ES2553456T3 - Perfilado de proteínas de ruta de señal para determinar una eficacia terapéutica - Google Patents
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Abstract
Un método para seleccionar un tratamiento para un sujeto que tiene, o que se sospecha que tiene, cáncer, comprendiendo el método: (a) medir el nivel de dimerización de al menos dos receptores tirosina quinasa (RTK), en el que la medición comprende: (i) incubar un extracto celular con una, o una pluralidad, de series de dilución de anticuerpos de captura, para formar una pluralidad de analitos RTK capturados, en el que el extracto celular se aísla de un sujeto que tiene cáncer después de la administración de un fármaco contra el cáncer o en el que el extracto celular se pone en contacto con un fármaco contra el cáncer; (ii) incubar la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos de detección que comprenden un primer anticuerpo, o una pluralidad de primeros anticuerpos independientes de un estado de activación y un segundo anticuerpo, o una pluralidad de segundos anticuerpos independientes de un estado de activación, específicos de un primer y un segundo elemento, respectivamente, de un par de analitos dimerizado para formar una pluralidad de analitos dimerizados capturados detectables, en el que los primeros anticuerpos independientes de un estado de activación se marcan con un grupo funcional facilitador, los segundos anticuerpos independientes de un estado de activación se marcan con un primer elemento de un par de amplificación de señal y el grupo funcional facilitador genera un agente oxidante que se canaliza hacia, y reacciona con, el primer elemento del par de amplificación de señal; (iii) incubar la pluralidad de analitos dimerizados capturados detectables con un segundo elemento del par de amplificación de señal para generar una señal amplificada; y (iv) detectar la señal amplificada generada a partir del primer y segundo elemento del par de amplificación de señal; y (b) seleccionar un fármaco contra el cáncer comparando la dimerización de al menos dos RTK con un perfil de dimerización de referencia de los mismos dos RTK, en el que el perfil de dimerización de referencia se genera en ausencia del fármaco contra el cáncer.
Description
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La FIG. 33 muestra un gráfico de escalado multidimensional (EMD) que presenta la concordancia de marcadores de ruta fosforilada.
La FIG. 34 ilustra una comparación de fosfo-PI3K y fosfo-AKT1ERK en el análisis de perfilado de ruta de pacientes con cáncer gástrico. En algunas muestras se detectó activación de la familia FGFR, que incluye FGFR1, FGFR2, FGFR3 y FGFR4.
La FIG. 35 ilustra la activación de la ruta PI3K y la activación de la ruta HER en un paciente con cáncer colorrectal antes de la terapia.
La FIG. 36 ilustra la activación de la ruta PI3K y la activación de la ruta HER en una muestra con una mutación del gen KRAS, G13D, tomada de un paciente con cáncer colorrectal antes de la terapia. La FIG. 36 muestra que las proteínas HER1 (EGFR), HER2, Shc, ERK y AKT están muy activadas.
La FIG. 37 ilustra la activación de la ruta PI3K y la activación de la ruta HER en un paciente con cáncer colorrectal con una mutación del gen KRAS, G12D, antes del tratamiento.
La FIG. 38 ilustra análisis AAF de biomarcadores en un perfilado de ruta de muestras de pacientes con cáncer colorrectal.
La FIG. 39 ilustra análisis AAF de biomarcadores en un perfilado de ruta de muestras de pacientes con cáncer pancreático con mutaciones del gen KRAS.
La FIG. 40 ilustra análisis AAF de biomarcadores en un perfilado de ruta de muestras de pacientes con cáncer pancreático con y sin mutaciones del gen KRAS.
La FIG. 41 muestra un esquema de un método ejemplar de un perfilado de enfermedad exhaustivo usando una combinación de análisis de ácido nucleico y proteína funcional.
La FIG. 42 muestra los detalles del estudio clínico descrito en el Ejemplo 12.
La FIG. 43 muestra más detalles del estudio clínico descrito en el Ejemplo 12.
La FIG. 44 ilustra el perfilado de la ruta PI3K activada (fosforilada) de aspirado de muestras de cáncer de mama (por ejemplo, A, B, C y D) expuesto a inhibidor de HER1.
La FIG. 45 ilustra el perfilado de la ruta PI3K activada (fosforilada) de AAF de un tumor de mama y de AAF de un tumor de nódulo linfático.
La FIG. 46A ilustra el nivel de la expresión de componentes proteicos de la ruta PI3K determinado mediante el ensayo CEER. La FIG. 46B muestra que los niveles proteicos de HER1, HER2, HER3, cMET, IGF1R y CK son similares en el tumor de mama y tumor de nódulo linfático de los pacientes.
La FIG. 47 muestra que en una cohorte de pacientes con cáncer de mama hay correlaciones estadísticamente significativas entre las proteínas de la ruta PI3K activada, las mutaciones en el gen PI3K activadas y sus combinaciones. Hay una correlación entre el nivel de fosfo-HER2 en pacientes con una puntuación de IHC HER2 primaria de +1 y +2 y el nivel de fosfo-AKT medido por CEER. En el 37 % de los pacientes en los que se realiza el perfilado, la presencia de fosfo-HER se correlaciona con la de fosfo-AKT.
La FIG. 48 ilustra los datos obtenidos de un perfilado de enfermedad exhaustivo del Paciente 14003-3004 del estudio. El paciente sobreexpresa HER2 y tiene un tumor con alta actividad de HER3 y PI3K. El perfilado de la enfermedad indica que el paciente puede beneficiarse del inhibidor de PI3K solo o con terapia de combinación.
La FIG. 49 ilustra un perfilado de cáncer de mama comparativo de AAF de un tejido adyacente normal y tumoral. La FIG. 49A muestra una imagen inmunohistoquímica de un corte de tejido teñido con un anticuerpo anti-pan CK. Las células tumorales expresan altamente CK en comparación con las células del estroma. La FIG. 49B ilustra los perfiles de la ruta PI3K de muestras de tumor de cáncer de mama y muestras de tejido adyacente normal. La FIG. 49C muestra una representación gráfica de resultados de ensayos CEER-AAF descritos en el presente documento.
La FIG. 50 muestra que el perfilado de ruta de la ruta HER2 proporciona datos más detallados con respecto a p95HER2 y a la expresión de p95HER2 activada en comparación con IHC para HER2 y p95HER2. La FIG. 50A muestra una transferencia de Western para la proteína HER2 y para la proteína p95HER2 en muestras de aspirado de cáncer de mama. La FIG. 50B muestra que las muestras de tumor que expresan altos niveles de HER2 (por ejemplo 3+), medidos por IHC, probablemente sobreexpresan proteína p95HER2 total y proteína p95HER2 activada (fosforilada) en comparación con las que expresan HER2 a niveles de 2+ o 1+/0. La FIG.
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analito es una molécula de transducción de señal tal como, por ejemplo, un componente de una ruta de señalización de HER2 (ErbB2).
La expresión “molécula de transducción de señal” o “transductor de señal” incluye proteínas y otras moléculas que realizan el proceso mediante el cual una célula convierte una señal o estímulo extracelular en una respuesta, lo que generalmente implica organizar secuencias de reacciones bioquímicas dentro de la célula. Los ejemplos de moléculas de transducción de señal incluyen, sin limitación, receptores tirosina quinasa, tales como EGFR (por ejemplo, EGFR/HER1/ErbB1, HER2/Neu/ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4), VEGFR1/FLT1, VEGFR2/FLK1/KDR, VEGFR3/FLT4, FLT3/FLK2, PDGFR (por ejemplo, PDGFRA, PDGFRB), c-KIT/SCFR, INSR (receptor de insulina), IGF-IR, IGF-IIR, IRR (receptor relacionado con el receptor de insulina), CSF-1R, FGFR 1-4, HGFR 1-2, CCK4, TRK A-C, c-MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYRO3, TIE 1-2, TEK, RYK, DDR 1-2, RET, c-ROS, Vcadherina, LTK (tirosina quinasa leucocitaria), ALK (quinasa de linfoma anaplásico), ROR 1-2, MUSK, AATYK 1-3 y RTK 106; formas truncadas de receptores tirosina quinasa tales como receptores de HER2 truncados con dominios extracelulares amino terminales ausentes (por ejemplo p95ErbB2 (p95m), p110, p95c, p95n, etc.); dímeros de receptores tirosina quinasa (por ejemplo, p95HER2/HER3, p95HER2/HER2, HER2/HER2, HER2/HER3, HER1/HER2, HER2/HER3, HER2/HER4, etc.); receptores no tirosina quinasa, tales como BCR-ABL, Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, y LIMK; componentes de la cascada de señalización de tirosina quinasa tales como AKT (por ejemplo, AKT1, AKT2, AKT3), MEK (MAP2K1), ERK2 (MAPK1), ERK1 (MAPK3), PI3K (por ejemplo, PIK3CA (p110), PIK3R1 (p85)), PDK1, PDK2, fosfatasa y homólogo de tensina (PTEN), SGK3, 4E-BP1, P70S6K (por ejemplo, la variante alfa I de corte y empalme de quinasa p70 S6), proteínas tirosina fosfatasas (por ejemplo, PTP1B, PTPN13, BDP1, etc.), RAF, PLA2, MEKK, JNKK, JNK, p38, Shc (p66), Ras (por ejemplo, K-Ras, N-Ras, H-Ras), Rho, Rac1, Cdc42, PLC, PKC, p53, ciclina D1, STAT1, STAT3, fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2), fosfatidilinositol 3,4,5-trisfosfato (PIP3), mTOR, BAD, p21, p27, ROCK, IP3, TSP-1, NOS, GSK-3, RSK 1-3, JNK, c-Jun, Rb, CREB, Ki67, y paxilina; receptores de hormona nuclear, tales como receptor de estrógeno (ER), receptor de progesterona (PR), receptor de andrógeno, receptor de glucocorticoide, receptor de mineralocorticoide, receptor de vitamina A, receptor de vitamina D, receptor retinoideo, receptor de la hormona tiroidea, y receptores huérfanos; coactivadores y represores de receptores nucleares, tales como correpresor 1 del receptor de cancer-1 de mama (AIB1) y nuclear (NCOR), respectivamente; y sus combinaciones.
La expresión “alteración de la ruta PI3K” se refiere a alteración aberrante de la regulación de la ruta de señalización de PI3K debido a mutaciones en el gen PI3K, a amplificaciones en el gen PI3K y/o a la pérdida de PTEN.
Las expresiones “receptor de tipo tirosina quinasa” o “RTK” incluyen cualquier elemento de una familia de receptores cada uno de ellos caracterizado por tener una parte extracelular, una transmembrana y una parte intracelular, mientras que las tirosina quinasas de tipo no receptor son completamente intracelulares. La familia de receptores comprende una gran cantidad de receptores transmembrana con diversas actividades biológicas. De hecho, se han identificado aproximadamente 20 subunidades diferentes de tirosina quinasas de tipo receptor. Una subfamilia de tirosina quinasas, denominada subfamilia HER (ErbB), está constituida por EGFR (HER1), HER2, HER3, y HER4. Los ligandos de esta subfamilia de receptores identificados hasta ahora incluyen el factor de crecimiento epitelial, TGF-alfa, anfirregulina, HB-EGF, betacelulina y herregulina. Otra subfamilia de estas tirosina quinasas de tipo receptor es la subfamilia de la insulina, que incluye INS-R, IGF-IR y IR-R. La subfamilia PDGF incluye los receptores alfa y beta de PDGF, CSFIR, c-kit y FLK-II.
La expresión “componente de una ruta de señalización de HER2” incluye uno cualquiera o más de un ligando aguas arriba de HER2, un compañero de unión de HER2 y/o una molécula efectora aguas abajo que se modula a través de HER2. Los ejemplos de componentes de la ruta de señalización de HER2 incluyen, pero sin limitación, herregulina, HER1/ErbB1, HER2/ ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4, AKT (por ejemplo, AKT1, AKT2, AKT3), MEK (MAP2K1), ERK2 (MAPK1), ERK1 (MAPK3), PI3K (por ejemplo, PIK3CA (p110), PIK3R1 (p85)), PDK1, PDK2, PTEN, SGK3, 4E-BP1, P70S6K (por ejemplo, la alfa I variante de corte y empalme), proteínas tirosina fosfatasas (por ejemplo, PTP1B, PTPN13, BDP 1, etc.), dímeros de HER2 (por ejemplo, p95HER2/HER3, p95HER2/HER2, HER2/HER2, HER2/HER3; HER1/HER2, HER2/HER3, HER2/HER4, etc.), GSK-3, PIP2, PIP3, p27 y sus combinaciones.
La expresión “componente de una ruta de señalización de HER3” incluye uno cualquiera o más de un ligando aguas arriba de HER3, un compañero de unión de HER3 y/o una molécula efectora aguas abajo que se modula a través de HER3. Los ejemplos de componentes de la ruta de señalización de HER3 incluyen, pero sin limitación, herregulina, HER1/ErbB1, HER2/ ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4, AKT (por ejemplo, AKT1, AKT2, AKT3), MEK (MAP2K1), ERK2 (MAPK1), ERK1 (MAPK3), PI3K (por ejemplo, PIK3CA (p110), PIK3R1 (p85)), PDK1, PDK2, PTEN, SGK3, 4E-BP1, P70S6K (por ejemplo, la variante alfa I de corte y empalme), proteínas tirosina fosfatasas (por ejemplo, PTP1B, PTPN13, BDP1, etc.), dímeros de HER2 (por ejemplo, p95HER2/HER3, p95HER2/HER2, HER2/HER2, HER2/HER3, HER1/HER2, HER2/HER3, HER2/HER4, etc.), GSK-3, PIP2, PIP3, p27, y sus combinaciones.
La expresión “adaptación de tumor” incluye un proceso en el que las células de un tumor se exponen a terapia contra el cáncer y activan rutas de señalización asociadas con, o adyacentes a, la ruta de señalización a la que dirige directamente el agente terapéutico. Las células tumorales activan rutas de señalización asociadas/adyacentes como un mecanismo para compensar el bloqueo o la inhibición como consecuencia de la terapia dirigida.
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La expresión “estado de activación” incluye una molécula de transducción de señal particular tal como un componente de la ruta de señalización de HER2 en su forma activada. De manera similar, la expresión “nivel de activación” se refiere al grado al cual está activada una molécula de transducción de señal particular, tal como un componente de la ruta de señalización de HER2. Generalmente, el estado de activación corresponde al estado de fosforilación, ubiquitinación y/o formación de complejos, de una o más moléculas de transducción de señales. Los ejemplos no limitantes de estados de activación (indicados entre paréntesis) incluyen: EGFR (EGFRvIII, (p-) EGFR fosforilado, EGFR:Shc, (u-) EGFR ubiquitinado, p-EGFRvIII); ErbB2 (p-ErbB2, p95HER2 (ErbB2 truncada), pp95HER2, ErbB2:Shc, ErbB2:PI3K, ErbB2:EGFR, ErbB2:ErbB3, ErbB2:ErbB4); ErbB3 (p-ErbB3, ErbB3:PI3K, pErbB3:PI3K, ErbB3:Shc); ErbB4 (p-ErbB4, ErbB4:Shc); c-MET (p-c-MET); AKT1 (p-AKT1); AKT2 (p-AKT2); AKT3 (p-AKT3); PTEN (p-PTEN); P70S6K (p-P70S6K); MEK (p-MEK); ERK1 (p-ERK1); ERK2 (p-ERK2); PDK1 (p-PDK1); PDK2 (p-PDK2); SGK3 (p-SGK3); 4E-BP1 (p-4E-BP1); PIK3R1 (p-PIK3R1); c-KIT (p-c-KIT); ER (p-ER); IGF-1R (pIGF-1R, IGF-1R:IRS, IRS:PI3K, p-IRS, IGF-1R:PI3K); INSR (p-INSR); FLT3 (p-FLT3); HGFR1 (p-HGFR1); HGFR2 (p-HGFR2); RET (p-RET); PDGFRA (p-PDGFRA); PDGFRB (p-PDGFRB); VEGFR1 (p-VEGFR1, VEGFR1:PLC, VEGFRI:Src); VEGFR2 (p-VEGFR2, VEGFR2:PLC, VEGFR2:Src, VEGFR2:heparín sulfato, VEGFR2:VEcadherina); VEGFR3 (p-VEGFR3); FGFR1 (p-FGFR1); FGFR2 (p-FGFR2); FGFR3 (p-FGFR3); FGFR4 (p-FGFR4); TIE1 (p-TIE1); TIE2 (p-TIE2); EPHA (p-EPHA); EPHB (p-EPHB); GSK-3 (p-GSK-3); NFKB (p-NFKB), IKB (p-IKB, p-P65:IKB); BAD (p-BAD, BAD:14-3-3); mTOR (p-mTOR); Rsk-1 (p-Rsk-1); Jnk (p-Jnk); P38 (p-P38); STAT3 (p-STAT3); Fak (p-Fak); Rb (p-Rb); Ki67; p53 (p-p53); CREB (p-CREB); c-Jun (p-c-Jun); c-Src (p-c-Src); y paxilina (ppaxilina).
De la manera en la que se usa en el presente documento, la expresión “serie de dilución” pretende incluir una serie de concentraciones descendientes de una muestra particular (por ejemplo, un lisado celular) o reactivo (por ejemplo, un anticuerpo). Una serie de dilución se produce generalmente mediante un proceso de mezcla de una cantidad medida de una concentración de partida de una muestra o reactivo, con un diluyente (por ejemplo, un tampón de dilución) para crear una concentración más baja de la muestra o reactivo, y repetir el proceso un número de veces suficiente hasta obtener el número de diluciones en serie deseado. La muestra o el reactivo puede diluirse en serie al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 500, o 1000 veces para producir una serie de dilución que comprenda al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 concentraciones descendientes de la muestra o reactivo. Por ejemplo, una serie de dilución que comprenda una dilución en serie de factor 2 de un reactivo de anticuerpo de captura a una concentración de partida de 1 mg/ml puede producirse mezclando una cantidad de la concentración de partida del anticuerpo de captura con una misma cantidad de un tampón de dilución para crear una concentración de 0,5 mg/ml del anticuerpo de captura, y repetir el proceso para obtener concentraciones del anticuerpo de captura de 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,0625 mg/ml, 0,0325 mg/ml, etc.
La expresión “intervalo dinámico superior”, de la manera en la que se usa en el presente documento, incluye la capacidad de un ensayo para detectar un analito específico en tan solo una célula o hasta en miles de células. Por ejemplo, los inmunoensayos descritos en el presente documento poseen un rango dinámico superior porque de manera ventajosa detectan una molécula de transducción de señal particular de interés en aproximadamente 1
10.000 células (por ejemplo, en aproximadamente 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000, 7500,
o 10.000 células) utilizando una serie de dilución de concentraciones del anticuerpo de captura.
De la manera en la que se usa en el presente documento, la expresión “células circulantes” comprende células extratumorales que se han metastatizado o micrometastatizado de un tumor sólido. Como ejemplos de células circulantes se incluyen, si limitación, células tumorales circulantes, células madre cancerosas y/o células que migran al tumor (por ejemplo, células progenitoras endoteliales circulantes, células endoteliales circulantes, células mieloides proangiogénicas circulantes, células dendríticas circulantes, etc.). Pueden obtenerse muestras de pacientes que contengan células circulantes de cualquier fluido biológico accesible (por ejemplo, sangre entera, suero, plasma, esputo, fluido de lavado bronquial, orina, aspirado de pezón, linfa, saliva, aspirado con aguja fina, etc.). En determinados casos, la muestra de sangre entera está separada en una fracción de plasma o suero y una fracción celular (por ejemplo, un sedimento celular). La fracción celular generalmente contiene eritrocitos, leucocitos y/o células circulantes de tumor sólido tales como células tumorales circulantes (CTC), células endoteliales circulantes (CEC), células progenitoras endoteliales circulantes (CPEC), células madre cancerosas (CMC), células tumorales diseminadas de nódulo linfático y combinaciones de los mismos. La fracción de plasma o suero normalmente contiene, entre otras cosas, ácidos nucleicos (por ejemplo ADN, ARN) y proteínas que liberan las células circulantes de un tumor sólido.
Las células circulantes se aíslan generalmente de una muestra de un paciente utilizando uno o más métodos de separación entre los que se incluyen, por ejemplo, separación inmunomagnética (véase, por ejemplo, Racila et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 4589-4594 (1998); Bilkenroth et al., Int. J. Cancer, 92: 577-582 (2001)), the CellTracks® System by Immunicon (Huntingdon Valley, PA), separación de microfluidos (véase, por ejemplo, Mohamed et al., IEEE Trans. Nanobiosci., 3: 251-256 (2004); Lin et al., Abstract No. 5147, 97th AACR Annual Meeting, Washington, D. C. (2006)), FACS (véase, por ejemplo, Mancuso et al., Blood, 97: 3658-3661 (2001)), centrifugación en gradiente de densidad (véase, por ejemplo, Baker et al., Clin. Cancer Res., 13: 4865-4871 (2003)), y métodos de empobrecimiento (véase, por ejemplo, Meye et al., Int. J. Oncol, 21: 521-530 (2002)).
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o más moléculas de transducción de señal. Se desvela, usando anticuerpos dependientes de un estado de activación se detecta la fosforilación de elementos de la familia EGFR de receptores tirosina quinasa y/o la formación de complejos heterodiméricos entre elementos de la familia EGFR. Se desvela que los anticuerpos dependientes de un estado de activación son útiles para detectar uno o más sitios de fosforilación en una o más de las siguientes moléculas de transducción de señal (sitios de fosforilación que corresponden a la posición del aminoácido en la secuencia de proteína humana): EGFR/HER1/ErbB1 (por ejemplo, tirosina (Y) 1068); ErbB2/HER2 (por ejemplo, Y1248); ErbB3/HER3 (por ejemplo, Y1289); ErbB4/HER4 (por ejemplo, Y1284); SGK3 (por ejemplo, treonina (T) 256 y/o serina (S) 422); 4E-BP1 (por ejemplo, T70); ERK1 (por ejemplo, T202 y/o Y204); ERK2 (por ejemplo, T202); MEK (por ejemplo, S217 y/o S221); PIK3R1 (por ejemplo, Y688); PDK1 (por ejemplo, S241); P70S6K (por ejemplo, T229, T389, y/o S421); c-MET (por ejemplo, Y1349); PTEN (por ejemplo, S380); AKT1 (por ejemplo, S473 y/o T308); AKT2 (por ejemplo, S474 y/o T309); AKT3 (por ejemplo, S472 y/o T305); GSK-3 (por ejemplo, S9); NFKB (por ejemplo, S536); IKB (por ejemplo, S32); BAD (por ejemplo, S112 y/o S136); mTOR (por ejemplo, S2448); Rsk-1 (por ejemplo, T357 y/o S363); Jnk (por ejemplo, T183 y/o Y185); P38 (por ejemplo, T180 y/o Y182); STAT3 (por ejemplo, Y705 y/o S727); FAK (por ejemplo, Y576); Rb (por ejemplo, S249, T252, y/o S780); p53 (por ejemplo, S392 y/o S20); CREB (por ejemplo, S133); c-Jun (por ejemplo, S63); c-Src (por ejemplo, Y416); y paxilina (por ejemplo, Y118).
La expresión “anticuerpo independiente de un estado de activación” incluye un anticuerpo de detección que es específico de (es decir, se une a, está unido por, o forma un complejo con) uno o más analitos de interés en una muestra sin importar su estado de activación. Por ejemplo, el anticuerpo independiente de un estado de activación puede detectar formas tanto fosforiladas como no fosforiladas de uno o más analitos, tales como una o más moléculas de traducción de señal.
III. Descripción
Se desvelan composiciones y métodos para detectar el estado (por ejemplo, los niveles de expresión y/o de activación) de los componentes de las rutas de transducción de señal en células tumorales procedentes de tejido tumoral o de células circulantes de un tumor sólido con un ensayo de proximidad específico, multicomplejo, de alto rendimiento, como se describe en el presente documento.
Se desvela un método para detectar y/o cuantificar la dimerización de al menos dos receptores tirosina quinasa (RTK). Se desvela un método para medir (por ejemplo, detectar y o cuantificar) el nivel del complejo de PI3K que comprende un dímero de RTK, una subunidad reguladora p85 de PI3K, y una subunidad catalítica p110 de PI3K.
La subunidad reguladora p85 de PI3K comprende una cualquiera de las cinco variantes, denominadas p85α (SEC ID Nº: 1), p85β (SEC ID Nº: 2), p55 (SEC ID Nº: 3), p150 (SEC ID Nº: 4), y p101 (SEC ID Nº: 5). La subunidad p110 de PI3K comprende una cualquiera de las variantes denominadas p110α (SEC ID Nº: 6), 110 (SEC ID Nº: 7), p110 (SEC ID Nº: 8), y p110 (SEC ID Nº: 9).
Se desvela un método para medir (por ejemplo, detectar y cuantificar) el nivel de PI3K activada en células tumorales
o en células circulantes de un tumor sólido. Se desvelan métodos para monitorizar la formación de complejos de PI3K, la activación de PI3K (por ejemplo, fosforilación), la activación de proteínas aguas abajo (por ejemplo, proteínas quinasa, adaptadoras, efectoras) de la ruta PI3K y otros transductores de señal de rutas asociadas con la ruta de PI3K.
Se desvelan composiciones y métodos para determinar o predecir la respuesta de un tumor de un paciente a una terapia contra el cáncer (por ejemplo, compuestos que modulan RTK y PI3K, o combinaciones de los mismos). En algunos casos, los métodos se usan para predecir el beneficio clínico de la terapia con un inhibidor de PI3K o con una combinación de inhibidores de PI3K. Por ejemplo, la medición de niveles elevados de activación de PI3K o componentes activados en la ruta de señalización de PI3K en las células tumorales de un paciente utilizando los métodos descritos en el presente documento, predice que el paciente puede beneficiarse clínicamente de la terapia con el inhibidor de PI3K o de la terapia con la combinación de PI3K. Se desvelan composiciones y métodos para seleccionar tratamientos apropiados para regular negativamente o desconectar una o más rutas de transducción de señal mal reguladas. Por tanto, para facilitar el diseño de terapias personalizadas basándose en la firma molecular particular proporcionada por el conjunto de proteínas de transducción de señal total y activada, en un tumor de un paciente determinado, pueden usarse determinados métodos.
Se desvelan métodos de medición (por ejemplo, detección y cuantificación) del nivel de expresión y/o del grado de activación (por ejemplo, fosforilación) de PI3K y de las RTK, de sus sustratos, y/o de otras moléculas de transducción de señal en una muestra tumoral de un paciente reincidente con terapia contra el cáncer. Como tal, la presente divulgación proporciona, de manera ventajosa, beneficios a pacientes con tumores sólidos, tales como cáncer de mama, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer gástrico, cáncer pancreático y cáncer colorrectal, que reciben una o más terapias dirigidas, explorándolos y monitorizándolos durante el transcurso de la terapia y evaluando si deben cambiarse a una terapia dirigida alternativa o a una terapia de combinación. Se desvelan métodos para determinar si un cáncer o un tumor se han adaptado a una terapia existente contra el cáncer. En determinados casos, la adaptación del tumor a la terapia produce la activación de rutas de señalización
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compensatorias que puede detectarse usando los métodos desvelados. En otros casos, la determinación de la adaptación del tumor en un paciente indica que el tratamiento del paciente debe cambiarse a una terapia dirigida alternativa o a una terapia de combinación.
Se desvelan métodos para seleccionar un tratamiento farmacológico contra el cáncer para un paciente con un cáncer de tumor sólido, comparando la detección y/o cuantificación de la dimerización de RTK y/o la formación de complejos de PI3K en las muestras tumorales, bien en presencia o en ausencia de un fármaco contra el cáncer. Ventajosamente las composiciones y los métodos pueden identificar pacientes que son resistentes a terapias contra el cáncer debido a mutaciones en la proteína quinasa diana, a resistencia adquirida a un agente terapéutico, a adaptación a la terapia mediante moléculas de transducción de señal, al no cumplimiento con el régimen terapéutico y/o a la administración de una dosis de fármaco subóptima.
En determinados aspectos, los métodos descritos en el presente documento controlan y siguen la adaptación del cáncer o del tumor a una terapia existente contra el cáncer. En determinados casos, el seguimiento y el control de activación de perfiles de rutas usando técnicas CEER, pueden determinar si hay una compensación de la ruta para la terapia existente, por ejemplo, mediante derivación de la activación y/o expresión a una ruta asociada. Estas técnicas permiten evaluar la eficacia de la terapia. Si la activación de la ruta original está desconectada o disminuida, es importante indagar acerca de las rutas asociadas para determinar si hay una compensación de ruta en otra ruta. En estos casos, puede recomendarse un régimen de terapia de combinación, o intercambiar terapias del todo. Por ejemplo, como se ilustra en los Ejemplos 3, 4 y 6 descritos en el presente documento, se utilizan métodos para controlar niveles de PI3K, HER1, HER2, HER3, IGF-1R, AKT y/o ERK activadas en células tumorales de pacientes que reincidieron con terapia contra el cáncer. En estos tumores de pacientes, las rutas de señalización compensatorias no están directamente dirigidas por la terapia cuando se activan (véanse las FIGS 14-17 y 25). Ventajosamente, utilizando los métodos del presente documento, los análisis del perfilado de rutas indican que los pacientes pueden beneficiarse clínicamente de la terapia inhibidora de PI3K o de la terapia de combinación con el inhibidor de PI3K.
Los análisis de expresión de proteínas dianas o mutación genética solo tienen limitaciones para seleccionar el régimen de terapia apropiado con una eficacia clínica máxima para un sujeto con cáncer o que se sospecha que tiene cáncer. El perfilado exhaustivo de la dimerización de RTK y la formación de complejos de PI3K proporcionan información reveladora sobre la eficacia de agentes específicos contra el cáncer sobre sus proteínas diana a las que se dirigen. Los métodos de la presente invención también proporcionan información valiosa con respecto a posibles mecanismos de resistencia a fármacos, tales como activación de rutas compensatorias y proporcionan una guía para tratamientos terapéuticos eficaces y regímenes para pacientes con cáncer.
IV. Señalización de PI3K y cáncer
El estado de activación de la ruta de PI3K y/o de las rutas de RTK (por ejemplo, las rutas de HER1, HER2, HER3, HER4, cMET e IGF-1R) puede medirse cuantitativamente en células tumorales procedentes de un paciente con cáncer de tumor sólido, tal como cáncer de mama, colorrectal, gástrico, de pulmón o pancreático. Se desvela un método para la cuantificación simultánea del nivel de activación de numerosas proteínas de la ruta de PI3K en una muestra tumoral.
Se ha descubierto que las fosfoinositida 3-quinasas (PI3K) desempeñan funciones clave en muchos procesos celulares, incluyendo supervivencia, proliferación, diferenciación, metabolismo y motilidad celular. Como efectoras principales aguas abajo de receptores tirosina quinasa (RTK) y de receptores acoplados a proteína G, las PI3K transducen señales desde diversos factores de crecimiento y citocinas en mensajes intracelulares generando fosfolípidos, que, a su vez, activan la serina/treonina quinasa AKT y otras rutas efectoras. Como ejemplos de otras proteínas efectoras aguas abajo, se incluyen, sin limitación, RAC1, SGK, PKC, Mdm2, FKHR, NF-κB, BAD, MEK, PTEN, GSK3β, mTOR y S6K.
Cuando las PI3K se activan mediante estimulación de factores de crecimiento a través de los RTK (por ejemplo, HER1, HER2, HER3 y HER4), la subunidad p85 de PI3K se une directamente a los restos de fosfotirosina en los RTK y/o en proteínas adaptadoras. Esta unión libera la inhibición intermolecular de la subunidad p110 de PI3K mediante p85 y localiza a PI3K en la membrana plasmática de la célula. Allí, la PI3K cataliza la fosforilación de PIP2 a PIP3 que después facilita la fosforilación de AKT. La AKT activada fosforila muchas otras proteínas en rutas asociadas/adyacentes que inician procesos que permiten la supervivencia, la supresión de la apoptosis y el control del ciclo celular.
Además de la complejidad de la ruta PI3K, existen abundantes interferencias con otros circuitos de señalización celular. Estos circuitos de señalización asociados o adyacente incluyen, pero sin limitación, las rutas mTOR, p53, RAS y MAPK. La expresión y/o activación aberrante de los componentes de la ruta PI3K, así como de las rutas de la familia de ErbB, se ha notificado en diversos tumores humanos, incluyendo cáncer de mama, de ovario, cáncer gástrico, de pulmón y colorrectal. Se desvela que los métodos se utilizan para detectar, en un extracto celular de células tumorales, tales como de células de cáncer de mama, de pulmón, de cáncer pancreático, gástrico, colorrectal u otras células cancerosas, la presencia de dimerización, el nivel de expresión y/o el estado de activación de una o
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La cantidad de señal amplificada puede ser correlativa a la cantidad de receptor tirosina quinasa dimerizado.
Los anticuerpos de captura y los anticuerpos de detección se seleccionan preferentemente para minimizar la competición entre ellos con respecto a la unión al analito (es decir, ambos anticuerpos de captura y selección pueden unirse simultáneamente a sus moléculas de transducción de señal correspondientes).
Se desvelan diversos grupos funcionales facilitadores. Un grupo funcional facilitador adecuado incluye cualquier molécula que pueda generar un agente oxidante que se canalice hacia (es decir, se dirija a) y reaccione con (es decir, se una a, esté unido por, o forme un complejo con) otra molécula en proximidad (es decir, espacialmente cerca o próxima) al grupo funcional facilitador. Como ejemplos de grupos funcionales facilitadores se incluyen, sin limitación, enzimas tales como glucosa oxidasa o cualquier otra enzima que catalice una reacción de oxidación/reducción que implique oxígeno molecular (O2) como el aceptor de electrones y fotosensibilizadores, tales como, azul de metileno, rosa de Bengala, porfirinas, colorantes de escualano, ftalocianinas y similares. Los ejemplos no limitantes de agentes oxidantes incluyen peróxido de hidrógeno (H2O2), un oxígeno singlete, o cualquier otro compuesto que transfiera átomos de oxígeno o gane electrones en una reacción de oxidación/reducción. Preferentemente, en presencia de un sustrato adecuado (por ejemplo, glucosa, luz, etc.), el grupo funcional facilitador (por ejemplo, glucosa oxidasa, fotosensibilizador, etc.) genera un agente oxidante (por ejemplo, peróxido de hidrógeno (H2O2), un oxígeno singlete, etc.) que se canalice hacia, y reaccione con, el primer elemento del par de amplificación de señal (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (HRP), hapteno protegido por un grupo protector, una enzima inactivada por enlace tioéter con un inhibidor enzimático, etc.) cuando los dos grupos funcionales están próximos entre sí.
Los elementos de pares de amplificación de señal adecuados incluyen, pero sin limitación, peroxidasas, tales como peroxidasa de rábano picante (HRP), catalasa, cloroperoxidasa, citocromo c peroxidasa, peroxidasa eosinófila, glutatión peroxidasa, lactoperoxidasa, mieloperoxidasa, peroxidasa de tiroides, desyodinasa, y similares. Otros ejemplos de elementos de pares de amplificación de señal incluyen haptenos protegidos con un grupo protector y enzimas inactivadas por enlace tioéter con un inhibidor enzimático.
En un ejemplo de canalización de proximidad, el grupo funcional facilitador es glucosa oxidasa (GO) y el primer elemento del par de amplificación de señal es peroxidasa de rábano picante (HRP). Cuando la GO se pone en contacto con un sustrato, tal como glucosa, se genera un agente oxidante (por ejemplo, peróxido de hidrógeno (H2O2)). Si la HRP está en la canalización de proximidad a la GO, el H2O2 generado por la GO se canaliza hacia, y forma complejos con, la HRP para formar un complejo HRP-H2O2, que, en presencia del segundo elemento del par de amplificación de señal (por ejemplo, un sustrato quimioluminiscente tal como luminol o isoluminol o un sustrato fluorogénico tal como tiramida (por ejemplo, biotina-tiramida), ácido homovanílico o ácido 4-hidroxifenilacético), genera una señal amplificada. Cuando se utiliza biotina-tiramida como el segundo elemento del par de amplificación de señal, el complejo HRP-H2O2 oxida la tiramida para generar un radical de tiramida reactivo que une covalentemente restos nucleófilos adyacentes. La tiramida activada se detecta directamente o después de la adición de un reactivo de detección de señal, tal como, por ejemplo, un fluoróforo marcado con estreptavidina o una combinación de una peroxidasa marcada con estreptavidina y un reactivo cromogénico. Los ejemplos de fluoróforos incluyen, pero sin limitación, un colorante Alexa Fluor® (por ejemplo, Alexa Fluor® 555), fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), Oregon Green™; rodamina, rojo Texas, isotiocianato de tetrarrodamina (TRITC), un flúor CyDye™ (por ejemplo, Cy2, Cy3, Cy5) y similar. El marcador de estreptavidina puede acoplarse directa o indirectamente al fluoróforo o a la peroxidasa usando métodos bien conocidos en la técnica. Como ejemplos no limitantes de reactivos cromogénicos se incluyen 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina (TMB), 3,3’-diaminobencidina (DAB), 2,2’-acino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico) (ABTS), 4-cloro-1-naftol (4CN), y/o porfirógeno.
En otro ejemplo de canalización por proximidad, el grupo funcional facilitador es un fotosensibilizador y el primer elemento del par de amplificación de señal es una molécula grande marcada con haptenos múltiples que están protegidos con grupos protectores que impiden la unión de los haptenos con un compañero de unión específico (por ejemplo, ligando, anticuerpo, etc.). Por ejemplo, el elemento del par de amplificación de señal puede ser una molécula de dextrano marcada con moléculas de biotina, coumarina y/o fluoresceína protegidas. Como grupos protectores adecuados se incluyen, pero sin limitación, grupos fenoxi-, analino-, olefin-, tioéter-y selenoéter. En la Patente de Estados Unidos Nº 5.807.675 se describen fotosensibilizadores y moléculas marcadas con haptenos protegidos, adicionales, adecuados para su uso en el ensayo de proximidad. Cuando el fotosensibilizador se excita con luz, genera un agente oxidante (es decir, un oxígeno singlete). Si las moléculas de hapteno están en la proximidad de canalización al fotosensibilizador, el oxígeno singlete generado por el fotosensibilizador se canaliza hacia, y reacciona con, tioéteres en los grupos protectores de los haptenos para dar lugar a grupos carbonilo (cetonas o aldehídos) y a ácido sulfínico, liberando los grupos protectores de los haptenos. Los haptenos desprotegidos se encuentran después disponibles para unirse específicamente con el segundo elemento del par de amplificación de señal (por ejemplo, un compañero de unión específico que puede generar una señal detectable). Por ejemplo, cuando el hapteno es biotina, el compañero de unión específico puede ser una estreptavidina marcada con enzimas. Las enzimas ejemplares incluyen fosfatasa alcalina, -galactosidasa, HRP, etc. Después de lavar para retirar los reactivos no unidos, la señal detectable puede generarse añadiendo un sustrato detectable (por ejemplo, fluorescente, quimioluminiscente, cromogénico, etc.) de la enzima y detectarse usando cualquiera de los métodos e instrumentación adecuados conocidos en la materia. Como alternativa, la señal detectable puede amplificarse
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usando amplificación de señal con tiramida y la tiramida activada puede detectarse bien directamente o detectarse después de la adición de un reactivo detector de señales, como se ha descrito anteriormente.
En otro ejemplo más de canalización por proximidad, el grupo funcional facilitador es un fotosensibilizador y el primer elemento del par de amplificación de señal es un complejo enzima-inhibidor. La enzima y el inhibidor (por ejemplo, dextrano marcado con ácido fosfónico), se unen entre sí mediante un enlazador escindible (por ejemplo tioéter). Cuando el fotosensibilizador se excita con luz, genera un agente oxidante (es decir, oxígeno singlete). Si el complejo enzima-inhibidor está dentro de la proximidad de canalización al fotosensibilizador, el oxígeno singlete generado por el fotosensibilizador se canaliza hacia, y reacciona con, el enlazador escindible, liberando al inhibidor de la enzima, activando de este modo a la enzima. Para generar una señal detectable se añade un sustrato enzimático, o como alternativa, para generar una señal amplificada, se añade un reactivo de amplificación,
En un ejemplo adicional de canalización por proximidad, el grupo funcional facilitador es HRP, el primer elemento del par de amplificación de señal es un hapteno protegido o un complejo enzima-inhibidor como se ha descrito anteriormente y los grupos protectores comprenden p-alcoxi fenol. La adición de fenilendiamina y H2O2 genera una fenilendiimina reactiva que se canaliza hacia el hapteno protegido o al complejo enzima-inhibidor y reacciona con los grupos protectores de p-alcoxi fenol para producir haptenos expuestos o una enzima reactiva. La señal amplificada se genera y se detecta como se ha descrito anteriormente (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nos 5.532.138 y 5.445.944).
El extracto celular puede comprender un extracto de células aislado de una muestra. En determinados casos, la muestra se selecciona de sangre entera, suero, plasma, aspirado con aguja fina (AAF), orina, esputo, fluido de lavado bronquial, lágrimas, aspirado de pezón, linfa, saliva y combinaciones de los mismos. La muestra puede obtenerse de un paciente que tenga cáncer de tumor sólido. Los ejemplos de dichos cánceres incluyen, sin limitación, cáncer de mama, cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinoma de pulmón no microcítico), cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer colorrectal y combinaciones de los mismos.
En algunos casos, el extracto celular se aísla de un paciente con cáncer después de recibir terapia farmacológica contra el cáncer. En determinados casos, las células aisladas se ponen en contacto con un fármaco contra el cáncer
o con una combinación de fármacos contra el cáncer. En algunos casos, un fármaco contra el cáncer incluye un compuesto inhibidor de PI3K o modulador RTK, tal como HER1, HER2, HER3, cMET o inhibidor de IGF-1R). En otros casos, las células aisladas se incuban con un fármaco contra el cáncer o con una combinación de fármacos contra el cáncer antes de la estimulación del factor de crecimiento. En otros casos adicionales, se produce la lisis de células aisladas después de la estimulación del factor de crecimiento, para producir el extracto celular.
Los métodos pueden ser particularmente útiles para determinar la activación (por ejemplo fosforilación) de RTK, de una o más RTK oncogénicas (por ejemplo HER1, HER2, HER3, p95HER2, cMET e IGF-1R) en pacientes que están en riesgo de desarrollar, que se sospecha que tienen, o a los que se les ha diagnosticado, un cáncer de tumor sólido, tal como cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de pulmón o pancreático. En determinados casos, los métodos pueden ayudar, dar asistencia, o facilitar, a realizar el diagnóstico y el pronóstico de un cáncer en un sujeto, midiendo los RTK activadas (por ejemplo, fosforiladas) (por ejemplo, niveles de fosfo-HER2) para determinar si el sujeto expresa una forma activada de una o más de la familia de proteínas de RTK (por ejemplo, un paciente positivo a HER2). Los métodos pueden realizarse en un sujeto en el que ya se ha determinado que expresa una o más proteínas oncogénicas, para optimizar la terapia, reducir la toxicidad, monitorizar la eficacia del tratamiento terapéutico y/o detectar una no sensibilidad adaptativa a la terapia.
Los métodos pueden comprender adicionalmente determinar el estado de activación de una o más proteínas efectoras y adaptadoras de la ruta RTK, y/o una ruta asociada o compensatoria. En algunos casos, la ruta asociada
- o compensatoria está mal regulada después de la adaptación del tumor a la terapia contra el cáncer.
- B.
- Ensayos de detección para un complejo PI3K
Se sabe por ejemplo, que la activación de HER3 da como resultado la activación de PI3K. Sin embargo, sorprendentemente ahora se ha descubierto que, en determinados casos y en determinadas condiciones, la fosforilación de HER3 y la fosforilación de PI3K se producen de manera simultánea. Usando los ensayos descritos en el presente documento, es posible detectar y cuantificar la cantidad del complejo DE PI3K y la cantidad de activación y/o fosforilación de un complejo DE PI3K. El complejo DE PI3K comprende i) un par receptor tirosina quinasa dimerizado; ii) una subunidad p85 y una subunidad p110 (por ejemplo α o β) de PI3K. El ensayo comprende tres anticuerpos: (1) un anticuerpo de captura específico para la subunidad p85 o la una subunidad p110 de PI3K;
- (2)
- un primer anticuerpo de detección específico de un primer elemento del par de dímeros, o la subunidad PI3K, en el que el primer anticuerpo de detección es específico de un dominio diferente al del anticuerpo de captura y en el que la subunidad PI3K puede estar activada; y (3) un segundo anticuerpo de detección específico de un segundo elemento del par de dímeros o una subunidad de PI3K.
La FIG. 2 muestra un complejo de PI3K, 210, detectable mediante los métodos y ensayos descritos en el presente documento. En esta figura, (1) la subunidad p85 de PI3K, 212, está unida por el anticuerpo de captura, 220; (2) un
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Además, numerosas publicaciones han indicado el uso de la tecnología de presentación de fagos para producir y explorar bibliotecas de polipéptidos para la unión a un antígeno diana seleccionado (véase, por ejemplo, Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378-6382 (1990); Devlin et al., Science, 249: 404-406 (1990); Scott et al., Science, 249: 386-388 (1990); y Ladner et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.571.698). Un concepto básico de los métodos de presentación de fagos es el establecimiento de una asociación física entre un polipéptido codificado por el ADN del fago y un antígeno diana. Esta asociación física la proporciona la partícula de fago, que presenta un polipéptido como parte de una cápside que encierra el genoma del fago que codifica el polipéptido. El establecimiento de una asociación física entre los polipéptidos y su material genético permite explorar en masa, de manera simultánea, inmensas cantidades de fagos portadores de diferentes polipéptidos. El fago presenta un polipéptido con afinidad por un antígeno diana que se une al antígeno diana y estos fagos se enriquecen por exploración de afinidad con el antígeno diana. La identidad de los polipéptidos presentados por estos fagos puede determinarse por sus genomas respectivos. Usando estos métodos, un polipéptido identificado como que tiene una afinidad de unión por un antígeno diana deseado, puede después sintetizarse en cantidades mediante medios convencionales (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.057.098).
Los anticuerpos generados mediante estos métodos pueden después seleccionarse explorando primero la afinidad y especificidad con el antígeno polipeptídico de interés purificado y, si se requiere, comparando los resultados con la afinidad y especificidad de los anticuerpos con otros antígenos polipeptídicos que se desean excluir de la unión. El procedimiento de exploración puede implicar la inmovilización de antígenos polipeptídicos purificados en pocillos distintos de placas de microtitulación. La solución que contiene un posible anticuerpo o un grupo de anticuerpos, se coloca después en los pocillos de microtitulación respectivos y se incuban durante aproximadamente 30 minutos a 2 horas. Después, los pocillos de microtitulación se lavan y a los pocillos se añade un anticuerpo secundario marcado (por ejemplo, un anticuerpo anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina, si los anticuerpos creados son anticuerpos de ratón) y se incuban durante aproximadamente 30 minutos y después se lavan. El sustrato se añade a los pocillos y, cuando el anticuerpo está presente en el antígeno polipeptídico inmovilizado, aparecerá una reacción de color.
Después, puede analizarse la afinidad y especificidad de los anticuerpos identificados de este modo. En el desarrollo de inmunoensayos para una proteína diana, la proteína diana purificada actúa como un patrón con el cual se evalúa la sensibilidad y especificidad del inmunoensayo usando los anticuerpos que se han seleccionado. Dado que la afinidad de unión de diversos anticuerpos puede variar, por ejemplo, determinadas concentraciones de anticuerpos pueden interferir con las de otras desde el punto de vista del efecto estérico, el rendimiento del ensayo de un anticuerpo puede ser una medida más importante que la afinidad y especificidad absolutas de ese anticuerpo.
Los expertos en la técnica reconocerán que, para producir anticuerpos o fragmentos de unión y para la exploración y selección de afinidad y especificidad de los diversos polipéptidos de interés, pueden llevarse a cabo muchas estrategias.
1. Anticuerpos policlonales
Los anticuerpos policlonales se suscitan preferentemente en animales mediante inyecciones múltiples subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) de un polipéptido de interés y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el polipéptido de interés con una proteína transportadora que sea inmunogénica en la especie que se va a inmunizar, tal como, por ejemplo, hemocianina de lapa americana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, inhibidor de tripsina de semilla de soja, usando un agente bifuncional o derivatizante. Como ejemplos no limitantes de agentes bifuncionales o derivatizantes se incluyen ester de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de restos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (conjugación a través de restos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl2 y R1N=C=NR, en la que R y R1 son grupos alquilo diferentes.
Los animales se inmunizan contra el polipéptido de interés o contra un conjugado inmunogénico o un derivado de los mismos, combinando, por ejemplo, 100 g (para conejos) o 5 g (para ratones) del antígeno o conjugado con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después, los animales reciben un refuerzo con aproximadamente 1/5 o 1/10 la cantidad original del polipéptido
o conjugado en adyuvante incompleto de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. Después de siete a catorce días, se extrae sangre de los animales y el suero se somete a ensayo con respecto a la titulación del anticuerpo. Generalmente los animales reciben un refuerzo hasta el nivel de titulación. Preferentemente, el animal recibe un refuerzo con el conjugado del mismo polipéptido, pero también puede usarse la conjugación con una proteína inmunogénica diferente y/o a través de un reactivo de entrecruzamiento diferente. También pueden prepararse conjugados en cultivo de células recombinantes como proteínas de fusión. En determinados casos, pueden usarse agentes agregantes, tales como alumbre, para potenciar la respuesta inmunitaria.
2. Anticuerpos monoclonales
Generalmente, los anticuerpos monoclonales se obtienen de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pudiesen estar presentes en cantidades minoritarias. Por tanto, el modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo como que no es una mezcla de anticuerpos distintos. Por ejemplo,
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