CN111148506A

CN111148506A - 在化妆品和/或营养保健品中使用Let-7b抑制剂的方法

Info

Publication number: CN111148506A
Application number: CN201880062148.4A
Authority: CN
Inventors: V·巴尔代; C·雷梅尔米耶
Original assignee: BASF Beauty Care Solutions France SAS
Current assignee: BASF Beauty Care Solutions France SAS
Priority date: 2017-10-03
Filing date: 2018-10-02
Publication date: 2020-05-12
Also published as: FR3071742B1; FR3071742A1; WO2019069007A1

Abstract

本发明涉及在化妆品和/或营养保健品中使用let‑7b抑制剂的方法，并且尤其涉及具有let‑7b抑制能力的沙棘籽的水提取物的化妆品或营养保健品用途，用于抑制let‑7b在皮肤和/或粘膜中的表达以维持或改善其生物力学特性，尤其是其紧致度、弹性和/或密度。

Description

在化妆品和/或营养保健品中使用Let-7b抑制剂的方法

本发明涉及在化妆品和/或营养保健品领域中使用微RNAhsa-Let-7b-5p(下文称为Let-7b)的潜在抑制剂的方法。

本发明还涉及新颖的化妆品和/或营养保健品成分的用途，并且还涉及包含该成分的组合物，用于抑制Let-7b的表达，特别是在健康皮肤和/或健康粘膜中的表达，和/或用于维持和/或改善健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性。

皮肤的结构和特性在复杂的生物、物理和生物力学过程的影响下发生变化，从而导致真皮的弹性、紧致度和密度下降。这导致身体皮肤，特别是面部皮肤无美感地松弛和下垂。

从结构的角度来看，皮肤生物力学特性的损害通常是由真皮的细胞外基质的组构变化所致。这些变化特别包含糖胺聚糖(或GAG)、特别是硫酸软骨素的合成的失调，硫酸软骨素参与皮肤的结构功能和生理调控。这些变化还包括胶原蛋白和弹性蛋白纤维的聚合和交联方面的损害。在这种情况下，这些纤维网络失去其生物力学特性，皮肤失去其支撑功能并变得下垂。

这些现象一方面是由内在因素，特别是遗传因素引起的，另一方面也是由外在因素，如紫外线和/或吸烟和/或污染引起的。后面这些因素可以显著地导致表观遗传修饰，在其中可能存在由微RNA进行的调控。

内源性微RNA(或miRNA)是一类小的非编码RNA，通常具有20至24个核苷酸的长度，在转录后水平下调基因表达。它们在碱基-碱基的基础上连接其靶mRNA的3′-UTR区，从而导致其降解并因此导致细胞中相应蛋白质翻译的减少或抑制。在2000年代，早期研究证明这些分子起着生物调节因子的作用，并参与了活体生物的许多过程。对表观遗传调控的理解和对miRNA靶向的mRNA的发现一直以来都是重大课题，特别是在治疗和美容领域中。

计算算法辅助的序列比对预测是为此而使用的方法之一。然而，实验结果表明，比对，即使是完美的比对，也无法构成miRNA与其靶标之间存在体内相互作用的绝对证据。实际上，由于miRNA和mRNA的表达具有细胞特异性，因此通过序列比对进行预测受以下事实阻碍：该预测未考虑到细胞中两个实体的共表达或不存在。

申请人发现，Let-7b表观遗传性地下调成纤维细胞中以下五种蛋白质的合成：原纤维蛋白1(FBN1)、木糖基转移酶1(XYLT1)、TGFβ受体2(TGFBR2)、整联蛋白β3(ITGB3)和硫酸软骨素合酶3(CHSY3)(参见实施例2)。

蛋白质CHSY3和XYLT1负责合成硫酸软骨素(如核心蛋白聚糖(decorin)和双糖链蛋白聚糖(biglycan))，它们是组装糖胺聚糖(GAG)链所必需的，糖胺聚糖链本身参与了细胞外基质内胶原蛋白纤维和弹性纤维的组构。

TGFBR2是TGF-β信号传导途径中的两个受体之一。它在瘢痕形成和组织修复的调控中起作用。而且，TGFBR2不表达导致了称为疤痕挛缩的现象减慢，并延缓了细胞外基质内真皮胶原蛋白的重构。

FNB1是肌原纤维的主要组分之一，用作细胞外基质内在弹性纤维合成期间供原弹性蛋白沉积的纬线。

ITGB3形成整联蛋白复合物的一部分，并通过与原纤维蛋白1结合而参与细胞-基质相互作用，从而影响细胞外基质的沉积和真皮的3D结构。

申请人因此发现，Let-7b的增加，除了下调真皮中胶原蛋白的合成以外，在真皮细胞外基质的组构损失中也起主要作用，特别是在胶原蛋白纤维、弹性纤维和GAG的组构中起主要作用。该miRNA也是造成健康皮肤和/或健康粘膜的紧致度、弹性和密度降低的原因。

如专利申请EP 2 721 408中所阐述的，申请人已经发现，细胞外基质(ECM)的分子在与ECM接触的细胞中以其天然形式合成。它们从细胞内区室中分泌出细胞。在许多成熟现象之后，它们进行自身组构和排列而形成ECM的网络。然后，它们处于其功能形式。一些化妆品活性成分使得可以全面刺激ECM胶原蛋白的合成，但是不会显示出任何胶原蛋白功能的改善，即既不会显示出ECM中胶原蛋白含量的增加，也不会显示出经组构的胶原蛋白纤维含量的增加。申请人还发现，一些成分改善了胶原蛋白的功能性，即ECM中胶原蛋白纤维的组构质量和/或ECM中组构的胶原蛋白纤维的量，但是没有测量到任何原胶原合成的增加。因此，在细胞内和/或细胞外基质中测得的培养细胞的ECM分子高度合成不一定反映为功能分子的量更大。

因此，本发明还涉及Let-7b抑制剂用于改善细胞外基质的分子功能性的化妆品和/或营养保健品用途。因此，本发明涉及Let-7b抑制剂用于维持和/或改善细胞外基质的组构质量，和/或用于维持和/或改善细胞外基质的经组构的分子、特别是胶原蛋白纤维和/或弹性纤维的量，和/或用于维持和/或增加糖胺聚糖、特别是硫酸软骨素的合成的用途。

因此，Let-7b表达抑制剂的化妆品和/或营养保健品用途使得可以维持和/或改善健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性，优选地健康皮肤和/或健康粘膜、尤其是健康真皮的紧致度和/或弹性和/或密度。r

这种新颖化妆品靶标已经得到鉴别，于是有必要确定一种用于测试潜在抑制剂的新颖手段。

实际上，如上所述，miRNA如Let-7b具有细胞特异性表达。因此，申请人开发了一种使用Let-7b的潜在抑制剂的方法，该方法使得可以考虑到miRNA和mRNA的细胞特异性表达。

借助于后者，申请人已经发现沙棘(Hippophae rhamnoides L.)籽的水提取物(下文简称为沙棘)是Let-7b表达抑制剂，就其针对以下的化妆品和/或营养保健品用途而言特别有利：用于维持和/或改善健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性，特别是用于维持和/或增加健康皮肤和/或健康粘膜、尤其是健康真皮的紧致度和/或弹性和/或密度，和/或用于维持和/或改善细胞外基质的组构质量，和/或用于维持和/或增加细胞外基质的经组构的分子、特别是胶原蛋白纤维和/或弹性纤维的量，和/或用于维持和/或增加糖胺聚糖、特别是硫酸软骨素的合成。

沙棘(也称为鼠李)，是发现于欧洲(特别是德国)和亚洲(特别是中国)的木本植物物种，属于胡颓子科(Elaeagnaceae)。

在藏族传统医学中海鼠李果的使用已有一千多年的历史，该植物广泛用于中国传统医学中，特别是用于治疗心血管疾病。希腊人还出于其镇痛特性而使用沙棘果实作为对胃痛和坏血病的治疗。

来自籽的油由于其多不饱和脂肪酸含量高，因此得到非常广泛的使用，特别是作为抗衰老剂用于化妆品中，而且还用作食品补充剂或用于皮肤病学中治愈烧伤。

由沙棘籽生产油会产生由籽的含水级分组成的残留物。通常将后一种级分丢弃，并构成了重大的物质损失。特别出乎意料的是，申请人已经发现，这种迄今很少进行研究的从植物中获得的含水级分具有构成本发明主题的许多活性物的潜力。

专利FR 2 840 809、JP 4 933 768和JP 4 495 925披露了沙棘果实的亲水性级分作为抗衰老剂的用途。然而，这些专利都未披露沙棘籽的水提取物的用途。

专利申请EP 2 282 750描述了由超临界CO₂提取沙棘果产生的，通过水提取进一步提取的残留物的用途，用于维持健康皮肤，减轻皮肤衰老，用于维持和改善皮肤弹性，或作为促进皮肤再生和疤痕形成的有效成分。然而，所述专利申请并未披露沙棘籽的水提取物的化妆品用途。

专利KR 101 276 141披露了一种提取沙棘籽的方法，该方法使得可以去除油性化合物，该方法包括使用C₁-C₄醇作为提取溶剂，并且使用硅藻土进行真空过滤。所获得的提取物具有抗氧化性和抗菌特性，并且特别地可以用作防止皮肤衰老的组合物中的活性成分。然而，所述专利并未披露沙棘籽的水提取物用于抑制Let-7b表达以维持和/或改善皮肤生物力学特性的化妆品用途。

因此，就申请人所知，没有现有技术披露沙棘籽的水提取物的化妆品和/或营养保健品用途，用于维持和/或改善皮肤的生物力学特性，特别是用于维持和/或增加皮肤，尤其健康真皮的紧致度和/或弹性和/或密度，和/或用于维持和/或改善细胞外基质的组构质量，和/或用于维持和/或增加细胞外基质的经组构的分子、特别是胶原蛋白纤维和/或弹性纤维的量，和/或用于维持和/或增加糖胺聚糖、特别是硫酸软骨素的合成。

本发明的第一方面在于提供了使用Let-7b抑制剂的方法。

本发明的第二方面还在于提供了新颖的化妆品和/或营养保健品活性成分，该成分能够抑制Let-7b(特别是在皮肤中)的表达。

此类成分具有以下优点：维持和/或改善健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性，特别是健康皮肤和/或健康粘膜、尤其是健康真皮的紧致度和/或弹性和/或密度，和/或维持和/或改善细胞外基质的组构质量，和/或维持和/或改善细胞外基质的经组构的分子、特别是胶原蛋白纤维和/或弹性纤维的量，和/或维持和/或增加糖胺聚糖、特别是硫酸软骨素的合成。

本发明的另一方面还在于特别是在化妆品组合物的生产中使用沙棘的无价值级分。

这种新颖的化妆品活性成分的优点是其对于皮肤，特别是头皮和/或粘膜而言是局部可接受的，它是无毒的，容易获得，并且可以容易地以工业规模生产和包装。

本发明的第一主题是在一种在化妆品和/或营养保健品中使用Let-7b抑制剂的方法，包括以下步骤：

a)使靶细胞与Let-7b的潜在抑制剂进行接触，

b)对Let-7b的表达进行定量，

c)在Let-7b的表达降低的情况下选择Let-7b的该潜在抑制剂，

d)使用所选的Let-7b的潜在抑制剂作为化妆品和/或营养保健品中的活性成分。

就本发明的目的而言，术语“潜在抑制剂”是指植物、动物和/或原核生物材料的任何提取物，以及源自化学合成的任何分子或分子混合物及其混合物。优选地，潜在抑制剂是植物生物材料的提取物。

使潜在抑制剂接进行触后，通过RT-qPCR测得的Let-7b的量低于在相同或类似的温度、接触时间和操作条件下未使潜在抑制剂进行接触的情况下测得的量时，选择这种提取物和/或这种合成分子作为“Let-7b抑制剂”。优选地，与不存在根据本发明的潜在抑制剂的情况下测得的Let-7b的量相比，在潜在Let-7b抑制剂的存在下，它为至少10％，更优选地为至少30％的抑制。

术语“Let-7b”应理解为“has-Let-7b-5p”。在SEQ ID NO：1中描述了这种微RNA的序列。

步骤a)对应于进行接触，即向靶细胞和/或向所述靶细胞的培养基中添加潜在抑制剂。优选地，靶细胞是成纤维细胞，优选人类，优选健康的。

有利地，成纤维细胞是表达Let-7b的那些；更优选地，这些成纤维细胞源自皮肤***。

就本发明的目的而言，术语“靶细胞”意指靶蛋白和/或其相应的mRNA与Let-7b在其中共表达的所有细胞。

就本发明的目的而言，措辞“靶蛋白和/或其相应的mRNA”意指其表达受Let-7b调控的所有蛋白和/或编码这些蛋白的mRNA。优选地，待调控的蛋白和/或其相应的mRNA为原纤维蛋白1(FBN1)和/或木糖基转移酶1(XYLT1)和/或TGFβ受体2(TGFBR2)和/或整联蛋白β3(ITGB3)和/或硫酸软骨素合酶3(CHSY3)，优选为木糖基转移酶1(XYLT1)和/或整联蛋白β3(ITGB3)和/或硫酸软骨素合酶3(CHSY3)，更优选地为木糖基转移酶1(XYLT1)和/或硫酸软骨素合酶3(CHSY3)。

除非另有说明，否则术语“健康”细胞，特别是“健康”成纤维细胞意指未显示出任何病理的细胞，特别是成纤维细胞。

靶细胞优选为成纤维细胞。有利地，成纤维细胞是表达Let-7b的那些；更优选地，这些成纤维细胞源自皮肤***。

根据本领域技术人员已知的常规培养方法预培养靶细胞。优选地，在

培养基

中培养靶细胞。

根据本发明的方法的有利的实施方案，潜在抑制剂存在的浓度范围按Let-7b抑制剂的重量相对于培养基的体积计为1×10^-4％至10％(w/v)，优选为0.001％至0.1％(w/v)，更优选地为0.003％至0.02％(w/v)。有利地，潜在抑制剂的试验浓度按Let-7b抑制剂的重量相对于培养基的总体积计为0.003％至0.02％(w/v)。

优选地，进行接触进行12小时至72小时范围内的时段。有利地，进行接触持续约48小时。

有利地，在20℃至45℃范围内的温度下，优选在环境温度下，优选在约37℃下进行接触。

以举例且非限制性的方式，可以根据实施例3.1中详述的方案来培养细胞。

步骤b)，称为“量化步骤”，是旨在测量Let-7b表达的步骤。可以使用任何已知的分子生物学测量方法来进行。量化步骤是通过测量Let-7b的量进行直接量化和/或通过测量受Let-7b调控的蛋白质和/或其相应的mRNA的量进行间接量化。

可以是通过测量Let-7b的量，特别是通过在RNA芯片上测量和/或通过使用实时逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR或实时RT-PCR)测量来进行直接量化。

也可以是通过测量靶蛋白和/或其相应的mRNA的量来进行间接量化。蛋白和/或其相应的mRNA的量与Let-7b的表达水平呈负相关。靶mRNA的量化可以通过在RNA芯片上测量和/或通过使用实时逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR或实时RT-PCR)测量来进行。靶蛋白的量化可以通过蛋白质印迹法(Western blotting)进行。

优选地，通过使用RT-qPCR直接量化来进行Let-7b表达的量化。

以有利且非限制性的方式，步骤b)可以根据实施例3.2中描述的方案进行。

步骤c)，称为“选择步骤”，包括步骤b)的结果相对于对Let-7b的抑制呈阳性的一种或多种对照和/或相对于对Let-7b的抑制呈阴性的一种或多种对照和/或它们之间具有潜在活性的几种物质之间和/或相对于不存在任何添加到培养基和/或细胞中的物质的情况的比较。优选地，相对于在不存在任何添加到培养基和/或细胞中的物质的情况下测得的量进行比较。

有利地，在本发明的上下文中，申请人认为可以在筛选期间，针对可以描述为“强烈”的Let-7b合成抑制进行潜在活性分子的选择。就本发明的目的而言，术语“强烈抑制，，意指大于或等于参考活性的30％的任何抑制。该参考活性是在相同或类似的温度、接触时间和操作条件下，在还未使靶细胞与潜在活性物质进行接触的情况下测量的。

在根据本发明的利用方法的一个优选实施方案中，Let-7b抑制剂是沙棘籽的水提取物。

步骤d)对应于使用所选的Let-7b抑制剂作为化妆品和/或营养保健品中的活性成分。

本发明的主题还是如上所述的在化妆品和/或营养保健品中使用Let-7b抑制剂的方法，其中Let-7b抑制剂用于维持和/或改善健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性，特别是用于维持和/或改善健康皮肤和/或健康粘膜、特别是健康真皮的紧致度和/或弹性和/或密度。

本发明的主题还是如上所述的在化妆品和/或营养保健品中使用Let-7b抑制剂的方法，其中Let-7b抑制剂用于维持和/或改善健康皮肤和/或健康粘膜、尤其是健康真皮的紧致度和/或密度。

本发明的主题还是如上所述的在化妆品和/或营养保健品中使用Let-7b抑制剂的方法，其中Let-7b抑制剂用于维持和/或改善细胞外基质的组构质量，和/或用于维持和/或改善细胞外基质的经组构的分子、特别是胶原蛋白纤维和/或弹性纤维的量，和/或用于维持和/或增加糖胺聚糖、特别是硫酸软骨素的合成。

本发明的主题还是一种沙棘籽的水提取物的化妆品和/或营养保健品用途，用于抑制Let-7b在健康皮肤和/或健康粘膜中的表达，和/或用于维持和/改善健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性，特别是健康皮肤和/或健康粘膜、尤其是健康真皮的紧致度、弹性和/或密度。

本发明的主题还是一种美容护理方法，包括向健康皮肤，特别是向健康头皮和/或健康粘膜施用，优选局部施用沙棘籽的水提取物和/或包含沙棘籽的水提取物的化妆品组合物，以抑制Let-7b在健康皮肤和/或健康粘膜中的表达，或维持或改善健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性，尤其是维持或改善健康皮肤和/或健康粘膜、尤其是健康真皮的紧致度、弹性和/或密度。可以在健康的身体和/或面部和/或头皮的全部或一部分上，优选在腿部、大腿、手臂、腹部、颈纹、颈部、腋窝，整个或部分面部，优选在脸颊和/或面部棱角区域上进行施用。

具体而言，实现该化妆品和/或营养保健品用途或该方法以维持或改善细胞外基质的组构质量，维持或改善细胞外基质的经组构的分子、特别是胶原蛋白纤维和/或弹性纤维的量，和/或维持或增加糖胺聚糖、特别是硫酸软骨素的合成。

根据本发明的提取物是籽提取物。出于本发明的目的，籽对应于不含果肉部分的沙棘果(或果实)(也称为果皮)。

提取物可以通过本领域已知的植物水提取法获得，例如通过将籽的至少一部分以相对于籽部分和溶剂的总重量优选为按重量计1％至90％(w/w)，优选为按重量计1％至50％(w/w)，更优选地为按重量计5％至20％(w/w)的量浸渍在水或溶剂混合物例如水/醇、水/乙二醇或水/多元醇中。例如，提取物可以通过在水/乙醇混合物中提取而获得，特别是按体积计各自的比例为70/30。优选地，通过使用水作为唯一溶剂进行水提取来获得提取物。

就本发明的目的而言，术语“水提取”意指用相对于水溶液的总重量包含按重量计至少60％(w/w)，有利地按重量计至少70％(w/w)，尤其按重量计至少80％(w/w)，更特别地按重量计至少90％(w/w)，特别地按重量计至少95％(w/w)的水的水溶液进行的任何提取。根据一个优选实施方案，使用水作为唯一溶剂进行沙棘籽的水提取。

根据一个有利的实施方案，因此可以通过用相对于沙棘籽和溶剂的总重量，在按重量计1％至50％(w/w)范围内的量的沙棘籽，优选使用水作为唯一溶剂进行水提取而获得提取物。

可以通过在4℃至95℃，优选在20℃至95℃，更优选在50℃至95℃，优选在70℃至90℃范围内的温度下进行水提取而获得提取物。在一个特定实施方案中，在约80℃下进行提取。

提取可以进行1小时至24小时，优选1小时至12小时，更优选1小时至6小时的时间。有利地，提取进行2至3小时范围内的时间。

优选地，根据实施例1a)中描述的方案制备提取物。

可以进行在于添加麦芽糖糊精的附加步骤。有利地，向提取物中添加相对于提取物和麦芽糖糊精的总重量为按重量计至少20％(w/w)，优选按重量计至少50％(w/w)，更优选按重量计至少70％(w/w)的麦芽糖糊精。然后可以通过蒸发溶剂来浓缩提取物和/或通过冷冻干燥和/或喷雾干燥来干燥提取物。

在本发明的一个优选实施方案中，在将麦芽糖糊精添加到溶液中之后，通过喷雾干燥来干燥提取物。

在本发明的一个优选实施方案中，首先使用超临界二氧化碳提取来提取沙棘籽。

根据该实施方案，沙棘籽的水提取物是通过对沙棘籽的超临界二氧化碳提取的副产物进行水提取而获得的。

超临界二氧化碳提取是本领域技术人员熟悉的技术，该技术允许分离要提取的化合物的油性级分，所以可以用于各种施用中。就本发明的目的而言，该提取的残余物称为“副产物”，并且含有通过所述技术未提取的所有化合物。因此，它是指沙棘籽的脱脂级分。

为了该陈述的目的，沙棘籽的水提取物仅含有微量的脂质化合物。优选地，该提取物包含相对于提取物的总重量浓度范围为1×10^-6％至1％(w/w)的脂质化合物，更优选地为0.01％至1％(w/w)，并且有利地该提取物含有相对于提取物的总重量为0.1％至1％(w/w)的脂质化合物。

这种提取技术使得可以获得无残留溶剂的副产物，并且该副产物可以更容易地分离并掺入化妆品和/或营养保健品组合物中。

该技术可以在存在或不存在助溶剂的情况下进行；有利地，在没有任何助溶剂的情况下进行。它可以在50至80巴范围的压力和25℃至70℃范围的温度下进行；优选地，在约60巴和约30℃下进行。超临界提取的持续时间范围可以为30至120分钟，优选为60至100分钟。

然后借助于如上所述的水提取法来提取副产物。

优选地，根据实施例1b)中描述的方案制备提取物。

本发明的另一方面涉及Let-7b抑制剂用于维持或改善健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性，特别是健康皮肤和/或健康粘膜、尤其是健康真皮的紧致度、弹性和/或密度的用途。

而且，本发明还涉及一种美容护理方法，包括向健康皮肤，特别是健康头皮和/或健康粘膜施用，优选局部施用Let-7b抑制剂和/或包含Let-7b抑制剂的化妆品组合物，以维持或改善健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性，特别是健康皮肤和/或健康粘膜、尤其是健康真皮的紧致度、弹性和/或密度。可以在健康的身体和/或面部和/或头皮的全部或一部分上，优选在腿部、大腿、手臂、腹部、颈纹、颈部、腋窝，整个或部分面部，优选在脸颊和/或面部棱角区域上进行施用。

优选地，实现该方法和用途以维持或改善细胞外基质的组构质量，维持或增加细胞外基质的经组构的分子、特别是胶原蛋白纤维和/或弹性纤维的量，和/或维持或增加糖胺聚糖、特别是硫酸软骨素的合成。

在一个特定实施方案中，如上所述，通过根据本发明的方法选择Let-7b抑制剂。许多Let-7b抑制剂是本领域技术人员可获得的。例如，可以提及与Let-7b序列互补的寡核苷酸，如序列SEQ ID NO：2的寡核苷酸。

本发明涉及包含Let-7b抑制剂和至少一种美容上可接受的赋形剂的化妆品组合物。

在本发明的一个实施方案中，美容护理方法包括：

a)鉴定其中需要抑制Let-7b在健康皮肤和/或健康粘膜中的表达，或维持或改善健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性，特别是健康皮肤和/或健康粘膜、尤其是健康真皮的紧致度、弹性和/或密度的健康皮肤区域；以及

b)向该皮肤区域局部施用根据本发明的沙棘提取物，优选地局部施用含有根据本发明的沙棘提取物的化妆品组合物。

在本发明的一个替代实施方案中，美容护理方法包括：

a)鉴定显示出健康皮肤和/或健康粘膜、尤其是健康真皮的紧致度、弹性和/或密度的非病理性损失的健康皮肤区域；以及

就本发明的目的而言，措辞“化妆品用途和/或化妆品组合物”意指非药物的，即不需要治疗性治疗，即意在用于健康皮肤，特别是健康头皮和/或健康粘膜的任何区域的用途和/或组合物。

就本发明的目的而言，措辞“营养保健品用途和/或营养保健品组合物”意指非药物口服施用，即不需要治疗性治疗的用途和/或组合物。

术语“健康皮肤”和/或“健康粘膜”和/或“健康头皮”意指向其施用根据本发明的提取物并且被皮肤科医生称为“非病理性”，即不呈现出任何感染、疤痕、疾病、伤口或病变和/或其他类型的皮肤病的皮肤和/或粘膜和/或头皮区域。

术语“粘膜”意指眼粘膜、***粘膜、泌尿生殖***粘膜、***粘膜、鼻粘膜和/或颊粘膜、唇粘膜和/或牙龈粘膜，优选为眼和/或颊粘膜。

就本发明的目的而言，措辞“抑制Let-7b表达”意指减少Let-7b的量，特别是健康皮肤和/或健康粘膜中、优选为健康真皮中的Let-7b的量。优选地，相对于不存在根据本发明的提取物的情况下测得的Let-7b的量，在沙棘籽的水提取物的存在下，它为至少10％，更优选地为至少30％的抑制。

本发明的一个特定实施方案涉及根据本发明的沙棘籽的水提取物用于抑制Let-7b在健康真皮和/或健康基底层、特别是在健康的真皮表皮连接、优选在健康真皮中的表达的用途。

本发明的一个优选实施方案涉及根据本发明的沙棘籽的水提取物用于抑制Let-7b在健康成纤维细胞中的表达的用途。

可以使用任何已知的分子生物学量化方法来测量Let-7b的量。可以是直接量化Let-7b miRNA的量，特别是通过在RNA芯片上测量和/或通过实时逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR或实时RT-PCR)的测量。优选地，根据本领域技术人员已知的通常方法通过RT-qPCR测量Let-7b的量。更优选地，根据实施例3.2进行测量。

就本发明的目的而言，措辞“健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性”意指健康皮肤和/或健康粘膜、尤其是健康真皮的紧致度和/或弹性和/或密度和/或抗压缩性和/或抗拉伸性和/或柔性和/或可延展性和/或承受变形的能力。优选地，它涉及健康皮肤和/或健康粘膜、尤其是健康真皮的紧致度和/或弹性和/或密度。

可以通过本领域技术人员已知的测量技术，特别是通过牵引、扭曲、抽吸、压痕、levatometry、弹性测定法(ballistometry)，通过高分辨率超声成像或弹性成像，优选通过压痕或通过高分辨率超声成像来研究健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性。有利地，根据实施例5中描述的方案研究健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性。

就本发明的目的而言，措辞“维持健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性”意指防止与不存在根据本发明的提取物的情况下测得的健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性相比，健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性，特别是健康皮肤和/或健康粘膜、尤其是健康真皮的紧致度和/或弹性和/或密度降低。

就本发明的目的而言，措辞“改善健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性”意指相对于不存在根据本发明的Let-7b抑制剂或提取物的情况下测得的健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性相比，在Let-7b抑制剂或沙棘籽的水提取物的存在下，健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性，特别是健康皮肤和/或健康粘膜、尤其是健康真皮的紧致度和/或弹性和/或密度增加，优选增加至少10％。

根据一个特定实施方案，本发明的主题是根据本发明的Let-7b抑制剂或沙棘籽的水提取物用于维持和/或增加健康皮肤和/或健康粘膜、尤其是健康真皮的紧致度和/或密度的化妆品和/或营养保健品用途。

具体而言，健康皮肤生物力学特性的维持和/或改善使得可以限制和/或减少面部，尤其是脸颊和/或面部棱角区域(通常称为面部曲线或面部V区)的健康皮肤下垂。

本发明的另一个主题涉及根据本发明的Let-7b抑制剂或沙棘籽的水提取物用于维持和/或改善细胞外基质的组构质量，特别是胶原蛋白纤维和/或弹性纤维的组构质量的化妆品和/或营养保健品用途。

就本发明的目的而言，措辞“细胞外基质的组构质量”意指构成细胞外基质的分子的功能组构水平。如在本专利申请的引言中所阐述的，蛋白FBN1和/或XYLT1和/或TGFBR2和/或ITGB3和/或CHSY3参与细胞外基质的沉积和/或组构，并且被Let-7b下调。Let-7b的抑制导致对这些蛋白质的抑制降低，并且使得可以维持和/或改善细胞外基质的组构质量。

就本发明的目的而言，措辞“维持细胞外基质的组构质量”意指特别是通过限制蛋白FBN1和/或XYLT1和/或TGFBR2和/或ITGB3和/或CHSY3的下调，防止细胞外基质的组构相对于不存在根据本发明的Let-7b抑制剂或提取物的情况下目测的细胞外基质的组构减少。

就本发明的目的而言，措辞“改善细胞外基质的组构质量”意指特别是通过限制蛋白FBN1和/或XYLT1和/或TGFBR2和/或ITGB3和/或CHSY3的下调，相对于不存在根据本发明的Let-7b抑制剂或提取物的情况下目测的细胞外基质的组构，改善细胞外基质的组构。

细胞外基质的功能组构的目测可以通过免疫组构化学技术或根据申请人的专利EP 2 721 408中描述的方法进行。

本发明的另一个主题涉及根据本发明的Let-7b抑制剂或沙棘籽的水提取物用于维持和/或增加细胞外基质的经组构的分子、特别是胶原蛋白纤维和/或弹性纤维的量的化妆品和/或营养保健品用途。

就本发明的目的而言，措辞“细胞外基质的经组构的分子的量”意指在细胞外基质内排列并且具有功能性的细胞外基质的分子数目。

就本发明的目的而言，措辞“维持细胞外基质的经组构的分子的量”意指防止细胞外基质的经组构的分子相对于不存在根据本发明的Let-7b抑制剂或提取物的情况下测得的细胞外基质的经组构的分子的量减少。

就本发明的目的而言，措辞“增加细胞外基质的经组构的分子的量”意指细胞外基质的经组构的分子的量相对于不存在根据本发明的Let-7b抑制剂或提取物的情况下测得的细胞外基质的经组构的分子的量增加。

细胞外基质的经组构的分子、特别是胶原蛋白纤维和/或弹性纤维的量，可以根据申请人的专利EP 2 721 408中描述的方法进行测量。

本发明的另一个主题涉及根据本发明的Let-7b抑制剂或沙棘籽的水提取物用于维持和/或增加糖胺聚糖、特别是硫酸软骨素的合成的化妆品和/或营养保健品用途。

就本发明的目的而言，措辞“维持糖胺聚糖、特别是硫酸软骨素的合成”意指防止糖胺聚糖、特别是硫酸软骨素的合成水平相对于不存在根据本发明的Let-7b抑制剂或提取物的情况下检测到的糖胺聚糖、特别是硫酸软骨素的合成水平降低。

就本发明的目的而言，表述“增加糖胺聚糖、特别是硫酸软骨素的合成”意指在Let-7b抑制剂或沙棘籽提取物的存在下，糖胺聚糖、特别是硫酸软骨素的合成水平相对于不存在根据本发明的Let-7b抑制剂或提取物的情况下检测到的糖胺聚糖、特别是硫酸软骨素的合成水平增加，优选增加至少10％，优选增加至少50％，更优选增加至少70％。

根据本发明的一个优选实施方案，沙棘籽的水提取物是局部可接受的化妆品提取物。

根据本发明的另一个优选实施方案，Let-7b抑制剂是局部可接受的。

就本发明的目的而言，术语“局部可接受的”意指适于局部施用，无毒，对健康皮肤，特别是健康头皮和/或健康粘膜无刺激性，不会引起任何过敏反应，并且不是化学上不稳定的。

将根据本发明的Let-7b抑制剂或提取物施用于健康皮肤，该健康皮肤可以是身体和/或面部和/或头皮，优选为腿部、大腿、手臂、腹部、颈纹、颈部、腋窝，更优选地为整个或部分面部，优选为脸颊和/或面部棱角区域(通常称为面部曲线或面部V区)的全部或部分健康皮肤和/或健康粘膜。

Let-7b抑制剂或沙棘籽的水提取物可以单独用作化妆品和/或营养保健品活性成分，或者可以包含在化妆品和/或营养保健品组合物中。

当其单独用作活性成分时，根据本发明的提取物优选为粉末形式，并且在存在或不存在甘油的情况下溶解在溶剂，特别是极性溶剂如水、醇、多元醇、二醇或其混合物中。

在本发明的一个特定实施方案中，根据本发明的提取物与麦芽糖糊精混合。在这种情况下，麦芽糖糊精使得可以获得不吸潮的化妆品和/或营养保健品成分。

有利地，向提取物中添加相对于提取物和麦芽糖糊精的总重量为按重量计至少20％(w/w)，优选按重量计至少50％(w/w)，更优选按重量计至少70％(w/w)的麦芽糖糊精。然后可以将提取物通过溶剂蒸发来浓缩，或例如通过冷冻干燥或喷雾干燥来干燥。优选地，提取物通过喷雾干燥进行干燥。

在这种情况下有利地，化妆品成分如实施例6中所述。

本发明的主题还是根据本发明的提取物的化妆品用途，该提取物在包含至少一种美容上可接受的赋形剂的化妆品组合物中局部施用于健康皮肤，特别是头皮和/或粘膜。

本发明的主题还是在包含至少一种美容上可接受的赋形剂的化妆品和/或营养保健品组合物中的沙棘籽的水提取物的用途，并且其中该提取物存在的浓度范围按根据本发明的提取物的重量相对于该组合物的总体积计为1×10^-4％至10％(w/v)，优选为1×10^-4％至5％(w/v)，更有利地为1×10^-3％至0.5％(w/v)。

在本发明的一个特定实施方案中，化妆品组合物含有相对于该组合物的总体积为按重量计0.2％(w/v)的沙棘籽的水提取物。

优选地，将提取物用于如实施例7中所述的组合物中。

在本发明的一个实施方案中，将提取物用于化妆品和/或营养保健品组合物中，用于抑制Let-7b的表达和/或用于维持和/或改善健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性，尤其是用于维持和/或改善健康皮肤和/或健康粘膜、特别是健康真皮的紧致度和/或弹性和/或密度，和/或用于维持或改善细胞外基质的组构质量，用于维持或增加细胞外基质的经组构的分子、特别是胶原蛋白纤维和/或弹性纤维的量，和/或用于维持或增加糖胺聚糖、特别是硫酸软骨素的合成。

根据本发明，化妆品组合物还可包含美容上可接受的媒介物。术语“美容上可接受的媒介物”意指适合与人类皮肤细胞，尤其是表皮细胞接触使用而没有异常毒性、刺激性或过敏反应等，并且与合理的效益/风险比成比例的媒介物。媒介物可以是例如麦芽糖糊精。

根据本发明的组合物可以局部和/或口服施用。有利地，进行局部施用。

化妆品组合物还可以含有一种或多种美容上可接受的赋形剂，这些赋形剂选自表面活性剂和/或乳化剂、防腐剂、缓冲剂、螯合剂、变性剂、遮光剂、pH调节剂、还原剂、稳定剂、增稠剂、胶凝剂、成膜聚合物、填充剂、消光剂、光泽剂、颜料、着色剂、芳香剂及其混合物。PCPC(个人护理产品委员会)描述了适合用于本发明的各种化妆品赋形剂。

有利地，一种或多种赋形剂选自：聚甘油、酯、纤维素聚合物和衍生物、羊毛脂衍生物、磷脂、乳铁蛋白、乳过氧化物酶、基于蔗糖的稳定剂、维生素E及其衍生物、黄原胶、天然和合成蜡、植物油、甘油三酸酯、不皂化物、植物甾醇、硅酮、蛋白质水解物、甜菜碱、氨基氧化物、植物提取物、蔗糖酯、二氧化钛、甘氨酸和对羟基苯甲酸酯，更优选：硬脂醇聚醚-2、硬脂醇聚醚-21、乙二醇-15硬脂醇醚、鲸蜡硬脂醇、苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、丁二醇、辛二醇、天然生育酚、甘油、二羟鲸蜡醇磷酸钠、异丙基羟基酮醚、硬脂酸乙二醇酯、三异壬精、椰油酸辛酯、聚丙烯酰胺、异链烷烃、月桂醇聚醚-7、卡波姆、丙二醇、己二醇、甘油、没药醇、二甲聚硅氧烷、氢氧化钠、PEG 30-二聚羟基硬脂酸酯、辛酸/癸酸甘油三酯、鲸蜡硬脂醇辛酯、己二酸二丁酯、葡萄籽油、霍霍巴油、硫酸镁、EDTA、环甲硅油、黄原胶、柠檬酸、月桂基硫酸钠、矿物蜡和油、异硬脂基异硬脂酸酯、丙二醇二壬酸酯、丙二醇异硬脂酸酯、PEG 8、蜂蜡、来自氢化棕榈仁油的甘油酯、羊毛脂油、芝麻油、乳酸十六烷基酯、羊毛脂醇、蓖麻油、二氧化钛、乳糖、蔗糖、低密度聚乙烯、等渗盐水溶液及其混合物。

根据本发明的化妆品组合物可以选自：水溶液、霜剂或水凝胶(特别是沐浴凝胶)、乳、乳剂、微乳剂或纳米乳剂(特别是水包油基或油包水基或多基或硅酮基的)、面膜、精华、洗液、液体肥皂、软膏、摩丝、贴剂，优选为霜剂、乳、乳剂、面膜或精华。

根据本发明使用的组合物还可以含有产生互补或协同作用的化妆品活性成分，如抗衰老活性剂。在这些活性剂中，可以提及刺激真皮大分子合成或防止其降解的活性剂、刺激角化细胞增殖的活性剂、镇静剂、保湿剂或作用于毛孔大小的调节和/或打开毛孔的活性剂。

在抗衰老剂中，可以提及：

-用于刺激纤连蛋白合成的活性剂，尤其是玉米提取物(此类提取物特别是由巴斯夫美容护理解决方案法国公司(BASF Beauty Care Solutions France)以商品名Deliner^TM销售)以及由斯达玛公司(Sederma)以商品名

销售的棕榈酰五肽；

-用于刺激胶原蛋白纤维形成的活性剂，如申请人以商品名Dermagenist^TM销售的马郁兰(Origanum majorana)提取物；

-用于刺激细胞外基质和/或上皮基底膜中的串珠素和营养不良蛋白聚糖(dystoglycan)表达的活性剂，例如像由巴斯夫美容护理解决方案法国公司以商品名Perlaura^TM销售的拳蓼(Polygonum bistorta)提取物；

-用于保护细胞外基质成纤维细胞生长因子(FGF2)免于降解和/或变性的活性剂，特别是如编号FR 0 654 316下提交的在巴斯夫美容护理解决方案法国公司名下的专利申请中描述的并且由巴斯夫美容护理解决方案法国公司以商品名Linefactor^TM销售的黄葵(Hibiscus abelmoscus)提取物；和/或用于刺激成纤维细胞生长的活性剂，例如称为Phytokine^TM并由巴斯夫美容护理解决方案法国公司销售，还在专利申请EP 1 119 344 B1(法国科延公司(Laboratoires Expanscience))中进行描述的含有肽的发酵大豆提取物；并且优选为这两种提取物的组合；

-用于刺激层粘连蛋白合成的活性剂，尤其是通过生物技术改性的麦芽提取物，此类提取物特别是由巴斯夫美容护理解决方案法国公司以商品名Basaline^TM销售；

-用于刺激透明质酸合酶2(HAS2)的表达和/或活性的活性剂，如专利申请FR 2893 252 A1中描述的植物提取物，并且尤其是由巴斯夫美容护理解决方案法国公司以商品名Hyalufix^TM销售的高良姜(大高良姜(Alpinia galanga))的水提取物；

-用于刺激赖氨酰氧化酶样蛋白(LOXL)合成的活性剂，如心形叶爱地草(Geophilacordifolia)提取物和专利申请FR 2 855 968中描述的那些，尤其是由巴斯夫美容护理解决方案法国公司以商品名Lys’lastine^TM销售的莳萝提取物；

-用于刺激细胞内ATP合成的活性剂，特别是由巴斯夫美容护理解决方案法国公司以商品名Seanergilium^TM销售的掌状海带(Laminaria digitata)藻类提取物；

-用于刺激糖胺聚糖合成的活性剂，如乳发酵产物；

-用于刺激胶原蛋白的活性剂，如视黄醇和/或维生素C；

-用于抑制金属蛋白酶(MMP)(如更具体地MMP1、MMP2、MMP3和MMP9)的活性剂，如类视黄醇和衍生物、寡肽和脂肽、脂氨基酸、由巴斯夫美容护理解决方案法国公司(BASFBeauty Care Solutions France SAS)以商品名Arganyl^TM销售的刺阿干树(Arganiaspinoso)叶的提取物；番茄红素；异黄酮、栎精、山柰酚、芹菜素；

-用于增加LOX表达，增加表皮结构的活性剂，例如由巴斯夫美容护理解决方案法国公司以商品名LOX-AGE^TM销售的菊苣(Cichorium intybus)提取物；

-用于增加胶原蛋白去糖化和/或增加I型胶原蛋白表达的活性剂，如由巴斯夫美容护理解决方案法国公司以商品名CollRepair^TM销售的丹参(Salvia miltiorrhiza)叶提取物和烟酸的组合；

-用于刺激基膜聚糖和胶原蛋白合成的活性剂，如由巴斯夫美容护理解决方案法国公司以商品名Dermican^TM销售并且在专利申请WO 2005/120554 A1中描述的合成乙酰基四肽Gln Asp Val His His；

-用于保护和刺激弹性蛋白和胶原蛋白的活性剂，如由巴斯夫美容护理解决方案法国公司以商品名Elestan^TM销售的多脉铁线子(Manilkara multinervis)叶提取物，由巴斯夫美容护理解决方案法国公司以商品名Eperuline^TM销售的镰形木英苏木(Eperuafalcata)根提取物。

作为可优选用于根据本发明的组合物中的镇静剂，可提及五环三萜、熊果酸及其盐、齐墩果酸及其盐、桦木酸及其盐、水杨酸盐(并且尤其是水杨酸锌)、没药醇、尿囊素、ω-3不饱和油、可的松、氢化可的松、吲哚美辛和倍他米松、抗炎性活性剂，并且特别是在专利申请FR 2 847 267中描述的那些，尤其是由巴斯夫美容护理解决方案法国公司SAS以商品名

销售的葛根(Pueraria lobata)根提取物，以及可可(Theobroma cacao)提取物。

在影响调节毛孔大小和/或毛孔打开的活性剂中，例如，将会提及由巴斯夫美容护理解决方案法国公司以商品名LOX-AGE^TM销售的菊苣提取物，和/或在影响皮脂产生的活性剂中，例如，将会提及以商品名Mat-XS^TM Clinical销售的合成肌氨酸和/或如专利申请WO2010/063674中描述的，在巴斯夫美容护理解决方案法国公司名下以商品名Mat-XS^TMBright销售的猫须草(Orthosiphon stamineus)提取物。

作为可以优选用于根据本发明的组合物中的保湿剂，可以提及支链淀粉、透明质酸钠和海藻酸钠的组合，如由巴斯夫美容护理解决方案法国公司以商品名Patch2O^TM销售的产品。

基于阅读解释性描述，本领域技术人员将清楚地理解本发明的其他目的、特征和优点，该解释性描述参考了仅作为说明给出的实施例，并且不应该以任何方式限制本发明的范围。

实施例形成了本发明的组成部分，并且任一特征在其功能和一般性质上形成本发明的组成部分，从包括实施例在内的说明书整体来看，所述任一特征无论怎样相对于任何现有技术似乎都具有新颖性。因此，每个实施例具有一般范围。

而且，在实施例中，除非另有说明，否则所有百分必均以重量计，除非另有说明，否则温度以摄氏度表示，并且除非另有说明，否则压力为大气压。

实施例1：根据本发明的沙棘籽的水提取物的制备

实施例1a)根据本发明的沙棘籽的水提取

将相对于籽和水的总重量为按重量计20％的沙棘籽(产地：德国)用电磨机研磨，然后用匀化器匀化几秒钟，然后用水作为唯一溶剂在室温下提取2小时的时段。然后将提取物离心，并将沉淀物弃去。然后将获得的提取物通过0.1-0.3微米的过滤器过滤，接着进行冷冻干燥。

实施例1b)根据本发明的沙棘籽的超临界提取

将按重量计10％的沙棘籽(产地：德国)用电磨机研磨，然后在60巴、30℃下通过超临界二氧化碳提取进行提取80分钟。

将超临界二氧化碳提取沙棘的副产物置于渗透水中，在搅拌的同时在80℃±2℃下保持1小时，并将pH调至5.4±0.2。然后使混合物冷却至23℃±3℃。然后对提取物进行粗筛，然后进行离心，并丢弃上清液。最终将提取物过滤至0.1-0.3微米。相对于混合物的总重量，添加60％至80％(w/w)范围的量的麦芽糖糊精。然后将获得的提取物再次过滤，接着在180℃的温度下雾化。

实施例2：Let-7b靶蛋白的测定

借助于功能获得/丧失实验，通过蛋白质印迹法测量受Let-7b潜在调控的五种被鉴别的蛋白质的浓度变化。

在原代成纤维细胞(通过对47岁女性受试者活检获得)中转染Let-7b的抑制其活性的合成互补RNA(参考编号4100945-101，EXIQON，ACCACACAACCTACTACCTC(SEQ ID NO：2))以及转染具有与Let-7b相同的序列其模拟其活性的合成RNA(参考编号470775-001，EXIQON，TGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTT(SEQ ID NO：1))之后，提取总蛋白72小时和96小时。

在丙烯酰胺凝胶(NuPAGE Novex 4-12％BBos-Tris

-英杰公司

)上分离10μg蛋白质，然后转移到硝酸纤维素膜(通用电气

)上。使用一抗(来自圣克鲁斯生物技术公司

的抗XYLT1、抗CHSY3和抗TGFBR2，来自赛默飞世尔科技公司

的抗FBN1和来自

的抗ITGB3)对蛋白质进行特异性检测。使用抗HRP-b-肌动蛋白抗体(西格玛

)进行对照。借助于数据处理软件(

-凝胶分析仪算法)测量针对每个条带获得的信号强度。

表1：用或不用Let-7b抑制剂转染进行的蛋白质印迹的结果分析

表2：用或不用模拟Let-7b活性的RNA转染进行的蛋白质印迹的结果分析。

结论

Let-7b miRNA对FBN1、XYLT1、TGFBR2、ITGB3和CHSY3，尤其是XYLT1和CHSY3的合成具有负面影响。

实施例3：在存在或不存在潜在活性物质的情况下Let-7b的量化

3.1培养

通过胰蛋白酶消化(腹部，年龄在53至68步之间的女性)从健康真皮中分离出成纤维细胞，并在含有10％(v/v)胎牛血清和抗生素的

培养基

中进行培养，然后在5％(v/v)CO₂的存在下在37℃下孵育24小时。然后将细胞置于存在或不存在潜在活性物质的环境中，在无任何胎牛血清的情况下在5％CO₂的存在下保持48小时，该潜在活性物质按根据本发明的提取物的重量相对于培养基的总体积计具有两种不同的浓度0.003％(w/v)和0.02％(w/v)。

3.2量化

使用核酸分离试剂盒(NucleoSpin

-Macherey-

从各种培养物(如实施例3.1中所呈现的那样，在存在或不存在如实施例1b中所呈现的活性物质的情况下进行培养)中提取总RNA，其中长RNA和短RNA之间进行物理分离。然后，对260nm和280nm下的光密度的测量允许验证RNA的质量和数量。

然后使用逆转录试剂盒(miScript II RT试剂盒

凯杰

)用来自各种试验条件的1μg短RNA进行逆转录步骤，最终体积为20μl。将反应混合物在37℃下孵育1小时，然后通过将温度升高至95℃并保持5分钟来灭活逆转录酶，并将反应混合物保存在-20℃下直至通过定量PCR分析进行测定。

使用三种类型的引物(如下表所呈现的)进行定量PCR步骤。第一种引物允许Let-7b miRNA扩增，并且另两种引物用于扩增小核RNA，以便通过delta-delta-Ct方法构建校正曲线。该步骤是在热循环仪

中，在1μl稀释为1/250的逆转录反应混合物中使用特异性寡核苷酸和定量PCR试剂盒进行的。每个测定一式两份地进行。在每个扩增循环后，测量试剂盒中所含的SYBR Green的荧光。每次qPCR后产生融合曲线。

hsa-let-7b-5p正向引物TGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTT SEQ ID NO：3

snoRNA U6正向引物ATGTTATGATGATGGGCGAAATGT SEQ ID NO：4

snRNA U1A正向引物TTACCTGGCAGGGGAGATAC SEQ ID NO：5

聚T反向引物TTTTTTTTTTTTTTT SEQ ID NO：6

表3：在根据本发明的提取物存在下人成纤维细胞中Let-7b的浓度降低

结论

相对于未处理的对照，对于按根据本发明的提取物的重量相对于培养基中组合物的总体积计为0.003％(w/v)和0.02％(w/v)的相应浓度而言，根据本发明的提取物导致Let-7b的表达降低18％和39％。

实施例4：真皮生物力学特性改善的体外评估

借助于对真皮替代物的低压压痕和松弛试验来测量真皮的密度和紧致度。

所使用的真皮替代物对应于本申请人的

技术。为了生产真皮替代物，将500 000个细胞/cm²的人原代成纤维细胞(来自18岁女性供体的***真皮)接种在补充有20％胎牛血清的DMEM/HAM F12

中的胶原蛋白海绵(来自本申请人的

)上。培养基中每天更换50μg/ml的抗坏血酸。从培养的第三天起，采用按根据本发明的提取物的重量相对于组合物的总体积计0.02％(w/v)的根据实施例1b)的体外籽的水提取物处理或不处理真皮。28天后停止培养经处理和未处理的真皮替代物。

然后对由此获得的真皮替代物进行低压压痕和松弛试验。对每个样品重复试验3次，直至达到恒定的穿透深度(100μm)，并以恒定的压痕速度施加运动(δ1/4 50μm/s持续120秒)。以1kHz的采样率收集数据。

所使用的压头是曲率半径R1/4为1.6mm的球形PTFE压头。在空调房内进行试验，温度控制在22℃至24℃且相对湿度为约30％至40％。

结论

在处理之后，申请人观察到，相对于未处理的对照，根据本发明的提取物导致杨氏模量增加14％(p＝0.06)，这证明提取物引起真皮生物力学特性的增加。

实施例5：对人类志愿者的体内研究

进行了对人类志愿者的研究，以便测试含有0.2％(w/v)的实施例1b中所述的提取物的制剂关于真皮生物力学特性丧失的主要迹象(尤其是皮肤松弛)的功效。

1.研究方案

55岁至70岁的呈现出皮肤紧致度和弹性损失的27名白人妇女接受双盲随机试验，该试验包括在一半面部施用实施例中所述的制剂，而在另一半面部施用安慰剂，每天两次，持续56天。在皮肤病学控制下，在治疗开始时(D0)，在28天后(D28)和在56天后(D56)测量结果。

2.真皮密度和弹性变化的研究

使用高分辨率超声扫描仪(Dub SkinScanner-TPM，22MHz)，测量强回声密度因子来测量真皮密度和弹性的变化，强回声密度因子对应于测得的具有高强度(200至255之间)的像素的百分比。

结论

申请人观察到，根据本发明的提取物相对于安慰剂在施用56天后导致强回声密度因子显著增加约26％。

3.皮肤紧致度变化的研究

使用允许测量皮肤紧致度的

设备

在面部下角处测量皮肤紧致度的变化。该因子的增大对应于皮肤紧致度的增加。

结论

本申请人观察到，根据本发明的提取物相对于安慰剂在施用56天后，引起脸颊皮肤紧致度显著增加约18.5％，这意味着包含根据本发明的提取物的组合物增加真皮的密度和弹性。

实施例6：包含沙棘籽的水提取物的化妆品成分

根据实施例1b)获得的沙棘籽的水提取物	按重量计30％
		麦芽糖糊精	按重量计70％

实施例7：包含沙棘籽的水提取物的化妆品组合物

使用本领域技术人员已知的方法将以下各相A、B、C和D混合在一起，以制备根据本发明的组合物。比例表示为百分比。

相A

辛酸丙基庚酯 4.00

碳酸二辛酯 4.00

聚丙烯酸钠 0.70

相B

相C

菌核胶 2.00

相D

根据实施例6的化妆品成分 0.20

水 2.00。

Claims

1.沙棘籽的水提取物的化妆品和/或营养保健品用途，用于抑制Let-7b在健康皮肤和/或健康粘膜中的表达，或用于维持或改善健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性，特别是健康皮肤和/或健康粘膜、尤其是健康真皮的紧致度、弹性和/或密度。

2.如权利要求1所述的用途，用于抑制Let-7b在健康真皮和/或健康基底层、特别在健康的真皮表皮连接、优选在健康真皮中的表达。

3.如权利要求1和2中任一项所述的用途，用于抑制Let-7b在健康成纤维细胞中的表达。

4.如权利要求1至3中任一项所述的用途，用于维持或改善细胞外基质的组构质量，用于维持或增加细胞外基质的经组构的分子、特别是胶原蛋白纤维和/或弹性纤维的量，和/或用于维持或增加糖胺聚糖、特别是硫酸软骨素的合成。

5.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中通过对沙棘籽的超临界二氧化碳提取的副产物进行水提取获得该沙棘籽的水提取物。

6.如权利要求1至5中任一项所述的用途，其中用溶剂进行该沙棘籽的水提取，该溶剂相对于水溶液的总重量包含按重量计至少60％、有利地按重量计至少70％、特别是按重量计至少80％、更特别地按重量计至少90％和特别地按重量计至少95％的水。

7.如权利要求1至6中任一项所述的用途，其中使用水作为唯一溶剂进行该沙棘籽的水提取。

8.如权利要求1至7中任一项所述的提取物的用途，其中该沙棘提取物存在于包含至少一种美容上可接受的赋形剂的化妆品和/或营养保健品组合物中，并且其中该提取物存在的浓度范围按根据本发明的提取物的重量相对于该组合物的总体积计为1×10^-4％至10％(w/v)，优选为1×10^-4％至5％(w/v)，更有利地按根据本发明的提取物的重量相对于该组合物的总体积计为1×10^-3％至0.5％(w/v)。

9.美容护理方法，该美容护理方法包括向健康皮肤，特别是向健康头皮和/或健康粘膜施用，优选局部施用如权利要求1至8中任一项所述的沙棘籽的水提取物和/或包含该沙棘籽的水提取物的化妆品组合物，以抑制Let-7b在健康皮肤和/或健康粘膜中的表达，或维持或改善健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性，特别是维持或改善健康皮肤和/或健康粘膜、特别是健康真皮的紧致度、弹性和/或密度，优选维持或改善细胞外基质的组构质量，维持或改善胶原蛋白纤维和/或弹性纤维的组构，和/或增加糖胺聚糖、特别是硫酸软骨素的合成。

10.如权利要求9所述的美容护理方法，其中在健康的身体和/或面部和/或头皮的全部或一部分上，优选在腿部、大腿、手臂、腹部、颈纹、颈部、腋窝，整个或部分面部，优选在脸颊和/或面部棱角区域上进行该施用。

11.在化妆品和/或营养保健品中使用Let-7b抑制剂的方法，该方法包括以下步骤：

a)使靶细胞与Let-7b的潜在抑制剂进行接触，

b)对Let-7b的表达进行定量，

c)在Let-7b的表达降低的情况下选择Let-7b的该潜在抑制剂，

12.如权利要求11所述的方法，其中该Let-7b抑制剂用于维持或改善健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性，特别是用于维持和/或改善健康皮肤和/或健康粘膜、特别是健康真皮的紧致度和/或弹性和/或密度。

13.如权利要求11和12中任一项所述的方法，其中该Let-7b抑制剂用于维持或改善细胞外基质的组构质量，用于维持或改善细胞外基质的经组构的分子、特别是胶原蛋白纤维和/或弹性纤维的量，和/或用于维持或增加糖胺聚糖、特别是硫酸软骨素的合成。

14.如权利要求11至13中任一项所述的方法，其中这些靶细胞是健康的人类成纤维细胞。

15.如权利要求11至14中任一项所述的方法，其中该量化步骤是直接量化Let-7b的量和/或通过测量靶蛋白和/或其相应mRNA的量的变化进行间接量化。

16.如权利要求11至15中任一项所述的方法，其中待调控的蛋白和/或其相应的mRNA为原纤维蛋白1(FBN1)和/或木糖基转移酶1(XYLT1)和/或TGFβ受体2(TGFBR2)和/或整联蛋白β3(ITGB3)和/或硫酸软骨素合酶3(CHSY3)，优选为木糖基转移酶1(XYLT1)和/或整联蛋白β3(ITGB3)和/或硫酸软骨素合酶3(CHSY3)，更优选地为木糖基转移酶1(XYLT1)和/或硫酸软骨素合酶3(CHSY3)。

17.如权利要求11至16中任一项所述的方法，其中通过经由RT-qPCR直接量化进行该Let-7b表达的量化。

18.如权利要求11至17中任一项所述的方法，其中该潜在抑制剂存在的浓度范围按该Let-7b抑制剂的重量相对于培养基的体积计为1×10^-4％至10％(w/v)，优选为0.001％至0.1％(w/v)，更优选地为0.003％至0.02％(w/v)。

19.Let-7b抑制剂的化妆品和/或营养保健品用途，用于维持或改善健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性，特别是健康皮肤和/或健康粘膜、特别是健康真皮的紧致度、弹性和/或密度。

20.如权利要求19所述的用途，用于维持或改善细胞外基质的组构质量，用于维持或增加细胞外基质的经组构的分子、特别是胶原蛋白纤维和/或弹性纤维的量，和/或用于维持或增加糖胺聚糖、特别是硫酸软骨素的合成。

21.如权利要求19或20所述的用途，其中该Let-7b抑制剂通过如权利要求11至18中任一项所述的方法进行选择。

22.美容护理方法，该美容护理方法包括向健康皮肤、特别是健康头皮和/或健康粘膜局部施用Let-7b抑制剂和/或包含Let-7b抑制剂的化妆品组合物，以维持或改善健康皮肤和/或健康粘膜的生物力学特性，特别是健康皮肤和/或健康粘膜、尤其是健康真皮的紧致度、弹性和/或密度。

23.如权利要求22所述的美容护理方法，其中在健康的身体和/或面部和/或头皮的全部或一部分上，优选在腿部、大腿、手臂、腹部、颈纹、颈部、腋窝，整个或部分面部，优选在脸颊和/或面部棱角区域上进行该施用。