TWI439295B - Protein composition of microcupiates and its preparation method - Google Patents

Description

蛋白質藥物之微脂奈米組成物及其製備方法

本發明係關於一種蛋白質藥物之微脂奈米組成物及其製備方法，特別是關於一種可包載蛋白質或胜肽之大分子藥物的微脂奈米組成物及其製備方法。

隨著大量人力投入基因學的研究中，間接發現有許多新穎的藥用活性肽和蛋白質可作為疾病治療藥物，並且有機會在生物科技和基因工程技術發展，美國藥物生產暨研發協會(Pharmaceutical Research and Manufacturers of America，PhRMA)在2008年整理出了633種新開發的生技製劑，其中就有超過66個是屬於蛋白質或胜肽藥物，而這些新藥都已經運用在臨床試驗或是FDA確效階段。

然而，科學家觀察這些藥物在生物體內的遞送或分佈，往往是依據藥物分子本身的體積大小、3D立體空間結構和親疏水性而定，其發現除非有特殊傳遞因子或通道，否則這些大分子藥物遞送的效果都差強人意。主要原因有下列幾項：(1)分子粒徑大不易進入各類循環，且無法有效的通過細胞膜；(2)蛋白質大分子的安定性主要是靠著蛋白質二級、三級和四級結構間的微弱的非共價鍵作用(non-covalent interactions)維持，而但此作用很容易受到干擾而失效；(3)當這些大分子藥物注入生物體內後，很容易受到體內的酵素或體液降解，造成藥物在體內的半衰期短。

以上種種原因造成這些蛋白質藥物的生物利用度差，使得在長期療程中必須大量且頻繁的給予藥物，才有機會達到預期的治療效果。但往往因為這些大量且頻繁的投藥，造成生物體內出現許多非預期且不理想的副作用常見如發炎反應等。

另外，因蛋白質藥物的化學性及物理性安定率不佳，常常在製備或調配製劑的滅菌消毒或凍乾等製程，或是製備過程中的環境因子如pH值、離子強度、溫度、高壓、有機溶劑、金屬離子、界面活性劑和許多不當的減應力都有可能讓蛋白質藥物受到破壞而降解其活性。

因此，若想讓這些蛋白質藥物發揮其最大療效，便有迫切需求需要一個包載蛋白質大分子藥物的合適載體，並具有藥物遞送優點來提高蛋白質藥物的生物可利用性。

英國科學家Bangham在1986年實驗時，意外發現含有磷脂質(phospholipid)和水於燒杯中反應會產生許多很細微的小泡，而進一步經分析後證實這些微泡是由磷脂質組成雙層膜所形成，且小泡中包含少量的水份(Journal of molecular biology, Vol. 13,No. 1,pp. 238-52(1965))；之後由Sessa和Weissman等人正式命名為微脂粒(liposome)(Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 816,No. 1,pp. 1-8(1985))。構成微脂粒的磷脂質(phospholipid)是人類表皮內膜的主要成分，與皮膚及其他器官都能相容、無過敏性。當磷脂質分子分散在水中，會因兩端親疏水性的不同，而自我排列成同心球體的結構，體徑約20~1000 nm，每個脂質雙層的厚度約4 nm，可以是一層或多層的脂質雙層小球，並且裡外雙面具親水性，夾層為疏水性。換句話說，微脂粒會有三夾板結構，把水溶性物質包在球心，油溶性物質夾在脂質雙膜層內，因此可以分別或同時當作水性物質及油性物質的傳輸載體。

透過微脂粒系統作為藥物遞送載體，可保護藥物在生物體內避免受到免疫系統攻擊，而提供於體內有較長的循環滯留時間，並且降低生物毒性；而進入生物體後的溫度升高變化等機制，使得藥物達到控制釋放，另外可調控粒徑大小及專屬配體，進而增強特定細胞或組織的標靶性，提升藥物的生物到達效率。例如，科學家發現若微脂粒粒徑為50-200 nm時，會比大粒子微脂粒有較慢的生物清除率。

臨床上腫瘤通常都具有保護屏障進而影響到藥物輸送至腫瘤的量，因此，當靜脈注射小分子的抗癌藥物後，其實只有少部分藥物可到腫瘤細胞，絕大部分是在血液中分佈，因此，對於腫瘤治療效果不但不佳，反而在健康的組織中造成巨大的毒性與傷害。

微脂粒的發展及應用已在許多文獻上被報導且被肯定，但卻發現目前成功被應用的微脂粒系統仍是以遞送小分子藥物為主，而在微脂粒包載蛋白質/胜肽等大分子藥物仍屬罕見，而且包覆率都偏低，原因在於不同的蛋白質/胜肽具有不同的結構、電荷、穩定性或溶解性的特性，也與這些蛋白質分子容易受外界干擾而降解使得製備不易。因此找出一個最廣泛適合蛋白質/胜肽等大分子藥物的微脂粒配方與製程為一個刻不容緩的需求。

為解決前述問題，本發明提供一種蛋白質藥物之微脂奈米組成物，包含一微脂奈米核芯，包含一細胞穿透蛋白及一蛋白質藥物，且其莫爾比例在400：1至1200：1之間；以及一膜形成脂質，包含一中性電荷磷脂質、一膽固醇及一聚乙二醇(PEGlyted)脂質，且其莫爾比例在39：57：4至59：36：5之間。

在本發明一實施例中，上述的微脂奈米組成物，其中該膜形成脂質進一步包含一不飽和脂肪酸，且該中性電荷磷脂質、該膽固醇、該聚乙二醇脂質及該不飽和脂肪酸的莫爾比例在29：36：5：5至54：36：5：30之間。

本發明另提供一種蛋白質藥物之微脂奈米組成物的製備方法，其步驟包含：(1)把一蛋白質藥物及一細胞穿透蛋白混合形成一懸浮液；(2)把一中性電荷磷脂質、一膽固醇及一聚乙二醇(PEGlyted)脂質混合得到一膜形成脂質；以及(3)把步驟(1)的懸浮液加入該膜形成脂質中，經由一注射方法並佐以一薄膜予以擠壓後降溫，得到一微脂奈米組成物。

在本發明製備方法之一實施例中，其中步驟(1)之細胞穿透蛋白及該蛋白質藥物的莫爾比例在400：1至1200：1之間，且步驟(2)包含添加一不飽和脂肪酸，且該中性電荷磷脂質、該膽固醇、該聚乙二醇脂質及該不飽和脂肪酸的莫爾比例在29：36：5：5至54：36：5：30之間。

上述的製備方法中，該蛋白質或胜肽之分子量大於55kDa時，仍可具有優越的穩定性。另外，本發明製備方法所製成之微脂粒具有藥物釋放時間可達傳統微脂粒的二倍、對所包載蛋白質或胜肽有良好載送能力、對細胞無毒性之優點。因此，將抗癌藥物包覆在微脂粒載體中就可以明顯的減少藥物在血液的分佈而且增加腫瘤中藥物的濃度。

另以生理觀點觀之，健康組織周邊血管的內皮細胞間的間隙很小，可以減少稍大的分子進入健康組織，相對的，腫瘤組織周邊的內皮細胞間的間隙大得許多，使大分子的載體如微脂粒進入腫瘤組織的量相對增加，所以直徑約100 nm的微脂粒可提高微脂粒的血液循環半衰期，而且這樣大小的微脂粒能穿過腫瘤新生血管壁的漏洞，使包裹抗癌藥物的微脂粒能大量累積在腫瘤，增進治療效果。此外，微脂粒亦保護藥物不受血漿中的酵素影響延長藥物的半衰期，因此，造成微脂粒包覆的抗癌藥物具有增加藥效及減少對健康組織的毒性。

綜觀而言，經由本發明製備方法所製成之微脂粒擁有包覆蛋白質或胜肽等大分子良好的能力，凍乾後保存的穩定性亦佳，更因製造出來的微脂粒粒徑約100nm左右，使應用於包裹抗癌藥物的微脂粒能大量累積在腫瘤，增進治療效果。

以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

本發明除非另作說明，否則單數名詞「一(a,an,the)」在此均涵蓋其複數形式。

除了在操作實施例中或另有定義之外，所有在此用來表示一成分數量、反應條件的數值大小，均為一約略範圍，可視為該數值之±5%之範圍。因此，除非代表相反意涵，否則所有的數值均可視欲求的反應效果或性質來加以變化。

「細胞穿透蛋白」一詞在此係指具有穿透細胞膜的能力之蛋白質，包括任何富含正電荷胺基酸如精胺酸(Arginine)及離胺酸(Lysine)之蛋白質，例如魚精蛋白(protamine)。細胞穿透蛋白質容易穿透細胞膜，也就有機會將生物活性物質帶入細胞，而且因為具有生物可降解性，因此蛋白質藥物可藉由細胞穿透胜肽做為載體，加速蛋白質藥物的吸收，進而改善治療效果。

本發明係提供一種結合奈米粒子及微脂粒的微脂奈米粒子(LipoParticle)，以加強微脂粒的包覆性及其載體本體的穩定性，分別針對脂質配方及水層藥物結構進行配方設計，期望能克服蛋白質等大分子藥物包覆率、穩定性及釋放速率過快等問題。

因此，在一實施例中，本發明提供一種蛋白質藥物之微脂奈米組成物，其包含一微脂奈米核芯，包含一細胞穿透蛋白及一蛋白質藥物，且其莫爾比例在400：1至1200：1之間，較佳為400：1至800：1之間；一膜形成脂質，包含一中性電荷磷脂質、一膽固醇及一聚乙二醇(PEGlyted)脂質，且其莫爾比例在39：57：4至59：36：5之間。

在本發明另一實施例中，上述膜形成脂質進一步包含一不飽和脂肪酸，且該中性電荷磷脂質、該膽固醇、該聚乙二醇(PEGlyted)脂質及該不飽和脂肪酸的莫爾比例在29：36：5：：5至54：36：5：30之間，較佳為44：36：5：15。

以下，將藉由詳細實施例以闡述本發明之其他特點、目的及優點。所揭示實施例及所使用的技術名詞均係為了闡述本發明而用，非用以限制本發明之範疇。本發明範疇也涵蓋未揭示於此、但對於任一參閱過本說明書之習知技藝人士來說顯而易見的實施例。

本發明之微脂粒配方主要成分為二硬酯酸磷脂醯膽鹼(distearoyl phosphatidylcholine，DSPC)及膽固醇外，並加入少量聚乙二醇(PEGlyted)脂質及不飽和脂肪酸如二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)及多元不飽和脂肪酸(eicosapentaenoic acid，EPA)。聚乙二醇脂質的長鏈和本身的負電荷，可以降低微脂粒發生聚集沉降的風險，亦能有效延長微脂粒的體內循環時間。而不飽和脂肪酸(如DHA、EPA等)會增進微脂粒及細胞膜的流動性，進而提升微脂粒與細胞接觸關係；此外DHA亦同時具有細胞保護(尤其是神經細胞)的功能。

在本發明之一實施例中，微脂粒水層中的奈米粒子選用帶正電之魚精蛋白(protamine)來取代高分子，以形成蛋白質奈米粒子。希望藉由蛋白質間特有的凝聚性，加強奈米粒子對於控制藥物洩漏的效果，並且同時能降低生物體對於載體的排斥，以利魚精蛋白發揮穿透細胞胜肽的特性時，提升藥物進入細胞內的可能性。

本發明選用胎牛血清蛋白(BSA)、具螢光結合之胎牛血清蛋白(bovine serum albumin conjugated with fluorescein isothiocyanate，FITC-BSA)作為蛋白質的模式藥物，先以魚精蛋白與FITC-BSA混合凝聚成固體蛋白質奈米粒子(FITC-BSA-particle)，並調整此奈米粒子蛋白質略帶正電；之後給予含有PEG及DHA的負電脂質配方進行奈米粒子微脂粒製備，期望能透過粒子間異電相吸的原理，藉此提升微脂粒對於蛋白質的載藥能力及穩定性。

在本發明之較佳實施例中，實施例一係微脂粒空球之製備，試驗脂質配方、微脂粒製程之最佳組合；實施例二係蛋白質奈米粒子之製備，試驗魚精蛋白/FITC-BSA複合配方之比例；實施例三係包載蛋白質藥物之微脂奈米粒之製備及其製劑最佳化。結合實施例一至三之結果，製備出包載FITC-BSA微脂奈米粒子，粒徑約莫100 nm，電位趨近於電中性且均一大小的微脂粒載藥系統。並於實施例四以安定性、釋放速率、細胞毒性及吞噬效益等，確認此組配方有效性及安全性。

實施例一： 微脂粒空球之製備 1-1　脂質配方評估

本發明以乙醇注射法製備出注射型微脂粒空球後，接續以薄膜擠壓法使用100 nm後搭配50 nm薄膜來回擠壓，形成粒徑均一的注射擠壓型微脂粒空球。製備完成之微脂粒分別測定其粒徑及界面電位，並將樣品儲存於4℃下，觀察其粒徑及界面電位經時變化情形。步驟詳述如下：以微量天平量取適量二硬脂酸磷脂醯膽鹼(2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DSPC;Avanti Polar Lipids)、膽固醇(cholesterol;99%,Sigma-Aldrich)、二硬脂磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇2000(distearoyl phosphoethanolamine-PEG₂₀₀₀ ,DSPE-PEG₂₀₀₀ ；99.3%;NOF CORPORATION)及二十二碳六稀酸(docosahexaenoic acid,DHA,98%,Sigma-Aldrich)置於玻璃樣品管中，以試管振盪混合機混合均勻，以60℃水浴槽加熱10分鐘。

添加無水乙醇(99.8%;Sigma-Aldrich)後，以振盪混合機振盪混合至脂質完全溶於乙醇中，並立刻以注射針筒吸取脂質乙醇溶液，注射入定量二次水的注射樣品瓶中，以振盪混合機振盪。

預熱(35~40℃)微脂粒擠壓器座台，以針筒吸取微脂粒空球懸浮液後回插擠壓座台，並確認密合，以100 nm薄膜來回擠壓，將擠壓器中的100 nm濾膜取出換為50 nm之濾膜，再次緩慢來回擠壓，將懸浮液注入冰浴之樣品管，以振盪混合機振盪。

放入-20℃冷凍庫快速降溫定形，完成微脂粒空球(BlankLip-IE)懸浮液製備，保存於4℃冰箱內。

表一為各配方於儲存第0、7及28天後的平均粒徑及界面電位變化。在未添加DHA的組別編號(A~F)中，編號E能維持粒徑120 nm，界面電位-32 mV，其190天內的粒徑及界面電位經時變化並無顯著變化(p >0.05)，表示微脂粒空球配方穩定性佳。而當以不同比例(5、15和30 mol%)的DHA加入脂質配方中組別E5、E15、E30，其中編號E15在第0~90天的平均粒徑及界面電位經時變化情形如第一圖，在90天內粒徑及電位都無明顯變化(p >0.05)，顯示微脂粒空球穩定度高變化小。因此，選定脂質莫爾比例為44/36/5/15(DSPC/膽固醇/DSPE-PEG₂₀₀₀ /DHA)編號E 15之配方。

1-2　以物性及安定性選擇最佳製備方式

固定以編號E 15的脂質配方(DSPC/膽固醇/DSPE-PEG₂₀₀₀ /DHA莫爾比為44/36/5/15，脂質與乙醇和水比例是75/1/9(mg/ml/ml))，分別試驗乙醇注射法及/或搭配超音波震盪法來製備微脂粒，並選擇性以100 nm和50 nm薄膜擠壓，製備出微脂粒空球懸浮液均保存於4℃，並分別測量粒徑及界面電位差異，以選擇最佳製備方式。步驟詳述如下：

A.　乙醇注射法(I)

以微量天平量依編號E 15之配方取DSPC、膽固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀ 和DHA置於玻璃樣品管中，再以試管振盪混合機混合均勻，以60℃水浴槽加熱10分鐘。

於玻璃樣品管中添加無水乙醇後，以振盪混合機振盪混合至脂質完全溶於乙醇後，立刻以注射針筒吸取脂質乙醇溶液，注射入含有定量二次水的注射樣品瓶中，以振盪混合機振盪，再移入-20℃冷凍庫快速降溫定形，形成注射型微脂粒(BlankLip-I)，保存於4℃環境。

B.　乙醇注射法+薄膜擠壓(IE)

作法同前(I)，但最後階段以振盪混合機振盪，不進行快速冷凍，而是預熱(35~40℃)微脂粒擠壓器座台，以針筒吸取注射型微脂粒懸浮液(BlankLip-I)後重組擠壓座台，以100 nm薄膜來回擠壓，將擠壓器中的100 nm濾膜取出換為50 nm之濾膜，再次緩慢來回擠壓，將懸浮液注入冰浴之樣品管，以振盪混合機振盪，放入-20℃冷凍庫快速降溫定形，形成注射擠壓型微脂粒(BlankLip-IE)懸浮液，保存於4℃環境。

C.　超音波震盪法(U)

以微量天平量依編號E 15之配方取DSPC、膽固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀ 和DHA置於玻璃樣品管中，再以試管振盪混合機混合均勻，以60℃水浴槽加熱10分鐘。

於玻璃樣品管中添加無水乙醇後，以振盪混合機振盪混合至脂質完全溶於乙醇中，加入二次水混合均勻。於冰浴狀態下，以探針式超音波震盪(功率=50%，循環=0.5s/0.5s)取出，以振盪混合機振盪，再放入-20℃冷凍庫快速降溫定形，30分鐘後形成震盪型微脂粒(BlankLip-U)懸浮液，放入4℃冰箱保存。

D.　超音波震盪法+薄膜擠壓(UE)

作法同前(U)，但最後階段以振盪混合機振盪，不進行快速冷凍，預熱(35~40℃)微脂粒擠壓器座台，以針筒吸取震盪型微脂粒懸浮液(BlankLip-U)後，重組擠壓座台，以100 nm薄膜來回擠壓，將擠壓器中的100 nm濾膜取出換為50 nm之濾膜，再次緩慢來回擠壓。將懸浮液注入冰浴之樣品管，以振盪混合機振盪，放入-20℃冷凍庫快速降溫定形，形成震盪擠壓型微脂粒(BlankLip-UE)懸浮液，保存於4℃環境。

比較各組別之經時安定性，表二為儲存0、7及28天後粒徑及電位的量測結果，表中顯示超音波震盪反而會造成不穩定的現象發生，故仍以乙醇注射法搭配薄膜擠壓法(簡稱乙醇注射擠壓法,IE)最為穩定。

根據前述結果，將脂質配方莫爾比例固定為44/36/5/15(DSPC/膽固醇/DSPE-PEG₂₀₀₀ /DHA)，利用乙醇注射擠壓法製備微脂粒。

1-3　乙醇注射擠壓法製程參數調整

進一步以表三進行乙醇注射擠壓法製備微脂粒空球流程參數調整，目的是希望藉由製程之細部調整控制，形成較小粒徑且均一的微脂粒載體，方便簡化甚至省略後續薄膜擠壓法，降低不必要的損耗。

變數如(1)使用不同孔徑(100 nm、50 nm、及100 nm搭配50 nm)的濾膜來進行微脂粒擠壓；或(2)乙醇注射時，於水相中加以磁石定速(1,000 rpm)攪拌(BlankLipo-Is(75)、BlankLipo-IEs(75))，各配方的粒徑及界面電位詳如表四，並且與未攪拌對照組((BlankLipo-I(75)、BlankLipo-IE(75))比較。

一開始在選擇以薄膜擠壓做為後續加工時，曾經做過不同濾膜孔徑擠壓效果的比較，發現需要以100 nm搭配50 nm階段式擠壓才可有效將粒徑控制，如第二圖所示，但考量未來包載藥物蛋白質的分子量都較大，且無法長時間承受高溫；因此，在乙醇注射時，水相環境持續以磁石進行攪拌，可有效提升微脂粒系統的安定性。

由表四顯示經過磁石快速攪拌下以乙醇注射法製備微脂粒，確實可以粒徑有效降低，同時讓後續薄膜擠壓製程更加有效率，單以100 nm的濾膜就可讓粒徑有效降至120 nm以下。

經由前述實施例一，微脂粒空球製備方法之試驗，選定脂質配方DSPC/膽固醇/DSPE-PEG₂₀₀₀ /DHA之莫爾比例為44/36/5/15，而脂質與乙醇和水比例是25/1/9(mg/ml/ml)，製程則是在磁石攪拌環境下進行乙醇注射法，並佐以薄膜(孔徑為100 nm)擠壓法，來製備出包載具螢光結合之胎牛血清蛋白(bovine serum albumin conjugated with fluorescein isothiocyanate,FITC-BSA)之微脂粒系統。

實施例二： 蛋白質奈米粒子之製備

奈米粒子製備方法是藉由靜電相吸，將大量帶正電的蛋白質魚精蛋白與微弱負電之具螢光結合之胎牛血清蛋白(FITC-BSA)混勻，藉由球體帶正電以利未來負電荷脂質進行微脂粒製備，藉由蛋白質間螯合的能力，延緩藥物洩漏速率。故嘗試將FITC-BSA溶液與不同濃度的魚精蛋白溶液，其為硫酸魚精蛋白溶液(protamine sulfate_(aq) ；商品名Grade X;Sigma-Aldrich)，混勻凝聚形成蛋白質奈米粒子。

實驗選用鏈狀蛋白魚精蛋白與具螢光結合之胎牛血清蛋白(FITC-BSA)混成，藉由觀察不同魚精蛋白/FITC-BSA比例配方的粒徑、界面電位及包覆率變化，來評估並篩選最佳的FITC-BSA_(aq) 和BSA_(aq) 混合液形成的FBSA-粒子之配方。

(1)　溶液配製：

配置濃度為8.56 mg/mL的硫酸魚精蛋白(protamine sulfate_(aq) )靜置過夜，再分別配置濃度為1.4 mg/mL的具螢光結合之胎牛血清蛋白(FITC-BSA_(aq) )及BSA_(aq) ，再將FITC-BSA_(aq) 和BSA_(aq) 依體積比1:19混合均勻，定為FBSA_(aq) 混合液，因為FITC-BSA/BSA比例為1/19，即可在製備區間保持其分散性，定為FBSA標準溶液，在以此標準溶液注入不同濃度魚精蛋白中均勻混合成奈米粒子。

(2)　奈米粒子製備：

依表五之比例，均勻混合前述硫酸魚精蛋白及二次水，固定以磁石攪拌(固定轉速1,000 rpm)，緩慢滴入FBSA_(aq) ，並在全數FBSA_(aq) 放入後攪拌，即完成FBSA粒子懸浮液之製備。

依配方表五所製備出的FBSA-粒子結果列於表六。根據結果顯示，當FBSA混合液中的FITC-BSA濃度由17.5μg/ml升為35μg/ml，包覆率(EE%)會由97%下降至60%，然而就載藥比例(LE%)而言，FITC-BSA濃度為35μg/ml仍優於17.5μg/ml的組別；其中配方組別20-70(魚精蛋白-FITC-BSA初始配置濃度)及40-70載藥比例是最高的，並且組別20-70有機會將粒徑控制於100 nm以下，因將有助於未來微脂奈米粒子製備時的粒徑表現。

綜觀蛋白質奈米粒子製備之結果，我們選定配方20-70(魚精蛋白/FITC-BSA之莫爾比例為400；FITC-BSA濃度為35μg/ml)為主要配方，主要因其可製備出100nm以下的粒子，且換算出的載體載藥率為最佳；並加選40-70(魚精蛋白/FITC-BSA之莫爾比例為800；FITC-BSA濃度為35 μg/ml)作為輔對照配方。

實施例三： 包載蛋白質藥物之微脂奈米粒之製備及其製劑最佳化

根據實施例一至二之結果，微脂奈米粒子製備法固定以乙醇注射法製備後，並選擇性輔以薄膜擠壓法製備，整理並設計包覆FITC-BSA的微脂粒配方，脂質配方固定為44/36/5/15(DSPC/膽固醇/DSPE-PEG₂₀₀₀ /DHA莫爾比例)，脂質濃度為25 mg/1 mL/9 mL(脂質/乙醇/水溶液(aqueous solution))，奈米粒子配方以魚精蛋白/FITC-BSA之莫爾比例為400為主以及800為輔，FBSA濃度為1.4 mg/mL(FITC-BSA/BSA=1/19(v/v))，詳細配方如表七，依配方製備出微脂粒系統後，利用透析法去除游離FITC-BSA，最後利用冷凍乾燥法將其凍乾成粉末態以利保存。

首先依實施例二方式製備FBSA-粒子，並以微量天平量取DSPC、膽固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀ 和DHA(莫爾比例為44:36:5:15)置於玻璃樣品管中，以試管振盪混合機混合均勻，以60℃水浴槽加熱10分鐘，反應完即自動產出FBSA-粒子被脂質包覆在內。

於玻璃樣品管中添加0.1 mL無水乙醇後，以振盪混合機振盪混合至脂質完全溶於乙醇中，再以1 mL注射針筒吸取脂質乙醇溶液，注射入注射樣品瓶，並以磁石攪拌。

移入-20℃冷凍庫快速降溫定形以形成注射型微脂粒(FBSA-Lip-I或FBSA-LipoParticle-I)，保存於4℃環境。

本發明另一實施例，預熱(35~40℃)微脂粒擠壓器座台，以100 nm濾膜來回擠壓15次後將懸浮液注入冰浴之樣品管，以振盪混合機混合。放入-20℃冷凍庫快速降溫定形，30分鐘後，形成注射擠壓型微脂粒(FBSA-Lip-IE或FBSA-LipoParticle-IE)懸浮液，保存於4℃環境。

選擇以透析方式(阻隔分子量為1,000 kDa，Spectrum Laboratories,USA)來分離微脂粒系統及游離FITC-BSA等未包覆藥物。並預先以BlankLip-IE及已知濃度FITC-BSA_(aq) 測試，確認分離游離FITC-BSA所需時間為8小時，並確定能將微脂粒保留在透析膜內。

分離步驟為首先於冷房(4℃)環境下，加入二次水到透析槽中，開始以磁石穩定攪拌。另取透析袋，以二次水潤洗，將1 mL微脂粒懸浮液放入透析袋，夾緊後放入透析槽中，磁石攪拌後，小心取出透析袋。以定量吸管吸取透析後的微脂粒懸浮液，並重新定體積為1 mL(以二次水填補體積)。

海藻糖作為本發明製劑的凍乾保護劑，係考量其可讓微脂粒在凍乾的過程中仍有超過90%的包載藥物可穩定存於微脂粒載體內，添加比例是海藻糖與脂質的比例為1:4(w/w)。其操作步驟如下：將微脂粒及適量海藻糖水溶液放入凍晶瓶後，置於-80℃冰箱結冰過夜。開啟冷凍乾燥機凍乾機，預冷降壓至5×10^-1 torr、-40℃以下。以試鏡紙覆蓋各樣本瓶口後，放入凍乾瓶接上凍乾支架開口，連續抽乾25小時後取出樣品，即完成微脂粒乾粉成品。

產率之計算方式為計算凍乾前後之重量差異並扣除海藻糖重量，與最初製備所加各試劑重量比較後，即可計算出各組配方微脂粒的產率。

微脂粒製備完成後，分別量測粒徑，各配方經過薄膜擠壓後，都得到粒徑較小且均一的粒徑分佈。凍乾前後粒徑差異、界面電位、凍乾產率(yield%)及包覆效率(EE%)等測量結果整理後彙整成表八。

其中配方FBSA-20LipoParticle-IE粒徑分佈曲線表現於第三圖，粒徑分佈指數(p.I)為0.257，凍乾前平均粒徑133.7±18.5 nm，比較凍乾前後粒徑差異(d%)為10.4%，經由t-test分析顯示p>0.24，顯示兩者無所差異；而其界面電位為13.0 mV，並如第四圖所示，在0~32天平均粒徑及界面電位經時變化情形無顯著差異。包覆效率為59.6%，為實驗組別中最佳配方。

實施例四： 包載蛋白質藥物之微脂奈米粒特性分析 4-1　TEM及SEM分析

利用穿透式電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy，TEM)及場發射電子顯微鏡(Field-Emission Scanning Electron Microscope，FE-SEM)以確認奈米粒子及微脂粒的構形。

欲以TEM觀測時，分別收集微脂粒空球、包覆FITC-BSA的奈米粒子及微脂粒等各配方之樣品懸浮液，滴入10 μl樣品懸浮液至鍍碳膜之銅網上，使粒子沉降在碳膜上；滴入5 μl 1%醋酸鈾醯(uranyl acetate)，避光進行負染色後，以二次水洗去染劑及雜質後以濾紙完全吸乾，即可利用TEM觀察構形及拍攝影像。

第五圖中分別顯示(a)微脂粒空球、(b)蛋白質奈米粒子及(c)微脂奈米粒子的TEM圖像。其中奈米粒子粒徑約80 nm，微脂粒空球及微脂奈米粒子粒徑約為100-150 nm，由微脂粒空球的放大圖可看出其脂質雙層膜結構，經標準尺量測比較後，計算出其脂質雙層膜厚度約為6-10 nm。

欲以FE-SEM觀測微脂粒時，分別收集微脂粒空球、包覆FITC-BSA的奈米粒子及微脂奈米粒子等樣品懸浮液，並滴入50μl樣品懸浮液至SEM載台之碳膠帶上，使水分自然揮發乾燥；濺鍍鉑至碳膠帶表面，保存於乾燥箱後，即可利用FE-SEM電子顯微鏡觀察構形及拍攝影像。

第六圖則是微脂粒空球及微脂奈米粒子的FE-SEM圖像；微脂粒空球(a)呈現圓盤狀，微脂奈米粒子(b)、(c)同為圓盤狀形貌且明顯看出為雙層結構，證實本發明確實設計並製備出微脂奈米粒子系統。

4-2　製程及產品安定性評估

為確認實驗製程不會對蛋白質造成傷害而裂解，故收集製程中間產物(FBSA-粒子)及微脂粒懸浮液(FBSA-load liposome)、凍乾回溶後之微脂奈米粒子lyo(FBSA-LipoParticle))，並同時評估於釋放環境中4及8小時的微脂粒存留的載藥能力，以SDS-PAGE電泳測定其分子量，並以原始藥物(BSA、FITC-BSA)當做對照組。

利用界面活性劑SDS(sodium dodecyl sulfate)會附著在蛋白質疏水區表面，並且藉由SDS本身所帶之負電荷引導泳動。而泳動速率只會因蛋白質分子量而改變只決定於蛋白質分子量，故SDS電泳適合測定蛋白質的分子量。在樣本處理過程中，利用加熱破壞蛋白質的三級及四級結構，使其分子內部的疏水區暴露而與SDS結合；並加入還原劑可破壞蛋白質分子內的雙硫鍵，常用還原劑如β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)或二硫蘇糖醇(dithiothreitol)。

如第七圖結果顯示各樣品都與對照組都在高於66 kDa及45 kDa之上分別有一條蛋白質電泳帶。原始藥物(BSA、FITC-BSA)也同樣具兩條蛋白質電泳帶，因此雙電泳帶的產生應來自於原始藥物成分或純度的差異，而並非是在製備微脂粒時造成的蛋白質降解。而在第七圖中的No. 8和No.9分別是等量的FBSA-20 Lipoparticle-IE配方於溶離環境下，4、8小時過後所測得微脂粒內部的蛋白質反應，證明在微脂粒內部的蛋白質藥物並未立刻在模擬體內環境完全洩漏，可達到載體控制釋放之目的。

4-3　載體留存FITC-BSA效率評估

於36℃循環水浴槽中以13.7 mM磷酸鹽緩衝溶液(pH 7.4)，利用透析袋(1,000 kDa)來分離洩漏出之藥物。以螢光光度計量測FITC-BSA之最大激發波長、發射波長，分別繪製FITC-BSA的激發及發射光光譜圖，進一步用激發、發射波長等前述實驗量測結果作為參數，利用冷光螢光分析儀製作FITC-BSA標準曲線。

微脂粒的洩漏曲線圖顯示如第八圖，各配方都於24小時內釋放完藥物。而除FBSA-Liposome之0.5小時及FBSA-40LipoParticle的8小時外，各配方凍晶前後所做之洩漏率結果無顯著差異(p>0.01)。

藉由載體保留藥物能力評估，可以更加清楚微脂奈米粒子的穩定載體功效，故進一步分別以零級(Zero order)、一級(First order)及Higuchi模型等各藥物釋放動力學模式，分析24小時各配方的洩漏係數(k₀ ,k₁ ,k_h )，經轉換後得各單位可保留載體內FITC-BSA含量曲線(第九圖)及參數表(表九)。以R² 來判斷，Higuchi模型最為適切，其中配方FBSA-20LipoParticle(魚精蛋白/FBSA之莫爾比例為20/1))，參數k’_h 分別為-0.1879 hr^(-0.5) 及-0.2172 hr^(-0.5) ，表示7.4小時之後仍可保留50%的FITC-BSA。

由第九圖可看出凍乾前微脂奈米粒子在7.9小時後仍可以有50%的FITC-BSA仍留在載體內部，相較於傳統微脂粒來說，是傳統微脂粒劑型3.3小時的兩倍，推測就是蛋白質奈米粒子(FBSA-粒子)發揮其作用，利用蛋白質間的凝聚力和正負電的靜電吸引力，達到延緩蛋白質藥物洩漏的時間；而凍乾前後的差異，凍乾前後洩漏50%的時間(t₅₀ )差異也都在10%以內，而經過魚精蛋白處理過的微脂奈米粒子，透過奈米粒子與微脂粒的靜電吸引力可能在凍乾時，提供微脂粒的穩定性的效能，將凍乾製程造成的影響降至最低，因而又將洩漏變異程度進一步控制在6%以下。

4-4　細胞毒性分析

實驗以Caco-2細胞作為細胞平台，進行細胞毒性分析以確認載體對於細胞的傷害。第十圖顯示出利用WST-1試劑所做之細胞存活試驗，其結果看出微脂粒及各組包載FITC-BSA藥物的各組的細胞毒性近乎相等。

而載體含量對細胞毒性的差異，當脂質濃度為2.6 mM時，細胞存活率約80%，如第十一圖(b)所示；但當脂質濃度為0.26 mM以下時，發現除了FBSA-40LipoParticle之外，各組的存活近乎100%，無顯著差異(p>0.01)如第十一圖(a)所示。根據體液循環中，脂質相對濃度絕對低於2.6 mM濃度，因此推論不會對於生物體造成不必要的毒性。

4-5　細胞吞噬FITC-BSA效率分析

實驗以Caco-2細胞作為細胞平台，利用流式細胞儀來進行細胞吞噬計算。Caco-2細胞係由美國菌種中心取得(ATCC，Rockville,MD)。

根據細胞存活實驗的結果顯示，如直接給予未稀釋的微脂粒配方進行細胞吞噬試驗，可能會因脂質濃度而造成細胞毒性等不必要的干擾，另一方面須避免螢光強度過低而造成實驗結果內部化而無法判讀。因此，將最佳化微脂粒配方FBSA-20LipoParticle-IE以無FBSA基本培養基(free-FBSA-DMEM)稀釋至濃度為0.01 mg/mL後，進行時間序列的細胞吞噬實驗。

Caco-2細胞以1×10⁵ 個細胞/孔的密度植入8孔培養盤中，在每孔加入完全培養液，培養24小時。將培養盤中每孔皆更換新的生長培養液後，加入不同配方之包覆FITC-BSA微脂粒懸浮液(0.01 mg/mL)，再繼續培養1、2、3、4以及6小時。以空微脂粒的實驗結果當作一正向控制組，所有的細胞吞噬實驗皆以三重複實驗進行。細胞以倒立螢光顯微鏡(DMI 4000B；Leica Microsystems，Wetzlar，Germany)拍攝影像。細胞吞噬效率以FITC-BSA活性作分析。在不同培養時間下，將細胞以磷酸鹽緩衝溶液清洗三次，再用0.05%胰蛋白酶/0.02% EDTA將細胞取下收集，用磷酸鹽緩衝溶液清洗，在磷酸鹽緩衝溶液中再懸浮以作流式細胞分析。最終的吞噬量結果以細胞吞噬空微脂粒數量的倍數表示。

實驗結果如第十二圖所示，包覆FITC-BSA之微脂粒能夠有效地被細胞吞噬，控制組的細胞維持原先的形狀與表面形態。實驗組的細胞吸收奈米粒子後，有可接受的延展現象。所有粒子在1小時培養後，細胞膜中呈現螢光亮點，這個現象最多可保持6小時。由第十二圖可看出，在第1小時，FITC-BSA的吞噬作用顯著增加(細胞於包覆FITC-BSA之微脂粒的吞噬量為空微脂粒的吞噬量的12倍；P <0.01)，顯示粒徑為100~200 nm的微脂粒為細胞吞噬作用最佳的大小。Caco-2細胞之細胞質的螢光分布可能部份是由於微脂粒中FITC-BSA的高度釋放。此結果指出包覆FITC-BSA之微脂粒被細胞吞入細胞內，且可提高微脂粒穿透細胞的能力。

經由實施例可知，本發明提出一種高安定性極高蛋白質包載率之控制釋放微脂奈米顆粒系統。經由藥物劑型中的配方添加及調控，搭配製備方法的調控，可成功製備出高包載蛋白質的微脂奈米顆粒，粒徑135±9nm，界面電位+13.3mV，並由TEM及FE-SEM觀察型態確認，經分析FITC-BSA的包覆率可由最初之19%提升至59.7%(p<0.01)，並經由SDS-PAGE證實成品及經8小時洩漏後之微脂粒內蛋白質結構並無變化，並可保存於4℃超過1個月。於體外的緩效釋能試驗中，PEG微脂奈米顆粒藥物經由藥物釋放模式中之Higuchi模式評估後，t₅₀ 可由傳統微脂粒的3.2小時上升至7.9小時。最後以Caco-2細胞平台進行的細胞毒性實驗，及細胞吞噬藥物經時變化，證實當脂質在一定濃度以下，理想配方對於細胞的傷害都未達統計意義，並且可將藥物有效送入細胞(p<0.01)。

第一圖係為存於4℃第0~90天時微脂粒之平均粒徑(○)以及界面電位(●)的穩定性測試。脂質配方之莫爾比例為DSPC/膽固醇/DSPE-PEG₂₀₀₀ /DHA=44/36/5/15；脂質(mg)/乙醇(ml)/二次水(ml)之比例為75/1/9。三次重複試驗。

第二圖係為經由乙醇注射法以及不同孔徑之擠壓膜製備之微脂粒的粒徑(□)以及界面電位(●)。脂質配方DSPC/膽固醇/DSPE-PEG₂₀₀₀ /DHA之莫爾比例為39/57/4/0；脂質(mg)/乙醇(ml)/二次水(ml)之比例為75/1/6。三次重複試驗。

第三圖係為配方FBSA-20LipoParticle-IE之粒徑分布(粒徑分布指數為0.257)。

第四圖係為包載FITC-BSA之微脂粒懸浮液於1~32天之穩定性測試。三次重複試驗。FBSA-20LipoParticle-IE(○)以及FBSA-Liposome-IE(□)之平均粒徑，與FBSA-20LipoParticle-IE(●)以及FBSA-Liposome-IE()之界面電位。(*與0天時比較p <0.005者(pair t-test))

第五圖係為(a)微脂粒空球；(b)蛋白質奈米粒子；以及(c)微脂奈米粒子之TEM圖。比例尺分別為(a) 50 nm；(b) 100 nm；以及(c) 100 nm。

第六圖係為FE-SEM圖。樣本經1%醋酸鈾醯進行負染色(negative stain)。(a)微脂粒空球；(b)凍乾後之微脂粒；以及(c)微脂奈米粒子。比例尺為100 nm。

第七圖係為SDS-PAGE影像(M：分子量標記蛋白質；1：BSA；2：FITC-BSA；3：FBSA-粒子；4：FBSA-微脂粒；5：FBSA-20Lipo Particle-I；6：FBSA-20LipoParticle-IE；7：lyo-(FBSA-20LipoParticle-IE)；8：FBSA-20LipoParticle-IE於13.7 mM磷酸鹽緩衝溶液4小時後；以及9：FBSA-20LipoParticle-IE於13.7 mM磷酸鹽緩衝溶液8小時後)。

第八圖係為包載FITC-BSA之微脂粒之累積釋放率(%)與釋放量(FITC-BSA(μg)/微脂粒(mg))。(a)、(c)分別為未經凍乾之微脂粒的釋放率及釋放量；(b)、(d)為經凍乾保存後之微脂粒的釋放率及釋放量；○代表FBSA-Liposome-IE；□代表FBSA-20LipoParticle-IE；◇代表FBSA-40Lipo Particle-IE。三次重複試驗。*係與凍乾前比較p <0.01(pair t-test)(FBSA-Liposome-0.5hr:p =0.0056;FBSA-40LipoParticle-8hr:p =0.002)

第九圖係為FITC-BSA之殘留率及殘留量。(a)、(c)凍乾前；(b)、(d)凍乾後。○：BSA-Liposome-IE；□：BSA-20LipoParticle-IE；◇：BSA-40LipoParticle-IE。

第十圖係為包載FITC-BSA之微脂粒對Caco-2之細胞毒性測試。△：空微脂粒；○：FBSA-Liposome；□：FBSA-20LipoParticle；◇：FBSA-40LipoParticle。6次重複試驗。*號代表與控制組相較有顯著差異(p<0.01，pair t-test)

第十一圖係為包載FITC-BSA之微脂粒對Caco-2之細胞毒性測試。(a)脂質為0.26 mM；(b)脂質為2.6 mM。6次重複試驗。*號代表與0天時比較，具顯著差異(p <0.001，pair t-test)

第十二圖係為Caco-2細胞吞噬作用測試之實驗結果。(A)正常細胞的正向及側向散射光圖譜。(B)Caco-2細胞在不同時間點攝入包覆FITC-BSA之微脂粒以及微脂粒空球的情形。(C)包覆FITC-BSA之微脂粒以及微脂粒空球之正常Caco-2細胞的螢光強度，測得之螢光強度以除以未經處理的控制組細胞之螢光強度的比率表示。(以student’st -test統計分析，**P ,0.01)。

Claims (10)

1. 一種蛋白質藥物之微脂奈米組成物，包含：一微脂奈米核芯，包含一魚精蛋白及一蛋白質藥物，且其莫爾比例在400：1至1200：1之間；以及一膜形成脂質，包含二硬脂酸磷脂醯膽鹼、膽固醇、二硬脂磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇2000、及二十二碳六烯酸，且其莫爾比例在41.8：34.2：4.75：14.25至46.2：37.8：5.25：15.75之間。
2. 如申請專利範圍第1項所述的微脂奈米組成物，進一步包含一水互溶性有機溶劑，係用於該膜形成脂質之溶液，且該膜形成脂質、該水互溶性有機溶劑及水的濃度比例在25：1：19至75：1：19之間。
3. 如申請專利範圍第2項所述的微脂奈米組成物，其中該水互溶性有機溶劑為無水乙醇。
4. 如申請專利範圍第1項所述的微脂奈米組成物，其中該微脂奈米組成物的粒徑範圍為100nm至150nm。
5. 一種蛋白質藥物之微脂奈米組成物的製備方法，其步驟包含：(1)把一蛋白質藥物及一魚精蛋白混合形成一懸浮液；(2)把二硬脂酸磷脂醯膽鹼、膽固醇、二硬脂磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇2000、及二十二碳六烯酸以41.8：34.2：4.75：14.25至46.2：37.8：5.25：15.75之莫爾比例混合得到一膜形成脂質；以及(3)把步驟(1)的懸浮液加入該膜形成脂質中，經由一注射方 法並佐以一薄膜予以擠壓後降溫，得到一微脂奈米組成物。
6. 如申請專利範圍第5項所述的製備方法，其中步驟(1)之細胞穿透蛋白及該蛋白質藥物的莫爾比例在400：1至1200：1之間。
7. 如申請專利範圍第5項或第6項所述的製備方法，其中步驟(3)進一步包含添加一水互溶性有機溶劑於該膜形成脂質中混合。
8. 如申請專利範圍第7項所述的製備方法，其中該水互溶性有機溶劑為一醇類。
9. 如申請專利範圍第5項所述的製備方法，其中該蛋白質藥物之分子量大於55kDa。
10. 如申請專利範圍第5項所述的製備方法，其中該薄膜之孔徑為50nm至100nm。