき、抗癌薬による治療に対する胃癌の応答を同定すること
を含む方法を提供する。
(a)抗癌薬の投与後又は抗癌薬とのインキュベーション前に癌細胞を単離すること;
(b)単離された細胞を溶解させて細胞抽出物を生成すること;
(c)細胞抽出物中のHER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR、PDGFR及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;並びに
(d)工程(c)において決定された1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを、抗癌薬の非存在下で作成された1種以上の分析物の参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較して胃癌が抗癌薬による治療に対して応答性か非応答性かを同定すること
を含む方法を提供する。
(a)抗癌薬の投与後又は抗癌薬とのインキュベーション前に癌細胞を単離すること;
(b)単離された細胞を溶解させて細胞抽出物を生成すること;
(c)細胞抽出物中のHER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR、PDGFR及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;
(d)工程(c)において決定された1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを、抗癌薬の非存在下で作成された1種以上の分析物の参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較すること;並びに
(e)1種以上の分析物について決定された発現レベル及び/又は活性化レベルが参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較して変化(例えば、実質的に減少)した場合、胃癌が抗癌薬による治療に対して応答性である(例えば、胃腫瘍が抗癌薬による治療に対して応答する可能性又は確率が増加する)ことを示すこと
を含む方法を提供する。
(a)単離癌細胞から生成される細胞抽出物中のHER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR、PDGFR及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;並びに
(b)工程(a)において決定された1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルに基づき、抗癌薬による治療に対する胃癌を有する対象の応答を予測すること
を含む方法を提供する。
(a)抗癌薬の投与後又は抗癌薬とのインキュベーション前に癌細胞を単離すること;
(b)単離された細胞を溶解させて細胞抽出物を生成すること;
(c)細胞抽出物中のHER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR、PDGFR及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;並びに
(d)工程(c)において決定された1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを、抗癌薬の非存在下で作成された1種以上の分析物の参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較して胃癌を有する対象が抗癌薬による治療に対して応答する可能性を予測すること
を含む方法を提供する。
(a)抗癌薬の投与後又は抗癌薬とのインキュベーション前に癌細胞を単離すること;
(b)単離された細胞を溶解させて細胞抽出物を生成すること;
(c)細胞抽出物中のHER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR、PDGFR及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;
(d)工程(c)において決定された1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを、抗癌薬の非存在下で作成された1種以上の分析物の参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較して対象が抗癌薬による治療に対して応答する可能性を予測すること;並びに
(e)1種以上の分析物について決定された発現レベル及び/又は活性化レベルが参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較して変化(例えば、実質的に減少)した場合、胃癌を有する対象が抗癌薬による治療に対して応答する可能性が高い(例えば、胃癌を有する対象が抗癌薬による治療に対して応答する可能性又は確率が増加する)ことを示すこと
を含む方法を提供する。
c−Metは、多くの悪性腫瘍において過剰発現され得る。c−Met媒介癌において、チロシンキナーゼドメイン、膜近傍ドメイン又はセマホリン内の増幅及び/又は活性化突然変異が同定されている。c−Met媒介癌の治療に好適な抗癌薬の選択は、治療の存在下でのc−Metの発現及び/又は活性化状態のレベルを査定することにより可能である。c−Metの活性化は、細胞成長、浸潤、血管新生及び転移をもたらす。ある実施態様において、本発明は、適切な治療方針を選択してc−Met活性化及び/又は過剰発現を阻害する方法を提供する。
(a)単離癌細胞から生成された細胞抽出物中のc−Met及び場合により1種以上の追加の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;並びに
(b)工程(a)において決定された1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルに基づきc−Met媒介癌の治療に好適な抗癌薬を選択すること
を含む方法を提供する。
(a)抗癌薬の投与後又は抗癌薬とのインキュベーション前に癌細胞を単離すること;
(b)単離された細胞を溶解させて細胞抽出物を生成すること;
(c)細胞抽出物中のc−Met及び場合により1種以上の追加の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;並びに
(d)工程(c)において決定されたc−Met及び場合により1種以上の追加の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを、抗癌薬の非存在下で作成されたc−Met及び場合により1種以上の追加の分析物の参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較して抗癌薬がc−Met媒介癌の治療に好適か不適かを決定すること
を含む方法を提供する。
(a)単離癌細胞から生成された細胞抽出物中のc−Met及び場合により1種以上の追加の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;並びに
(b)工程(a)において決定された1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルに基づき抗癌薬による治療に対するc−Met媒介癌の応答を同定すること
を含む方法を提供する。
(a)抗癌薬の投与後又は抗癌薬とのインキュベーション前に癌細胞を単離すること;
(b)単離された細胞を溶解させて細胞抽出物を生成すること;
(c)細胞抽出物中のc−Met及び場合により1種以上の追加の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;並びに
(d)工程(c)において決定されたc−Met及び場合により1種以上の追加の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを、抗癌薬の非存在下で作成されたc−Met及び場合により1種以上の追加の分析物の参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較して胃癌が抗癌薬による治療に対して応答性か非応答性かを同定すること
を含む方法を提供する。
(a)単離癌細胞から生成された細胞抽出物中のc−Met及び場合により1種以上の追加の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;並びに
(b)工程(a)において決定された1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルに基づき抗癌薬による治療に対するc−Met媒介癌を有する対象の応答を予測すること
を含む方法を提供する。
(a)抗癌薬の投与後又は抗癌薬とのインキュベーション前に癌細胞を単離すること;
(b)単離された細胞を溶解させて細胞抽出物を生成すること;
(c)細胞抽出物中のc−Met及び場合により1種以上の追加の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;並びに
(d)工程(c)において決定されたc−Met及び場合により1種以上の追加の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを、抗癌薬の非存在下で作成されたc−Met及び場合により1種以上の追加の分析物の参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較して胃癌を有する対象が抗癌薬による治療に対して応答する可能性を予測すること
を含む方法を提供する。
ある態様において、腫瘍細胞、例えば、胃癌細胞の細胞抽出物中の分析物(例えば、シグナル伝達分子)の1種以上(例えば、複数)の発現レベル及び/又は活性化状態は、固体担体上に拘束された捕捉抗体の希釈系列を含む抗体ベースのアレイを使用して検出される。これらのアレイは、典型的には、異なるアドレス可能な位置における固体担体の表面に結合しているある範囲の捕捉抗体濃度で複数の異なる捕捉抗体を含む。
一部の実施態様において、細胞、例えば腫瘍細胞の細胞抽出物中の対象となる1種以上の分析物(例えば、1種以上のシグナル伝達分子、例えば、HER2及び/又はc−Metシグナリング経路の1種以上の構成因子)の発現及び/又は活性化レベルを検出するためのアッセイは、優れたダイナミックレンジを有するマルチプレックスハイスループット2抗体アッセイである。非限定的例として、本アッセイにおいて使用される2種の抗体は:(1)対象となる特定の分析物に特異的な捕捉抗体;及び(2)分析物の活性化形態に特異的な検出抗体(すなわち、活性化状態依存性抗体)を含むことができる。活性化状態依存性抗体は、例えば、分析物のリン酸化、ユビキチン化及び/又は複合体化状態を検出することができる。あるいは、検出抗体は、細胞抽出物中の分析物の全量を検出する、活性化状態非依存性抗体を含む。活性化状態非依存性抗体は、一般に、分析物の活性化及び非活性化形態の両方を検出することができる。
(i)細胞抽出物を捕捉抗体の1種又は複数の希釈系列とインキュベートして複数の捕捉された分析物を形成すること;
(ii)複数の捕捉された分析物を、対応する分析物に特異的な検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉された分析物を形成すること(検出抗体は、分析物の活性化(例えば、リン酸化)レベルを検出するための活性化状態依存性抗体又は分析物の発現レベル(例えば、全量)を検出するための活性化状態非依存性抗体を含む);
(iii)複数の検出可能な捕捉された分析物を、シグナル増幅ペアの第1及び第2のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを発生させること;並びに
(iv)シグナル増幅ペアの第1及び第2のメンバーから発生した増幅されたシグナルを検出すること
を含む。
(i)細胞抽出物を完全長受容体の細胞外ドメイン(ECD)結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートすること;
(ii)複数のビーズを細胞抽出物から除去し、これにより完全長受容体を除去して完全長受容体を欠く細胞抽出物を形成すること;
(iii)完全長受容体を欠く細胞抽出物を、完全長受容体の細胞内ドメイン(ICD)結合領域に特異的な1種又は複数の捕捉抗体の希釈系列とインキュベートして複数の捕捉されたトランケート化受容体を形成すること;
(iv)複数の捕捉されたトランケート化受容体を、完全長受容体のICD結合領域に特異的な検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉されたトランケート化受容体を形成すること(検出抗体は、トランケート化受容体の活性化(例えば、リン酸化)レベルを検出するための活性化状態依存性抗体又はトランケート化受容体の発現レベル(例えば、全量)を検出するための活性化状態非依存性抗体を含む);
(v)複数の検出可能な捕捉されたトランケート化受容体を、シグナル増幅ペアの第1及び第2のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを発生させること;並びに
(vi)シグナル増幅ペアの第1及び第2のメンバーから発生した増幅されたシグナルを検出すること
を含む方法を提供する。
一部の実施態様において、細胞、例えば、腫瘍細胞の細胞抽出物中の対象となる1種以上の分析物(例えば、1種以上のシグナル伝達分子、例えば、HER2及び/又はc−Metシグナリング経路の1種以上の構成因子)の発現及び/又は活性化レベルを検出するためのアッセイは、優れたダイナミックレンジを有するマルチプレックスハイスループット近接(すなわち、3抗体)アッセイである。非限定的な例として、本近接アッセイにおいて使用される3種の抗体は:(1)対象となる特定の分析物に特異的な捕捉抗体;(2)分析物の活性化形態に特異的な検出抗体(すなわち、活性化状態依存性抗体);及び(3)分析物の全量を検出する検出抗体(すなわち、活性化状態非依存性抗体)を含むことができる。活性化状態依存性抗体は、例えば、分析物のリン酸化、ユビキチン化及び/又は複合体形成状態を検出することができる一方、活性化状態非依存性抗体は、分析物の全量(すなわち、活性化及び非活性化形態の両方)を検出することができる。
(i)細胞抽出物を捕捉抗体の1種又は複数の希釈系列とインキュベートして複数の捕捉された分析物を形成すること;
(ii)複数の捕捉された分析物を、対応する分析物に特異的な1種又は複数の活性化状態非依存性抗体及び1種又は複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉された分析物を形成すること、
(活性化状態非依存性抗体は促進成分により標識されており、活性化状態依存性抗体はシグナル増幅ペアの第1のメンバーにより標識されており、促進成分はシグナル増幅ペアの第1のメンバーにチャネリングし、これと反応する酸化剤を発生させる);
(iii)複数の検出可能な捕捉された分析物をシグナル増幅ペアの第2のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを発生させること;並びに
(iv)シグナル増幅ペアの第1及び第2のメンバーから発生した増幅されたシグナルを検出すること
を含む。
(i)細胞抽出物を完全長受容体の細胞外ドメイン(ECD)結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートすること;
(ii)複数のビーズを細胞抽出物から除去し、これにより完全長受容体を除去して完全長受容体を欠く細胞抽出物を形成すること;
(iii)完全長受容体を欠く細胞抽出物を、複数の捕捉された完全長受容体の細胞内ドメイン(ICD)結合領域に特異的な1種又は複数の捕捉抗体とインキュベートして複数の捕捉されたトランケート化受容体を形成すること;
(iv)複数の捕捉されたトランケート化受容体を、完全長受容体のICD結合領域に特異的な1種又は複数の活性化状態非依存性抗体及び1種又は複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉されたトランケート化受容体を形成すること
(活性化状態非依存性抗体は促進成分により標識されており、活性化状態依存性抗体はシグナル増幅ペアの第1のメンバーにより標識されており、促進成分はシグナル増幅ペアの第1のメンバーにチャネリングし、これと反応する酸化剤を発生させる);
(v)複数の検出可能な捕捉されたトランケート化受容体をシグナル増幅ペアの第2のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを発生させること;並びに
(vi)シグナル増幅ペアの第1及び第2のメンバーから発生した増幅されたシグナルを検出すること
を含む。
(i)細胞抽出物を捕捉抗体の1種又は複数の希釈系列とインキュベートして複数の捕捉された分析物を形成すること;
(ii)複数の捕捉された分析物を、対応する分析物に特異的な1種又は複数の第1及び第2の活性化状態非依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉された分析物を形成すること
(第1の活性化状態非依存性抗体は促進成分により標識されており、第2の活性化非依存性抗体はシグナル増幅ペアの第1のメンバーにより標識されており、促進成分はシグナル増幅ペアの第1のメンバーにチャネリングし、これと反応する酸化剤を発生させる);
(iii)複数の検出可能な捕捉された分析物をシグナル増幅ペアの第2のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを発生させること;並びに
(iv)シグナル増幅ペアの第1及び第2のメンバーから発生した増幅されたシグナルを検出すること
を含む。
(i)細胞抽出物を完全長受容体の細胞外ドメイン(ECD)結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートすること;
(ii)複数のビーズを細胞抽出物から除去し、これにより完全長受容体を除去して完全長受容体を欠く細胞抽出物を形成すること;
(iii)完全長受容体を欠く細胞抽出物を、複数の捕捉された完全長受容体の細胞内ドメイン(ICD)結合領域に特異的な1種又は複数の捕捉抗体とインキュベートして複数の捕捉されたトランケート化受容体を形成すること;
(iv)複数の捕捉されたトランケート化受容体を、完全長受容体のICD結合領域に特異的な1種又は複数の第1及び第2の活性化状態非依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉されたトランケート化受容体を形成すること
(第1の活性化状態非依存性抗体は促進成分により標識されており、第2の活性化非依存性抗体はシグナル増幅ペアの第1のメンバーにより標識されており、促進成分はシグナル増幅ペアの第1のメンバーにチャネリングし、これと反応する酸化剤を発生させる);
(v)複数の検出可能な捕捉されたトランケート化受容体をシグナル増幅ペアの第2のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを発生させること;並びに
(vi)シグナル増幅ペアの第1及び第2のメンバーから発生した増幅されたシグナルを検出すること
を含む。
本発明による細胞、例えば胃癌細胞中のシグナル伝達分子(例えば、HER2及び/又はc−METシグナリング経路化合物)の発現及び/又は活性化レベルを分析するために未だ市販されていない抗体の作製及び選択は、いくつかの手法により実施することができる。例えば、1つの手法は、当分野において公知のタンパク質発現及び精製方法を使用して対象となるポリペプチド(すなわち、抗原)を発現させ、及び/又は精製する方法である一方、別の手法は当分野において公知の固相ペプチド合成法を使用して対象となるポリペプチドを合成する方法である。例えば、Guide to Protein Purification,Murray P.Deutcher,ed.,Meth.Enzymol.,Vol.182(1990);Solid Phase Peptide Synthesis,Greg B.Fields,ed.,Meth.Enzymol.,Vol.289(1997);Kiso et al.,Chem.Pharm.Bull.,38:1192−99(1990);Mostafavi et al.,Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids,1:255−60,(1995);及びFujiwara et al.,Chem.Pharm.Bull.,44:1326−31(1996)参照。次いで、精製又は合成されたポリペプチドは、例えば、マウス又はウサギに注射してポリクローナル又はモノクローナル抗体を発生させることができる。当業者であれば、例えば、Antibodies,A Laboratory Manual,Harlow and Lane,Eds.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1988)に記載のとおり、抗体を生成するための多数の手順を利用可能であることを認識する。当業者であれば、結合フラグメント又は抗体を模倣する(例えば、抗体の機能的結合領域を保持する)Fabフラグメントも種々の手順により遺伝子情報から調製することができることも認識する。例えば、Antibody Engineering:A Practical Approach,Borrebaeck,Ed.,Oxford University Press,Oxford(1995);及びHuse et al.,J.Immunol.,149:3914−3920(1992)参照。
ポリクローナル抗体は、好ましくは対象となるポリペプチド及びアジュバントの複数回の皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射により動物において作製される。対象となるポリペプチドを、二官能剤又は誘導体化剤を使用して、免疫すべき種内で免疫原性であるタンパク質担体、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン又はダイズトリプシン阻害剤などにコンジュゲートさせることが有用であり得る。二官能剤又は誘導体化剤の非限定的例には、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介するコンジュゲーション)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リシン残基を介するコンジュゲーション)、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、SOCl2及びR1N=C=NR(式中、R及びR1は異なるアルキル基である)が含まれる。
モノクローナル抗体は、一般に、実質的に均質な抗体の集団から入手される、すなわち、この集団を含む個々の抗体は小量で存在し得る考えられる天然型突然変異を除いて同一である。従って、修飾語句「モノクローナル」は、抗体の特徴が別々の抗体の混合物ではないことを示す。例えば、モノクローナル抗体は、Kohler et al.,Nature,256:495(1975)により記載されたハイブリドーマ法又は当分野において公知の任意の組換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号参照)を使用して作製することができる。
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当分野において公知である。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである起源からこの中に導入された1個以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的には「インポート」可変ドメインから採取される、「インポート」残基と称されることが多い。ヒト化は、本質的には非ヒト抗体の超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列と置換することにより実施することができる。例えば、Jones et al.,Nature,321:522−525(1986);Riechmann et al.,Nature,332:323−327(1988);及びVerhoeyen et al.,Science,239:1534−1536(1988)参照。従って、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体(例えば、米国特許第4,816,567号参照)であり、実質的にインタクト未満のヒト可変領域は、非ヒト種からの対応する配列により置換されている。実際、ヒト化抗体は、典型的には一部の超可変領域残基及びおそらくは一部のフレームワーク領域(FR)残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基により置換されているヒト抗体である。
ヒト化の代替法として、ヒト抗体を発生させることができる。一部の実施態様において、免疫すると、内因性免疫グロブリン産生の非存在下で全レパートリーのヒト抗体を産生することができるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を生成することができる。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子のホモ接合体欠失は内因性抗体産生の完全阻害をもたらすと記載されている。このような生殖細胞系突然変異マウスへのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移動は、抗原チャレンジ後にヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993);Jakobovits et al.,Nature,362:255−258(1993);Bruggermann et al.,Year in Immun.,7:33(1993);並びに米国特許第5,591,669号、第5,589,369号及び第5,545,807号参照。
抗体フラグメントを生成するために、種々の技術が開発されてきた。慣習的には、これらのフラグメントはインタクト抗体のタンパク質分解消化により導き出された(例えば、Morimoto et al.,J.Biochem.Biophys.Meth.,24:107−117(1992);及びBrennan et al.,Science,229:81(1985)参照)。しかしながら、これらのフラグメントは、現在では組換え宿主細胞を使用して直接的に生成することができる。例えば、抗体フラグメントは、上記で考察した抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Fab’−SHフラグメントを大腸菌細胞から直接的に回収し、化学的に結合させてF(ab’)2フラグメントを形成することができる(例えば、Carter et al.,BioTechnology,10:163−167(1992)参照)。別のアプローチによれば、F(ab’)2フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接的に単離することができる。抗体フラグメントを産生するための他の技術は、当業者には明白である。他の実施態様では、最適な抗体は、一本鎖Fvフラグメント(scFv)である。例えば、PCT国際公開第93/16185号;並びに米国特許第5,571,894号及び第5,587,458号参照。抗体フラグメントは、例えば米国特許第5,641,870号に記載の直鎖抗体であり得る。このような直鎖抗体フラグメントは、単一特異的又は二重特異的であり得る。
二重特異性抗体は、少なくとも2種の異なるエピトープについての結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、対象となる同一ポリペプチドの2種の異なるエピトープに結合することができる。他の二重特異性抗体は、対象となるポリペプチドについての結合部位を、1種以上の追加の抗原についての(1種以上の)結合部位と組み合わせることができる。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体フラグメント(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)として調製することができる。
組換え技術を使用する場合、抗体は単離された宿主細胞の内側で、宿主細胞のペリプラスム間隙内において産生することができ、又は宿主細胞から培地中に直接的に分泌させることができる。抗体が細胞内で産生される場合、最初に微粒子片が例えば遠心分離又は限外濾過により除去される。Carter et al.,BioTech.,10:163−167(1992)は、大腸菌のペリプラスム間隙内に分泌される抗体を単離する手順について記載している。手短に述べると、細胞ペーストは酢酸ナトリウム(pH3.5)、EDTA及びフェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)の存在下で約30分間解凍される。細胞片は、遠心分離により除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合、このような発現系からの上清は一般に、例えば、Amicon又はMillipore Pellicon製の限外濾過装置である市販されているタンパク質濃縮フィルターを使用して濃縮される。プロテアーゼ阻害剤、例えばPMSFを上記の工程のいずれかに含めてタンパク質分解を阻害することができ、抗生物質を含めて外来汚染物質の成長を妨げることができる。
本発明の方法によれば、本明細書に記載の抗癌薬は、当分野において公知の任意の便宜的手段により対象に投与される。本発明の方法は、対象における腫瘍、例えば、胃(胃)腫瘍を治療するのに好適な抗癌薬又は抗癌薬の組合せを選択するために使用することができる。本発明の方法は、抗癌薬又は抗癌薬の組合せによる治療に対する対象における腫瘍、例えば、胃(胃)腫瘍の応答を同定するために使用することもできる。更に、本発明の方法は、抗癌薬又は抗癌薬の組合せによる治療に対する腫瘍、例えば、胃(胃)腫瘍を有する対象の応答を予測するために使用することができる。当業者であれば、本明細書に記載の抗癌薬を単独で、又は慣用の化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法及び/もしくは手術との組合せ治療アプローチの一部として投与することができることを認識する。
以下の実施例は、本発明を限定するためではなく例示するために提供する。
固形腫瘍の循環細胞は固形腫瘍から転移又は微小転移した細胞を含み、循環腫瘍細胞(CTC)、癌幹細胞(CSC)及び/又は腫瘍へ移動中である細胞(例えば、循環内皮前駆細胞(CEPC)、循環内皮細胞(CEC)、循環プロ血管新生骨髄性細胞、循環樹状細胞など)を含む。循環細胞を含有する患者試料は、任意のアクセス可能な生体液(例えば、全血、血清、血漿、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液、尿、唾液、細針吸引液など)から得ることができる。循環細胞は、例えば、免疫磁気分離(例えば、Racila et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:4589−4594(1998);Bilkenroth et al.,Int.J.Cancer,92:577−582(2001)参照)、Immunicon(Huntingdon Valley,PA)によるCellTracks(商品名)システム、マイクロ流体分離(例えば、Mohamed et al.,IEEE Trans.Nanobiosci.,3:251−256(2004);Lin et al.,Abstract No.5147,97th AACR Annual Meeting,Washington,D.C.(2006))、FACS(例えば、Mancuso et al.,Blood,97:3658−3661(2001))、密度勾配遠心分離(例えば、Baker et al.,Clin.Cancer Res.,13:4865−4871(2003))及び枯渇法(例えば、Meye et al.,Int.J.Oncol.,21:521−530(2002)参照)を含む1種以上の分離方法を使用して患者試料から単離することができる。
CTCの免疫磁気分離−手動単離に続く活性化アッセイ:
1)抗EpCAMモノクローナル抗体(Kordia Life Sciences、Leiden,The Netherlands)に既にコンジュゲートされた磁気ビーズ(Dynal M450;Dynal AS、Oslo,Norway)を使用する。あるいは、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の混合物を使用することができる。
2)使用直前、プレコーティングされたDynabeadsを0.01%のBSAを有する等容量のPBS中で1回洗浄する。
3)25μLのプレコーティングされたDynabeadsを1mLの試料に添加する。
4)混合物を穏やかに傾斜及び回転させながら、2〜8℃で20分間インキュベートする。
5)試験管を磁気分離装置(MPL−1マグネット)内に2分間配置する。
6)上清を廃棄し、0.01%のBSAを有するPBS中に再懸濁させることによりビーズ結合細胞を3回洗浄し、次いで磁気分離する。
7)この試料を100μLの刺激緩衝液中に再懸濁させる。
1)ヒト対象からの末梢血を、1mg/mLのEDTAを含有するシリコン被覆試験管内に抜き出す。穿刺した静脈から遊離される上皮細胞による汚染を回避するために、最初の3〜5mLは廃棄する。
2)使用前に、0.9%のNaClにより1mLの全血を1:3に希釈する。
1)細胞系対照は、ヒト癌細胞系をHL−60細胞中にスパイクすることにより作製する。
2)細胞系対照は、ヒト癌細胞系を健常ドナーからの全血中にスパイクすることにより作製する。
非限定的な例として、生存可能なCEC及びCEPCは、Beerepoot et al.,Ann.Oncology,15:139−145(2004)に記載の免疫磁気分離/濃縮技術を使用して単離することができる。手短に述べると、末梢血を抗CD146モノクローナル抗体(Kordia Life Sciences)に既にコンジュゲートされた磁気ビーズ(Dynal M450 IgG1)とともにインキュベートする。この抗体は、末梢血中で造血細胞又は上皮細胞以外の全系統の内皮細胞を認識する(George et al.,J.Immunol.Meth.,139:65−75(1991))。造血細胞及び上皮細胞の陰性選択は、適切な抗体(例えば、白血球を枯渇させるためにはDynal−CD45ビーズ、単球を枯渇させるためにはDynal−CD14ビーズ、上皮細胞を枯渇させるためにはDynal−EpCAM(Invitrogen、Carlsbad,CA))に結合した磁気ビーズを用いる陽性選択の前に使用することができる。本実施例においては陽性選択のみを使用する。
1)抗CD146モノクローナル抗体(Kordia Life Sciences)に既にコンジュゲートされた磁気ビーズ(Dynal M450)を使用する。
2)使用直前、プレコーティングされたDynabeadsを0.01%のBSAを有する等容量のPBS中で1回洗浄する。
3)25μLのプレコーティングされたDynabeadsを1mLの試料に添加する。
4)混合物を穏やかに傾斜及び回転させながら、2〜8℃で20分間インキュベートする。
5)試験管を磁気分離装置(MPL−1マグネット)内に2分間配置する。
6)上清を廃棄し、0.01%のBSAを有するPBS中に再懸濁させることによりビーズ結合細胞を3回洗浄し、次いで磁気分離する。
7)この試料を100μLの刺激緩衝液中に再懸濁させる。
1)ヒト対象からの末梢血を、1mg/mLのEDTAを含有するシリコン被覆試験管内に抜き出す。穿刺した静脈から遊離される内皮細胞による汚染を回避するために、最初の3〜5mLは廃棄する。
2)使用前に、0.9%のNaClにより1mLの全血を1:3に希釈する。
1)細胞系対照は、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)をHL−60細胞中にスパイクすることにより作製する。
2)細胞系対照は、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を健常個体から提供された全血中にスパイクすることにより作製する。
CEPCは、種々の血管新生成長因子に応答して成熟内皮細胞に分化する能力を有する骨髄由来前駆細胞の循環サブタイプである。CEPCは、表面マーカーCD34を認識する抗体による選択により単離することができる。CD133は、CEPCから未成熟内皮前駆細胞(EPC)又は原子造血幹細胞(HSC)を分化させる表面マーカーである。様々な起源からのCEPCの種々の単離手順は、接着培養又は磁気マイクロビーズを使用して記載されている。本実施例において、Asahara et al.,Science,275:964−967(1997)に記載のプロトコールから修正されたプロトコールを使用する。
1)磁気ビーズ(Dynal M450 CD34)を使用する。これらのビーズは、CD34表面抗原に特異的なモノクローナル抗体によりコーティングする。
2)使用直前、プレコーティングされたDynabeadsを0.01%のBSAを有する等容量のPBS中で1回洗浄する。
3)25μLのプレコーティングされたDynabeadsを1mLの試料に添加する。
4)混合物を穏やかに傾斜及び回転させながら、2〜8℃で20分間インキュベートする。
5)試験管を磁気分離装置(MPL−1マグネット)内に2分間配置する。
6)上清を廃棄し、0.01%のBSAを有するPBS中に再懸濁させることによりビーズ結合細胞を3回洗浄し、次いで磁気分離する。
7)この試料を100μLの刺激緩衝液中に再懸濁させる。
1)ヒト対象からの末梢血を、1mg/mLのEDTAを含有するシリコン被覆試験管内に抜き出す。穿刺した静脈から遊離される内皮細胞による汚染を回避するために、最初の3〜5mLは廃棄する。
2)平衡塩類溶液により10mLの全血を1:1に希釈する。
3)4mLの希釈血液を10mLの試験管中の3mLのFicoll−Paque上へ層状に重ねる。
4)試験管を18〜20℃において30〜40分間400×gにおいて回転させる。
5)無菌パスツールピペットを使用して血漿及び血小板を含有する上層を取り出し、界面で平静である単核球の層を残す。
6)単核球は、無菌ピペットを使用して無菌遠心分離管に移す。
7)6mLの平衡塩類溶液を添加し、細胞を穏やかに再懸濁させる。
8)混合物を18〜20℃において10分間60〜100×gにおいて遠心分離する。
9)上清を除去し、各試験管からの単核球を1mLのPBS中に再懸濁させる。
Veridex,LLC(Warren,NJ)は、CellTracks(商標)AutoPrep(商標)システム、CellSearch(商品名)上皮細胞キット及びCellTracks(商標)アナライザーから構成されるCellSearchシステムを市販している。CellTracks(商標)AutoPrep(商標)システムは、半自動化試料調製システムである(Kagan et al.,J.Clin.Ligand Assay,25:104−110(2002))。CellSearch(商品名)上皮細胞キットは:上皮細胞に特異的な抗EpCAM抗体によりコーティングされた強磁性流体;サイトケラチン8、18及び19に対するフィコエリトリンにコンジュゲートされた抗体;アロフィコシアニンにコンジュゲートされた抗CD45抗体;DAPI色素;並びに細胞を洗浄し、透過させ、再懸濁化させるための緩衝液からなる。本実施例において使用するプロトコールは、Allard et al.,Clin.Cancer Res.,10:6897−6904(2004)にも記載されている。全VeridexシステムはCTC計数のために使用することができ、又はCellTracks(商標)AutoPrep(商標)システムを用いた単離後に試料を手動で除去することにより、分析前に経路活性化のための単離方法を提供することができる。CTCの数は、アルゴリズム開発のために情報を提供することができる。
1)7.5mLの血液を6mLの緩衝液と混合し、10分間800×gにおいて遠心分離し、次いでCellTracks(商標)AutoPrep(商標)システム上に配置する。
2)機器が上清を吸引した後、機器は強磁性流体を添加する。
3)機器はインキュベーション及び後続の磁気分離工程を実施する。
4)未結合細胞及び残留血漿を吸引する。
5)蛍光染色のために透過緩衝液を結び付けて染色試薬を添加する。
6)システムによるインキュベーション後、細胞を再び磁気的に分離し、MagNest(商標)細胞提示装置に再懸濁させる。
7)次いで、MagNest(商標)細胞提示装置を4色半自動化蛍光顕微鏡であるCellTracks(商標)アナライザー上に配置する。
8)Veridex規定基準を満たす画像を捕捉し、最終手動選択のためにウエブベースのブラウザにより示す。
9)細胞計数の結果は、血液7.5mL当たりの細胞数として表現する。
1)7.5mLの血液を6mLの緩衝液と混合し、10分間800×gにおいて遠心分離し、次いでCellTracks(商標)AutoPrep(商標)システム上に配置する。
2)機器が上清を吸引した後、機器は強磁性流体を添加する。
3)機器はインキュベーション及び後続の磁気分離工程を実施する。
4)未結合細胞及び残留血漿を吸引する。
5)試料を100μLの刺激緩衝液中に再懸濁させる。
1)Veridexは、抗CD146抗体による捕捉を利用するCellSearch(商品名)内皮細胞キットを供給する。CellSearch(商品名)内皮細胞キットは、血液試料調製のためにはCellTracks(商標)AutoPrep(商標)システムと、及び全血からのCEC及びCEPCを計数及び特性決定するためにはCellTracks(商標)アナライザーと結び付けて使用される。プロトコールは、CellSearch(商品名)上皮細胞キットについてのプロトコールと同一である。
1)計数:ヒト対象からの末梢血を、製造業者の取扱説明書に従ってCellSave保存用試験管内に採血する。穿刺した静脈から遊離される上皮又は内皮細胞による汚染を回避するため、最初の3〜5mLは廃棄する。
2)経路分析:ヒト対象からの末梢血を、1mg/mLのEDTAを含有するシリコン被覆試験管内に抜き出す。穿刺した静脈から遊離される上皮又は内皮細胞による汚染を回避するため、最初の3〜5mLは廃棄する。
腫瘍が固有の自己再生及び生存機序を有する小集団の推定癌幹細胞を含有するという証拠が確立されつつある(例えば、Sells,Crit.Rev.Oncol.Hematol.,51:1−28(2004);Reya et al.,Nature,414:105−111(2001);Dontu et al.,Trends Endocrinol.Metal.,15:193−197(2004);及びDick,Nature,423:231−233(2003)参照)。癌幹細胞(CSC)は長時間静穏状態で存在し得、このことによりこの細胞が***細胞を標的とする化学療法薬に耐性となる。この癌開始集団は、選択的除去のための標的療法を受ける自己再生及び生存経路の活性化について特徴付けることができる。CSCの単離手順は、接着培養又は磁気マイクロビーズを使用して記載されている。本実施例においては、Cote et al.,Clin.Can.Res.,12:5615(2006)に記載のプロトコールから修正されたプロトコールを使用する。
1)磁気ビーズ(Dynal AS;Oslo,Norway)を使用する。これらのビーズは、CD34又はCD133表面抗原のいずれかに特異的なモノクローナル抗体によりコーティングする。
2)使用直前、プレコーティングされたDynabeadsを0.01%のBSAを有する等容量のPBS中で1回洗浄する。
3)1〜107個のプレコーティングされたDynabeadsを3mLの試料に添加する。
4)混合物を穏やかに傾斜及び回転させながら、2〜8℃で60分間インキュベートする。
5)混合物を1mL部分に分割し、各試験管を磁気分離装置(MPL−1マグネット)内に少なくとも6分間配置する。
6)上清を廃棄し、0.01%のBSAを有するPBS中に再懸濁させることによりビーズ結合細胞を3回洗浄し、次いで磁気分離する。
7)この試料を100μLの刺激緩衝液中に再懸濁させる。
1)骨髄標本を、癌患者からインフォームドコンセントを得た後に得る。
2)骨髄吸引液を処理する工程は、Bauer et al.,Clin.Can.Res.,6:3552−3559(2000))に記載のとおり実施する。任意の播種性腫瘍細胞を含有する単核球分画は、35分間にわたり4000×gでBeckman GS−6遠心分離装置を使用してFicoll−Hypaque密度勾配遠心分離により濃縮し、PBSにより2回洗浄する。
細胞の刺激:
1)成長因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)及び/又はIGF(100nM)を細胞に添加し、37℃で5分間インキュベートする。
1)試料を治療有効濃度のHerceptin、ラパチニブ、Tarceva及び/又はラパマイシンアナログと37℃で30分間インキュベートする。
2)次いで、因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)及び/又はIGF(100nM)を添加することにより細胞を刺激し、37℃で5分間インキュベートする。
1)試料を治療有効濃度のHerceptin、ラパチニブ、Tarceva及び/又はラパマイシンアナログと37℃で30分間インキュベートする。
2)次いで細胞をTGF−α(100nM)、Hrg(100nM)及び/又はIGF(100nM)により刺激し、37℃で120分間インキュベートする。
1)新たな溶解緩衝液を、表3に記載の試薬を混合することにより新たに調製する。
2)最終洗浄後、細胞を氷上で100μLの冷蔵緩衝液中に再懸濁させる。
3)インキュベーションを氷上で30分間実施する。
4)混合物を最高速度でマイクロフュージ(microfuge)内で10分間回転させて溶解物からビーズを分離する。
5)溶解物をアッセイのために新しい試験管に移し、又は80℃で貯蔵する。
VEGFは、CEPC(Larrivee et al.,J.Biol.Chem.,278:22006−22013(2003))及び血管壁から剥がれた成熟CEC(Solovey et al.,Blood,93:3824−3830(1999))の両方において抗アポトーシス経路を活性化することにより生存を促進すると考えられている。VEGFは、CEPC又は成熟CECの増殖を刺激することもできるが、成熟CECはCEPCに比較して限定された増殖能力しか有しないと思われる(Lin et al.,J.Clin.Invest.,105:71−77(2000))。これらの理由から、CEC及び/又はCEPCは、溶解前にVEGFファミリー成長因子とのインキュベーションにより活性化される。
1)成長因子VEGF、FGF、PDGF、PIGF及び/又はAngをそれぞれ100nMで細胞に添加し、37℃で5分間インキュベートする。
1)試料を、治療有効濃度のAvastin、Nexavar、Sutent及び/又はラパマイシンアナログと、37℃で30分間インキュベートする。
2)次いで、因子VEGF、FGF、PDGF、PIGF及び/又はAngをそれぞれ100nMで添加することにより細胞を刺激し、37℃で5分間インキュベートする。
1)試料を、治療有効濃度のAvastin、Nexavar、Sutent及び/又はラパマイシンアナログと、37℃で30分間インキュベートする。
2)次いで、VEGF、FGF、PDGF、PIGF及び/又はAngをそれぞれ100nMで添加することにより細胞を刺激し、37℃で120分間インキュベートする。
1)新たな溶解緩衝液を、表3に記載の試薬を混合することにより新たに調製する。
2)最終洗浄後、細胞を氷上で100μLの冷蔵緩衝液中に再懸濁させる。
3)インキュベーションを氷上で30分間実施する。
4)混合物を最高速度でマイクロフュージ内で10分間回転させて溶解物からビーズを分離する。
5)溶解物をアッセイのために新しい試験管に移し、又は80℃で貯蔵する。
刺激された細胞:
1)成長因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)及び/又はIGF(100nM)を細胞に添加し、37℃で5分間インキュベートする。
1)試料を治療有効濃度のHerceptin、ラパチニブ、Tarceva及び/又はラパマイシンアナログと37℃で30分間インキュベートする。
2)次いで、因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)及び/又はIGF(100nM)を添加することにより細胞を刺激し、37℃で5分間インキュベートする。
1)試料を治療有効濃度のHerceptin、ラパチニブ、Tarceva及び/又はラパマイシンアナログと37℃で30分間インキュベートする。
2)次いで、因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)及び/又はIGF(100nM)を添加することにより細胞を刺激し、37℃で120分間インキュベートする。
1)新たな溶解緩衝液を、表3に記載の試薬を混合することにより新たに調製する。
2)最終洗浄後、細胞を氷上で100μLの冷蔵緩衝液中に再懸濁させる。
3)インキュベーションを氷上で30分間実施する。
4)混合物を最高速度でマイクロフュージ内で10分間回転させて溶解物からビーズを分離する。
5)溶解物をアッセイのために新しい試験管に移し、又は80℃で貯蔵する。
本実施例は、腫瘍組織又は生検標本から細胞を単離し、刺激し、及び溶解させる方法を説明する。本実施例は、組織、生検物又は全血から単離された腫瘍細胞の一次培養を開始し、刺激し、及び溶解させる方法も説明する。化学療法剤をスクリーニングするための生物学的標本から腫瘍細胞を単離及び培養する追加の方法は、例えば、米国特許第第5,728,541号;第6,416,967号;第6,887,680号;第6,900,027号;第6,933,129号;第7,112,415号並びに米国特許出願公開第20040023375号及び第20050202411号に記載されている。本実施例に従って調製された細胞抽出物は、単一検出又は本明細書に記載の近接アッセイにおいて使用することができる。
細胞の単離及び培養:
1)約5〜100mgの非壊死性、非汚染腫瘍組織を外科的に採取し、無菌細胞培養培地(例えば、10%FBS及び抗生物質を有するRMPI−1640)を含有する100mLボトル内に配置する。
2)試料は、抽出後72時間以内に室温で貯蔵又は輸送することができる。
3)試料を細胞培養培地中で3回すすぎ洗う。
4)組織は外科用メスにより小片に細分化し、次いで微細なワイヤーメッシュに導通させることにより細胞懸濁液に分解させる。
5)あるいは、細分化された組織を、抗生物質を含有する血清不含細胞培養培地中に希釈された0.25%コラゲナーゼII及び0.001%DNアーゼを含有するカクテルにより処理する。インキュベーションは、穏やかに撹拌しながら15〜20分間行う。細胞培養培地により3回洗浄することによる処理後に酵素を除去する。
6)細胞濃度を106/mLに調整し、細胞を6ウエルプレート内に播種し、一晩沈降させる。翌日、細胞をトリプシン処理し、リガンドによる刺激及び/又は標的薬による阻害のためにマイクロタイタープレート内に再播種する。
細胞の刺激:
1)成長因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)及び/又はIGF(100nM)を細胞に添加し、37℃で5分間インキュベートする。
1)試料を治療有効濃度のHerceptin、ラパチニブ、Tarceva及び/又はラパマイシンアナログと37℃で30分間インキュベートする。
2)次いで、因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)及び/又はIGF(100nM)を添加することにより細胞を刺激し、37℃で5分間インキュベートする。
1)試料を治療有効濃度のHerceptin、ラパチニブ、Tarceva及び/又はラパマイシンアナログと37℃で30分間インキュベートする。
2)次いで細胞をTGF−α(100nM)、Hrg(100nM)及び/又はIGF(100nM)により刺激し、37℃で120分間インキュベートする。
1)新たな溶解緩衝液を、表3に記載の試薬を混合することにより新たに調製する。
2)最終洗浄後、細胞を氷上で100μLの冷蔵緩衝液中に再懸濁させる。
3)インキュベーションを氷上で30分間実施する。
4)混合物を最高速度でマイクロフュージ内で10分間回転させて溶解物からビーズを分離する。
5)溶解物をアッセイのために新しい試験管に移し、又は80℃で貯蔵する。
細胞の単離及び培養:
1)コア生検物を外科的に抽出し(真空支援生検のための1〜2片の生検物とともに、14ゲージ針については2つのコア、16ゲージ針については3つのコア及び18ゲージ針については4つのコア)、腫瘍標本のための細胞培養培地を含有する10mLの無菌バイアル内に配置する。
2)試料は、抽出後72時間以内に室温で貯蔵又は輸送することができる。
3)コア生検物からの細胞材料を、微細なワイヤーメッシュに導通させることにより細胞懸濁液に分解させる。
4)あるいは、生検物を、抗生物質を含有する細胞培養培地中に希釈された0.25%コラゲナーゼII及び0.001%DNアーゼを含有するカクテルにより処理することができる。インキュベーションは、穏やかに撹拌しながら15〜20分間行う。細胞培養培地により3回洗浄することによる処理後に酵素を除去する。
5)細胞濃度を106/mLに調整し、細胞を6ウエルプレート内に播種し、一晩沈降させる。翌日、細胞をトリプシン処理し、リガンドによる刺激及び/又は標的薬による阻害のためにマイクロタイタープレート内に再播種する。
細胞の刺激:
1)成長因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)及び/又はIGF(100nM)を細胞に添加し、37℃で5分間インキュベートする。
1)試料を治療有効濃度のHerceptin、ラパチニブ、Tarceva及び/又はラパマイシンアナログと37℃で30分間インキュベートする。
2)次いで、因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)及び/又はIGF(100nM)を添加することにより細胞を刺激し、37℃で5分間インキュベートする。
1)試料を治療有効濃度のHerceptin、ラパチニブ、Tarceva及び/又はラパマイシンアナログと37℃で30分間インキュベートする。
2)次いで細胞をTGF−α(100nM)、Hrg(100nM)及び/又はIGF(100nM)により刺激し、37℃で120分間インキュベートする。
1)新たな溶解緩衝液を、表3に記載の試薬を混合することにより新たに調製する。
2)最終洗浄後、細胞を氷上で100μLの冷蔵緩衝液中に再懸濁させる。
3)インキュベーションを氷上で30分間実施する。
4)混合物を最高速度でマイクロフュージ内で10分間回転させて溶解物からビーズを分離する。
5)溶解物をアッセイのために新しい試験管に移し、又は80℃で貯蔵する。
細胞の培養:
1)上記の組織、生検物又は全血から単離された腫瘍細胞を、単離された腫瘍細胞の数に応じて小さい無菌フラスコ(例えば、T−25)、ペトリ皿(例えば、10mm)又はプレート(例えば、24ウェルプレート)内で培養する。
2)インキュベーションは、5%CO2が補給された加湿37℃インキュベーション内の細胞培養培地(例えば、2%FBS及び抗生物質を有するRMPI−1640)中で行う。経時的に細胞は容器底部上で単層を形成し、***し始める。細胞がコンフルエンスに近付くと、細胞をトリプシン処理し、リガンドによる刺激及び/又は標的薬による阻害のためにマイクロタイタープレート内に再播種する。
細胞の刺激:
1)成長因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)及び/又はIGF(100nM)を細胞に添加し、37℃で5分間インキュベートする。
1)試料を治療有効濃度のHerceptin、ラパチニブ、Tarceva及び/又はラパマイシンアナログと37℃で30分間インキュベートする。
2)次いで、因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)及び/又はIGF(100nM)を添加することにより細胞を刺激し、37℃で5分間インキュベートする。
1)試料を治療有効濃度のHerceptin、ラパチニブ、Tarceva及び/又はラパマイシンアナログと37℃で30分間インキュベートする。
2)次いで細胞をTGF−α(100nM)、Hrg(100nM)及び/又はIGF(100nM)により刺激し、37℃で120分間インキュベートする。
1)新たな溶解緩衝液を、表3に記載の試薬を混合することにより新たに調製する。
2)最終洗浄後、細胞を氷上で100μLの冷蔵緩衝液中に再懸濁させる。
3)インキュベーションを氷上で30分間実施する。
4)混合物を最高速度でマイクロフュージ内で10分間回転させて溶解物からビーズを分離する。
5)溶解物をアッセイのために新しい試験管に移し、又は80℃で貯蔵する。
本実施例は、希少循環細胞中のシグナル伝達分子の活性化状態を分析するのに好適な優れたダイナミックレンジを有するマルチプレックスハイスループット単一検出マイクロアレイELISAを説明する。
1)捕捉抗体を、2倍の段階希釈物により16パッドのFASTスライド(Whatman Inc.;Florham Park,NJ)上にプリントした。
2)一晩乾燥させた後、スライドをWhatmanブロッキング緩衝液によりブロッキングした。
3)80μLの細胞溶解物を、10倍の段階希釈物を含む各パッド上に添加した。スライドを、室温で2時間インキュベートした。
4)TBS−Tweenにより6回洗浄した後、80μLのビオチン標識検出抗体(例えば、リン酸化c−Metを認識するモノクローナル抗体又は活性化状態とは無関係にc−Metを認識するモノクローナル抗体)を室温で2時間インキュベートした。
5)6回洗浄した後、ストレプトアビジン標識セイヨウワサビペルオキシダーゼ(SA−HRP)を添加し、1時間インキュベートしてSA−HRPをビオチン標識検出抗体に結合させた。
6)シグナル増幅のため、5μg/mLの80μLのビオチン−チラミドを添加し、15分間反応させた。スライドをTBS−Tweenにより6回、20%DMSO/TBS−Tweenにより2回及びTBSにより1回洗浄した。
7)80μLのSA−Alexa 555を添加し、30分間インキュベートした。次いでスライドを2回洗浄し、5分間乾燥させ、マイクロアレイスキャナ(Perkin−Elmer,Inc.;Waltham,MA)上でスキャンした。
本実施例は、希少循環細胞中のシグナル伝達分子の活性化状態を分析するのに好適な優れたダイナミックレンジを有するマルチプレックスハイスループット近接二重検出マイクロアレイELISAを説明する。
1)捕捉抗体を、1mg/mLから0.004mg/mLの範囲内の連続希釈物を含む16パッドのFASTスライド(Whatman Inc.)上でプリントした。
2)一晩乾燥させた後、スライドをWhatmanブロッキング緩衝液によりブロッキングした。
3)80μLのA431細胞溶解物を、10倍の連続希釈物を有する各パッド上に添加した。スライドを室温で2時間インキュベートした。
4)TBS−Tweenにより6回洗浄した後、TBS−Tween/2%BSA/1%FBS中に希釈された近接アッセイのための80μLの検出抗体をスライドに添加した。インキュベーションを室温で2時間行った。
a)非限定的な例として、検出抗体は以下のものを含むことができる:(i)グルコースオキシダーゼ(GO)に直接コンジュゲートされた抗c−Metモノクローナル抗体;及び(ii)セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)に直接コンジュゲートされたリン酸化c−Metを認識するモノクローナル抗体。
b)あるいは、検出工程は、リン酸化c−Metを認識するモノクローナル抗体のビオチン−コンジュゲートを利用することができる。これらの例において、6回洗浄した後、ストレプトアビジン−HRPによる1時間のインキュベーションの追加の連続工程を含める。
c)あるいは、検出工程は、抗c−Met抗体のオリゴヌクレオチド媒介グルコースオキシダーゼ(GO)コンジュゲートを利用することができる。リン酸化c−Met抗体に直接コンジュゲートされた、又はHRPのビオチン−ストレプトアビジン(SA)結合コンジュゲートのいずれかを使用することができる。
5)シグナル増幅のため、5μg/mLの80μLのビオチン−チラミドを添加し、15分間反応させた。スライドをTBS−Tweenにより6回、20%DMSO/TBS−Tweenにより2回及びTBSにより1回洗浄した。
6)80μLのSA−Alexa555を添加し、30分間インキュベートした。次いでスライドを2回洗浄し、5分間乾燥させ、マイクロアレイスキャナ(Perkin−Elmer Inc.)上でスキャンした。
本発明の方法及び組成物は、癌治療のための薬物選択に適用することができる。典型的なプロトコールは、2種のプロファイル、すなわち参照活性化プロファイル及び試験活性化プロファイルを作成し、次いでこれらを比較して特定の薬物治療レジメンの効力を決定することを必要とする(図2参照)。
参照活性化プロファイルを導出するため、血液又は細針吸引液(FNA)試料は、抗癌薬治療前に特定のタイプの癌(例えば、胃癌)を有する患者から得る。癌性腫瘍に由来する希少循環細胞は、血液試料から単離し、又は腫瘍細胞は、例えば、本明細書により詳細に記載された免疫磁気分離技術を使用してFNA試料から単離する。単離された細胞は、1種以上の成長因子を用いてインビトロで刺激することができる。次いで、刺激された細胞を溶解させて細胞抽出物を生成する。細胞抽出物は、活性化状態が患者の癌のタイプにおいて変化され得るシグナル伝達分子に特異的な捕捉抗体のパネルの希釈系列を含有するアドレス可能なアレイに適用する。単一検出又は近接アッセイは、適切な検出抗体(例えば、活性化状態非依存性抗体及び/又は活性化状態依存性抗体)を使用して実施して対象となる各シグナル伝達分子の活性化状態を決定する。表2に示した「経路選択」表は、患者の癌のタイプに基づいてどの活性化状態を検出すべきかを選択するために特に有用である。例えば、ある患者は、表2の「経路1」に記載のEGFR経路の活性化状態を提示する癌のタイプを有し得る。あるいは、別の患者は、表2の「経路2」に記載のEGFR経路の活性化状態を提示する別の癌のタイプを有し得る。従って、参照活性化プロファイルは、任意の抗癌薬の非存在下で患者の癌におけるシグナル伝達分子の活性化状態を提供するように作成する。
試験活性化プロファイルを得るため、第2の血液又はFNA試料を、抗癌薬治療前又は抗癌薬の投与後のいずれかに(例えば、癌治療の過程を通して任意の時点に)特定タイプの癌(例えば、胃癌)を有する患者から得る。癌性腫瘍に由来する希少循環細胞を血液試料から単離し、又は腫瘍細胞をFNA試料から単離する。単離された細胞を抗癌薬による治療を受けていない対象から得る場合、単離された細胞を、上記の参照活性化プロファイルから決定された活性化シグナル伝達分子の1種以上を標的とする抗癌薬とインキュベートする。「薬物選択」表(表1)は、特異的活性化標的シグナル伝達分子を阻害する、承認されている又は臨床試験下の適切な抗癌薬を選択するために特に有用である。例えば、EGFRが活性化されていることが参照活性化プロファイルから決定された場合、細胞を表1の欄「A」又は「B」に列挙した薬物の1種以上とインキュベートすることができる。次いで、単離された細胞を1種以上の成長因子によりインビトロで刺激することができる。次いで、単離された細胞を溶解させて細胞抽出物を生成する。細胞抽出物をアドレス可能なアレイに適用し、近接アッセイを実施して対象となる各シグナル伝達分子の活性化状態を決定する。従って、患者のための試験活性化プロファイルを、特定の抗癌薬の存在下での患者の癌におけるシグナル伝達分子の活性化状態を提供するように作成する。
抗癌薬は、試験活性化プロファイルを対照活性化プロファイルと比較することにより、患者の癌の治療に好適か不適かを決定する。例えば、薬物治療により、ほとんど又は全部のシグナル伝達分子が薬物の非存在下よりも実質的に低く活性化される場合、例えば、薬物を用いない強い活性化から薬物を用いた弱い又は極めて弱い活性化への変化が引き起こされる場合、治療は患者の癌に好適であると決定する。このような例において、治療は薬物療法を受けていない患者においては好適な抗癌薬を用いて開始し、又は薬物を既に摂取している患者においては好適な抗癌薬による後続の治療を継続する。しかしながら、薬物治療が患者の癌の治療に不適とみなした場合、異なる薬物を選択及び使用して新規な試験活性化プロファイルを作成し、次いでこのプロファイルを参照活性化プロファイルと比較する。このような例において、治療は薬物療法を受けていない患者においては好適な抗癌薬により開始し、又は不適な薬物を現在摂取している患者においては後続の治療を好適な抗癌薬に変更する。
本実施例は、抗c−Met阻害剤に対して応答する患者を同定するための、及び抗c−Met阻害剤と他の標的剤との組合せから利益を受ける患者を同定するための、本明細書に記載のマルチプレックス化タンパク質マイクロアレイプラットフォームの使用を説明する。
(1)選択された標的は、マイクロアレイ表面上に段階希釈物でプリントされた標的特異性抗体により捕捉される。このフォーマットは、結合した各標的タンパク質ごとに後続のチャネリング事象のために酵素と結合している2種の追加の検出抗体の共局在化を要する(図5)。
(2)捕捉抗体による最初の標的結合及び捕捉された標的分子上の択一的エピトープを認識するGO(105/分のTON)にコンジュゲートされた抗体の二次結合により形成された免疫複合体は、GO基質グルコースの存在下でH2O2を生成することができる。
(3)次いで、H2O2の標的特異的局所流入は、捕捉された標的上のリン酸化ペプチドに結合するHRP(104/分のTON)にコンジュゲートされたホスホペプチド特異的抗体により利用され、従って標的特異的シグナルが増幅される。リン酸化標的を検出するための特異性は、3種の異なるタイプの抗体の同時結合のための要件を前提にすると、共同免疫検出及び増幅プロセスを介して大きく増加される。約2〜3×104回という少ないリン酸化事象の検出及び定量は、この検出を「単」細胞レベルにする本方法により定型的に達成される。ある例において、この共同免疫アッセイの構成は、タンパク質相互作用及び活性化状態を調査するために更に適用することができる。
腫瘍組織の逐次サンプリングに基づくキナーゼ及び他のシグナル伝達経路分子の発現/活性化プロファイリングは、時間及び治療に応じて腫瘍細胞において生じる変化に基づく貴重な情報を提供する。腫瘍進行のこの一時的なプロファイリングにより、臨床医が各患者において急速に発達する癌シグネチャーを追跡することが可能となる。本実施例は、胃癌に関与する受容体チロシンキナーゼ(RTK)経路の発現のレベル及びリン酸化の程度を検出するための新規で堅牢なアッセイを説明し、単細胞レベルの感度を有するこのような治療ガイド診断システムを使用する利点を実証する。本アッセイは、一般に、試料、例えば、細針吸引液(FNA)及び血液に依存し、このような試料から得られた限定量の癌細胞の調査のための高い感度及び特異性を達成する。
オプション番号1組織切片回収:
1.プラスチック秤量ボートをドライアイス上で保持し、このボート内で試料切断を行う。
a.材料を冷蔵するため、かみそり刃又はミクロトームブレード、微細鉗子及び予備標識試料回収バイアルをドライアイス上で保持する。
2.冷凍ヒト癌組織を−80℃フリーザーから取り出し、試料を直ちにドライアイス上に移す。
3.冷凍組織をドライアイス上の秤量ボートに移し、かみそり刃又はミクロトームブレードを使用して冷凍組織を小片(10μm切片×3)に切断し、予備冷蔵鉗子を使用して組織を予備冷蔵及び予備標識された試料回収バイアルに移す。
4.キャップを閉じ、これをドライアイス上で保持する。
5.回収された標本を、最初に二重プラスチックバッグ中に配置し、次いでStyrofoam容器(一次容器)中に適切量のドライアイスとともに配置する。
a.少なくとも6〜8ポンドのドライアイスを使用する。夏季においてはより多くのドライアイスを使用する。
注:正確な量のドライアイスは、輸送会社との協議後に決定する。
b.必要な許可及びドキュメンテーションについて国際的な輸送プロセスのために輸送会社と協議する。
c.湿った氷又は冷却剤(すなわち、クールパック)は使用しない。
6.必要条件を確認し、試料リストをボックス中に配置するが、二重バッグの外側に配置する。
7.容器を安全に密封し、「冷凍組織−解凍不可」のラベルを貼る。
オプション番号2冷凍組織からのFNA調製:
1.冷凍ヒト癌組織を−80℃フリーザーから取り出し、試料バイアルを直ちにドライアイス上に移す。
2.FNA手順について準備された試料を湿った氷の上に10分間配置して組織を軟化させるべきである。
3.FNA試料回収は、23又は25ゲージ針を軟化した冷凍組織に5から10回通すことにより実施すべきである。残りの試料バイアルをドライアイスに戻す。
4.FNA試料回収バイアルの蓋をアルコールにより拭く。
5.冷凍FNA試料は、100μLの「タンパク質後溶液」(Prometheus Laboratories;San Diego,CA)を含有する回収バイアル中への直接注射により回収すべきである。回収された組織材料を、内容物を穏やかに混合することにより分注する。
6.FNA回収バイアルを片手によりしっかり固定し、急速な指によるタッピング(約15×)を実施して完全な細胞溶解を確保する(可能な場合、10秒間ボルテックスにかける)。
7.回収された標本を、最初に二重プラスチックバッグ中に配置し、次いでStyrofoam容器(一次容器)中にクールパックとともに配置する。
a.必要な許可及びドキュメンテーションについて国際的な輸送プロセスのために輸送会社と協議する。
8.必要条件を確認し、試料リストをボックス中に配置するが、二重バッグの外側に配置する。
9.容器を安全に密封し、「生物学的標本」のラベルを貼る。
全転移性腫瘍の約3%〜5%は、原発不明癌(CUP)のカテゴリーに分類される。起源組織の正確な診断は、現行療法が多分に解剖学的部位に基づいているので、治療の決定において重要である。遺伝子発現パネルは、最初に胃癌を有すると診断された患者に与えられる治療と一致する治療から利益が得られるであろう転移性胃癌を有する患者の同定において有用であり得る。好適なシステムには、限定されるものではないが、マイクロRNAの発現パターンの分析を通して癌及び起源組織を分類するRosetta Genomics CUPアッセイ(例えば、PCT国際公開第08/117278号参照);92種の遺伝子を測定して39種の腫瘍タイプについて原発起源部位を同定するRT−PCRベースの発現アッセイであるAviara DX(Carlsbad,CA)CancerTYPE ID(商品名)アッセイ;及びマイクロアレイ上で1600種超の遺伝子の発現を測定し、15種の既知の組織タイプに対して腫瘍の遺伝子発現「シグニチャー」を比較する、Pathwork(商品名)起源組織検査(Sunnyvale,CA)が含まれる。患者の原発性癌の組織が食道及び/又は胃であると同定されると、経路活性化プロファイルを使用して適切な標的療法を選択して治療スケジュールに含めることができる。
1)転移性腫瘍から外科的又は細針生検のいずれかにより切除された厚さ7μmの組織切片を載せた2枚以上のガラススライドを患者から得る。これらの細胞をホルマリン中で固定し、パラフィン(FFPE)内に包埋する。1枚の追加の同一腫瘍のスライドをH&Eにより染色する。
2)病理学者は、H&Eスライドを精査し、CancerTYPE ID(商品名)アッセイのために回収すべき領域を示す。スライドを分析のためにAviara DXに送付する。
3)Aviara DXからの試験報告書は、k近傍分析から決定された上位5つの最も可能性が高い起源部位を示し、予測が導出される。患者のための予測が原発不明腫瘍として食道及び/又は胃を示す場合、患者の腫瘍細胞を経路活性化について査定することができる。
4)腫瘍細胞(例えば、CTC)を、実施例1に記載のとおり血液から単離し、分析のために調製する。あるいは、細針生検物を使用して実施例2に記載のとおり腫瘍細胞抽出物を調製することができる。細胞調製物は、実施例3又は実施例4に記載のとおりアッセイする。活性化プロファイルは、実施例6又は実施例7に記載のものと類似の様式において評価する。適切な標的療法又は標的療法の組合せを選択する。
胃切除は胃癌(GCA)患者における唯一の根治治療であるが、根治手術後の40〜60%に及ぶ高い再発率が依然として不良な全生存率の一因となっている。生存率を更に改善するため、患者オーダーメード治療方針の開発に進展する、アジュバント化学放射線療法後の生存率又は再発率についての信頼性のある分子診断マーカーを同定する緊急の必要性が存在する。胃癌療法の改善は、最終的には、癌増殖に重要な分子を標的とする新規治療アプローチに依存する。伝達経路タンパク質は細胞シグナリングにおいて機能し、成長、分化、接着、遊走及びアポトーシスを調節するシグナルを伝達するので、これらは種々の治療剤の標的となっている。本明細書に記載のマルチプレックス化免疫アッセイプラットフォームは、これらの伝達経路タンパク質の機能的プロファイリングに利用することができる。
要旨
胃切除は胃癌(GCA)患者における唯一の根治治療であるが、根治手術後の40〜60%に及ぶ高い再発率が依然として不良な全生存率の一因となっている。生存率を更に改善するため、患者オーダーメード治療方針の開発に進展する、アジュバント化学放射線療法後の生存率又は再発率についての信頼性のある分子診断マーカーを同定する緊急の必要性が存在する。従って、本発明者らは、マルチプレックス化免疫マイクロアレイプラットフォームを使用するシグナル伝達経路タンパク質の機能的プロファイリングのためのマルチプレックス化免疫アッセイプラットフォームを開発した。本実施例は、GCAにおけるHER2、HER1、HER3、PI3K、cMET及びIGF1Rの機能的プロファイリングを実証する。
胃癌は、世界規模で主な癌による死因であり、発病率は1年当たり18.9人/100000人であり、致死率は1年当たり14.7人/100000人である。転移性胃癌は、不良な予後に起因して腫瘍内科医にとって治療的な困難性が残存している。胃癌のための新規治療標的を追求して、HER2過剰発現が試験されており、胃腫瘍及び胃食道腫瘍の6〜35%で報告された。HER2を選択的に標的とするヒト化モノクローナル抗体トラスツズマブは、HER2(+)転移性乳癌を有する患者において生存利益を示している。注目すべきは、HER2過剰発現する乳癌患者の70〜80%は、初回又は獲得耐性のいずれかに起因してトラスツズマブに対して応答しない。トラスツズマブ耐性についての重要な機序の1つは、細胞外トラスツズマブ結合ドメインを欠損するHER2トランケート化形態(p95−HER2)の蓄積である。本明細書において本発明者らは、胃癌におけるHER2標的剤を取り込む将来的な臨床試験のための基礎を作るため、HER2、p95−HER2及びHER2活性化についてトランス活性化潜在性を有する他の経路タンパク質の発現/活性化プロファイリングを報告する。
共同近接免疫アッセイ(COPIA):組織溶解物中に存在する標的タンパク質をニトロセルロース表面上にプリントされた特異的捕捉抗体に結合させ、未結合の非標的タンパク質をスライドから除去する。グルコースオキシダーゼ(GO)にコンジュゲートされた、捕捉された標的タンパク質上の択一的エピトープに対する一方の検出抗体と、HRPにコンジュゲートされた、標的タンパク質上のリン酸化部位又は別の重複しないエピトープに特異的な他方の検出抗体との酵素的相互作用は、シグナル発生及び後続のチラミド媒介シグナル増幅をもたらす(図8)。
HER2標準滴定曲線を、BT474細胞を使用して作成し、図9に示すとおり単細胞レベルの感度が達成された。これらの値をスタンダードとして使用して臨床試料についての定量値を作成した。完全長HER2を除去し、及び除去しないBT474細胞のディファレンシャルなHER2プロファイリング(HER2−ECD及びHER2−ICD捕捉による)の比較は、HER2増幅参照細胞系BT474において約4.4%のp95HER2が存在することを示した(図10A)。標的タンパク質発現及びリン酸化の定量は、各RTKに特異的なリガンドにより処理した既知レベルのRTK発現を有する細胞系(例えば、BT474、T47D、HCC827)に基づくものであった(図10B)。
HER2及びこの変種形態並びに他のRTKの状態に基づく本実施例に記載の知見は、初回又は獲得耐性のいずれかに起因してトラスツズマブに応答しないHER2陽性GCA患者についての潜在的な機序についての重要な情報を提供する。本発明のCOPIAフォーマット及び分析は、有利には、有効な標的療法を選択するため、GCA患者を、これらのシグナル伝達タンパク質についてプロファイリングするために利用することができる。
本実施例は、本明細書に記載の共同近接免疫アッセイ(COPIA)マルチプレックス化タンパク質マイクロアレイプラットフォームを使用して胃癌(GCA)患者の血液から得られた循環腫瘍細胞(CTC)におけるシグナル伝達経路タンパク質、例えば、HER1及びHER2の機能的プロファイリングを実証する。従って、本実施例に記載の実験の1つの特定の目的は、GCAにおけるHER2陽性CTCの頻度を検査することであった。
本実施例は、本明細書に記載の共同近接免疫アッセイ(COPIA)マルチプレックス化タンパク質マイクロアレイプラットフォームを使用して胃癌(GCA)腫瘍組織試料におけるシグナル伝達経路タンパク質、例えば、HER1、HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K及びShcの機能的プロファイリングを実証する。本実施例は、COPIAを使用するGCA腫瘍組織試料におけるp95HER2の機能的プロファイリングも実証する。従って、本実施例に記載の実験の1つの特定の目的は、(1)GCA腫瘍組織におけるp95HER2の頻度を検査すること、(2)臨床病理可変要素とp95HER2との相関を分析すること及び(3)トラスツズマブ耐性p95HER2(+)胃癌からのインビトロでの前臨床データと相関付けることであった。
本実施例は、対象となる特定の分析物について作成された標準曲線に対する生物学的試料(例えば、血液又は腫瘍組織)中の1種以上の分析物、例えば、1種以上のシグナル伝達タンパク質の発現及び/又は活性化レベルの定量を説明する。
−標準曲線のそれぞれ(例えば、3種の捕捉抗体希釈物及び3つのPMTゲイン設定スキャニング)からの個々の予測は、単一の最終予測に組み合わせることができる。各予測のため、標準曲線上の点の傾きを計算する。この傾きは、x軸上でlog単位を取り、すなわち、傾きの分母における単位はlog計算単位(CU)である。第2に、予測の加重平均を計算し、この重みは傾きから決定する。特に、重みを合算し、各点に全傾きにより割った傾きに等しい重みを与える。各アッセイは、既知対照についての予測に対して検証することができる。
HER2陽性進行性胃癌
この提案される進行性胃癌の臨床試験において、HER−2標的剤、例えば、トラスツズマブをHER−1及びHER−2二重阻害剤、例えば、ラパチニブと組み合わせた組合せの治療効力を、これらの一方又は他方の単一治療が不適合であった患者において評価する。資格要件は、個体が少なくとも1種の化学療法レジメン、すなわち、トラスツズマブ又はラパチニブにおいて既に不適合であったことである。個体は、根治療法がなじまない局所進行性又は再発性及び/又は転移性疾患を有する手術不能な、組織学的に確認された胃又は胃食道接合部の腺癌を有する。
この提案される無作為化第II相試験は、胃癌を有する患者の治療におけるファーストライン療法としてラパチニブジトシレートを用いて一緒に又は用いないで与える場合、エピルビシン塩酸塩又は5−フルオロウラシルがいかに十分であるかを決定する。
転移性胃癌を有する患者の大多数は、化学療法(例えば、白金誘導体及びフルオロピリミジン、タキサンと組み合わせることもある)と組み合わせたファーストラインを受けるが、セカンドライン化学療法の役割は依然として十分に規定されていない。従って、ファーストライン化学療法の間又は直後の進行は、標準的な医学的アプローチが存在しない医学的病態である。胃癌及び胃食道癌におけるEGFR及びHER2の過剰発現により、これらの適応症が二重ErbB1/2チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)、例えば、ラパチニブによる治療についての最有力候補となる。
Claims (180)
- 胃癌の治療に好適な抗癌薬を選択する方法であって、
(a)単離癌細胞から生成される細胞抽出物中のHER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR、PDGFR及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;並びに
(b)工程(a)において決定された前記1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルに基づき、胃癌の治療に好適な抗癌薬を選択すること
を含む方法。 - 前記1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルが、前記1種以上の分析物について作成された標準曲線に対して較正される、請求項1に記載の方法。
- 癌細胞が、胃癌を有する対象から抗癌薬の投与後に単離される、請求項1に記載の方法。
- 単離された癌細胞が抗癌薬と接触される、請求項1に記載の方法。
- 好適な抗癌薬が、前記1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを、抗癌薬の非存在下で作成された前記1種以上の分析物の参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較することにより選択される、請求項3又は4に記載の方法。
- 胃癌が腺癌である、請求項1に記載の方法。
- 胃癌が、食道、小腸、リンパ節、器官、骨又はこれらの組合せに転移している、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)が、細胞抽出物中の2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13種の分析物の任意の組合せの発現レベル及び/又は活性化レベルを決定することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記1種以上の分析物が、HER1、HER2、p95HER2及びHER3を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記1種以上の分析物が、HER1、HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K及びShcを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記1種以上の分析物が、HER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR及びPDGFRを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記VEGFRが、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記PDGFRが、PDGFRA、PDGFRB及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 癌細胞が、腫瘍から得られた循環腫瘍細胞又は細針吸引液(FNA)細胞である、請求項1に記載の方法。
- 腫瘍が胃腫瘍である、請求項14に記載の方法。
- 癌細胞が試料から単離される、請求項1に記載の方法。
- 試料が胃癌を有する対象から得られる、請求項16に記載の方法。
- 試料が、全血、血清、血漿、腫瘍組織、リンパ液、骨髄吸引液、尿、唾液及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 腫瘍組織が原発性腫瘍組織又は転移性腫瘍組織である、請求項18に記載の方法。
- 単離された細胞が1種以上の成長因子によりインビトロで刺激される、請求項1に記載の方法。
- 抗癌薬が、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、抗増殖剤、化学療法剤及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- モノクローナル抗体が、トラスツズマブ(Herceptin(商標))、パーツズマブ(2C4)、アレムツズマブ(Campath(商標))、ベバシズマブ(Avastin(商標))、セツキシマブ(Erbitux(商標))、ゲムツズマブ(Mylotarg(商標))、パニツムマブ(Vectibix(商品名))、リツキシマブ(Rituxan(商標))、トシツモマブ(BEXXAR(商標))、AMG102(抗HGF抗体)、MetMAb(抗Met抗体)及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
- チロシンキナーゼ阻害剤が、ゲフィチニブ(Iressa(商標))、スニチニブ(Sutent(商標))、エルロチニブ(Tarceva(商標))、ラパチニブ(Tykerb(商標))、カネルチニブ(CI1033)、ペリチニブ(EKB−569)、セマキシニブ(SU5416)、バタラニブ(PTK787/ZK222584)、ソラフェニブ(Nexavar(商標))、イマチニブメシレート(Gleevec(商標))、レフルノミド(SU101)、バンデタニブ(ZACTIMA(商品名))、ARQ197、PF−02341066、SGX523、XL184、MGCD265、XL880及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
- 抗増殖剤が、mTOR阻害剤、AKT阻害剤、PI3K阻害剤、MEK阻害剤、pan−HER阻害剤及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
- 化学療法剤が、白金系薬物、アルキル化剤、代謝拮抗薬、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、抗腫瘍抗生物質及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
- 工程(c)が、前記1種以上の分析物の発現レベル及び活性化レベルの両方を決定することを含む、請求項1に記載の方法。
- 細胞抽出物中の1種以上の追加の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 1種以上の追加の分析物が、受容体チロシンキナーゼ、非受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼシグナリングカスケード構成因子、核ホルモン受容体、核受容体コアクチベーター、核受容体リプレッサー及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上のシグナル伝達分子を含む、請求項27に記載の方法。
- 1種以上の追加の分析物が、HER4、MEK、PTEN、SGK3、4E−BP1、ERK2(MAPK1)、ERK1(MAPK3)、PDK1、GSK−3β、Raf、SRC、NFkB−IkB、mTOR、Eph−a、Eph−b、Eph−c、Eph−d、Flt−3、Tie−1、Tie−2、cFMS、Abl、FTL3、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、ER、PR、NCOR、AIB1、RON及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
- 工程(c)における前記1種以上の分析物の発現レベルの決定が、細胞抽出物中の前記1種以上の分析物の全レベルを前記1種以上の分析物に特異的な1種以上の抗体により検出することを含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)における前記1種以上の分析物の活性化レベルの決定が、細胞抽出物中の前記1種以上の分析物のリン酸化レベルを前記1種以上の分析物のリン酸化形態に特異的な1種以上の抗体により検出することを含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)における前記1種以上の分析物の発現レベルの決定が、
(i)細胞抽出物を、前記1種以上の分析物に特異的な捕捉抗体の希釈系列とインキュベートして複数の捕捉された分析物を形成することであって、ここで捕捉抗体は、固体担体上に拘束されている;
(ii)複数の捕捉された分析物を、前記1種以上の分析物に特異的な第1及び第2の活性化状態非依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉された分析物を形成することであって、ここで第1の活性化状態非依存性抗体は促進成分により標識されており、第2の活性化状態非依存性抗体はシグナル増幅ペアの第1のメンバーにより標識されており、促進成分はシグナル増幅ペアの第1のメンバーにチャネリングし、これと反応する酸化剤を発生させる;
(iii)複数の検出可能な捕捉された分析物をシグナル増幅ペアの第2のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを発生させること;並びに
(iv)シグナル増幅ペアの第1及び第2のメンバーから発生した増幅されたシグナルを検出すること
を含む、請求項1に記載の方法。 - 第1の活性化状態非依存性抗体が、促進部分により直接的に標識される、請求項32に記載の方法。
- 第2の活性化状態非依存性抗体が、シグナル増幅ペアの第1のメンバーにより直接的に標識される、請求項32に記載の方法。
- 第2の活性化状態非依存性抗体が、シグナル増幅ペアの第1のメンバーにより、第2の活性化状態非依存性抗体にコンジュゲートされた結合ペアの第1のメンバーとシグナル増幅ペアの第1のメンバーにコンジュゲートされた結合ペアの第2のメンバーとの結合を介して標識される、請求項32に記載の方法。
- 結合ペアの第1のメンバーがビオチンであり、及び/又は結合ペアの第2のメンバーがストレプトアビジンである、請求項35に記載の方法。
- 促進部分がグルコースオキシダーゼである、請求項32に記載の方法。
- グルコースオキシダーゼ及び第1の活性化状態非依存性抗体が、スルフヒドリル活性化デキストラン分子にコンジュゲートされる、請求項37に記載の方法。
- スルフヒドリル活性化デキストラン分子が、約500kDaの分子量を有する、請求項38に記載の方法。
- 工程(c)における前記1種以上の分析物の活性化レベルの決定が、
(i)細胞抽出物を、前記1種以上の分析物に特異的な捕捉抗体の希釈系列とインキュベートして複数の捕捉された分析物を形成することであって、ここで捕捉抗体は、固体担体上に拘束されている;
(ii)複数の捕捉された分析物を、前記1種以上の分析物に特異的な活性化状態非依存性抗体及び活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉された分析物を形成することであって、ここで活性化状態非依存性抗体は促進成分により標識されており、活性化状態依存性抗体はシグナル増幅ペアの第1のメンバーにより標識されており、促進成分はシグナル増幅ペアの第1のメンバーにチャネリングし、これと反応する酸化剤を発生させる;
(iii)複数の検出可能な捕捉された分析物をシグナル増幅ペアの第2のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを発生させること;並びに
(iv)シグナル増幅ペアの第1及び第2のメンバーから発生した増幅されたシグナルを検出すること
を含む、請求項1に記載の方法。 - 活性化状態非依存性抗体が、促進部分により直接的に標識される、請求項40に記載の方法。
- 活性化状態依存性抗体が、シグナル増幅ペアの第1のメンバーにより直接的に標識される、請求項40に記載の方法。
- 活性化状態依存性抗体が、シグナル増幅ペアの第1のメンバーにより、活性化状態依存性抗体にコンジュゲートされた結合ペアの第1のメンバーとシグナル増幅ペアの第1のメンバーにコンジュゲートされた結合ペアの第2のメンバーとの結合を介して標識される、請求項40に記載の方法。
- 結合ペアの第1のメンバーがビオチンであり、及び/又は結合ペアの第2のメンバーがストレプトアビジンである、請求項43に記載の方法。
- 促進部分がグルコースオキシダーゼである、請求項40に記載の方法。
- グルコースオキシダーゼ及び活性化状態非依存性抗体が、スルフヒドリル活性化デキストラン分子にコンジュゲートされる、請求項45に記載の方法。
- スルフヒドリル活性化デキストラン分子が、約500kDaの分子量を有する、請求項46に記載の方法。
- 固体担体が、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項32又は40に記載の方法。
- 捕捉抗体が、アドレス可能なアレイの固体担体上に拘束される、請求項32又は40に記載の方法。
- 酸化剤が過酸化水素(H2O2)である、請求項37又は45に記載の方法。
- シグナル増幅ペアの第1のメンバーがペルオキシダーゼである、請求項50に記載の方法。
- ペルオキシダーゼがセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)である、請求項51に記載の方法。
- シグナル増幅ペアの第2のメンバーがチラミド試薬である、請求項51に記載の方法。
- チラミド試薬がビオチン−チラミドである、請求項53に記載の方法。
- 増幅されたシグナルが、活性化チラミドを生成するビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化により発生する、請求項54に記載の方法。
- 活性化チラミドが直接的に検出される、請求項55に記載の方法。
- 活性化チラミドが、シグナル検出試薬の添加に基づいて検出される、請求項55に記載の方法。
- シグナル検出試薬がストレプトアビジン標識フルオロフォアである、請求項57に記載の方法。
- シグナル検出試薬がストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ及び発色試薬の組合せである、請求項57に記載の方法。
- 発色試薬が3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)である、請求項59に記載の方法。
- 抗癌薬による治療に対する胃癌の応答を同定する方法であって、
(a)単離癌細胞から生成される細胞抽出物中のHER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR、PDGFR及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;並びに
(b)工程(a)において決定された前記1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルに基づき、抗癌薬による治療に対する胃癌の応答を同定すること
を含む方法。 - 前記1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルが、前記1種以上の分析物について作成された標準曲線に対して較正される、請求項61に記載の方法。
- 癌細胞が、胃癌を有する対象から抗癌薬の投与後に単離される、請求項61に記載の方法。
- 単離された癌細胞が抗癌薬と接触される、請求項61に記載の方法。
- 前記1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを、抗癌薬の非存在下で作成された前記1種以上の分析物の参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較することにより胃癌の応答が同定される、請求項63又は64に記載の方法。
- 胃癌が腺癌である、請求項61に記載の方法。
- 胃癌が、食道、小腸、リンパ節、器官、骨又はこれらの組合せに転移している、請求項61に記載の方法。
- 工程(a)が、細胞抽出物中の2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13種の分析物の任意の組合せの発現レベル及び/又は活性化レベルを決定することを含む、請求項61に記載の方法。
- 前記1種以上の分析物が、HER1、HER2、p95HER2及びHER3を含む、請求項61に記載の方法。
- 前記1種以上の分析物が、HER1、HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K及びShcを含む、請求項61に記載の方法。
- 前記1種以上の分析物が、HER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR及びPDGFRを含む、請求項61に記載の方法。
- 前記VEGFRが、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項61に記載の方法。
- 前記PDGFRが、PDGFRA、PDGFRB及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項61に記載の方法。
- 癌細胞が、腫瘍から得られた循環腫瘍細胞又は細針吸引液(FNA)細胞である、請求項61に記載の方法。
- 腫瘍が胃腫瘍である、請求項74に記載の方法。
- 癌細胞が試料から単離される、請求項61に記載の方法。
- 試料が胃癌を有する対象から得られる、請求項76に記載の方法。
- 試料が、全血、血清、血漿、腫瘍組織、リンパ液、骨髄吸引液、尿、唾液及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項76に記載の方法。
- 腫瘍組織が原発性腫瘍組織又は転移性腫瘍組織である、請求項78に記載の方法。
- 単離された細胞が1種以上の成長因子によりインビトロで刺激される、請求項61に記載の方法。
- 抗癌薬が、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、抗増殖剤、化学療法剤及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項61に記載の方法。
- モノクローナル抗体が、トラスツズマブ(Herceptin(商標))、パーツズマブ(2C4)、アレムツズマブ(Campath(商標))、ベバシズマブ(Avastin(商標))、セツキシマブ(Erbitux(商標))、ゲムツズマブ(Mylotarg(商標))、パニツムマブ(Vectibix(商品名))、リツキシマブ(Rituxan(商標))、トシツモマブ(BEXXAR(商標))、AMG102(抗HGF抗体)、MetMAb(抗Met抗体)及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項81に記載の方法。
- チロシンキナーゼ阻害剤が、ゲフィチニブ(Iressa(商標))、スニチニブ(Sutent(商標))、エルロチニブ(Tarceva(商標))、ラパチニブ(Tykerb(商標))、カネルチニブ(CI1033)、ペリチニブ(EKB−569)、セマキシニブ(SU5416)、バタラニブ(PTK787/ZK222584)、ソラフェニブ(Nexavar(商標))、イマチニブメシレート(Gleevec(商標))、レフルノミド(SU101)、バンデタニブ(ZACTIMA(商品名))、ARQ197、PF−02341066、SGX523、XL184、MGCD265、XL880及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項81に記載の方法。
- 抗増殖剤が、mTOR阻害剤、AKT阻害剤、PI3K阻害剤、MEK阻害剤、pan−HER阻害剤及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項81に記載の方法。
- 化学療法剤が、白金系薬物、アルキル化剤、代謝拮抗薬、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、抗腫瘍抗生物質及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項81に記載の方法。
- 工程(c)が、前記1種以上の分析物の発現レベル及び活性化レベルの両方を決定することを含む、請求項61に記載の方法。
- 細胞抽出物中の1種以上の追加の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定することを更に含む、請求項61に記載の方法。
- 1種以上の追加の分析物が、受容体チロシンキナーゼ、非受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼシグナリングカスケード構成因子、核ホルモン受容体、核受容体コアクチベーター、核受容体リプレッサー及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上のシグナル伝達分子を含む、請求項87に記載の方法。
- 1種以上の追加の分析物が、HER4、MEK、PTEN、SGK3、4E−BP1、ERK2(MAPK1)、ERK1(MAPK3)、PDK1、GSK−3β、Raf、SRC、NFkB−IkB、mTOR、Eph−a、Eph−b、Eph−c、Eph−d、Flt−3、Tie−1、Tie−2、cFMS、Abl、FTL3、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、ER、PR、NCOR、AIB1、RON及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項87に記載の方法。
- 工程(c)における前記1種以上の分析物の発現レベルの決定が、細胞抽出物中の前記1種以上の分析物の全レベルを前記1種以上の分析物に特異的な1種以上の抗体により検出することを含む、請求項61に記載の方法。
- 工程(c)における前記1種以上の分析物の活性化レベルの決定が、細胞抽出物中の前記1種以上の分析物のリン酸化レベルを前記1種以上の分析物のリン酸化形態に特異的な1種以上の抗体により検出することを含む、請求項61に記載の方法。
- 工程(c)における前記1種以上の分析物の発現レベルの決定が、
(i)細胞抽出物を、前記1種以上の分析物に特異的な捕捉抗体の希釈系列とインキュベートして複数の捕捉された分析物を形成することであって、ここで捕捉抗体は、固体担体上に拘束されている;
(ii)複数の捕捉された分析物を、前記1種以上の分析物に特異的な第1及び第2の活性化状態非依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉された分析物を形成することであって、ここで第1の活性化状態非依存性抗体は促進成分により標識されており、第2の活性化状態非依存性抗体はシグナル増幅ペアの第1のメンバーにより標識されており、促進成分はシグナル増幅ペアの第1のメンバーにチャネリングし、これと反応する酸化剤を発生させる;
(iii)複数の検出可能な捕捉された分析物をシグナル増幅ペアの第2のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを発生させること;並びに
(iv)シグナル増幅ペアの第1及び第2のメンバーから発生した増幅されたシグナルを検出すること
を含む、請求項61に記載の方法。 - 第1の活性化状態非依存性抗体が、促進部分により直接的に標識される、請求項92に記載の方法。
- 第2の活性化状態非依存性抗体が、シグナル増幅ペアの第1のメンバーにより直接的に標識される、請求項92に記載の方法。
- 第2の活性化状態非依存性抗体が、シグナル増幅ペアの第1のメンバーにより、第2の活性化状態非依存性抗体にコンジュゲートされた結合ペアの第1のメンバーとシグナル増幅ペアの第1のメンバーにコンジュゲートされた結合ペアの第2のメンバーとの結合を介して標識される、請求項92に記載の方法。
- 結合ペアの第1のメンバーがビオチンであり、及び/又は結合ペアの第2のメンバーがストレプトアビジンである、請求項95に記載の方法。
- 促進部分がグルコースオキシダーゼである、請求項92に記載の方法。
- グルコースオキシダーゼ及び第1の活性化状態非依存性抗体が、スルフヒドリル活性化デキストラン分子にコンジュゲートされる、請求項97に記載の方法。
- スルフヒドリル活性化デキストラン分子が、約500kDaの分子量を有する、請求項98に記載の方法。
- 工程(c)における前記1種以上の分析物の活性化レベルの決定が、
(i)細胞抽出物を、前記1種以上の分析物に特異的な捕捉抗体の希釈系列とインキュベートして複数の捕捉された分析物を形成することであって、ここで捕捉抗体は、固体担体上に拘束されている;
(ii)複数の捕捉された分析物を、前記1種以上の分析物に特異的な活性化状態非依存性抗体及び活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉された分析物を形成することであって、ここで活性化状態非依存性抗体は促進成分により標識されており、活性化状態依存性抗体はシグナル増幅ペアの第1のメンバーにより標識されており、促進成分はシグナル増幅ペアの第1のメンバーにチャネリングし、これと反応する酸化剤を発生させる;
(iii)複数の検出可能な捕捉された分析物をシグナル増幅ペアの第2のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを発生させること;並びに
(iv)シグナル増幅ペアの第1及び第2のメンバーから発生した増幅されたシグナルを検出すること
を含む、請求項61に記載の方法。 - 活性化状態非依存性抗体が、促進部分により直接的に標識される、請求項100に記載の方法。
- 活性化状態依存性抗体が、シグナル増幅ペアの第1のメンバーにより直接的に標識される、請求項100に記載の方法。
- 活性化状態依存性抗体が、シグナル増幅ペアの第1のメンバーにより、活性化状態依存性抗体にコンジュゲートされた結合ペアの第1のメンバーとシグナル増幅ペアの第1のメンバーにコンジュゲートされた結合ペアの第2のメンバーとの結合を介して標識される、請求項100に記載の方法。
- 結合ペアの第1のメンバーがビオチンであり、及び/又は結合ペアの第2のメンバーがストレプトアビジンである、請求項103に記載の方法。
- 促進部分がグルコースオキシダーゼである、請求項100に記載の方法。
- グルコースオキシダーゼ及び活性化状態非依存性抗体が、スルフヒドリル活性化デキストラン分子にコンジュゲートされる、請求項105に記載の方法。
- スルフヒドリル活性化デキストラン分子が、約500kDaの分子量を有する、請求項106に記載の方法。
- 固体担体が、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項92又は100に記載の方法。
- 捕捉抗体が、アドレス可能なアレイの固体担体上に拘束される、請求項92又は100に記載の方法。
- 酸化剤が過酸化水素(H2O2)である、請求項97又は105に記載の方法。
- シグナル増幅ペアの第1のメンバーがペルオキシダーゼである、請求項110に記載の方法。
- ペルオキシダーゼがセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)である、請求項111に記載の方法。
- シグナル増幅ペアの第2のメンバーがチラミド試薬である、請求項111に記載の方法。
- チラミド試薬がビオチン−チラミドである、請求項113に記載の方法。
- 増幅されたシグナルが、活性化チラミドを生成するビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化により発生する、請求項114に記載の方法。
- 活性化チラミドが直接的に検出される、請求項115に記載の方法。
- 活性化チラミドが、シグナル検出試薬の添加に基づいて検出される、請求項115に記載の方法。
- シグナル検出試薬がストレプトアビジン標識フルオロフォアである、請求項117に記載の方法。
- シグナル検出試薬がストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ及び発色試薬の組合せである、請求項117に記載の方法。
- 発色試薬が3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)である、請求項119に記載の方法。
- 抗癌薬による治療に対する胃癌を有する対象の応答を予測する方法であって、
(a)単離癌細胞から生成される細胞抽出物中のHER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR、PDGFR及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定すること;並びに
(b)工程(a)において決定された前記1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルに基づき、抗癌薬による治療に対する胃癌を有する対象の応答を予測すること
を含む方法。 - 前記1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルが、前記1種以上の分析物について作成された標準曲線に対して較正される、請求項121に記載の方法。
- 癌細胞が、胃癌を有する対象から抗癌薬の投与後に単離される、請求項121に記載の方法。
- 単離された癌細胞が抗癌薬と接触される、請求項121に記載の方法。
- 前記1種以上の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを、抗癌薬の非存在下で作成された前記1種以上の分析物の参照発現及び/又は活性化プロファイルと比較することにより対象の応答が予測される、請求項123又は124に記載の方法。
- 胃癌が腺癌である、請求項121に記載の方法。
- 胃癌が、食道、小腸、リンパ節、器官、骨又はこれらの組合せに転移している、請求項121に記載の方法。
- 工程(a)が、細胞抽出物中の2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13種の分析物の任意の組合せの発現レベル及び/又は活性化レベルを決定することを含む、請求項121に記載の方法。
- 前記1種以上の分析物が、HER1、HER2、p95HER2及びHER3を含む、請求項121に記載の方法。
- 前記1種以上の分析物が、HER1、HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K及びShcを含む、請求項121に記載の方法。
- 前記1種以上の分析物が、HER1、HER2、p95HER2、HER3、c−Met、IGF1R、cKit、PI3K、Shc、Akt、p70S6K、VEGFR及びPDGFRを含む、請求項121に記載の方法。
- 前記VEGFRが、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項121に記載の方法。
- 前記PDGFRが、PDGFRA、PDGFRB及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項121に記載の方法。
- 癌細胞が、腫瘍から得られた循環腫瘍細胞又は細針吸引液(FNA)細胞である、請求項121に記載の方法。
- 腫瘍が胃腫瘍である、請求項134に記載の方法。
- 癌細胞が試料から単離される、請求項121に記載の方法。
- 試料が胃癌を有する対象から得られる、請求項136に記載の方法。
- 試料が、全血、血清、血漿、腫瘍組織、リンパ液、骨髄吸引液、尿、唾液及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項136に記載の方法。
- 腫瘍組織が原発性腫瘍組織又は転移性腫瘍組織である、請求項138に記載の方法。
- 単離された細胞が1種以上の成長因子によりインビトロで刺激される、請求項121に記載の方法。
- 抗癌薬が、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、抗増殖剤、化学療法剤及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項121に記載の方法。
- モノクローナル抗体が、トラスツズマブ(Herceptin(商標))、パーツズマブ(2C4)、アレムツズマブ(Campath(商標))、ベバシズマブ(Avastin(商標))、セツキシマブ(Erbitux(商標))、ゲムツズマブ(Mylotarg(商標))、パニツムマブ(Vectibix(商品名))、リツキシマブ(Rituxan(商標))、トシツモマブ(BEXXAR(商標))、AMG102(抗HGF抗体)、MetMAb(抗Met抗体)及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項141に記載の方法。
- チロシンキナーゼ阻害剤が、ゲフィチニブ(Iressa(商標))、スニチニブ(Sutent(商標))、エルロチニブ(Tarceva(商標))、ラパチニブ(Tykerb(商標))、カネルチニブ(CI1033)、ペリチニブ(EKB−569)、セマキシニブ(SU5416)、バタラニブ(PTK787/ZK222584)、ソラフェニブ(Nexavar(商標))、イマチニブメシレート(Gleevec(商標))、レフルノミド(SU101)、バンデタニブ(ZACTIMA(商品名))、ARQ197、PF−02341066、SGX523、XL184、MGCD265、XL880及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項141に記載の方法。
- 抗増殖剤が、mTOR阻害剤、AKT阻害剤、PI3K阻害剤、MEK阻害剤、pan−HER阻害剤及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項141に記載の方法。
- 化学療法剤が、白金系薬物、アルキル化剤、代謝拮抗薬、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、抗腫瘍抗生物質及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項141に記載の方法。
- 工程(c)が、前記1種以上の分析物の発現レベル及び活性化レベルの両方を決定することを含む、請求項121に記載の方法。
- 細胞抽出物中の1種以上の追加の分析物の発現レベル及び/又は活性化レベルを決定することを更に含む、請求項121に記載の方法。
- 1種以上の追加の分析物が、受容体チロシンキナーゼ、非受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼシグナリングカスケード構成因子、核ホルモン受容体、核受容体コアクチベーター、核受容体リプレッサー及びこれらの組合せからなる群から選択される1種以上のシグナル伝達分子を含む、請求項147に記載の方法。
- 1種以上の追加の分析物が、HER4、MEK、PTEN、SGK3、4E−BP1、ERK2(MAPK1)、ERK1(MAPK3)、PDK1、GSK−3β、Raf、SRC、NFkB−IkB、mTOR、Eph−a、Eph−b、Eph−c、Eph−d、Flt−3、Tie−1、Tie−2、cFMS、Abl、FTL3、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、ER、PR、NCOR、AIB1、RON及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項147に記載の方法。
- 工程(c)における前記1種以上の分析物の発現レベルの決定が、細胞抽出物中の前記1種以上の分析物の全レベルを前記1種以上の分析物に特異的な1種以上の抗体により検出することを含む、請求項121に記載の方法。
- 工程(c)における前記1種以上の分析物の活性化レベルの決定が、細胞抽出物中の前記1種以上の分析物のリン酸化レベルを前記1種以上の分析物のリン酸化形態に特異的な1種以上の抗体により検出することを含む、請求項121に記載の方法。
- 工程(c)における前記1種以上の分析物の発現レベルの決定が、
(i)細胞抽出物を、前記1種以上の分析物に特異的な捕捉抗体の希釈系列とインキュベートして複数の捕捉された分析物を形成することであって、ここで捕捉抗体は、固体担体上に拘束されている;
(ii)複数の捕捉された分析物を、前記1種以上の分析物に特異的な第1及び第2の活性化状態非依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉された分析物を形成することであって、ここで第1の活性化状態非依存性抗体は促進成分により標識されており、第2の活性化状態非依存性抗体はシグナル増幅ペアの第1のメンバーにより標識されており、促進成分はシグナル増幅ペアの第1のメンバーにチャネリングし、これと反応する酸化剤を発生させる;
(iii)複数の検出可能な捕捉された分析物をシグナル増幅ペアの第2のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを発生させること;並びに
(iv)シグナル増幅ペアの第1及び第2のメンバーから発生した増幅されたシグナルを検出すること
を含む、請求項121に記載の方法。 - 第1の活性化状態非依存性抗体が、促進部分により直接的に標識される、請求項152に記載の方法。
- 第2の活性化状態非依存性抗体が、シグナル増幅ペアの第1のメンバーにより直接的に標識される、請求項152に記載の方法。
- 第2の活性化状態非依存性抗体が、シグナル増幅ペアの第1のメンバーにより、第2の活性化状態非依存性抗体にコンジュゲートされた結合ペアの第1のメンバーとシグナル増幅ペアの第1のメンバーにコンジュゲートされた結合ペアの第2のメンバーとの結合を介して標識される、請求項152に記載の方法。
- 結合ペアの第1のメンバーがビオチンであり、及び/又は結合ペアの第2のメンバーがストレプトアビジンである、請求項155に記載の方法。
- 促進部分がグルコースオキシダーゼである、請求項152に記載の方法。
- グルコースオキシダーゼ及び第1の活性化状態非依存性抗体が、スルフヒドリル活性化デキストラン分子にコンジュゲートされる、請求項157に記載の方法。
- スルフヒドリル活性化デキストラン分子が、約500kDaの分子量を有する、請求項158に記載の方法。
- 工程(c)における前記1種以上の分析物の活性化レベルの決定が、
(i)細胞抽出物を、前記1種以上の分析物に特異的な捕捉抗体の希釈系列とインキュベートして複数の捕捉された分析物を形成することであって、ここで捕捉抗体は、固体担体上に拘束されている;
(ii)複数の捕捉された分析物を、前記1種以上の分析物に特異的な活性化状態非依存性抗体及び活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉された分析物を形成することであって、ここで活性化状態非依存性抗体は促進成分により標識されており、活性化状態依存性抗体はシグナル増幅ペアの第1のメンバーにより標識されており、促進成分はシグナル増幅ペアの第1のメンバーにチャネリングし、これと反応する酸化剤を発生させる;
(iii)複数の検出可能な捕捉された分析物をシグナル増幅ペアの第2のメンバーとインキュベートして増幅されたシグナルを発生させること;並びに
(iv)シグナル増幅ペアの第1及び第2のメンバーから発生した増幅されたシグナルを検出すること
を含む、請求項121に記載の方法。 - 活性化状態非依存性抗体が、促進部分により直接的に標識される、請求項160に記載の方法。
- 活性化状態依存性抗体が、シグナル増幅ペアの第1のメンバーにより直接的に標識される、請求項160に記載の方法。
- 活性化状態依存性抗体が、シグナル増幅ペアの第1のメンバーにより、活性化状態依存性抗体にコンジュゲートされた結合ペアの第1のメンバーとシグナル増幅ペアの第1のメンバーにコンジュゲートされた結合ペアの第2のメンバーとの結合を介して標識される、請求項160に記載の方法。
- 結合ペアの第1のメンバーがビオチンであり、及び/又は結合ペアの第2のメンバーがストレプトアビジンである、請求項163に記載の方法。
- 促進部分がグルコースオキシダーゼである、請求項160に記載の方法。
- グルコースオキシダーゼ及び活性化状態非依存性抗体が、スルフヒドリル活性化デキストラン分子にコンジュゲートされる、請求項165に記載の方法。
- スルフヒドリル活性化デキストラン分子が、約500kDaの分子量を有する、請求項166に記載の方法。
- 固体担体が、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項152又は160に記載の方法。
- 捕捉抗体が、アドレス可能なアレイの固体担体上に拘束される、請求項152又は160に記載の方法。
- 酸化剤が過酸化水素(H2O2)である、請求項157又は165に記載の方法。
- シグナル増幅ペアの第1のメンバーがペルオキシダーゼである、請求項170に記載の方法。
- ペルオキシダーゼがセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)である、請求項171に記載の方法。
- シグナル増幅ペアの第2のメンバーがチラミド試薬である、請求項171に記載の方法。
- チラミド試薬がビオチン−チラミドである、請求項173に記載の方法。
- 増幅されたシグナルが、活性化チラミドを生成するビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化により発生する、請求項174に記載の方法。
- 活性化チラミドが直接的に検出される、請求項175に記載の方法。
- 活性化チラミドが、シグナル検出試薬の添加に基づいて検出される、請求項175に記載の方法。
- シグナル検出試薬がストレプトアビジン標識フルオロフォアである、請求項177に記載の方法。
- シグナル検出試薬がストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ及び発色試薬の組合せである、請求項177に記載の方法。
- 発色試薬が3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)である、請求項179に記載の方法。
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