JP2010095459A - 脂肪蓄積・代謝改善剤、抗TNF−α作用剤、及び新規トリテルペン化合物 - Google Patents
脂肪蓄積・代謝改善剤、抗TNF−α作用剤、及び新規トリテルペン化合物 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】ザクロの花部、水もしくは低級脂肪族アルコールの含水物等によりザクロ花部を抽出して得られる抽出液、又は前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、又は該抽出液等を分離、精製して得られるトリテルペン化合物を含むことを特徴とする脂肪蓄積・代謝改善剤及び抗TNF−α作用剤、この脂肪蓄積・代謝改善剤及び抗TNF−α作用剤を含有するヒト又は動物用医薬及び食品、並び該抽出液等を分離、精製することにより得ることができる新規トリテルペン化合物。
【選択図】 なし
Description
上海科学技術出版社編、中薬大辞典、小学館、1985、pp.1455−1456
・ザクロの花部を有効成分として含むもの、
・ザクロの花部を水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により抽出して得られる抽出液を有効成分として含むもの、及び
・前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキスを有効成分として含むもの
を挙げることができる。
メタノール:ナカライテスク社製、試薬一級
酢酸エチル:ナカライテスク社製、試薬一級
アセトン:ナカライテスク社製、試薬一級
n−ヘキサン:ナカライテスク社製、試薬一級
HPLC用メタノール:ナカライテスク社製、試薬特級
HPLC用アセトニトリル:フィッシャーサイエンス社製、試薬特級
酢酸:ナカライテスク社製、試薬特級
順相シリカゲルカラムクロマトグラフ用担体:関東化学社製、Silica Gel 60N(spherical,neutral、63〜210メッシュ)、BW−200(150〜300メッシュ)
逆相ODSカラムクロマトグラフ用担体:富士シリシア社製、Chromatorex ODS1020T(100〜200メッシュ)
多孔質ポリマーカラムクロマトグラフ用担体:日本練水社製、ダイアイオンHP−20
ナカライテスク社製、Cosmosil 5C18−MS−II、20mm(i.d.)×250mm
和光純薬工業社製、Wakopak Navi C30−5、20mm(i.d.)×250mm
ザクロの乾燥花部510gを粉砕し、これに約10倍量のメタノール(5L)を加え、加熱還流下3時間抽出した。抽出後、ひだ折り濾紙で濾過した後、抽出残渣に新たに約10倍量のメタノール(5L)を加え、同様の抽出操作を計3回実施した。抽出液をあわせ、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下、溶媒を留去したところ、ザクロ花部のメタノール抽出エキス305g(乾燥原料からの収率59.8%)を得た。
前記のメタノール抽出エキス(255g)に水(約2.5L)を加えて懸濁し、懸濁液に同容量の酢酸エチル(約2.5L)を加え、分液操作を実施し、酢酸エチル及び水移行部に分配した。得られた水移行部について、新たに同容量の酢酸エチルを加え、同様の分液操作を計3回実施した。各移行部をあわせ、酢酸エチル移行部について、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下に溶媒を留去して、ザクロ花部のメタノール抽出エキスの酢酸エチル移行部(42.0g)を得た。
前記水移行部を、多孔質ポリマーカラムカラムクロマトグラフィー(ダイアイオンHP−20:2.0kg,移動相:水→メタノール→アセトン)で順次溶出し、水溶出部(137.3g)、メタノール溶出部(58.4g)及びアセトン溶出部(6.3g)を得た。
前記酢酸エチル移行部(35.0g)を、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(2.0kg、移動相:n−ヘキサン/酢酸エチル(10/1→3/1→1/1)→酢酸エチル→メタノール)で順次溶出し、溶出画分1(1.59g)、2(0.65g)、3(0.10g)、4(=オレアノール酸(oleanolic acid、0.40g、0.11%))、5(2.38g)、6(=ウルソール酸(ursolic acid、0.30g、0.084%))、7(0.15g)、8(0.29g)、9(25.30g)および10(5.28g)を得た。
このうち、溶出画分2(0.65g)について、逆相ODSカラムクロマトグラフィー(30g,移動相:メタノール→アセトン)にて分離、精製し、β−シトステロール(β−sitosterol、268.3mg、0.076%)を得た。
溶出画分3(60.0mg)について、HPLC(カラム:Cosmosil 5C18−MS−II、移動相:アセトニトリル/1%酢酸(55/45))にて分離、精製し、アジアチコ酸(asiatic acid、4.0mg、0.0019%)を得た。
溶出画分5(500mg)について、HPLC(カラム:Wakopak Navi C30−5、移動相:アセトニトリル/水(95/5))にて分離、精製し、オレアノール酸(oleanolic acid,134.4mg,0.18%)およびウルソール酸(ursolic acid、200.3mg、0.27%)を得た。
溶出画分7(150mg)について、HPLC(カラム:Wakopak Navi C30−5、移動相:アセトニトリル/水(95/5))にて分離、精製し、溶出画分7−1(=プニカノール酸(Punicanolic acid(17.8mg、0.0071%))、7−2(14.7mg)、7−3(16.7mg)、7−4(6.5mg)、7−5(8.1mg)、7−6(5.6mg)、7−7(=オレアノール酸、9.7mg、0.0027%)、7−8(=ウルソール酸、25.4mg、0.0071%)を得た。溶出画分7−3(16.7mg)について、更にHPLC(カラム:Cosmosil 5C18−MS−II、移動相:アセトニトリル/1%酢酸(55/45))にて分離、精製し、マスリニン酸(maslinic acid、2.0mg、0.0006%)を得た。
溶出画分9(25.30g)について、逆相ODSカラムクロマトグラフィー(1.0kg、移動相:メタノール/水(20/80→40/60→60/40)→メタノール→アセトン)にて分離、精製し、溶出画分9−1(1158.1mg)、9−2(2726.3mg)、9−3(1666.7mg)、9−4(1153.1mg)、9−5(9364.2mg)、9−7(1063.5mg)、9−8(1285.6mg)、9−9(93.8mg)、9−10(117.8mg)、9−11(951.4mg)を得た。
融点: 280−281℃
・旋光度:[α]D 28: −7.4°(c=0.19,MeOH)
・高分解能質量分析(High−resolution EI−MS):
理論値 C30H50O4 (M+) : 474.3709
実測値 : 474.3712
・赤外吸収スペクトル(KBr,cm1): 3451,1719
・質量分析EI−MS: m/z 474 (M+,4),456(M+−H2O,19),395(100)
1H−NMR(600MHz,pyridine−d5)のδ:
0.81(dd,1.9,11.6),0.86(3H,s),0.98(m),1.01(3H,s),1.02(3H,s),1.09(3H,s),1.22(m),1.23(3H,s),1.27(m),1.28(m),1.30(m),1.37(m),1.40(2H,m),1.41(m),1.41(3H,d,6.2),1.43(3H,s),1.53(m),1.55(m),1.60(ddd,4.0,13.5,14.2),1.70(ddd,3.2,3.6,14.0),1.79(dd,10.4,10.5),1.86(m),1.86(2H,m),2.03(m),2.10(ddd,3.2,12.9,16.9),2.32(ddd,2.9,12.9,14.9),2.38(ddd,2.9,4.1,14.2),2.50(dq,10.5,6.2),2.77(ddd,4.0,10.4,14.0),3.46(dd,5.8,10.3),
13C−NMR(150MHz,pyridine−d5)のδC:
15.3,16.4,16.5,16.8,18.8,19.0,22.0,28.3,28.7,29.8,30.0,30.9,33.9,35.2,36.1,37.4,37.5,39.3,39.5,40.0,41.0,41.7,43.1,47.9,50.5,51.4,55.9,72.5,78.2,179.3
文献2) Alves J.S.,deCastro J.C.M.,Freire M.O.,da−Cunha E.V.L.,Barbosa−Filho J.M.,deSilva M.S.,Magn.Res.Chem.,38,201−206(2000)
文献3) Taniguchi S.,Imayoshi Y.,Kobayashi E.,Takamatsu Y.,Ito H.,Hatano T.,Sakagami H.,Tokuda H.,Nishino H.,Sugita D.,Shimura S.,Yoshida T.,Phytochemistry,59,315−323
文献4)Matsuda H.,Morikawa T.,Ueda H.,Yoshikawa M.,Heterocycles,55,1499−1504(2001)
文献5) Matsuda H.,Morikawa T.,Ueda H.,Yoshikawa M.,Chem.Pharm.Bull.,49,1368−1371(2001)
文献6) Haddock E.A.,Gupta R.K.,Al−Shafi S.M.K.,Haslam E.,Magnolato D.,J.Chem.Soc.Perkin Trans.I,2515−2524(1982)
文献7) Fukuda T.,Ito H.,Yoshida T.,Phytochemistry,63,795−801(2003)
文献8) Matsuda H.,Morikawa T.,Toguchida I.,Yoshikawa M.,Chem.Pharm.Bull.,50,788−795(2002)
文献9) Markham K.R.,Ternai B.,Stanley R.,Geiger H.,Mabry T.J.,Tetrahedron,34,1389−1397(1978)
文献10) Kongduang D.,Wungsintaweekul J.,De−Eknamkul W.,Tetrahedron Lett.,49,4067−4072(2008)
溶出画分3より得られた化合物は、下記構造式(5)で表されるアジアチコ酸、
溶出画分4より得られた化合物は、下記構造式(2)で表されるオレアノール酸、
溶出画分6より得られた化合物は、下記構造式(3)で表されるウルソール酸、
溶出画分5より得られた化合物は、オレアノール酸及びウルソール酸、
溶出画分7−3より得られた化合物は、下記構造式(4)で表されるマスリニン酸、
溶出画分7−7より得られた化合物は、オレアノール酸、
溶出画分7−8より得られた化合物は、ウルソール酸、
溶出画分9−3より得られた化合物は、下記構造式(7)で表される1,2−ジ−O−ガロイル−4,6−O−(S)−ヘキサヒドロキシジフェノイルβ−D−グルコピラノシド、
溶出画分9−4より得られた化合物は、下記構造式(6)で表される1,2,6−トリ−O−ガロイルβ−D−グルコピラノシド、
溶出画分9−8より得られた化合物は、下記構造式(8)で表されるルテオリン、
溶出画分9−10より得られた化合物は、下記構造式(9)で表されるトリセチンであることが判明した。
実施例1で得られたメタノール抽出エキス、実施例2で得られた酢酸エチル移行部、実施例3で得られたメタノール溶出部および水溶出部、実施例4〜9で得られたプニカノール酸(構造式(1)の化合物、表3中では、化合物(1)と表す。構造式(2)〜(9)の化合物についても同じである。)、オレアノール酸(構造式(2)の化合物)、ウルソール酸(構造式(3)の化合物)、マスリニン酸(構造式(4)の化合物)、アジアチコ酸(構造式(5)の化合物)、1,2,6−トリ−O−ガロイルβ−D−グルコピラノシド(構造式(6)の化合物)、1,2−O−ジガロイル−4,6−O−(S)−ヘキサヒドロキシジフェニルβ−D−グルコピラノシド(構造式(7)の化合物)、ルテオリン(構造式(8)の化合物)およびトリセチン(構造式(9)の化合物)について、脂肪蓄積抑制作用の指標として、HepG2細胞を用いた細胞内脂肪蓄積抑制作用試験を実施した。
大日本住友製薬社より購入したヒト肝がん由来HepG2細胞を用いた。培地はminimum essential medium Eagle(MEM,シグマ−アルドリッチ社製)に10%(v/v)fatal calf serum(FCS)及び100units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン及び0.1mM非必須アミノ酸(インビトロジェン社製)を添加して使用した。細胞の培養は、75cm2培養フラスコ(ファルコン社製)中で行い、5%CO2雰囲気下37℃にて行った。継代操作は、培養した細胞をダルベッコPBS(−)(日水製薬社製)で洗浄した後、0.02%(w/v)トリプシン(ディフコ社製)及び0.05%(w/v)EDTA−2Na(同人化学社製)を含むPBS(−)により剥離して、定法に従い行った。尚、被験サンプルは0.5%(v/v)DMSO溶液として培地に添加した。
前記の実施例11と同様のサンプルについて、脂肪代謝改善作用の指標として、HepG2細胞を用いた細胞内脂肪代謝促進作用試験を実施した。試験方法を以下に示す。
前記の実施例11及び実施例12と同様のサンプルについて、in vitro試験における抗TNF−α作用の指標として、L929細胞を用いたTNF−α誘発細胞障害に対する保護作用試験を実施した。試験方法を以下に示す。
Claims (7)
- ザクロの花部、ザクロの花部を水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により抽出して得られる抽出液、又は前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキスを有効成分として含むことを特徴とする脂肪蓄積・代謝改善剤。
- ザクロの花部、ザクロの花部を水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により抽出して得られる抽出液、又は前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキスを有効成分として含むことを特徴とする抗TNF−α作用剤。
- 請求項3に記載のトリテルペン化合物を有効成分として含むことを特徴とする脂肪蓄積・代謝改善剤。
- 請求項3に記載のトリテルペン化合物を有効成分として含むことを特徴とする抗TNF−α作用剤。
- ザクロの花部、ザクロの花部を水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、又は請求項3に記載のトリテルペン化合物を有効成分として含むことを特徴とするヒト又は動物用の医薬。
- ザクロの花部、ザクロの花部を水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、又は請求項3に記載のトリテルペン化合物を有効成分として含むことを特徴とする食品。
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