JP2010095459A - Fat accumulation- or metabolism-ameliorating agent, anti-tnf-alpha agent and new triterpene compound - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ザクロ科（Ｐｕｎｉｃａｃｅａｅ）植物であるザクロの花部、その抽出物もしくは抽出エキス、又はこれらから得ることができる新規トリテルペン化合物を含有する脂肪蓄積・代謝改善剤及び抗ＴＮＦ−α作用剤に関する。本発明は又、前記の新規トリテルペン化合物にも関する。本発明はさらに、前記脂肪蓄積・代謝改善剤又は前記抗ＴＮＦ−α作用剤を含有する医薬及び食品に関するものである。 The present invention relates to a fat accumulation / metabolism-improving agent and an anti-TNF-α agonist containing a flower part of a pomegranate that is a Ponicaceae plant, an extract or extract thereof, or a novel triterpene compound obtainable therefrom. About. The invention also relates to the novel triterpene compounds described above. The present invention further relates to a medicament and food containing the fat accumulation / metabolism improving agent or the anti-TNF-α agonist.
ザクロ（学名：Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ Ｌ．）は、イラン東部から北インドのヒマラヤ山地が原産とされ、中東から中央・東アジアおよび南米に広く分布している。中国伝統医学においては、ザクロの花部を“石榴花（セキリュウカ）”と称し、中薬大辞典（非特許文献１）ではその薬効および主治として「鼻出血、中耳炎、傷による出血を治す。」、「吐血、月経不順、紅崩白帯を治す。」および「やけどには、研って粉末にし、香油を調えて塗布する。」などと記載されている。しかしながら従来は、ザクロの花部に関する詳細な含有成分の探索等の科学的研究は、あまり実施されていなかった。
そこで、本発明者らは、ザクロ花部の含有成分の解明研究を実施した。その結果、ザクロ花部には、肝細胞における脂肪の蓄積を抑制する作用および肝細胞に蓄積した脂肪の代謝に対する促進作用（脂肪蓄積・代謝改善作用）や、種々疾病（リウマチ、糖尿病、メタボリックシンドロームなど）の発症および進展に関わる炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αの作用を抑制する作用（抗ＴＮＦ−α作用）があることを見出し、ザクロ花部より、脂肪蓄積・代謝改善作用を有する薬剤（脂肪蓄積・代謝改善剤）や、抗ＴＮＦ−α作用を有する薬剤（抗ＴＮＦ−α作用剤）が得られること、そして、脂肪蓄積・代謝改善作用や抗ＴＮＦ−α作用を有する化合物が得られることが示唆された。 Therefore, the present inventors conducted research to elucidate the components contained in the pomegranate flower part. As a result, the pomegranate flower part has the action of suppressing the accumulation of fat in hepatocytes and the action of promoting the metabolism of fat accumulated in hepatocytes (fat accumulation / metabolism improving action), and various diseases (rheumatic, diabetes, metabolic syndrome). And the like, and found to have an action (anti-TNF-alpha action) that suppresses the action of TNF-α, which is an inflammatory cytokine involved in the onset and progression of the drug, and has a fat accumulation / metabolism improving action from the pomegranate flower part ( A fat accumulation / metabolism improving agent) and a drug having an anti-TNF-α action (anti-TNF-α acting agent), and a compound having a fat accumulation / metabolism improving action and an anti-TNF-α action are obtained. It has been suggested.
このような背景のもと本発明は、ザクロ花部より得られる脂肪蓄積・代謝改善剤及び抗ＴＮＦ−α作用剤を提供することを課題とする。 Under such circumstances, an object of the present invention is to provide a fat accumulation / metabolism improving agent and an anti-TNF-α agonist obtained from pomegranate flower parts.
本発明は、又、ザクロ花部より得られ、脂肪蓄積・代謝改善作用や抗ＴＮＦ−α作用を有する化合物、並びに、この化合物を含有する脂肪蓄積・代謝改善剤及び抗ＴＮＦ−α作用剤を提供することを課題とする。 The present invention also provides a compound obtained from a pomegranate flower part and having a fat accumulation / metabolism improving action and an anti-TNF-α action, and a fat accumulation / metabolism improving agent and an anti-TNF-α action agent containing this compound. The issue is to provide.
本発明は、さらに又、前記脂肪蓄積・代謝改善剤又は前記ＴＮＦ−α作用剤を含有する医薬又は食品を提供することを課題とする。 Another object of the present invention is to provide a medicine or food containing the fat accumulation / metabolism improving agent or the TNF-α agonist.
本発明者は、ザクロ花部に関する詳細な含有成分の探索、及びその薬剤としての作用についての研究を鋭意行った結果、ザクロの花部、ザクロの花部を水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により抽出して得られる抽出液、又は前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキスを有効成分として含有させることにより、脂肪蓄積・代謝改善剤又は前記ＴＮＦ−α作用剤が得られることを見出した。本発明者は、さらに、ザクロ花部には、脂肪蓄積・代謝改善作用や抗ＴＮＦ−α作用を有する新規トリテルペン化合物が含まれていることを見出した。これらの知見に基づき、本発明者は、以下に示す態様の発明を完成した。 As a result of earnest researches on the detailed content of the pomegranate flower part and research on its action as a drug, the present inventor has found that the pomegranate flower part, pomegranate flower part is water, lower aliphatic alcohol or lower fat. A fat accumulation / metabolism improving agent or the TNF-α agonist can be obtained by containing, as an active ingredient, an extract obtained by extraction with a water-containing aromatic alcohol or an extract obtained by concentrating the extract. I found out that The present inventor further found that the pomegranate flower part contains a novel triterpene compound having an action of improving fat accumulation / metabolism and an anti-TNF-α action. Based on these findings, the present inventor has completed the invention of the embodiment shown below.
本発明は、その第１の態様として、ザクロの花部、ザクロの花部を水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により抽出して得られる抽出液、又は前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキスを有効成分として含むことを特徴とする脂肪蓄積・代謝改善剤（請求項１）を提供する。 The present invention provides, as a first aspect thereof, a pomegranate flower part, an extract obtained by extracting the pomegranate flower part with water, a lower aliphatic alcohol or a hydrated product of a lower aliphatic alcohol, or concentrating the extract. A fat accumulation / metabolism-improving agent (Claim 1) characterized in that it contains an extract extracted as an active ingredient.
本発明者は、ザクロの花部や、ザクロ花部を水や低級脂肪族アルコール等により抽出して得られた抽出液、又は当該抽出液を濃縮して得られる抽出エキスについて、脂肪蓄積・代謝改善剤としての活性評価の指標として、ヒト肝がん由来細胞であるＨｅｐＧ２細胞を用いた細胞内脂肪蓄積抑制作用および脂肪代謝促進作用（脂肪蓄積・代謝改善作用）を検討した。その結果、ザクロ花部やその抽出液、抽出エキス等が、脂肪蓄積・代謝改善作用を示すことを見出し、この第１の態様の発明を完成したのである。 The present inventor is concerned with fat accumulation / metabolism of a pomegranate flower part, an extract obtained by extracting the pomegranate flower part with water or a lower aliphatic alcohol, or an extract obtained by concentrating the extract. As an index of activity evaluation as an improving agent, an intracellular fat accumulation-inhibiting action and a fat metabolism promoting action (fat accumulation / metabolism improving action) using HepG2 cells, which are cells derived from human liver cancer, were examined. As a result, it was found that the pomegranate flower part, its extract, extract extract and the like show a fat accumulation / metabolism improving action, and the invention of the first aspect has been completed.
また本発明は、その第２の態様として、ザクロの花部、ザクロの花部を水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により抽出して得られる抽出液、又は前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキスを有効成分として含むことを特徴とする抗ＴＮＦ−α作用剤（請求項２）を提供する。 Moreover, the present invention provides, as a second aspect thereof, a pomegranate flower part, an extract obtained by extracting the pomegranate flower part with water, a lower aliphatic alcohol or a hydrated product of a lower aliphatic alcohol, or the above extract. The present invention provides an anti-TNF-α agent (claim 2) characterized by containing an extract obtained by concentration as an active ingredient.
本発明者は、ザクロの花部や、ザクロ花部を水や低級脂肪族アルコール等により抽出して得られた抽出液、又は当該抽出液を濃縮して得られる抽出エキスについて、抗ＴＮＦ−α作用剤としての活性評価の指標として、ＴＮＦ−α感受性細胞であるＬ９２９細胞を用いた細胞障害抑制作用を検討した。その結果、ザクロ花部やその抽出液、抽出エキスが、抗ＴＮＦ−α作用を示すことを見出し、この第２の態様の発明を完成したのである。 The present inventor uses anti-TNF-α for a pomegranate flower part, an extract obtained by extracting the pomegranate flower part with water or a lower aliphatic alcohol, or an extract obtained by concentrating the extract. As an index for evaluation of activity as an agent, cytotoxicity-inhibiting action using L929 cells, which are TNF-α sensitive cells, was examined. As a result, it was found that the pomegranate flower part, the extract thereof, and the extract extract exhibit an anti-TNF-α action, and the invention of the second aspect has been completed.
本発明者は、さらに、前記の抽出液又は抽出エキスを分離、精製し、含有成分の詳細な探索等を行うとともに、この分離、精製により得られた化合物について、ヒト肝がん由来細胞であるＨｅｐＧ２細胞を用いた脂肪蓄積・代謝改善作用、及びＬ９２９細胞を用いた抗ＴＮＦ−α作用を検討したところ、前記の含有成分の中に、脂肪蓄積・代謝改善作用及び抗ＴＮＦ−α作用を有する化合物が含まれていることを見出し、さらに又、これらの化合物の中に新規なトリテルペン化合物が含まれていることを見出し、以下に示す態様の発明を完成した。 The inventor further isolates and purifies the extract or extract and conducts a detailed search for the components contained therein, and the compound obtained by the separation and purification is a human liver cancer-derived cell. The fat accumulation / metabolism improving action using HepG2 cells and the anti-TNF-α action using L929 cells were examined. Among the above-mentioned components, the fat accumulation / metabolism improving action and the anti-TNF-α action were found. It was found that the compound was contained, and furthermore, it was found that a novel triterpene compound was contained in these compounds, and the invention of the embodiment shown below was completed.
すなわち本発明は、その第３の態様として、下記の構造式（１）で表される新規なトリテルペン化合物（請求項３）を提供する。 That is, this invention provides the novel triterpene compound (Claim 3) represented by following Structural formula (1) as the 3rd aspect.
本発明は、さらに、その第４の態様として、構造式（１）で表されるトリテルペン化合物を有効成分として含むことを特徴とする脂肪蓄積・代謝改善剤（請求項４）、及び構造式（１）で表されるトリテルペン化合物を有効成分として含むことを特徴とする抗ＴＮＦ−α作用剤（請求項５）を提供する。 According to a fourth aspect of the present invention, there is provided a fat accumulation / metabolism improving agent comprising a triterpene compound represented by the structural formula (1) as an active ingredient (claim 4), and a structural formula ( An anti-TNF-α agonist (claim 5) is provided, which comprises the triterpene compound represented by 1) as an active ingredient.
前記の第１の態様及び第４の態様の脂肪蓄積・代謝改善剤は、脂肪蓄積抑制作用ならびに細胞内脂肪代謝促進作用を有するため、これを含有させることにより、脂肪蓄積・代謝改善作用を有するヒト又は動物用の医薬や健康食品等の食品を得ることができる。そこで、本発明は、さらに又、その第５の態様として、前記の第１の態様の脂肪蓄積・代謝改善剤（請求項１）又は前記の第４の態様の脂肪蓄積・代謝改善剤（請求項４）を含有することを特徴とする医薬（請求項６）、並びに、前記の第１の態様の脂肪蓄積・代謝改善剤（請求項１）及び前記の第４の態様の脂肪蓄積・代謝改善剤（請求項４）を含有することを特徴とする食品（請求項７）を提供する。 Since the fat accumulation / metabolism improving agent of the first aspect and the fourth aspect has a fat accumulation suppressing action and an intracellular fat metabolism promoting action, the inclusion thereof contains a fat accumulation / metabolism improving action. Foods such as human or animal medicines and health foods can be obtained. Accordingly, the fifth aspect of the present invention is the fat accumulation / metabolism improving agent of the first aspect (Claim 1) or the fat accumulation / metabolism improving agent of the fourth aspect (Claim). (4), a drug for improving fat accumulation / metabolism according to the first aspect (Claim 1), and a fat accumulation / metabolism according to the fourth aspect A food (Claim 7) characterized by containing an improving agent (Claim 4) is provided.
前記の第２の態様及び第４の態様の抗ＴＮＦ−α作用剤は、ＴＮＦ−αにより惹起される生物学的応答を抑制することから、これを含有させることにより、体内での過剰なＴＮＦ−αの産生により発症および憎悪が報告されている各種疾病（リウマチ、糖尿病、メタボリックシンドロームなど）の改善または予防効果を有するヒトまたは動物用の医薬や健康食品等の食品を得ることができる。そこで、本発明は、さらに又、その第６の態様として、前記の第２の態様の抗ＴＮＦ−α作用剤（請求項２）又は第４の態様の抗ＴＮＦ−α作用剤（請求項５）を含有することを特徴とする医薬（請求項８）、並びに、前記の第２の態様の抗ＴＮＦ−α作用剤又は第４の態様の抗ＴＮＦ−α作用剤を含有することを特徴とする食品（請求項９）を提供する。 Since the anti-TNF-α agonists of the second and fourth aspects suppress the biological response induced by TNF-α, the inclusion of this causes excessive TNF in the body. -Foods such as pharmaceuticals and health foods for humans or animals having an effect of improving or preventing various diseases (rheumatic, diabetes, metabolic syndrome, etc.) that have been reported onset and hatred due to the production of α can be obtained. Therefore, the present invention also provides, as a sixth aspect, the anti-TNF-α agonist of the second aspect (Claim 2) or the anti-TNF-α agonist of the fourth aspect (Claim 5). And a medicine (Claim 8), and the anti-TNF-α agonist according to the second aspect or the anti-TNF-α agonist according to the fourth aspect. A food product (claim 9) is provided.
本発明の第１の態様の脂肪蓄積・代謝改善剤は、ヒト肝がん由来細胞であるＨｅｐＧ２細胞を用いた細胞内脂肪蓄積抑制作用および細胞内脂肪代謝促進作用を示し、脂肪蓄積・代謝改善剤としての優れた活性を有する。又、本発明の第２の態様の抗ＴＮＦ−α作用剤は、ＴＮＦ−α感受性細胞として知られているＬ９２９細胞のＴＮＦ−αにより惹起される細胞死に対する抑制作用を示し、抗ＴＮＦ−α作用剤としての優れた活性を有する。 The agent for improving fat accumulation / metabolism according to the first aspect of the present invention exhibits an action for suppressing intracellular fat accumulation and an action for promoting intracellular fat metabolism using HepG2 cells, which are cells derived from human liver cancer, and improves fat accumulation / metabolism. Excellent activity as an agent. In addition, the anti-TNF-α agonist of the second aspect of the present invention exhibits an inhibitory action against cell death caused by TNF-α of L929 cells known as TNF-α-sensitive cells, and is anti-TNF-α. Excellent activity as an agent.
本発明の第３の態様の構造式（１）で表される新規なトリテルペン化合物は、脂肪蓄積・代謝改善剤としての優れた活性、及び、抗ＴＮＦ−α作用剤としての優れた活性を有する。そこで、この新規なトリテルペン化合物を有効成分として含むことを特徴とする、本発明の第４の態様の脂肪蓄積・代謝改善剤は、前記の第１の態様の脂肪蓄積・代謝改善剤と同様に、脂肪蓄積・代謝改善剤としての優れた活性を有する。又、この新規なトリテルペン化合物を有効成分として含むことを特徴とする、本発明の第４の態様の抗ＴＮＦ−α作用剤は、前記の第２の態様の抗ＴＮＦ−α作用剤と同様に、抗ＴＮＦ−α作用剤としての優れた活性を有する。 The novel triterpene compound represented by the structural formula (1) of the third aspect of the present invention has excellent activity as a fat accumulation / metabolism improving agent and excellent activity as an anti-TNF-α agonist. . Therefore, the fat accumulation / metabolism improving agent according to the fourth aspect of the present invention, which contains the novel triterpene compound as an active ingredient, is the same as the fat accumulation / metabolism improving agent according to the first aspect. It has excellent activity as a fat accumulation / metabolism improving agent. Further, the anti-TNF-α agonist of the fourth aspect of the present invention, which contains this novel triterpene compound as an active ingredient, is the same as the anti-TNF-α agonist of the second aspect. And has excellent activity as an anti-TNF-α agonist.
さらに、本発明の第５の態様の医薬や食品は、優れた脂肪蓄積抑制および脂肪代謝改善効果を示し、又、本発明の第６の態様の医薬や食品は、抗ＴＮＦ−α作用を示す。 Furthermore, the medicament or food of the fifth aspect of the present invention exhibits excellent fat accumulation suppression and fat metabolism improving effects, and the medicament or food of the sixth aspect of the present invention exhibits anti-TNF-α action. .
次に、本発明を実施するための最良の形態につき説明するが、本発明の範囲はこの実施の形態のみに限定されるものではない。 Next, although the best mode for carrying out the present invention will be described, the scope of the present invention is not limited only to this embodiment.
本発明の第１の態様の脂肪蓄積・代謝改善剤としては、
・ザクロの花部を有効成分として含むもの、
・ザクロの花部を水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により抽出して得られる抽出液を有効成分として含むもの、及び
・前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキスを有効成分として含むもの
を挙げることができる。
As the fat accumulation / metabolism improving agent of the first aspect of the present invention,
・ Containing pomegranate flower as an active ingredient,
・ Effective extract extract obtained by extracting pomegranate flower with water, lower aliphatic alcohol or water containing lower aliphatic alcohol as an active ingredient, and extract obtained by concentrating the extract What is included as a component can be mentioned.
ザクロ花部を有効成分として含むものの場合は、ザクロ花部をそのまま用いることができるし、又は、粉砕、破砕、切断、すりつぶしなどによる形状変化を行ったもの、もしくは、乾燥などの調製を実施したものを用いることもできる。 In the case of the one containing the pomegranate flower part as an active ingredient, the pomegranate flower part can be used as it is, or the one subjected to shape change by crushing, crushing, cutting, grinding or the like, or the preparation such as drying was carried out Things can also be used.
ザクロ花部を、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により抽出して得られる抽出液を用いる場合、この抽出液は、ザクロの花部をそのまま、水、低級脂肪族アルコール及び低級脂肪族アルコールの含水物より選ばれる抽出溶媒により、抽出して得ることもできるが、ザクロの花部を、粉砕、破砕、切断、すりつぶしなどによる形状変化を行ったものを用いて抽出する方法が、抽出効率の面で好ましい。 When using an extract obtained by extracting the pomegranate flower part with water, a lower aliphatic alcohol or a hydrated product of a lower aliphatic alcohol, the extract uses the pomegranate flower part as it is, water, a lower aliphatic alcohol and A method of extracting pomegranate flower parts using a pulverized, crushed, cut, crushed shape, etc., which can be obtained by extraction with an extraction solvent selected from waters containing lower aliphatic alcohols Is preferable in terms of extraction efficiency.
抽出溶媒として用いられるアルコールとしては、炭素数１〜４の低級アルコール類が挙げられ、具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール又はこれらの混液が挙げられる。抽出溶媒として好ましくは、これらのアルコール、又はこれらのアルコールに３０容量％までの水を含有する含水アルコールが用いられる。前記のアルコールの中でもメタノール又はエタノールが好ましい。これらの抽出溶媒は、抽出材料に対して、１〜５０倍（重量）程度、好ましくは１０〜３０倍程度用いられる。 Examples of the alcohol used as the extraction solvent include lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms, specifically, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, t-butanol, or a mixed solution thereof. It is done. As the extraction solvent, these alcohols or hydrous alcohols containing up to 30% by volume of water in these alcohols are preferably used. Of the above alcohols, methanol or ethanol is preferred. These extraction solvents are used in an amount of about 1 to 50 times (weight), preferably about 10 to 30 times the extraction material.
抽出温度は、室温〜溶媒の沸点の間で任意に設定できるが、５０℃〜抽出溶媒の沸点の温度が抽出効率を上げるためには好ましい。抽出は、前記の抽出材料、即ち、ザクロの花部、又は、それを粉砕、破砕、切断、すりつぶしなどによる形状変化を行ったもの等を、前記の抽出溶媒に浸漬することにより行うことができる。抽出は、振盪下もしくは非振盪下または還流下に行うことができるが、抽出効率を上げるためには、通常、振盪下または還流下に行うことが適当である。 The extraction temperature can be arbitrarily set between room temperature and the boiling point of the solvent, but a temperature from 50 ° C. to the boiling point of the extraction solvent is preferable for increasing the extraction efficiency. Extraction can be performed by immersing the extraction material, i.e., the pomegranate flower part, or the shape of the pomegranate flower part that has been crushed, crushed, cut, ground, or the like, in the extraction solvent. . The extraction can be carried out with shaking or non-shaking or refluxing. In order to increase the extraction efficiency, it is usually appropriate to carry out the shaking or refluxing.
好ましい抽出時間は、抽出温度や抽出の際の振盪の有無等により変動し、特に限定されない。例えば、抽出材料を振盪下に浸漬する場合には、３０分間〜１０時間程度行うのが適当であり、非振盪下に浸漬する場合には、１時間〜２０日間程度行うのが適当である。又、抽出溶媒の還流下に抽出するときは、３０分間〜数時間加熱還流するのが好ましい。なお、５０℃より低い温度で浸漬して抽出することも可能であるが、その場合には、前記の時間よりも長時間浸漬するのが好ましい。抽出操作は、同一材料について１回だけ行ってもよいが、複数回、例えば２〜５回程度繰り返すのが好ましい。 The preferred extraction time varies depending on the extraction temperature and the presence or absence of shaking during extraction, and is not particularly limited. For example, when the extraction material is immersed under shaking, it is appropriate to carry out for about 30 minutes to 10 hours, and when it is immersed under non-shaking, it is appropriate to carry out for about 1 hour to 20 days. Moreover, when extracting under reflux of an extraction solvent, it is preferable to heat to reflux for 30 minutes to several hours. In addition, although it is also possible to extract by immersing at a temperature lower than 50 ° C., it is preferable to immerse for a longer time than the above time. The extraction operation may be performed only once for the same material, but is preferably repeated a plurality of times, for example, about 2 to 5 times.
前記の抽出により得られた抽出液にはザクロ花部の含有成分が溶出されている。本発明の脂肪蓄積・代謝改善剤には、このようにして得られた抽出液をそのまま加えてもよいが、前記抽出液を濃縮した抽出エキスを有効成分として用いてもよい。 The components of the pomegranate flower part are eluted in the extract obtained by the above extraction. The extract thus obtained may be added as it is to the fat accumulation / metabolism improving agent of the present invention, but an extract obtained by concentrating the extract may be used as an active ingredient.
抽出液の濃縮は、低温で減圧下に行うのが好ましい。なお、濃縮する前に抽出液を濾過して濾液を濃縮してもよい。抽出エキスは、濃縮したままの状態で脂肪代謝改善剤として用いることができる。また、濃縮は乾固するまで行ってもよく、粉末状又は凍結乾燥品等として用いてもよい。濃縮する方法、粉末状及び凍結乾燥品とする方法は、当該分野での公知の方法を用いることができる。 Concentration of the extract is preferably performed at a low temperature and under reduced pressure. Note that the filtrate may be concentrated by filtering the extract before concentration. The extract can be used as a fat metabolism improving agent in a concentrated state. Further, the concentration may be performed until it is solidified, or may be used as a powder or lyophilized product. As a method of concentrating, a method of forming a powder and a lyophilized product, a method known in the art can be used.
このようにして得られる抽出液又は抽出エキスを、精製処理に付し、含有される各成分に分離することができる。そして、分離された成分中には、脂肪代謝改善作用を有する化合物が含まれており、これらも用いることができる（本発明の第３、第４の態様）。 The extract or extract thus obtained can be subjected to a purification treatment and separated into each component contained. The separated component contains a compound having an action of improving fat metabolism, and these can also be used (third and fourth aspects of the present invention).
精製処理は、例えば、クロマトグラフ法、イオン交換樹脂を使用する溶離法、溶媒による分配抽出等を単独、又は組み合わせて採用することができる。クロマトグラフ法としては、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、遠心液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を挙げることができ、これらのいずれか、又はそれらを組み合わせで行う方法が挙げられる。この際の担体、溶出溶媒等の精製条件は、各種クロマトグラフィーに対応して適宣選択することができる。 As the purification treatment, for example, a chromatographic method, an elution method using an ion exchange resin, partition extraction with a solvent, or the like can be employed alone or in combination. Examples of chromatographic methods include normal phase chromatography, reverse phase chromatography, thin layer chromatography, centrifugal liquid chromatography, high performance liquid chromatography, and the like, and any one of these or a combination thereof may be used. Can be mentioned. In this case, purification conditions such as a carrier and an elution solvent can be appropriately selected according to various chromatographies.
抽出液又は抽出エキスを、精製処理に付し、各成分に分離することにより、前記の構造式（１）で表される新規トリテルペン化合物を得ることができる。この新規化合物を、プニカノール酸（Ｐｕｎｉｃａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）と命名した。 A novel triterpene compound represented by the above structural formula (1) can be obtained by subjecting the extract or extract to purification treatment and separating it into each component. This new compound was named Punicanolic acid.
前記のように、ザクロの花部、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物によりザクロ花部を抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、及び、前記構造式（１）で表される新規トリテルペン化合物は、脂肪代謝改善剤としての活性評価の指標として実施したヒト肝がん由来細胞であるＨｅｐＧ２細胞を用いた細胞内脂肪蓄積抑制作用および細胞内脂肪代謝促進作用試験において、活性が見出された。 As described above, a pomegranate flower part, water, an extract obtained by extracting a pomegranate flower part with a water containing a lower aliphatic alcohol or a lower aliphatic alcohol, an extract obtained by concentrating the extract, and The novel triterpene compound represented by the structural formula (1) has an inhibitory effect on intracellular fat accumulation using HepG2 cells, which are cells derived from human liver cancer, as an index for evaluating activity as an agent for improving fat metabolism. The activity was found in the internal fat metabolism promoting action test.
この脂肪蓄積抑制作用試験は、ヒト肝がん由来細胞であるＨｅｐＧ２細胞を用い、オレイン酸−アルブミンおよび被検サンプルを含む培地にて培養し、細胞内に蓄積される脂肪量の指標として細胞内中性脂肪（ＴＧ）量を測定したものである。これにより、肝細胞における脂肪蓄積抑制作用の高い検体は、肝臓における脂肪蓄積（脂肪肝）を抑制すると判断される。従って、ザクロの花部、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物によりザクロ花部を抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、及び、前記構造式（１）で表される新規トリテルペン化合物は、脂肪蓄積抑制剤として用いることができる。 This fat accumulation inhibitory action test uses HepG2 cells, which are cells derived from human liver cancer, and is cultured in a medium containing oleic acid-albumin and a test sample, and is used as an indicator of the amount of fat accumulated in the cells. The amount of neutral fat (TG) was measured. Thus, it is determined that a specimen having a high fat accumulation inhibitory effect on hepatocytes suppresses fat accumulation (fatty liver) in the liver. Accordingly, a pomegranate flower part, water, an extract obtained by extracting a pomegranate flower part with a water containing a lower aliphatic alcohol or a lower aliphatic alcohol, an extract obtained by concentrating the extract, and the structure The novel triterpene compound represented by the formula (1) can be used as a fat accumulation inhibitor.
一方、脂肪代謝促進作用試験は、同じくＨｅｐＧ２細胞を用い、高濃度グルコースを含む培地にて培養し細胞内に脂肪を蓄積させた後、低濃度グルコース含有培地へ交換するとともに被検サンプルを添加し、培養後の細胞内ＴＧ残存量を脂肪代謝の指標として評価したものである。これにより、肝細胞における脂肪代謝促進作用の高い検体は、肝臓における脂肪代謝を改善すると判断される。ザクロの花部、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物によりザクロ花部を抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、及び、前記構造式（１）で表される新規トリテルペン化合物は、この細胞内脂肪蓄積抑制作用および細胞内脂肪代謝促進作用試験において、活性が見出されたので、脂肪蓄積・代謝改善剤として用いられることが明らかとなった。 On the other hand, in the fat metabolism promoting action test, HepG2 cells are also used, cultured in a medium containing high-concentration glucose and accumulated in the cells, then replaced with a medium containing low-concentration glucose and a test sample is added. The amount of residual intracellular TG after culture was evaluated as an index of fat metabolism. Thereby, it is determined that a specimen having a high fat metabolism promoting action in hepatocytes improves fat metabolism in the liver. Pomegranate flower part, water, an extract obtained by extracting a pomegranate flower part with water containing a lower aliphatic alcohol or a lower aliphatic alcohol, an extract obtained by concentrating the extract, and the structural formula ( The novel triterpene compound represented by 1) was found to be used as an agent for improving fat accumulation / metabolism since it was found to be active in this intracellular fat accumulation inhibitory action and intracellular fat metabolism promoting action test. It was.
さらに、この本発明の脂肪蓄積・代謝改善剤は、医薬や食品に適用することができ、この脂肪代謝改善剤を含有させることにより優れた脂肪蓄積・代謝改善効果を有する医薬や食品を製造することができる。 Furthermore, the fat accumulation / metabolism improving agent of the present invention can be applied to medicines and foods, and by containing the fat metabolism improving agent, a drug or food having an excellent effect of improving fat accumulation / metabolism is produced. be able to.
又、前記のように、ザクロの花部、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物によりザクロ花部を抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、及び、前記構造式（１）で表される新規トリテルペン化合物は、抗ＴＮＦ−α作用の試験で、抗ＴＮＦ−α作用を有することが判明した。 In addition, as described above, an extract obtained by extracting a pomegranate flower part with a pomegranate flower part, water, a lower aliphatic alcohol or a water content of a lower aliphatic alcohol, and an extract obtained by concentrating the extract And, the novel triterpene compound represented by the structural formula (1) was found to have an anti-TNF-α action in an anti-TNF-α action test.
この抗ＴＮＦ−α作用の試験では、ＴＮＦ−α感受性でマウス由来細胞であるＬ９２９細胞を用い、被験物質共存下、培養液中にＴＮＦ−αを添加した場合に観察される細胞死または細胞増殖の抑制に対する抑制活性についてＭＴＴアッセイ法を利用して判定する。これにより、培養液中のＴＮＦ−αにより惹起される細胞障害を抑制する物質は、ＴＮＦ−αによる生物学的な応答を抑制しており、即ち、ＴＮＦ−αにより発症および増悪が考えられる疾病群の治療剤または予防剤として利用できる。従って、ザクロの花部、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物によりザクロ花部を抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、及び、前記構造式（１）で表される新規トリテルペン化合物は、抗ＴＮＦ−α作用剤として用いられることが明らかとなった。 In this anti-TNF-α test, cell death or cell proliferation observed when TNF-α-sensitive and mouse-derived L929 cells are used and TNF-α is added to the culture medium in the presence of the test substance. The inhibitory activity against the inhibition of the protein is determined using the MTT assay. Thus, the substance that suppresses cell damage caused by TNF-α in the culture solution suppresses the biological response caused by TNF-α, that is, a disease that is thought to develop or worsen by TNF-α. It can be used as a therapeutic or prophylactic agent for groups. Accordingly, a pomegranate flower part, water, an extract obtained by extracting a pomegranate flower part with a water containing a lower aliphatic alcohol or a lower aliphatic alcohol, an extract obtained by concentrating the extract, and the structure It has been clarified that the novel triterpene compound represented by the formula (1) is used as an anti-TNF-α agonist.
さらに、本発明の抗ＴＮＦ−α作用剤は、医薬や食品に適用することができ、この抗ＴＮＦ−α作用剤を含有させることにより優れた抗ＴＮＦ−α作用を有する医薬や食品を製造することができる。 Furthermore, the anti-TNF-α agonist of the present invention can be applied to medicines and foods, and a pharmaceutical or food having an excellent anti-TNF-α action is produced by containing this anti-TNF-α agent. be able to.
本発明の脂肪蓄積・代謝改善剤や抗ＴＮＦ−α作用剤を医薬に適用する場合、ザクロの花部、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物によりザクロ花部を抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、又は前記構造式（１）で表される新規トリテルペン化合物を、そのままの状態で又は適当な媒体で希釈して、医薬品等の製造分野における公知の方法により、製造することができる。医薬品として使用する形態としては、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又は液剤等の種々の形態を挙げることができる。 When the fat accumulation / metabolism improving agent or anti-TNF-α agonist of the present invention is applied to a medicine, the pomegranate flower part is extracted with a pomegranate flower part, water, a lower aliphatic alcohol, or a lower aliphatic alcohol hydrate. The extract obtained, the extract obtained by concentrating the extract, or the novel triterpene compound represented by the structural formula (1) is diluted as it is or with an appropriate medium to produce a pharmaceutical product, etc. It can be produced by a known method in the field. As a form used as a pharmaceutical, various forms, such as a powder, a granule, a tablet, a capsule, or a liquid agent, can be mentioned.
これらの形態においては、適当な媒体を添加してもよい。適当な媒体としては、医薬的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガント又はポリビニルピロリドン）、充填剤（例えば乳糖、砂糖、トウモロコシ澱粉、リン酸カルシウム、ソルビトール又はグリシン）、錠剤用滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール又はシリカ）、崩壊剤（例えば馬鈴薯澱粉）又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）等が挙げられる。 In these forms, an appropriate medium may be added. Suitable vehicles include pharmaceutically acceptable excipients such as binders (eg syrup, gum arabic, gelatin, sorbitol, tragacanth or polyvinylpyrrolidone), fillers (eg lactose, sugar, corn starch, calcium phosphate, sorbitol). Or glycine), a lubricant for tablets (for example, magnesium stearate, talc, polyethylene glycol or silica), a disintegrant (for example, potato starch) or a wetting agent (for example, sodium lauryl sulfate).
錠剤とする場合は、通常の製薬における周知の方法でコートしてもよい。液体製剤とする場合は、例えば水性又は油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ又はエリキシルの形態であってもよい。又、使用前に水や他の適切な賦形剤と混合する乾燥製品として提供してもよい。 In the case of a tablet, it may be coated by a well-known method in ordinary pharmaceuticals. In the case of a liquid preparation, it may be in the form of, for example, an aqueous or oily suspension, solution, emulsion, syrup or elixir. It may also be provided as a dry product that is mixed with water or other suitable excipients prior to use.
こうした液体製剤は、通常の添加剤、例えば、ソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン水添加食用脂等の懸濁化剤、レシチン、ソルビタンモノオレエート、アラビアゴム等の乳化剤（食用脂を含んでもよい）、アーモンド油、分画ココヤシ油又はグリセリン、プロピレングリコールやエチレングリコールのような油性エステル等の非水性賦形剤、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル又はソルビン酸等の保存剤、を含んでもよく、さらに所望により着色剤又は香料等を含んでもよい。 These liquid preparations contain ordinary additives such as suspending agents such as sorbitol, syrup, methylcellulose, glucose syrup, gelatin water-added edible fat, and emulsifiers (including edible fat, lecithin, sorbitan monooleate, gum arabic). ), Non-aqueous excipients such as almond oil, fractionated coconut oil or glycerin, oily esters such as propylene glycol and ethylene glycol, preservatives such as methyl or propyl p-hydroxybenzoate or sorbic acid It may also include a colorant or a fragrance, if desired.
本発明の脂肪蓄積・代謝改善剤や抗ＴＮＦ−α作用剤を食品に適用する場合、ザクロの花部、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物によりザクロ花部を抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、前記構造式（１）で表される新規トリテルペン化合物は、それぞれ単独で、又は混合物として食品に含有させ、食品に前記の効果を与えることができる。ここで言う食品には健康食品も含まれる。 When the fat accumulation / metabolism improving agent or anti-TNF-α agonist of the present invention is applied to foods, the pomegranate flower part is extracted with the pomegranate flower part, water, a lower aliphatic alcohol or a hydrated product of the lower aliphatic alcohol. The obtained extract, the extract obtained by concentrating the extract, and the novel triterpene compound represented by the structural formula (1) are each contained alone or as a mixture in a food, and the food has the effects described above. Can be given. The foods mentioned here include health foods.
ここで健康食品とは、通常の食品よりも積極的な意味で、保健、健康維持・増進等を目的とした食品を意味する。食品又は健康食品の形態としては、例えば、液体又は半固形、固形の製品、具体的には散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又は液剤等のほか、クッキー、せんべい、ゼリー、ようかん、ヨーグルト、まんじゅう等の菓子類、清涼飲料、お茶類、栄養飲料、スープ等の形態が挙げられる。これらの食品の製造工程において、あるいは最終製品に、前記の抽出物、抽出エキス、及び／又は化合物を混合又は塗布、噴霧などにより添加して、健康食品とすることができる。 Here, the health food means a food that is more active than a normal food and is intended for health, health maintenance and promotion. As the form of food or health food, for example, liquid or semi-solid, solid products, specifically powders, granules, tablets, capsules or liquids, cookies, rice crackers, jelly, yokan, yogurt, manju And other forms of confectionery, soft drinks, teas, nutritional drinks, soups and the like. In the production process of these foods, or in the final product, the aforementioned extract, extract extract and / or compound can be added by mixing, coating, spraying, or the like to obtain a health food.
本発明の医薬又は食品における、前記抽出液、抽出エキス、前記構造式（１）で表される新規トリテルペン化合物の使用量は、濃縮、精製の程度、活性の強さ等、使用目的、対象疾患や自覚症状の程度、使用者の体重、年齢等によって適宣調整される。例えば、医薬として成人について使用する場合は、１回の投与毎に、抽出液又は抽出エキスでは、１ｍｇ〜２０ｇ程度の範囲で使用し、この範囲内で精製度や水分含量等に応じて調整することが適当な場合が多い。又、前記化合物を使用する場合は、１ｍｇ〜１ｇ程度が適当な場合が多い。 The amount of the extract, extract, and novel triterpene compound represented by the structural formula (1) used in the pharmaceutical or food of the present invention is the concentration, the degree of purification, the strength of activity, the purpose of use, the target disease And the degree of subjective symptoms, weight of the user, age, etc. For example, when used for adults as a medicine, for each administration, the extract or extract is used in the range of about 1 mg to 20 g, and adjusted within this range according to the degree of purification, water content, etc. Is often appropriate. Moreover, when using the said compound, 1 mg-about 1g are suitable in many cases.
又、健康食品として使用する場合は、食品の味や外観に悪影響を及ぼさない量、例えば、対象となる食品１ｋｇに対して、前記の抽出液又は抽出エキス、前記構造式（１）で表される新規トリテルペン化合物を、１ｍｇ〜２０ｇ程度の範囲で添加することが適当な場合が多い。 In addition, when used as a health food, it is expressed by the above extract or extract, the structural formula (1), for an amount that does not adversely affect the taste and appearance of the food, for example, 1 kg of the target food. It is often appropriate to add a novel triterpene compound in the range of about 1 mg to 20 g.
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。なお、以下の実施例では、特に記載がない限り、以下の各種溶媒、濾紙、クロマトグラフィー用担体及びＨＰＬＣカラムを用いた。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the examples do not limit the scope of the present invention. In the following examples, the following various solvents, filter paper, chromatography carrier and HPLC column were used unless otherwise specified.
［溶媒］
メタノール：ナカライテスク社製、試薬一級
酢酸エチル：ナカライテスク社製、試薬一級
アセトン：ナカライテスク社製、試薬一級
ｎ−ヘキサン：ナカライテスク社製、試薬一級
ＨＰＬＣ用メタノール：ナカライテスク社製、試薬特級
ＨＰＬＣ用アセトニトリル：フィッシャーサイエンス社製、試薬特級
酢酸：ナカライテスク社製、試薬特級
[solvent]
Methanol: Nacalai Tesque, reagent grade ethyl acetate: Nacalai Tesque, grade reagent Acetone: Nacalai Tesque, grade reagent n-Hexane: Nacalai Tesque, grade reagent HPLC methanol: Nacalai Tesque, grade reagent Acetonitrile for HPLC: Fischer Science Co., reagent special grade Acetic acid: Nacalai Tesque, reagent special grade
［濾紙］ アドバンテック社製：Ｎｏ．２ [Filter paper] Advantech: No. 2
［クロマトグラフィー用担体］
順相シリカゲルカラムクロマトグラフ用担体：関東化学社製、Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０Ｎ（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ，ｎｅｕｔｒａｌ、６３〜２１０メッシュ）、ＢＷ−２００（１５０〜３００メッシュ）
逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフ用担体：富士シリシア社製、Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ１０２０Ｔ（１００〜２００メッシュ）
多孔質ポリマーカラムクロマトグラフ用担体：日本練水社製、ダイアイオンＨＰ−２０
[Chromatographic carrier]
Normal phase silica gel column chromatographic carrier: manufactured by Kanto Chemical Co., Silica Gel 60N (spherical, neutral, 63-210 mesh), BW-200 (150-300 mesh)
Carrier for reverse phase ODS column chromatography: manufactured by Fuji Silysia, Chromatorex ODS1020T (100-200 mesh)
Carrier for porous polymer column chromatograph: Nippon Nersui Co., Ltd., Diaion HP-20
［ＨＰＬＣカラム］
ナカライテスク社製、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＭＳ−II、２０ｍｍ（ｉ．ｄ．）×２５０ｍｍ
和光純薬工業社製、Ｗａｋｏｐａｋ Ｎａｖｉ Ｃ３０−５、２０ｍｍ（ｉ．ｄ．）×２５０ｍｍ
[HPLC column]
Nacalai Tesque, Cosmosil 5C 18 -MS-II, 20mm (i.d.) × 250mm
Wakopak Navi C30-5, 20 mm (id) x 250 mm, manufactured by Wako Pure Chemical Industries
実施例１ ザクロ花部のメタノール抽出エキスの調製
ザクロの乾燥花部５１０ｇを粉砕し、これに約１０倍量のメタノール（５Ｌ）を加え、加熱還流下３時間抽出した。抽出後、ひだ折り濾紙で濾過した後、抽出残渣に新たに約１０倍量のメタノール（５Ｌ）を加え、同様の抽出操作を計３回実施した。抽出液をあわせ、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下、溶媒を留去したところ、ザクロ花部のメタノール抽出エキス３０５ｇ（乾燥原料からの収率５９．８％）を得た。
Example 1 Preparation of Methanol Extract Extract of Pomegranate Flower Part 510 g of dried flower part of pomegranate was pulverized, and about 10 times the amount of methanol (5 L) was added thereto, followed by extraction with heating under reflux for 3 hours. After extraction, the mixture was filtered through a fold filter paper, and about 10 times the amount of methanol (5 L) was newly added to the extraction residue, and the same extraction operation was performed three times in total. The extracts were combined and the solvent was distilled off under reduced pressure using a rotary evaporator to obtain 305 g of a pomegranate flower part methanol extract (yield 59.8% from dry raw material).
実施例２ メタノール抽出エキスの分画
前記のメタノール抽出エキス（２５５ｇ）に水（約２．５Ｌ）を加えて懸濁し、懸濁液に同容量の酢酸エチル（約２．５Ｌ）を加え、分液操作を実施し、酢酸エチル及び水移行部に分配した。得られた水移行部について、新たに同容量の酢酸エチルを加え、同様の分液操作を計３回実施した。各移行部をあわせ、酢酸エチル移行部について、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下に溶媒を留去して、ザクロ花部のメタノール抽出エキスの酢酸エチル移行部（４２．０ｇ）を得た。
Example 2 Fractionation of methanol extract The above methanol extract (255 g) was suspended by adding water (about 2.5 L), and the same volume of ethyl acetate (about 2.5 L) was added to the suspension. Liquid operation was performed and distributed to ethyl acetate and water transfer section. About the obtained water transfer part, the same volume ethyl acetate was newly added and the same liquid separation operation was implemented 3 times in total. The transition parts were combined, and the ethyl acetate transition part was distilled off under reduced pressure using a rotary evaporator to obtain an ethyl acetate transition part (42.0 g) of the methanol extract of the pomegranate flower part.
実施例３ 水移行部の調製
前記水移行部を、多孔質ポリマーカラムカラムクロマトグラフィー（ダイアイオンＨＰ−２０：２．０ｋｇ，移動相：水→メタノール→アセトン）で順次溶出し、水溶出部（１３７．３ｇ）、メタノール溶出部（５８．４ｇ）及びアセトン溶出部（６．３ｇ）を得た。
Example 3 Preparation of Water Migration Part The water migration part was sequentially eluted by porous polymer column column chromatography (Diaion HP-20: 2.0 kg, mobile phase: water → methanol → acetone), and the water elution part ( 137.3 g), a methanol elution part (58.4 g) and an acetone elution part (6.3 g) were obtained.
実施例４ 酢酸エチル移行部の分離及び精製
前記酢酸エチル移行部（３５．０ｇ）を、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（２．０ｋｇ、移動相：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル（１０／１→３／１→１／１）→酢酸エチル→メタノール）で順次溶出し、溶出画分１（１．５９ｇ）、２（０．６５ｇ）、３（０．１０ｇ）、４（＝オレアノール酸（ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ、０．４０ｇ、０．１１％））、５（２．３８ｇ）、６（＝ウルソール酸（ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ、０．３０ｇ、０．０８４％））、７（０．１５ｇ）、８（０．２９ｇ）、９（２５．３０ｇ）および１０（５．２８ｇ）を得た。
Example 4 Separation and Purification of Ethyl Acetate Transition Part The ethyl acetate transition part (35.0 g) was subjected to normal phase silica gel column chromatography (2.0 kg, mobile phase: n-hexane / ethyl acetate (10/1 → 3 / 1 → 1/1) → ethyl acetate → methanol), and elution fractions 1 (1.59 g), 2 (0.65 g), 3 (0.10 g), 4 (= oleanolic acid, 0.40 g, 0.11%)), 5 (2.38 g), 6 (= ursolic acid, 0.30 g, 0.084%)), 7 (0.15 g), 8 (0.29 g) ), 9 (25.30 g) and 10 (5.28 g).
実施例５
このうち、溶出画分２（０．６５ｇ）について、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（３０ｇ，移動相：メタノール→アセトン）にて分離、精製し、β−シトステロール（β−ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ、２６８．３ｍｇ、０．０７６％）を得た。
Example 5
Among them, the eluted fraction 2 (0.65 g) was separated and purified by reverse phase ODS column chromatography (30 g, mobile phase: methanol → acetone), and β-sitosterol (β-sisterol, 268.3 mg, 0 076%).
実施例６
溶出画分３（６０．０ｍｇ）について、ＨＰＬＣ（カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＭＳ−II、移動相：アセトニトリル／１％酢酸（５５／４５））にて分離、精製し、アジアチコ酸（ａｓｉａｔｉｃ ａｃｉｄ、４．０ｍｇ、０．００１９％）を得た。
Example 6
For elution fraction 3 (60.0 mg), HPLC separation in (column:: Cosmosil 5C 18 -MS-II , mobile phase acetonitrile / 1% acetic acid (55/45)), purified, Ajiachiko acid (asiatic acid, 4.0 mg, 0.0019%) was obtained.
実施例７
溶出画分５（５００ｍｇ）について、ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｋｏｐａｋ Ｎａｖｉ Ｃ３０−５、移動相：アセトニトリル／水（９５／５））にて分離、精製し、オレアノール酸（ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ，１３４．４ｍｇ，０．１８％）およびウルソール酸（ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ、２００．３ｍｇ、０．２７％）を得た。
Example 7
Elution fraction 5 (500 mg) was separated and purified by HPLC (column: Wakopak Navi C30-5, mobile phase: acetonitrile / water (95/5)), and oleanolic acid (134.4 mg, 0. 4). 18%) and ursolic acid (ursolic acid, 200.3 mg, 0.27%).
実施例８
溶出画分７（１５０ｍｇ）について、ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｋｏｐａｋ Ｎａｖｉ Ｃ３０−５、移動相：アセトニトリル／水（９５／５））にて分離、精製し、溶出画分７−１（＝プニカノール酸（Ｐｕｎｉｃａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ（１７．８ｍｇ、０．００７１％））、７−２（１４．７ｍｇ）、７−３（１６．７ｍｇ）、７−４（６．５ｍｇ）、７−５（８．１ｍｇ）、７−６（５．６ｍｇ）、７−７（＝オレアノール酸、９．７ｍｇ、０．００２７％）、７−８（＝ウルソール酸、２５．４ｍｇ、０．００７１％）を得た。溶出画分７−３（１６．７ｍｇ）について、更にＨＰＬＣ（カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＭＳ−II、移動相：アセトニトリル／１％酢酸（５５／４５））にて分離、精製し、マスリニン酸（ｍａｓｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ、２．０ｍｇ、０．０００６％）を得た。
Example 8
The eluted fraction 7 (150 mg) was separated and purified by HPLC (column: Wakopak Navi C30-5, mobile phase: acetonitrile / water (95/5)), and eluted fraction 7-1 (= punicanolic acid (Punicanolic acid)). acid (17.8 mg, 0.0071%)), 7-2 (14.7 mg), 7-3 (16.7 mg), 7-4 (6.5 mg), 7-5 (8.1 mg), 7 -6 (5.6 mg), 7-7 (= oleanolic acid, 9.7 mg, 0.0027%), 7-8 (= ursolic acid, 25.4 mg, 0.0071%) were obtained. About 7-3 (16.7 mg), further HPLC separation in (column:: Cosmosil 5C 18 -MS-II , mobile phase acetonitrile / 1% acetic acid (55/45)), purified, Masurinin acid (masl nic acid, to give 2.0mg, 0.0006%).
実施例９
溶出画分９（２５．３０ｇ）について、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（１．０ｋｇ、移動相：メタノール／水（２０／８０→４０／６０→６０／４０）→メタノール→アセトン）にて分離、精製し、溶出画分９−１（１１５８．１ｍｇ）、９−２（２７２６．３ｍｇ）、９−３（１６６６．７ｍｇ）、９−４（１１５３．１ｍｇ）、９−５（９３６４．２ｍｇ）、９−７（１０６３．５ｍｇ）、９−８（１２８５．６ｍｇ）、９−９（９３．８ｍｇ）、９−１０（１１７．８ｍｇ）、９−１１（９５１．４ｍｇ）を得た。
Example 9
Elution fraction 9 (25.30 g) was separated by reverse phase ODS column chromatography (1.0 kg, mobile phase: methanol / water (20/80 → 40/60 → 60/40) → methanol → acetone), Purified and eluted fractions 9-1 (1158.1 mg), 9-2 (2726.3 mg), 9-3 (1666.7 mg), 9-4 (1153.1 mg), 9-5 (9364.2 mg) 9-7 (1063.5 mg), 9-8 (1285.6 mg), 9-9 (93.8 mg), 9-10 (117.8 mg), 9-11 (951.4 mg).
溶出画分９−３（５００．０ｍｇ）について、更にＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｋｏｐａｋ Ｎａｖｉ Ｃ３０−５、移動相：アセトニトリル／１％酢酸（２０／８０））にて分離、精製し、１，２−ジ−Ｏ−ガロイル−４，６−Ｏ−（Ｓ）−ヘキサヒドロキシジフェノイルβ−Ｄ−グルコピラノシド（１，２−ｄｉ−Ｏ−ｇａｌｌｏｙｌ−４，６−Ｏ−（Ｓ）−ｈｅｘａｈｙｄｒｏｘｙｄｉｐｈｅｎｏｙｌ β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、２９．７ｍｇ、０．０２８％）を得た。また、溶出画分９−４（５００．０ｍｇ）について、更にＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｋｏｐａｋ Ｎａｖｉ Ｃ３０−５、移動相：メタノール／１％酢酸（２５／７５））にて分離、精製し、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイルβ−Ｄ−グルコピラノシド（１，２，６−ｔｒｉ−Ｏ−ｇａｌｌｏｙｌ β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、２５．２ｍｇ、０．０１６％）を得た。 The eluted fraction 9-3 (500.0 mg) was further separated and purified by HPLC (column: Wakopak Navi C30-5, mobile phase: acetonitrile / 1% acetic acid (20/80)). -O-galloyl-4,6-O- (S) -hexahydroxydiphenoyl β-D-glucopyranoside (1,2-di-O-galloyl-4,6-O- (S) -hexahydroxydiphenyl β-D -Glucopyranoside, 29.7 mg, 0.028%). Further, the eluted fraction 9-4 (500.0 mg) was further separated and purified by HPLC (column: Wakopak Navi C30-5, mobile phase: methanol / 1% acetic acid (25/75)). , 6-Tri-O-galloyl β-D-glucopyranoside (1,2,6-tri-O-galloyl β-D-glucopyranoside, 25.2 mg, 0.016%) was obtained.
また、溶出画分９−８（５００．０ｍｇ）について、更にＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｋｏｐａｋ Ｎａｖｉ Ｃ３０−５、移動相：メタノール／１％酢酸（５５／４５））にて分離、精製し、ルテオリン（ｌｕｔｅｏｌｉｎ、１３．１ｍｇ、０．００９５％）を得た。また、溶出画分９−１０（１１７．８ｍｇ）について、更にＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｋｏｐａｋ Ｎａｖｉ Ｃ３０−５、移動相：メタノール／１％酢酸（５５／４５））にて分離、精製し、トリセチン（ｔｒｉｃｅｔｉｎ、１６．７ｍｇ、０．００４７％）を得た。 In addition, the eluted fraction 9-8 (500.0 mg) was further separated and purified by HPLC (column: Wakopak Navi C30-5, mobile phase: methanol / 1% acetic acid (55/45)), and luteolin (luteolin). , 13.1 mg, 0.0095%). The elution fraction 9-10 (117.8 mg) was further separated and purified by HPLC (column: Wakopak Navi C30-5, mobile phase: methanol / 1% acetic acid (55/45)), and tricetin (tricitetin). 16.7 mg, 0.0047%).
実施例８で得られた溶出画分７−１の化合物について、性状、融点、質量分析、赤外吸収スペクトル、核磁気共鳴スペクトル等の測定を行った。得られた結果を以下に示す。 About the compound of the elution fraction 7-1 obtained in Example 8, properties, melting | fusing point, mass spectrometry, an infrared absorption spectrum, a nuclear magnetic resonance spectrum, etc. were measured. The obtained results are shown below.
性状： 無色針状結晶
融点： ２８０−２８１℃
・旋光度：［α］Ｄ ２８： −７．４°（ｃ＝０．１９，ＭｅＯＨ）
・高分解能質量分析（Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＥＩ−ＭＳ）：
理論値 Ｃ３０Ｈ５０Ｏ４ （Ｍ＋） ： ４７４．３７０９
実測値 ： ４７４．３７１２
・赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ，ｃｍ１）： ３４５１，１７１９
・質量分析ＥＩ−ＭＳ： ｍ／ｚ ４７４ （Ｍ＋，４），４５６（Ｍ＋−Ｈ２Ｏ，１９），３９５（１００）
Property: colorless needle crystal Melting point: 280-281 ° C
Optical rotation: [α] D 28 : −7.4 ° (c = 0.19, MeOH)
High-resolution mass spectrometry (High-resolution EI-MS):
Theoretical value C 30 H 50 O 4 (M + ): 4744.3709
Actual value: 474.3371
Infrared absorption spectrum (KBr, cm 1 ): 3451, 1719
Mass spectrometry EI-MS: m / z 474 (M + , 4), 456 (M + -H 2 O, 19), 395 (100)
・核磁気共鳴スペクトル：
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ｐｙｒｉｄｉｎｅ−ｄ５）のδ:
0.81(dd,1.9,11.6),0.86(3H,s),0.98(m),1.01(3H,s),1.02(3H,s),1.09(3H,s),1.22(m),1.23(3H,s),1.27(m),1.28(m),1.30(m),1.37(m),1.40(2H,m),1.41(m),1.41(3H,d,6.2),1.43(3H,s),1.53(m),1.55(m),1.60(ddd,4.0,13.5,14.2),1.70(ddd,3.2,3.6,14.0),1.79(dd,10.4,10.5),1.86(m),1.86(2H,m),2.03(m),2.10(ddd,3.2,12.9,16.9),2.32(ddd,2.9,12.9,14.9),2.38(ddd,2.9,4.1,14.2),2.50(dq,10.5,6.2),2.77(ddd,4.0,10.4,14.0),3.46(dd,5.8,10.3),
１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ｐｙｒｉｄｉｎｅ−ｄ５）のδＣ:
15.3,16.4,16.5,16.8,18.8,19.0,22.0,28.3,28.7,29.8,30.0,30.9,33.9,35.2,36.1,37.4,37.5,39.3,39.5,40.0,41.0,41.7,43.1,47.9,50.5,51.4,55.9,72.5,78.2,179.3
・ Nuclear magnetic resonance spectrum:
Δ of 1 H-NMR (600 MHz, pyridine-d 5 ):
0.81 (dd, 1.9,11.6), 0.86 (3H, s), 0.98 (m), 1.01 (3H, s), 1.02 (3H, s), 1.09 (3H, s), 1.22 (m), 1.23 (3H , s), 1.27 (m), 1.28 (m), 1.30 (m), 1.37 (m), 1.40 (2H, m), 1.41 (m), 1.41 (3H, d, 6.2), 1.43 (3H, s ), 1.53 (m), 1.55 (m), 1.60 (ddd, 4.0, 13.5, 14.2), 1.70 (ddd, 3.2, 3.6, 14.0), 1.79 (dd, 10.4, 10.5), 1.86 (m), 1.86 ( 2H, m), 2.03 (m), 2.10 (ddd, 3.2, 12.9, 16.9), 2.32 (ddd, 2.9, 12.9, 14.9), 2.38 (ddd, 2.9, 4.1, 14.2), 2.50 (dq, 10.5, 6.2) ), 2.77 (ddd, 4.0, 10.4, 14.0), 3.46 (dd, 5.8, 10.3),
13 C-NMR (150 MHz, pyridine-d 5 ) δ C :
15.3, 16.4, 16.5, 16.8, 18.8, 19.0, 22.0, 28.3, 28.7, 29.8, 30.0, 30.9, 33.9, 35.2, 36.1, 37.4, 37.5, 39.3, 39.5, 40.0, 41.0, 41.7, 43.1, 47.9, 50.5, 51.4,55.9,72.5,78.2,179.3
以上の結果より、溶出画分７−１より得られた化合物は、前記構造式（１）で表される新規化合物プニカノール酸であることが判明した。 From the above results, it was found that the compound obtained from the elution fraction 7-1 was a novel compound punicanolic acid represented by the structural formula (1).
また、実施例４〜９で得られた溶出画分２、３、４、５、６、７−７、７−８、９−３、９−４、９−８、９−１０についても、質量分析、赤外吸収スペクトル、核磁気共鳴スペクトル等の測定を行い、得られた物理化学データと下記の文献１）〜１０）に記載の値との比較により同定した。 Moreover, also about the elution fractions 2, 3, 4, 5, 6, 7-7, 7-8, 9-3, 9-4, 9-8, 9-10 obtained in Examples 4-9, The mass spectrometry, infrared absorption spectrum, nuclear magnetic resonance spectrum, and the like were measured, and the obtained physicochemical data was identified by comparison with the values described in the following documents 1) to 10).
文献１） Ｓｅｅｂａｃｈｅｒ Ｗ．，Ｓｉｍｉｃ Ｎ．，Ｗｅｉｓ Ｒ．，Ｓａｆ Ｒ．，Ｋｕｎｅｒｔ Ｏ．，Ｍａｇｎ．Ｒｅｓ．Ｃｈｅｍ．，４１，６３６−６３８（２００３）
文献２） Ａｌｖｅｓ Ｊ．Ｓ．，ｄｅＣａｓｔｒｏ Ｊ．Ｃ．Ｍ．，Ｆｒｅｉｒｅ Ｍ．Ｏ．，ｄａ−Ｃｕｎｈａ Ｅ．Ｖ．Ｌ．，Ｂａｒｂｏｓａ−Ｆｉｌｈｏ Ｊ．Ｍ．，ｄｅＳｉｌｖａ Ｍ．Ｓ．，Ｍａｇｎ．Ｒｅｓ．Ｃｈｅｍ．，３８，２０１−２０６（２０００）
文献３） Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｓ．，Ｉｍａｙｏｓｈｉ Ｙ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｅ．，Ｔａｋａｍａｔｓｕ Ｙ．，Ｉｔｏ Ｈ．，Ｈａｔａｎｏ Ｔ．，Ｓａｋａｇａｍｉ Ｈ．，Ｔｏｋｕｄａ Ｈ．，Ｎｉｓｈｉｎｏ Ｈ．，Ｓｕｇｉｔａ Ｄ．，Ｓｈｉｍｕｒａ Ｓ．，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｔ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５９，３１５−３２３
文献４）Ｍａｔｓｕｄａ Ｈ．，Ｍｏｒｉｋａｗａ Ｔ．，Ｕｅｄａ Ｈ．，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｍ．，Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ，５５，１４９９−１５０４（２００１）
文献５） Ｍａｔｓｕｄａ Ｈ．，Ｍｏｒｉｋａｗａ Ｔ．，Ｕｅｄａ Ｈ．，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｍ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４９，１３６８−１３７１（２００１）
文献６） Ｈａｄｄｏｃｋ Ｅ．Ａ．，Ｇｕｐｔａ Ｒ．Ｋ．，Ａｌ−Ｓｈａｆｉ Ｓ．Ｍ．Ｋ．，Ｈａｓｌａｍ Ｅ．，Ｍａｇｎｏｌａｔｏ Ｄ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ，２５１５−２５２４（１９８２）
文献７） Ｆｕｋｕｄａ Ｔ．，Ｉｔｏ Ｈ．，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｔ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６３，７９５−８０１（２００３）
文献８） Ｍａｔｓｕｄａ Ｈ．，Ｍｏｒｉｋａｗａ Ｔ．，Ｔｏｇｕｃｈｉｄａ Ｉ．，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｍ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，５０，７８８−７９５（２００２）
文献９） Ｍａｒｋｈａｍ Ｋ．Ｒ．，Ｔｅｒｎａｉ Ｂ．，Ｓｔａｎｌｅｙ Ｒ．，Ｇｅｉｇｅｒ Ｈ．，Ｍａｂｒｙ Ｔ．Ｊ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，３４，１３８９−１３９７（１９７８）
文献１０） Ｋｏｎｇｄｕａｎｇ Ｄ．，Ｗｕｎｇｓｉｎｔａｗｅｅｋｕｌ Ｊ．，Ｄｅ−Ｅｋｎａｍｋｕｌ Ｗ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，４９，４０６７−４０７２（２００８）
Reference 1) Seebacher W. , Simic N. , Weis R .; , Saf R .; Kunert O. , Magn. Res. Chem. , 41, 636-638 (2003)
Reference 2) Alves J. et al. S. , DeCastro J. C. M.M. , Freire M. et al. O. , Da-Cunha E .; V. L. , Barbosa-Filho J. et al. M.M. , DeSilva M .; S. , Magn. Res. Chem. 38, 201-206 (2000)
Reference 3) Taniguchi S. , Imayoshi Y. et al. , Kobayashi E .; Takamatsu Y .; , Ito H. , Hatano T. , Sakagami H. et al. , Tokuda H., et al. Nishino H .; , Sugita D. et al. , Shimura S .; Yoshida T. , Phytochemistry, 59, 315-323.
Reference 4) Matsuda H. et al. , Morikawa T .; Ueda H., et al. , Yoshikawa M .; , Heterocycles, 55, 1499-1504 (2001).
Reference 5) Matsuda H. et al. , Morikawa T .; Ueda H., et al. , Yoshikawa M .; , Chem. Pharm. Bull. , 49, 1368-1371 (2001)
Reference 6) Haddock E. et al. A. , Gupta R., et al. K. , Al-Shafi S. M.M. K. Haslam E .; , Magnolato D., et al. , J .; Chem. Soc. Perkin Trans. I, 2515-2524 (1982)
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Reference 8) Matsuda H. et al. , Morikawa T .; , Toguchida I .; , Yoshikawa M .; , Chem. Pharm. Bull. , 50, 788-795 (2002)
Reference 9) Markham K. et al. R. , Ternai B. Stanley R .; Geiger H., et al. Mabry T .; J. et al. , Tetrahedron, 34, 1389-1397 (1978).
Reference 10) Kongduang D. et al. , Wungsintawaykul J. et al. , De-Eknamkul W., et al. Tetrahedron Lett. , 49, 4067-4072 (2008)
その結果、
溶出画分３より得られた化合物は、下記構造式（５）で表されるアジアチコ酸、
溶出画分４より得られた化合物は、下記構造式（２）で表されるオレアノール酸、
溶出画分６より得られた化合物は、下記構造式（３）で表されるウルソール酸、
溶出画分５より得られた化合物は、オレアノール酸及びウルソール酸、
溶出画分７−３より得られた化合物は、下記構造式（４）で表されるマスリニン酸、
溶出画分７−７より得られた化合物は、オレアノール酸、
溶出画分７−８より得られた化合物は、ウルソール酸、
溶出画分９−３より得られた化合物は、下記構造式（７）で表される１，２−ジ−Ｏ−ガロイル−４，６−Ｏ−（Ｓ）−ヘキサヒドロキシジフェノイルβ−Ｄ−グルコピラノシド、
溶出画分９−４より得られた化合物は、下記構造式（６）で表される１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイルβ−Ｄ−グルコピラノシド、
溶出画分９−８より得られた化合物は、下記構造式（８）で表されるルテオリン、
溶出画分９−１０より得られた化合物は、下記構造式（９）で表されるトリセチンであることが判明した。
as a result,
The compound obtained from the eluted fraction 3 is an asiatic acid represented by the following structural formula (5):
The compound obtained from elution fraction 4 is oleanolic acid represented by the following structural formula (2):
The compound obtained from the eluted fraction 6 is ursolic acid represented by the following structural formula (3),
The compound obtained from the elution fraction 5 contains oleanolic acid and ursolic acid,
The compound obtained from the elution fraction 7-3 contains maslinic acid represented by the following structural formula (4),
The compound obtained from the elution fraction 7-7 was oleanolic acid,
The compound obtained from the eluted fractions 7-8 was ursolic acid,
The compound obtained from elution fraction 9-3 was 1,2-di-O-galloyl-4,6-O- (S) -hexahydroxydiphenoyl β- represented by the following structural formula (7). D-glucopyranoside,
The compound obtained from the eluted fraction 9-4 was 1,2,6-tri-O-galloyl β-D-glucopyranoside represented by the following structural formula (6):
The compound obtained from the elution fraction 9-8 is luteolin represented by the following structural formula (8),
The compound obtained from the elution fraction 9-10 was found to be tricetin represented by the following structural formula (9).
実施例１１ ＨｅｐＧ２細胞を用いた脂肪蓄積抑制作用試験
実施例１で得られたメタノール抽出エキス、実施例２で得られた酢酸エチル移行部、実施例３で得られたメタノール溶出部および水溶出部、実施例４〜９で得られたプニカノール酸（構造式（１）の化合物、表３中では、化合物（１）と表す。構造式（２）〜（９）の化合物についても同じである。）、オレアノール酸（構造式（２）の化合物）、ウルソール酸（構造式（３）の化合物）、マスリニン酸（構造式（４）の化合物）、アジアチコ酸（構造式（５）の化合物）、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイルβ−Ｄ−グルコピラノシド（構造式（６）の化合物）、１，２−Ｏ−ジガロイル−４，６−Ｏ−（Ｓ）−ヘキサヒドロキシジフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシド（構造式（７）の化合物）、ルテオリン（構造式（８）の化合物）およびトリセチン（構造式（９）の化合物）について、脂肪蓄積抑制作用の指標として、ＨｅｐＧ２細胞を用いた細胞内脂肪蓄積抑制作用試験を実施した。
Example 11 Fat accumulation inhibitory action test using HepG2 cells Methanol extract obtained in Example 1, ethyl acetate transfer part obtained in Example 2, methanol elution part and water elution part obtained in Example 3 The punicanolic acid obtained in Examples 4 to 9 (compound of structural formula (1), represented as compound (1) in Table 3). The same applies to the compounds of structural formulas (2) to (9). ), Oleanolic acid (compound of structural formula (2)), ursolic acid (compound of structural formula (3)), maslinic acid (compound of structural formula (4)), asiatic acid (compound of structural formula (5)), 1,2,6-tri-O-galloyl β-D-glucopyranoside (compound of structural formula (6)), 1,2-O-digaloyl-4,6-O- (S) -hexahydroxydiphenyl β-D -Glucopyranoside (Structural Formula (7) Compounds), for luteolin compound of the compound of (formula (8)) and Tricetin (structural formula (9)), as an indicator of fat accumulation inhibiting effect was carried intracellular fat accumulation inhibitory action test using HepG2 cells.
試験方法を以下に示す。
大日本住友製薬社より購入したヒト肝がん由来ＨｅｐＧ２細胞を用いた。培地はｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＭＥＭ，シグマ−アルドリッチ社製）に１０％（ｖ／ｖ）ｆａｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）及び１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び０．１ｍＭ非必須アミノ酸（インビトロジェン社製）を添加して使用した。細胞の培養は、７５ｃｍ２培養フラスコ（ファルコン社製）中で行い、５％ＣＯ２雰囲気下３７℃にて行った。継代操作は、培養した細胞をダルベッコＰＢＳ（−）（日水製薬社製）で洗浄した後、０．０２％（ｗ／ｖ）トリプシン（ディフコ社製）及び０．０５％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ−２Ｎａ（同人化学社製）を含むＰＢＳ（−）により剥離して、定法に従い行った。尚、被験サンプルは０．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ溶液として培地に添加した。
The test method is shown below.
Human liver cancer-derived HepG2 cells purchased from Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. were used. Medium is medium essential medium Eagle (MEM, manufactured by Sigma-Aldrich) 10% (v / v) fatal calf serum (FCS) and 100 units / mL penicillin G, 100 μg / mL streptomycin and 0.1 mM non-essential amino acids (Invitrogen) Used). Cells were cultured in a 75 cm 2 culture flask (Falcon) at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere. In the subculture operation, the cultured cells were washed with Dulbecco's PBS (-) (manufactured by Nissui Pharmaceutical), then 0.02% (w / v) trypsin (manufactured by Difco) and 0.05% (w / v). ) Peeled with PBS (-) containing EDTA-2Na (manufactured by Doujin Chemical Co., Ltd.), and performed according to a conventional method. The test sample was added to the medium as a 0.5% (v / v) DMSO solution.
ＨｅｐＧ２細胞を１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２００μＬ／ｗｅｌｌ）の細胞密度で４８穴培養プレート（住友ベークライト社製）に播種して実験を行った。培養１日後、被験サンプルおよび５％オレイン酸−アルブミン（シグマ−アルドリッチ社製）を添加したｄａｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、低濃度グルコース（１０００ｍｇ／Ｌ）、２００μＬ／ｗｅｌｌ）に培地交換して計４日間（２日に１回培地を交換）培養した。 HepG2 cells were seeded in a 48-well culture plate (Sumitomo Bakelite) at a cell density of 10 5 cells / well (200 μL / well) for experiments. After 1 day of culture, the medium was replaced with test sample and dalbecco's modified easy's medium (DMEM, low-concentration glucose (1000 mg / L), 200 μL / well) supplemented with 5% oleic acid-albumin (manufactured by Sigma-Aldrich). Then, the cells were cultured for a total of 4 days (medium was changed once every two days).
培養期間終了後、培養上清を除去、次いで蒸留水（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え、超音波破砕機にて細胞を破砕した後、細胞破砕液を得た。得られた細胞破砕液の中性脂肪濃度及びタンパク質濃度は、それぞれ市販キットであるトリグリセリドＥテストワコー（和光純薬工業社製）及びＢＣＡｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を使用して定量した。 After completion of the culture period, the culture supernatant was removed, distilled water (100 μL / well) was added, and the cells were crushed with an ultrasonic crusher to obtain a cell lysate. The triglyceride E test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and BCAprotein assay kit (manufactured by Pierce), which are commercially available kits, were quantified, respectively.
定量結果は、タンパク質あたりの中性脂肪量（下表のＴＧ／Ｐｒｏｔｅｉｎ）で算出し、対照群に対する相対値（％ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ）として表１、表２に表した。なお、以下の表中でＣｏｎｃ．（μｇ／ｍＬ）とは、被験物質（ＭｅＯＨ抽出エキスなど）の当該実験における、細胞に対して作用させた濃度を表す。例えば、１００μｇ／ｍＬとは、培養液１ｍＬ中に当該被験物質が１００μｇ存在するときを意味しており。表中の結果の数値はこのときに得られた、単位蛋白量当たりの中性脂肪量の対照群（１００％）に対する相対値を表している。 The quantification results were calculated by the amount of triglycerides per protein (TG / Protein in the table below), and are shown in Tables 1 and 2 as relative values (% of control) with respect to the control group. In the table below, Conc. (Μg / mL) represents the concentration of a test substance (such as MeOH extract) applied to cells in the experiment. For example, 100 μg / mL means when 100 μg of the test substance is present in 1 mL of the culture solution. The numerical value of the result in the table represents the relative value of the amount of neutral fat per unit protein amount obtained at this time with respect to the control group (100%).
表１及び表２中の値は、平均値±標準誤差（Ｎ＝４）で表記し、末尾の符号「＊」および「＊＊」は、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で検定した対照との有意差：ｐが０．０５および０．０１未満であったことを表す。 The values in Table 1 and Table 2 are expressed as mean ± standard error (N = 4), and the symbols “*” and “**” at the end are significant differences from the control tested by Dunnett's multiple comparison test. : It represents that p was less than 0.05 and 0.01.
表１及び表２の結果より、ザクロ花部のメタノール抽出エキス、酢酸エチル移行部およびメタノール溶出部、及び構造式（１）、（２）、（３）、（６）及び（８）で表される化合物は、ＨｅｐＧ２細胞を用いた脂肪蓄積抑制作用試験において有意な脂肪蓄積抑制作用を有することがわかる。 From the results of Tables 1 and 2, the pomegranate flower part extracted with methanol, the ethyl acetate transfer part and the methanol elution part, and the structural formulas (1), (2), (3), (6) and (8) It can be seen that the compound obtained has a significant fat accumulation inhibitory action in a fat accumulation inhibitory action test using HepG2 cells.
とりわけ、構造式（１）の新規化合物プニカノール酸は、市販抗高脂血症薬であるＰＰＡＲ−αアゴニストのクロフィブレートおよびベザフィブラートよりも強力な脂肪蓄積抑制効果を有することが判明した。 In particular, the novel compound punicanolic acid of the structural formula (1) was found to have a stronger fat accumulation inhibitory effect than the commercially available antihyperlipidemic PPAR-α agonists clofibrate and bezafibrate.
実施例１２ ＨｅｐＧ２細胞を用いた脂肪代謝促進作用試験
前記の実施例１１と同様のサンプルについて、脂肪代謝改善作用の指標として、ＨｅｐＧ２細胞を用いた細胞内脂肪代謝促進作用試験を実施した。試験方法を以下に示す。
Example 12 Fat Metabolism Promoting Action Test Using HepG2 Cells For the same sample as in Example 11 above, an intracellular fat metabolism promoting action test using HepG2 cells was performed as an index of fat metabolism improving action. The test method is shown below.
試験に供した細胞および試薬類は、前記の実施例１１と同様のものを用いた。 Cells and reagents used for the test were the same as those used in Example 11 above.
ＨｅｐＧ２細胞を１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２００μＬ／ｗｅｌｌ）の細胞密度で４８穴培養プレート（住友ベークライト社製）に播種して実験を行った。培養１日後、被験サンプルを含む高濃度グルコース（４５００ｍｇ／Ｌ）含有ＤＭＥＭ（２００μＬ／ｗｅｌｌ）に培地交換して計６日間（２日に１回培地を交換）培養した。高濃度グルコース含有ＤＭＥＭによる培養終了後、被験サンプルを添加した低濃度グルコース（１０００ｍｇ／Ｌ）含有ＤＭＥＭ（２００μＬ／ｗｅｌｌ）に培地交換して、さらに２０時間培養した。 HepG2 cells were seeded in a 48-well culture plate (Sumitomo Bakelite) at a cell density of 10 5 cells / well (200 μL / well) for experiments. After 1 day of culture, the medium was replaced with high-concentration glucose (4500 mg / L) -containing DMEM (200 μL / well) containing the test sample, and cultured for a total of 6 days (medium was changed once every 2 days). After completion of the culture with high-concentration glucose-containing DMEM, the medium was changed to low-concentration glucose (1000 mg / L) -containing DMEM (200 μL / well) to which the test sample was added, and the culture was further continued for 20 hours.
培養期間終了後、前記実施例１１と同様の手法により、細胞中のタンパク質あたりの中性脂肪量（下表のＴＧ／Ｐｒｏｔｅｉｎ）で算出し、対照群に対する相対値（％ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ）として表３及び表４に表した。 After completion of the culture period, the amount of triglyceride per protein in the cells (TG / Protein in the table below) was calculated in the same manner as in Example 11, and Table 3 shows the relative value (% of control) relative to the control group. And in Table 4.
表３及び表４中の値は、前記表１及び表２と同様に平均値±標準誤差（Ｎ＝４）で表記し、末尾の符号「＊」および「＊＊」は、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で検定した対照との有意差：ｐが０．０５および０．０１未満であったことを表す。 The values in Tables 3 and 4 are expressed as mean values ± standard error (N = 4) as in Tables 1 and 2 above, and the symbols “*” and “**” at the end are Dunnett's multiple comparisons. Significant difference from the control tested in the test: p represents less than 0.05 and 0.01.
表３及び表４の結果より、ザクロ花部のメタノール抽出エキス、酢酸エチル移行部およびメタノール溶出部、及び構造式（１）、（２）、（３）、（６）、（７）、（８）及び（９）で表される化合物は、ＨｅｐＧ２細胞を用いた脂肪代謝促進作用試験において有意な脂肪代謝改善作用あるいは脂肪代謝改善傾向を有することがわかる。 From the results of Tables 3 and 4, the extracted pomegranate flower extract, the ethyl acetate transfer part and the methanol elution part, and the structural formulas (1), (2), (3), (6), (7), ( It can be seen that the compounds represented by 8) and (9) have a significant fat metabolism improving action or fat metabolism improving tendency in the fat metabolism promoting action test using HepG2 cells.
とりわけ、構造式（１）の新規化合物プニカノール酸は、肝臓での脂肪代謝促進作用が報告されているビグアナイド系市販糖尿病治療薬であるメトホルミンよりも強力な脂肪代謝改善効果を有することが判明した。 In particular, the novel compound punicanolic acid of the structural formula (1) has been found to have a stronger effect of improving fat metabolism than metformin, which is a biguanide-based commercially available therapeutic agent for diabetes, which has been reported to promote fat metabolism in the liver.
実施例１３ Ｌ９２９細胞を用いたＴＮＦ−α誘発細胞傷害抑制作用試験
前記の実施例１１及び実施例１２と同様のサンプルについて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験における抗ＴＮＦ−α作用の指標として、Ｌ９２９細胞を用いたＴＮＦ−α誘発細胞障害に対する保護作用試験を実施した。試験方法を以下に示す。
Example 13 Test for inhibiting TNF-α-induced cytotoxicity using L929 cells About the same sample as in Example 11 and Example 12, L929 cells were used as an index of anti-TNF-α action in the in vitro test. A protective effect test against TNF-α-induced cell damage was performed. The test method is shown below.
大日本住友製薬社より購入したＬ９２９細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１００ ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００ μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び０．１ｍＭ非必須アミノ酸（インビトロジェン社製）を含むｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ、シグマ−アルドリッチ社製）培地を用いて培養して、本実験に使用した。９６穴平底マイクロプレートに１×１０４細胞／１００μＬ／穴の割合で細胞を播種した後、５％の二酸化炭素雰囲気下、３７℃において２０時間培養した。その後、前記培地に１ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ−α（シグマ−アルドリッチ社製）及び被験物質のＤＭＳＯ溶液をそれぞれ含有する培地を加えた。ここで、被験物質のＤＭＳＯ溶液は、培地中のＤＭＳＯ濃度が０．５％になるように添加した。４４時間培養した後、０．５ｍｇ／ｍＬの３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム ブロマイド（ＭＴＴ）を含有する培地と交換し、さらに４時間培養した。培地を除去後、生成したホルマザンを０．０４Ｎ塩酸含有イソプロピルアルコール１００μＬ／穴で溶解した後、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（測定波長５７０ｎｍ、参照波長６６０ｎｍ）を測定した。測定された吸光度を用い、以下の式に従って、ＴＮＦ−αによる細胞の障害抑制率を算出した。 L929 cells purchased from Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. were used as a minimum essential medium containing 10% (v / v) FCS, 100 units / mL penicillin G, 100 μg / mL streptomycin and 0.1 mM non-essential amino acids (Invitrogen). (MEM, Sigma-Aldrich) medium was used for this experiment. Cells were seeded on a 96-well flat-bottomed microplate at a rate of 1 × 10 4 cells / 100 μL / well, and then cultured at 37 ° C. for 20 hours in a 5% carbon dioxide atmosphere. Thereafter, a medium containing 1 ng / mL TNF-α (manufactured by Sigma-Aldrich) and a DMSO solution of the test substance were added to the medium. Here, the DMSO solution of the test substance was added so that the DMSO concentration in the medium was 0.5%. After culturing for 44 hours, the medium was replaced with a medium containing 0.5 mg / mL 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) 2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT), and further cultured for 4 hours. did. After removing the medium, the produced formazan was dissolved in 100 μL / well of 0.04N hydrochloric acid-containing isopropyl alcohol, and the absorbance (measurement wavelength 570 nm, reference wavelength 660 nm) was measured using a microplate reader. Using the measured absorbance, the inhibition rate of cell damage by TNF-α was calculated according to the following formula.
式中、Ｏ．Ｄ．Ｎｏｒｍａｌは、被験物質を含まない培地（即ち、培地中に０．５％ＤＭＳＯのみを含むもの）で測定される吸光度を示し、Ｏ．Ｄ．Ｃｏｎｔｒｏｌは、培地中に０．５％ＤＭＳＯ及び１ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ−αを含有する場合に測定される吸光度を、Ｏ．Ｄ．Ｓａｍｐｌｅは、培地中に被験物質及び１ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ−αを含有する場合に測定される吸光度を意味する。結果を表５、表６に示す。結果はいずれも平均値と標準誤差で表し、対照群との有意差検定には、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いた。 なお、以下の表中のＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍＬ）が−とはＴＮＦ−α非添加群を表し、＋とはＴＮＦ−αを培地中に１ｎｇ／ｍＬ含有していることを表す。 In the formula, O. D. Normal indicates the absorbance measured in a medium containing no test substance (that is, a medium containing only 0.5% DMSO). D. Control indicates the absorbance measured when the medium contains 0.5% DMSO and 1 ng / mL TNF-α, O.D. D. Sample means the absorbance measured when the test substance and 1 ng / mL TNF-α are contained in the medium. The results are shown in Tables 5 and 6. All results were expressed as mean values and standard errors, and Dunnett's multiple comparison test was used for the significance test with the control group. In addition, TNF-α (1 ng / mL) in the following table indicates that TNF-α is not added, and + indicates that 1 ng / mL of TNF-α is contained in the medium.
前記表５及び表６中、障害抑制率の結果の末尾の符号「＊」および「＊＊」は、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で検定した対照との有意差：ｐが０．０５および０．０１未満であったことを表す。 In Table 5 and Table 6, the signs “*” and “**” at the end of the results of the inhibition rate are significant differences from the control tested by Dunnett's multiple comparison test: p is 0.05 and 0.01. It was less than.
表５及び表６の結果より、ザクロ花部のメタノール抽出エキス、酢酸エチル移行部およびメタノール溶出部、及び構造式（１）、（２）、（４）、（５）、（６）、（７）及び（８）で表される化合物は、Ｌ９２９細胞を用いたＴＮＦ−α誘発細胞傷害抑制作用試験において有意な抗ＴＮＦ−α作用を有することが示されている。 From the results of Tables 5 and 6, the pomegranate flower part methanol extract, the ethyl acetate transfer part and the methanol elution part, and the structural formulas (1), (2), (4), (5), (6), ( The compounds represented by 7) and (8) have been shown to have a significant anti-TNF-α action in a TNF-α-induced cytotoxicity inhibitory test using L929 cells.
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