JP2013177355A - メタボリックシンドロームを予防及び治療するための有機体由来の天然成分及び抽出物 - Google Patents

Abstract

【課題】白桃花に着目して、メタボリックシンドロームを予防及び治療するための有機体由来の生薬成分及び抽出物を提供する。
【解決手段】
本発明の生薬成分は、白桃花由来の酢酸メチル画分の抽出物に含まれる天然成分のアロマデンドリンであることを特徴とする。また、本発明の抽出物は酢酸メチル画分または水画分の抽出物である。本発明の生薬成分及び抽出物は前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を促進してメタボリックシンドロームを予防及び治療できる。本発明の生薬成分及び抽出物は任意の医薬品、医薬部外品、化粧品又は健康補助食品などの飲食品の有効成分にできる。
【選択図】図２

Description

本発明は、メタボリックシンドロームを予防及び治療するための有機体由来の天然成分及び抽出物、ならびにその天然成分及び抽出物を用いた医薬品、健康補助食品などの飲食品、化粧品、及び医薬部外品に関する。

メタボリックシンドローム（代謝症候群）は、糖尿病、高脂血症、及び高血圧等のうちの２以上を合併した病態をいい、心筋梗塞や脳梗塞等の心血管病の危険因子の１つとして近年注目されている。メタボリックシンドロームは、肥満によるメタボリックシンドロームと脂肪萎縮によるメタボリックシンドロームとの２種類に大別される（図１）。

肥満によるメタボリックシンドロームは、健常状態の小型脂肪細胞の肥大化による、内臓脂肪の蓄積によって生じる。小型脂肪細胞の肥大化は、高脂肪食の摂取や運動不足といった生活習慣によって惹起される。肥大化した脂肪細胞では、炎症性アディポサイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン６（ＩＬ−６））の分泌が増加するとともに、抗炎症性アディポサイトカイン（例えば、インスリン感受性サイトカインであるアディポネクチン）の産生が減少し、インスリン抵抗性が惹起される。

従って、肥満によるメタボリックシンドロームを抑制する１つの方法は、小型脂肪細胞から肥大脂肪細胞への分化を抑制し、炎症性アディポサイトカインの分泌を減少させることである。特許文献１又は２には、前駆脂肪細胞から小型脂肪細胞への分化を抑制するための有機体由来の天然成分及び抽出物が開示されている。

一方、肥満によるメタボリックシンドロームにおいて、前駆脂肪細胞から小型脂肪細胞への分化を促進することによって、血中アディポネクチンレベルを上昇させ、ひいてはインスリン抵抗性を改善できることが知られている（非特許文献１）。

また、脂肪萎縮によるメタボリックシンドロームでは、前駆脂肪細胞の分化が障害されることによって、血中アディポネクチンレベルが低下し、ひいてはインスリン抵抗性が惹起されている。従って、脂肪萎縮によるメタボリックシンドロームを抑制するには、前駆脂肪細胞から小型脂肪細胞への分化を促進する必要がある。

更に、アディポネクチンの分泌量の低下は、肥大化した脂肪細胞で活性化したマクロファージから分泌されるＴＮＦ−α、及び脂肪細胞から分泌される遊離脂肪酸が互いに脂肪細胞とマクロファージの炎症性変化を促進することにより生じることが知られている。

以上のことから、メタボリックシンドロームを予防及び改善するために、前駆脂肪細胞から小型脂肪細胞への分化を促進できる天然成分、あるいはマクロファージの活性化を抑制できる天然成分を同定することは当該技術分野で重要な課題となっている。

特開２０１０−２０２５５８号公報 特開２０１０−２０２６０２号公報 特開２０１０−０８３８３８号公報 特開２０１０−２０２５３６号公報 特開２０１１−１５３０９３号公報

Ｙａｍａｕｃｈｉ Ｔら：Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２００１；７：９４１． Ｊｅｏｎ，Ｓ．Ｈ．；Ｃｈｕｎ，Ｗ．；Ｃｈｏｉ，．Ｙ．Ｊ．；Ｋｗｏｎ，Ｙ．Ｓ．Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｂａｒｋ ｏｆ Ｓａｌｉｘ ｈｕｌｔｅｎｉ．Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，３２（８），９７８−９８２（２００８） Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．；Ｌｉ，Ｓ．；Ｈａｒｉｇａｙａ，Ｙ．；Ｏｎｄａ，Ｍ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ．ＸＸＩＩ．Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ（＋）−Ａｒｏｍａｄｅｎｄｒｉｎ Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ Ｅｔｈｅｒ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ，ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３６（５），１８７７−１８８１（１９８８） Ｋｗａｋ，Ｊ．Ｈ．；Ｋａｎｇ，Ｍ．Ｗ．；Ｒｏｈ，Ｊ．Ｈ．；Ｃｈｏｉ，Ｓ．Ｕ．；Ｚｅｅ，Ｏ．Ｐ．Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｈｅｎｏｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｏｎａｎｔｈｕｓ ｒｅｔｕｓｕｓ．Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，３２（１２），１６８１−１６８７（２００９） Ｚｈａｎｇ，Ｙ．；Ｑｕｅ，Ｓ．；Ｙａｎｇ，Ｘ．；Ｗａｎｇ，Ｂ．；Ｑｉａｏ，Ｌ．；Ｚｈａｏ，Ｙ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｈｙｄｒｏｍｙｒｉｃｅｔｉｎ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｃｈｅｍ．，４５，９０９−９１６（２００７） Ｌｉ Ｙ．Ｌ．；Ｌｉ Ｊ．；Ｗａｎｇ Ｎ．Ｌ．；Ｙａｏ Ｘ．Ｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１３，１９３１−１９４１（２００８） Ｇａｏ，Ｄ．Ｆ．；Ｘｕ，Ｍ．；Ｙａｎｇ，Ｃ．Ｒ．；Ｘｕ，Ｍ．；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｐｈｅｎｏｌｉｃ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｃａｍｅｌｌｉａ ｐａｃｈｙａｎｄｒａ Ｈｕ．Ｊ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，５８，８８２０−８８２４（２０１０） Ｊｅｏｎ，Ｓ．Ｈ．；Ｃｈｕｎ，Ｗ．；Ｃｈｏｉ，Ｙ．Ｊ．；Ｋｗｏｎ，Ｙ．Ｓ．Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｂａｒｋ ｏｆ Ｓａｌｉｘ ｈｕｌｔｅｎｉ．Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，３１（８），９７８−９８２（２００８） Ｎｅｓｓａ，Ｆ．；Ｉｓｍａｉｌ，Ｚ．；Ｍｏｈａｍｅｄ，Ｎ．；Ｈａｒｉｓ，Ｍ．Ｒ．Ｈ．Ｋ．Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ−ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｓ ａｎｄ ｏｆ ｐｕｒｅ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｆ Ｂｌｕｍｅａ ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ ＤＣ ｌｅａｖｅｓ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，８８，２４３−２５２（２００４） Ｒｅｙ，Ｐ．；Ｒｏｓｓｉ，Ｊ．Ｃ．；Ｔａｉｌｌａｄｅｓ，Ｊ．；Ｇｒｏｓ，Ｇ．；Ｎｏｒｅ，Ｏ．Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎｉｔｒｉｌｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａｎ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｎｉｔｒｉｌａｓｅ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｍｅｔｈｉｎｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｘｙ Ａｎａｌｏｇｕｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，５２，８１５５−８１６２（２００４） Ｋａｒｌ Ｃ．；Ｍｕｌｌｅｒ Ｇ．；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ Ｐ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５，１０８４−１０８５（１９７６）

前駆脂肪細胞の分化は、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）やペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ（Ｃ／ＥＢＰ）ファミリー等の転写因子によって制御される。糖尿病治療薬であるピオグリタゾンはＰＰＡＲγのリガンドであり、ＰＰＡＲの活性化を通して小型脂肪細胞を増加し、ひいては血中アディポネクチンレベルを上昇することによってインスリン抵抗性を改善する。

また、特許文献３ないし５には前駆脂肪細胞から小型脂肪細胞への分化を促進できる有機体由来の天然成分及び抽出物が開示されており、ピオグリタゾンと同様の効能があることが知られている。その他、多数の有機体由来の天然成分及び抽出物（例えば、バニリン、サクラネリン、ノビレチン）においても、同様の効能があることが知られている。

有機体由来の天然成分及び抽出物（すなわち、天然成分の生薬）は安全性の面で非天然成分由来の医薬品より優れているため、メタボリックシンドロームの予防及び改善のために有機体由来の天然成分及び抽出物を用いることは当該技術分野において特に求められている。

本発明は、白桃花に着目して、メタボリックシンドロームを予防及び治療するための新規の有機体由来の生薬成分を提供することを目的とするものである。

本発明の一態様においては、本発明の生薬成分は前駆脂肪細胞の分化を促進するための有機体由来の抽出物であって、アロマデンドリンを含む有機体由来の抽出物である。

本発明の一実施形態においては、前記有機体は白桃花である。

本発明の別の実施形態においては、本発明の有機体由来の抽出物は、酢酸エチル画分の抽出物である。

本発明の別の態様においては、本発明の生薬成分は前駆脂肪細胞の分化を促進するための白桃花由来の抽出物である。

本発明の一実施形態においては、本発明の白桃花由来の抽出物は、酢酸エチル画分の抽出物又は水画分の抽出物である。

本発明の代替的な実施形態においては、本発明における白桃花等の有機体由来の抽出物は任意の医薬品、健康補助食品などの飲食品、化粧品又は医薬部外品に含まれてもよい。

本発明の別の態様は、アロマデンドリンを有効成分とする、前駆脂肪細胞の分化を促進するための医薬品、健康補助食品などの飲食品、化粧品又は医薬部外品である。

有機体由来のアロマデンドリンに、前駆脂肪細胞分化促進効果、及び脂肪細胞におけるアディポネクチン分泌促進効果が見られるため、メタボリックシンドロームの予防及び改善効果が達成される。

有機体由来のケンフェロールに、マクロファージ活性化の抑制効果が見られるため、メタボリックシンドロームの予防及び改善効果が達成される。

白桃花由来の酢酸エチル画分又は水画分の抽出物に、前駆脂肪細胞分化促進効果、脂肪細胞におけるアディポネクチン分泌促進効果、及びマクロファージ活性化の抑制効果が見られるため、メタボリックシンドロームの予防及び改善効果が達成される。

上述の有機体由来の天然成分、及び抽出物は安全性の面で非天然成分由来の医薬品よりも優れているため、医薬品、健康補助食品などの飲食品、化粧品又は医薬部外品としての広範な使用に好適である。

図１は、メタボリックシンドロームの発症における脂肪細胞の役割を示す概略図である。 図２は前駆脂肪細胞分化促進の指標として、本発明のサンプルにおける、コントロール（１００％）に対するグリセロール３リン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）活性の増加率を示すグラフである。 図３は、本発明のサンプルにおける、コントロール（１００％）に対する脂肪細胞のトリグリセリド（ＴＧ）蓄積量の増加率を示すグラフである。 図４は、上段が８０％のエタノールの抽出物における、小型脂肪細胞のＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色の結果であり、下段がコントロール（１００％）に対するＴＧ蓄積量の増加率を示すグラフである。 図５は、本発明のサンプルにおける、コントロール（１００％）に対するアディポネクチン分泌量の増加率を示すグラフである。 図６はマクロファージ活性化の抑制の指標として、本発明のサンプルにおける、コントロール（１００％）に対する一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制率を示すグラフである。

以下、実施例を挙げて、更に本発明を詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

本発明では、有機体としてバラ科モモ（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）の白桃花に着目して、白桃花の天然成分の分離、精製を行って成分分析を行った。更に、白桃花由来の抽出物及び成分分析した天然成分における、メタボリックシンドロームの治療及び予防の効果について考察を行った。

［材料］

本発明では有機体材料としてバラ科モモの白桃花を用いた。

モモはバラ科の落葉高木であり、中国北西部の黄河上流地帯を原産とする。モモは成長すると高さが５メートル以上に達する。モモの葉は互生し皮針形で有毛であり、初春に開花するモモの花は白色から桃紅色の五弁花である。「桃仁」とは、乾燥させたモモの種子の生薬名である。「白桃花」とは、乾燥させた開花期の花及び蕾の生薬名である。

白桃花は利尿、緩下、血行改善作用があることが知られており、民間では水腫の治療、便秘の改善に用いられている。最近の研究で、血行改善効果はプラスミノーゲン活性化因子阻害物質１（ＰＡＩ−１）の産生抑制作用によるものであることと、プルナシン酸、ネオプルナシン酸が有効成分の１つであることとが明らかになっている。

更に、ケンフェロール、ナリンゲニン等のフラボノイド、トリホリン等のフラボノイド配糖体、クマリン等のクマリン類などが白桃花の天然成分として明らかになっている。

［成分分離機器及び成分分析機器］

《成分分離機器》
本発明の実施例においては、カラムクロマトグラフィ用充填材として：
Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０Ｎ（関東化学）；
ＹＭＣ−ＧＥＬ ＯＤＳ−Ａ Ｓ−１５０（ＹＭＣ）；
Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＬＨ−２０（ＧＥヘルスケア・ジャパン）；
Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｈａｒｃｏａｌ（和光純薬工業）；あるいは、
ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＨＰ２０Ｐ（三菱化学）；
を用いた。

本発明の実施例においては、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）において：
Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ_２５４（ＭＥＲＣＫ）；あるいは
ＲＰ−１８Ｆ_２５４（ＭＥＲＣＫ）；
を用いた。

《成分分析機器》
高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）においては、検出器として：
ＪＡＳＣＯ ＵＶ−２０７５ Ｐｌｕｓ；
ＪＡＳＣＯ ＵＶ−１５７５；あるいは、
ＳＳＣ−５４１０；
を用い、ポンプとして：
ＪＡＳＣＯ ＰＵ−２０８９ Ｐｌｕｓ；
ＪＡＳＣＯ ＰＵ−１５８０；あるいは、
ＪＡＳＣＯ ＰＵ−９８６；
を用い、カラムとして：
ＣＯＳＭＯＳＩＬ πＮＡＰ（Φ１０×２５０ｍｍ）；
ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ_１８−ＭＳ−ＩＩ（Φ１０×２５０ｍｍ）；あるいは、
Ｓｈｏｄｅｘ ＧＦ３１０ ＨＱ（Φ４．６×２５０ｍｍ）；
を用いた。

核磁気共鳴（ＮＭＲ）装置は：ＪＥＯＬ Ｄｅｌｔａ ６００；あるいはＪＥＯＬ Ｄｅｌｔａ ５００；を用いた。

質量分析（ＭＳ）装置は、ＪＥＯＬ ＧＣｍａｔｅを用いた。

旋光計は、ＪＡＳＣＯ Ｐ−１０２０ Ｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒを用いた。

［白桃花の天然成分の分離及び精製］

市販品の白桃花１．５ｋｇを１５Ｌの８０％エタノールで抽出し、抽出物を濃縮、乾固して３００ｇのエタノール抽出物を得た。その後、エタノール抽出物を２Ｌの水に溶解し、等容量のｎ−ヘキサン、酢酸エチル、及びｎ−ブタノールを用いて順次段階的に抽出した。ｎ−ヘキサン抽出物の画分の重量は３５．０ｇ、酢酸エチル抽出物の画分の重量は５４．４ｇ、ｎ−ブタノール抽出物の画分の重量は６４．１ｇであった。

これらの抽出物の画分のうち、酢酸エチル抽出物の画分において、強い前駆脂肪細胞の分化促進作用が見られた（実施例１）ため、酢酸エチル抽出物の画分（５４．４ｇ）を順相のシリカゲルカラムクロマトグラフィ（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０Ｎ）に付し、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル系でｎ−ヘキサン：酢酸エチルの比率を、１００：０から０：１００まで変化させて溶出し、次いで１００％のアセトン、１００％のメタノールで溶出して、７の画分（ＰｒＰＥ−ＡないしＰｒＰＥ−Ｇ）に分画した。

白桃花の天然成分を得るために、７の画分のうち、３の画分（ＰｒＰＥ−Ｃ（６．９４ｇ）、ＰｒＰＥ−Ｄ（７．２８ｇ）、及びＰｒＰＥ−Ｆ（２１．３ｇ））の更なる精製を行った。

《画分ＰｒＰＥ−Ｃの分離》
画分ＰｒＰＥ−Ｃ（６．９４ｇ）を順相のシリカゲルカラムクロマトグラフィ（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０Ｎ）に付し、クロロホルム−メタノール系で、クロロホルム：メタノールの比率を、１００：０から０：１００まで変化させて溶出して、１０の画分（ＰｒＰＥ−Ｃ−ＡないしＰｒＰＥ−Ｃ−Ｊ）に分画した。

これらの１０の画分のうち、４の画分（ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｄ（２．０２ｇ）、ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｅ（１２１ｍｇ）、ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｆ（１５３ｍｇ）、及びＰｒＰＥ−Ｃ−Ｈ（５０ｍｇ））の更なる分離及び精製を行った。

〈画分ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｄの分離及び化合物の精製〉
画分ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｄ（２．０２ｇ）を逆相のカラムクロマトグラフィ（ＹＭＣ−ＧＥＬ ＯＤＳ−Ａ Ｓ−１５０）に付し、水−メタノール系で、水：メタノールの比率を、１００：０から０：１００まで変化させて溶出し、１０の画分（ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｄ−１ないしＰｒＰＥ−Ｃ−Ｄ−１０）に分画した。

これらの１０の画分のうち、画分ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｄ−４（４７７ｍｇ）から化合物（４７７ｍｇ）を精製した（本明細書における「化合物７」）。

〈画分ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｅの分離及び化合物の精製〉
画分ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｅ（１２１ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィ（ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒ Φ１０×２５０ｍｍ、０．１％のトリフルオロ酢酸：アセトニトリル（６０：４０）、流量４．０ｍＬ／分、波長２１０ｎｍ）に付して、４の画分（ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｅ−１ないしＰｒＰＥ−Ｃ−Ｅ−４）に分画した。

これらの４の画分のうち、画分ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｅ−２（２０．２ｍｇ）から化合物（２０．２ｍｇ）を精製した（本明細書における「化合物１」）。

更に、画分ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｅ−４（３１．６ｍｇ）から化合物（３１．６ｍｇ）を精製した（本明細書における「化合物４」）。

〈画分ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｆの分離及び化合物の精製〉
画分ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｆ（１５３ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィ（ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒ Φ１０×２５０ｍｍ、０．１％のトリフルオロ酢酸：アセトニトリル（６０：４０）、流量４．０ｍＬ／分、波長２１０ｎｍ）に付して、３の画分（ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｆ−１ないしＰｒＰＥ−Ｃ−Ｆ−３）に分画した。

これらの３の画分のうち、画分ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｆ−２（１８．２ｍｇ）から化合物（１８．２ｍｇ）を精製した（本明細書における「化合物３」）。

〈画分ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｈの分離及び化合物の精製〉
画分ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｈ（５０ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィ（ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒ Φ１０×２５０ｍｍ、０．１％のトリフルオロ酢酸：アセトニトリル（６０：４０）、流量４．０ｍＬ／分、波長２１０ｎｍ）に付して、３の画分（ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｈ−１ないしＰｒＰＥ−Ｃ−Ｈ−３）に分画した。

これらの３の画分のうち、画分ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｈ−２（１８ｍｇ）を更に高速液体クロマトグラフィ（ＣＯＳＭＯＳＩＬ πＮＡＰ Φ１０×２５０ｍｍ、０．１％のトリフルオロ酢酸：アセトニトリル（６０：４０）、流量４．０ｍＬ／分、波長２１０ｎｍ）に付して、３の画分（ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｈ−２−１ないしＰｒＰＥ−Ｃ−Ｈ−２−３）に分画した。

これらの３の画分のうち、画分ＰｒＰＥ−Ｃ−Ｈ−２−１（７ｍｇ）から化合物（７ｍｇ）を精製した（本明細書における「化合物９」）。

《画分ＰｒＰＥ−Ｄの分離》
画分ＰｒＰＥ−Ｄ（７．２８ｇ）を活性炭カラムクロマトグラフィ（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｈａｒｃｏａｌ）に付し、次いで１００％のメタノール、１：１の比率のクロロホルム：メタノール（クロロホルム−メタノール系）で溶出した。

溶出した画分ＰｒＰＥ−Ｄ（３．６１ｇ）を順相のシリカゲルカラムクロマトグラフィ（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０Ｎ）に付し、クロロホルム−メタノール系で、クロロホルム：メタノールの比率を１００：０から０：１００まで変化させて溶出し、７の画分（ＰｒＰＥ−Ｄ−１ないしＰｒＰＥ−Ｄ−７）に分画した。これらの７の画分のうち、画分ＰｒＰＥ−Ｄ−４（１．２５ｇ）の更なる分離を行った。

画分ＰｒＰＥ−Ｄ−４（１．２５ｇ）を逆相のカラムクロマトグラフィ（ＹＭＣ−ＧＥＬ ＯＤＳ−Ａ Ｓ−１５０）に付し、水−メタノール系で、水：メタノールの比率を、１００：０から０：１００まで変化させて溶出し、１４の画分（ＰｒＰＥ−Ｄ−４−１ないしＰｒＰＥ−Ｄ−４−１４）に分画した。

これらの１４の画分のうち、２の画分（ＰｒＰＥ−Ｄ−４−５（６８．９ｍｇ）、ＰｒＰＥ−Ｄ−４−７（８９．９ｍｇ））の更なる分離及び精製を行った。

〈画分ＰｒＰＥ−Ｄ−４−５の分離及び化合物の精製〉
画分ＰｒＰＥ−Ｄ−４−５（６８．９ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィ（ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒ Φ１０×２５０ｍｍ、０．１％のトリフルオロ酢酸：メタノール（６０：４０）、流量４．０ｍＬ／分、波長２５４ｎｍ）に付して、５の画分（ＰｒＰＥ−Ｄ−４−５−１ないしＰｒＰＥ−Ｄ−４−５−５）に分画した。

これらの５の画分のうち、ＰｒＰＥ−Ｄ−４−５−４（２３．５ｍｇ）を更に高速液体クロマトグラフィ（ＣＯＳＭＯＳＩＬ πＮＡＰ Φ１０×２５０ｍｍ、０．１％のトリフルオロ酢酸：メタノール（５５：４５）、流量４．０ｍＬ／分、波長２１０ｎｍ）に付して、化合物（１４．５ｍｇ）を生成した（本明細書における「化合物１０」）。

更に、これらの５の画分のうち、ＰｒＰＥ−Ｄ−４−５−５（２０．６ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィ（ＣＯＳＭＯＳＩＬ πＮＡＰ Φ１０×２５０ｍｍ、０．１％のトリフルオロ酢酸：メタノール（５５：４５）、流量４．０ｍＬ／分、波長２５４ｎｍ）に付して、２の画分（ＰｒＰＥ−Ｄ−４−５−５−１、ＰｒＰＥ−Ｄ−４−５−５−２）に分画した。

これらの２の画分のうち、画分ＰｒＰＥ−Ｄ−４−５−５−２（１４．２ｍｇ）から化合物（１４．２ｍｇ）を精製した（本明細書における「化合物２」）。

〈画分ＰｒＰＥ−Ｄ−４−７の分離及び化合物の精製〉
画分ＰｒＰＥ−Ｄ−４−７（８９．９ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィ（ＣＯＳＭＯＳＩＬ πＮＡＰ Φ１０×２５０ｍｍ、０．１％のトリフルオロ酢酸：メタノール（７０：３０）、流量４．０ｍＬ／分、波長２１０ｎｍ）に付して、３の画分（ＰｒＰＥ−Ｄ−４−７−１ないしＰｒＰＥ−Ｄ−４−７−３）に分画した。

これらの３の画分のうち、画分ＰｒＰＥ−Ｄ−４−７−２（６２．０ｍｇ）から化合物（６２．０ｍｇ）を精製した（本明細書における「化合物８」）。

《画分ＰｒＰＥ−Ｆの分離》
画分ＰｒＰＥ−Ｆ（２１．３ｇ）を順相のシリカゲルカラムクロマトグラフィ（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０Ｎ）に付し、クロロホルム−メタノール系で、クロロホルム：メタノールの比率を、１００：０から０：１００まで変化させて溶出して、７の画分（ＰｒＰＥ−Ｆ−１ないしＰｒＰＥ−Ｆ−７）に分画した。これらの７の画分のうち、画分ＰｒＰＥ−Ｆ−６（８．７０ｇ）の更なる分離を行った。

画分ＰｒＰＥ−Ｆ−６（８．７０ｇ）を逆相のカラムクロマトグラフィ（ＹＭＣ−ＧＥＬ ＯＤＳ−Ａ Ｓ−１５０）に付し、水−メタノール系で、水：メタノールの比率を、９０：１０から０：１００まで変化させて溶出し、１０の画分（ＰｒＰＥ−Ｆ−６−１ないしＰｒＰＥ−Ｆ−６−１０）に分画した。これらの１０の画分のうち、画分ＰｒＰＥ−Ｆ−６−４（１．１４ｇ）の更なる分離を行った。

画分ＰｒＰＥ−Ｆ−６−４（１．１４ｇ）を順相のカラムクロマトグラフィ（ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＨＰ２０Ｐ）に付し、水−メタノール系で、水：メタノールの比率を、９０：１０から０：１００まで変化させて溶出し、６の画分（ＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−１ないしＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−６）に分画した。これらの６の画分のうち、画分ＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−２（７４７ｍｇ）の更なる分離を行った。

画分ＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−２（７４７ｍｇ）を順相のカラムクロマトグラフィ（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＬＨ−２０）に付し、７０％のメタノール、１００％のメタノールで溶出して、１２の画分（ＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−２−１ないしＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−２−１２）に分画した。

これらの１２の画分のうち、２の画分（ＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−２−５（１９１ｍｇ）、ＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−２−７（１６８ｍｇ））の更なる分離及び精製を行った。

〈ＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−２−５の分離及び化合物の精製〉
画分ＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−２−５（１９１ｍｇ）を順相のカラムクロマトグラフィ（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＬＨ−２０）に付し、次いで１：１の比率のクロロホルム：メタノール（クロロホルム−メタノール系）、１００％のメタノールで溶出し、９の画分（ＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−２−５−１ないしＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−２−５−９）に分画した。

これらの９の画分のうち、画分ＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−２−５−４（９６．４ｍｇ）から化合物（９６．４ｍｇ）を精製した（本明細書における「化合物５」）。

〈ＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−２−７の分離及び化合物の精製〉
画分ＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−２−７（１６８ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィ（ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒ Φ１０×２５０ｍｍ、０．１％のトリフルオロ酢酸：メタノール（５５：４５）、流量４．０ｍＬ／分、波長２１０ｎｍ）に付して、５の画分（ＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−２−７−１ないしＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−２−７−５）に分画した。これらの５の画分のうち、画分ＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−２−７−４（８７．４ｍｇ）の更なる分離を行った。

画分ＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−２−７−４（８７．４ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィ（Ｓｈｏｄｅｘ ＧＦ−３１０ＨＱ Φ４．６×２５０ｍｍ、０．１％のトリフルオロ酢酸：メタノール（１０：９０）、流量４．０ｍＬ／分、波長２１０ｎｍ）に付して、５の画分（ＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−２−７−４−１ないしＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−２−７−４−５）に分画した。

これらの５の画分のうち、画分ＰｒＰＥ−Ｆ−６−４−２−７−４−２（３８．５ｍｇ）から化合物（３８．５ｍｇ）を精製した（本明細書における「化合物６」）。

［白桃花から精製した化合物の成分同定］

《化合物１の同定》
化合物１は白色粉末であり、［α］^２５ _Ｄ−４７．８°（ｃ＝０．１、メタノール）を示し、ＥＩ−ＭＳでｍ／ｚ＝２８８［Ｍ］^＋となった。

^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは：
メタカップリングするプロトンシグナル（δ_Ｈ５．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ）、５．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ））と；
Ａ_２Ｂ_２タイプのプロトンシグナル（δ_Ｈ６．７８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．３０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ））と；
１，２−ジアキシャルプロトンによるシグナル（δ_Ｈ４．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．３，５．９Ｈｚ）、５．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ））と；
キレート水酸基によるシグナル（δ_Ｈ１１．８７（１Ｈ，ｓ））と；
を検出した。

^１３Ｃ−ＮＭＲ及びＤＥＰＴスペクトルでは：
１５個のｓｐ^２炭素によるシグナル（δ_Ｃ９４．９，９６．０，１００．４，１１４．８×２，１２７．５，１２９．３×２，１５７．７，１６２．５，１，１６３．２，１６６．７，１９７．７）と；
２個のｓｐ^３炭素（δ_Ｃ７１．４，８２．８）によるシグナルと；
を検出した。

上述の旋光度及びｍ／ｚ値から分子構造を推定し、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルデータを非特許文献２、３に記載のデータと比較することによって、化合物１を（−）−アロマデンドリンと同定した。

（−）−アロマデンドリンは、その鏡像異性体である（＋）−アロマデンドリンと比較して、有機体からの発見例が極めて希少な化合物である。更に、（−）−アロマデンドリンが白桃花から単離精製、同定されたのは初めてである。

《化合物２の同定》
化合物２は黄色粉末であり、ＥＩ−ＭＳでｍ／ｚ＝３０４［Ｍ］^＋となった。

^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは：
メタカップリングするプロトンシグナル（δ_Ｈ５．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ）、５．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ））と；
１，２−ジアキシャルプロトンによるシグナル（δ_Ｈ４．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．３，６．０Ｈｚ）、４．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ））と；
キレート水酸基によるシグナル（δ_Ｈ１１．８８（１Ｈ，ｓ））と；
を検出した。

また、プロトンシグナル（δ_Ｈ６．７２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ）、６．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ））を検出したことから、１，３，５−三置換ベンゼンの存在が推定された。

^１３Ｃ−ＮＭＲ及びＤＥＰＴスペクトルでは：
１５個のｓｐ^２炭素によるシグナル（δ_Ｃ９５．４，９６．４，１００．９，１１５．５，１１５．７，１１９．８，１２８．４，１４５．３，１４６．２，１６３．０，１６３．７，１６７．２，１９８．２）と；
２個のｓｐ^３炭素によるシグナル（δ_Ｃ７２．０，８３．５）と；
を検出した。

上述のｍ／ｚ値から分子量を推定し、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルデータを非特許文献４、５に記載のデータと比較することによって、化合物２を５，７，３’，５’−テトラヒドロキシフラバノノールと同定した。

５，７，３’，５’−テトラヒドロキシフラバノノールが白桃花から単離精製、同定されたのは初めてである。

《化合物３の同定》
化合物３は黄色粉末であり、ＥＩ−ＭＳでｍ／ｚ＝３０２［Ｍ］^＋となった。

^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは：
メタカップリングするプロトンシグナル（δ_Ｈ６．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ）、６．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ））と；
ＡＢＸタイプのプロトンシグナル（δ_Ｈ６．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）、７．５３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．３Ｈｚ）、７．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ））と；
キレート水酸基によるシグナル（δ_Ｈ１２．４９（１Ｈ，ｓ））と；
を検出した。

^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルでは：
１５個のｓｐ^２炭素によるシグナル（δ_Ｃ９４．１，９８．９，１０３．７，１１５．７，１１６．２，１２０．６，１２２．６，１３６．３，１４５．６，１４７．３，１４８．２，１５６．６，１６１．２，１６４．５，１７６．２）；
を検出した。

上述のｍ／ｚ値から分子量を推定し、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルデータを非特許文献６に記載のデータと比較することにより、化合物３をクエルセチンと同定した。

《化合物４の同定》
化合物４は黄色粉末であり、ＥＩ−ＭＳでｍ／ｚ＝２８６［Ｍ］^＋となった。

^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは：
メタカップリングするプロトンシグナル（δ_Ｈ６．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ）、６．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ））と；
Ａ_２Ｂ_２タイプのプロトンシグナル（δ_Ｈ６．９２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、８．０３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ））と；
キレート水酸基によるシグナル（δ_Ｈ１２．４５（１Ｈ，ｓ））と；
を検出した。

^１３Ｃ−ＮＭＲ及びＤＥＰＴスペクトルでは：
１５個のｓｐ^２炭素によるシグナル（δ_Ｃ９３．４，９８．１，１０２．９，１１５．３×２，１２１．６，１２９．４×２，１３５．５，１４６．８，１５６．１，１５９．１，１６０．６，１６３．８，１７５．８）；
を検出した。

上述のｍ／ｚ値から分子量を推定し、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルデータを非特許文献６に記載のデータと比較することにより、化合物４をケンフェロールと同定した。

《化合物５の同定》
化合物５は黄色粉末であり、ＦＡＢ−ＭＳではｍ／ｚ＝４４９［Ｍ＋Ｈ］^＋で疑似イオンピークを検出した。

^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは：
メタカップリングするプロトンシグナル（δ_Ｈ６．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ）、６．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ））と；
ＡＢＸタイプのプロトンシグナル（δ_Ｈ６．８５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４）、７．２３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４，２．３Ｈｚ）及び７．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ））と；
キレート水酸基によるシグナル（δ_Ｈ１２．６４（１Ｈ，ｓ））と；
を検出し、更に：
糖のアノメリックプロトンと推測されるシグナル（δ_Ｈ５．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ））と；
メチル基のプロトンシグナル（δ_Ｈ０．８０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ））と；
を検出した。

^１３Ｃ−ＮＭＲ及びＤＥＰＴスペクトルでは：
１５個のｓｐ^２炭素によるシグナル（δ_Ｃ９３．７，９８．７，１０４．１，１１５．５，１１５．７，１２０．８，１２１．１，１３４．２，１４５．２，１４８．５，１５６．５，１５７．３，１６１．３，１６４．２，１７７．８）；
を検出した。

また、脂肪族領域に６つの炭素シグナル（δ_Ｃ１７．５，７０．１，７０．４，７０．６，７１．２，１０１．８）を検出したことから、ラムノースのようなデオキシ糖の存在を推定した。

ＨＭＢＣスペクトルにおいて、δ_Ｈ５．２４（Ｒｈａ−１）からδ_Ｃ１３５．５（Ｃ−３）にクロスピークを検出した。

上述のｍ／ｚ値から分子量を推定し、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルデータを非特許文献６に記載のデータと比較することにより、化合物５をクエルシトリンと同定した。

《化合物６の同定》
化合物６は黄色粉末であり、ＦＡＢ−ＭＳではｍ／ｚ＝４６５［Ｍ＋Ｈ］^＋で疑似イオンピークを検出した。

^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは：
メタカップリングするプロトンシグナル（δ_Ｈ６．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ）、６．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ））と；
ＡＢＸタイプのプロトンシグナル（δ_Ｈ６．８５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ）、７．２３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．４，１０．０Ｈｚ）、７．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ））と；
キレート水酸基によるシグナル（δ_Ｈ１２．６０（１Ｈ，ｓ））と；
を検出し、更に：
糖のアノメリックプロトンと推測されるシグナル（δ_Ｈ５．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ））；
を検出した。

^１３Ｃ−ＮＭＲ及びＤＥＰＴスペクトルでは：
１５個のｓｐ^２炭素によるシグナル（δ_Ｃ９４．８，９９．９，１０５．６，１１６．０，１１７．６，１２３．０，１２３．２，１３５．６，１４５．８，１４９．８，１５８．４，１５９．０，１６２．９，１６６．１，１７９．４）；
を検出した。

また、脂肪族領域に６つの炭素シグナル（δ_Ｃ６２．５，７１．２，７５．７，７８．１，７８．３，１０４．４）を検出したことから、糖の存在を推定した。

ＨＭＢＣスペクトルにおいて、δ_Ｈ５．２３（Ｇｌｃ−１）からδ_Ｃ１３５．６（Ｃ−３）にクロスピークを検出した。

上述のｍ／ｚ値から分子量を推定し、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルデータを非特許文献７に記載のデータと比較することにより、化合物６をイソクエルシトリンと同定した。

イソクエルシトリンが白桃花から単離精製、同定されたのは初めてである。

《化合物７の同定》
化合物７は黄色粉末であり、［α］^２５ _Ｄ−８０．３°（ｃ＝０．１、メタノール）を示し、ＥＩ−ＭＳでｍ／ｚ＝２７２［Ｍ］^＋となった。

^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは：
Ａ_２Ｂ_２タイプのプロトンシグナル（δ_Ｈ６．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ））；
を検出したことから、１，４−二置換ベンゼンの存在を推定し、更に：
プロトンシグナル（δ_Ｈ１２．１６（１Ｈ，ｓ））；
を検出したことから、キレート水酸基の存在を推定した。

^１３Ｃ−ＮＭＲ及びＤＥＰＴスペクトルでは：
１３個のｓｐ^２炭素によるシグナル（δ_Ｃ９５．０，９５．９，１０１．８，１１５．２×２，１２８．４×２，１２８．９，１５７．８，１６３．０，１６３．５，１６６．７，１９６．５）と；
２個のｓｐ^３炭素によるシグナル（δ_Ｃ４２．０，７８．５）と；
を検出した。

上述の旋光度及びｍ／ｚ値から分子構造を推定し、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルデータを非特許文献８に記載のデータと比較することにより、化合物７を（−）−ナリンゲニンと同定した。

《化合物８の同定》
化合物８は黄色粉末として得られ、［α］^２５ _Ｄ−４８．４°（ｃ＝０．１、メタノール）を示し、ＥＩ−ＭＳでｍ／ｚ＝２８８［Ｍ］^＋となった。

^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは：
２Ｈ分のメタカップリングするプロトンシグナル（δ_Ｈ５．８７（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ））；
を検出し、１，２，３，５−四置換ベンゼンの存在を推定し：
プロトンシグナル（δ_Ｈ６．７４（２Ｈ，ｓ）、δ_Ｈ６．８７（１Ｈ，ｓ）；
を検出し、１，３，５−三置換ベンゼンの存在を推定し、更には：
キレート水酸基によるシグナル（δ_Ｈ１２．１５（１Ｈ，ｓ））；
を検出した。

^１３Ｃ−ＮＭＲ及びＤＥＰＴスペクトルでは：
１３個のｓｐ^２炭素によるシグナル（δ_Ｃ９５．５，９６．３，１０２．３，１１４．９，１１５．９，１１８．５，１３０．０，１４５．７，１４６．２，１６３．４，１６４．０，１６７．３，１９６．９）と；
２個のｓｐ^３炭素によるシグナル（δ_Ｃ４２．１，７９．０）と；
を検出した。

上述の旋光度及びｍ／ｚ値から分子構造を推定し、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルデータを非特許文献９に記載のデータと比較することにより、化合物８を（−）−５，７，３’，５’−テトラヒドロキシフラバノンと同定した。

（−）−５，７，３’，５’−テトラヒドロキシフラバノンが白桃花から単離精製、同定されたのは初めてである。

《化合物９の同定》
化合物９は白色粉末であり、ＥＩ−ＭＳではｍ／ｚ＝１５２［Ｍ］^＋で分子イオンピークを検出した。

^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは：
芳香族領域のプロトンシグナル（δ_Ｈ７．２０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）、７．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）、７．３５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ））；
を検出し、一置換ベンゼンの存在を推定した。

^１３Ｃ−ＮＭＲ及びＤＥＰＴスペクトルでは：
７個のｓｐ^２炭素によるシグナル（δ_Ｃ，１２７．４×２，１２８．７，１２８．９×２，１４０．３，１７５．７）と；
１個のｓｐ^３炭素によるシグナル（δ_Ｃ７３．６）と；
を検出し、ケミカルシフトからカルボニル基（δ_Ｃ１７５．７）の存在を推定した。

上述のｍ／ｚ値から分子量を推定し、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルデータを非特許文献１０に記載のデータと比較することにより、化合物９をマンデル酸と同定した。

マンデル酸が白桃花から単離精製、同定されたのは初めてである。

《化合物１０の同定》
化合物１０は白色粉末であり、ＥＩ−ＭＳではｍ／ｚ＝１６４［Ｍ］^＋で分子イオンピークを検出した。

^１Ｈ−ＮＭＲでは、芳香族領域において：
Ａ_２Ｂ_２タイプに***するプロトンシグナル（δ_Ｈ６．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．５１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ））；
を検出し、更には：
トランスカップリングするオレフィンプロトンシグナル（δ_Ｈ６．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ）、７．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ））に基づくピーク；
も検出した。

^１３Ｃ−ＮＭＲ及びＤＥＰＴスペクトルでは：
６個のｓｐ^２炭素によるシグナル（δ_Ｃ１１５．３，１１５．７×２，１２５．３，１３０．１×２，１４４．１，１５９．６，１６８．０）；
を検出し、ケミカルシフトからカルボニル基（δ_Ｃ１６７．９）の存在を推定した。

上述のｍ／ｚ値から分子量を推定し、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルデータを非特許文献１１に記載のデータと比較することにより、化合物１０をｐ−クマル酸と同定した。

［白桃花由来の抽出物及び化合物の生物活性］

白桃花から分離、又は単離精製されたサンプル：
ｎ−ヘキサン画分の抽出物（ＰｒＰＨ）；
酢酸エチル画分の抽出物（ＰｒＰＥ）；
ｎ−ブタノール画分の抽出物（ＰｒＰＢ）；
水画分の抽出物（ＰｒＰＷ）；
（−）−アロマデンドリン（化合物１）；
ケンフェロール（化合物４）；
（−）−ナリンゲニン（化合物７）；及び
（−）−５，７，３’，５’−テトラヒドロキシフラバノン（化合物８）；
について、
前駆脂肪細胞の分化に及ぼす影響；
脂肪細胞のトリグリセリド（ＴＧ）蓄積量に及ぼす影響；
脂肪細胞におけるマクロファージの活性化の抑制に及ぼす影響；
の検討を行った。

《本発明のサンプルが前駆脂肪細胞の分化に及ぼす影響》
〈目的〉
グリセロール３リン酸脱水素酵素（ｇｌｙｃｅｒｏｌ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＧＰＤＨ）の活性の増加は、前駆脂肪細胞が脂肪細胞に分化した指標となることが知られている。そこで、本発明の抽出物及び化合物がＧＰＤＨ活性に及ぼす影響を検討するために、マウス線維芽細胞の３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞を用いてインビトロ実験を行った。

〈対照試験におけるコントロールのサンプル〉
本実施例のコントロールのサンプルは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いた。また、ポジティブコントロールのサンプルとして、小型脂肪細胞への分化を促進させる化合物であるピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ：ＳＩＧＭＡ社）を用い、ネガティブコントロールのサンプルとして小型脂肪細胞への分化を抑制する化合物であるＧＷ９６６２（和光純薬工業）とクエルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ：東京化成工業）とを用いた。更に、比較例のサンプルとして８０％のエタノールによる白桃花の抽出物（８０％ ＥｔＯＨ ｅｘｔ．）を用いた。

〈方法〉
１．培地の調製

本実施例で用いる３種類の培地は以下の通り調製した。

（１）細胞増殖培地の調製
５００ｍＬのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ：高グルコース、ＧＩＢＣＯ１１９６５）に：
ａ）６０℃で３０分間非動化処理した、終濃度が１０％となるように調製したウシ胎仔血清（ＦＣＳ）と；
ｂ）終濃度が１％となるように調製したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ）と：
を添加して、細胞増殖培地を調製した。

（２）細胞分化誘導培地の調製
５００ｍＬのダルベッコ変法イーグル培地（ＧＩＢＣＯ１１９６５）に：
ａ）終濃度が１０％となるように調製したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と；
ｂ）終濃度が５００μＭとなるように調製したＩＢＭＸ（５０ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン）と；
ｃ）終濃度が１μＭとなるように調製したＤＥＸ（デキサメタゾン）と；
ｄ）終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように調製した、１０ｍｇ／ｍＬのインスリン溶液と；
ｅ）終濃度が１％となるように調製したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社）と；
を添加して、細胞分化誘導培地を調製した。

（３）細胞分化促進培地の調製
５００ｍＬのダルベッコ変法イーグル培地（ＧＩＢＣＯ１１９６５）に：
ａ）終濃度が１０％となるように調製したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と；
ｂ）終濃度が５μｇ／ｍＬとなるように調製した、１０ｍｇ／ｍＬのインスリン溶液と；
ｃ）終濃度が１％となるように調製したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社）と；
を添加して、細胞分化促進培地を調製した。

２．前駆脂肪細胞の調製

３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞をコンフルエント状態になるまで培養し、その後ディッシュの培地を取り除き、細胞表面をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））を添加して洗浄し、その後ＰＢＳを吸引した。次いで、細胞に０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＳＩＧＭＡ Ｔ４０４９）を添加して、ＣＯ_２インキュベータで培養した。

顕微鏡を用いて、細胞がディッシュの底からはがれたことを確認した後、１０ｍＬの細胞増殖培地を添加して、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに注入した。細胞を１０００ｒｐｍの速度で、４℃で３分間遠心分離し、上清を取り除いた。新鮮な培地５０ｍＬを添加して懸濁し、２４ウェルプレート（住友ベークライト）２枚に１ｍＬずつ分注し、４日間ＣＯ_２インキュベータで５０ウェルの細胞を培養した。

４日後、全てのウェルの培地を取り除き、１ｍＬ／ウェルの細胞分化誘導培地を添加した。更に、サンプルを添加して３日間ＣＯ_２インキュベータで培養した。

３日後、全てのウェルの培地を取り除き、１ｍＬ／ウェルの細胞分化促進培地を添加した。更に、サンプルを添加して３日間ＣＯ_２インキュベータで培養した。

３日後、全てのウェルの培地を取り除き、１ｍＬ／ウェルの細胞分化促進培地を添加した。更に、サンプルを添加して２日間ＣＯ_２インキュベータで培養した。

２日後、以下のように細胞破砕物を調製した。

３．細胞破砕物の調製

各々のウェルから培地をチューブ（Ｒｉｎｇ Ｌｏｏｋ Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ ＢＭ−１５）に回収した。培地を取り除いた後、ＰＢＳ（−）を用いて細胞表面を２回洗浄した。１ｍＭのＥＤＴＡを含む２５ｍＭのトリス緩衝液（超純水にｐＨ７．５で１Ｍのトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）１２．５ｍＬと０．１ＭのＥＤＴＡとを添加し、５００ｍＬに調製）を５００μＬ添加した。マイクロピペットを用いて細胞を剥離し、チューブに回収した。回収した細胞を、氷冷下で１分間超音波で破砕処理した後、細胞を１５００ｒｐｍの速度で、４℃で２分間遠心分離した。

４．細胞破砕物のＤＮＡの定量
細胞内のＤＮＡの量は、ＤＮＡ定量キット（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ社）を用いて測定した。細胞破砕物と緩衝液及び発色剤とを添加して完全に混合した。混合した溶液を３５６ｎｍの励起フィルター、４５８ｎｍの蛍光フィルターを用いて蛍光測定した。標準曲線を作るために、基準液（１００μｇ／ｍＬのＤＮＡ）を精製水で希釈し、１００、５０、２５、１２．５、０μｇ／ｍＬになるように調製した。

５．ＧＰＤＨ活性の測定

細胞内のＧＰＤＨ活性の測定は、株式会社プライマリーセルのＧＰＤＨ活性測定キットを用いた。

上記キットの反応基質（凍結乾燥状態）のバイアル１本に対して、４．２ｍＬの精製水を添加して溶解し、反応基質溶液を調製した。調製した反応基質溶液は分光光度計用セル（石英ミクロセル）に添加した。次いで、細胞破砕物を分光光度計用セル（石英ミクロセル）に添加して十分に攪拌した。

波長３４０ｎｍにおける各サンプルの吸光度の変化量は、３０秒おきに４分間測定し、１分間あたりの吸光度の変化量（ΔＯ．Ｄ．）を算出した。

細胞破砕物１ｍＬあたりのＧＰＤＨが１分間に１μＭのニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を消費する活性を１Ｕとすると、ＧＰＤＨ活性は次式：
ＧＰＤＨ活性（Ｕ／ｍＬ）＝ΔＯ．Ｄ．×０．４８２
で求められる（光路長が１ｃｍの場合）。

コントロール（１００％）に対するＧＰＤＨ活性の増加率は次式：
ＧＰＤＨ活性（％ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ）＝（Ｘ／Ｙ）×１００；
より算出した。ここで、Ｘは各サンプルを添加した際の１ウェルあたりのＧＰＤＨ活性を１ウェルあたりのＤＮＡ量で除算した数値であり、Ｙはコントロールのサンプル（ＤＭＳＯ）を添加した際の１ウェルあたりのＧＰＤＨ活性を１ウェルあたりのＤＮＡ量で除算した数値である。

〈結果〉

図２に、本発明のサンプルにおける、コントロール（１００％）に対するＧＰＤＨ活性の増加率を示す。抽出物では酢酸エチル画分（ＰｒＰＥ）、水画分（ＰｒＰＷ）にＧＰＤＨ活性の増加が見られ、単離化合物では（−）−アロマデンドリン（符号１）にＧＰＤＨ活性の顕著な増加が見られた。

《白桃花由来のサンプルが脂肪細胞のトリグリセリド蓄積に及ぼす影響》
〈目的〉
脂肪細胞における過剰なＴＧ蓄積は、脂肪細胞の肥大化を惹起するため、肥満ひいてはメタボリックシンドロームの原因となることが知られている。そこで、本発明の白桃花由来の抽出物及び化合物が脂肪細胞におけるトリグリセリド（ＴＧ）蓄積に及ぼす影響を検討するために、マウス線維芽細胞の３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞を用いてインビトロ実験を行った。

〈方法〉

対照試験におけるコントロールサンプルの設定、培地の調製方法、前駆脂肪細胞の調製方法、細胞破砕物の調製方法、及びＤＮＡの定量方法は、実施例１と同一の方法を用いた。以下にＴＧ含量の測定方法について述べる。

各サンプルの細胞破砕物内に蓄積したＴＧ含量は、ＬａｂＡｓｓａｙ（商標）Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ（和光純薬工業）を用いて定量した（ＧＰＯ・ＤＡＯＳ法）。各サンプルの細胞破砕物にトリグリセリド発色試薬を添加して十分に混合し、３７℃で５分間加温した。ＤＭＳＯをコントロールのサンプルとして、波長５９５ｎｍにおける各サンプルの吸光度を測定した。標準曲線を作るために、終濃度が１００、２００、３００、５９６、８８２ｍｇ／ｄＬになるように基準液を調製して添加した。

コントロール（１００％）に対するＴＧ蓄積量の割合（％ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ）は次式：
ＴＧ蓄積量（％ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ）＝（Ｘ／Ｙ）×１００；
より算出した。ここで、Ｘは各サンプルを添加した際の１ウェルあたりのＴＧ量を１ウェルあたりのＤＮＡ量で除算した数値であり、Ｙはコントロールのサンプル（ＤＭＳＯ）を添加した際の１ウェルあたりのＴＧ量を１ウェルあたりのＤＮＡ量で除算した数値である。

〈結果〉

図３に、本発明のサンプルにおける、コントロール（１００％）に対するＴＧ蓄積量の増加率を示す。抽出物で水画分（ＰｒＰＷ）にＴＧ蓄積量の増加が見られ、単離化合物では（−）−アロマデンドリン（符号１）にＴＧ蓄積量の顕著な増加が見られた。

《８０％のエタノールによる白桃花の抽出物が小型脂肪細胞の分化とＴＧ蓄積量の増加とに及ぼす影響》
〈目的〉
本実施例では、前駆脂肪細胞の分化誘導時にＤＥＸ、ＩＢＭＸを添加せずにインスリンのみを添加した場合に、８０％のエタノールによる白桃花の抽出物（８０％ ＥｔＯＨ ｅｘｔ．）が小型脂肪細胞の分化とＴＧ蓄積量とに及ぼす影響を検討するために、マウス線維芽細胞の３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞を用いてインビトロ実験を行った。

本実験の小型脂肪細胞の分化は、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色を用いることによって可視的に確認した。また、本実験のＴＧ蓄積量の比較はコントロールのサンプル（ＤＭＳＯ）との対照実験で行った。

〈方法〉
１．培地の調製

本実施例で用いる３種類の培地は以下の通り調製した。

（１）細胞増殖培地の調製
５００ｍＬのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ：高グルコース、ＧＩＢＣＯ１１９６５）に：
ａ）６０℃で３０分間非動化処理した、終濃度が１０％となるように調製したウシ胎仔血清（ＦＣＳ）と；
ｂ）終濃度が１％となるように調製したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ）と：
を添加して、細胞増殖培地を調製した。

（２）細胞分化誘導培地の調製
５００ｍＬのダルベッコ変法イーグル培地（ＧＩＢＣＯ１１９６５）に：
ａ）終濃度が１０％となるように調製したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と；
ｂ）終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように調製した、１０ｍｇ／ｍＬのインスリン溶液と；
ｃ）終濃度が１％となるように調製したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社）と；
を添加して、細胞分化誘導培地を調製した。

（３）細胞分化促進培地の調製
５００ｍＬのダルベッコ変法イーグル培地（ＧＩＢＣＯ１１９６５）に：
ａ）終濃度が１０％となるように調製したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と；
ｂ）終濃度が５μｇ／ｍＬとなるように調製した、１０ｍｇ／ｍＬのインスリン溶液と；
ｃ）終濃度が１％となるように調製したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社）と；
を添加して、細胞分化促進培地を調製した。

２．試薬の調製

本実施例で用いる３種類の試薬は以下の通り調製した。

（１）１０％（ｖ／ｖ）のホルムアルデヒド溶液
１．５ｍＬのホルムアルデヒド溶液を注射用水で希釈し、全量を１５ｍＬにした。

（２）６０％のイソプロパノール
１５ｍＬのイソプロパノールを注射用水で希釈し、全量を２５ｍＬにした。

（３）Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ液
１５０ｍｇのＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏを５０ｍＬのイソプロパノールで溶解し、１０分間混合して、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏの原液を精製した。次いで、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏの原液と注射用水とを６：４の比率で混合して、室温で１０分静置し、孔径０．５μｍのフィルタで濾過した。調製したＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ液は、調製後１ないし２時間以内に用いた。

３．細胞の調製

３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞をコンフルエント状態になるまで培養し、その後ディッシュの培地を取り除き、細胞表面をＰＢＳ（−）を添加して洗浄し、その後ＰＢＳを吸引した。次いで、細胞に０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＳＩＧＭＡ Ｔ４０４９）を添加して、ＣＯ_２インキュベータで培養した。

顕微鏡を用いて、細胞がディッシュの底からはがれたことを確認した後、１０ｍＬの細胞増殖培地を添加して、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに注入した。細胞を１０００ｒｐｍの速度で、４℃で３分間遠心分離し、上清を取り除いた。新鮮な培地５０ｍＬを添加して懸濁させ、φ６０ｍｍディッシュに１０ｍＬずつ分注し、４日間ＣＯ_２インキュベータで培養した。

４日後、全てのウェルの培地を取り除き、細胞分化誘導培地を１０ｍＬ添加した。更に、サンプルを添加して３日間ＣＯ_２インキュベータで培養した。

３日後、全てのウェルの培地を取り除き、細胞分化促進培地を１０ｍＬ添加した。更に、サンプルを添加して３日間ＣＯ_２インキュベータで培養した。

３日後、全てのウェルの培地を取り除き、細胞分化促進培地を１０ｍＬ添加した。更に、サンプルを添加して２日間ＣＯ_２インキュベータで培養した。

２日後、以下のようにＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色を行った。

４．Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色

ディッシュの培地を取り除き、１０ｍＬのＰＢＳ（−）で２回洗浄した。１０％のホルムアルデヒド溶液を１０ｍＬ添加し、室温で１０分間固定した。固定後、１０ｍＬのＰＢＳ（−）で２回洗浄し、６０％のイソプロパノールで置換した。６０％のイソプロパノールを取り除き、１０ｍＬのＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ液を添加し、室温で１５分間静置した。

１５分後Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ液を取り除き、１０ｍＬの６０％のイソプロパノールを用いて洗浄した。１０ｍＬのＰＢＳ（−）で１回洗浄し、ＰＢＳ（−）中で顕微鏡観察を行った。

５．ＴＧ含量の測定

Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色の観察後、ＰＢＳ（−）を取り除き、イソプロパノールを１０ｍＬ添加して色素を溶出させ、波長５２０ｎｍの吸光度を測定した。

コントロール（１００％）に対するＴＧ蓄積量の割合（％ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ）は次式：
ＴＧ蓄積量（％ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ）＝（Ａｂ．ｓａｍ．／Ａｂ．ｃｏｎ．）；
より算出した。ここで、Ｘは各サンプルを添加した際の吸光度であり、Ｙはコントロールのサンプル（ＤＭＳＯ）を添加した際の吸光度である。

〈結果〉

図４に、８０％のエタノールの抽出物における、小型脂肪細胞のＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色の結果と、コントロール（１００％）に対するＴＧ蓄積量の増加率を示す。

Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色では、８０％のエタノールの抽出物添加をした場合に、コントロールと比較して小型脂肪細胞が増加した。

また、８０％のエタノールの抽出物を添加した場合に、コントロールと比較してＴＧ蓄積量が増加した。

《白桃花由来のサンプルが脂肪細胞のアディポネクチン分泌に及ぼす影響》
〈目的〉
脂肪細胞におけるアディポネクチン分泌量の増加が、血中アディポネクチンレベルを上昇させ、ひいてはインスリン抵抗性を改善できることが知られている。そこで、白桃花由来のサンプルが脂肪細胞のアディポネクチン分泌に及ぼす影響を検討するために、マウス線維芽細胞の３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞を用いてインビトロ実験を行った。

本実験は、コントロールのサンプル（ＤＭＳＯ）との対照実験で行い、白桃花由来のサンプル：
８０％のエタノールによる白桃花の抽出物（８０％ ＥｔＯＨ ｅｘｔ．）と；
酢酸エチル画分の抽出物（ＰｒＰＥ）と；
（−）−アロマデンドリン（化合物１）と；
について、脂肪細胞のアディポネクチン分泌に及ぼす影響を検討した。

〈方法〉
１．試薬の調製

本実施例の測定ではマウス／ラットアディポネクチンＥＬＩＳＡキット（大塚製薬）を用い、本キット中の５種類の試薬は以下の通り調製した。

（１）洗浄液
全量４０ｍＬの洗浄用原液に９６０ｍＬの精製水を混合した。原液に結晶が析出している場合は、加温して溶解してから調製した。調製した洗浄液は２ないし８℃で保存した。

（２）検体希釈液
全量５０ｍＬの検体希釈用原液に２００ｍＬの精製水を混合した。調製した検体希釈液は２ないし８℃で保存した。

（３）標準液
８．０ｎｇ／ｍＬの標準品を検体希釈液で２倍段階希釈して、４．０、２．０、１．０、０．５、０．２５ｎｇ／ｍＬの標準液を調製した。８．０ｎｇ／ｍＬの標準液として８．０ｎｇ／ｍＬの標準品を、０ｎｇ／ｍＬの標準液として検体希釈液を使用した。

（４）酵素標識ストレプトアビジン液
１２ｍＬのストレプトアビジン希釈液に対して、ストレプトアビジン原液を６０μＬの割合で混合し、使用前に必要量調製した。

（５）基質液
６ｍＬの基質液Ｂに対して、基質液Ａを６ｍＬの割合で混合し、使用前に必要量調製した。

２．培養上清の希釈

実施例１でチューブ（Ｒｉｎｇ Ｌｏｏｋ Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ ＢＭ−１５）に回収した培地（培養上清）１０μＬを検体希釈液１．０ｍＬに添加して混合した（１０１倍に希釈した培養上清となる）。このうち５０μＬを新たな容器に移し、検体希釈液１．０ｍＬと混合した（２，１２１倍に希釈した培養上清となる）。

３．測定用培養上清の調製

洗浄液を抗体プレートの各ウェルに約３５０μＬずつ添加した後、ウェル内の液を完全に取り除いた。次いで、抗体プレートを逆さにしてペーパータオルに軽く叩きつけ、ウェル内に残った洗浄液を取り除いた。各濃度の標準液、希釈した培養上清を各ウェルに１００μＬずつ添加し、プレートシールで抗体プレートをカバーして、２２ないし２８℃で６０分間静置反応させた。

次いで、抗体プレートからプレートシールを取り除き、ウェル内の液を完全に取り除いた。洗浄液を抗体プレートの各ウェルに約３５０μＬずつ加えた後、ウェル内の液を完全に取り除いた。この操作を計３回繰り返し、抗体プレートを逆さにしてペーパータオルに軽く叩きつけ、ウェル内に残った洗浄液を取り除いた。ビオチン標準抗体液を抗体プレートの各ウェルに１００μＬずつ添加し、プレートシールで抗体プレートをカバーし、２２ないし２８℃で６０分間静置反応させた。

次いで、抗体プレートからプレートシールを取り除き、ウェル内の液を完全に取り除いた。洗浄液を抗体プレートの各ウェルに約３５０μＬずつ加えた後、ウェル内の液を完全に取り除いた。この操作を計３回繰り返し、抗体プレートを逆さにしてペーパータオルに軽く叩きつけ、ウェル内に残った洗浄液を取り除いた。酵素標識ストレプトアビジン液を抗体プレートの各ウェルに１００μＬずつ添加した。プレートシールで抗体プレートをカバーし、上記と同様に洗浄した。基質液を抗体プレートの各ウェルに１００μＬずつ添加して、２２ないし２８℃で１５分間静置反応させて、測定用培養上清を調製した。

４．アディポネクチン分泌量の測定

反応停止液を抗体プレートの各ウェルに１００μＬずつ添加し、６５０ｎｍでの吸光度を対照に、４５０ｎｍでの吸光度を測定し、各ウェルのアディポネクチン濃度を算出した。

算出したアディポネクチン濃度に培養上清の希釈率（２，１２１倍）を乗じて培養上清中のアディポネクチン濃度を算出した。コントロール（１００％）に対するアディポネクチン分泌量の割合（％ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ）は次式：
アディポネクチン分泌量（％ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ）＝（Ｘ／Ｙ）×１００；
より算出した。ここで、Ｘはサンプルを添加した際の１ウェルあたりのアディポネクチン量であり、Ｙはコントロールのサンプル（ＤＭＳＯ）を添加した際の１ウェルあたりのアディポネクチン量である。

〈結果〉

図５に、本発明のサンプルにおける、コントロール（１００％）に対するアディポネクチン分泌量の増加率を示す。８０％のエタノールによる白桃花の抽出物（８０％ ＥｔＯＨ ｅｘｔ．）、酢酸エチル画分の抽出物（ＰｒＰＥ）、及び（−）−アロマデンドリン（符号１）の総てに顕著なアディポネクチン分泌量の増加が見られた。

《白桃花由来のサンプルが脂肪細胞におけるマクロファージの活性化の抑制に及ぼす影響》
〈目的〉
メタボリックシンドロームの一因であるアディポネクチンの分泌量の低下は、肥大化した脂肪細胞で活性化したマクロファージから分泌されるＴＮＦ−α、及び脂肪細胞から分泌される遊離脂肪酸が互いに脂肪細胞とマクロファージの炎症性変化を促進することにより生じることが知られている。更に、マクロファージにおける一酸化窒素（ＮＯ）の産生がマクロファージの活性化の指標となることが知られている。

そこで、本発明の白桃花由来の抽出物及び化合物が脂肪細胞におけるＮＯの産生に対して及ぼす影響を検討するために、マウスマクロファージ様細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞を用いてインビトロ実験を行った。

本実施例のコントロールのサンプルは、クエルセチン（ＩＣ_５０ ２６．８）を用い、試験薬物を添加しないものを１００％とした。本実施例では、比較例のサンプルとして８０％のエタノールによる白桃花の抽出物（８０％ ＥｔＯＨ ｅｘｔ．）を用いた。

〈方法〉
１．培地の調製

５００ｍＬのＦ−１２ ＨＡＭ培地（ＳＩＧＭＡ Ｎ４８８８）に：
ａ）終濃度が１．８ｍＭとなるように調製したＬ−グルタミン（ＳＩＧＭＡ社）と；
ｂ）６０℃で３０分間非動化処理した、終濃度が１０％となるように調製したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と；
ｃ）終濃度が１％となるように調製したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社）と；
を添加して調製した。

２．試薬の調製

本実施例で用いる４種類の試薬は以下の通り調製した。

（１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ（Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｔｅｃｈｎｅ）の調製
０．３ｍｇ／ｍＬのＩＮＦ−γ原液を上述の調製した培地で１００倍に希釈し、３μｇ／ｍＬの濃度にして、−３５℃で保存した。

（２）ＬＰＳ（ＳＩＧＭＡ Ｏ５５：Ｂ５）の調製
ＬＰＳを培地で５ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈して、−３５℃で保存した（ＬＰＳ原液）。ＬＰＳ原液を培地で５倍に希釈し、−３５℃で保存した。

（３）０．１％のナフチルエチレンジアミン溶液の調製
使用前に５ｍｇのナフチルエチレンジアミン二塩酸（Ｗａｋｏ）を５ｍＬの注射用水で溶解して調製した。調製した０．１％のナフチルエチレンジアミン溶液は遮光保存した。

（４）スルファニルアミド溶液の調製
使用前に５０ｍｇのスルファニルアミド（Ｗａｋｏ）を２５０μＬのリン酸（Ｗａｋｏ）で溶解して、注射用水を添加して５ｍＬに調製した。調製したスルファニルアミド溶液は遮光保存した。

３．細胞の調製

マクロファージ様細胞ＲＡＷ２６４．７細胞を、１０％のウシ胎仔血清を含むＦ−１２ ＨＡＭ培地でコンフルエント状態になるまで培養した。その後、培養したＲＡＷ２６４．７細胞を５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに注入した。細胞を１０００ｒｐｍの速度で、４℃で３分間遠心分離し、上清を取り除いた。１０ｍＬの新鮮な培地を添加して懸濁し、１．２×１０^６個／ｍＬの濃度に調製した。調製した細胞を９６ウェルプレート（住友ベークライト ８０９６Ｒ）に２００μＬずつ分注し、１ないし２時間、ＣＯ_２インキュベータで６０ウェル分を培養して細胞を接着した。

次いで、１０μｇ／ｍＬのＬＰＳ（ＳＩＧＭＡ Ｏ５５：Ｂ５）を２μＬ添加し、３０ｎｇ／ｍＬのｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）を２μＬ添加し、０．４μＬのサンプルを添加した。その後、ＣＯ_２インキュベーターにて１６時間培養した。終濃度は、ＩＦＮ−γが０．３３ｎｇ／ｍＬ、ＬＰＳが１００ｎｇ／ｍＬである。また、サンプルはＤＭＳＯに溶解し、かつ培地に対する含量が０．２％になるように調製した。

４．グリース法によるＮＯ産生の評価

１００μＬの培地上清を採取し、０．１％のナフチルエチレンジアミン溶液を５０μＬ添加し、スルファニルアミド溶液を５０μＬを添加し、室温にて１０分間遮光状態で静置した。その後、６５５ｎｍでの吸光度を対照に５２０ｎｍの吸光度の変化（Ｏ．Ｄ．）を測定した。

ＮＯ産生抑制率（％ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ）は次式：
抑制率（％）＝｛１−（Ｘ−Ｙ）／（Ｚ−Ｙ）｝×１００；
より算出した。ここで、Ｘはサンプルの存在下でＩＦＮ−γとＬＰＳにより誘導される吸光度であり、Ｙはサンプル、ＩＦＮ−γ及びＬＰＳがない状態で誘導される吸光度コントロールのサンプルであり、ＺはＩＦＮ−γとＬＰＳにより誘導される吸光度である。

５．細胞毒性の測定

細胞毒性の測定は鏡検による観察と通常のＭＴＴ法で行った。以下にＭＴＴ法における細胞毒性の測定方法について概略を述べる。

ＲＡＷ２６４．７細胞を、１０％のウシ胎仔血清を含むＦ−１２ ＨＡＭ培地でコンフルエント状態になるまで培養した。その後、培養したＲＡＷ２６４．７細胞を５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに注入した。細胞を１０００ｒｐｍの速度で、４℃で３分間遠心分離し、上清を取り除いた。１０ｍＬの新鮮な培地を添加して懸濁し、１．２×１０^６個／ｍＬの濃度に調製した。調製した細胞を９６ウェルプレート（住友ベークライト ８０９６Ｒ）に２００μＬずつ分注し、１ないし２時間、ＣＯ_２インキュベータで６０ウェル分を培養して細胞を接着した。

次いで、１０μｇ／ｍＬのＬＰＳ（ＳＩＧＭＡ Ｏ５５：Ｂ５）を２μＬ添加し、３０ｎｇ／ｍＬのｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）を２μＬ添加し、０．４μＬのサンプルを添加した。その後、ＣＯ_２インキュベーターにて１６時間培養し、培養上清を１００μＬ採取し、１００μＬのＮＯアッセイ細胞に１ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを２５μＬ添加して４時間培養した。その後、培地を取り除き、細胞に１５０μＬのＤＭＳＯを添加して生成したホルマザンを完全に溶解し、５分間放置した後、６５５ｎｍでの吸光度を対照に５７０ｎｍの吸光度を測定した。

〈結果〉

図６に、本発明のサンプルにおけるＮＯ産生抑制率を示す。抽出物でｎ−ヘキサン画分（ＰｒＰＨ）に強いＮＯ産生抑制活性が見られ、酢酸エチル画分（ＰｒＰＥ）、ｎ−ブタノール画分（ＰｒＰＢ）、水画分（ＰｒＰＷ）の順に弱いながらもＮＯ産生抑制活性が見られた。単離化合物ではケンフェロール（符号４）にＮＯ産生抑制活性が見られた。

なお、試験を行った総てのサンプルに細胞毒性は認められなかった

［考察］

実施例により、白桃花由来の酢酸エチル画分の抽出物に、前駆脂肪細胞分化促進効果、脂肪細胞におけるアディポネクチン分泌促進効果、及び一酸化窒素産生抑制効果が見られた。酢酸エチル画分の抽出物では、脂肪細胞のトリグリセリド蓄積量が増加しないため、脂肪細胞が肥大化することなく、インシュリン抵抗性が改善される。従って、白桃花由来の酢酸エチル画分の抽出物を生薬成分として適用することによって、メタボリックシンドロームの予防及び改善効果が達成される。

実施例により、白桃花由来の水画分の抽出物に、前駆脂肪細胞分化促進効果、脂肪細胞におけるアディポネクチン分泌促進効果、及び一酸化窒素産生抑制効果が見られた。水画分の抽出物では、脂肪細胞のトリグリセリド蓄積量が増加するもののアディポネクチン分泌が顕著に促進されているため、脂肪細胞が肥大化することなく、インシュリン抵抗性が改善される。このことは、白桃花由来の水画分の抽出物を生薬成分として適用することによって、メタボリックシンドロームの予防及び改善効果が達成されうることを示唆している。また、水画分で強い前駆脂肪細胞分化促進効果が見られたことは、水画分に含まれる未知の生薬成分にこのような効果が認められる可能性が高いことを示唆している。

以上のような、白桃花由来の抽出物における、メタボリックシンドロームの予防及び改善効果は、本発明で発見された新規の効果である。

実施例により、白桃花由来の（−）−アロマデンドリンに、前駆脂肪細胞分化促進効果、及び脂肪細胞におけるアディポネクチン分泌促進効果が見られた。（−）−アロマデンドリンでは、脂肪細胞のトリグリセリド蓄積量が増加するもののアディポネクチン分泌が顕著に促進されているため、脂肪細胞が肥大化することなく、インシュリン抵抗性が改善される。従って、（−）−アロマデンドリンを生薬成分として適用することによって、メタボリックシンドロームの予防及び改善効果が達成される。

アロマデンドリンの薬効として抗真菌作用が知られている。しかしながら、アロマデンドリンにおけるメタボリックシンドロームの予防及び改善効果は、本発明で新規に発見された効果である。

実施例により、白桃花由来の総ての画分の抽出物に、ＲＡＷ２６４．７細胞における一酸化窒素産生抑制効果が見られた。このことはマクロファージの活性化が抑制され、炎症性アディポカインの産生が抑制され、ひいてはインスリン抵抗性が改善されることを示唆している。

実施例により、白桃花由来のケンフェロールに、ＲＡＷ２６４．７細胞における一酸化窒素産生抑制効果が見られた。ケンフェロールは前駆脂肪細胞の分化を促進する効果はないが、一酸化窒素の産生を抑制できる。このことはマクロファージの活性化が抑制されるため、炎症性アディポカインの産生が抑制され、ひいてはインスリン抵抗性が改善されることを示唆している。更に、ケンフェロールは、脂肪細胞のトリグリセリド蓄積量を増加しないため、脂肪細胞は肥大化しない。従って、ケンフェロールを生薬成分として適用することによって、メタボリックシンドロームの予防及び改善効果が達成される。

本発明によって、白桃花由来の生薬成分が、人間及び動物に対してメタボリックシンドロームの予防及び改善効果を発揮できることが示唆された。従って、本発明の生薬成分は既知の剤形を用いて医薬品として人間又は動物に対して適用することができる。また、本発明の有効成分は医薬品、健康補助食品などの飲食品、化粧品、又は医薬部外品として利用することができる。

医薬品の剤形は限定しないが、注射剤、懸濁剤、座剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、固形剤、液剤、ゲル剤、気泡剤、乳剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、シート剤、吸入剤であってもよい。

医薬品の投与方法は、経口投与又は非経口投与のいずれも採用することができる。本発明の生薬成分は経口投与、直腸内投与、注射等の投与方法に適した固体又は液体の医薬用担体と混合して、既知の医薬製剤の形態で投与してもよい。製剤は限定しないが、既知の製剤調合手段で調製可能な錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤であってもよい。医薬用担体は限定しないが、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水であってもよい。又、医薬用担体は更に、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤等の添加剤を含んでもよい。

本発明の生薬成分は限定しないが、保健用食品又は健康食品、サプリメント、食品素材として用いることができる。また、既知の手段を用いて顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形して飲食品に適した形態にしてもよい。更に、本発明の生薬成分は限定しないが、かまぼこ、ちくわ等の加工水産ねり製品、ソーセージ、ハム等の畜産製品、洋菓子類、和菓子類、生めん、中華めん、ゆでめん、ソバ等のめん類、ソース、醤油、タレ、砂糖、ハチミツ、粉末あめ、水あめ等の調味料、カレー粉、からし粉、コショウ粉等の香辛料、ジャム、マーマレード、チョコレートスプレッド、漬物、そう菜、ふりかけ、又は各種野菜・果実の缶詰・瓶詰等の加工野菜・果実類、チーズ、バター、ヨーグルト等の乳製品、みそ汁、スープ、果実ジュース、野菜ジュース、乳清飲料、清涼飲料、酒類等の飲料、及び流動食に用いてもよい。また、ペットフード等の動植物用飼料に用いてもよい。

本発明の生薬成分は限定しないが、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パック、洗顔料や皮膚洗浄剤、マッサージ用剤、クレンジング用剤、除毛剤、脱毛剤、シェービングクリーム、アフターシェーブローション、プレショーブローション、シェービングクリーム、ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ、香水類、美爪剤、美爪エナメル、美爪エナメル除去剤、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、貼付剤、エアゾール、シャンプー剤、リンス剤、ヘアートリートメント剤、プレヘアートリートメント剤、パーマネント液、染毛料、整髪料、ヘアートニック剤、育毛・養毛剤、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、貼付剤、エアゾール剤、浴用剤、腋臭防止剤や消臭剤、防臭剤、制汗剤、衛生用品、衛生綿類、ウェットティッシュ、歯磨類、洗口剤、含嗽剤、食器洗浄剤といった化粧品又は医薬部外品等に用いてもよい。

Claims (14)

1. 前駆脂肪細胞の分化を促進するための有機体由来の抽出物であって、前記有機体由来の抽出物がアロマデンドリンを含むことを特徴とする抽出物。
2. 請求項１に記載の抽出物において、前記有機体が白桃花であることを特徴とする抽出物。
3. 前駆脂肪細胞の分化を促進するための白桃花由来の抽出物。
4. 請求項１ないし３に記載の抽出物が、酢酸エチル画分の抽出物であることを特徴とする抽出物。
5. 請求項３に記載の抽出物が、水画分の抽出物であることを特徴とする抽出物。
6. 請求項１ないし５のいずれか１項に記載の抽出物を含むことを特徴とする医薬品。
7. 請求項１ないし５のいずれか１項に記載の抽出物を含むことを特徴とする飲食品。
8. 請求項１ないし５のいずれか１項に記載の抽出物を含むことを特徴とする化粧品。
9. 請求項１ないし５のいずれか１項に記載の抽出物を含むことを特徴とする医薬部外品。
10. アロマデンドリンを有効成分とする、前駆脂肪細胞の分化を促進するための医薬品。
11. アロマデンドリンを有効成分とする、前駆脂肪細胞の分化を促進するための飲食品。
12. 請求項７又は１１に記載の飲食品が、栄養補助食品であることを特徴とする飲食品。
13. アロマデンドリンを有効成分とする、前駆脂肪細胞の分化を促進するための化粧品。
14. アロマデンドリンを有効成分とする、前駆脂肪細胞の分化を促進するための医薬部外品。