CN111378645B

CN111378645B - 一种基因合成的方法

Info

Publication number: CN111378645B
Application number: CN201811613214.0A
Authority: CN
Inventors: 李一凡; 邱蔚; 戴晓慧; 吴政宪
Original assignee: Jiangsu Genscript Biotech Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Genscript Biotech Co Ltd
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2038-12-27
Also published as: WO2020135669A1; CN111378645A

Abstract

本发明提供一种基因合成的方法，所述方法包含将多种靶基因分割成若干个重叠寡核苷酸序列，在重叠寡核苷酸序列的端部添加酶切位点序列和标签序列，所述标签序列因不同的靶基因而不同；使连接有标签序列的重叠寡核苷酸序列以单链形式与连接有标签序列的反向互补序列的磁珠通过双链结构特异性连接，然后在油包水体系中酶切得到单链的重叠寡核苷酸，再进行聚合酶链式组装，同时获得多种靶基因片段。

Description

一种基因合成的方法

技术领域

本发明涉及一种基因合成的方法，具体涉及一种同时合成多个不同基因的方法。

背景技术

基因合成是现代生物技术持续快速发展的重要使能技术，能否以更低的成本更高的通量获得价格更低的基因非常关键。近年来基于芯片的DNA合成技术得以快速发展，使得科研人员能够以非常低廉的价格获得大量DNA序列。同时，与之对应的也有一些DNA合成技术被开发出来，能够利用这些价格低廉的DNA文库进行基因合成(Large-scale de novoDNA synthesis:technologies and applications,Nat Methods.2014May；11(5):499-507)。但是，到目前为止，大部分的技术都需要做depooling，之后将目的基因分别合成出来，这会带来比较高的下游处理成本。

2018年，Sriram Kosuri团队开发了一种多元基因合成的方法(Multiplexed genesynthesis in emulsions for exploring protein functionallandscapes.Science.2018Jan19；359(6373):343-347)，该方法通过精巧的oligo文库设计，使得不同基因的合成引物能够被磁珠吸附进入不同的微球，从而能够将不同的基因在同一个PCR反应体系中进行合成。然而该方法的引物设计过程含有两次酶切的步骤，致使整个流程特别繁琐；同时，单条引物的设计需要分别对两个酶切位点加入两次，致使引物长度的利用率很低；另外，该方法不能用来合成序列中含有这两个酶位点的序列，致使方法的应用非常有限，而且下游处理的流程过于复杂，限制了这个方法的广泛应用。

发明内容

本发明提供了一种多基因合成方法，所述方法包括：

(1)将待合成的多种靶基因片段中的每种靶基因片段分割成若干个重叠寡核苷酸序列，在每个重叠寡核苷酸序列端部加上修饰序列使其能够以单链形式与磁珠特异性连接，所述修饰序列包括酶切位点序列和标签序列，所述标签序列因不同的靶基因片段而不同；

(2)合成带有修饰序列的重叠寡核苷酸序列；

(3)使带有修饰序列的重叠寡核苷酸序列与磁珠特异性连接；所述磁珠上连接有标签序列的反向互补序列，所述的特异性连接是通过标签序列与其反向互补序列形成双链结构；

(4)通过酶切得到单链的重叠寡核苷酸序列，再进行聚合酶链式组装(PCA)，获得多种靶基因片段；

其中，所述酶切和聚合酶链式组装在油包水体系中进行。

在一些实施方案中，至少一个油包水体系的每个油包水体系中仅中包含一个磁珠。

在一些实施方案中，在酶切之前加入酶切和PCA反应所需的缓冲液和试剂，并将其加入到油性介质中，震荡形成油包水体系。

在一些实施方案中，每个靶基因片段两端具有通用引物。

在一些实施方案中，所述酶切是通过内切酶进行切割，所述内切酶优选BspQI酶。

在一些实施方案中，所述的标签序列含有10-100个碱基，优选15-70个碱基，更优选20-40个碱基，最优选20-30个碱基。

在一些实施方案中，每一个重叠寡核苷酸序列含40-150个碱基；优选50-130个碱基；更优选60-110个碱基；再优选65-90个碱基；最优选65-80个碱基。

在一些实施方案中，所述重叠寡核苷酸序列包含重叠碱基，所述重叠碱基数量为10-100；优选10-70；更优选10-50；更优选10-30；更优选10-20；最优选15-16。

在一些实施方案中，所述磁珠通过链霉亲和素-生物素与所述标签序列的反向互补序列连接。

在一些实施方案中，所述多基因合成方法进一步包含在聚合酶链式组装后纯化多种靶基因片段的步骤。

在一些实施方案中，所述多基因合成方法进一步包含扩增获得的多种靶基因片段的步骤。

附图说明

通过以下详细的描述并结合附图将更充分地理解本发明。

图1是重叠寡核苷酸序列示意图；

图2是目标合成序列的电泳图；

图3是目标合成序列Gene1的测序结果；

图4是目标合成序列Gene2的测序结果；

图5是目标合成序列Gene3的测序结果。

具体实施方式

本发明提供了一种多基因合成的方法，解决了现有技术中在多基因合成在引物设计方面过于繁琐的技术难题。

本发明提供一种多基因合成方法，如图1所示，首先将双链靶基因片段分割成若干个重叠寡核苷酸序列，给每个重叠寡核苷酸序列加上修饰序列，即，在其端部添加酶切位点序列和标签序列；分别合成添加有修饰序列的重叠寡核苷酸序列和标签序列的反向互补序列，将磁珠与标签序列的反向互补序列连接；使标签序列与其反向互补序列形成一段双链结构，从而使修饰的重叠寡核苷酸序列被磁珠捕获，其中重叠寡核苷酸序列以单链的形式存在；通过酶切得到单链的重叠寡核苷酸序列；再进行聚合酶链式组装(polymerase chainassembly,PCA)同时获得多种靶基因片段；所述的酶切和聚合酶链式组装(PCA)在油包水体系中进行。

本发明中，重叠寡核苷酸序列是基于聚合酶链式组装(PCA)的原理由双链靶基因片段分割而成，一条链分割得到的寡核苷酸序列与其反向互补链分割得到的寡核苷酸序列部分反向互补，反向互补的部分位于所述寡核苷酸序列的两端，参见图1。具体而言，本发明中的重叠寡核苷酸序列是由双链靶基因片段分割而成的、且可以通过PCA反应合成完整的靶基因片段的寡核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述重叠寡核苷酸序列具有40-150个碱基或其范围内的任意的碱基数；优选50-130个碱基；更优选60-110个碱基；再优选65-90个碱基；最优选65-80个碱基。重叠寡核苷酸序列的碱基数具体可选自但不限于40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，1200，125，130，135，140，145，150个碱基。

在一些实施方案中，重叠寡核苷酸序列具有65-80个碱基。

在一些实施方案中，所述重叠寡核苷酸序列包含重叠碱基，所述重叠碱基数量为10-100；优选10-70；更优选10-50；再优选10-30；最优选10-20。本发明中，“重叠碱基”是指两个相邻重叠寡核苷酸序列端部相接的能够互补的碱基。

在一些实施方案中，重叠寡核苷酸序列包含重叠碱基数为15-16。

本发明中，给每个重叠寡核苷酸序列加上修饰序列的目的是为了使其能够以单链形式与磁珠特异性连接。修饰序列可以连接在重叠寡核苷酸序列的5'端或3'端。修饰序列包括酶切位点序列和标签序列。基于此目的，可以在每个重叠寡核苷酸序列的5’端或3'端添加酶切位点序列和标签序列。对不同靶基因片段使用不同的标签序列，因此，来自于不同靶基因片段的重叠寡核苷酸序列连接有相同的标签序列，来自于相同靶基因片段的重叠寡核苷酸序列连接有不同的标签序列，根据标签序列区分不同靶基因片段的重叠寡核苷酸序列。

当同时合成多种靶基因片段时，将每个靶基因片段分割成若干个重叠寡核苷酸序列。针对不同的靶基因片段使用不同的标签序列，合成添加有标签序列的重叠寡核苷酸序列并混合，随后通过磁珠上的标签序列的反向互补序列与标签序列形成双链结构来捕获重叠寡核苷酸序列，不同靶基因片段相应的重叠寡核苷酸序列在被磁珠捕获时通过标签序列被分选和区别开。

一个磁珠上只连接一种反向互补序列，因此与同一个磁珠相连的重叠寡核苷酸序列都具有相同的标签序列，即与同一个磁珠相连的重叠寡核苷酸序列均来自同一种靶基因片段，由此通过磁珠特异性捕获的方式将来自不同靶基因片段的重叠寡核苷酸序列区分开，以便于后续的进一步合成。一个磁珠上可以连接多个相同的反向互补序列，由此可以在同一个磁珠上捕获来自于同一种靶基因片段的多个重叠寡核苷酸序列。在一些实施方案中，一个磁珠上可以连接足够多个(例如多于10³个、多于10⁴个或多于10⁵个)相同的反向互补序列，使得至少一个磁珠可以捕获来自同一个靶基因片段的全部重叠寡核苷酸序列。

标签序列的另一个功能是用于连接重叠寡核苷酸序列和磁珠。磁珠上连接有标签序列的反向互补序列，标签序列能够与其反向互补序列形成双链结构，由此使得重叠寡核苷酸序列与磁珠相连，连接到磁珠上的重叠寡核苷酸序列为单链状态。

在一些实施方案中，标签序列具有10-100个碱基，更优选15-70个碱基，再优选20-40个碱基，最优选20-30个碱基。

在一些实施方案中，标签序列具有的碱基数选自但不限于20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30。

在一些实施方案中，带有修饰序列的重叠寡核苷酸序列、和/或标签序列的反向互补序列可以通过任何适当的方式合成。合成寡核苷酸序列的方法是本领域公知的，例如可以通过芯片合成，例如可以采用喷墨打印法或者光活化的方法。

带有修饰序列的重叠寡核苷酸序列被合成后，可以混合成寡核苷酸混合物。来自不同靶基因片段的重叠寡核苷酸序列可以被混合在一起，在后续步骤中通过带有不同反向互补序列的磁珠分选出来。例如，可以通过芯片合成来自不同靶基因片段的带有修饰序列的重叠寡核苷酸序列，从芯片上收集合成的序列，在收集时无需将不同靶基因片段的重叠寡核苷酸序列区分开，可以全部混合在一起，在后续步骤中通过带有不同反向互补序列的磁珠进行分选。

磁珠可以通过任何可能的方式与标签序列的反向互补序列相连接。使磁珠与序列相连接的方法是本领域公知的，例如可以通过亲和吸附连接。在一些实施方案中，所述的磁珠通过链霉亲和素-生物素与标签序列的反向互补序列连接。在一些实施方案中，一个磁珠上可以有足够多的链霉亲和素(例如多于10³个、多于10⁴个或多于10⁵个)，以使得一个磁珠可以连接足够多的反向互补序列。具有多个链霉亲合素的磁珠可以自行制备或通过商购获得。

使标签序列与其反向互补序列形成双链结构的方法是本领域公知的，例如可以通过退火使二者形成双链结构。

修饰的重叠寡核苷酸序列被磁珠捕获后，可以将不同的磁珠分隔开，分别进行每一个靶基因片段的合成。磁珠被分隔开，在分隔的体系中从磁珠上将重叠寡核苷酸序列切割下来，得到单链的重叠寡核苷酸序列，再进行聚合酶链式组装，获得靶基因片段。每个分隔的体系中可以含有来自同一种靶基因片段的全部重叠寡核苷酸序列，因此在一个分隔的体系中可以合成完整的一种靶基因片段。不同的体系中可以包含来自不同靶基因片段的重叠寡核苷酸序列，多个不同的体系同时进行反应，可以获得多种不同的靶基因片段。

在一些实施方案中，所述分隔的体系可以是油包水体系。磁珠通过油包水体系被分隔开。每个油包水体系中包含连接有重叠寡核苷酸序列的磁珠、酶切反应所需的缓冲液和试剂、以及聚合酶链式组装所需的缓冲液和试剂。在油包水体系中通过酶切作用将标签序列与其反向互补序列的双链结构与单链重叠寡核苷酸序列分割开，得到单链的未经修饰的重叠寡核苷酸序列，再进行聚合酶链式组装，获得靶基因片段。

每个油包水体系中可以含有来自同一种靶基因片段的全部重叠寡核苷酸序列，因此在一个分隔的体系中可以合成完整的一种靶基因片段。不同的油包水体系中可以含有来自不同靶基因片段的重叠寡核苷酸序列，多个这样的油包水体系同时进行反应，可以同时获得多种靶基因片段。

在一些实施方案中，至少一个油包水体系中的每一个油包水体系只含有一种靶基因片段的若干重叠寡核苷酸序列，这些重叠寡核苷酸片段在该油包水体系中包含的PCA溶液中进行组装，其组装不会受到其它靶基因片段的重叠寡核苷酸片段的影响。在一些实施方案中，至少一个油包水体系中的每一个油包水体系只含有一个磁珠。

酶切反应所需的缓冲液和试剂、以及聚合酶链式组装所需的缓冲液和试剂在形成油包水体系之前与磁珠混合。可以通过任何合适的方法形成油包水体系，例如通过将缓冲液与水不相容的溶剂(例如油性介质)混合并震荡形成油包水体系。在一些实施方案中，可以在酶切反应之前加入缓冲液，并将含有磁珠的缓冲液与水不相容的溶剂(例如油性介质)混合并震荡形成油包水体系，之后进行酶切反应和聚合酶链式组装。在一些实施方案中，可以通过在酶切反应之前向磁珠加入缓冲液，并将含有磁珠的缓冲液加入到与水不相容的溶剂例如油性介质中，或者将与水不相容的溶剂例如油性介质加入到含有磁珠的缓冲液中，震荡形成油包水体系。

对缓冲液与水不相容的溶剂(例如油性介质)的混合物进行震荡以使得形成的油滴(油包水体系表现为油滴的形式，一个油包水体系即为一个油滴)尽量小，由此使得至少至少一个油包水体系中的每一个油包水体系只含有一种靶基因片段的若干重叠寡核苷酸序列，或者，进一步地，使得至少一个油包水体系中的每一个油包水体系只含有一个磁珠。

在一些实施方案中，混合时水不相容的溶剂(例如油性介质)与缓冲液的体积比可以是3:1-10:1，优选5:1。在一些实施方案中，震荡的转速可以是2000rpm-4000rpm，优选2800rpm。

在一些实施方案中，所加入的缓冲液可以包含酶切反应所需的缓冲液和试剂。在一些实施方案中，所加入的缓冲液可以包含聚合酶链式组装所需的缓冲液和试剂。

在一些实施方案中，所述油性介质可以包含油和表面活性剂。在一些实施方案中，所述油性介质中的油可以是矿物油。在一些实施例中，所述油性介质中的表面活性剂可以选自Span、Tween和Triton X-100的任意一种或几种。在一些实施例中，所述油性介质中的表面活性剂可以是Span、Tween和Triton X-100的混合物。在一些实施方案中，所述油性介质的组成可以是：Span 4.5％，Tween 80 0.4％，Triton X-100 0.05％，剩余为矿物油，其中的百分含量为体积/体积比。

从磁珠上将重叠寡核苷酸序列切割下来可以利用重叠寡核苷酸序列上连接的酶切位点，通过酶切进行。在一些实施方案中，酶切采用的酶可以是任意能够将单链切割的酶，所述的酶选自但不限于内切酶，所述内切酶选自但不限于BspQI酶。

在一些实施方案中，酶切位点序列和标签序列可以连接在重叠寡核苷酸序列的5'端或3’端，其中酶切位点位于标签序列和重叠寡核苷酸序列之间。

本发明中，聚合酶链式组装(polymerase chain assembly,PCA)是本领域公知的技术，它是一种基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)原理的方法，是指使彼此之间部分重叠并覆盖整个目的基因的单链寡核苷酸(其示意图参见图1)互为引物和模板，在存在聚合酶的条件下通过多轮变性、退火、延伸循环，最终获得目的基因。

在一些实施方案中，在每种靶基因片段两端可以连接通用引物，使其能够在后续的扩增中采用通用引物进行扩增，而不需要额外设计引物。在一些实施方案中，所使用的通用引物F可以是CACGACTACAGTGAATAGGCAAGCG，所使用的通用引物R可以是CGTCTGGGTAACATAACTATCTGGGAGG。

在一些实施方案中，在聚合酶链式组装之后，还可以包含纯化的步骤。在一些实施方案中，纯化可以包括先将油包水体系的乳浊液破乳，再进行核酸的纯化回收。破乳的方法是本领域公知的，例如可以通过离心和水饱和***萃取去除油，剩下水相进行纯化回收。纯化回收核酸的方法是本领域公知的，例如可以通过可商购的试剂盒，例如PCR clean up回收试剂盒进行柱回收。

在一些实施方案中，本发明的方法还可以包含进一步扩增合成的靶基因片段的步骤。在一些实施方案中，可以通过通用引物扩增每种靶基因片段。在一些实施方案中，可以通过通用引物扩增多种靶基因片段的混合物。在一些实施方案中，所述多种靶基因片段的混合物可以在同一个扩增反应中被扩增。

本发明中所述的“至少一个”可以包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少100个、至少1000个、或至少10000个。

在一些实施方案中，本发明的基因合成流程可以分为以下几步：

1.在靶基因片段两端添加上通用引物序列，利用引物设计软件分成多个65-80bp的小重叠片段；

2.给每个小重叠片段的5’端添加上对特定基因的标签序列和BspQI酶切位点，最终形成92-102bp小片段，合成这些小重叠片段并将这些小片段混合成重叠寡核苷酸混合物(Mix)；

3.将链霉亲和素的磁珠和与生物素连接的标签序列的反向互补序列进行亲和吸附，形成带标签序列的反向互补序列的磁珠；

4.带标签序列的反向互补序列的磁珠与步骤2中得到的寡核苷酸混合物混合，进行缓慢退火，使重叠寡核苷酸片段上带有的标签序列与磁珠上的标签序列的反向互补序列形成双链结构，使得1个磁珠上有靶基因合成所需要的所有重叠寡核苷酸序列；

5.将磁珠加入到聚合酶链式组装(PCA)体系中，同时加入BspQI，将含有BspQI的PCA体系缓慢加入5倍体积的与水不相容的油性介质(oil-surfactant)中并剧烈震荡(转速为2800rpm)，形成油包水结构，；将乳浊液分装至PCR管中先进行酶切后进行重叠聚合酶链反应(PCA)；

6.PCA反应后的乳浊液先进行乳浊液破乳，再进行纯化回收，得到PCA产物；

7.利用通用引物进行PCR获得靶基因目的片段。

本领域技术人员应当理解，上述流程中，一些步骤在操作上并没有先后的要求，因此一些步骤的先后顺序可以任意调换，例如获得重叠寡核苷酸混合物的步骤(包括上述步骤1、2)和获得带标签序列的反向互补序列的磁珠的步骤(上述步骤3)可以任意顺序进行。

在一个优选的实施方案中，通过以下步骤进行多基因合成：

1.将需要合成的靶基因片段两端添加上通用引物序列，利用引物设计软件将待合成的片段分成多个65-80bp的小片段；

为了可以在一个体系中进行多个靶基因片段的合成，需要在待合成的靶基因片段两端分别添加上通用引物序列作为最终的序列；5’端添加通用引物序列：CACGACTACAGTGAATAGGCAAGCG；3’端添加通用引物序列：CCTCCCAGATAGTTATGTTACCCAGACG；将带有通用引物的待合成基因片段放入相应的设计软件中，设置每条重叠寡核苷酸序列的长度为65-80bp，重叠寡核苷酸序列之间的重叠碱基(overlap)长度为15bp，得到拆解后的多条重叠寡核苷酸序列。注：通用引物F：CACGACTACAGTGAATAGGCAAGCG；通用引物R：CGTCTGGGTAACATAACTATCTGGGAGG；

2.在得到的重叠寡核苷酸序列两端添加特定的序列并进行合成

在同一个靶基因片段的所有重叠寡核苷酸序列的5’端添加上BspQI位点，然后再在BspQI位点的5’端添加上一段标签序列(同一个基因的所有重叠寡核苷酸序列用同一个标签序列)；具体地，基因1的所有重叠寡核苷酸序列5’端添加上BspQI位点然后在BspQI位点5’端添加上标签序列1；基因2的所有引物5’端添加上BspQI位点然后在BspQI位点5’端添加上标签序列2；以此类推；

标签序列1的反向互补序列定义为D1-R，标签序列2的反向互补序列义为D2-R，在其序列的3’端添加生物素修饰；

将上述设计好的寡核苷酸进行化学合成，将合成的带有酶切位点和标签序列的重叠寡核苷酸混合成寡核苷酸混合物(Mix)；

3.将带有链霉亲和素的磁珠和生物素-标签序列的反向互补序列进行亲和吸附，形成带标签序列的反向互补序列的磁珠；

具体而言，将生物素修饰的D1-R和D2-R等分别与带有链霉亲和素的磁珠进行孵育，使生物素修饰的D1-R和D2-R等吸附于磁珠表面；

4.带标签序列的反向互补序列的磁珠与寡核苷酸混合物一起混合，进行缓慢退火使寡核苷酸上的标签序列与其反向互补序列形成部分双链结构，因此1个磁珠上有一个靶基因片段合成所需要的所有寡核苷酸；

由于每条重叠寡核苷酸片段的5’端都添加了标签序列，而磁珠上结合上很多带有标签序列的反向互补序列，标签序列与其反向互补序列形成正好是反向互补，因此可以通过退火将所有重叠寡核苷酸片段结合在磁珠上；一个靶基因片段合成所需要的重叠寡核苷酸片段只能与特定的磁珠结合在一起；

5.将结合有重叠寡核苷酸片段的磁珠加入到PCA体系中，同时加入BspQI，将含有BspQI的PCR体系缓慢加入到5倍体积的oil-surfactant中并剧烈震荡(转速为2800rpm)，形成油包水结构；

退火形成的结构中，包含1个BspQI酶切位点。通过酶切可以将所有的重叠寡核苷酸片段从磁珠上切割下来，通过PCA可以组装成所需的靶基因片段；震荡形成的油滴中至少存在一个油滴仅能容纳一个磁珠，所有的重叠寡核苷酸片段在该油滴包含的PCA溶液中进行组装，其组装不会受到其它靶基因片段的重叠寡核苷酸片段的影响；

6.乳浊液破乳，纯化回收，得到PCA产物；

具体地，通过离心和水饱和***萃取去除油，柱纯化，得到PCA产物；

7.利用通用引物进行PCR获得目的片段；

具体地，以上一步得到的PCA产物为模板，使用通用引物F和通用引物R进行PCR获得目的产物。

本发明中，可以利用常规的引物设计软件将靶基因片段分割成若干个重叠寡核苷酸序列，这样的引物设计软件是本领域技术人员容易获得的，例如可以由https:// primerize.stanford.edu/获得。

本发明的方法在引物设计上更简便，引物的获得仅需要一步酶切步骤，更省时高效，并且节省试剂，提高了基因合成的效率。

下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步详细的说明，但本发明不限于下面的实施例。

实施例1对3个需要合成的基因进行分段

首先对需要进行合成的3个DNA序列进行编号，分别命名为Gene1，Gene2，Gene3。为了方便后续使用通用引物进行扩增，分别在每个基因两端添加通用引物序列：

5’端添加通用引物序列：CACGACTACAGTGAATAGGCAAGCG；

3’端添加通用引物序列：CCTCCCAGATAGTTATGTTACCCAGACG；

下划线的部分是添加的序列。

Gene1

CACGACTACAGTGAATAGGCAAGCGTGTCGTGATGACCCAGACTCCAGTCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAATGGTAATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGAATCTGGAATCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTAGACCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAATGCACTTATGGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTTATAGTGGTGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAGGCGATCCTGTTGCTCCTACCCTCCCAGATAGTTATGTTACCCAGACG

Gene2

CACGACTACAGTGAATAGGCAAGCGCCAATGAAGACAGAATTCGGTCTCACGCGGGCGGCCCGGGTTCGATTCCCGGCCGATGCAGCATAATCCGCTCCTGGTGAGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCAGTGCACCCTCGCTCACCAAGGTTTAAGAGCTATGCTGAAGTCTTCCCAATCCTCCCAGATAGTTATGTTACCCAGACG

Gene3

CACGACTACAGTGAATAGGCAAGCGCAGTCTTTGGAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCTGGGGCATCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCAATTATTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCGTGCATTGATGGTGGTAGTGCTACTAGTACTTACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAGTCCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTCACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGATCCCCCCTTTATGTTGATTACGGCATGGACCTCTGGGGCCCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCTTCAGGACAACCTAAGGCTCCCTCCCTCCCAGATAGTTATGTTACCCAGACG

在对应的引物设计软件中，将添加了通用引物区域的基因序列输入，设定overlap长度为15-16bp，单条引物长度为65-80bp，即可得到基因合成所需要的重叠寡核苷酸(oligo)序列，由于oligo较多，以下仅展示Gene1通过软件设计的8条oligo序列：

Gene1_1

CACGACTACAGTGAATAGGCAAGCGTGTCGTGATGACCCAGACTCCAGTCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGG

Gene1_2

AATTACCATTAATGCTCTGACTGGCCTGGCACTTGATGGTGACTGTGCCTCCCACAGCTGCCTCC

Gene1_3

CAGTCAGAGCATTAATGGTAATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCC

Gene1_4

TTTGAACCGCGATGGGATTCCAGATTCCAGAGTGGATGCCCTGTAGATCAGGAGCTTGGGAGGCT

Gene1_5

CCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTAGACCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGT

Gene1_6

ACTACTACTACCATAAGTGCATTGACAGTAGTAAGTGGCAGCATCGGCACACTCCAGGTCGCTGAT

Gene1_7

ATGCACTTATGGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTTATAGTGGTGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGG

Gene1_8

CGTCTGGGTAACATAACTATCTGGGAGGGTAGGAGCAACAGGATCGCCTTTGACCACCACCTCGGTCCCTC

实施例2在得到的oligo序列两端添加特定的序列并进行合成

为了能从芯片合成的oligo mix中，把其中某一个基因的所有oligo独立地分离出来，需要在同一个基因的所有oligo的5’端添加上一段特异性序列，并在oligo与特异性序列之间添加上BspQI识别位点：gctcttca。

具体的oligo序列变为：

Gene1_1

ATAGATGCCGTCCTgctcttcaCACGACTACAGTGAATAGGCAAGCGTGTCGTGATGACCCAGACTCCAGTCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGG

Gene1_2

ATAGATGCCGTCCTgctcttcaAATTACCATTAATGCTCTGACTGGCCTGGCACTTGATGGTGACTGTGCCTCCCACAGCTGCCTCC

Gene1_3

ATAGATGCCGTCCTgctcttcaCAGTCAGAGCATTAATGGTAATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCC

Gene1_4

ATAGATGCCGTCCTgctcttcaTTTGAACCGCGATGGGATTCCAGATTCCAGAGTGGATGCCCTGTAGATCAGGAGCTTGGGAGGCT

Gene1_5

ATAGATGCCGTCCTgctcttcaCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTAGACCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGT

Gene1_6

ATAGATGCCGTCCTgctcttcaACTACTACTACCATAAGTGCATTGACAGTAGTAAGTGGCAGCATCGGCACACTCCAGGTCGCTGAT

Gene1_7

ATAGATGCCGTCCTgctcttcaATGCACTTATGGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTTATAGTGGTGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGG

Gene1_8

ATAGATGCCGTCCTgctcttcaCGTCTGGGTAACATAACTATCTGGGAGGGTAGGAGCAACAGGATCGCCTTTGACCACCACCTCGGTCCCTC

以上为展示Gene1中的8条oligo的最终序列，下划线部分为5’端添加的序列。

根据上述的oligo序列，设计反向互补的连接生物素的oligo，下表1为3个基因5’端添加的序列及其对应的生物素修饰R序列。

表1 5’端添加的序列及其对应的生物素修饰R序列

	序列
		Gene1	ATAGATGCCGTCCTgctcttca
Gene2	GTGGGTAAATGGTAgctcttca
		Gene3	CGACGGGGAGTATAgctcttca

		Gene1-R	tgaagagcAGGACGGCATCTAT-Biotin
Gene2-R	tgaagagcTACCATTTACCCAC-Biotin
		Gene3-R	tgaagagcTATACTCCCCGTCG-Biotin

通过化学合成的方法合成上述设计的所有序列。

实施例3生物素oligo与链霉亲和素磁珠结合

取5μl链霉亲和素磁珠加入清洗缓冲液(10mM Tris-HCl,pH 7.5、1mM EDTA、2.0MNaCl)清洗3次，使用45μl 1*HF buffer(NEB的Phusion聚合酶的buffer)重悬，加入100pmolGene1-R引物，使终体积为50μl。在室温25℃震荡(2200rpm)过夜，第二天使用清洗缓冲液清洗去除未与磁珠结合的生物素oligo。通过此种方式得到3种带有生物素oligo的磁珠(Gene-R-Beads)，分别命名为Gene1-R-Beads、Gene2-R-Beads、Gene3-R-Beads。

实施例4退火

将3种磁珠Gene1-R-Beads、Gene2-R-Beads、Gene3-R-Beads等比例混合在一起用20μl水重悬，与3个基因的oligo mix混合在一起。配制以下50μl体系：5*HF Buffer 10μl，3种连接有生物素oligo的磁珠混合物2μl，3个基因的oligo mix 0.9pmol(单条引物浓度，加入的引物需要过量)，H₂O至50μl。在振荡器2200rpm中进行如下反应，退火程序如下：50℃孵育3小时，按照0.1℃/s降温至40℃并维持3小时，按照0.1℃/s降温至30℃并维持3小时，按照0.1℃/s降温至20℃并维持2小时，按照0.1℃/s降温至10℃并维持2小时。退火结束后，使用洗脱缓冲液(Elution buffer)对产物进行清洗3-4次，将未结合上的oligo去除，最终使用20μl H₂O悬浮。

实施例5酶切和PCA

配制如下酶切和PCA体系：5*HF buffer 20μl、dNTPs(10mM each)2μl、BSA(20mg/ml)2μl、Phusion(2U/μl聚合酶NEB Inc.)2.5μl、通用引物F(25μM)2μl、通用引物R(25μM)2μl、BspQI 4μl、无菌水补充至100μl体系。

将100μl实施例4的溶液体系逐滴加入到500μl的oil-surfactant(Span 4.5％，Tween 80 0.4％，Triton X-100 0.05％，剩余为Mineral oil，均为体积/体积百分比)，并加入过程中在振荡器(Vortex-5，海门市其林贝尔仪器制造公司)中剧烈震荡，以最大转速2800转/分进行涡旋，形成油包水的结构。将最终的油包水的乳浊液体系分装至PCR管中，按照以下程序进行反应：50℃酶切90min；95℃预变性2min；95℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸40s，60个循环，最后72℃延伸反应5min。

实施例6纯化

将反应结束的几个PCR管中的乳浊液重新合并至1.5ml离心管中，首先12000rpm离心10min，结束后将上层的油层去除；加入1.5ml水饱和***，振荡混匀，1000rpm离心10s后，将上层的***层去除；再次加入1.5ml水饱和***，振荡混匀，1000rpm离心10s后，将上层的***层去除，此步骤尽可能将***层去除干净；将剩下的水相使用PCR clean up回收试剂盒进行柱回收，最后使用30μl无菌水洗脱，产物留待备用。

实施例7利用通用引物进行PCR获得目的片段

将上述的柱纯化得到的产物作为模板，按照以下体系继续PCR：5*HF buffer 10μl、dNTPs(10mM each)1μl、Phusion(2U/μl,NEB Inc.)0.5μl、通用引物F(25μM)1μl、通用引物R(25μM)1μl、无菌水补充至50μl体系。反应程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s,70℃退火15s,72℃延伸45s，25个循环；最后72℃延伸反应5min。反应结束后，将产物进行电泳检测及sanger测序，结果见图2-5。从图3-5测序结果可以看出，测序结果与目标靶基因序列完全一致，本实施例成功地完成了三条基因的同时合成。

本发明的实施方式并不限于上述实施例所述，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。

Claims

1.一种多基因合成方法，所述方法包括：

(1)将待合成的多种靶基因片段中的每种靶基因片段分割成若干个单链重叠寡核苷酸序列，在每个单链重叠寡核苷酸序列端部加上修饰序列使其能够以单链形式与磁珠特异性连接，所述修饰序列包括酶切位点序列和标签序列，所述标签序列因不同的靶基因片段而不同；

(2)合成带有修饰序列的单链重叠寡核苷酸序列；

(3)使带有修饰序列的单链重叠寡核苷酸序列与磁珠特异性连接；所述磁珠上连接有标签序列的反向互补序列，所述的特异性连接是通过标签序列与其反向互补序列形成双链结构；

(4)通过酶切得到单链重叠寡核苷酸序列，再进行聚合酶链式组装，获得多种靶基因片段；

其中，所述酶切和聚合酶链式组装在油包水体系中进行。

2.权利要求1所述的方法，其中至少一个油包水体系的每个油包水体系中仅包含一个磁珠。

3.权利要求1或2的方法，其中在酶切之前加入酶切和PCA反应所需的缓冲液和试剂，并将其与油性介质混合，震荡形成油包水体系。

4.权利要求3的方法，其中与油性介质混合的液体的体积与油性介质的体积比为1:5；震荡的转速为2800rpm。

5.权利要求1或2的方法，其中每个靶基因片段两端具有通用引物。

6.权利要求1或2的方法，其中所述酶切是通过内切酶进行切割。

7.权利要求6的方法，其中所述内切酶是BspQI酶。

8.权利要求1或2的方法，其中所述的标签序列含有10-100个碱基。

9.权利要求8的方法，其中所述标签序列含有15-70个碱基。

10.权利要求8的方法，其中所述标签序列含有20-40个碱基。

11.权利要求8的方法，其中所述标签序列含有20-30个碱基。

12.权利要求1或2的方法，其中所述单链重叠寡核苷酸序列含40-150个碱基。

13.权利要求12的方法，其中所述单链重叠寡核苷酸序列含50-130个碱基。

14.权利要求12的方法，其中所述单链重叠寡核苷酸序列含60-110个碱基。

15.权利要求12的方法，其中所述单链重叠寡核苷酸序列含65-90个碱基。

16.权利要求12的方法，其中所述单链重叠寡核苷酸序列含65-80个碱基。

17.权利要求1或2的方法，其中所述单链重叠寡核苷酸序列包含的重叠碱基的数量为10-100。

18.权利要求17的方法，其中所述单链重叠寡核苷酸序列包含的重叠碱基的数量为10-70。

19.权利要求17的方法，其中所述单链重叠寡核苷酸序列包含的重叠碱基的数量为10-50。

20.权利要求17的方法，其中所述单链重叠寡核苷酸序列包含的重叠碱基的数量为10-30。

21.权利要求17的方法，其中所述单链重叠寡核苷酸序列包含的重叠碱基的数量为10-20。

22.权利要求17的方法，其中所述单链重叠寡核苷酸序列包含的重叠碱基的数量为15-16。

23.权利要求1或2的方法，其中所述磁珠通过链霉亲和素-生物素与所述标签序列的反向互补序列连接。

24.权利要求1或2的方法，进一步包含在聚合酶链式组装后纯化多种靶基因片段的步骤。

25.权利要求1或2的方法，进一步包含扩增获得的多种靶基因片段的步骤。