CN102608052B - 用于诊断白血病的*** - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于诊断白血病的***以及诊断白血病的方法，其以受试者的外周血为检测对象，不需进行骨髓穿刺即可得到准确的诊断结果，不仅对患者创伤小，而且灵敏度高，特异性强，仅需一步染色、无洗涤，操作简单，检测时间短，便于大规模筛查与追踪治疗。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体而言涉及一种用于诊断白血病的***。
背景技术
白血病是造血***的恶性肿瘤，又叫“血癌”，在儿科恶性肿瘤的发病率中居第一位，它的死亡率在导致儿童及35岁以下成年人死亡的恶性肿瘤中排首位，是威胁儿童和青壮年生命健康最常见的恶性肿瘤。目前我国白血病的发病率，在各种肿瘤发病率中位居6-8位。
白血病的病源是由于细胞内DNA的变异形成的骨髓中造血组织的不正常工作。骨髓中的干细胞每天可以制造约540万个/1立方毫米的红血球和7400个/1立方毫米白血球，而白血病病人过分生产白血球且多数的白细胞是不成熟的，为幼稚细胞，其存活期比正常情况下长。尽管这种白细胞数量很大，然而却不能像正常白细胞那样抗感染。体内这种白细胞的增多，会直接影响一些重要器官的功能，影响正常健康血细胞的产量。由于肿瘤细胞恶性增生，抑制红细胞和血小板止血的产生，甚至没有足够的正常白细胞抗感染，很容易受擦伤、出血、感染。而且过多的白细胞也妨害骨髓的其他工作，这使得骨髓生产其它血细胞的功能降低。
白血病可以扩散到***、脾、肝、中枢神经***和其它器官，产生不同症状。这些症状，主要跟骨髓内造血功能的破坏有关，如持续发烧，感染经久不愈，贫血，点状出血等；还有血癌细胞穿渗组织引起的症状，如***肿大，骨痛或关节痛，牙龈肿胀，肝脾肿大等。
白血病的诊断非常困难，一般需要结合临床表现、体格检查和实验室化验三方面综合判断才能最终确诊。白细胞计数可以在一定程度上反映骨髓造血功能异常的风险，但单单此项检查远远不能达到确诊的需要。通常而言，要确诊白血病，外周血检和骨髓穿刺取样检测都是必须的。
但是，由于骨髓穿刺并不易为常人所接受，因此目前临床无法提供一种白血病风险预警的手段，同时也大大阻碍了白血病的早期发现及介入治疗。当病人察觉到时，往往已经进入了白血病发病的中后期。此外，血液中癌细胞的微小残留是预后的一个重要指标，对于微小残留病的准确检测，对指导医生的下一步治疗有重要意义。然而目前临床常用的分子生物学检测方法(PCR)所能达到的灵敏度仅为每104个血细胞含有一个癌细胞，限制了对微小残留病的检测水平。
菁染料是一种常用染料，具有独特的光敏感性质，几个世纪以来，伴随其独特理化、光学性质被发现，逐渐被用做显影剂，光敏剂，非线性光学材料等。
发明内容
本发明的一个方面提供一种用于诊断白血病的***，所述***包括试剂盒、紫外-可见光吸收光谱仪和荧光光谱仪。
根据本发明的***，其中所述试剂盒包括试剂I和试剂II，其中试剂I为pH值为6～8的缓冲液，试剂II为下式I所示的化合物
其中：R1为C1-C6的烷基、苯基、烷基取代的苯基；R2、R3、R4和R5独立地选自H或C1-C6的烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构，或者R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构；R6和R7独立地选自C1-C6的烷基；Y为卤素；X1，X2独立选自C、O、S、Se、Te。
根据本发明的***，其中对于式I的化合物而言，其制备方法可以参考Leslie G.S.，Brooker and Frank L.W.，JACS，1935，547-551中记载的合成路线，也可以使用本领域熟知的其他方法来制备。
根据本发明的***，其中试剂I优选为pH6～8的含有一价金属离子的缓冲液，包括但不限于磷酸钠-磷酸氢钠缓冲液、磷酸钾-磷酸氢钾缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
根据本发明的***，其中C1-C6的烷基为碳原子数为1至6的直链或支链的烷基，包括但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基等。
根据本发明的***，其中R1选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基、异己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基。
根据本发明的***，其中R2、R3、R4和R5独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基。
根据本发明的***，其中R2和R3与它们所连接的碳原子可以形成5元至7元的饱和环结构或不饱和环结构，所述环结构可以含有或不含有N或S原子。
根据本发明的***，其中R4和R5与它们所连接的碳原子可以形成5元至7元的饱和环结构或不饱和环结构，所述环结构可以含有或不含有N或S原子。
根据本发明的***，其中Y优选为氟、氯、溴或碘。
本发明的另一方面一种诊断白血病的方法，所述方法包括以下步骤：
提取受试者的全血DNA，将提取的全血DNA溶解于试剂I中得到DNA溶液A，其中试剂I如前文所定义；
将溶液A在80℃～95℃的温度下，优选在85℃～95℃的温度下加热2至15分钟，以使溶液A中的DNA变性，即，使双链DNA解聚为单链形式，然后，使溶液A在20℃以下的温度下，优选在10℃以下的温度下，更优选在4℃的温度下快速淬火，并在淬火温度下静置过夜，得到溶液B；
用荧光光谱仪测定溶液B在570-580nm范围内的荧光发射峰的最强荧光强度，记为FlM 0；
将适量的溶液B与适量的试剂I和试剂II混合以制备溶液C，所述试剂I和试剂II如前文所定义；其中溶液B的加入量取决于使用紫外-可见光吸收光谱仪测定的溶液C在260nm处的吸光度，溶液C在260nm处的吸光度优选在0.01至1的范围内，更优选0.1-0.3的范围内，试剂I和试剂II的加入量取决于溶液C中式I化合物的浓度，溶液C中式I的化合物浓度为1uM至100uM；
分别测定溶液C的如下指标：
550-560nm范围内的吸收峰的最强吸光度，记为AM；
515-525nm范围内的吸收峰的最强吸光度，记为AD；
570-580nm范围内的荧光发射峰的最强荧光强度，记为FlM；
605-615nm范围内的荧光发射峰的最强荧光强度，记为FlD；
根据以上测定结果，计算以下指标：
MD(A)＝AM/AD；
MD(Fl)＝FlM/FlD；
若MD(A)小于1.4，或MD(Fl)小于5.2，则可认定受试者患有白血病。
根据本发明的方法，其中在制备溶液C的步骤中，可以将溶液B与试剂I盒试剂II直接混合来制备溶液C；也可以先将试剂II溶于试剂I中，再将得到的溶液与溶液B混合来制备溶液C。
与现有技术相比，本发明提供的用于诊断白血病的试剂盒及其使用方法以及诊断***的优点在于：
检测对象为受试者的外周血，不需进行骨髓穿刺即可得到准确的诊断结果，不仅对患者创伤小，更便于大规模筛查与追踪治疗；
高灵敏度，创新性的采用超分子荧光探针，灵敏度是传统单分子探针的100倍以上；
高特异性，直接针对全血中的DNA提取物，白血病诊断准确率约85-97％；
仅需一步染色，无洗涤，操作简单，检测时间短；
仪器通用性强，仅需使用临床常规检测仪器(紫外-可见光吸收光谱仪或荧光光谱仪)；
附图说明
图1是表示根据本发明一个实施例得到的受试者的MD(A)指标的统计图；
图2是表示根据本发明一个实施例得到的受试者的MD(FI)指标的统计图。
具体实施方式
下面将参照附图以具体实施例的方式来更详细地描述本发明，但是应当理解，本发明可以以不同的方式实施，提供这些实施例仅是为了使本说明书充分和完整，以使本领域技术人员能够实施本发明，本发明的范围并不应当限定为本文所列的具体实施例。
本实验所有血样均是通过合同研究组织(Contract Research Organization，CRO)，与医院签订正式的临床试验合同后获得。所有血样的测试均已经过医院伦理委员会讨论通过。
实施例1
提取19位健康受试者和33位白血病患者的全血DNA，将提取的全血DNA分别用pH为6.0的PBS缓冲液溶解，得到52份DNA溶液A。
将每份溶液A在80℃的水浴中加热15分钟，然后在4℃的冰箱中快速淬火，并在4℃的冰箱中静置过夜，得到52份溶液B。
用荧光光谱仪测定每份溶液B在570-580nm范围内的荧光发射峰的最强荧光强度FlM 0。
取适量的溶液B与适量的pH为6.0为的PBS缓冲液和化合物制备溶液C，使所制备的52份溶液C在260nm处的吸光度为0.1-0.3，溶液C中化合物的浓度为1uM。
然后分别测定每个溶液C的如下指标：
550-560nm范围内的吸收峰的最强吸光度，记为AM；
515-525nm范围内的吸收峰的最强吸光度，记为AD；
570-580nm范围内的荧光发射峰的最强荧光强度，记为FlM；
605-615nm范围内的荧光发射峰的最强荧光强度，记为FlD；
根据以上测定结果，计算以下指标：
MD(A)＝AM/AD；
MD(Fl)＝FlM/FlD；
对通过以上方式获得的52份溶液C的MD(A)指标进行统计分析，结果如图1所示。对通过以上方式获得的52份溶液C的MD(FI)指标分别进行统计分析，结果如图2所示。
参照图1，可以清楚地看出87.9％白血病患者的血液样品MD(A)指标小于1.4(即，诊断准确率为87.9％)，仅10.5％健康受试者的血液样品MD(A)指标小于1.4(即，假阳性率为10.5％)；参照图2，可以清楚地看出97.0％白血病患者的血液样品MD(Fl)指标小于5.2(即，诊断准确率为97.0％)，仅％健康受试者的血液样品MD(Fl)指标大于5.2(即，假阳性率为5.3％)。因此，采用本事实例的诊断方式可以容易地将正常受试者和白血病患者的血样区分开来。
实施例2
采用与实施例1相同的步骤对以上52位受试者的全血DNA进行检测，区别在于，使用pH为6.5的PBS缓冲液，在85℃下加热8分钟然后在10℃下快速淬火，所制备的52份溶液C在260nm处的吸光度为0.1-0.3，所使用的化合物为
化合物浓度为10uM
检测结果：采用MD(A)指标的检测准确率为93.94％，假阳性率为10.52％；采用MD(Fl)指标的检测准确率为90.91％，假阳性率为0％。
实施例3
采用与实施例1相同的步骤对以上52位受试者的全血DNA进行检测，区别在于，使用pH为7.0的PBS缓冲液，在90℃下加热5分钟然后在5℃下快速淬火，所制备的52份溶液C在260nm处的吸光度为0.2-0.7，所使用化合物为
化合物的浓度为20uM。
检测结果：采用MD(A)指标的检测准确率为96.97％，假阳性率为5.26％；采用MD(Fl)指标的检测准确率为93.94％，假阳性率为5.26％。
实施例4
采用与实施例1相同的步骤对以上52位受试者的全血DNA进行检测，区别在于，使用pH为的PBS缓冲液，在95℃下加热4分钟然后在10℃下快速淬火，所制备的52份溶液C在260nm处的吸光度为0.5-0.9，所使用化合物为
化合物的浓度为40uM。
检测结果：采用MD(A)指标的检测准确率为87.88％，假阳性率为15.79％；采用MD(Fl)指标的检测准确率为93.94％，假阳性率为15.79％。
实施例5
采用与实施例1相同的步骤对以上52位受试者的全血DNA进行检测，区别在于，使用pH为的PBS缓冲液，在95℃下加热4分钟然后在5℃下快速淬火，所制备的52份溶液C在260nm处的吸光度为0.05-0.4，所使用化合物为
化合物的浓度为50uM。
检测结果：采用MD(A)指标的检测准确率为90.91％，假阳性率为10.52％；采用MD(Fl)指标的检测准确率为96.97％，假阳性率为5.26％。
实施例6
采用与实施例1相同的步骤对以上52位受试者的全血DNA进行检测，区别在于，使用pH为的PBS缓冲液，在90℃下加热5分钟然后在4℃下快速淬火，所制备的52份溶液C在260nm处的吸光度为0.2-0.5，所使用化合物为
化合物的浓度为70uM。
检测结果：采用MD(A)指标的检测准确率为93.94％，假阳性率为5.26％；采用MD(Fl)指标的检测准确率为96.97％，假阳性率为0％。
实施例7
采用与实施例1相同的步骤对以上52位受试者的全血DNA进行检测，区别在于，使用pH为的PBS缓冲液，在90℃下加热5分钟然后在4℃下快速淬火，所制备的52份溶液C在260nm处的吸光度为0.1-0.3，所使用化合物为
化合物的浓度为100uM。
检测结果：采用MD(A)指标的检测准确率为90.91％，假阳性率为15.79％；采用MD(Fl)指标的检测准确率为90.91％，假阳性率为10.52％。
对比例
采用与实施例1相同的步骤对以上52位受试者的全血DNA进行检测，区别在于，使用化合物配制溶液C，该化合物在溶液C中的浓度为50uM。
检测结果：采用MD(A)指标的检测准确率为60.61％，假阳性率为63.16％；采用MD(Fl)指标的检测准确率为69.70％，假阳性率为36.84％。
由此可见，当使用该化合物时，并不能将健康受试者和白血病患者的血样区分开。
虽然已经以具体实施例的方式详细地描述了本发明，但是对于本领域技术人员来说明显的是，在不脱离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种变化和修改，这些变化和修改同样包括在本发明的范围内。
Claims (8)
1.一种用于通过外周血诊断白血病的***，所述***包括试剂I和试剂II以及紫外-可见光吸收光谱仪和荧光光谱仪，其中所述试剂I为pH值为6～8的缓冲液，所述试剂II为式I的化合物：
其中：R1为C1-C6的烷基、苯基、烷基取代的苯基；R2和R3独立地选自H或C1-C6的烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构；R4和R5独立地选自H或C1-C6的烷基，或者R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构；R6和R7独立地选自C1-C6的烷基；Y为卤素；X1，X2独立选自C、O、S、Se、Te。
2.如权利要求1所述的***，其中所述缓冲液为含有一价金属离子的缓冲液。
3.如权利要求1或2所述的***，其中所述缓冲液选自磷酸钠-磷酸氢钠缓冲液、磷酸钾-磷酸氢钾缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
4.如权利要求1所述的***，其中R1选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基、异己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基。
5.如权利要求1所述的***，其中R2、R3、R4和R5独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基。
6.如权利要求1所述的***，其中在R2和R3与它们所连接的碳原子形成环结构的情况下，所述环结构为饱和环或不饱和环，含有或不含有N或S原子。
7.如权利要求1所述的***，其中在R4和R5与它们所连接的碳原子形成环结构的情况下，所述环结构为饱和环或不饱和环，含有或不含有N或S原子。
8.如权利要求1所述的***，其中Y为氟、氯、溴或碘。
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