JP2011513481A

JP2011513481A - 低分子及び高分子ヒアルロン酸と楡根皮とから抽出した多糖類を含有する老化防止用組成物

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Publication number: JP2011513481A
Application number: JP2010550597A
Authority: JP
Inventors: ホキム、キ; スキム、キ; ヒキム、ヨン; グクキム、ジン; テキム、キョン; スンハン、チャン; イルコ、カン
Original assignee: Bioland Ltd
Current assignee: Bioland Ltd
Priority date: 2008-03-13
Filing date: 2009-03-12
Publication date: 2011-04-28
Anticipated expiration: 2029-03-12
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Abstract

本発明は、高分子ヒアルロン酸、低分子ヒアルロン酸、及び楡根皮から抽出した多糖類を有効成分として含有する皮膚外用老化防止用薬学的組成物に関する。
本発明によれば、低分子ヒアルロン酸、高分子ヒアルロン酸及び楡根皮から抽出した多糖類を一定の割合で混合して、それぞれ単独で使用するより優れた皮膚保湿効果、皮膚弾力の増進効果及び炎症緩和効果を持つ組成物を生産することができ、これを用いて、老化防止用薬学的組成物及び化粧料組成物として利用することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、低分子と高分子ヒアルロン酸と楡根皮から抽出した多糖類を含有する老化防止用組成物に関し、更に具体的には、高分子ヒアルロン酸、低分子ヒアルロン酸、及び楡根皮から抽出した多糖類抽出物を有効成分として含有する皮膚外用老化防止用薬学的または化粧料組成物に関する。

老化(aging)とは、生物が年を取るに従って表す現象であって、細胞、遺伝子、タンパク質の変化により、身体の生理機能が徐々に低下する現象を言う。皮膚(肌)の老化は、身体の成長が停止する時期である１７〜２５歳から徐々に現す。肌の老化が始まっても、表皮は、基底細胞の***によって変化(再生)するが、真皮は成長を停止する。これらの現象の主な理由は、肌内の水分の損失と共に、細胞内の炎症反応による細胞間物質の生体合成機能が低下するために表す。そのため、しわを減らし、老化を予防するためには、皮膚をしっとりと維持し、外部から皮膚を保護するのはもちろん、皮膚内の炎症反応を抑制しなければならない。

これを更に詳しく説明すると、皮膚を構成している複数層のうち、外部環境から身体を保護し、弾力があり、しっとりとした皮膚を維持させてくれる最も重要な部分は、表皮層である。この層は、外部物質の生体内への侵入を防ぎ、内部の生体水分の損失を防ぐ役割を担う。適量の水分を維持することは、皮膚の弾力性や柔軟性を維持するのに非常に重要である。また、肌の老化から、皮脂の分泌が低下して、油分が足りなくなり、皮膚の水分の蒸発を防止する能力が低下して、表皮が乾くなって、コジワが生じる。また、太陽の光のように、外部から皮膚に常に刺激が加わると、ケラチノサイトは、いろいろなサイトカインなどの化学物質を出し、その情報は、真皮にある細胞に渡され、繊維芽細胞の代謝を変化させる。また、サイトカインが血管を構成する血管内皮細胞に作用すれば、リンパ球などの免疫に関与する細胞が、炎症細胞として血管でコラゲナーゼやエラスターゼなど真皮の繊維の蛋白質を分解する酵素を分泌し、コラーゲンとエラスチンの分解が進まれる。その結果、新たに合成される繊維の蛋白質の量と分解される繊維の蛋白質の量との間のバランスが壊れ、このような反応が繰り返して、皮膚の弾力性が低下し、しわや皮膚の弛み現象が発生する。また、人体の老化が進行すれば、身体の免疫機能が低下し、皮膚が乾燥し、荒れながら、小さな細菌にも容易に感染して、深い炎症に進行されたり、皮膚の角化サイクルが長くなり、角質が厚くなり、ざらざらになってしまう。

炎症は、紫外線や活性酸素、遊離ラジカルなどの酸化的ストレスなどが炎症性因子を活性化させて発生し、様々な病気や肌の老化を引き起こす。炎症の特徴の一つは、プロスタグランジンを生成するシクロオキシゲナーゼ(ＣＯＸ)及びリューコトリエンを生成する５‐リポキシゲナーゼ経路によって代謝されるアラキドン酸(Arachidonic acid)の酸素添加反応の増加である。プロスタグランジン及びリューコトリエンは、炎症の媒介である。したがって、シクロオキシゲナーゼ及び/又はリポキシゲナーゼ活性を抑制するように設計された治療法は、最近の大きな関心事である。シクロオキシゲナーゼ酵素は、シクロオキシゲナーゼ‐１及びシクロオキシゲナーゼ‐２の２つの形態がある。後者の形態、すなわち、シクロオキシゲナーゼ‐２は、炎症の進行に重要な役割を果たすものと見なされる。また、シクロオキシゲナーゼ‐２酵素を抑制する場合は、不可逆的なシクロオキシゲナーゼ‐１抑制とは異なり、関連する副作用がなく、炎症を減らすことができ、効果的である。

もう１つの強力な炎症媒介物のナイトリック酸化物(Nitric oxide、ＮＯ)は、ＮＯ合成酵素(ＮＯＳ)によってＬ−アルジニンから生成され、ＵＶのようなストレスやエンドトキシン、サイトカインによって、多くのタイプの細胞から発生する。これらの炎症の刺激は、細胞内の誘導性ＮＯＳの発現を増加させ、ＮＯを発生させ、大食細胞を活性化させ、炎症反応を起こす。

本発明で使用されるヒアルロン酸(Hyaluronic acid)は、胎盤、動物の目や関節、鶏の官職などでも見出され、医薬品、化粧品、食品用に工業化されており、最近では、動物から誘発され得る感染症の懸念のため、微生物を利用した発酵法で生産されて用いられている。ヒアルロン酸は、D-glucuronic acidとN-acetyl-D-glucosamineがβ-１,３結合により連結された構造が交互に繰り返されて連結された鎖状構造からなっており、繰り返し単位の間は、β‐１,４結合により連結されている。ヒアルロン酸の分子量は、数十万から数百万dalton(Da)に至る分子の塊であり、非常に高い粘着性を備えている。ヒアルロン酸は、細胞を互いに接触させ、関節をスムーズにし、体全体、皮膚、臓器や細胞間を結合するか、又は支える役割を担う。したがって、これらは、人間の体のほぼすべての部分から見出されており、特に皮下脂肪層、関節部位、関節液、臍の緒、及び眼球の水晶体の構成物質で多く見出されている。ヒアルロン酸は、細胞間の間隔の維持、細胞の***と分化、移動、免疫調節などに関与するものと報告されている。人体の皮膚においてヒアルロン酸の量は、老化が進むと、減少すると報告されているが、これは、皮膚弾力の低下や含水率の減少の直接的な原因の１つとして考慮される。本発明は、最近、ヒアルロン酸の分子量に従って、生体内での作用機序と効能が異なって現すことを明らかにした。上記の結果を纏めると、高分子ヒアルロン酸は、皮膚の表面にフィルムを形成して、水分の損失を抑える効果を示す。一方、低分子ヒアルロン酸は、Caco‐２ cellを用いた細胞層透過実験において、高分子ヒアルロン酸がほとんど透過しない細胞層を１６.０％まで透過している。また、人工皮膚を用いた皮膚透過実験でも、低分子ヒアルロン酸は、約９０％のかなり高透過率を示しており、また、皮膚の水分量と経皮水分の損失量を測定した結果、高分子ヒアルロン酸のような優れた保湿効果を持っていることを確認した。

楡根皮(Ulmus macrocarpa Hance)は、ニレの根皮で、６月頃に根の皮を剥いて表皮を整えて、太陽に干して使用される。楡根皮(Ulmus davidiana)は、双子葉植物イラクサ目(Urticales)ニレ科(Ulmaceae)の落葉性の広葉樹喬木で、春楡、又は家楡とも呼ばれ、高さ約１０mに至る落葉性の喬木である。この葉は、広い楕円形であり、歯があり、春に薄い草色の小さな花が集まって咲く。ニレの漢字には、楡と呼ばれ、この皮は、楡皮又は楡白皮、根皮は、楡根皮と呼ばれる。この実は、蕪い又は蕪い仁と呼ばれる。この皮には、フラボノイド、サポニン、タンニン質(３％)と、大量の粘液質がある。楡根皮から抽出した多糖は、水分保持能と炎症緩和効果があると報告された。楡根皮抽出物は、更に小腸と膀胱の平滑筋の運動を強化させ、咳止め作用、収れん作用、及び抗炎症作用などをする。東洋医学の治療では、この皮を煎じて、胃の痛み、腰の痛みに服用したり、炎症薬として軟膏を作り、膿んだ傷に適用して使用される。

本発明は、低分子ヒアルロン酸、高分子ヒアルロン酸、及び楡根皮抽出物を、それぞれ単独で使用した上記の従来技術の問題点を克服するために鋭意研究努力した結果、皮膚透過性に優れ、皮膚内で保湿効果及びヒアルロン酸合成促進効果を示す低分子ヒアルロン酸、皮膚の外側の表面に保湿フィルム層を形成する高分子ヒアルロン酸、及び抗炎症効果に優れた楡根皮抽出物を混合した場合は、それぞれ単独で使用した場合よりも相乗した皮膚保湿効果、皮膚弾力増進効果と炎症緩和効果を持つことを確認し、本発明を完成することになった。

したがって、本発明の主な目的は、皮膚透過性に優れ、皮膚内で保湿及びヒアルロン酸合成促進効果を示す低分子ヒアルロン酸、皮膚の外側の表面の保湿フィルム層を形成する高分子ヒアルロン酸、及び抗炎症効果に優れた楡根皮抽出物を含有する老化防止用組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、皮膚保湿効果、皮膚弾力増進効果及び炎症緩和効果を持つ上記の老化防止用組成物を用いて、それぞれ単独で使用した場合より相乗した効果を持つ、老化防止用薬学的組成物又は化粧料組成物を製造することにある。

本発明の一様態によれば、本発明は、高分子ヒアルロン酸、低分子ヒアルロン酸、及び楡根皮多糖類の混合物を有効成分として含有する皮膚外用老化防止用薬学的組成物を提供する。本発明のヒアルロン酸は、下記式を有する。
ヒアルロン酸(hyaluronic acid)

本発明では、低分子ヒアルロン酸、高分子ヒアルロン酸、そして楡根皮から分離された多糖類の混合物を含有する組成物を製造しており、これらの皮膚保湿効果、皮膚弾力増進効果及び炎症緩和効果をそれぞれ試験した。その結果、上記の高分子量ヒアルロン酸と低分子量ヒアルロン酸、そして楡根皮から分離された多糖類を一定の割合で混合して使用する場合は、それぞれ高分子ヒアルロン酸、低分子ヒアルロン酸、又は楡根皮多糖類のみからなる組成物より予期せぬ格段に改善された老化防止効果を表すことを観察した。

本発明の上記の高分子ヒアルロン酸は、微生物発酵法や動物の臓器抽出法で製造できるが、望ましくは、Streptococcus属微生物、例えば、Streptococcus equi、Streptococcus zooepidemicusなどを培養して生産することができる。また、本発明の上記の低分子ヒアルロン酸は、上記の生産された高分子ヒアルロン酸を公知の方法により酸性条件で加水分解して製造することができる。具体的には、本発明は、上記の高分子ヒアルロン酸は、大韓民国特許公報(公告番号：１９８９‐０００３７０８)の方法によって、供試菌株であるstreptococcus equi。 KCTC １８７３を培地に接種して、２４時間培養した後、アルコールに沈殿精製して得た。上記の高分子ヒアルロン酸の平均分子量５００,０００ないし３,０００,０００ダルトンだった。本発明の上記の低分子ヒアルロン酸は、大韓民国特許公報(登録番号：１０‐０６６５９１６‐００００)の方法によって、高分子ヒアルロン酸を強酸性イオン交換樹脂で反応させ、アルコールに沈殿して得て、分子量は、５００ないし５０,０００ダルトンと測定された。

本発明の上記楡根皮多糖類は、楡根皮を完全に乾燥した後、本発明が属する技術分野で公知された任意の抽出方法を使用して抽出可能であり、望ましくは、水、リン酸緩衝溶液、弱塩基性水溶液、グリセリン、エチレングリコール及びプロピレングリコールなどの公知の溶媒を使用して抽出できる。具体的には、本発明では、大韓民国特許公報(登録番号：１０‐０４４５４３０‐００００)の方法によって、楡根皮から多糖類を抽出した。まず、楡根皮を完全に乾燥した後、乾燥重量につき５〜３０倍の体積量の抽出溶媒を加える。抽出溶媒は、水、リン酸緩衝液、弱塩基性水溶液、グリセリン、エチレングリコール及びプロピレングリコールからなる群から選ばれた１つ以上の溶媒を使用する。続いて、溶媒が蒸発することを防止するために、冷却コンデンサーを備えた抽出器で３０〜７０℃、４〜４８時間加熱して抽出するか、５〜３７℃で１〜１５日間の沈積させ、有効成分を抽出した後、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール及びアセトンからなる群から選ばれた１つ以上の溶媒に沈殿させて製造する。そうして製造された多糖類の分子量(Mw)は、１０,０００〜３５,０００の範囲にあり、固有の粘度は、８０〜１００dl / gの範囲にある。

本発明の老化防止用薬学的組成物において、上記の高分子ヒアルロン酸は、平均分子量５００,０００ないし３,０００,０００ダルトンインが望ましく、上記の低分子ヒアルロン酸は、平均分子量５００ないし５０,０００ダルトン、更に望ましくは、５００ないし１０,０００ダルトンインの方がよい。天然の生物学的物質内のヒアルロン酸の実際の分子量は、非常に急激なばらつきを有す。ヒアルロン酸の分子量を測定する場合、分析法によって、供給源からの分離方法によって、分子量が変わる可能性がある。

本発明の老化防止用薬学的組成物において、上記の低分子ヒアルロン酸は、組成物の総重量を基準として、０.１〜８０重量％、高分子ヒアルロン酸は、０.１〜７０重量％、そして楡根皮多糖類の混合物は、０.１〜７０重量％で含まれていることが望ましく、上記の低分子ヒアルロン酸は、組成物の総重量を基準として、１５〜７０重量％、高分子ヒアルロン酸は、１５〜６０重量％、そして楡根皮多糖類の混合物は、１５〜６０重量％で含まれている方が更に望ましい。本発明の実施例１では、上記の配合割合の範囲内でヒアルロン酸と楡根皮多糖類との混合物を製造した(表１)。

本発明の老化防止用薬学的組成物において、上記の組成物は、保湿効果を持つ。本発明の実施例１の実験例１は、保湿効果測定装備(corneometer CM825)を用いて、保湿効果を測定して、その結果、本発明の高分子ヒアルロン酸、低分子ヒアルロン酸、及び楡根皮多糖類を有効成分として含む組成物は、それぞれ高分子ヒアルロン酸、低分子ヒアルロン酸、又は楡根皮多糖類のみからなる組成物より予期せぬ格段に改善された保湿効果を表すことを観察した(表２)。

本発明の老化防止用薬学的組成物において、上記の組成物は、皮膚弾力増進効果を持つ。本発明の実施例１の実験例２では、弾性測定装備(cutometer MPA580)を用いて、皮膚弾力増進効果を測定して、その結果、本発明の高分子ヒアルロン酸、低分子ヒアルロン酸、及び楡根皮多糖類を有効成分として含む組成物は、それぞれ高分子ヒアルロン酸、低分子ヒアルロン酸、又は楡根皮多糖類のみからなる組成物より予期せぬ格段に改善された皮膚弾力増進効果を表すことを観察した(表３)。

本発明の老化防止用薬学的組成物において、上記の組成物は、抗炎効果を持つ。炎症反応において、プロスタグランジン及びリューコトリエンは、炎症の媒介であり、したがって、プロスタグランジンを生成するシクロオキシゲナーゼ(COX)‐２の酵素を抑制する場合は、非可逆的なシクロオキシゲナーゼ‐１の抑制とは異なり、関連する副作用がなく、炎症を減らすことができる[Kyung-Soo Nam、et al、Kor. J. Pharmacogn., 35(2), pp147-151, 2004]。もう１つの強力な炎症媒介物であるナイトリックオキシド(Nitric oxide、NO)は、NO合成酵素(NOS)によってL‐アルジニンから生成され、UVのようなストレスやエンドトキシン、サイトカインによって、多くのタイプの細胞から発生する。これらの炎症の刺激は、細胞内の誘導性NOSの発現を増加させて、NOを発生させ、大食細胞を活性化させて、炎症反応を引き起こす。本発明の実施例１の実験例３では、シクロオキシゲナーゼ(COX)‐２酵素やNOS遺伝子の逆転写重合反応を行って、炎症抑制効果を測定した。その結果、本発明の高分子ヒアルロン酸、低分子ヒアルロン酸、及び楡根皮多糖類を有効成分として含む組成物は、それぞれ高分子ヒアルロン酸、低分子ヒアルロン酸、又は楡根皮多糖類のみからなる組成物より予期せぬ格段に改善された炎症抑制効果を表すことを観察した(表５)。

本発明の老化防止用薬学的組成物において、上記の組成物は、自体が老化防止活性を持っていると判明されて完成されたものであって、皮膚、毛髪などに塗布して使用するいずれの剤型であってもよいが、望ましくは、クリーム、ゲル、パッチ、スプレー、軟膏劑(Ointments)、硬膏劑(Plasters)、ローション剤、リニメント剤、パスタ剤及びカタプラズマゼからなる群から選ばれたものがよい。本発明による老化防止用薬学的組成物は、外用製剤であるので、人体に吸収され、副作用を示す恐れもなく、また、皮膚の表面にどのような刺激も与えないため、上記の高分子ヒアルロン酸、低分子ヒアルロン酸、及び楡根皮多糖類の混合物の使用量は、薬学的に許容可能な添加剤と均質に混合可能な程度なら問題ない。本発明の製造例では、高分子ヒアルロン酸、低分子ヒアルロン酸、及び楡根皮多糖類の混合物を１０重量％含有する柔軟スキン、栄養ローション、栄養クリーム、及び親水性の軟膏剤を製造し、製造された栄養ローションにより皮膚の保湿や皮膚の弾力性の改善効果に対して実験した結果、本発明の組成物が含まれていない栄養ローションに比べて、格段に改善された効果を表すことを観察した(表９、表１０)。

また、本発明による老化防止用薬学的組成物の使用量は、皮膚全体を完全に塗布できる程度に使用すればよく、特に量が定められるわけではなく、使用回数も使用しているユーザーの便宜に沿って随時に皮膚に塗布すればよい。

次に、本発明で使用可能な添加物について考察してみる。

本発明で使用可能な添加剤は、一般的に軟膏剤やクリームの製造に使用されるものであり、本発明が属する技術分野に知られているものであれば、特別な制限なしに利用可能である。例えば、ワセリン、流動パラフィン、パラフィン、プラスティーベース(plastibase)、ラード、植物油、ワックス、精製ラノリンなどのような油脂性基剤、ポリエチレングリコールなどのような水溶性基剤、吸収軟膏、親水軟膏のような乳剤性基剤などがある。また、これらの添加物の酸化防止剤、防水剤、保湿剤、軟化補助剤などを更に含ませて、本発明で使用可能な製剤を作成することもある。

本発明の他の様態によれば、本発明は、高分子ヒアルロン酸、低分子ヒアルロン酸、及び楡根皮多糖類の混合物を有効成分として含有する老化防止用化粧料組成物を提供する。

本発明の老化防止化粧料組成物において、上記の組成物は、保湿、皮膚弾力の増進、及び抗炎症効果を持つ。

本発明の老化防止化粧料組成物において、上記の組成物は、自体が老化防止活性を持っていると判明されて完成されたものであって、皮膚、毛髪などに塗布して使用するいずれの剤型であってもよいが、望ましくは、スキンローション、スキンソプノ、スキントナー、アストリンゼント(収斂剤)、ローション、ミルクローション(油液)、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、パック、石鹸、クレンジングフォーム(洗顔料)、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディローション、及びボディクレンザーからなる群から選ばれたものがよい。

本発明によれば、低分子ヒアルロン酸、高分子ヒアルロン酸及び楡根皮から抽出した多糖類を一定の割合で混合して、それぞれ単独で使用するより優れた皮膚保湿効果、皮膚弾力の増進効果及び炎症緩和効果を持つ組成物を生産することができ、これを用いて、老化防止用薬学的組成物及び化粧料組成物として利用することができる。

以下、実施例に基づいて本発明を更に詳しく説明することにする。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであるので、本発明の範囲が、これらの実施例によって制限されるものとは解釈されない。

実施例１．配合比によるヒアルロン酸と楡根皮多糖類との混合物の製造及び効果の実験
高分子ヒアルロン酸[平均分子量５００,０００ないし３,０００,０００ダルトン、大韓民国特許公報(公告番号：１９８９‐０００３７０８)の方法に従って製造]、低分子ヒアルロン酸(平均分子量５００ないし１０,０００、大韓民国特許公報[登録番号：１０‐０６６５９１６ ‐ ００００)の方法に従って製造]、及び楡根皮多糖類[大韓民国特許公報(登録番号：１０‐０４４５４３０‐００００)の方法に従って製造]を、下記表１の割合(重量％)で混合し、精製水に溶かし、固形分が１g / L(最終濃度０.１％)になるように製造した。

実験例１．保湿効果の測定(Corneometer 825)
上記の表１の配合比によって製造された各々の混合物の保湿効果を測定するために、実験結果に影響を及ぼすほどの皮膚疾患を持っていない２２〜３３歳の男女２０(男性５人、女性１５人)を対象として実験した。各対象の試料の適用前に、実験部位を水で洗浄後、３０分間、外部環境に適応させた。実験環境条件は、室温２２〜２４℃、室内湿度４５〜５０％に維持した同じ場所で施した。試料をそれぞれ１０uLずつ上腕の内側に２×２？に塗布し、１分間乾燥した。その後、各塗布部位に精製水を２０uLずつ塗布し、キムワイプ(kimwipes)で水分をふき取った直後、１分間隔で(０分、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、０９分)各々の塗布部位の皮膚の表面の静電容量をCorneometer CM825(Courage and Khazaka、Koln、Germany)で測定した。下記式１を用いて、保湿効果を測定し、表２にその結果を表した。単位は、Corneometer value(Cv)で示した。

その結果、本発明の高分子ヒアルロン酸、低分子ヒアルロン酸、及び楡根皮多糖類を有効成分として含む組成物は、各々高分子ヒアルロン酸、低分子ヒアルロン酸、又は楡根皮多糖類のみからなる組成物よりも改善された保湿効果を表すことを観察した。

実験例２．皮膚弾力効果の測定試験
持続的な音圧を測定時間の間に皮膚に加えて探針(probe)の中に皮膚が吸い込まれた後、音圧が削除されると、皮膚が元の姿に戻る原理を用いて、弾力性を測定する装備であるCutometer MPA580(Courage and Khazaka、 Koln、 Germany)を使用して、皮膚の弾力性をR５値を用いて測定した。上記の機器に連結された２ mm径の探針を除毛された皮膚に密着させ、非侵襲的に測定した。試料の適用前の皮膚の弾力度を皮膚弾力測定器を用いて測定し、各々の試料２５Ｍｌ/cm²を上腕部に塗布した。塗布後１時間経過後の皮膚の弾力性を測定した。温度２０℃、湿度５０％に調整される恒温、恒湿室で施した。被試験者は、２０代〜３０代の男女、２０人を対象として施し、下記式２を使用して、弾力改善率を比較計算した。実験の結果は、下記表３に記載している。

その結果、本発明の高分子ヒアルロン酸、低分子ヒアルロン酸、及び楡根皮多糖類を有効成分として含む組成物は、各々高分子ヒアルロン酸、低分子ヒアルロン酸、又は楡根皮多糖類のみからなる組成物より予期せぬ格段に改善された皮膚弾力増進の効果を表すことを観察した。

実験例３．炎症抑制効果の測定(iNOS及びCOX‐２遺伝子発現阻害効果の測定)
マウス(mouse)の大食細胞であるRaw264.7細胞(ATCC TIB‐71)にリポポリサッカライド(lipopolysaccharide)を処理して、人為的にCOX 2(Cyclooxygenase 2)遺伝子の発現を増加させた後、試料(実施例１‐１ないし１‐１４、及び比較例)による阻害能をRT‐PCRの方法を用いて測定した(Green L. et al., Anal. Biochem, 126、pp131‐138, 1982)。１０％FBS‐DMEM培地に８×１０⁵の細胞を懸濁して、１００mmディッシュ(dish)に接種して取り付けた。一日の後、試料(実施例１‐１ないし実施例１‐１４、及び比較例)を２５ug/mlの濃度で処理して、１８時間培養(incubation)したのち、１ug/ mlのリポポリサッカライド(lipopolysaccharide、LPS 、シグマ社)を処理して、８時間の間培養(incubation)した。細胞の培地を除去し、トライゾル(Trizol、インビトロゼン社)１mlを添加して、インビトロゼン社のRNA分離法に基づいてRNAを分離した後、２６０nmで定量化して、逆転写重合反応(Reverse transcription-polymerase chain reaction)を施した。逆転写重合反応は、オールインワン逆転写重合反応キット(All‐in‐one RT‐PCR kit、スーパーバイオ社)を使用し、プライマー(primer)との反応条件は、下記表４に表した。

オールインワン逆転写重合反応キットのマニュアルに基づいて実験を進めており、その結果を下記表５に表した。

製造例１．柔軟スキンの製造
実施例１‐４の混合物を含有した柔軟スキンの製造例を下記表６に表した。

剤型例１
エタノールにハイドロジェネイテッドキャスターオイル、メチルパラベン、及び組合香料を溶解し、残りの要素を溶解した精製水に投入して溶解した。

比較剤型例１
原料物質１を除いて、上記の剤型例１と同様な方法により製造した。

製造例２．栄養ローションの製造
実施例１‐４の混合物を含有したローションの製剤例を、下記表７に表した。

剤型例２
上記のような含量の原料を、一般的な乳化方法によりオイルに溶解される成分を油性成分とし、精製水に溶解される成分を水性成分として、一定の温度(８０〜８５℃)で水性成分と油性成分とを一般のホモミキサーで均質混合する乳化工程を経て、増粘剤(カボモ)を中和したのち、冷却し、原料物質１を加えた後、脱泡過程を経て製造を完了した。

比較剤型例２
原料物質１を除いて、上記の剤型例２と同様な方法で製造した。
製造例３．栄養クリームの製造
実施例１‐４の混合物を含有した栄養クリームの製剤例は、下記表８に表した。

剤型例３
上記のような含量の原料を、一般的な乳化方法によりオイルに溶解される成分を油性成分とし、精製水に溶解される成分を水性成分として、一定の温度(８０〜８５℃)で水性成分と油性成分とを一般のホモミキサーで均質混合する乳化工程を経て、増粘剤(カボモ)を中和したのち、冷却し、原料１を加えて、脱泡する過程を経て製造を完了した。

比較剤型例３
原料物質１を除いて、上記の剤型例３と同様な方法で製造している。

製造例４．親水性外用の製造

剤型例４
上記のような含量の原料を、一般的な乳化方法によりオイルに溶解される成分を油性成分とし、精製水に溶解される成分を水性成分として、一定の温度(８０〜８５℃)で水性成分と油性成分とを一般のホモミキサーで均質混合する乳化工程を経て、増粘剤(カボモ)を中和したのち、冷却し、原料物質１を加えて、脱泡する過程を経て製造を完了した。

比較剤型例４
原料物質１を除いて、上記の剤型例４と同様な方法で製造した。

臨床試験例１．皮膚の保湿実験
１２人の被験者を対象として実験した。これらを朝に石鹸や一体の洗浄剤を使用せずに、シャワーを浴びた後、エリド皮膚科学研究所を訪問して、左/右の前腕部の手首から肘までの部位を流れる水のみで洗浄するようにした。試験部位(前腕部)は、実験対象者の手首から５cm距離の前膊屈側の部位とし、試験部位に、直径２cmの正方形を１.５cm間隔で合計６つを描いた。試験部位は、右側の前腕部と左側の前腕部に、それぞれ３つずつランダムに選定した。
恒温恒湿で３０分間待機した後、試験部位をCorneometer CM825(Courage＆Khazaka、Germany)で５回測定し、最大最小を除いた３つの測定値の平均を求めた(baseline)。
試験部位に剤型例２と比較剤型例２の試料を、それぞれ５μｌの量で塗布し、試料を塗布後、９分３０秒後に精製水を塗布した。精製水を塗布してから３０秒後、キムワイプスで水分を除去した後、再び１分間隔(０分、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、０８分)でCorneometer(CM825 Courage＆ Khazaka、Germany)で試験部位を５回測定し、最大最小を除いた３つの測定値の平均を求めた。
試料塗布前(baseline、０分)、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分経過後に、Corneometer測定結果を用いて、各々の測定時間での測定結果と試料塗布前の測定結果との差を求め、時間の経過に従って、試料塗布前に比べて、保湿改善率(％)を計算して、下記表１０に表した。

上記の結果、表１０に示すように、本発明の低分子ヒアルロン酸、高分子ヒアルロン酸、及び楡根皮抽出物の混合物を含有する剤型例２のローションが、比較剤型例２のローションに比べて、皮膚状態の改善効果により、皮膚弾力効果が非常に優れていることが分かった。

臨床試験例２．皮膚弾力度の改善効果
皮膚のしわに対する上記の混合物の影響を実験するために、剤型例２及び比較剤型例２のローションを２０歳〜５５歳の女性層でかつ普通肌、脂性肌、乾性肌、複合性肌の所有者の２０人に、顔の左側部には、剤型例２のローションを、顔の右側部には、比較剤型例２のローションを、朝、夕方に１日２回塗布して使用させた後、２週間及び４週間後に、皮膚弾力の測定機器(Ballistometer)を用いて、皮膚の弾力性を測定して、下記表１１に表した。

上記の結果、表１１に示すように、本発明の低分子ヒアルロン酸、高分子ヒアルロン酸、及び楡根皮抽出物の混合物を含有する剤型例２のローションが、比較剤型例２のローションに比べて、皮膚状態の改善効果により、皮膚弾力効果が非常に優れていることが分かった。

以上で述べたように、本発明によれば、低分子ヒアルロン酸(平均分子量５００ないし５０,０００ダルトン)、高分子ヒアルロン酸(平均分子量５００,０００ないし３,０００,０００ダルトン)、及び楡根皮多糖類抽出物を一定の割合で混合して、それぞれ単独で使用した場合より優れた皮膚保湿効果、皮膚弾力増進効果及び炎症緩和効果を持つ組成物を生産することができる。本発明の上記組成物は、Corneometer825を使用した保湿効果の測定において、各成分を単独で使用した場合より優れた保湿効果を示し、また、皮膚弾力試験、及び抗炎症試験においても、各要素を単独で使用した場合より優れた弾力増強効果及び抗炎症効果を示したので、これを用いて、老化防止用薬学的組成物及び化粧料組成物として利用することができる。

Claims

高分子ヒアルロン酸、低分子ヒアルロン酸、及び楡根皮から抽出した多糖類を有効成分として含有する皮膚外用老化防止用薬学的組成物。
上記高分子ヒアルロン酸は、平均分子量が５００,０００ないし３,０００,０００ダルトンであり、上記低分子ヒアルロン酸は、平均分子量が５００ないし５０,０００ダルトンであることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用老化防止用薬学的組成物。
上記低分子ヒアルロン酸は、組成物の総重量を基準として、０.１〜８０重量％、高分子ヒアルロン酸は、０.１〜７０重量％、そして、楡根皮から抽出した多糖類は、０.１〜７０重量％と含まれていることを特徴とする請求項１に記載の皮外用の老化防止用薬学的組成物。
上記組成物は、保湿、皮膚弾力の増進、及び抗炎症効果を持つことを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用老化防止用薬学的組成物。
上記組成物は、クリーム、ゲル、パッチ、スプレー、軟膏劑、硬膏劑、ローション剤、リニメント剤、パスタ剤、及びカタプラズマ剤から成る群から選ばれたいずれか一つの剤型であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用老化防止用薬学的組成物。
高分子ヒアルロン酸、低分子ヒアルロン酸、及び楡根皮から抽出した多糖類を有効成分として含有する老化防止用化粧料組成物。
上記組成物は、保湿、皮膚弾力の増進、及び抗炎症効果を持つことを特徴とする請求項６に記載の皮膚外用老化防止用化粧料組成物。
上記組成物は、スキンローション、スキンソプノ、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、パック、石鹸、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディローション、及びボディークレンザーからなる群から選ばれたいずれか一つの剤型であることを特徴とする請求項６に記載の皮膚外用老化防止用化粧料組成物。