CN112147113B - 香豆素衍生物在二氧化硫定量检测中的应用 - Google Patents

香豆素衍生物在二氧化硫定量检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供香豆素衍生物在二氧化硫定量检测中的应用，以香豆素衍生物作为荧光探针，实现二氧化硫残留的定量检测和低含量检测。

Description

香豆素衍生物在二氧化硫定量检测中的应用
技术领域
本发明属于二氧化硫残留检测领域，具体涉及一种香豆素衍生物二氧化硫定量检测中的应用。
背景技术
在中药材的加工过程中，硫磺熏蒸方法常用于中药材的防虫、防霉、防腐、保持水分和增加外观色泽等，但大量的使用硫磺熏蒸，会造成二氧化硫残留量过大，进一步危害人体健康，如实验研究表明，过量的SO2残留可对肠胃、肝脏及免疫***等造成损害。根据文献记载，加工中需要用硫磺熏蒸的药材有：人参(糖参、生晒参)、黄连(云连)、川贝母、浙贝母、白芷、白及、牛膝、山药、泽泻、天麻、天冬、天花粉、天南星、乌头(白附片)、半夏、葛根、山奈、百合、白附子、金银花、菊花(亳菊、怀菊)、甘遂。在贮藏中使用硫磺杀虫、防虫的中药材更多，有文献记载的大约有50种。《中国药典》2015版一部中药材二氧化硫残留量规定：照二氧化硫残留量测定法，山药、天冬、天花粉、天麻、牛膝、白及、白术、白芍、党参、粉葛这些传统习用硫熏的中药材不得过400mg/kg。其他中药材中药材及饮片二氧化硫残留量不得超过150mg/kg。
目前，对于二氧化硫检测的荧光探针，所涉及的反应机理主要有乙酰丙酮酸酯的加成、醛基加成、其他双键的麦克尔加成、C＝N键异构化等，如光致诱导电子转移、分子内电荷转移、荧光共振能量转移、C＝N键异构化、聚集导致荧光增强和羧酸螺环开关等机理。现有技术中也报道了一些属于上述反应机理的检测用化合物和检测方法，但都仅仅是有无的检测，还没有一种定量检测和低浓度(或含量)检测方法。同时，探针的选择性和灵敏度有限，导致检测结果准确度不高。因此，寻找一种具有高选择性和灵敏度的荧光探针，并实现对残留二氧化硫进行定量检测，甚至研究出对应的快速检测装置具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供香豆素衍生物在二氧化硫定量检测中的应用，以香豆素衍生物作为荧光探针，实现二氧化硫残留的定量检测和低含量检测。
由于在中性水溶液及中药材中二氧化硫以其两种衍生物亚硫酸氢根和亚硫酸根的平衡形式存在，故本发明提供一种高选择性和灵敏度的检测中药材中亚硫酸根和亚硫酸氢根的荧光探针和相应检测方法。
荧光探针通常由两部分组成：识别基团和信号基团。由于二氧化硫气体在中药材中以SO3 2-和/或HSO3 -的形式存在，基于SO3 2-和/或HSO3 -的亲核性，将双键作为识别基团用于检测HSO3 -，作为香豆素衍生物的SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针，用于检测中药材中，或其他有可能存在二氧化硫残留的产品中的二氧化硫残留量。
本文所研究的香豆素衍生物的SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针是以荧光共振能量转移(FRET)的双键麦克尔加成机理进行的，SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针与SO2的反应是加成反应，反应位点是香豆素环外双键。由于SO2易溶于水，因此常将SO2转换成HSO3 -进行检测。在弱酸性条件下亚硫酸氢盐、亚硫酸盐与香豆素衍生物的SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针反应生成香豆素衍生物的磺酸盐荧光化合物，荧光强度比与其浓度呈正比。本文所研究的香豆素衍生物的SO3 2-和/或HSO3 -探针本身是一种在可见光下呈红色荧光，在365nm紫外灯下呈***荧光的化合物，其结构中吡喃环以外的碳碳双键与SO3 2-发生加成反应后，由于阻断了SO3 2-和/或HSO3 -探针内部的电子转移，生成在可见光下呈黄色荧光，在365nm紫外灯下呈绿色荧光的化合物，显色程度与SO3 2-浓度成正相关。因此通过显色程度可反映出SO3 2-浓度，根据SO3 2-浓度与SO2浓度转化关系进一步可反映出待测样品中SO2残留，从而实现可视化荧光检测SO3 2-。
本发明提供的香豆素衍生物作为SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针的应用，所述香豆素衍生物化学结构式如下：
Figure BDA0002311094630000021
其中，R1、R2、R3中至少一个为吸电子基团；R4或R5为推电子基团，且整个化学结构呈共轭增加结构；
进一步地，R1、R2选自-H、-CN、
Figure BDA0002311094630000022
R3选自-H、-CN、-Cl、-NO2；R4选自-H、-Me、-OH等；R5选自-OH、-NH2、-NMe2、-NEt2、-OMe；R选自-H、-CN、苯基、烯基。
本发明还提供了上述化合物的一下用途。
本发明提供香豆素衍生物在检测二氧化硫中的应用。
本发明提供香豆素衍生物在在检测有二氧化硫残留的产品中二氧化硫残留量的应用。
进一步地，在检测时香豆素衍生物是作为SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针，对SO3 2-和/或HSO3 -进行检测。
进一步地，所述二氧化硫残留的产品包括中药材、食品。
进一步地，所述香豆素衍生物为
Figure BDA0002311094630000023
上述应用，需对所述中药材进行预处理，处理方法包括以下内容：
将中药材与水混合加热至沸腾，以羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液为吸收液收集SO2气体，再以香豆素衍生物溶液为SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针进行酸碱滴定，滴定过程中观察和记录颜色变化，根据SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针的标准比色卡比对得SO3 2-的浓度，即测得中药材样品中二氧化硫残留量。
本发明提供一种SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针组合物，包括结构式如下的香豆素衍生物中的至少一种，
Figure BDA0002311094630000024
其中，R1、R2、R3中至少一个为吸电子基团；R4或R5为推电子基团，且整个化学结构呈共轭增加结构；
进一步地，R1、R2选自-H、-CN、
Figure BDA0002311094630000031
R3选自-H、-CN、-Cl、-NO2；R4选自-H、-Me、-OH等；R5选自-OH、-NH2、-NMe2、-NEt2、-OMe。
本发明提供一种二氧化硫残留检测装置，其特征在于，以香豆素衍生物为SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针，所述香豆素衍生物化学结构式如下：
Figure BDA0002311094630000032
其中，R1、R2、R3中至少一个为吸电子基团；R4或R5为推电子基团，且整个化学结构呈共轭增加结构；
进一步地，R1、R2选自-H、-CN、
Figure BDA0002311094630000033
R3选自-H、-CN、-Cl、-NO2；R4选自-H、-Me、-OH等；R5选自-OH、-NH2、-NMe2、-NEt2、-OMe；R选自-H、-CN、苯基、烯基。
本发明提供二氧化硫残留检测方法，以香豆素衍生物为SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针，对二氧化硫进行定量检测，所述香豆素衍生物化学结构式如下：
Figure BDA0002311094630000034
其中，R1、R2、R3中至少一个为吸电子基团；R4或R5为推电子基团，且整个化学结构呈共轭增加结构；
进一步地，R1、R2选自-H、-CN；
Figure BDA0002311094630000035
R3选自-H、-CN、-Cl、-NO2；R4选自-H、-Me、-OH等；R5选自-OH、-NH2、-NMe2、-NEt2、-OMe；R选自-H、-CN、苯基、烯基。
上述应用或方法中，需对所述产品进行预处理，处理方法包括以下内容：
将产品与水混合加热至沸腾，以羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液为吸收液收集SO2气体，再以香豆素衍生物溶液为SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针进行酸碱滴定，滴定过程中观察和记录颜色变化，根据SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针的标准比色卡比对得SO3 2-的浓度，即测得中药材样品中二氧化硫残留量。
上述应用或方法中，对所述产品进行预处理的方法还可以是，包括以下内容：
将产品与水、盐酸混合加热至沸腾，以羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液为吸收液收集SO2气体；
进一步地，将香豆素衍生物溶液与吸收了SO2的吸收液混合，通过混合后吸收液的颜色与SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针的标准比色卡比对得SO3 2-的浓度，即测得中药材样品中二氧化硫残留量；
进一步地，在观察混合后240～300s的液体颜色与比色卡对比。
上述应用或方法中，对所述产品进行预处理的方法还可以是，包括以下内容：
将产品与50％乙醇的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液混合超声处理得提取液；
所述50％乙醇的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，其中的50％是指乙醇的体积分数，由50％的无水乙醇和50％的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)缓冲水溶液配制，整体构成50％乙醇的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)缓冲溶液。
进一步地，将香豆素衍生物溶液与提取液混合，通过混合后提取液的颜色与SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针的标准比色卡比对得SO3 2-的浓度，即测得中药材样品中二氧化硫残留量；
进一步地，在观察混合后240～300s的液体颜色与比色卡对比。
所述羟乙基哌嗪乙硫磺酸即是指(N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)。
本发明还提供了本发明香豆素衍生物的制备方法，包括如下内容：
(1)将4-(二乙氨基)水杨醛与丙二酸二乙酯反应得到中间体1，哌啶做催化剂，其中，4-(二乙氨基)水杨醛：丙二酸二乙酯：哌啶的摩尔比为1：(2～3)：(0.2～0.4)；
(2)将中间体1通过环化反应得到中间体2；
(3)将中间体2通过Vilsmeier-Haack反应得到中间体3；
(4)将中间体3与丙二腈反应得到权利要求6所述的香豆素衍生物，哌啶做催化剂，其中，中间体3：丙二腈：哌啶的摩尔比为1：(2～3)：(0.5～1.5)，反应温度为0～10℃；
进一步地，步骤(1)中，4-(二乙氨基)水杨醛：丙二酸二乙酯：哌啶的摩尔比为1：2.4：0.35，溶剂为乙醇；
进一步地，步骤(2)的反应条件为以乙酸：浓盐酸体积比为1：(0.8～1.2)的溶液为溶剂，在80～140℃下反应；其中，乙酸：浓盐酸体积比优选1：1，反应温度优选120℃；
进一步地，步骤(3)的反应条件为以DMF：POCl3体积比为(3～5):1的溶液为溶剂，在50～75℃下反应；其中，DMF：POCl3体积比优选4:1，反应温度优选65℃；
进一步地，步骤(4)中，中间体3：丙二腈：哌啶的摩尔比为1：2.4：1，反应温度为0～5℃，溶剂为乙醇。
所述浓盐酸是指市售的浓度为36％～38％的浓盐酸。
检测反应原理如下：
Figure BDA0002311094630000041
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种新的SO3 2-和/或HSO3 -探针，并建立了比色彩检测方法，可快速检测二氧化硫残留量的大小和范围值，实现了中药材中二氧化硫残留的定量检测。
附图说明
图1是本发明探针不同检测时间的结果对照图；
图2是检测不同浓度的二氧化硫溶液的紫外动力学吸收图；
图3是检测30mg/L左右浓度的二氧化硫溶液的紫外动力学吸收图；
图4是不同检测时间考察对照图；
图5是不同pH条件对检测的影响；
图6是本发明探针在不同用量下对检测效果的影响；
图7是以50％乙醇的DMF-HEPES buffer做溶剂的检测结果；
图8是以50％乙醇的DMF-HEPES buffer做溶剂检测30mg/L左右浓度的二氧化硫溶液的结果；
图9是不同温度对检测结果的影响；
图10是可见光和365nm紫外光下探针XDST离子选择性显色结果；
图11是标准比色卡，a)为可见光下二氧化硫标准对照液显色图，b)为365nm紫外光下二氧化硫标准对照液显色图；
图12是未硫熏的中药材的检测结果(图中分别是可见光和365nm紫外光下的照片)；
图13是检测时间为30s时可见光下的检测结果；
图14是根据可见光下30s时的检测结果制定的比色卡；
图15是检测时间为30s时365nm紫外光下的检测结果；
图16是根据365nm紫外光下30s时的检测结果制定的比色卡；
图17是探针离子选择性检测结果(可见光下，30s)；
图18是探针离子选择性检测结果(365nm紫外光下，30s)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明做进一步说明。以下所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
本实施例中，所述DMF-HEPES buffer是指(N,N-二甲基甲酰胺)-(N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)缓冲溶液；
本实施例中所述“当量”，是指以某一物质的用量(物质的量)为基础(即1当量)，其它物质与该物质的用量(物质的量)比值。
实施例1
化合物
Figure BDA0002311094630000051
的合成方法如下：
以4-(二乙氨基)水杨醛(109.213mmol)与丙二酸二乙酯(≥109.213mmol)在哌啶和乙醇存在下进行环化反应，回流6小时得中间体1(54.606mmol)。再溶于比例为(1：1)的乙酸与Conc.HCl(浓盐酸)溶液中，120℃下反应16小时，进行伴有浓缩的脱羧反应得中间体2。中间体2(27.303mmol)在DMF-POCl3体系中将温度调整到65℃反应12小时，进行Vilsmeier-Haack反应得中间体3。在哌啶和乙醇的存在下中间体3(13.651mmol)和丙二腈(≥13.651mmol)通过Knoevenagel反应得初步样品。冷却至室温，过滤并干燥得产品SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针，计算产率。
在上述合成路线的基础上，发明人进行了一系列具体的合成方法的探索，但最终产率仍然不高，最终，发明人意外的发现，当各步骤的原料在特定的摩尔比下，且由中间体3合成探针XDST的步骤中采用低温时，产率显著提升，最佳的合成方法如下。
具体制备方法为：
(1)取4-(二乙氨基)水杨醛(25g，129.53mmol)，2.4当量丙二酸二乙酯(47.14ml，310.872mmol)，100ml无水乙醇加入反应器中，待溶解后加入0.35当量的哌啶(4.143ml)。反应约6h完全，回收溶剂，浓缩得黄色油状物中间体1，柱层析，环己烷与乙酸乙酯为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩至干，即得黄色晶体状中间体1(19.875g，收率53.09％)。
(2)取19.875g中间体1溶于比例为V:V＝1:1的乙酸与Conc.HCl溶液中，乙酸与Conc.HCl溶液的混合溶液作反应溶剂，溶剂共300ml，120℃下反应16h，反应完全后降至室温，加入8倍量水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和碳酸氢钠洗至中性，无水硫酸钠干燥，浓缩得黄色粘稠液体，取出常温自然冷却，即得黄色固体物质中间体2(14.806g，收率99.21％)。
(3)取14.806g中间体2(68.23mmol)在34.2ml的DMF-POCl3(V:V＝4:1)体系中将温度调整到65℃反应12小时，反应完全后将反应液降至室温，加入8倍量水，分散液放入4℃冰箱重结晶，抽滤，真空干燥，即得黄色固体物中间体3(10.712g，收率64.08％)。
(4)称取2.555g中间体3，2.4当量丙二腈和1当量哌啶，并量取30ml无水乙醇，加入到100ml反应器，0℃下反应4.5h，停止反应，用稀HCl中和至中性，加入适量硅胶，浓缩至干，柱层析，环己烷:乙酸乙酯(4:1)为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩至干，即得红色粉末状探针样品(2.016g，收率78.91 65.99％)
并进行1HNMR和高分辨质谱测定，表征最终产物结构。合成路线如下：
Figure BDA0002311094630000061
7-(二乙氨基)-2-氧-2H-苯并吡喃-3-羧化物(中间体1)：得黄色晶体，收率79.5％，MS m/z＝290.1361(M+1)；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:1.14(t,6H,J＝8.0Hz,H-CH2CH2),1.28(t,3H,J＝8.0Hz,H-CH2CH2),3.45～3.50(q,4H,J＝8.0Hz,H-CHCH3),4.20～4.25(q,2H,J＝8.0Hz,H-CHCH3),6.52～6.53(d,1H,1.5Hz,CHCCH),6.75～6.77(dd,1H,J1＝7.5Hz,CHCH,J2＝1.5Hz,CHCCH),7.60～7.63(d,1H,J1＝7.5Hz,CHCH),8.53(s,1H,CH)。
7-(二乙氨基)-香豆素(中间体2)：得黄色固体，收率74.5％，MS m/z＝218.1174(M+1)；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:1.12(t,6H,J＝8.0Hz,H-CH2CH2),3.39～3.45(q,4H,J＝8.0Hz,H-CHCH3),5.97～5.99(d,1H,10.9Hz,CH＝CH),6.50～6.51(d,1H,J＝1.5Hz,CHCCH),6.66～6.69(dd,1H,J1＝7.5Hz,CHCH,J2＝1.5Hz,CHCCH),7.41～7.43(d,1H,7.5Hz,CHCH),7.80～7.82(d,1H,J＝10.9Hz,CH＝CH)。
7-(二乙氨基)-2-氧-2H-苯并吡喃-3-甲醛(中间体3)：得黄色固体，收率72.35％，MS m/z＝246.1127(M+1)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:1.15(t,6H,J＝8.0Hz,H-CH2CH2),3.48～3.54(q,4H,J＝8.0Hz,H-CHCH3),6.60～6.61(d,1H,1.5Hz,CHCCH),6.81～6.84(dd,1H,J1＝7.5Hz,CHCH,J2＝1.5Hz,CHCCH),7.67～7.69(d,1H,J1＝7.5Hz,CHCH),8.41(s,1H,-1.0Hz,H>C＝C<C-H),9.89(s,1H,CHO)。
2-((7-(二乙氨基)-香豆素)亚甲基)丙二腈(目标探针XDST)：得红色粉末，收率78.91％，MS m/z＝294.1199(M+1)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:1.16(t,6H,J＝8.0Hz,H-CH2CH2),3.53～3.58(q,4H,J＝8.0Hz,H-CHCH3),6.66(d,1H,1.5Hz,CHCCH),6.85～6.88(dd,1H,J1＝7.5Hz,CHCH,J2＝1.5Hz,CHCCH),7.61～7.63(d,1H,J1＝7.5Hz,CHCH),8.01(s,1H,CH),8.60(s,1H,CH)。
对照例1
1、步骤(1)中，4-(二乙氨基)水杨醛：丙二酸二乙酯：哌啶的摩尔比为1：1.2：0.35，其余反应条件同实施例1，步骤(1)的产率为30.25％。
2、步骤(4)中，中间体3：丙二腈：哌啶的摩尔比为1：1.2：1.0，其余反应条件同实施例1，步骤(4)的产率为35.2％。
3、步骤(4)中，中间体3：丙二腈：哌啶的摩尔比为1：2.4：0.35，其余反应条件同实施例1，步骤(4)的产率为39.6％。
4、步骤(4)中，中间体3：丙二腈：哌啶的摩尔比为1：2.4：1.0，反应温度为室温(25℃左右)，其余反应条件同实施例1，步骤(4)的产率为45.6％。
5、步骤(4)中，中间体3：丙二腈：哌啶的摩尔比为1：2.4：1.0，反应温度为60℃，其余反应条件同实施例1，步骤(4)的产率为43.0％。
对照例中的各个实验仅是发明人在探索最佳合成路线中，众多实验中的几例，通过对照例1中的各个试验可以看出，本发明合成方法中的物料的用量比、反应温度等反应条件，相互搭配发挥了协同增效作用，使得产率得到了显著提升。
实施例2荧光探针检测器应用于中药材二氧化硫残留量测定
建立一种基于香豆素结构类比率型荧光探针检测SO3 2-及中药材中二氧化硫残留量的方法，由于探针反应快，灵敏，这将会缩短检测时间，提高检测效率。其中比率型荧光探针可以消除溶剂等因素引起的光谱干扰，从而降低对测定结果的影响。
此部分的工作包括对探针的荧光光谱进行测定，建立荧光探针的检测限及线性，得出初步的待测物与荧光强度间比例关系，其次再对探针检测条件进行优化，离子选择性进行考察，检测机理进行确证，检测动力学考察等。然后再对该探针检测方法进行方法学考察并用于中药材二氧化硫残留量测定，最后以药典第一法-酸碱滴定法测定结果为标准，对该方法进行评价，得出检测方法。
以下所述探针XDST为
Figure BDA0002311094630000081
SO3 2-和/或HSO3 -探针。
1.1二氧化硫标准溶液的制备
分别称取亚硫酸钠0，0.098，0.196，0.294，0.392，0.490，0.588，0.686，0.784，0.882，0.980，1.078，1.176，1.254，1.274，1.372，1.470mg，依次加N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)缓冲溶液2.5ml配成0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，128，130，140，150mg/L的二氧化硫标准溶液。照2015版《中国药典》四部通则2331项下收载的二氧化硫残留量测定法进行试验，结果确定了所配制二氧化硫标准溶液质量浓度的准确性。其中SO2的质量浓度和亚硫酸钠浓度之间的关系如下：
SO3 2-浓度与SO2浓度的转换关系式：
Figure BDA0002311094630000082
其中，V溶:表示缓冲溶液DMF-HEPES buffer(pH＝7.40,20mmol)的体积；V溶’:表示中药材SO2吸收液的体积；CSO2质:表示SO2质量浓度(mg/L)。
SO2的质量浓度与药典浓度之间的关系式：
CSO2×V溶＝mSO2
所以药典浓度为：
Figure BDA0002311094630000083
1.2单因素试验考察及性质研究
1.2.1荧光探针XDST检测时间的考察
分别取20μmol/L探针溶液2.5mL，以及由0，0.098，0.196，0.294，0.392，0.490，0.588，0.686mg NaSO3分别配制质量浓度为0mg/L，10mg/L，20mg/L，30mg/L，40mg/L，50mg/L，60mg/L，70mg/L的二氧化硫标准对照溶液2.5mL(pH 7.40，0.04mol/L)，依次分别加入到10mL量瓶中，摇匀，室温静置。在可见光下观察反应后溶液的颜色，以2015版《中国药典》的一般药材限硫指标150mg/kg(对应质量浓度30mg/L)为考察对象，并在18s，30s，60s，90s，120s，150s，180s，210s，240s，270s，300s共13个时间点对显色后的溶液进行拍照，拍照结果见图1。
根据图1可知，可见光下0mg/L～30mg/L SO2标准对照溶液在0～18s颜色变化不大，但40mg/L～70mg/L SO2标准对照溶液在0～18s颜色显著变为淡红色或黄色；18s～210s时0mg/L～30mg/L SO2标准对照溶液颜色较稳定，随浓度增大逐渐由红变为淡红，而从18s起，40mg/L～70mg/L SO2标准对照溶液颜色发生明显变化，在30s以后变为黄色；210s后0mg/L～20mg/L SO2标准对照溶液颜色仍然稳定为红色，30mg/L～70mg/L SO2标准对照溶液颜色均变为黄色。以2015版《中国药典》的一般药材限硫指标150mg/kg对应浓度30mg/L的组为考察对象，初步确定荧光探针XDST检测时间为240s。
另外，按照“1.1二氧化硫标准溶液的制备”的方法配制质量浓度为0mg/L，10mg/L，20mg/L，30mg/L，40mg/L，60mg/L，80mg/L，100mg/L，120mg/L，128mg/L，130mg/L，140mg/L，150mg/L的13个二氧化硫对照溶液，转化为药典浓度分别为0mg/kg，50mg/kg，100mg/kg，150mg/kg，200mg/kg，300mg/kg，400mg/kg，500mg/kg，600mg/kg，640mg/kg，650mg/kg，700mg/kg，750mg/kg。依次将配制好的13个二氧化硫对照溶液分别装入到13个对应的10ml比色瓶，用0.5mol/L NaOH调二氧化硫对照溶液pH至7.40，再依次加入20μmol/L探针DMF溶液2.5mL到相应比色瓶中，立即将比色瓶中待测样品转移至比色皿，放入UV-1800紫外-可见分光光度计测定其紫外动力学吸收曲线，测定结果如图2所示。
从检测结果图2来看，SO2质量浓度为0mg/L时，探针XDST的(N,N-二甲基甲酰胺)-(N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)缓冲溶液(pH＝7.40,20mmol)溶液吸光度值在0至120s趋于稳定；当SO2质量浓度不为0mg/L时，随着二氧化硫浓度的增大，初始吸光度值(0s处的吸光度值)逐渐减小，这是由于在转移样品至紫外-可见分光光度计期间，探针与不同浓度的SO3 2-发生迈克尔加成反应所致，其中，各组SO2对照溶液紫外动力学吸收曲线先减小后增加，这是由于SO3 2-亲核攻击探针XDST中4位，破坏了探针XDST中7-二乙氨基香豆素部分的结构，使得紫外红色吸收减弱，接着大部分SO3 2-再重排到环外双键，使得探针XDST中7-二乙氨基香豆素部分的荧光得以部分恢复，此部分恢复荧光为黄色，不影响红色荧光变化；另外，每一个质量浓度对应SO2对照溶液的紫外动力学吸收曲线不同，随着二氧化硫浓度的增大，在10μmol/L探针XDST对SO3 2-的检测范围0～2000μmol/L内，吸光度值减小得越多，减小的速度越快，随后趋于稳定，从30s起，SO2质量浓度大于30mg/L的二氧化硫对照溶液吸光度值较空白组均趋于稳定，且Abs小于0.04，说明相应SO3 2-反应完全，溶液呈现黄颜色，而SO2质量浓度在0至30mg/L范围的二氧化硫对照溶液吸光度值仍然在持续减小，且Abs大于0.04，溶液呈现红色或淡红色。可见，0mg/L～70mg/L SO2标准对照溶液与探针溶液在0～120s的紫外动力学吸收扫描结果和可见光下显色结果一致。
以2015版《中国药典》的一般药材限硫指标150mg/kg对应浓度30mg/L的组为考察对象，进一步考察30mg/L的二氧化硫对照溶液使得探针溶液颜色显著变化的具体时间。分别配制质量浓度为25mg/L，26mg/L，27mg/L，28mg/L，29mg/L，30mg/L，31mg/L，32mg/L，33mg/L，34mg/L，35mg/L，39mg/L，40mg/L，41mg/L的14个二氧化硫对照溶液，转化为药典浓度分别为125mg/kg，130mg/kg，135mg/kg，140mg/kg，145mg/kg，150mg/kg，155mg/kg，160mg/kg，165mg/kg，170mg/kg，175mg/kg，195mg/kg，200mg/kg，205mg/kg(具体见SO2式2)。依次将配制好的14个二氧化硫对照溶液分别装入到13个对应的10ml比色瓶，用0.5mol/L NaOH调二氧化硫对照溶液pH至7.40，再依次加入20μmol/L探针DMF溶液2.5mL到相应比色瓶中，立即将比色瓶中待测样品转移至比色皿，放入UV-1800紫外-可见分光光度计测定其紫外动力学吸收曲线。测定结果如图3所示。
从图3中可以看出，30mg/L的二氧化硫对照溶液使得探针溶液颜色显著变化的具体时间为220s。220s起，30ml/L及以上浓度二氧化硫对照液使得探针溶液颜色呈黄色，小于30ml/L的溶液颜色仍为红色至淡红色。并按照前述方法对质量浓度为25mg/L，26mg/L，27mg/L，28mg/L，29mg/L，30mg/L，31mg/L，32mg/L，33mg/L，34mg/L，35mg/L，39mg/L，40mg/L，41mg/L的14个二氧化硫对照溶液分别在室温下进行探针显色，在可见光下观察反应后溶液的颜色，以2015版《中国药典》的一般药材限硫指标150mg/kg对应浓度30mg/L的组为考察对象，并在18s，30s，60s，90s，120s，150s，180s，210s，240s，270s，300s共13个时间点对显色后的溶液进行拍照，记录结果如图4。
由图4可知，从质量浓度为25mg/L，26mg/L，27mg/L，28mg/L，29mg/L，30mg/L，31mg/L，32mg/L，33mg/L，34mg/L，35mg/L，39mg/L，40mg/L，41mg/L的14个二氧化硫对照溶液的探针显色结果可知，240s为显著区分2015版《中国药典》规定中药材最低限硫指标150mg/kg(30mg/L)的最佳时间起始点。
综上考察结果，240s～300s是显著区分2015版《中国药典》规定中药材最低限硫指标150mg/kg(30mg/L)的最佳时间段，最终确定300s(5min)为观察和比色时间点。
1.2.2荧光探针XDST检测的pH条件考察
分别取3份20μmol/L探针溶液2.5mL，以及pH值依次为6.40，7.40，8.40，且质量浓度分别为30mg/L(150mg/kg)的3份二氧化硫标准对照溶液各2.5mL，依次加入到对应比色瓶中，摇匀，立即将比色瓶中待测样品转移至比色皿，放入UV-1800紫外-可见分光光度计测定其在0～420s的紫外动力学吸收曲线，扫描结果如图5所示。
图5的结果表明pH对30mg/L(150mg/kg)二氧化硫标准对照溶液与探针溶液的显色反应影响较大，为了便于显色判别，pH为7.40合适。
1.2.3荧光探针XDST的用量
分别取20μmol/L探针DMF溶液1mL、2.5mL、4mL各1份，以及质量浓度分别为30mg/L(150mg/kg)的二氧化硫标准对照溶液各3份，对应为4mL、2.5mL、1mL，依次分别加入到6个10ml比色瓶中，摇匀，立即将比色瓶中待测样品转移至比色皿，放入UV-1800紫外-可见分光光度计测定其在0～420s的紫外动力学吸收曲线，扫描结果如图6所示。
图6表明探针用量对30mg/L(150mg/kg)二氧化硫标准对照溶液与探针溶液的显色反应有影响，为了便于显色判别，探针用量为2.5mL较为合适。
1.2.4荧光探针XDST检测的溶剂考察
改良药典法采用的是N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)(pH＝7.40,40mmol)溶液作为SO2提取液及样品检测液。为了确保SO2提取液对SO3 2-的提取程度及样品检测液的澄明度，采用50％乙醇的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)(0.04mol/L)缓冲吸收液作为超声提取法的样品提取液。
所述50％乙醇的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)(0.04mol/L)缓冲吸收液，其中的50％是指乙醇的体积分数，由50％的无水乙醇和50％的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)(0.08mol/L)缓冲水溶液配制，整体构成50％乙醇的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)(0.04mol/L)缓冲溶液。
按照“1.4.1荧光探针XDST检测时间的考察”部分方法在50％乙醇的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)(0.04mol/L)缓冲吸收液中考察10μmol/L探针溶液对0mg/L～70mg/L的8个二氧化硫对照样品在300s内显色变化，结果如图7所示：
以2015版《中国药典》的一般药材限硫指标150mg/kg(对应浓度30mg/L)的组为考察对象，初步确定荧光探针XDST检测时间为240s。
以2015版《中国药典》的一般药材限硫指标150mg/kg(对应浓度30mg/L)的组为考察对象，进一步考察30mg/L的二氧化硫对照溶液使得探针溶液颜色显著变化的具体时间。照“1.4.1荧光探针XDST检测时间的考察”部分方法在50％乙醇的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)(0.04mol/L)缓冲吸收液中考察10μmol/L探针溶液对质量浓度为25mg/L，26mg/L，27mg/L，28mg/L，29mg/L，30mg/L，31mg/L，32mg/L，33mg/L，34mg/L，35mg/L，39mg/L，40mg/L，41mg/L的14个二氧化硫对照样品在300s内显色变化，结果如图8所示。
从图8的显色结果可知，240s为显著区分2015版《中国药典》规定中药材最低限硫指标150mg/kg(30mg/L)的最佳时间起始点，240s～300s是显著区分2015版《中国药典》规定中药材最低限硫指标150mg/kg(30mg/L)的最佳时间段，这与之前“1.4.1荧光探针XDST检测时间的考察”部分的显色变化一致，说明50％乙醇的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)(0.04mol/L)缓冲溶液可以用来提取SO3 2-。
1.2.5荧光探针XDST检测的温度条件考察
分别取20μmol/L探针DMF溶液2.5mL，150mg/kg(30mg/L)的标准二氧化硫对照液2.5mL，各7份于比色小瓶，调节pH至7.40，分别对应取一瓶置于BCD-226WTM(E)型美的电冰箱或HH-S6型电热恒温水浴锅，调节温度分别为0℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，45℃，保持10min。随后取出对应温度下的二氧化硫标准对照液和探针DMF溶液，将待测二氧化硫标准对照液加入相应温度的探针DMF溶液，计时，摇匀。观察各温度下的待测二氧化硫标准对照液在300s内显色变化，结果如图9所示。
从图9的显色结果来看，在0℃，15℃，20℃，25℃，30℃下2015版《中国药典》规定中药材最低限硫指标150mg/kg(30mg/L)对应的标准二氧化硫对照液的显色时间点是240s，这与之前“1.4.1荧光探针XDST检测时间的考察”部分的显色变化一致，而35℃，45℃下对应的显色时间点为90s，这与之前“1.4.1荧光探针XDST检测时间的考察”部分的显色变化不符，表明温度对30mg/L(150mg/kg)二氧化硫标准对照溶液与探针溶液的显色反应有影响，因此，荧光探针XDST检测的温度条件为0～30℃。
1.2.6荧光探针XDST选择性的考察
取20μmol/L探针DMF溶液2.5mL，100当量的SO3 2-、F-、Cl-、Br-、I-、NO2 -、CH3COO-、HPO4 2-、CO3 2-、SO4 2-、S2O3 2-、SCN-、S2O4 2-、H2PO4 -、HCO3 -的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)盐溶液各2.5mL，依次加入到10ml比色瓶中，摇匀，室温静置5min，分别在可见光和365nm紫外光下观察反应后溶液颜色并拍照，记录结果(如图10)。
结果显示，在可见光下，只有SO3 2-与探针XDST发生反应，使得溶液颜色变黄，其他组均为红色。在紫外光下，只有SO3 2-与探针XDST发生反应，使得溶液颜色变绿，绿色荧光增强，其他组均为***；综上所述，说明探针XDST对SO3 2-具有良好的选择性。
1.2.7供试品制备方法
分别采用改良药典法及超声提取法对安徽葛根、河北白芍、广西白术、河南知母、四川牛膝进行前处理，提取其中的二氧化硫残留制备供试液，对比最终的检测效果。
改良药典法：采用N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)缓冲溶液(pH＝7.40,40mmol)溶液吸收改良药典法提取的SO2，即采用改良的酸蒸馏法对药材进行前处理。分别称取各药材约5g，精密称定，置两颈圆底烧瓶中，加水120mL和6mol/L盐酸溶液2mL，导入氮气至瓶底，连接回流冷凝管，在冷凝管上端连接导气管，将导气管***到100mL锥形烧瓶底部，锥形瓶内加N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)
(0.04mol/L)缓冲溶液25mL作为吸收液。加热两颈烧瓶内溶液至沸，保持20min，以确保SO2收集完全。所得SO2吸收溶液密封，避光保存。
超声提取法：分别取药材细粉或剪至约3mm×3mm药材颗粒约5g，精密称定，置100mL锥形瓶中，加50％乙醇的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)(0.04mol/L)缓冲溶液25mL，密塞，超声20min，振摇，滤过，即得供试品溶液。
用两种方法制备得到的供试液的检测结果见表1。
表1
Figure BDA0002311094630000131
显色结果一致，说明采用超声提取法得到的二氧化硫提取液中药材成分对探针XDST显色检测的没有干扰，考虑到操作的简便性，后续检测采用超声提取法制备。
将超声提取法中采用药材细粉和为3mm×3mm药材颗粒进行提取的效果进行对比，制备供试品溶液，并检测安徽山药、牛膝、葛根、白芍、白术、知母药材二氧化硫残留，对比结果见表2。
表2
Figure BDA0002311094630000132
从表2中的结果来看，采用超声提取法对药材细粉和药材颗粒进行处理，得到供试品溶液的显色结果一致。因此，为了便于快速检测，可取用较小的药材饮片或者颗粒进行制备供试样品。
1.3标准比色卡的制备
根据探针XDST对SO3 2-的检测范围为0-2000μmol/L，即探针检测SO2的浓度范围为0～128mg/L，故以2015版《中国药典》的一般药材限硫指标150mg/kg对应浓度30mg/L的组为考察对象，选择0～128mg/L的4个浓度对应SO2标准对照液进行标准比色卡建立(见SO3 2-浓度与SO2浓度的转换关系式)。
取浓度为20μmol/L探针DMF溶液2.5mL，SO2药典浓度分别为0mg/kg(0mg/L)，145mg/kg(29mg/L)，150mg/kg(30mg/L)，155mg/kg(31mg/L)的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)盐溶液各2.5mL，依次加入到10ml比色瓶中，摇匀，室温静置5min，分别在可见光和365nm紫外光下观察反应后溶液颜色并拍照，记录结果(如图11)。
从图11中的可见光显色图片来看，随着SO2浓度的增大，10μmol/L探针XDST的(N,N-二甲基甲酰胺)-(N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)缓冲溶液(pH＝7.40,20mmol)溶液颜色逐渐由红变淡红，最后变黄，在5min时可以明显区分出150mg/kg(30mg/L)及以上浓度二氧化硫对照溶液。
从图11中的紫外光显色图片来看，随着SO2浓度的增大，10μmol/L探针XDST的(N,N-二甲基甲酰胺)-(N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)缓冲溶液(pH＝7.40,20mmol)溶液颜色逐渐由紫红变淡紫红，最后变绿，在5min时可以明显区分出150mg/kg(30mg/L)及以上浓度二氧化硫对照溶液。
综上所述，确定可见光及365nm紫外光下药典浓度为0mg/kg(0mg/L)，145mg/kg(29mg/L)，150mg/kg(30mg/L)，155mg/kg(31mg/L)的4个二氧化硫标准对照液的显色结果即为标准比色卡。
1.4空白试验
分别取未硫熏的安徽亳州牛膝、河南禹州白芍和四川成都葛根，用本发明探针进行药材中的SO2残留检测，检测结果见图12，表明本发明探针的专属性良好。
1.5中药材中二氧化硫残留量的测定
取20μmol/L探针DMF溶液2.5mL，供试品溶液2.5mL，依次加入到10mL比色瓶中，调节pH至7.40，摇匀，室温静置5min。分别在可见光和365nm紫外光下观察反应后溶液的颜色，记录结果。将其与荧光探针XDST的标准比色卡比对得SO3 2-的浓度，即测得中药材样品中二氧化硫残留范围，并判断是否超出规定限量。同时按2015版《中国药典》四部通则2331项下收载的方法测定二氧化硫残留量，结果见表3、表4。
表3探针比色法和酸碱滴定法测得36批中药材中二氧化硫残留结果
Figure BDA0002311094630000141
Figure BDA0002311094630000151
Figure BDA0002311094630000161
表4探针比色法和酸碱滴定法测定36批中药材中二氧化硫残留量的结果对照
Figure BDA0002311094630000162
Figure BDA0002311094630000171
注：①“1”表示荧光探针法和酸碱滴定法的结果相符，“0”表示荧光探针法和酸碱滴定法的结果不符；②“*”表示中药材中二氧化硫残留量含量超过国家标准限量；③准确率＝(探针比色法测得结果得分/药材总数)×100％。
本发明探针XDST对SO3 2-具有显著的显色反应性质，本发明通过建立比色法，测定了购自安徽亳州等五大药材市场的山药等8种共36批中药材含硫量，经多次试验表明，XDST在缓冲溶液中的颜色深浅与二氧化硫残留量的高低成正相关，根据溶液颜色变化即可反映出溶液中二氧化硫残留范围。采用XDST显色法和酸碱滴定法(药典法)分别对购自安徽亳州等五大药材市场的山药等8种共36批中药材含硫量进行测定，结果表明，相较于药典第一法-酸碱滴定法，本发明XDST显色法可快速测定中药材二氧化硫含硫量，并反映出中药材含硫量是否超过2015版《中国药典》规定的一般药材限硫指标150mg/kg，准确率为高达100％。
综上所述，本发明探针XDST显色法具有检测快捷，操作简单，显色灵敏等特点，适用于中药材二氧化硫残留量的快速定性及半定量检测，适合于有关执法等部门现场快速检测，也可用于一般市售药材含硫量的初步筛选，这对提高和控制中药材在流通和使用过程中的质量具有重要意义。此外，本发明方法还可以应用于检测食品中的二氧化硫残留量，如香菇，馒头等。
对照例2
将检测时间为30s的方案来与本发明的最佳方案做对比。
1.探针比色卡建立
取20μmol/L的探针DMF溶液2.5mL，SO2质量浓度分别为0mg/L，10mg/L，20mg/L，30mg/L，40mg/L，50mg/L，60mg/L，70mg/L，80mg/L，90mg/L，100mg/L，110mg/L，120mg/L，128mg/L，130mg/L，140mg/L，150mg/L的HEPES盐溶液各2.5mL，依次加入到10ml比色瓶中，摇匀，室温避光静置30s，分别在可见光和365nm紫外光下观察反应后溶液颜色并拍照，记录结果。
从可见光显色图片(图13)来看，随着SO2浓度的增大，10μmol/L探针XDST的DMF-HEPES buffer(pH＝7.40,20mmol)溶液颜色逐渐由红变淡红，最后变黄。在SO2浓度从0mg/L起到30mg/L，10μmol/L探针XDST的DMF-HEPES buffer(pH＝7.40,20mmol)溶液颜色逐渐由红变淡红。当SO2浓度超过30mg/L，从40mg/L起，10μmol/L探针XDST的DMF-HEPES buffer(pH＝7.40,20mmol)溶液颜色最后变黄。可见质量浓度为30mg/L的SO2标准溶液，即药典浓度为150mg/kg的SO2标准溶液是使得探针XDST的DMF-HEPES buffer(pH＝7.40,20mmol)溶液颜色显著变化的因素(具体见SO2的质量浓度与药典浓度之间的关系式)，而当SO2质量浓度大于或等于40mg/L，直到检测上线128mg/L及更大浓度，探针XDST的DMF-HEPES buffer(pH＝7.40,20mmol)溶液颜色仍旧为黄色不变。因此该探针XDST的DMF-HEPES buffer(pH＝7.40,20mmol)溶液颜色可以明显反映质量浓度为150mg/L及以下的SO2标准溶液浓度，而质量浓度大于150mg/L的SO2标准溶液浓度不能具体反映，可以反映一个范围。故采用PS7.0软件对可见光下SO2质量浓度从0mg/L起到40mg/L对应的共5张图片进行透明样品瓶溶液中部取色，制成标准比色卡，备用。
可见光下0mg/L起至40mg/L SO2的10μmol/L探针XDST的DMF-HEPES buffer(pH＝7.40,20mmol)溶液对应的共5个色卡如图14。五个色卡表示浓度分别表示探针XDST的DMF-HEPES buffer(pH＝7.40,20mmol)溶液中SO2的质量浓度为0mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L、≥40mg/L。转化为SO2的药典浓度即0mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、≥200mg/kg(具体见SO2的质量浓度与药典浓度之间的关系式)。
从紫外光显色图片(图15)来看，随着SO2浓度的增大，透明样品瓶中凹液面处10μmol/L探针XDST的DMF-HEPES buffer(pH＝7.40,20mmol)溶液颜色逐渐由紫红变黄，最后变绿。在SO2浓度从0mg/L起到30mg/L，10μmol/L探针XDST的DMF-HEPES buffer(pH＝7.40,20mmol)溶液颜色逐渐由紫红变黄。当SO2浓度超过30mg/L，从40mg/L起，10μmol/L探针XDST的DMF-HEPES buffer(pH＝7.40,20mmol)溶液颜色最后变绿。可见质量浓度为30mg/L的SO2标准溶液，即药典浓度为150mg/kg的SO2标准溶液是使得探针XDST的DMF-HEPES buffer(pH＝7.40,20mmol)溶液颜色显著变化的因素(具体见SO2的质量浓度与药典浓度之间的关系式)，而当SO2质量浓度大于或等于40mg/L，直到检测上线128mg/L及更大浓度，探针XDST的DMF-HEPES buffer(pH＝7.40,20mmol)溶液颜色仍旧为绿色不变。因此该探针XDST的DMF-HEPES buffer(pH＝7.40,20mmol)溶液颜色可以明显反映质量浓度为150mg/L及以下的SO2标准溶液浓度，而质量浓度大于150mg/L的SO2标准溶液浓度不能具体反映，可以反映一个范围。故采用PS7.0软件对可见光下SO2质量浓度从0mg/L起到40mg/L对应的共5张图片进行透明样品瓶上凹液面边缘取色，制成标准比色卡，备用。
紫外光下0mg/L起至40mg/L SO2的10μmol/L探针XDST的DMF-HEPES buffer(pH＝7.40,20mmol)溶液对应的共5个色卡如图16。五个色卡表示浓度分别表示探针XDST的DMF-HEPES buffer(pH＝7.40,20mmol)溶液中SO2的质量浓度为0mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L、≥40mg/L。转化为SO2的药典浓度即0mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、≥200mg/kg(具体见SO2的质量浓度与药典浓度之间的关系式)。
2.探针离子选择性
方法选择性实验:取20μmol/L在探针浓度为10μmol/L探针DMF溶液2.5mL，100当量(1000μmol/L)的SO3 2-、F-、Cl-、Br-、I-、NO2 -、CH3COO-、HPO4 2-、CO3 2-、SO4 2-、S2O3 2-、SCN-、S2O4 2-、H2PO4 -的HEPES盐溶液各2.5mL，依次加入到10ml比色瓶中，摇匀，室温避光静置30s，分别在可见光和365nm紫外光下观察反应后溶液颜色并拍照，记录结果。
在可见光下(图17)，只有SO3 2-与探针XDST发生迈克尔加成反应，使得溶液颜色变黄，其他组均为红色。在紫外光下(图18)，只有SO3 2-与探针XDST发生迈克尔加成反应，使得溶液颜色变绿，绿色荧光增强，其他组均为红色。
综上所述，说明探针XDST对SO3 2-具有良好的选择性。另外，由于采用HEPES buffer(pH＝7.40,40mmol)溶液吸收改良药典法提取的SO2，与药材煎煮液的关系较小，故药材成分对探针XDST的干扰不大。
3.采用快速荧光测定法(比色法)测定来自安徽亳州、河北安国、广西玉林、河南禹州和四川成都荷花池的山药等6种共30个批号中药材的二氧化硫残留量。
采用改良的酸蒸馏法对药材进行前处理，分别称取各药材约5g，精密称定，置两颈圆底烧瓶中，加水100mL和6mol/L盐酸溶液2mL，导入氮气至瓶底，连接回流冷凝管，在冷凝管上端连接导气管，将导气管***到100mL锥形烧瓶底部，锥形瓶内加HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)(0.04mol/L)缓冲溶液25mL作为吸收液。加热两颈烧瓶内溶液至沸，保持20min，以确保SO2收集完全。所得SO2吸收溶液密封，避光保存。
为了检测药材中的SO2残留，取探针XDST溶液2.5mL，样品吸收溶液2.5mL，依次加入到10mL比色瓶中，构成探针XDST的DMF-HEPES buffer(pH＝7.40,20mmol)介质体系，摇匀，室温避光静置30s。分别在可见光和365nm紫外光下观察反应后溶液的颜色，记录结果。根据SO3 2-/HSO3 -荧光探针的标准比色卡(具体见标准比色卡)比对得SO3 2-的浓度，即测得中药材样品中二氧化硫残留量。
将荧光探针用于检测来自安徽亳州、河北安国、广西玉林、河南禹州和四川成都荷花池的山药等6种共30个批号中药材中潜在的SO2残留量。通过与可见光及紫外光下建立的标准比色卡(比色卡如图所示)进行比对，购自安徽亳州等五个药材市场的6种共30个批次中药材中二氧化硫残留量结果分别如下表。
表5 30个批次药材中二氧化硫残留量结果表
Figure BDA0002311094630000201
4.采用药典法测定来自安徽亳州、河北安国、广西玉林、河南禹州和四川成都荷花池的山药等6种共30个批号中药材的二氧化硫残留量
按照2015版《中国药典》四部(通则2331)二氧化硫残留量测定法(药典第一法-酸碱滴定法)，对山药等6种30个批号的市售中药材的二氧化硫残留量进行测定。
测定法：取药材或饮片细粉约10g(如二氧化硫残留量较高，超过1000mg/kg，可适当减少取样量，但应不少于5g)，精密称定，置两颈圆底烧瓶中，加水300～400mL(350mL)。打开回流冷凝管开关给水，将冷凝管的上端处连接一橡胶导气管置于100mL锥形瓶底部。锥形瓶内加入3％过氧化氢溶液50mL作为吸收液(橡胶导气管的末端应在吸收液液面以下)。使用前，在吸收液中加入3滴甲基红乙醇溶液指示剂(2.5mg/mL)，并用0.01mol/L氢氧化钠滴定液滴定至黄色(即终点；如果超过终点，则应舍弃该吸收溶液)。开通氮气，使用流量计调节气体流量至约0.2L/min；打开分液漏斗的活塞，使盐酸溶液(6mol/L)10mL流入蒸馏瓶，立即加热两颈烧瓶内的溶液至沸，并保持微沸；烧瓶内的水沸腾1.5小时后，停止加热。吸收液放冷后，置于磁力搅拌器上不断搅拌，用氢氧化钠滴定液(0.01mol/L)滴定，至黄色持续时间20秒不褪，并将滴定的结果用空白实验校正。照下式计算：
供试品中二氧化硫残留量
Figure BDA0002311094630000202
式中，A为供试品溶液消耗氢氧化钠滴定液的体积，mL；B为空白消耗氢氧化钠滴定液的体积，mL；c为氢氧化钠滴定液摩尔浓度，mol/L；0.032为1mL氢氧化钠滴定液(1mol/L)相当的二氧化硫的质量，g；W为供试品的重量，g。
补充：根据2015版《中国药典》和文献规定：山药、天冬、天花粉、天麻、牛膝、白及、白术、白芍、党参、粉葛这些传统习用硫熏的中药材不得过400mg/kg。浙贝母等其他中药材及饮片二氧化硫残留量不得超过150mg/kg。
实验仪器及药品：酸碱滴定法蒸馏仪器装置(1000ml两颈圆底烧瓶、竖式回流冷凝管、带刻度的分液漏斗)、磁力搅拌器、电热套、氮气源及气体流量计、锥形瓶、橡胶导气管、电子天平；不同产地中药材及饮片、3％过氧化氢溶液、甲基红乙醇溶液指示剂(2.5mg/ml)、0.01mol/L氢氧化钠溶液、盐酸溶液、蒸馏水。
本方法系将中药材以蒸馏法进行处理，样品中的亚硫酸盐系列物质加酸处理后转化为二氧化硫后，随氮气流带入到含有双氧水的吸收瓶中，双氧水将其氧化为硫酸根离子，采用酸碱滴定法测定，计算药材及饮片中的二氧化硫残留量。
表6.药典第一法-酸碱滴定法测定中药材二氧化硫残留量
Figure BDA0002311094630000211
以上为三次测定平均值
将药典第一法-酸碱滴定法测定结果和荧光探针检测法结果进行比较，并用准确率作为评价荧光探针检测法准确性的指标，当药典第一法-酸碱滴定法测定结果和荧光探针检测法结果相符时标为“1”，不符时标为“0”，其计算公式如下：
准确率＝(荧光探针检测法测得结果得分/药材总数)×100％
表7.荧光探针检测法和药典第一法-酸碱滴定法测定30批中药材中二氧化硫残留量的结果对照
Figure BDA0002311094630000212
Figure BDA0002311094630000221
注：①“1”表示荧光探针法和酸碱滴定法的结果相符，“0”表示荧光探针法和酸碱滴定法的结果不符；②“*”表示中药材中二氧化硫残留量含量超过国家标准限量。
通过对照试验，在检测时间为30s的条件下检测购自安徽亳州等五个药材市场的6种共30个批次中药材中二氧化硫残留量，以药典第一法-酸碱滴定法测定结果为基准，检测时间为30s的荧光探针检测法的准确率为93.33％，准确率低于采用300s检测时间的准确率。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (2)

1.一种二氧化硫残留检测方法，其特征在于，包括以下内容：
制备香豆素衍生物：
(1)取4-(二乙氨基)水杨醛，2.4当量丙二酸二乙酯，100ml无水乙醇加入反应器中，待溶解后加入0.35当量的哌啶；反应约6h完全，回收溶剂，浓缩得黄色油状物中间体1，柱层析，环己烷与乙酸乙酯为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩至干，即得黄色晶体状中间体1；
(2)取19.875g中间体1溶于比例为V:V＝1:1的乙酸与Conc.HCl溶液中，乙酸与Conc.HCl溶液的混合溶液作反应溶剂，溶剂共300ml，120℃下反应16h，反应完全后降至室温，加入8倍量水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和碳酸氢钠洗至中性，无水硫酸钠干燥，浓缩得黄色粘稠液体，取出常温自然冷却，即得黄色固体物质中间体2；
(3)取14.806g中间体2在34.2ml的比例为V:V＝4:1的DMF-POCl3体系中将温度调整到65℃反应12小时，反应完全后将反应液降至室温，加入8倍量水，分散液放入4℃冰箱重结晶，抽滤，真空干燥，即得黄色固体物中间体3；
(4)称取2.555g中间体3，2.4当量丙二腈和1当量哌啶，并量取30ml无水乙醇，加入到100ml反应器，0℃下反应4.5h，停止反应，用稀HCl中和至中性，加入适量硅胶，浓缩至干，柱层析，环己烷与乙酸乙酯为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩至干，即得红色粉末状探针样品；
其中，所述香豆素衍生物化学结构式如下：
Figure FDA0004076065380000011
检测产品二氧化硫:对产品进行预处理：将产品与水、盐酸混合加热至沸腾，以羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液为吸收液收集SO2气体；再以香豆素衍生物溶液为
Figure FDA0004076065380000012
和/或
Figure FDA0004076065380000013
荧光探针进行酸碱滴定，滴定过程中观察和记录颜色变化，在观察混合后240～300s的液体颜色与比色卡对比；根据
Figure FDA0004076065380000014
和/或
Figure FDA0004076065380000015
荧光探针的标准比色卡比对得
Figure FDA0004076065380000016
的浓度，即测得中药材样品中二氧化硫残留量：
检测温度为0～30℃；
所述产品为中药材，包括但不限于山药、牛膝、葛根、白芍、知母、白芷、百合。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，对所述产品进行预处理时，还可以将产品与50％乙醇的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液混合超声处理得到提取液，其中，所述50％乙醇的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，其中的50％是指乙醇的体积分数，由50％的无水乙醇和50％的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)缓冲水溶液配制，整体构成50％乙醇的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)缓冲溶液；
将香豆素衍生物溶液与提取液混合，在观察混合后240～300s的液体颜色与比色卡对比，通过混合后提取液的颜色与
Figure FDA0004076065380000021
和/或
Figure FDA0004076065380000022
荧光探针的标准比色卡比对得
Figure FDA0004076065380000023
的浓度，即测得中药材样品中二氧化硫残留量。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102005004745A1 (de) * 2005-01-31 2006-08-10 Dyomics Gmbh Verfahren zu Nachweis und Quantifizierung von Proteinen
EP2223086B2 (en) * 2007-12-14 2016-06-01 Biotium Inc. Fluorescent compounds - labeling dyes
KR101047129B1 (ko) * 2008-10-22 2011-07-07 고려대학교 산학협력단 구리 이온 선택성을 갖는 쿠마린 유도체, 이의 제조 방법, 이를 이용한 구리 이온 검출 방법 및 형광화학센서
CN102590163A (zh) * 2012-01-15 2012-07-18 山西大学 一种检测亚硫酸氰根的方法
AT512675B1 (de) * 2012-03-30 2015-12-15 Joanneum Res Forschungsgmbh Opto-chemischer Sensor
US10370351B2 (en) * 2016-04-25 2019-08-06 The Regents Of The University Of California Photoinduced electron transfer voltage-sensitive compounds
CN106946902B (zh) * 2017-04-11 2019-03-01 济南大学 一种二氧化硫近红外-双光子比率荧光探针及其制备方法
CN107474044B (zh) * 2017-08-10 2019-12-06 河北大学 一种香豆素类衍生物、其制备方法和应用及一种亚硫酸氢根检测试剂盒
CN108530415A (zh) * 2018-07-03 2018-09-14 济南大学 一种近红外双光子转换型so2荧光探针的合成及其应用
CN109651319B (zh) * 2019-01-16 2020-10-13 许昌学院 一种基于香豆素卡巴腙衍生物的荧光探针及其制备方法和应用

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