JP2012102043A - 単胞リポソームの製造方法、単胞リポソームの分散液とその乾燥粉末及びそれらの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】二段階乳化法を用いて製造する単胞リポソームの製造方法において、W1/O/W2エマルション形成後に、添加剤を添加することを特徴とする単胞リポソームの製造方法。
【選択図】なし
Description
(1)
二段階乳化法を用いて製造する単胞リポソームの製造方法において、W1/O/W2エマルション形成後に、添加剤を添加することを特徴とする単胞リポソームの製造方法。
前記添加剤は、乳化する機能を有する物質であることを特徴とする(1)に記載の単胞リポソームの製造方法。
前記添加剤は、タンパク質、多糖類、イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤の少なくとも1種を含有することを特徴とする(1)または(2)に記載の単胞リポソームの製造方法。
前記添加剤は、ゼラチン、アルブミン、デキストランまたはポリアルキレンオキサイド系化合物の少なくとも1種を含有することを特徴とする(1)〜(3)のいずれか一項に記載の単胞リポソームの製造方法。
前記添加剤を添加した後に、溶媒を除去することを特徴とする(1)〜(4)のいずれか一項に記載の単胞リポソームの製造方法。
前記W1/O/W2エマルション形成後、前記添加剤を添加する前に、溶媒を除去することを特徴とする(1)〜(4)のいずれか一項に記載の単胞リポソームの製造方法。
前記添加剤の添加後に、撹拌を行うことを特徴とする(1)〜(6)のいずれか一項に記載の単胞リポソームの製造方法。
前記添加剤は、W2の質量に対して0.2〜0.5%の質量比で添加することを特徴とする(1)〜(7)のいずれか一項に記載の単胞リポソームの製造方法。
前記二段階乳化法の二次乳化工程として撹拌乳化法を用いることを特徴とする(1)〜(8)にいずれか一項に記載の単胞リポソームの製造方法。
前記二段階乳化法の二次乳化工程としてSPG膜を用いた膜乳化を用いることを特徴とする(1)〜(9)のいずれか一項に記載の単胞リポソームの製造方法。
前記単胞リポソームに内包されるべき物質として、医療用の薬剤類を用いることを特徴とする(1)〜(10)のいずれか一項に記載の単胞リポソームの製造方法。
(1)〜(11)のいずれか一項に記載の単胞リポソームの製造方法を用いて製造することを特徴とする単胞リポソーム分散液の製造方法。
(12)に記載の単胞リポソーム分散液の製造方法により造られたことを特徴とする単胞リポソーム分散液。
ゼラチン、アルブミン、デキストランまたはポリアルキレンオキサイド系化合物の少なくとも1種を含有することを特徴とする(13)に記載の単胞リポソーム分散液。
(13)または(14)に記載の単胞リポソーム分散液を用いて造られたことを特徴とする単胞リポソームの乾燥粉末。
−製造原料−
・混合脂質成分(F1)・(F2)
一次乳化工程で後述する有機溶媒(O)に添加する混合脂質成分(F1)は主としてリポソームの脂質二重膜の内膜を構成し、場合によっては外膜の構成にも寄与する。一方、必要に応じて二次乳化工程で添加する混合脂質成分(F2)は主としてリポソームの外膜を構成する。混合脂質成分(F1)および(F2)は、同一の組成であっても、異なる組成であってもよい。
水性溶媒(W1)および(W2)ならびに有機溶媒(O)は、公知のリポソームの製造方法でも用いられるような、一般的なものを用いることができる。一次乳化工程で用いられる水性溶媒(W1)および有機溶媒(O)は、それぞれW1/Oエマルションの水相および油相をなし、(W1)は、W1/O/W2エマルションの内水相、二次乳化工程で用いられる水性溶媒(W2)は、W1/O/W2エマルションの外水相をなす。水性溶媒としては、たとえば純水に必要に応じて水と混合する他の溶媒、浸透圧調整のための塩類・糖類、pH調整のための緩衝液などを配合したものが挙げられる。有機溶媒としては、たとえばヘキサン(n−ヘキサン)やクロロホルム、シクロヘキサン、1,2−ジクロロエテン、ジクロロメタン、1,2−ジメトキシエタン、1,1,2−トリクロロエテン、t−ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ギ酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、メチルエチルケトン、ペンタンなどの非水溶性有機溶媒が挙げられる。また、アセトニトリル、メタノール、アセトン、エタノール、2−プロパノールなどの水溶性有機溶媒や、上記以外のエーテル、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、ハロゲン化エーテル、エステル類が挙げられる。なかでもクロロホルム、シクロヘキサン、ジクロロメタン、ヘキサン、t−ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ギ酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、メチルエチルケトン、ペンタン、アセトニトリル、メタノール、アセトン、エタノール、2−プロパノールなどが好ましい。溶媒除去工程を考慮すると有機溶媒は揮発性の化合物が好ましく、水よりも沸点の低い溶媒が好ましい。これらの溶媒は、いずれか1種単独で用いても、2種以上を組み合わせて用いても良い。例えば、得られるナノサイズのW1/Oエマルションの単分散性が良好なものとなることから、ヘキサンを主成分(50体積%以上)とする有機溶媒、好ましくはヘキサンが60体積%以上である有機溶媒である。
本発明において、リポソームに内包させる物質(薬剤類と総称する)は特に限定されるものではなく、リポソームの用途に応じて医薬品、化粧品、食品などの分野で知られている各種の物質を用いることができる。
・リポソームおよびその懸濁液
本発明の単胞リポソームは、典型的には以下に説明するような本発明の製造方法により、水性溶媒(W2:外水相)に懸濁した状態で得られる。このようなリポソームの懸濁液が各種の用途に供されるが、使用されるまでの間、たとえば凍結乾燥法などにより粉末状態のリポソームとして保存することもできる。使用の際には、粉末状態のリポソームを水性溶媒に添加し、再度懸濁させればよい。
−リポソームの製造方法−
本発明のリポソームの製造方法は、下記工程(1)〜(3)を有し、必要に応じてその他の工程を適宜組み合わせることができるものである。以下、図面を参照しながら各工程について説明する。
一次乳化工程は、有機溶媒(O)、水性溶媒(W1)、および混合脂質成分(F1)を乳化することにより、W1/Oエマルションを調製する工程である(図1(a)参照)。
二次乳化工程は、上記工程(1)により得られたW1/Oエマルションを用いて、W1/O/W2エマルションを形成する工程である(図1(b)参照)。
本発明の製造方法では、W1/O/W2エマルション形成後に添加剤を添加することを特徴としている。W1/O/W2エマルション形成後に添加剤を添加することにより、最終的に製造される単胞リポソーム粒径の均一性が向上する。具体的には、後述するリポソームの単分散性のCV値が30%以下である単胞リポソームである。
溶媒除去工程は、前記二次乳化工程により得られたW1/O/W2エマルションに含まれる有機溶媒相(O)を除去し、リポソームを形成させる工程である(図1(c)参照)。すなわち、W1/O/W2エマルションを回収し、開放容器内に移し静置あるいは撹拌することで、W1/O/W2エマルションに含まれる有機溶媒(O)を蒸発除去することができる。これにより、混合脂質膜成分(F1(および必要に応じて添加される(F2))からなる脂質膜を内水相の周囲に形成し、リポソームを得ることができる。
リポソームの分散液を凍結乾燥などにより乾燥粉末化し、使用するまでの間の保管に適した形態にすることも望ましい。凍結乾燥は従来のリポソームを製造する場合と同様の手段や装置を用いて行うことができる。たとえば、間接加熱凍結方法、冷媒直膨方法、熱媒循環方法、三重熱交換方法、重複冷凍方法などに従い、適切な条件下(温度:−120〜−20℃、圧力:1〜15Pa、時間:16〜26時間など)で凍結乾燥を行えばよい。このようにして得られた凍結乾燥物を水中に投入すれば、再びリポソームの分散液を調製することができる。
本発明において、単分散性(粒度分布)とは、粒径の標準偏差/平均粒径をいい、下記の測定方法で測定した値(CV値)をいう。具体的には次式により求められる値である。平均粒径は体積平均粒径のことである。
(一次乳化工程によるW1/Oエマルションの製造)
ホスファチジルコリン含量が95%である卵黄レシチン「COATSOME NC−50」(日油株式会社)0.3g、コレステロール(Chol)0.152gおよびオレイン酸(OA)0.108gを含むヘキサン15mlを有機溶媒相(O)とし、カルセイン(0.4mM)を含むトリス−塩酸緩衝液(pH8、50mmol/L)5mlを内水相用の水分散相(W1)とした。50mlのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径20mmのプローブをセットした超音波分散装置(UH−600S、株式会社エスエムテー)により、25℃にて15分間超音波を照射し(出力5.5)、乳化処理を行った。この一次乳化工程で得られたW1/Oエマルションは体積平均粒径約220nmの単分散W/Oエマルションであることが確認された。
続いて、上記一次乳化工程により得られたW1/Oエマルションを分散相とし、SPG膜乳化装置(SPGテクノ社製、商品名「外圧式マイクロキット」)を使用して、SPG膜を用いた膜乳化によるW1/O/W2エマルションの製造を行った。
W1/O/W2エマルション製造後、添加剤として精製ゼラチン(株式会社ニッピ,ニッピ ハイグレードゼラチンタイプAP)(W2の質量に対する質量比0.5%となるように添加)を、W1/O/W2エマルションに添加した。
次に、上記W1/O/W2エマルションを蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約20時間静置し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。
(一次乳化工程によるW1/Oエマルションの製造)
ホスファチジルコリン含量が95%である卵黄レシチン「COATSOME NC−50」(日油株式会社)1.08g、コレステロール(Chol)0.547gおよびオレイン酸(OA)0.389gを含むヘキサン54mlを有機溶媒相(O)とし、カルセイン(0.4mM)を含むトリス−塩酸緩衝液(pH8、50mmol/L)18mlを内水相用の水分散相(W1)とした。150mlの容器にこれらの混合液を入れ、直径25mmのプローブをセットしたホモミキサー(ULTRA TURRAX T25 basic、IKA社)により、25℃にて24000rpmで10分間、プレ分散処理を行った。その後、このプレ分散液を、卓上湿式微粒化装置NV−200−D(吉田機械株式会社)を用いて、150MPaで10パス処理した。
続いて、上記一次乳化工程により得られたW1/Oエマルションを分散相とし、SPG膜乳化装置(SPGテクノ社製、商品名「外圧式マイクロキット」)を使用して、SPG膜を用いた膜乳化によるW1/O/W2エマルションの製造を行った。
次に、上記W1/O/W2エマルションを蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約20時間静置し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られた。
得られたリポソーム粒子の懸濁液に、添加剤として精製ゼラチン(株式会社ニッピ,ニッピ ハイグレードゼラチンタイプAP)(W2の質量に対する質量比0.5%となるように添加)を添加し、添加剤添加後のリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。
実施例1において、添加剤を精製ゼラチンからプルロニックF−68(ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコール、数平均分子量9600、登録商標、非イオン界面活性剤プロノン(#188P,日油株式会社))(W2の質量に対する質量比0.02%となるように添加)に変更した以外は同様にして、製造を実施した。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。
実施例2において、添加剤を精製ゼラチンからプルロニックF−68(ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコール、数平均分子量9600、登録商標、非イオン界面活性剤プロノン(#188P,日油株式会社))(W2の質量に対する質量比0.02%となるように添加)に変更した以外は同様にして、製造を実施した。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。
実施例3において、二次乳化工程によるW1/O/W2エマルションの製造を、SPG膜を用いた膜乳化から撹拌乳化法に変更した以外は、実施例3と同様にして、製造を実施した。すなわち、撹拌乳化は、スターラーによりW2を強く撹拌しているところに、上記W1/Oエマルションを供給し、W1:W2が1:40となるようにW1/O/W2エマルションを製造した。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。
実施例4において、二次乳化工程によるW1/O/W2エマルションの製造を、SPG膜を用いた膜乳化から撹拌乳化法に変更した以外は、実施例4と同様にして、製造を実施した。すなわち、撹拌乳化は、スターラーによりW2を強く撹拌しているところに、上記W1/Oエマルションを供給し、W1:W2が1:40となるようにW1/O/W2エマルションを製造した。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。
実施例5において、一次乳化工程によるW1/Oエマルションの製造を、以下のように変更した以外は、実施例5と同様にして、製造を実施した。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはシタラビンが含まれていることが確認された。
ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)「COATSOME MC−6060」(日油株式会社)1.5g、およびジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)「COATSOME MG−6060LA」(日油株式会社)0.25gを含むヘキサン15mlを有機溶媒相(O)とし、シタラビン(80mM))を含むトリス−塩酸緩衝液(pH8、50mmol/L)5mlを内水相用の水分散相(W1)とした。50mlのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径20mmのプローブをセットした超音波分散装置(UH−600S、株式会社エスエムテー)により、25℃にて15分間超音波を照射し(出力5.5)、乳化処理を行った。
実施例6において、一次乳化工程によるW1/Oエマルションの製造を、以下のように変更し、添加剤の添加後にスターラーにより撹拌を行った以外は、実施例6と同様にして、製造を実施した。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはシタラビンが含まれていることが確認された。なお、添加剤の添加後に撹拌を行ったことから、実施例6に比較しリポソーム粒径の均一性がより早く向上した。
ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)「COATSOME MC−6060」(日油株式会社)5.4g、およびジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)「COATSOME MG−6060LA」(日油株式会社)0.9gを含むヘキサン54mlを有機溶媒相(O)とし、シタラビン(80mM))を含むトリス−塩酸緩衝液(pH8、50mmol/L)18mlを内水相用の水分散相(W1)とした。150mlの容器にこれらの混合液を入れ、直径25mmのプローブをセットしたホモミキサー(ULTRA TURRAX T25 basic、IKA社)により、25℃にて24000rpmで10分間、プレ分散処理を行った。その後、このプレ分散液を、卓上湿式微粒化装置NV−200−D(吉田機械株式会社)を用いて、150MPaで10パス処理した。
実施例1において、添加剤を精製ゼラチンからカルボキシデキストラン(W2の質量に対する質量比0.5%となるように添加)に変更した以外は実施例1と同様にして、製造を実施した。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。
実施例2において、添加剤を精製ゼラチンから「Tween 80」(東京化成工業株式会社,ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート,分子量1309.68)(W2の質量に対する質量比0.2%となるように添加)に変更した以外は実施例2と同様にして、製造を実施した。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。
(一次乳化工程によるW1/Oエマルションの製造)
ホスファチジルコリン含量が95%である卵黄レシチン「COATSOME NC−50」(日油株式会社)0.3g、コレステロール(Chol)0.152gおよびオレイン酸(OA)0.108gを含むヘキサン15mlを有機溶媒相(O)とし、カルセイン(0.4mM)を含むトリス−塩酸緩衝液(pH8、50mmol/L)5mlを内水相用の水分散相(W1)とした。50mlのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径20mmのプローブをセットした超音波分散装置(UH−600S、株式会社エスエムテー)により、25℃にて15分間超音波を照射し(出力5.5)、乳化処理を行った。
続いて、上記一次乳化工程により得られたW1/Oエマルションを分散相とし、SPG膜乳化装置(SPGテクノ社製、商品名「外圧式マイクロキット」)を使用して、SPG膜を用いた膜乳化によるW1/O/W2エマルションの製造を行った。
W1/O/W2エマルション製造後、添加剤として精製ゼラチン(株式会社ニッピ,ニッピ ハイグレードゼラチンタイプAP)(W2の質量に対する質量比0.5%となるように添加)を、W1/O/W2エマルションに添加した。
次に、上記W1/O/W2エマルションを蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約20時間静置し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られた。
得られたリポソーム粒子の懸濁液に、添加剤としてプルロニックF−68(ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコール、数平均分子量9600、登録商標、非イオン界面活性剤プロノン(#188P,日油株式会社))(W2の質量に対する質量比0.02%となるように添加)を添加し、添加剤添加後のリポソーム粒子の懸濁液を得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。
(一次乳化工程によるW1/Oエマルションの製造)
ホスファチジルコリン含量が95%である卵黄レシチン「COATSOME NC−50」(日油株式会社)0.3g、コレステロール(Chol)0.152gおよびオレイン酸(OA)0.108gを含むヘキサン15mlを有機溶媒相(O)とし、カルセイン(0.4mM)を含むトリス−塩酸緩衝液(pH8、50mmol/L)5mlを内水相用の水分散相(W1)とした。50mlのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径20mmのプローブをセットした超音波分散装置(UH−600S、株式会社エスエムテー)により、25℃にて15分間超音波を照射し(出力5.5)、乳化処理を行った。
続いて、上記一次乳化工程により得られたW1/Oエマルションを分散相とし、SPG膜乳化装置(SPGテクノ社製、商品名「外圧式マイクロキット」)を使用して、SPG膜を用いた膜乳化によるW1/O/W2エマルションの製造を行った。
W1/O/W2エマルション製造後、添加剤として精製ゼラチン(株式会社ニッピ,ニッピ ハイグレードゼラチンタイプAP)(W2の質量に対する質量比0.5%となるように添加)を、W1/O/W2エマルションに添加した。
次に、上記W1/O/W2エマルションを蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約20時間静置し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。
(一次乳化工程によるW1/Oエマルションの製造)
ホスファチジルコリン含量が95%である卵黄レシチン「COATSOME NC−50」(日油株式会社)1.08g、コレステロール(Chol)0.547gおよびオレイン酸(OA)0.389gを含むヘキサン54mlを有機溶媒相(O)とし、カルセイン(0.4mM)を含むトリス−塩酸緩衝液(pH8、50mmol/L)18mlを内水相用の水分散相(W1)とした。150mlの容器にこれらの混合液を入れ、直径25mmのプローブをセットしたホモミキサー(ULTRA TURRAX T25 basic、IKA社)により、25℃にて24000rpmで10分間、プレ分散処理を行った。その後、このプレ分散液を、卓上湿式微粒化装置NV−200−D(吉田機械株式会社)を用いて、150MPaで10パス処理した。
続いて、上記一次乳化工程により得られたW1/Oエマルションを分散相とし、SPG膜乳化装置(SPGテクノ社製、商品名「外圧式マイクロキット」)を使用して、SPG膜を用いた膜乳化によるW1/O/W2エマルションの製造を行った。
次に、上記W1/O/W2エマルションを蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約20時間静置し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られた。
得られたリポソーム粒子の懸濁液に、添加剤として精製ゼラチン(株式会社ニッピ,ニッピ ハイグレードゼラチンタイプAP)(W2の質量に対する質量比0.5%となるように添加)を添加し、添加剤添加後のリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。
(一次乳化工程によるW1/Oエマルションの製造)
ホスファチジルコリン含量が95%である卵黄レシチン「COATSOME NC−50」(日油株式会社)0.3g、コレステロール(Chol)0.152gおよびオレイン酸(OA)0.108gを含むヘキサン15mlを有機溶媒相(O)とし、カルセイン(0.4mM)を含むトリス−塩酸緩衝液(pH8、50mmol/L)5mlを内水相用の水分散相(W1)とした。50mlのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径20mmのプローブをセットした超音波分散装置(UH−600S、株式会社エスエムテー)により、25℃にて15分間超音波を照射し(出力5.5)、乳化処理を行った。
続いて、上記一次乳化工程により得られたW1/Oエマルションを分散相とし、SPG膜乳化装置(SPGテクノ社製、商品名「外圧式マイクロキット」)を使用して、SPG膜を用いた膜乳化によるW1/O/W2エマルションの製造を行った。
W1/O/W2エマルション製造後、添加剤としてプルロニックF−68(ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコール、数平均分子量9600、登録商標、非イオン界面活性剤プロノン(#188P,日油株式会社))(W2の質量に対する質量比0.02%となるように添加)を、W1/O/W2エマルションに添加した。
次に、上記W1/O/W2エマルションを蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約20時間静置し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られた。
得られたリポソーム粒子の懸濁液に、添加剤としてプルロニックF−68(ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコール、数平均分子量9600、登録商標、非イオン界面活性剤プロノン(#188P,日油株式会社))(W2の質量に対する質量比0.02%となるように添加)を添加し、添加剤添加後のリポソーム粒子の懸濁液を得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。
(一次乳化工程によるW1/Oエマルションの製造)
ホスファチジルコリン含量が95%である卵黄レシチン「COATSOME NC−50」(日油株式会社)0.3g、コレステロール(Chol)0.152gおよびオレイン酸(OA)0.108gを含むヘキサン15mlを有機溶媒相(O)とし、カルセイン(0.4mM)を含むトリス−塩酸緩衝液(pH8、50mmol/L)5mlを内水相用の水分散相(W1)とした。50mlのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径20mmのプローブをセットした超音波分散装置(UH−600S、株式会社エスエムテー)により、25℃にて15分間超音波を照射し(出力5.5)、乳化処理を行った。
続いて、上記一次乳化工程により得られたW1/Oエマルションを分散相とし、SPG膜乳化装置(SPGテクノ社製、商品名「外圧式マイクロキット」)を使用して、SPG膜を用いた膜乳化によるW1/O/W2エマルションの製造を行った。
W1/O/W2エマルション製造後、添加剤としてカルボキシデキストラン(W2の質量に対する質量比0.5%となるように添加)を、W1/O/W2エマルションに添加した。
次に、上記W1/O/W2エマルションを蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約20時間静置し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られた。
得られたリポソーム粒子の懸濁液に、添加剤としてプルロニックF−68(ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコール、数平均分子量9600、登録商標、非イオン界面活性剤プロノン(#188P,日油株式会社))(W2の質量に対する質量比0.02%となるように添加)を添加し、添加剤添加後のリポソーム粒子の懸濁液を得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。
(一次乳化工程によるW1/Oエマルションの製造)
ホスファチジルコリン含量が95%である卵黄レシチン「COATSOME NC−50」(日油株式会社)0.3g、コレステロール(Chol)0.152gおよびオレイン酸(OA)0.108gを含むヘキサン15mlを有機溶媒相(O)とし、カルセイン(0.4mM)を含むトリス−塩酸緩衝液(pH8、50mmol/L)5mlを内水相用の水分散相(W1)とした。50mlのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径20mmのプローブをセットした超音波分散装置(UH−600S、株式会社エスエムテー)により、25℃にて15分間超音波を照射し(出力5.5)、乳化処理を行った。
続いて、上記一次乳化工程により得られたW1/Oエマルションを分散相とし、SPG膜乳化装置(SPGテクノ社製、商品名「外圧式マイクロキット」)を使用して、SPG膜を用いた膜乳化によるW1/O/W2エマルションの製造を行った。
次に、上記W1/O/W2エマルションを蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約20時間静置し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。
比較例1において、一次乳化工程によるW1/Oエマルションの製造を、以下のように変更し、W1/O/W2生成前に添加する添加剤を精製ゼラチンからプルロニックF−68(ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコール、数平均分子量9600、登録商標、非イオン界面活性剤プロノン(#188P,日油株式会社))(W2の質量に対する質量比0.1%となるように添加)に変更し、ならびに二次乳化工程によるW1/O/W2エマルションの製造をSPG膜を用いた膜乳化から撹拌乳化法に変更した以外は、比較例1と同様にして、製造を実施した。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはシタラビンが含まれていることが確認された。
ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)「COATSOME MC−6060」(日油株式会社)1.5g、およびジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)「COATSOME MG−6060LA」(日油株式会社)0.25gを含むヘキサン15mlを有機溶媒相(O)とし、シタラビン(80mM))を含むトリス−塩酸緩衝液(pH8、50mmol/L)5mlを内水相用の水分散相(W1)とした。50mlのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径20mmのプローブをセットした超音波分散装置(UH−600S、株式会社エスエムテー)により、25℃にて15分間超音波を照射し(出力5.5)、乳化処理を行った。
比較例1において、W1/O/W2生成前に添加する添加剤を精製ゼラチンからプルロニックF−68(ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコール、数平均分子量9600、登録商標、非イオン界面活性剤プロノン(#188P,日油株式会社))(W2の質量に対する質量比0.1%となるように添加)に変更した以外は比較例1と同様にして、製造を実施した。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。
比較例3において、二次乳化工程によるW1/O/W2エマルションの製造を、SPG膜を用いた膜乳化から撹拌乳化法に変更した以外は、比較例3と同様にして、製造を実施した。すなわち、撹拌乳化は、スターラーによりW2を強く撹拌しているところに、上記W1/Oエマルションを供給し、W1:W2が1:40となるようにW1/O/W2エマルションを製造した。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。
(一次乳化工程によるW1/Oエマルションの製造)
ホスファチジルコリン含量が95%である卵黄レシチン「COATSOME NC−50」(日油株式会社)0.3g、コレステロール(Chol)0.152gおよびオレイン酸(OA)0.108gを含むヘキサン15mlを有機溶媒相(O)とし、カルセイン(0.4mM)を含むトリス−塩酸緩衝液(pH8、50mmol/L)5mlを内水相用の水分散相(W1)とした。50mlのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径20mmのプローブをセットした超音波分散装置(UH−600S、株式会社エスエムテー)により、25℃にて15分間超音波を照射し(出力5.5)、乳化処理を行った。
続いて、上記一次乳化工程により得られたW1/Oエマルションを分散相とし、SPG膜乳化装置(SPGテクノ社製、商品名「外圧式マイクロキット」)を使用して、SPG膜を用いた膜乳化によるW1/O/W2エマルションの製造を行った。
次に、上記W1/O/W2エマルションを蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約20時間静置し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。
比較例5において、二次乳化工程によるW1/O/W2エマルションの製造を、SPG膜を用いた膜乳化から撹拌乳化法に変更した以外は、比較例5と同様にして、製造を実施した。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。
比較例6において、内包する薬剤をカルセイン(0.4mM)からシタラビン(80mM)に変更した以外は、比較例6と同様にして、製造を実施した。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはシタラビンが含まれていることが確認された。
リポソーム水溶液(3ml)全体の蛍光強度(Ftotal)を分光光度計(U−3310、日本分光株式会社)により測定した。次に0.01M,CoCl2トリス塩酸緩衝液30μLを加えて外水相に漏出したカルセインの蛍光をCo2+により消光することで、ベシクル内の蛍光強度(Fin)を測定した。さらに、カルセインを加えないでサンプルと同じ条件でベシクルを作製し、脂質自身が発する蛍光(Fl)を測定した。内包率は下記式より算出した;
内包率E(%) = (Fin−Fl)/(Ftotal−Fl)×100
(シタラビンの内包率の測定方法)
超遠心装置で固形分(リポソーム)を分離(デカント)し、上澄と固形分をそれぞれHPLCで定量した。HPLCカラムとしてVarian Polaris C18−A(3μm 2x40mm)を用いてアッセイされた。内包されていない当該化合物と内包されている当該化合物の絶対値から、シタラビンの内包率を算出した。
作製したリポソーム粒子の懸濁液をリン酸緩衝食塩水(PBS)で25倍に希釈し、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計(UPA−EX150、日機装株式会社)を用いて単分散性(粒度分布)を測定しこれに基づき体積平均粒径を算出した。
くぼみのあるスライドガラスを用いて実施例1〜15及び比較例1〜7のリポソーム分散液25μlのプレパラートを作製し、正立顕微鏡(Axio Imager.A1、カールツァイス社製)の明視野条件で観察した。
2 薬剤
3 有機溶媒
4 内水相
5 外水相
Claims (15)
- 二段階乳化法を用いて製造する単胞リポソームの製造方法において、W1/O/W2エマルション形成後に、添加剤を添加することを特徴とする単胞リポソームの製造方法。
- 前記添加剤は、乳化する機能を有する物質であることを特徴とする請求項1に記載の単胞リポソームの製造方法。
- 前記添加剤は、タンパク質、多糖類、イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤の少なくとも1種を含有することを特徴とする請求項1または2に記載の単胞リポソームの製造方法。
- 前記添加剤は、ゼラチン、アルブミン、デキストランまたはポリアルキレンオキサイド系化合物の少なくとも1種を含有することを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の単胞リポソームの製造方法。
- 前記添加剤を添加した後に、溶媒を除去することを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の単胞リポソームの製造方法。
- 前記W1/O/W2エマルション形成後、前記添加剤を添加する前に、溶媒を除去することを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の単胞リポソームの製造方法。
- 前記添加剤の添加後に、撹拌を行うことを特徴とする請求項1〜6のいずれか一項に記載の単胞リポソームの製造方法。
- 前記添加剤は、W2の質量に対して0.2〜0.5%の質量比で添加することを特徴とする請求項1〜7のいずれか一項に記載の単胞リポソームの製造方法。
- 前記二段階乳化法の二次乳化工程として撹拌乳化法を用いることを特徴とする請求項1〜8にいずれか一項に記載の単胞リポソームの製造方法。
- 前記二段階乳化法の二次乳化工程としてSPG膜を用いた膜乳化を用いることを特徴とする請求項1〜9のいずれか一項に記載の単胞リポソームの製造方法。
- 前記単胞リポソームに内包されるべき物質として、医療用の薬剤類を用いることを特徴とする請求項1〜10のいずれか一項に記載の単胞リポソームの製造方法。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の単胞リポソームの製造方法を用いて製造することを特徴とする単胞リポソーム分散液の製造方法。
- 請求項12に記載の単胞リポソーム分散液の製造方法により造られたことを特徴とする単胞リポソーム分散液。
- ゼラチン、アルブミン、デキストランまたはポリアルキレンオキサイド系化合物の少なくとも1種を含有することを特徴とする請求項13に記載の単胞リポソーム分散液。
- 請求項13または14に記載の単胞リポソーム分散液を用いて造られたことを特徴とする単胞リポソームの乾燥粉末。
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