JP2011506673A - 蛍光性化合物 - Google Patents
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- GLSOQSBOWUDUIY-UHFFFAOYSA-N C[O](c(cccc1)c1C(c(c(O1)c2)ccc2[O]=C)=C(CC2)C1=CC2=O)=C Chemical compound C[O](c(cccc1)c1C(c(c(O1)c2)ccc2[O]=C)=C(CC2)C1=CC2=O)=C GLSOQSBOWUDUIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
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Abstract
Description
Tは,1以上の化学結合で形成された結合部位であり,3以上の別個の部位と結合しており,前記結合部位が約1〜100原子を含み,
m及びnは,独立に0〜20の範囲の整数であり,
R1,R2及びR3は,各々独立に(R)p-(L)q-であって,
R1,R2及びR3のLは,各々独立に1以上の化学結合で形成された連結部位であり,安定な部位であるような基から選択された約1〜100原子を含み,
R1,R2及びR3のpは,各々1〜20の範囲の整数であり,
R1,R2及びR3のqは,各々0〜20の範囲の整数であり,
R1,R2及びR3のRは,各々独立に,
i)反応性基質と反応し共有結合を形成可能な反応基,
ii)水溶性高分子基,
iii)アルキル基,トリフルオロアルキル基,ハロゲン基,スルホニル基,スルホン酸基,ホスホン酸基又はスルホンアミド基,若しくは,
iv)-Hであって,少なくともR1,R2及びR3のR一つが反応基であり,少なくともR1,R2及びR3のR他の一つが水溶性高分子基である。
Ra,Rb,Rc,Rd,Re及びRfのRが,各々独立に,
i)反応性基質と反応し共有結合を形成可能な反応基,
ii)水溶性高分子のラジカル,
iii)アルキル基,トリフルオロアルキル基,ハロゲン基,スルホニル基,スルホン酸基,ホスホン酸基又はスルホンアミド基,若しくは,
iv)-Hであり,
Ra,Rb,Rc,Rd,Re及びRfのLが各々1以上の化学結合で形成された連結部位であり,安定な部位であるような基から選択された約1〜100の原子を含み,
Ra,Rb,Rc,Rd,Re及びRfのpが各々独立に1〜20の範囲の整数であり,
Ra,Rb,Rc,Rd,Re及びRfのqが各々独立に0〜20の範囲の整数である。
R4,R5及びR6のRが,各々独立に,
i)反応性対と反応し共有結合を形成可能な反応基,
ii)水溶性高分子基,
iii)アルキル基,トリフルオロアルキル基,ハロゲン基,スルホン酸基又はスルホンアミド基,若しくは,
iv)-Hであり,
R4,R5及びR6のLが,各々1以上の化学結合で形成された連結部位であり,約1〜100原子を含み,
R4,R5及びR6のpが,各々独立に1〜20の範囲の整数であり,
R4,R5及びR6のqが,各々独立に0〜20の範囲の整数であり,
a,b,及びcが,各々独立に0,1,2又は3である。
i)反応性基質と反応し共有結合を形成可能な反応基,
ii)水溶性高分子基,
iii)アルキル基,アリール基,アルキルアミノ基,ジアルキルアミノ基,アルコキシ基,トリフルオロアルキル基,ハロゲン基,スルホニル基,スルホン酸基又はスルホンアミド基,
iv)-H,である。
R7は,(R)p-(L)q-であり,
各(R)p-(L)q-のRは,各々独立に
i)反応性基質と反応し共有結合を形成可能な反応基,
ii)水溶性高分子基,
iii)アルキル基,アリール基,アルキルアミノ基,ジアルキルアミノ基,アルコキシ基,トリフルオロアルキル基,ハロゲン基,スルホニル基,スルホン酸基又はスルホンアミド基,
iv)-H,
前記化合物の各(R)p-(L)q-のLは,各々独立に1以上の化学結合で形成された連結部位であり,約1〜100原子を含み,
pは,各々独立に約1〜約20の範囲の整数であり,
qは,各々独立に1〜約20の範囲の整数である。
i)反応性基質と反応し共有結合を形成可能な反応基,
ii)水溶性高分子基,
iii)アルキル基,トリフルオロアルキル基,ハロゲン基,スルホン酸基又はスルホンアミド基,
iv)-Hである。
i)反応性基質と反応し共有結合を形成可能な反応基,
ii)水溶性高分子基,
iii)アルキル基,トリフルオロアルキル基,ハロゲン基,ホスホン酸基,スルホン酸基又はスルホンアミド基,
iv)-Hである。
当業者にとって,本発明から離れることなく多数の変形、変更、及び置換を実施することが可能である。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する多数の代替を本発明の実施において採用しうることが理解できる。下記の請求項が本発明の範囲を定義し,これら請求項の範囲内の方法及び構造並びにその均等物が本発明の範囲に及ぶ意図である。
加えて,本発明の標識分子は,対応する基質生体分子よりもインビボにおいてより低い免疫原性及びより低い抗原性であってもよい。更に,本発明の化合物及び標識分子は,よりよい光安定性及び蛍光性基の曝露抵抗を示してもよい。
本発明の化合物は,不斉中心,キラル軸及びキラル面(E L Eliel及びS H Wilen,「炭素化合物の立体化学」John Wiley & Sons, New York, 1994,1119 1190頁中に記載のように)を有してもよく,ラセミ体,ラセミ混合物及び個々のジアステレオマーとして生成してもよく,光学異性体を含むすべての可能な異性体及びその混合物は,本発明に含まれる。加えて,本明細書で開示した化合物は,互変異性体として存在してもよく,一互変異性体構造のみが描述されていたとしても,両互変異性体形態はともに本発明の範囲に含まれる意図である。
置換基から環システム中に描いた線は,いずれか好適な環の炭素原子と結合しうることを示す。環システムが多環式であった場合,近位の環上のいずれか好適な炭素原子のみと結合することを意図する。置換基による環の置換は,一般に,置換基が環に融合する環状構造であることを許容する。
「ヒト化」の用語は,非ヒト(例えば,げっ歯類又は霊長類)に適用する場合,抗体は,非ヒト免疫グロブリンから由来する最小限の配列を含む複合免疫グロブリン,免疫グロブリン鎖又はその断片である。
大部分,ヒト化抗体は,レシピエントの相補性決定領域(CDR)からの残基が,所望する特異性,親和性及び容量を有するマウス,ラット,ウサギ又は霊長類などの非ヒト種(ドナー抗体)のCDRからの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。一部の例では,ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基が対応する非ヒト残基によって置換される。更に,ヒト化抗体は,レシピエント抗体と導入されたCDR又はフレームワーク配列のいずれもが見られない残基を含んでもよい。これらの修飾により,さらに洗練された最適の抗体性能を作り,人体に導入する場合,免疫原性を最小化する。一般的に,ヒト化抗体は,全て又は実質的に全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンに一致し,全て又は実質的に全てのFR領域 がヒト免疫グロブリン配列である,実質的に全ての少なくとも一つの,典型的には二つの可変ドメインを含んでもよい。また,ヒト化抗体は,少なくとも免疫グロブリン固定領域(Fc)の一部分,典型的にはヒト免疫グロブリンの固定領域の一部分を含んでもよい。
「蛍光性」の用語は,化合物の分子に適応する場合、エネルギー吸収(紫外線、可視光線又は赤外線輻射)及び再発光,少なくとも経時的な光としてのエネルギーの画分についての化合物の特性を言うのに用いる。蛍光性基,化合物又はフルオロフォアは,限定されないが,個々の化合物,分子,タンパク質及び高分子錯体を含む。また,フルオロフォアは,有機配位子増感剤とのランタニドイオン及びランタニド錯体のような長寿命の蛍光減衰を示す化合物を含む。
本発明では,FRETは,少なくとも二つの蛍光性化合物間,蛍光性化合物及び非蛍光性化合物間又は蛍光性成分と非蛍光性成分間で発生するエネルギー移動過程を言う。
結合剤は,ポリペプチド,抗体又はタンパク質,ポリペプチドベースの毒素,アミノ酸ベースの毒素,ヌクレオチド,DNA及びRNAを含むポリヌクレオチド,脂質及び炭化水素若しくはそれらの組み合わせなどの生体分子であってもよい。また,結合剤は,金属キレート,微粒子,合成又は天然重合体,細胞,細菌又は本発明に係る色素分子を含む他の蛍光性分子などのハプテン,薬剤,イオン性錯化剤であってもよい。
本発明は式1の化合物を提供する。
蛍光性基の分類は,例えば,蛍光性基の下位分類が,特定の蛍光性基の下位分類に特有の一つ以上の置換基を含む異なる下位分類に分類してもよい。それゆえ,各蛍光性基の下位分類の核となる構造があってもよい。例えば,下記式Eとして示した7-アミノクマリンは,それ自体が,より一般的なクマリン蛍光性基に属する式Aの核となる構造を有する蛍光性基の下位分類であり,すべての7-アミノクマリン誘導体に対して核となる構造である。
複数の(R)p-(L)q-基が化合物中にある場合,各R,L,p又はqは,同一化合物中に存在する他のR,L,p又はq基のいずれとも独立である。一般に,pは,各々1〜20の範囲の整数である。いくつかの実施形態において,pは1である。他の実施形態において,pは,1〜2,3,4,5,10又は15の範囲を取りうる。一般に,qは,各々0〜20の範囲の整数であり,pが0の実施形態において,Lは存在せず,Lに結合するよう示されたあらゆるR基は結合を介して直接つながると理解される。あるいはpが1であってもよい。他の態様において,qは,1〜2,3,4,5,10又は15の範囲を取りうる。
一実施形態によると,反応基は,紫外線光活性化又は光分解により,炭化水素分子と反応可能な光活性化されうる基である。他の実施形態によると,反応基は,ディールズ・アルダー反応を介して共役ジエンと反応可能な求ジエン体である。更に他の実施形態によると,反応基は,求ジエン体と反応可能な1,3-ジエンである。更に他の実施形態によると,
反応基は,1,2,3-トリアゾール連結を形成するアジド官能基と反応可能なアルキンである。更に他の実施形態によると,反応基は,いわゆるシュタウディンガー反応を介してアミド連結を形成するアジド官能基と反応可能な2-(ジフェニルホスフィノ)安息香酸メチルエステルである。単なる例示として,本発明に係る有用な反応基,官能基及び対応する連結を,Table 1中に一覧した。
**:また,アクリルアジドは,イソシアネートに再配列しうる。
他の実施形態において,本発明の水溶性高分子は炭化水素である。かかる炭化水素は,単糖類又は多糖類を含み,例えば,可溶性スターチ,グリコーゲン,デキストラン,ペクチン、マンナン,ガラクタン,ヒドロキシメチルセルロース,ヒドロキシエチルセルロース他のセルロース誘導体が挙げられる。水溶性高分子が炭化水素である場合,炭化水素中に存在するヒドロキシル基の少なくとも30%が,メチルエーテル,スルホナートアルキルエーテル及び/又はアセテートエステルでマスクされてもよい。
同様に,水溶性高分子は一般に反応基が求核剤である場合,強求電子剤を含まない。しかしながら,水溶性物は,反応基の化学性が有意に影響しない又は本発明の化合物の安定性が貯蔵及び取り扱い中に影響されないなどの最小限数の弱求核剤又は最小限数の弱求電子剤を含みうる。弱求核剤の例としては,炭化水素分子中に通常存在するヒドロキシル基がある。そこで,いくつかの実施形態において,水溶性高分子が炭化水素である場合,好適には炭化水素中に存在するヒドロキシル基の少なくとも30%が,メチルエーテルなどのエーテル及び/又はアセテートエステルなどのエステルとしてマスクされてもよい。他の実施形態において,全ヒドロキシル基がエーテル及び/又はエステルとしてマスクされてもよい。
しかしながら,比較的多数の荷電基は一般に望ましくない。なぜなら,高度に荷電したフルオロフォアを得ることとなり,タンパク質と接合する上で,例えば,タンパク質の等電点を有意に荷電し,それゆえ,標識タンパク質の生物学的特性におそらく影響しするからである。例えば,高度に荷電したフルオロフォア分子で標識した抗体は,染色で大きなバックグラウンドを示す。いくつかの実施形態において,かかる荷電水溶性R基の数は,0〜4又は0〜3である。本発明の蛍光性基が少なくとも一つの水溶性高分子基を有するため,また,蛍光性基の水溶性及び/又はその蛍光量子収率を増大させることが可能であるため,スルホン酸基などの荷電R基の数は,最小限に維持でき,このため,標識タンパク質の生物学的特異性の消失を最小限にとどめた。
一部の場合,Rは,例えば,ジエチルアミン又はジメチルアミンなどのジアルキルアミン置換基であってもよい。Rが炭素含有置換基である場合,例えば,アルキル,シクロアルキル,アルケニル又はアルキニルを含むいかなる構造又は立体配置を想定してもよい。
R4,R5及びR6のRが,各々独立に,
i)反応性対と反応し共有結合を形成可能な反応基,
ii)水溶性高分子基,
iii)アルキル基,トリフルオロアルキル基,ハロゲン基,スルホン酸基又はスルホンアミド基,若しくは,
iv)-Hであり,
R4,R5及びR6のLが,各々1以上の化学結合で形成された連結部位であり,約1〜100原子を含み,
R4,R5及びR6のpが,各々独立に1〜20の範囲の整数であり,
R4,R5及びR6のqが,各々独立に0〜20の範囲の整数であり,
a,b,及びcが,各々独立に0,1,2又は3である。
例えば,Yは,メチン単位であってもよく,あるいは,任意に一つ以上の4員環,5員環又は6員環を組み込んでいるポリメチン単位(トリ-,ペンタ-又はヘプタメチン)あってもよい。また,本発明のR基への付加的置換も想定される。例えば,Yは,上記に定義した水溶性高分子,反応基又は付加的な置換基であるR基を含んでもよい。例えば,アルキル,SO3 -及びハロゲンはみなが,Y基の一部として存在するありうる置換基である。
i)反応性基質と反応し共有結合を形成可能な反応基,
ii)水溶性高分子基,
iii)アルキル基,アリール基,アルキルアミノ基,ジアルキルアミノ基,アルコキシ基,トリフルオロアルキル基,ハロゲン基,スルホニル基,スルホン酸基又はスルホンアミド基,
iv)-Hである。
(R)p-(L)q-のqは,各々独立に0〜約20の範囲の整数である。
一部の実施形態において,二つの隣接するR1及び/又は二つの隣接するR2は,6員環を形成するように結合している場合、形成された環が芳香族である。一部の実施形態において,二つの隣接する(R2)b及び結合している環B中の原子が,炭素環を形成するように結合し,更に蛍光性基の溶解性を増大させうる基と任意に付加的に置換される。一部の実施形態において,二つの隣接する(R2)b及び結合している環B中の原子が,芳香族である炭素環を形成するように結合し,更に蛍光性基の溶解性を増大させうる基と任意に付加的に置換される。一部の実施形態において,二つの隣接する(R1)a及び結合している環A中の原子が,炭素環を形成するように結合し,更に蛍光性基の溶解性を増大させうる基と任意に付加的に置換される。一部の実施形態において,二つの隣接する(R1)a及び結合している環A中の原子が,芳香族である炭素環を形成するように結合し,更に蛍光性基の溶解性を増大させうる基と任意に付加的に置換される。
他の実施形態において,化合物は下記構造である。
水溶性高分子の置換基は,本発明の近赤外色素の特性を徹底的に改善させ,先例のない蛍光輝度(図を参照)を得た。水溶性高分子の置換基は,近赤外色素の特性を徹底的に改善させた(図を参照)。
近赤外色素の安定性は問題点であり,貯蔵及び取り扱い上,極度の注意が必要であり,それゆえ,色素の使用に制限があった。
本発明に従い,選択したクマリン式を,table 5中に一覧する。
一般に,a,b,c及びdの合計は,2,3又は4である。一つの実施形態において,a,b,c及びdの合計は,4である。例えば,R1,R2及びR3は,各々(R)p-(L)q-基が独立に式-SO2NH(CH2CH2O)nCH3でnが約3〜約30又は約7〜約24であるものを含みうるような水溶性高分子基を含んでもよい。本実施態様によれば、R4は,活性化カルボン酸のエステルなどの反応基であるRを含む。
目的化合物には多様な異なる用途での使用が見出せる。関心のある一つの用途は,目的化合物の特定の対象化合物に対し蛍光特性を付与することが可能な標識剤としての使用である。本発明の化合物は、限定されないが,ポリペプチド,ポリペプチドベース毒素,アミノ酸,ヌクレオチド,DNA及びRNAを含むポリヌクレオチド,脂質及び炭化水素並びにそれらいずれかの組合せなどの生体分子を含む広範囲の分子のいずれかと反応するのに使用できる。加えて,本発明の化合物は,ハプテン,医薬,金属キレートなどのイオン錯化剤,微粒子,合成又は天然重合体,細胞,ビールス,本発明にかかる色素分子を含む他の蛍光性分子又は表面と反応するのに使用できる。基質分子は,典型的には,目的化合物の反応基と反応して,共有結合又は非共有結合の連結を形成する一つ以上の官能基を含む。一つの形態において,本発明の化合物の反応基は,エステル(スクシンイミドエステル又はSEなど),マレイミド,ヒドラジド又はアミノオキシ基である。従って,一部の実施形態において,基質分子(又は反応基質)からの官能基はアミン,チオール,アルデヒド又はケトンである。得られた蛍光標識された基質分子は,接合体又は標識された基質分子と言ってもよい。当業者の実践するいかなる蛍光性基-基質接合体の調製方法(例えば,Brinkley, Bioconjugate Chem. 3, 2(1992)を参照しここに組み込む。)も,本発明の実施に適応しうる。
他の実施形態において,目的化合物は,ヌクレオシド,ヌクレオチド又はポリヌクレオチドと接合するのに使用でき,かかる分子のいずれも天然又は合成,修飾又は非修飾であってもよい。標識に用いる本発明の化合物は,ホスホラミダイト,活性化エステル(スクシンイミドエステル),アルキル化基又は反応性白金錯体である反応基を含んでもよい。かかる分子は,本発明の化合物上の反応基に対する一つ以上の反応対を含むか含むように誘導されてもよい。本発明の化合物の反応基は,共有結合の連結を形成するよう該分子上の適切な反応対と反応してもよい。例えば,ホスホラミダイト基は,脱保護後にヒドロキシル基と反応して,リン酸連結を形成してもよく,スクシンイミドエステルなどは,アミン基と反応してアミド連結を形成してもよく,反応性白金錯体は,グアノシン塩基と反応して白金錯体連結を形成してもよい。
一つの実施形態において,活性化エステルを含む本発明の反応性化合物は,アミノアルキニル基,アミノアリル基又はアミノアルキル基を含む塩基を含んでいるヌクレオチド三リン酸と,蛍光標識されたヌクレオチド三リン酸を形成するため反応する。
かかる標識ヌクレオチド三リン酸は,しばしば酵素的取込みを介して,蛍光標識された核酸重合体の調製に使用される。
アミノアルキニル連結部は,酵素又は標的結合位置とのフルオロフォア相互作用を低減するため,蛍光部位とヌクレオチド間に導入されてもよい。かかる四原子の架橋に加えて,7〜10原子のスペーサーを,塩基からフルオロフォアを更に分離するために,導入してもよい。より長いスペーサーの使用により,より高輝度な接合体が得られ,二次検出剤のハプテン容易性を増大してもよい。
他の実施形態において,目的の化合物は,アミノ酸,アミノ酸類縁体又はポリペプチドと接合するのに使用できる。標識アミノ酸,アミノ酸類縁体及びポリペプチドは,本発明の化合物と,上記化合物上の反応基に対する反応対を含むアミノ酸,アミノ酸類縁体及びポリペプチドとを反応させて,標識される。かかる反応対は,前記ポリペプチド中に存在する天然又は非天然の基であってもよい。例示として,反応対は,天然リシン残基の一部であるアミノ基,天然システイン基の一部であるチオール基などの天然残基であってもよい。
目的の化合物は,広範で多様な用途での生体分子を標識するための効果的な手段を提供する。標識は,タンパク質,糖タンパク質,核酸及び脂質などの生体分子,無機化学品だけでなく及びそれらの組合せに生じる相互作用を識別できるようにする。相互作用は,核酸分子間,核酸とタンパク質間,タンパク質と小分子間であってもよい。相互作用は,組織又は器官若しくは被験者内である細胞内での活動まで範囲が及ぶ,無細胞の生物学的系内で,細胞系内で(細胞内及び細胞外系を含む)又はインビボ内で,識別されてもよい。多様な相互作用を描写することは,科学研究及び開発,医薬品設計,スクリーニング及び最適化,系統学的分類,個人,親子の遺伝子型解析及び法医学的同定,環境研究,疾病状態の診断,予後及び/又は治療において,しばしば有意義な手段である。
ハイブリッド形成は,PCR反応の開始やリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的分割などの拡張的な工程を構成してもよい。
かかるハイブリッド形成前後の変化は,検出された信号強度の増大又は減少として得られる。運転中の特定のハイブリッド形成アッセイに基づいて,ハイブリッド形成後の一つ以上の現象が,信号強度の変化生成に寄与してもよい。例えば,レポーター信号の増大は,空間的な拡張又は両者がまだプローブと結合している消光剤基からのレポーター蛍光性基の分離により生じてもよい。加えて,プローブのレポーター又は消光剤のいずれかは,検出されるレポーター信号を生成する,酵素(例えば,5'-3'エキソヌクレアーゼを有するポリメラーゼ)を介した分割の手段によって分離してもよい。上述のように,レポーター及び消光剤の両者は,これらの基が,供出を通じて同一で,相互に関連し,ハイブリッド形成反応中で使用される場合,異なる機能であるように,官能末端で規定される。例えば,プローブに結合する基は,消光剤であり,なぜなら,プローブが標的核酸(典型的には,プローブがランダムな場合を想定している)とハイブリッド形成している場合,光学信号の発光を減少するからである。同様の基は,標的核酸とのハイブリッド形成後の酵素による分割によって,アッセイの間,蛍光性基の信号が検出されるレポーター蛍光性基になりうる。
該方法は,典型的には,(a)上記標的核酸,標的核酸とハイブリッド形成される少なくとも一のプライマー,増幅中の標的核酸の増加に比例する強度の検出可能な信号を発する本発明の標識オリゴヌクレオチドプローブを含む増幅反応混合物を提供し,(b) 標的核酸を増幅する条件下で,上記混合物を処理し,(c)上記処理工程(b)中,上記混合物により発せられた上記信号の量を測定する工程を備える。所望の場合,信号量は,増幅反応中ずっと連続的に測定され,又は,増幅反応中断続的に測定される。増幅は,プライマー対の使用で指数的又は対の一方のプライマーの使用で線形的でありうる。
かかる方式は,例えば,血液銀行でのスクリーニング処理におけるAIDSのスクリーニングなどの遺伝子検査用の大規模試料スクリーニングのために,臨床検査室で頻繁に要望される。
一つの実施形態において,試験試料中に存在する全核酸配列は,分析のため,同時にマイクロアッセイにかけられ,そのため,全標的核酸配列のアレイ上に存在する全核酸との相互作用を行いうる。他の実施形態において,アレイに適用した標的核酸は,マイクロアッセイを用いた精製ハイブリッド形成分析向けのサブセットを得るため予備選択される。例えば,限定された数の標的配列は,例えば,1以上の単一ヌクレオチド遺伝子多型である,1以上の配列の分析されるべき特定のヌクレオチド配列を含むことができる本設定の核酸配列は,マイクロアッセイ上での分析に先立ち,特定のプライマーの支援によりPCRによって増幅されてもよい。
異なる被験者から由来する標的ポリヌクレオチドのハイブリッド形成により,生成したハイブリッド形成パターン中で検出されたいずれかの不一致は,これら被験者の遺伝子転写の多数の異なる発現を示す。
ゲルシフトアッセイを実行する方法は既知である。
例えば,Garner, M.M. and Revzin, A. (1981) 「特定のDNA領域と結合するタンパク質のゲルでの定量方法: Escherichia coliのラクトースのオペロン調節システムの成分への適応」Nucleic Res. 9:3047-3060又はFried, M. and Crothers, D.M. (1981) 「ポリアクリルアミドゲルによるEquilibria and kinetics of lac受容体-オペレーター相互作用の平衡及び動態」 Nucleic Res., 9:6505-6525を参照。
例えば,ペプチダーゼにより分割されたペプチド配列を含むペプチドは,ペプチド配列末端で,本発明の蛍光性基から選択した蛍光ドナー蛍光性基である第一蛍光性基によって,また,ペプチド配列の他の末端で,蛍光アクセプター蛍光性基(本発明からの他の蛍光性基又は消光剤等)である第二蛍光性基,ここで,一次色素及び二次色素は蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)対を形成する,によって,標識してもよい。FRET対のドナー蛍光性基又はアクセプター蛍光性基のいずれかの,上記ペプチダーゼによるペプチド分割の前後での,蛍光の差を検出することで,酵素活性のレベルを評価できる。
ヒサクトフィリンは,ミリストイル化ヒスチジンの豊富なタンパク質であり,(細胞性粘菌中に存在することが知られている。アクチン及び酸性脂質への結合は,細胞質のpH変動の範囲内で,鋭くpHに依存する。生きた細胞内では膜結合が,ヒサクトフィリンとアクチン線維との相互作用を打ち消すように見える。およそpH6.5において,これらは典型的には形質膜及び核へ局在化している。これに対し,pH7.5では,細胞質空間全体に分布している。かかる分布の変化は可逆的で,分子表面上でループ状に晒されるヒスチジンクラスターに起因する。細胞質のpH変動の範囲内での細胞内分布の逆転は,ヒスチジン残渣のpK6.5に基づく。細胞分布は,タンパク質のミリストイル化に依存しない。対応する蛍光性色素をヒサクトフィリンへ接合することで,標識ヒサクトフィリンの細胞内分布は,レーザー走査,共焦点顕微鏡又は標準蛍光顕微鏡によって追跡できる。蛍光定量分析は,細胞を通した線走査(レーザー走査共焦点顕微鏡)又は他の電子データ分析(例えば,メタモルフォソフトウエア(Universal Imaging Corp社製)の使用及び細胞集団内で収集したデータの平均処理)を実施することで行うことが可能である。
ヤギ抗マウスIgG(GAM),ヤギ抗ウサギIgG(GAR)及びストレプトアビジンの蛍光接合体を,反応性タンパク質及び反応性色素から,刊行された手順(米国特許第6,974873号,Hauglandら,Meth Mol Biol 45, 205(1995),Hauglandetal ,Meth Mol Biol 45, 223(1995),Hauglandら,Meth Mol Biol 45, 235(1995),Hauglandら,Current プロトコールs in Cell Biology, 1651-16522(2000))に従って,調整した。簡潔には,抗体又はストレプトアビジン1mg/mLの0.1mM pH8.5重炭酸ナトリウム緩衝液を,反応性色素の一つと様々な色素分子/タンパク質分子比率で混合した。室温で約一時間保温後,反応混合物を,PBS(pH7.4)で緩衝したSephadex G-25を用いたゲルろ過により分離した。標識反応において多様な色素分子/タンパク質比を用いたことで,色素/タンパク質の対ごと下記Table7中に一覧したとおりの,異なる色素標識度(DOL)でタンパク質接合体を生成した。
アミノファロイジン(1mg)及び化合物No.5,7及び23(1.5当量)のDMF溶液(200μL)に,N,N-ジイソプロピルエチルアミン(3当量)を添加し,混合物を室温で一晩撹拌した。溶液を真空下濃縮乾固し,残渣をLH-20カラム(1.5mg)でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。生成物は,固定細胞の調製において,F-アクチン線維に対する効果的な染色剤である。
α-ブンガロトキシン(1mg)の0.1M重炭酸ナトリウム(25μL)溶液へ,化合物No.7(1.5当量)を一回で添加し,混合物を室温で2時間撹拌した。生成物をG-25サイズ排除カラムで,その後,逆相HPLCで精製した。アセチルコリン受容体の染色及び得られた蛍光の検出は,長波長において検出されるのだが, Texas Red α-ブンガロトキシン接合体によって得られるものに匹敵する。
平均13アミノ基を有する70000MWアミノデキストランの0.1M重炭酸ナトリウム(400μL)溶液へ,色素/デキストランが約12となるように,化合物No.7を添加した。6時間後,接合物をSEPHADEX G-50上で水を溶出剤として精製した。典型的には,4-6モルの色素が,70000MWデキストランと接合した。
加熱殺菌した大腸菌をpH8-9緩衝剤(10mg/mL)中に懸濁し,その後,化合物No.7などの0.5-1.0mg/mLのアミノ反応性色素と一緒に培養した。30-60分後,標識細菌を遠心分離及び緩衝剤で数回洗浄して遊離色素を除去した。標識細菌を流動細胞計測により分析した。
5(3-アミノアリール)-2-デオキシウリジン5'-三リン酸(2mg,Sigma 化学的社製)のH2O(100μL)溶液中へ,化合物No.7又は化合物No.23のDMF及びトリエチルアミン溶液(5μL)を添加した。混合物を室温で3時間撹拌し,その後,真空下濃縮乾固した。残渣を分取型HPLCで精製した。生成物画分を凍結乾燥し,暗青色ヌクレオチド接合体を得た。
5'-アミノ修飾,18ベース M13プライマー配列(100μg)のH2O溶液(4μL)に,化合物No.7(500μg)の0.1Mホウ酸ナトリウムpH=8.5緩衝剤(200μL)溶液を添加した。混合物を室温で一晩撹拌し,3体積の冷エタノールを添加した。混合物を-20℃へ冷却し,遠心分離し,上澄液をデカントし,ペレットをエタノールで濯ぎ,その後,H2O(100μL)中に溶解した。標識オリゴヌクレオチドを分取型HPLCで精製した。目的ピークを収集し、留去して,蛍光性オリゴヌクレオチドを得た。
一試料当たり百万個のジャーカット細胞を,0.25μgのマウス抗ヒトCD3(BD Biosciences社製)で,続いて,図8(例96)に示したDOLでの化合物No.41で標識した1μgのヤギ抗マウスIgGで染色した。流動細胞計測は,CXPソフトウエアを用いたBeckman Coulter社製 FC-500上で実測した。雑音は,対照バックグラウンドとして,ヤギ抗マウス化合物No.41接合体のみで染色した細胞からの平均蛍光強度を示す。信号は,CD3及びヤギ抗マウス化合物No.41接合体fで染色した細胞からの平均蛍光強度を示す。
百万個のジャーカット細胞を固定し,透過処理し,0.25μgのマウス抗ヒトCD3抗体(BD Biosciences社製)と一緒に培養した。続いて,CD3抗体を,AlexaFluor647(DOL 3.1)又は化合物No.41(DOL 3.9)(例96)と接合した1μgのヤギ抗マウスIgGと一緒に培養した。各試料から約10,000個の細胞をBD社製 FACS Calibur流動細胞計測装置上で分析し,蛍光をFL4チャンネル内で検出した。
遊離チオール基中タンパク質に富むβ-ガラクトシダーゼ溶液を,PBS緩衝剤(200μL中1mg)中で調製し,その後,チオール反応性化合物No.85(5mg)のDMF(100μL)溶液で処理した。未反応色素を,遠心分離装置を用いて遠心分離して除去した。色素による置換度は例96中に引用した方法を用いて評価した。
アクチン線維を,化合物No.96,Alexa Fluor 488及びフルオレセイン(ファロイジン接合体は,例98に記載した手順を用いた色素のアミノファロイジン及びスクシンイミドエステル形態から調製した)で標識したファロイジンにより染色した。洗浄後,各染色試料を連続的に照射し,蛍光強度を5秒ごとに測定することで経過観察した。各試料の相対蛍光対時間をプロットした(図11)。長い間,フルオレセインは,色素の吸収ピークがアルゴンレーザー線の488nmとよく一致するため,緑色蛍光の選ばれた色素であった。しかしながら,フルオレセインは非常に急速に光退色し,顕微鏡研究の使用を限定する。Molecular Probes, Inc.からのAlexa Fluor 488は,その異例の光安定性ゆえに,優れた代替品として開発された。図11は,本発明の化合物No.96は,Alexa Fluor 488よりも光安定性がより優れていることを示す
例108 本発明の標識生体分子の血清での半減期の測定
本発明の標識生体分子のインビボ・血清での半減を,例えば,カテーテル処理したラットへ標識生体分子を注入後,例えば,[Pepinsky, R Bら(2001) J Pharmacol Exp Ther, 297 1059-66]に記載されたように測定してもよい。生体分子の血漿濃度は,その後,抽出した血液試料中で測定される。かかる試料は,研究の時間経過に則った多様な時点で回収されてもよい。標識生体分子の濃度は,蛍光測定及び/又はELISA又はウエスタンブロット等の生化学技術を含む多様な方法を用いて測定してもよい。本発明の蛍光性基の安定化効果は,該色素を有さない対応する生体分子に関して本発明の標識生体分子の安定性を対比することで計測してもよい。
三種類の近赤外色素の一つでヤギ抗マウスIgGの所定量を標識することで,一系統のヤギ抗マウスIgG接合体を調製した。加えて,色素ごと別々の割合,つまり数個の異なる標識度(DOL)の一つで標識し,標識度の増加に伴い,抗体上の色素分子濃度としての凝集挙動に対する吸収スペクトルが増加することを観測した。使用した色素は,Cy7(登録商標)色素,Alexa Fluor 750(登録商標)(AF750(登録商標))色素及び本発明の色素である色素No.29(表3)である。図12Aは,4種の異なるDOL(抗体当たり1.2〜3.4色素分子)でのCy7(登録商標)色素で標識したヤギ抗マウスIgGから形成された接合の吸収スペクトルを示す。図12Bは,四種の異なるDOL(抗体当たり2.2〜5.9色素分子)でのAlexa Fluor 750(登録商標)(AF750(登録商標))色素で標識したヤギ抗マウスIgGから形成された接合の吸収スペクトルを示す。図12Cは,六種の異なるDOL(抗体当たり1.1〜7.4色素分子)での色素No.29(表3)で標識したヤギ抗マウスIgGから形成された接合の吸収スペクトルを示す。全スペクトルはPBS7.4緩衝剤中室温で測定した。Cy7(登録商標)色素及びAF750(登録商標)色素で標識した接合物(A及びB)のスペクトルは共に色素凝集に特徴的な二重ピークを示し,一方,化合物No.29で標識した接合物(C)のスペクトルは,実質的に単一ピークを示し,色素凝集が実質的にないことを表わしている。
三種類の近赤外色素の一つでヤギ抗マウスIgGの所定量を標識することで,一系統のヤギ抗マウスIgG接合体を調製した。加えて,色素ごと別々の割合,つまり数個の異なる標識度(DOL)の一つで標識し,標識度の増加に伴い,抗体上の色素分子濃度としての蛍光出力が増加することを観測した。使用した色素は,本発明の色素である色素No.29(表3),Cy7(登録商標)色素及びAlexa Fluor 750(登録商標)(AF750(登録商標))色素である。Cy7(登録商標)色素及びAlexa Fluor 750(登録商標)(AF750(登録商標))色素は水溶性高分子基を有さない。図13は,色素No.29(表3),Alexa Fluor 750(登録商標)(AF750(登録商標))色素及びCy7(登録商標)色素をPBS緩衝剤pH7.4中で,同一タンパク質濃度で接合したヤギ抗マウスIgGの735nmで励起した全蛍光対標識度(DOL)を示す。AF750(登録商標)色素及びCy7(登録商標)色素と比べて,色素29の蛍光性基は,広範囲の標識度においてより高い蛍光量子収率であり,高標識度の抗体に関して蛍光消光がより少ないことをデータは示している。
色素No.29(表3),Alexa Fluor 750(登録商標)色素又はCy7(登録商標)色素の一つでヤギ抗マウスIgGの所定量を標識することで,一系統のヤギ抗マウスIgG標識接合体を調製した。ジャーカット細胞を最初にマウス抗ヒトCD3抗体で標識し,その後,すべて同様の標識度で標識された三種類の二次抗体の一つで染色した。標識した各二次抗体からの背景蛍光を計測するため,細胞を一次抗体なしに蛍光二次抗体で各々直接的に染色した(暗色コラム)。図14は,流動細胞計測により計測した近赤外色素,本発明の色素No.29(表3),Alexa Fluor 750(登録商標)色素及びCy7(登録商標)色素の各々で蛍光標識した抗体で染色したジャーカット細胞の相対蛍光レベルを示す。本発明の接合抗体で染色した細胞は,市販の接合抗体で染色した細胞より高輝度であり優れた信号雑音比であることを結果は示している。
図15は,表3の化合物No.29,Alexa Fluor750(登録商標)(AF750(登録商標))色素及びCy7(登録商標)色素の三種類の近赤外色素の光安定性と比較した。5μM色素濃度での三種類の色素の溶液を1/2時間,太陽光に曝露した。溶液の吸収スペクトルを光分解の前後で記録した。本発明の近赤外色素は,AF750(登録商標)色素及びCy7(登録商標)色素の両者よりも有意義に安定であることを結果は示す。
図16A及びBは,APC-Alexa Fluor 750(登録商標)直列色素又は色素29(表3)で標識した抗体で細胞内にて標識した抗体で染色したジャーカット細胞の相対蛍光レベルを示す。図16Aは,流動細胞計測により計測した,表示量の化合物No.29(DOL=3.5)で標識したヤギ抗マウスIgG又はAPC-AF750(登録商標)直列色素で標識した市販のヤギ抗マウスIgG(invitrogen社製)のいずれかで染色したジャーカット細胞の相対蛍光レベルを示す代表図である。細胞を最初にマウス抗ヒトCD3抗体で標識し,その後,すべて同様の標識度で標識された二種類の二次抗体の一つで染色した。標識した各二次抗体からの背景蛍光を計測するため,細胞を一次抗体なしで直接各蛍光二次抗体でも染色した(アイソタイプ,暗色コラム)。 図16Bは,図16Aからの染色の信号雑音比を示す流動細胞計測実験は,633nmレーザー及び780/60nm PMT検出器を備えたBD LSR II上で実施した。色素No.29は極僅かな背景を有する良好な蛍光信号を発し,一方,APC-AF750(登録商標)直列色素は有意に非特異的な染色であることを結果は示した。色素No.29は633nmでの吸収が極僅かであり,一方,直列色素はドナー色素であるAPCによって該レーザー波長において最大吸収に近い。APC-AF750(登録商標)色素などの直列色素は相当に製造困難であるため,色素No.29などの単純な色素と比べて製造に費用がかかるため,本発明の近赤外色素は波長633nm以下の励起光源を用いる流動細胞計測分析に特に有利である。
図17は,本発明の色素,色素No.31(表3),Thermo Fisher社からのDylight(登録商標)800色素及びLi-Cor Biosciences社からのIRDye 800(登録商標)CW色素という全てが同様の波長を有する色素を接合したヤギ抗マウスIgGの全蛍光対標識度(DOL)を示す。色素No.31は,他の二種類の色素より広範囲のDOLにわたって有意に高輝度であることをデータは示す。
図18は,流動細胞計測により計測した色素No.31(表3),Thermo Fisher社からのDylight(登録商標)800色素及びLi-Cor Biosciences社からのIRDye 800(登録商標)CW色素の各々で標識したヤギ抗マウスIgG,抗体で染色したジャーカット細胞の相対蛍光レベルを示す。三種類の近赤外色素の蛍光消光を評価するため,表示された異なる数個の標識度(DOL)で各色素によって抗体を標識した。細胞を最初にマウス抗ヒトCD3抗体で標識し,その後,標識された二次抗体の一つで染色した。標識した各二次抗体からの背景蛍光を計測するため,細胞を一次抗体なしで直接各蛍光二次抗体でも染色した(アイソタイプ,暗色コラム)。色素No.31は,Dylight(登録商標)800色素及びIRDye 800(登録商標)CW色素の両方より広範囲のDOLにわたって有意に高輝度であり,色素No.31は他の二種類の色素よりもはるかに良好な信号雑音比であることを結果は示す。
図19は,近赤外色素である本発明の色素No.32(表3),及び三種類の分光的に類似の近赤外蛍光性基を持つGE Healthcare社からのCy5.5(登録商標)色素,invitrogen社からのAlexa Fluor 680(登録商標)(AF680)色素及びThermo Fisher社からのDylight(登録商標)680色素の各々で接合したヤギ抗マウスIgGの全蛍光対標識度(DOL)のプロット図である。蛍光測定はPBS7.4緩衝剤中室温で660nm励起を用いて実施した。Cy5.5(登録商標),Alexa Fluor 680(登録商標)及びDylight(登録商標)680と比べて,本発明の蛍光性基は,広範囲の標識度においてより高い蛍光量子収率であることをデータは示している。
図20A及びBは,個々の四種類の異なる近赤外色素で標識したヤギ抗マウスIgG,抗体で染色したジャーカット細胞の相対蛍光レベルに関するデータを示す。図20Aは,流動細胞計測により計測した色素No.32(表3),GE Healthcare社からのCy5.5(登録商標)色素,Thermo Fisher社からのDylight(登録商標)680色素又はinvitrogen社からのAlexa Fluor 680(登録商標)(AF680)色素で標識した抗体で染色したジャーカット細胞の相対蛍光レベルを示す。四種類の近赤外色素の蛍光消光を評価するため,1色素当たり表示された異なる1種又は2種の標識度(DOL)で各分量のヤギ抗マウスIgG,抗体を標識し,八系統の抗体を形成した。細胞を最初にマウス抗ヒトCD3抗体で標識し,その後,標識された二次抗体の一つで染色した。標識した各二次抗体からの背景蛍光を計測するため,細胞を一次抗体なしで直接各蛍光二次抗体でも染色した(アイソタイプ,暗色コラム)。図20Bは,図20Aでの染色の信号雑音比(S/N)に関するプロット図である。色素No.32は,他の三種類の市販近赤外色素から調製した接合物よりもはるかに高輝度であり,該接合物よりも染色においてより特異的であることをデータは示す。
Claims (113)
- 式Iの化合物であって,
Tは,1以上の化学結合で形成された結合部位であり,3以上の別個の部位と結合しており,前記結合部位が約1〜100原子を含み,
m及びnは,独立に0〜20の範囲の整数であり,
R1,R2及びR3は,各々独立に(R)p-(L)q-であって,
R1,R2及びR3のLは,各々独立に1以上の化学結合で形成された連結部位であり,約1〜100原子を含み,
R1,R2及びR3のpは,各々1〜20の範囲の整数であり,
R1,R2及びR3のqは,各々0〜20の範囲の整数であり,
R1,R2及びR3のRは,各々独立に,
i)反応性基質と反応し共有結合を形成可能な反応基,
ii)水溶性高分子基,
iii)アルキル基,トリフルオロアルキル基,ハロゲン基,スルホニル基,スルホン酸基,ホスホン酸基又はスルホンアミド基,若しくは,
iv)-Hであって,少なくともR1,R2及びR3のR一つが反応基であり,少なくともR1,R2及びR3のR他の一つが水溶性高分子基である,式Iの化合物。 - 前記フルオロフォアが,キサンテン色素,クマリン色素,ピレン色素又はシアニン色素である請求項1に記載の化合物。
- 前記フルオロフォアが,クマリン色素である請求項1に記載の化合物。
- 前記フルオロフォアが,ピレン色素である請求項1に記載の化合物。
- 前記フルオロフォアが,ローダミン色素である請求項1に記載の化合物。
- 前記水溶性高分子が,ポリアルキレンオキシドである請求項1に記載の化合物。
- 前記水溶性高分子が,ポリエチレンオキシドである請求項1に記載の化合物。
- 前記水溶性高分子が,炭化水素である請求項1に記載の化合物。
- 前記水溶性高分子が,ポリペプチドである請求項1に記載の化合物。
- 前記水溶性高分子が,約300Daより大きい分子量を有する請求項1に記載の化合物。
- 前記水溶性高分子が,約800Daより大きい分子量を有する請求項1に記載の化合物。
- 前記水溶性高分子が,約800Da〜約3000Daの範囲の分子量を有する請求項1に記載の化合物。
- 前記反応基が,アミノ,スルフヒドリル又はヒドロキシ求核剤と共有結合を形成する請求項1に記載の化合物。
- 前記反応基が,イソチオシアネート,イソシアネート,モノクロロトリアジン,ジクロロトリアジン,ハロゲン置換ピリジン,ハロゲン置換ジアジン,ホスホラミダイト,マレイミド,アジリジン,スルホニルハライド,酸ハロゲン化物,ヒドロキシスクシンイミジルエステル,ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル,テトラフルオロフェノールエステル,イミドエステル,ヒドラジン,アジドニトロフェニル,アジド,アルキン,3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド,グリオキサール又はアルデヒドである請求項1に記載の化合物。
- 前記化合物の最大蛍光励起波長が,約350〜約1200nmの範囲である請求項1に記載の化合物。
- 前記化合物の最大蛍光発光波長が,約360〜約1250nmの範囲である請求項1に記載の化合物。
- 前記フルオロフォアが,下記式のクマリンであって,
Ra,Rb,Rc,Rd,Re及びRfのRが,各々独立に,
i)反応性基質と反応し共有結合を形成可能な反応基,
ii)水溶性高分子基,
iii)アルキル基,トリフルオロアルキル基,ハロゲン基,スルホニル基,スルホン酸基,ホスホン酸基又はスルホンアミド基,若しくは,
iv)-Hであり,
Ra,Rb,Rc,Rd,Re及びRfのLが各々1以上の化学結合で形成された連結部位であり,約1〜100原子を含み,
Ra,Rb,Rc,Rd,Re及びRfのpが各々独立に1〜20の範囲の整数であり,
Ra,Rb,Rc,Rd,Re及びRfのqが各々独立に0〜20の範囲の整数である,
請求項1に記載の化合物。 - 前記フルオロフォアが,1以上のスルホン酸基で置換されている請求項17に記載の化合物。
- 前記フルオロフォアが下記式の化合物であって,
R4,R5及びR6のRが,各々独立に,
i)反応性基質と反応し共有結合を形成可能な反応基,
ii)水溶性高分子基,
iii)アルキル基,トリフルオロアルキル基,ハロゲン基,スルホニル基,スルホン酸基,ホスホン酸基又はスルホンアミド基,若しくは,
iv)-Hであり,
R4,R5及びR6のLが,各々1以上の化学結合で形成された連結部位であり,約1〜100原子を含み,
R4,R5及びR6のpが,各々独立に1〜20の範囲の整数であり,
R4,R5及びR6のqが,各々独立に0〜20の範囲の整数であり,
a,b,及びcが,各々独立に0,1,2又は3である,請求項1に記載の化合物。 - R1が,水溶性高分子基を含み,R2が,反応基を含む請求項21に記載の化合物。
- R1が,ポリエチレングリコールを含む請求項22に記載の化合物。
- R2が,N-ヒドロキシこはく酸イミド基を含む請求項22に記載の化合物。
- 最大蛍光励起波長を有する化合物であって,前記化合物が,式IIの構造を有し,
Yは,F及びΨ間で電子消失しうる架橋単位であり,
Ψは,下記構造の1つを有する部位であって,
b'は,0,1又は2であり,
Ψが式1であり,前記化合物の最大蛍光励起波長が660nmより小さい場合,R5及びR6は,各々独立に(R)p-(L)q-で,R5及びR6は,置換環を形成するように結合せず,
R1,R2,R3,R4,R5及びR6は,各々独立に(R)p-(L)q-であり,
前記化合物の各(R)p-(L)q-のRは,各々独立に
i)反応性基質と反応し共有結合を形成可能な反応基,
ii)水溶性高分子基,
iii)アルキル基,アリール基,アルキルアミノ基,ジアルキルアミノ基,アルコキシ基,トリフルオロアルキル基,ハロゲン基,スルホニル基,スルホン酸基又はスルホンアミド基,
iv)-H,
前記化合物の各(R)p-(L)q-のLは,各々独立に1以上の化学結合で形成された連結部位であり,約1〜100原子を含み,
各(R)p-(L)q-のpは,各々独立に約1〜約20の範囲の整数であり,
R1又はR2の各(R)p-(L)q-のqは,各々独立に0〜約20の範囲の整数であり,
R3,R4,R5,R6又はR7の各(R)p-(L)q-のqは,各々独立に1〜約20の範囲の整数であり,
cは0又は1であり,
dは0又は1であり,
前記化合物の各(R)p-(L)q-のRの少なくとも1つは,反応性部位であり,
前記化合物の各(R)p-(L)q-のRの少なくとも1つは,水溶性高分子である,化合物。 - 少なくとも二つの隣接するR1及び/又は二つの隣接するR2が存在する場合,前記二つの隣接するR1及び/又は二つの隣接するR2は,1以上の(R)p-(L)q-により置換されない又は置換された六員環を形成するように結合している請求項25に記載の化合物。
- 前記二つの隣接するR1及び/又は二つの隣接するR2は,六員環を形成するように結合している場合、形成された環が芳香族である請求項26に記載の化合物。
- Ψが式1であり,前記化合物の最大蛍光励起波長が660nm以上である,又はΨが式1以外である場合,R5及びR6は,各々独立に(R)p-(L)q-,又はR5及びR6は,1以上の(R)p-(L)q-により置換されない又は置換された環状部位を形成するように結合している請求項25に記載の化合物。
- Yが下記であって,
R7は,(R)p-(L)q-であり,
各(R)p-(L)q-のRは,各々独立に
i)反応性基質と反応し共有結合を形成可能な反応基,
ii)水溶性高分子基,
iii)アルキル基,アリール基,アルキルアミノ基,ジアルキルアミノ基,アルコキシ基,トリフルオロアルキル基,ハロゲン基,スルホニル基,スルホン酸基又はスルホンアミド基,
iv)-H,
前記化合物の各(R)p-(L)q-のLは,各々独立に1以上の化学結合で形成された連結部位であり,約1〜100原子を含み,
pは,各々独立に約1〜約20の範囲の整数であり,
qは,各々独立に1〜約20の範囲の整数である,請求項25に記載の化合物。 - R1及びR2のRの少なくとも1つは,荷電部位である請求項25に記載の化合物。
- R1及びR2のRの少なくとも1つが,スルホン酸基又はホスホン酸基を含む請求項25に記載の化合物。
- R1及びR2の各Rが,スルホン酸基又はホスホン酸基を含む請求項25に記載の化合物。
- 前記水溶性高分子が,ポリアルキレンオキシドである請求項25に記載の化合物。
- 前記水溶性高分子が,ポリエチレンオキシドである請求項25に記載の化合物。
- 前記水溶性高分子が,約300より大きい分子量を有する請求項25に記載の化合物。
- 前記水溶性高分子が,約800より大きい分子量を有する請求項25に記載の化合物。
- 前記水溶性高分子が,約800〜約3000の範囲の分子量を有する請求項25に記載の化合物。
- 二つの隣接する(R1)a及び結合している環A中の原子が,炭素環を形成するように結合している請求項26に記載の化合物。
- 前記炭素環が,芳香族である請求項40に記載の化合物。
- 二つの隣接する(R2)b及び結合している環B中の原子が,炭素環を形成するように結合している請求項26に記載の化合物。
- 前記炭素環が,芳香族である請求項42に記載の化合物。
- 前記化合物の最大蛍光励起波長が,約350〜約1200nmの範囲である請求項25に記載の化合物。
- 前記化合物の最大蛍光発光波長が,約360〜約1250nmの範囲である請求項25に記載の化合物。
- 前記水溶性高分子が,ポリアルキレンオキシドである請求項25に記載の化合物。
- 前記水溶性高分子が,ポリエチレンオキシドである請求項25に記載の化合物。
- 前記水溶性高分子が,炭化水素である請求項25に記載の化合物。
- 前記水溶性高分子が,ポリペプチドである請求項25に記載の化合物。
- 前記水溶性高分子が,約300より大きい分子量を有する請求項25に記載の化合物。
- 前記水溶性高分子が,約800より大きい分子量を有する請求項25に記載の化合物。
- シアニン色素の最大蛍光励起波長が660nm以上である,反応基及び1以上の水溶性高分子基を含む置換シアニン色素。
- シアニン色素の最大吸収波長が660nm以上である,反応基及び1以上の水溶性高分子基を含む置換シアニン色素。
- 前記色素が,非スピロ部位によって置換されている請求項59又は60に記載の置換シアニン色素。
- 結合剤が標的ポリペプチドに選択的に結合して錯体を形成し,該錯体の形成によって蛍光の信号雑音比が少なくとも100となる請求項59又は60の置換シアニン色素で標識された結合剤。
- 前記置換シアニン色素が,非スピロ置換基によって置換されている請求項62に記載の結合剤。
- 前記結合剤が,ポリペプチドである請求項62に記載の結合剤。
- 前記ポリペプチドが,抗体である請求項63に記載の結合剤。
- 式IIIの化合物であって,
X2が,-OH,-NH2又は-NR8R9であり,
R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8及びR9は,各々独立に(R)p-(L)q-であり,
R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8及びR9のRは,各々独立に
i)反応性基質と反応し共有結合を形成可能な反応基,
ii)水溶性高分子基,
iii)アルキル基,トリフルオロアルキル基,ハロゲン基,スルホン酸基又はスルホンアミド基,
iv)-H,
R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8及びR9のLは,各々独立に1以上の化学結合で形成された連結部位であり,約1〜100原子を含み,
R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8及びR9のpは,各々独立に1〜20の範囲の整数であり,
R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8及びR9のqは,各々独立に0〜20の範囲の整数であり,
a,b,c,d及びeは,各々独立に0,1,2,3又は4であり,
R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8及びR9のRの少なくとも1つは,反応性部位であり,
R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8及びR9のRの少なくとも1つは,水溶性高分子基である,化合物。 - R6,R7,R8及びR9の少なくとも1つが,1以上の(R)p-(L)q-により置換されない又は置換された5員環又は6員環を形成するように,隣接するR1又はR2及び隣接するR1又はR2が結合しているいずれかの環中の介在原子と結合可能である請求項66に記載の化合物。
- 前記R6,R7,R8及びR9の少なくとも1つ及び隣接するR1又はR2が,5員環又は6員環を形成するように,結合可能である場合,前記環が不飽和である請求項67に記載の化合物。
- 前記R6,R7,R8及びR9の少なくとも1つ及び隣接するR1又はR2が,5員環又は6員環を形成するように,結合可能である場合,前記環が飽和である請求項67に記載の化合物。
- X1が,=NH2 +である請求項66に記載の化合物。
- X1が,=Oである請求項66に記載の化合物。
- X2が,-OHである請求項66に記載の化合物。
- X2が,-NH2である請求項66に記載の化合物。
- 前記化合物の最大蛍光励起波長が,約450〜約750nmの範囲である請求項66に記載の化合物。
- 前記化合物の最大蛍光発光波長が,約470〜約800nmの範囲である請求項66に記載の化合物。
- 式Vの化合物であって,
R1,R2,R3及びR4のRは,各々独立に
i)反応性基質と反応し共有結合を形成可能な反応基,
ii)水溶性高分子基,
iii)アルキル基,トリフルオロアルキル基,ハロゲン基,ホスホン酸基,スルホン酸基又はスルホンアミド基,
iv)-H,
R1,R2,R3及びR4のLは,各々独立に1以上の化学結合で形成された連結部位であり,約1〜100原子を含み,
R1,R2,R3及びR4のpは,各々独立に1〜20の範囲の整数であり,
R1,R2,R3及びR4のqは,各々独立に0〜20の範囲の整数であり,
a,b,c及びdは,各々独立に0,1,2又は3であり,
R1,R2,R3及びR4のRの少なくとも1つは,反応性部位であり,
R1,R2,R3及びR4のRの少なくとも1つは,水溶性高分子基である,化合物。 - i)請求項1,25,59,60,66又は76に記載の化合物,ii)緩衝剤,iii)接合生成物を精製する材料又は装置,iv)前記化合物の使用を説明する使用説明書,を含むキット。
- 請求項1,25,59,60,66又は76に記載した式の構造を有する標識を含む生体分子であって,前記式の前記少なくとも1つの反応性部位が,前記標識を前記生体分子に結合する反応を起こした生体分子。
- 前記生体分子が,ポリヌクレオチドを含む請求項78に記載した標識を含む生体分子。
- 前記生体分子が,ポリペプチドを含む請求項78に記載した標識を含む生体分子。
- 前記ポリペプチドが,更に抗原結合部位を含む請求項80に記載の生体分子。
- 前記ポリペプチドが,完全免疫グロブリンである請求項80に記載の生体分子。
- 前記ポリペプチドが,Fabフラグメントである請求項80に記載の生体分子。
- 請求項1,25,59,60,66又は76に記載した式の構造を有する標識を含む免疫グロビンであって,前記式の前記少なくとも1つの反応性部位が,前記標識を前記免疫グロビンに結合する反応を起こし,前記免疫グロビンが,がん細胞上の抗原と特異的に結合する抗体である免疫グロビン。
- 前記抗体が,erb2と結合する請求項84に記載の免疫グロビン。
- 請求項1,25,59,60,66又は76に記載の化合物と基質生体分子とを,前記化合物と前記基質生体分子間を架橋するのに十分な条件で,反応させる工程を備える標識生体分子の調製方法。
- 前記基質生体分子が,ポリペプチド,ポリヌクレオチド,炭化水素,脂質又はこれらの組合せである請求項86に記載の方法。
- 前記基質生体分子が,ポリヌクレオチドである請求項87に記載の方法。
- 集団内で隣接細胞に関連した細胞を特異的に標識する,集団内の細胞を標識する方法であって,前記方法は,前記生体分子が細胞を表示する結合相手と結合する標的部位を含み,前記部位によって集団内の隣接細胞に関連した細胞を特異的に標識する,細胞を請求項78に記載の生体分子と接触させる工程を備える方法。
- さらに細胞をイメージングする工程を供える方法であって,
前記イメージング工程が,
i)細胞へ励起波長を当てる工程と,
ii)細胞から発光された蛍光を検出する工程と,
を備える請求項89に記載の方法。 - インビトロで標識が起こる請求項89に記載の方法。
- インビボで標識が起こる請求項89に記載の方法。
- ポリアルキレンオキシド及び最大吸収波長が685nm以上であるフルオロフォアを含む蛍光性化合物によって標識された免疫グロブリン。
- ポリアルキレンオキシド及び最大吸収波長が750nm以上であるフルオロフォアを含む蛍光性化合物によって標識された免疫グロブリン。
- 前記免疫グロビンが,前記蛍光性化合物との接合における標的への結合特異性を保持する請求項93又は94に記載の免疫グロビン。
- 前記免疫グロビンが,がん細胞上の抗原と特異的に結合する抗体である請求項95に記載の免疫グロビン。
- 前記抗体が,erb2と結合する請求項96に記載の免疫グロビン。
- 前記蛍光性化合物が,請求項1,25,59,60又は66に記載の化合物である請求項93又は94に記載の免疫グロビン。
- 蛍光性化合物によって標識されたポリペプチドであって,請求項1,25,59,60,66又76に記載の化合物である蛍光性化合物を欠く対応するポリペプチドの半減期よりも短くない血清半減期を示すポリペプチド。
- 前記ポリペプチド及び結合剤を含む錯体の形成工程を備えるポリペプチドの標識方法であって,前記結合剤が,請求項1,25,59,60,66又は76に記載した式の構造を有する蛍光標識を含み,前記式の前記少なくとも1つの反応性部位が,前記標識を前記結合剤に結合する反応を起こしたポリペプチドの標識方法。
- 前記結合剤が抗体である請求項100に記載の方法。
- 前記錯体が,(a) 前記ポリペプチドと結合する一次抗体,及び,(b)二次抗体に対する結合能力を示して二次抗体として機能する結合剤を含む請求項101に記載の方法。
- 標識が,固体基質上で起こる請求項102に記載の方法。
- ポリペプチドを細胞内で標識する請求項102に記載の方法。
- 前記錯体が,約100より大きい信号雑音比を生成する方法であって,前記信号雑音比が,下記式によって算出される請求項102に記載の方法。
(順次結合剤と結合する一次抗体によって結合したポリペプチドを含む錯体からの蛍光信号)/(ポリペプチド,アイソタイプ対照一次抗体及び結合剤の混合物からの蛍光信号) - 前記錯体が,約250より大きい信号雑音比を生成する方法であって,前記信号雑音比が,下記式によって算出される請求項102に記載の方法。
(順次結合剤と結合する一次抗体によって結合したポリペプチドを含む錯体からの蛍光信号)/(ポリペプチド,アイソタイプ対照一次抗体及び結合剤の混合物からの蛍光信号) - 前記錯体が,約270より大きい信号雑音比を生成する方法であって,前記信号雑音比が,下記式によって算出される請求項102に記載の方法。
(順次結合剤と結合する一次抗体によって結合したポリペプチドを含む錯体からの蛍光信号)/(ポリペプチド,アイソタイプ対照一次抗体及び結合剤の混合物からの蛍光信号) - 前記錯体が,標識度がDyLight 680(登録商標)色素に匹敵する,同一の一次抗体及び同一の二次抗体により形成された錯体によって生成した全蛍光信号より少なくとも5%より大きい全蛍光信号を生成する請求項102に記載の方法。
- 前記錯体が,標識度がCy5.5(登録商標)色素に匹敵する,同一の一次抗体及び同一の二次抗体により形成された錯体によって生成した全蛍光信号より少なくとも5%より大きい全蛍光信号を生成する請求項102に記載の方法。
- 前記錯体が,標識度がAlexa Fluor 680(登録商標)色素に匹敵する,同一の一次抗体及び同一の二次抗体により形成された錯体によって生成した全蛍光信号より少なくとも5%より大きい全蛍光信号を生成する請求項102に記載の方法。
- 各錯体が,635nm又は633nmで励起される請求項111に記載の方法。
- 各錯体が,同一タンパク質濃度で存在する請求項111に記載の方法。
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