JP2010512752A - Pcrのリアルタイムでの多重分析のためのシステムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は一般に、PCRなどのDNA増幅の測定を行うためのシステムおよび方法に関する。特に、本発明は、多重化能力を備えたPCRの「リアルタイム」測定に関する。ある態様は、常磁性ミクロスフェアなどの粒子、およびPCR過程を補助するための制御可能な熱サイクリングをも行える測定デバイスの撮像チャンバーを用いるシステムに関する。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、生きた生物を用いることなしにDNAを酵素的に複製するための分子生物学の手法である。PCRは、医学および生物学の研究所で、遺伝性疾患の発見、遺伝子フィンガープリントの同定、感染症の診断、遺伝子のクローニング、実父確定検査およびDNAコンピューティングといったさまざまな作業のために一般的に用いられている。PCRは、その比類のない増幅および正確さの能力から、核酸検出のために選択すべき方法として分子生物学者に受け入れられている。DNA検出は典型的にはPCR反応のエンドポイントまたはプラトー相で行われるため、開始テンプレートを定量することは困難になる。リアルタイムPCRまたはキネティックPCRは、反応が進行するのに伴うアンプリコン濃度を記録することにより、エンドポイントPCR分析の能力を増進させる。アンプリコン濃度は、増幅された標的に付随する蛍光シグナルの変化を介して記録されることが最も多い。リアルタイムPCRはまた、閉鎖系の中で行われうるために混入が限定的である点でもエンドポイント検出より有利である。他の利点には、感度、ダイナミックレンジ、速度がより大きいこと、および必要とされる過程がより少ないことが含まれる。
A.撮像システム
ここで図面に目を向けると、図が原寸通りに描かれてはいないことに留意されたい。詳細には、図の要素のうちいくつかの縮尺は、それらの要素の特性を強調するために非常に誇張されている。図が同じ縮尺で描かれていないことにも留意されたい。同様の構成をとりうる複数の図に示された要素は、同じ参照番号を用いて指し示されている。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、インビトロでの酵素的複製によってDNA片を増幅するために分子生物学において広く用いられている手法である。典型的には、PCRの用途には、Taqポリメラーゼなどの耐熱性DNAポリメラーゼが用いられる。このDNAポリメラーゼは、テンプレートとしての一本鎖DNA、およびDNA合成を開始させるためのDNAプライマーを用いて、ヌクレオチド(dNTP)から新たなDNA鎖を酵素的に組み立てる。基本的なPCR反応はいくつかの成分および試薬を必要とし、これには以下が含まれる:増幅しようとする標的配列を含むDNAテンプレート;標的配列の5'および3'末端にあるDNA領域に対して相補的な1つまたは複数のプライマー;最適な温度が好ましくは70℃前後であるDNAポリメラーゼ(例えば、Taqポリメラーゼ);デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP);DNAポリメラーゼの最適な活性および安定性のための適した化学的環境を与えるバッファー溶液;二価陽イオン、典型的にはマグネシウムイオン(Mg2+);ならびに一価陽イオンカリウムイオン。
リアルタイムPCRに現在用いられているいくつかの市販の核酸検出化学手法がある。これらの化学手法は、DNA結合剤、FRETに基づく核酸検出、ハイブリダイゼーションプローブ、分子ビーコン、加水分解プローブ、および色素-プライマーに基づくシステムを含む。これらの化学手法のそれぞれについて、以下にさらに詳細に考察する。
キネティックPCRの最初の分析はHiguchiらによって行われ、彼らは二本鎖DNA産物と結合させるために臭化エチジウムを用いた(Higuchi et al., 1992;Higuchi et al., 1993;米国特許第5,994,056号;米国公開出願第2001/6171785号)。臭化エチジウムは、キネティックPCRに用いられる他のすべてのDNA結合剤と同じく、結合すると蛍光強度を高めることができる。その結果生じるシグナルの増加を、反応の経過を通じて記録して、サイクル数に対してプロットすることができる。データをこのように記録することで、エンドポイント分析と比較して、関心対象の試料の初期濃度がより指し示される。
多くのリアルタイム核酸検出方法は、フェルスター共鳴エネルギー転移(FRET)によって相互作用する標識を利用する。この機序はドナーとアクセプターの対を要し、ドナー分子が特定波長で励起され、その後にそのエネルギーを非放射性にアクセプター分子に転移させる。これは典型的には、ドナー分子およびアクセプター分子が互いに近接していることを意味するシグナル変化を結果的にもたらす。
リアルタイムPCRに用いられるハイブリダイゼーションプローブは、主としてRoche LightCycler(登録商標)装置とともに用いるために開発された(米国公開出願第2001/6174670号;米国公開出願第2000/6140054号)。これらは時に、FRETプローブ、LightCycler(登録商標)プローブまたは二重FRETプローブと呼ばれる(Espy et al., 2006)。
分子ビーコンは、ヘアピンプローブとしても知られ、相補的標的配列の存在下で開放されてそれとハイブリダイズし、典型的には蛍光の増加を引き起こすステムループ構造である(米国特許第5,925,517号);米国公開出願第2006/103476号)。分子ビーコンは典型的には、標的の存在しないアッセイ条件下では互いに相互作用してステム二重鎖を形成する親和性対に挟まれた、核酸標的相補的配列を有する。プローブとあらかじめ選択されたその標的配列とのハイブリダイゼーションは、プローブのコンフォメーション変化を生じさせ、「アーム」を強制的に隔てさせてステム二重鎖を消失させ、それによってフルオロフォアとクエンチャーを分離させる。
TaqMan(登録商標)アッセイ(米国特許第5,210,015号)としても知られる加水分解プローブは、それらが標的配列毎に2つのプローブ(ハイブリダイゼーションプローブの場合のように)ではなく単一のプローブのみを要するという理由から普及している。このことは試料毎のコスト削減を結果的にもたらす。これらのプローブのデザインも分子ビーコンのそれよりは複雑でない。これらは典型的には、5'末端でレポーターにより、3'末端でクエンチャーにより標識される。レポーターおよびクエンチャーが同じプローブに固定されると、それらは非常に近接した状態に強制的に保たれる。この近接性は、プローブが標的配列とハイブリダイズした場合にもレポーターシグナルを有効にクエンチングする。PCR反応の伸長段階または延長段階中には、Taqポリメラーゼとして知られるポリメラーゼがその5'エキソヌクレアーゼ活性を理由として用いられる。このポリメラーゼは上流プライマーを結合部位として利用し、続いて伸長を行う。加水分解プローブはポリメラーゼ伸長中にその5'末端でTaqの5'-エキソヌクレアーゼ活性によって切断される。これが起こると、レポーターフルオロフォアがプローブから放出され、その後はもはやクエンチャーと近接しなくなる。これは、PCR反応のサイクリングを続けた場合に各伸長段階に伴うレポーターシグナルの絶え間ない増加を生じさせる。各サイクルに伴って最大限のシグナルを確実に得るために、加水分解プローブは反応物中のプライマーよりもおおよそ10℃高いTmを有するように設計される。
リアルタイムPCRのために利用しうる色素-標識プライマーに基づくシステムは数多くある。これらは複雑さの点で、単純なヘアピンプライマーシステムから、ヘアピンプローブのステムループ部分が非増幅性リンカーを介して特異的PCRプライマーと結び付けられるより複雑なプライマー構造までの範囲にわたる。これらの方法は、プローブに基づくアッセイシステムには必須である追加的な介在性標識プローブを必要としない上に、DNA結合色素を用いたのでは不可能な多重化も可能にするという利点がある。しかし、これらの方法のそれぞれの成功の可否は、プライマー配列の慎重な設計にかかっている。
以上で考察したように、リアルタイムPCRに現在用いられている市販の核酸検出化学手法はいくつかある。しかし、現行のリアルタイムPCR技術はその多重化能力の点で約1〜6 plexの反応までに限定されている。本発明の方法およびシステムは、リアルタイムPCRのためにこれまで用いられていない検出化学手法を含む、市販の核酸検出化学手法を用いて、はるかに多くのリアルタイムPCR多重化を達成することができる。本発明の状況におけるこれらの検出化学手法のいくつかの使用法を説明する態様について以下に考察する。
分子ビーコンは、ヘアピンプローブとしても知られ、相補的標的配列の存在下で開放されてそれとハイブリダイズして典型的には蛍光の増加を引き起こすが、その非存在下ではステムループ構造を形成して蛍光の減少をもたらすステムループ構造として記述することができる(米国特許第5,925,517号;米国公開出願第2006/103476号)。本発明の1つの態様によるプローブは、標的の存在しないアッセイ条件下では互いに相互作用してステム二重鎖を形成する親和性対またはアームのメンバーによって挟まれた、核酸標的相補的配列を有する標識プローブである。プローブとあらかじめ選択されたその標的配列とのハイブリダイゼーションは、プローブのコンフォメーション変化を生じさせ、「アーム」を強制的に隔てさせてステム二重鎖を消失させる。本発明によるプローブの態様は、コンフォメーション変化が検出可能である相互作用性標識を用いるか、または特に限定されたアレル識別性構造を用いるか、またはその両方を用いる。シグナルレベルの特徴的な変化は、プローブが閉鎖位置にあるために標識部分が近接しているか、またはプローブが開放位置にあるために分離しているかのいずれかに依存する。この態様によれば、分子ビーコンもスペクトル的にまたは別の様式で識別可能な粒子と結合しており、このことは、捕捉プローブと結び付けられた粒子の識別特性ではなく、ヘアピンプローブに結び付けられた色素について色素の色調を識別することによるという従来の方法を用いることによってこれまで可能であったよりも高レベルの多重化をもたらす。
リアルタイムPCRに用いられるハイブリダイゼーションプローブは、時にFRETプローブ、LightCycler(登録商標)プローブまたは二重FRETプローブと呼ばれる(Espy et al., 2006)。ハイブリダイゼーションプローブは、FRETが直接的に測定される方式で用いられる(Wilhelm and Pingoud, 2003)。2つのプローブのそれぞれが蛍光エネルギー転移対の各々のメンバーで標識され、標的DNA配列の隣接領域とのハイブリダイゼーションが起こると励起エネルギーがドナーからアクセプターに転移し、アクセプターによるその後の発光をレポーターシグナルとして記録することができる(Wittwer et al., 1997)。2つのプローブは標的配列とアニーリングし、そのため上流プローブはその3'末端で蛍光標識され、下流プローブはその5'末端で標識される。下流プローブの3'末端は典型的には、PCR中のプローブの伸長を防ぐためにリン酸化または何らかの他の手段によってブロックされる。上流プローブの3'末端と連結された色素は、このプローブの伸長を防ぐのに十分である。
また別の態様は、標的核酸配列毎に2つのプローブを使用することを伴う。1つのプローブをビーズに結び付け、それをフルオロフォアで標識することができる。FRETが起こるように、クエンチャーまたはフルオロフォアの対のいずれかを含む相補的「浮遊性」プローブも添加する。この場合には、ビーズ上のプローブが3'末端にフルオロフォアを含み、5'末端でビーズに結び付けられてもよい。浮遊性プローブは、それがフルオロフォアに非常に近接してそれ故にプローブとのハイブリダイゼーションが起こるとシグナルの低下を達成するように、その逆相補物として設計され、その5'末端にクエンチング部分を有することにより、ビーズ上のフルオロフォアに付随するシグナルをクエンチングすることができる。これらのプローブは、PCR増幅または何らかの他の増幅イベント中にも存在すると考えられる。PCRサイクルの標的検出相では、浮遊性プローブはプローブをビーズに結び付けたままで、標的配列とハイブリダイズすると考えられる。ビーズと結び付けられるプローブは、標的配列を伴った浮遊性プローブと比べて、それがより不都合な結合ならびに浮遊性プローブとのより低い融解温度を呈するように設計されると考えられる。PCR反応が続き、標的配列の濃度が増すのに伴って、ビーズに付随するシグナルの有意な増加が観察されると考えられる。シグナルの測定可能な増加という同じ効果を、浮遊性プローブを伴う標的配列の結合動態と比較して標的配列の方が好都合な結合を呈するようにビーズと結び付けられたプローブを設計する同様の方法によって得ることもできる。結合動態の違いを、互いに異なる長さとなるように浮遊性プローブおよび固定プローブを設計することによって、またはプローブの一方に、もう一方のプローブ上の配列に対してはミスマッチであるが標的配列に対してはそうでない1つもしくは複数の塩基を挿入することによって得ることもできる。
図8は、クエンチング分子にヌクレオチドをあらかじめ連結させる(pre-couple)ことにより、新たに合成されたDNA鎖中にクエンチング分子が組み込まれる一例を例示している。このあらかじめ連結されたヌクレオチド/クエンチャーはPCR反応混合物中で利用可能と考えられ、増幅産物中に組み込まれると考えられる。ビーズ40の表面と結び付けられた蛍光色素によって標識された相補的プローブは、標的オリゴヌクレオチド配列がより多く生成されるほど蛍光シグナルが低下するシステムを結果的にもたらすと考えられる。例えば、チャンバー内で、複数の核酸標的を含む試料、複数の核酸標的の増幅の刺激のための複数のプライマー対、dNTPの一部分がクエンチャー分子と連結されているdNTPの混合物、および複数の核酸標的に対して相補的な複数の蛍光標識されたプローブを複数の蛍光標識されたプローブを混ぜ合わせ、ここでプローブが、各プローブの独自性がそれが固定化されているコード化された磁性ビーズから分かるように、複数のコード化された磁性ビーズ上に固定化されていることが考えられる。増幅サイクルを行って、複数のプライマー対により増幅される複数の核酸標的のそれぞれについてクエンチャー分子を含む増幅産物を形成させる。増幅反応物中のdNTPの一部分はクエンチャー分子と連結されているため、増幅産物はこれらのクエンチャー分子を組み込んでいると考えられる。続いて、増幅産物を、コード化された磁性ビーズ上に固定化されたプローブとハイブリダイズさせ、コード化された磁性ビーズ、およびコード化された磁性ビーズ上に固定化されたプローブとハイブリダイズした増幅産物を、チャンバーの表面に引き寄せるために、磁場をチャンバーの表面に印加する。続いて、コード化された磁性ビーズからのシグナル、および標識されたプローブからのシグナルを検出する。増幅産物はクエンチャー分子を組み込んでいるため、プローブからの蛍光シグナルは、増幅産物がより多く生成されるほど低下する。さらなる増幅サイクルを行う前に、チャンバーの表面から磁場を除去することができる。増幅および検出を所望の回数にわたって反復することで、反応に関するリアルタイム定量データを入手することができる。
増幅配列またはアンプリコンを形成させるために用いられるプライマーが、蛍光色素(例えば、Cy3)または検出を可能にする他の物質で標識されているようなPCRを行うことができる。標識は例えば、プライマーの5'末端にあってよい。標識されたプライマーを用いることで、標識されたアンプリコンの形成が可能になる。標識されている増幅された核酸配列は、識別可能な粒子と連結されたオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすること、およびそれによって捕捉することができる。現在の市販のリアルタイムPCR法のうち、直接ハイブリダイゼーション法を採用しているものはない。
もう1つの態様において、本発明は、試料中の複数の核酸標的を増幅して検出する方法であって、チャンバー内で、複数の核酸標的を含む試料;複数の核酸標的の増幅の刺激のための複数のプライマー対を混ぜ合わせる段階を含む方法であり、ここで各プライマー対が、標的特異的配列、標的特異的配列の5'側にあるタグ配列、および標的特異的配列とタグ配列との間にあるブロッカーを含む第1のプライマー、ならびに標的特異的配列を含む第2のプライマー;標識剤;ならびに複数のプライマー対のタグ配列に対して相補的な複数のプローブ(抗タグ)を含み、ここでプローブが、各プローブの独自性がそれが固定化されているコード化された磁性ビーズから分かるように、複数のコード化された磁性ビーズ上に固定化されている方法を提供する。増幅サイクルを行って、複数のプライマー対により増幅される複数の核酸標的のそれぞれについてタグ付加および標識された増幅産物を形成させる。タグ付加および標識された増幅産物を、コード化された磁性ビーズ上に固定化されたプローブとハイブリダイズさせ、コード化された磁性ビーズ、ならびにコード化された磁性ビーズ上に固定化されたプローブとハイブリダイズしたタグ付加および標識された増幅産物を、チャンバーの表面に引き寄せるために、磁場をチャンバーの表面に印加する。続いて、コード化された磁性ビーズからのシグナル、ならびにタグ付加および標識された増幅産物からのシグナルを、例えば、本明細書に記載したもののような撮像システムを用いて検出する。さらなる増幅サイクルを行う前に、チャンバーの表面から磁場を除去することができる。増幅および検出を所望の回数にわたって反復することで、反応に関するリアルタイム定量データを入手することができる。ある局面において、標識剤は、プライマー対の第2のプライマーと結び付けられたレポーター分子であってよい。他の局面において、標識剤はインターカレート色素であってよい。
本発明のある態様においては、それ自体が磁性応答性粒子の表面に結び付けられたプライマーを用いることができる。そのような態様においては、アンプリコンがビーズ上に合成されると考えられるため、アンプリコンを捕捉するためにビーズに結び付けられたハイブリダイゼーションプローブは必要でないと考えられる。典型的には、各プライマー対の一方のみを粒子に結び付ける。プライマー対のもう一方のプライマーは「浮遊性」となる。そのようなプライマーはまた、分子ビーコンとしても作用するプライマーなどによる伸長に応じてそれらをスペクトル的に識別可能にするような特性を呈し、その結果、フルオロフォアとクエンチャーの近接性を変化させるプライマーの伸長に応じてシグナルの変化が観察される。浮遊性プライマーを標識する、標識されたdNTPをアンプリコン中に組み入れる、またはDNAインターカレート剤を用いるといったその他の検出化学手法を、これらの態様とともに用いることもできる。
標的核酸検出のもう1つの方法は、ある種のポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を利用する。この態様において、フルオロフォアとクエンチャーの対またはFRET対は、粒子(例えば、ビーズ)に結び付けられた単一のプローブの修飾物であってよい。両方の蛍光色素がお互いの密接な空間的近接性のために相互作用するように、これらの蛍光色素の一方を磁性ビーズの表面に結び付け、もう一方の他の蛍光色素を、粒子の表面に固定されたプローブに結び付けることもできる。標的配列とプローブのハイブリダイゼーションが起こると、別のプライマーがプローブの下流に位置し、そのためにプライマーの伸長が起こるとクエンチング部分(または蛍光部分)が切断されて、シグナルの測定可能な変化が生じる。
他の態様は、データをリアルタイムで観察する目的でビーズと結び付けられた、SimpleProbes(登録商標)またはSimpleProbes(登録商標)と同等なプローブの使用を組み入れることができる。これらのプローブは米国特許第6,635,427号に記載されている。SimpleProbes(登録商標)を、アミノ修飾されたC12リンカーを用いて、または何らかの他のリンカーもしくは別の共有結合性相互作用によって超常磁性ミクロスフェアと結び付けることもできる。これらのプローブをビーズと結び付けることによって、意図した標的配列との結合によって二本鎖産物が形成され、核酸配列の検出および分析が高度に多重化されたリアルタイムPCR形式で可能になるように、ビーズをPCR反応中に存在させることができる。
イムノ-PCRを、抗体によって検出しうる関心対象の抗原、細胞、内生胞子または任意の他の分子もしくはタンパク質を検出するために用いてもよく、ここで前記抗体は核酸配列と連結されている。イムノ-PCRの既存の方法は、米国特許第5,665,539号;Sano, T. et al., Science, 258:120-122(1992);およびSims, PW et al,, Anal Biochem. 281:230-232(2000)に記載されており、これらのそれぞれは参照により組み入れられる。しかし、既存の方法は、イムノ-PCRをリアルタイムで検出する多重化能力に限界がある。1つの態様において、本発明は、捕捉抗体またはアプタマーを性質的に磁性(例えば、超常磁性)である粒子とまず連結させることによって、イムノ-PCRをリアルタイムで検出する多重化能力を大きく増大させることのできる方法であって、その粒子が関心対象の標的分子と反応して結合することのできる方法を提供する。この粒子はスペクトル的に識別可能なようにコード化される必要はない。反応が起こった後に、反応の最中、または反応の前に、ナノ粒子またはミクロ粒子でありうる磁性粒子を検出および増幅用のチャンバーに入れることができる。捕捉抗体またはアプタマーと連結されている粒子は、磁場を印加することによってチャンバーの表面に引き寄せることができる。これらの粒子、ならびにそれらに結合または他の様式で結び付けられた分子は洗浄手順を受け、それはある容積の水溶液を、磁力によって所定の位置に保たれた粒子上に流し、必要があれば過剰な標的分子を洗い流すことを含みうる。
本明細書で開示する方法において用いられる核酸には、「ロックド核酸(Locked Nucleic Acid)」またはその他などのヌクレオチド異性体または塩基類似体が含まれうる。核酸配列は、天然に存在するヌクレオチドの類似体を含んでもよく、またはすべてがそれから構成されてもよい。ヌクレオチド類似体は当技術分野において周知である。非限定的な一例は「ペプチド核酸」であり、これは「PNA」、「ペプチドに基づく核酸類似体」または「PENAM」としても知られ、米国特許第5,786,461号、第5,891,625号、第5,773,571号、第5,766,855号、第5,736,336号、第5,719,262号、第5,714,331号、第5,539,082号およびWO 92/20702号に記載されており、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み入れられる。ペプチド核酸は一般に、DNAおよびRNAなどの分子と比較して、向上した配列特異性、結合特性および酵素分解に対する抵抗性を有する(Egholm et al., 1993;PCT/EP/01219号)。ペプチド核酸は一般に、核酸塩基部分、五炭糖でない核酸塩基リンカー部分、および/またはリン酸骨格部分でない骨格部分を含む、1つまたは複数のヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。PNA用に記載されている核酸塩基リンカー部分の例には、アザ窒素原子、アミドおよび/またはウレイドテザーが含まれる(例えば、米国特許第5,539,082号を参照)。PNA用に記載されている骨格部分の例には、アミノエチルグリシン、ポリアミド、ポリエチル、ポリチオアミド、ポリスルフィンアミドまたはポリスルホンアミド骨格部分が含まれる。
本明細書で用いる場合、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズしうる」は、二本鎖もしくは三本鎖分子、または部分的に二本鎖もしくは三本鎖の性質を備えた分子を形成することを意味する。「アニールする」という用語は、本明細書で用いる場合、「ハイブリダイズする」と同義である。「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズしうる」という用語は、「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー」という用語、および「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」という用語を包含する。
本明細書ではある特定の態様をコード化されたミクロスフェア(すなわち、ビーズ)に関して説明してきたが、照射サブシステム、システムおよび方法を、ミクロ粒子、金または他の金属ナノ粒子、量子ドットまたはナノドットといった他の粒子とともに用いてもよいことが理解される必要がある。粒子は超常磁性であることが好ましい。ミクロスフェア、ビーズおよび粒子の例は、Fultonに対する米国特許第5,736,330号、Chandlerらに対する第5,981,180号、Fultonに対する第6,057,107号、Chandlerらに対する第6,268,222号、Chandlerらに対する第6,449,562号、Chandlerらに対する第6,514,295号、Chandlerらに対する第6,524,793号、およびChandlerに対する第6,528,165号に例示されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。
本発明はまた、本明細書に開示した増幅および検出の方法とともに用いるための成分を含むキットも提供する。本明細書に開示した成分の任意のものをキットの中に組み合わせることができる。ある態様において、キットは、複数の核酸標的の増幅の刺激のための複数のプライマー対、および複数の核酸標的に対して相補的な複数のプローブを含み、ここでプローブは、各プローブの独自性がそれが固定化されているコード化された磁性ビーズから分かるように、複数のコード化された磁性ビーズ上に固定化されている。ある態様において、キットは標識剤も含む。ある態様において、キットは、コード化された磁性ビーズと結び付けられていないプローブを含む。いくつかの態様において、キットは撮像チャンバーを含み、それは撮像システムで用いるための使い捨て式撮像チャンバーであってもよい。
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含められる。以下の実施例において開示される手法が、本発明の実施において十分に機能することが発明者らによって見いだされた技術を代表しており、そのため、本発明の実践において十分に機能することが当業者には理解されるはずである。しかし、当業者は、本発明の開示に鑑みて、開示された具体的な態様に多くの変化を加えることができ、それでもなお本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を入手しうることも理解するはずである。
この試験は、PCRサイクリング条件下でのLuminex超常磁性ミクロスフェアの頑健な安定性を実証する。これはまた、アンプリコンを、PCR反応のさまざまな段階で、その濃度が高くなるのに伴って捕捉して検出することができることも実証する。この試験はまた、2プローブ式システムが、磁性ミクロスフェアを用いるリアルタイムPCR検出のための実行可能なデザインであることも示す。ハイブリダイゼーションプローブ(US 2001/6174670号)も2プローブ式システムを用いている。
2プローブ式システムを用いて、標的特異的ヌクレオチドプローブと連結された磁性ミクロスフェアの存在下で、第V因子遺伝子アンプリコンの生成を検出した。標的特異的プローブ(FVプローブAno)をビーズセット22と結び付けた。このプローブは蛍光標識しなかった。ビーズセットとは結び付けられていないが標的特異的であり、3'末端でCy3フルオロフォアにより標識されている別のプローブを混合物中に含めた。標的に対して特異的でないオリゴヌクレオチド配列と連結されている第2のビーズ(ビーズセット27)も陰性対照として添加した。
熱変性段階;95℃で5分間。
サイクリング段階(43サイクルにわたり):95℃で30秒間、45℃で45秒間、72℃で45秒間。
1.-20℃の乾燥保存Pierce EDC粉末の新鮮なアリコートを室温に至らせる。
2.アミン置換オリゴヌクレオチド(「プローブ」または「捕捉」オリゴ)をdH2O中に1mM(1ナノモル/μL)で再懸濁させる。
3.連結されていないLuminexミクロスフェアの貯蔵物を、ミクロスフェアに付属の製品情報シートに記載された指示に従って再懸濁させる。
4.ミクロスフェア貯蔵物の5.0×106個を、USA Scientific微量遠心管に移す。
5.ミクロスフェア貯蔵物を、8000×g以上で1〜2分間の微量遠心によってペレット化する。
6.上清を除去し、ペレット化したミクロスフェアを、50μLの0.1M MES、pH 4.5中にボルテックス処理およびおよそ20秒間の超音波処理によって再懸濁させる。
7.1mM捕捉オリゴのdH2O中の1:10希釈物を調製する(0.1ナノモル/μL)。
8.2μL(0.2ナノモル)の1:10希釈捕捉オリゴを、再懸濁させミクロスフェアに添加して、ボルテックス処理によって混合する。
9.dH2O中にある10mg/mL EDCの新鮮な溶液を調製する(注:EDC粉末は2回目のEDC添加に再利用するために乾燥剤に戻す)。
10.各カップリング反応のたび毎に、2.5μLの新鮮な10mg/mL EDCをミクロスフェア(
)に添加して、ボルテックス処理によって混合する。
11.暗所にて室温で30分間インキュベートする。
12.dH2O中にある10mg/mL EDCの第2の新鮮な溶液を調製する(注:EDC粉末のアリコートはここで廃棄すべきである)。
13.各カップリング反応のたび毎に、2.5μLの新鮮な10mg/mL EDCをミクロスフェアに添加して、ボルテックス処理によって混合する。
14.暗所にて室温で30分間インキュベートする。
15.連結されたミクロスフェアに1.0mLの0.02% Tween-20を添加する。
16.連結されたミクロスフェアを、8000×g以上で1〜2分間の微量遠心によってペレット化する。
17.上清を除去し、連結されたミクロスフェアを1.0mLの0.1% SDS中にボルテックス処理によって再懸濁させる。
18.連結されたミクロスフェアを、8000×g以上で1〜2分間の微量遠心によってペレット化する。
19.上清を除去し、連結されたミクロスフェアを100μLのTE、pH 8.0中に、ボルテックス処理およびおよそ20秒間の超音波処理によって再懸濁させる。
20.連結されたミクロスフェアを血球計算器によって算定する:
a.再懸濁された、連結されたミクロスフェアをdH2O中に1:100で希釈する。
b.ボルテックス処理によって十分に混合する。
c.10μLを血球計算器に移す。
d.血球計算器グリッドの4つの大きな隅部の内部のミクロスフェアを計数する。
e.ミクロスフェア/μL=(4つの大きな隅部の中のミクロスフェアの合計)×2.5×100(希釈係数)。
f.注:最大値は50,000ミクロスフェア/Lとする。
21.連結されたミクロスフェアを暗所にて2〜8℃に冷蔵して保存する。
以下の実施例は、核酸増幅シグナルを、タグ付加プライマー法を用いてリアルタイムで測定しうることを実証する。この実施例はまた、これらの測定を、石英撮像チャンバー、および超常磁性粒子を電荷結合素子(CCD)検出器の反対側の二次元チャンバーの表面に磁性で引き出すために石英撮像チャンバーに隣接させて動かすことのできる磁石を含む撮像システム(例えば、図1および2参照)を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応溶液の存在下で、それに変更を加えることなしに行いうること、ならびにそれらの測定がLuminex 200システムと同等であることも実証する。石英チャンバーおよび磁石を含む撮像システムは、検出器が、粒子およびそれらに結合した任意の分子の画像を、それらが磁場によってチャンバーの表面に固定化されている時に記録することから、「静的」撮像システムとみなすことができる。これとは対照的に、Luminex 200システムは、粒子が検出中に固定化されていないため、「フロー」システムとみなすことができる。
このデザインでは、プライマーの一方がその5'末端でCy3フルオロフォアによって修飾されている2つのプライマーを用いた。もう一方のプライマーは、標的特異的領域と、超常磁性ミクロスフェアに結び付けられた特異的プローブに対して相補的なタグ配列(抗タグ)配列との間に配置された炭素18個のスペーサーによって修飾させた。この場合、プライマーLUA-MEUは、C18スペーサーの5'側に、ビーズセット43に連結されたビーズME tfプローブ配列に対して相補的なタグ配列を有した(iSpl8-IDT)。この試験において、プライマーセットは、MTHFRエクソン7遺伝子配列のある領域を増幅するように設計した。2つのLuminex MagPlexミクロスフェアセット(ビーズセット)を、PCR反応中にPCR混液に含めた。ビーズセット43に結び付けられたプローブはプライマーLUA-MEU-TF上の5'タグ配列に対して相補的であり、一方、ビーズセット12に連結されたプローブはこの反応物におけるプライマーのタグ配列に対して相補的ではなく、それ故に陰性対照として利用した。添加したLuminex Magplexミクロスフェアセットはいずれも、反応物当たりおよそ5000ミクロスフェアの濃度とした。
熱変性段階;95℃で5分間。
サイクリング段階(36サイクルにわたり):94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で30秒間。
この例では、8種のプライマーセットおよび14種のビーズセットによる直接ハイブリダイゼーション方法を用いた。増幅産物が、関連のないプローブを含むビーズセットと非特異的にはハイブリダイズしないことを示すために、過剰なビーズセットを用いた。
熱変性段階:95℃で10分間。
サイクリング段階(36サイクルにわたり):94℃で30秒間、56℃で90秒間、72℃で90秒間。
Claims (37)
- 試料中の複数の核酸標的を増幅して検出する方法であって、以下の段階:
(a)チャンバー内で、複数の核酸標的を含む試料、複数の核酸標的の増幅の刺激のための複数のプライマー対、標識剤、および複数の核酸標的に対して相補的な第1の複数のプローブを混ぜ合わせる段階であって、プローブが、各プローブの独自性がそれが固定化されているコード化された磁性ビーズから分かるように、複数のコード化された磁性ビーズ上に固定化されている、前記段階;
(b)増幅サイクルを行って、複数のプライマー対により増幅される複数の核酸標的のそれぞれについて標識された増幅産物を形成させる段階;
(c)標識された増幅産物を、コード化された磁性ビーズ上に固定化されたプローブとハイブリダイズさせる段階;
(d)コード化された磁性ビーズ、およびコード化された磁性ビーズ上に固定化されたプローブとハイブリダイズした標識された増幅産物を、チャンバーの表面に引き寄せるために、磁場をチャンバーの表面に印加する段階;
(e)コード化された磁性ビーズからのシグナル、および標識された増幅産物からのシグナルを検出する段階;
(f)さらなる増幅サイクルを行う前に、チャンバーの表面から磁場を除去する段階;ならびに
(g)段階(b)から(f)までを少なくとも1回反復する段階
を含む方法であり、試料中の複数の核酸標的が増幅されて検出される方法。 - 標識された増幅産物からのシグナルを、試料中の核酸標的の濃度と相関付ける段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 複数のプライマー対が、8〜500種の異なるプライマー対としてさらに規定される、請求項1記載の方法。
- 標識剤がそれぞれのプライマー対の一方のプライマーと結び付けられている、請求項1記載の方法。
- チャンバーが石英チャンバーである、請求項1記載の方法。
- 標識剤が蛍光色素である、請求項1記載の方法。
- 標識剤が蛍光共鳴エネルギー転移対である、請求項1記載の方法。
- チャンバー内で、複数の核酸標的に対して相補的な第2の複数のプローブを混ぜ合わせる段階をさらに含む方法であって、第2の複数のプローブが複数のコード化された磁性ビーズ上に固定化されておらず、さらに、第2の複数のプローブが、第1の複数のプローブとは異なる、複数の核酸標的上の領域に対して相補的である、請求項1記載の方法。
- 蛍光共鳴エネルギー転移対の一方のメンバーが、コード化された磁性ビーズ上に固定化された第1の複数のプローブと結び付けられており、蛍光共鳴エネルギー転移対のもう一方のメンバーが、コード化された磁性ビーズ上に固定化されていない第2の複数のプローブと結び付けられている、請求項8記載の方法。
- 標識剤がフルオロフォアとクエンチャーの対である、請求項1記載の方法。
- 標識剤がDNAインターカレート剤である、請求項1記載の方法。
- コード化された磁性ビーズが蛍光色素によりコード化されている、請求項1記載の方法。
- コード化された磁性ビーズが、異なる蛍光強度によりコード化されている、請求項12記載の方法。
- コード化された磁性ビーズが、異なる蛍光発光波長によりコード化されている、請求項12記載の方法。
- コード化された磁性ビーズが超常磁性である、請求項1記載の方法。
- 磁場の印加が、永久磁石をチャンバーの表面に隣接させて配置することを含む、請求項1記載の方法。
- 磁場の印加が、チャンバーの表面に隣接させた電磁石の電源を入れることを含む、請求項1記載の方法。
- 磁場が増幅サイクルのプライマーアニーリング段階中に印加される、請求項1記載の方法。
- 磁場が増幅サイクルのプライマー伸長段階中に印加される、請求項1記載の方法。
- 磁場が増幅サイクルの後に印加される、請求項1記載の方法。
- コード化された磁性ビーズおよび標識された増幅産物を検出する段階が、コード化された磁性ビーズおよび標識された増幅産物から発せられた蛍光波長を撮像することを含む、請求項1記載の方法。
- 磁場を除去する段階が、永久磁石をチャンバーの表面に隣接した位置から除去することを含む、請求項1記載の方法。
- 磁場を除去する段階が、チャンバーの表面に隣接させた電磁石の電源を切ることを含む、請求項1記載の方法。
- 段階(b)から(f)までを10〜40回反復する、請求項1記載の方法。
- 複数のプローブが、ブロックされた3'ヒドロキシル基を含む、請求項1記載の方法。
- 3'ヒドロキシル基がリン酸基によってブロックされている、請求項25記載の方法。
- 3'ヒドロキシル基が3'逆方向dT(3' inverted dT)によってブロックされている、請求項25記載の方法。
- 試料中の複数の核酸標的を増幅して検出する方法であって、以下の段階:
(a)チャンバー内で、複数の核酸標的を含む試料、複数の核酸標的の増幅の刺激のための複数のプライマー対、および複数の核酸標的に対して相補的な複数の分子ビーコンを混ぜ合わせる段階であって、分子ビーコンが、各分子ビーコンの独自性がそれが固定化されているコード化された磁性ビーズから分かるように、複数のコード化された磁性ビーズ上に固定化されている、前記段階;
(b)増幅サイクルを行って、複数のプライマー対により増幅される複数の核酸標的のそれぞれについて増幅産物を形成させる段階;
(c)増幅産物を、コード化された磁性ビーズ上に固定化された分子ビーコンとハイブリダイズさせる段階;
(d)コード化された磁性ビーズ、およびコード化された磁性ビーズ上に固定化された分子ビーコンとハイブリダイズした増幅産物を、チャンバーの表面に引き寄せるために、磁場をチャンバーの表面に印加する段階;
(e)コード化された磁性ビーズからのシグナル、および分子ビーコンからのシグナルを検出する段階;
(f)さらなる増幅サイクルを行う前に、チャンバーの表面から磁場を除去する段階;ならびに
(g)段階(b)から(f)までを少なくとも1回反復する段階
を含む方法であり、試料中の複数の核酸標的が増幅されて検出される方法。 - 試料中の核酸標的を増幅して検出する方法であって、以下の段階:
(a)チャンバー内で、核酸標的を含む試料、核酸標的の増幅の刺激のためのプライマー対、および核酸標的に対して相補的なプローブセットを混ぜ合わせる段階であって、プローブセットが、磁性ビーズ上に固定化された第1のプローブ、および標識を含む第2のプローブを含む、前記段階;
(b)増幅サイクルを行って、プライマー対により増幅される核酸標的について増幅産物を形成させる段階;
(c)増幅産物をプローブセットとハイブリダイズさせる段階;
(d)磁性ビーズ、およびコード化された磁性ビーズ上に固定化されたプローブとハイブリダイズした増幅産物を、チャンバーの表面に引き寄せるために、磁場をチャンバーの表面に印加する段階;
(e)増幅産物とハイブリダイズした第2のプローブからのシグナルを検出する段階;
(f)さらなる増幅サイクルを行う前に、チャンバーの表面から磁場を除去する段階;ならびに
(g)段階(b)から(f)までを少なくとも1回反復する段階
を含む方法であり、試料中の核酸標的が増幅されて検出される方法。 - 磁性ビーズがコード化された磁性ビーズである、請求項29記載の方法。
- 複数の核酸標的を増幅して検出する方法としてさらに規定される方法であって、以下の段階:
(a)チャンバー内で、複数の核酸標的を含む試料、複数の核酸標的の増幅の刺激のための複数のプライマー対、および複数の核酸標的に対して相補的な複数のプローブセットを混ぜ合わせる段階であって、各プローブセットが、第1のプローブの独自性がそれが固定化されているコード化された磁性ビーズから分かるように、コード化された磁性ビーズ上に固定化されている、第1のプローブと、標識を含む第2のプローブとを含む、前記段階;
(b)増幅サイクルを行って、複数のプライマー対により増幅される複数の核酸標的のそれぞれについて増幅産物を形成させる段階;
(c)増幅産物をプローブセットとハイブリダイズさせる段階;
(d)コード化された磁性ビーズ、およびコード化された磁性ビーズ上に固定化されたプローブとハイブリダイズした増幅産物を、チャンバーの表面に引き寄せるために、磁場をチャンバーの表面に印加する段階;
(e)コード化された磁性ビーズからのシグナル、および増幅産物とハイブリダイズした第2のプローブからのシグナルを検出する段階;
(f)さらなる増幅サイクルを行う前に、チャンバーの表面から磁場を除去する段階;ならびに
(g)段階(b)から(f)までを少なくとも1回反復する段階
を含む方法であり、試料中の複数の核酸標的が増幅されて検出される、請求項29記載の方法。 - 試料中の核酸標的を増幅して検出する方法であって、以下の段階:
(a)チャンバー内で、核酸標的を含む試料、核酸標的の増幅の刺激のためのプライマー対、クエンチャー分子と連結されたdNTP、および核酸標的に対して相補的な蛍光標識されたプローブを混ぜ合わせる段階であって、プローブが磁性ビーズ上に固定化されている、前記段階;
(b)増幅サイクルを行って、クエンチャー分子を含む増幅産物である、核酸標的の増幅産物を形成させる段階;
(c)増幅産物を、磁性ビーズ上に固定化されたプローブとハイブリダイズさせる段階;
(d)磁性ビーズ、およびコード化された磁性ビーズ上に固定化されたプローブとハイブリダイズした増幅産物を、チャンバーの表面に引き寄せるために、磁場をチャンバーの表面に印加する段階;
(e)標識されたプローブからのシグナルを検出する段階であって、標識されたプローブからのシグナルの減少が、標識されたプローブとクエンチャー分子を含む増幅産物とのハイブリダイゼーションを意味する段階;
(f)さらなる増幅サイクルを行う前に、チャンバーの表面から磁場を除去する段階;ならびに
(g)段階(b)から(f)までを少なくとも1回反復する段階
を含む方法であり、試料中の核酸標的が増幅されて検出される方法。 - 磁性ビーズがコード化された磁性ビーズである、請求項32記載の方法。
- 複数の核酸標的を増幅して検出する方法としてさらに規定される方法であって、以下の段階:
(a)チャンバー内で、複数の核酸標的を含む試料、複数の核酸標的の増幅の刺激のための複数のプライマー対、クエンチャー分子と連結されたdNTP、および複数の核酸標的に対して相補的な複数の蛍光標識されたプローブを混ぜ合わせる段階であって、プローブが、各プローブの独自性がそれが固定化されているコード化された磁性ビーズから分かるように、複数のコード化された磁性ビーズ上に固定化されている、前記段階;
(b)増幅サイクルを行って、複数のプライマー対により増幅される複数の核酸標的のそれぞれについてクエンチャー分子を含む増幅産物を形成させる段階;
(c)増幅産物を、コード化された磁性ビーズ上に固定化されたプローブとハイブリダイズさせる段階;
(d)コード化された磁性ビーズ、およびコード化された磁性ビーズ上に固定化されたプローブとハイブリダイズした増幅産物を、チャンバーの表面に引き寄せるために、磁場をチャンバーの表面に印加する段階;
(e)コード化された磁性ビーズからのシグナル、および標識されたプローブからのシグナルを検出する段階であって、標識されたプローブからのシグナルの減少が、標識されたプローブとクエンチャー分子を含む増幅産物とのハイブリダイゼーションを意味する段階;
(f)さらなる増幅サイクルを行う前に、チャンバーの表面から磁場を除去する段階;ならびに
(g)段階(b)から(f)までを少なくとも1回反復する段階
を含む方法であり、試料中の複数の核酸標的が増幅されて検出される、請求項32記載の方法。 - 試料中の複数の核酸標的を増幅して検出する方法であって、以下の段階:
(a)チャンバー内で、複数の核酸標的を含む試料;複数の核酸標的の増幅の刺激のための複数のプライマー対を混ぜ合わせる段階であって、各プライマー対が、標的特異的配列、標的特異的配列の5'側にあるタグ配列、および標的特異的配列とタグ配列との間にあるブロッカーを含む第1のプライマー、ならびに標的特異的配列を含む第2のプライマー;標識剤;ならびに複数のプライマー対のタグ配列に対して相補的な複数のプローブを含み、プローブが、各プローブの独自性がそれが固定化されているコード化された磁性ビーズから分かるように、複数のコード化された磁性ビーズ上に固定化されている、前記段階;
(b)増幅サイクルを行って、複数のプライマー対により増幅される複数の核酸標的のそれぞれについてタグ付加および標識された増幅産物を形成させる段階;
(c)タグ付加および標識された増幅産物を、コード化された磁性ビーズ上に固定化されたプローブとハイブリダイズさせる段階;
(d)コード化された磁性ビーズ、ならびにコード化された磁性ビーズ上に固定化されたプローブとハイブリダイズしたタグ付加および標識された増幅産物を、チャンバーの表面に引き寄せるために、磁場をチャンバーの表面に印加する段階;
(e)コード化された磁性ビーズ、ならびにタグ付加および標識された増幅産物を検出する段階;
(f)さらなる増幅サイクルを行う前に、チャンバーの表面から磁場を除去する段階;ならびに
(g)段階(b)から(f)までを少なくとも1回反復する段階
を含む方法であり、試料中の複数の核酸標的が増幅されて検出される方法。 - 標識剤が、プライマー対の第2のプライマーと結び付けられたレポーター分子である、請求項35記載の方法。
- 標識剤がインターカレート色素である、請求項35記載の方法。
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