JP2009533020A - Gm−csf受容体に対する結合構造要素 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
Nicolaら[2]は、2B7-17-Aまたは“2B7”と呼ばれるヒトGM-CSFRαに対するマウス抗体を記載したが、これはヒトGM-CSFRαに対して比較的高親和性を有し、いくつかの異なるバイオアッセイにおいてヒトGM-CSFの生物学的作用の強力な阻害剤であることを報告した。抗体2B7はChemiconからMAB1037として市販されており、MAB1037の製品データシートは、抗体2B7がGM-CSFの生物学的作用の強力な阻害剤であることを注記している。2B7はWO94/09149においても開示された。
よって、本発明は、ヒトGM-CSFRαに結合し、ヒトGM-CSFのGM-CSFRαへの結合を阻害する結合構造要素に関する。本発明の結合構造要素はGM-CSFRのアンタゴニストであり得る。本結合構造要素は、GM-CSFRを介するGM-CSFによる情報伝達の競合的可逆的阻害因子であり得る。
・生化学的リガンド結合アッセイ
・TF-1増殖アッセイ
・ヒト顆粒球形態変化アッセイ
・カニクイザル非ヒト霊長類顆粒球形態変化アッセイ
・単球TNFα放出アッセイ
・顆粒球生存アッセイ
・コロニー形成アッセイ(血球前駆細胞のin vitro GM-CSF媒介分化の阻害)
・例えばヒトGM-CSFRを発現するトランスジェニック骨髄を有するキメラマウスにおけるin vivo GM-CSF生物活性の阻害
・末梢血単核細胞サイトカイン放出アッセイ
の1以上において中和活性を有することができる。
IC50値は複数個の測定値の平均値を表すことができる。従って、例えば、3連実験の結果からIC50値を得ることができ、ついで平均IC50値を算出できる。
本発明の結合構造要素は、TF-1増殖アッセイにおいて-6、-7、-8、-9、-10、-10.5または-11より大きな負のpA2を有することができる。例えば、pA2は約-10.5または-11であり得る。pA2値の計算および有意性は、実験の部においてアッセイ方法および材料の項目で詳細に説明されている。
カニクイザル顆粒球形態変化アッセイにおいて、本発明の結合構造要素は、通常20pM未満のIC50を有し、一般的には10、5または2.5pM未満のIC50を有する。IC50は少なくとも0.5、1または1.5pMであり得る。公知のマウス抗体2B7は、本アッセイにおいて試験するとき、26pMのIC50を有していた。本明細書において用いたカニクイザル顆粒球形態変化アッセイには、最終濃度7pMのヒトGM-CSFを用いた。このように、カニクイザル顆粒球形態変化アッセイにおけるIC50中和能は、7pMヒトGM-CSFにより引き起こされるカニクイザル顆粒球の形態変化を阻害する結合構造要素の能力を表す。さらに詳しくはアッセイ方法および材料セクションを参照のこと。
本発明の結合構造要素は、ヒトおよび/またはカニクイザル形態変化アッセイにおいて-6、-7、-8、-9、-10、-10.5または-11より大きな負のpA2を有することができる。好ましくはpA2は約-10または-11である。
通常、本発明の結合構造要素は、以下にさらに詳しく説明するように、抗体分子、例えば全長抗体または抗体フラグメントを含む。好ましくは、本発明の抗体分子はヒト抗体分子である。
本発明の結合構造要素は、通常抗体VHおよび/またはVLドメインを含む。結合構造要素のVHドメインおよびVLドメインもまた本発明の一部として提供される。VHおよびVLドメインのそれぞれの内部には、相補性決定領域(“CDR”)およびフレームワーク領域(“FR”)が存在する。VHドメインは1組のHCDRを含み、VLドメインは1組のL CDRを含む。抗体分子は、一般的にはVH CDR1、CDR2およびCDR3ならびにフレームワークを含む抗体VHドメインを含む。抗体分子は、代わりにあるいは同様に、VL CDR1、CDR2およびCDR3ならびにフレームワークを含む抗体VLドメインを含むことができる。VHまたはVLドメインフレームワークは、次の構造:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
中のCDRにより散在させられた4つのフレームワーク領域FR1、FR2、FR3およびFR4を含む。
我々の分析により、受容体結合に特に強い影響を有する、CDRにおける4残基の位置が示された:H97、H100B、L90およびL92(Kabat番号付け)。好ましくは、VH CDR3のH97はSである。全160クローンにおいてこの位置にセリン残基が観察されたので、このことはセリン残基が抗原認識に重要な残基であることを示している。
Kabat残基H95におけるV、N、AまたはL、最も好ましくはV;
Kabat残基H99におけるS、F、H、P、TまたはW、最も好ましくはS;
Kabat残基H100BにおけるA、T、P、S、VまたはH、最も好ましくはAまたはT
の1以上を含む。
好ましくは、VH CDR1におけるKabat残基H34はIである。好ましくは、VH CDR2はKabat残基H54におけるEおよび/またはKabat残基H57におけるIを含む。
好ましくは、VL CDR3は以下の残基:
Kabat残基L90におけるS、TまたはM、最も好ましくはSまたはT;
Kabat残基L92におけるD、E、Q、S、MまたはT、最も好ましくはDまたはE;
Kabat残基L96におけるA、P、S、T、I、L、MまたはV、最も好ましくはS、P、IまたはV、特別にはS
の1以上を含む。
好ましくは、VL CDR1は以下の残基:
Kabat残基27AにおけるS;
Kabat残基27BにおけるN;
Kabat残基27CにおけるI;
Kabat残基32におけるD
の1以上を含む。
好ましくは、VL CDR2は以下の残基:
Kabat残基51におけるN;
Kabat残基52におけるN;
Kabat残基53K
の1以上を含む。
非生殖系列抗体は、同じCDRを有するが生殖系列抗体と比較して異なるフレームワークを有する。
競合は、例えばELISAを用いて測定できる。ELISAにおいて、例えばGM-CSFRαの細胞外ドメインまたは細胞外ドメインのペプチドがプレートに固定化され、1以上の他のタグなし結合構造要素と共に最初にタグをつけた結合構造要素がプレートに添加される。タグをつけた結合構造要素により生じるシグナルの低下により、タグをつけた結合構造要素と競合するタグなし結合構造要素の存在が認められる。同様に、表面プラズモン共鳴アッセイを用いて結合構造要素間の競合を測定できる。
競合試験において、抗原のペプチドフラグメント、特に関心のあるエピトープまたは結合領域を含むかまたは本質的にそれらからなるペプチドを使用することができる。エピトープまたは標的配列を有し、1以上のアミノ酸をいずれかの末端に加えたペプチドを使用できる。本発明による結合構造要素は、抗原に対するそれらの結合が所定の配列を有するかまたは含むペプチドにより阻害されるものであり得る。
ペプチドに結合する結合構造要素は、例えばペプチド(単数または複数)を用いるパンニングによりファージディスプレイライブラリーから単離することができる。
本発明は、本明細書記載の結合構造要素のGM-CSFRαへの結合を引き起こすまたは可能にすることを含む方法を提供する。このような結合は、例えば結合構造要素または、結合構造要素をコードする核酸の投与後にin vivoで生じさせることができ、あるいはこのような結合は、例えばELISA、ウェスタンブロット法、免疫細胞化学、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィーまたは細胞系アッセイ、例えばTF-1アッセイにおいてin vitroで生じさせることができる。
GM-CSFRαへの結合構造要素の結合量は測定できる。定量は試験サンプル中の抗原量に関連したものであることができ、これらの量は診断関心事または予後関心事であろう。
個々の抗体-レポーター結合体により生成されるシグナルは、サンプル(標準および試験)中の関連する抗体結合の定量化可能な絶対データまたは相対データを導くために用いることができる。
導入に続いて、例えば遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からの発現を引き起こすかまたは可能にすることができる。
本発明はまた、上記の結合構造要素またはポリペプチドを発現させるために発現系において上記の構築物を用いることを含む方法を提供する。従って、本発明の結合構造要素、VHドメインおよび/またはVLドメインの製造方法は、本発明のさらなる側面である。この方法は前記結合構造要素、VHドメインおよび/またはVLドメインの産生をもたらす条件下で前記核酸を発現させ、それからそれを回収することを含むことができる。このような方法は、前記結合構造要素または抗体ドメインを産生させる条件下で宿主細胞を培養することを含むことができる。
本製造方法は、生成物の単離および/または精製のステップを含むことができる。本製造方法は、薬学的に許容される賦形剤などの少なくとも1つのさらなる成分を含む組成物中に生成物を処方することを含むことができる。
培養下の真核細胞における発現もまた、結合構造要素の製造の選択肢の1つとして当業者に利用可能である[4、5、6]。異種ポリペプチドの発現のために当該技術分野で利用可能な哺乳動物細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、新生仔ハムスター腎臓細胞、NS0マウスメラノーマ細胞、YB2/0ラット骨髄腫細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト胚性網膜細胞等々を含む。
必要に応じてプロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を含む適切な調節配列を含む適切なベクターを選択または構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、例えばファージミドあるいはウイルス、例えばファージであり得る[7]。例えば核酸構築物の製造、突然変異誘発、配列決定、細胞へのDNAの導入および遺伝子発現ならびにタンパク質の分析における、核酸の操作のための多くの公知の技術およびプロトコルは、Ausubelら[8]に詳細に説明されている。
ライブラリーは、粒子または分子複合体、例えば複製可能な遺伝子パッケージ、例えば酵母、細菌もしくはバクテリオファージ(例えばT7)粒子または共有ディスプレイ、リボソームディスプレイもしくは他のin vitroディスプレイ系であって、各粒子または分子複合体がその上にディスプレイされた抗体VH可変ドメインおよび場合により存在する場合はディスプレイされたVLドメインをコードする核酸を含む前記粒子または分子複合体上にディスプレイされることができる。バクテリオファージまたは他のライブラリー粒子または分子複合体上にディスプレイされた抗原に結合できる結合構造要素の選択後、前記選択された結合構造要素をディスプレイしているバクテリオファージまたは他の粒子または分子複合体から核酸を取り出すことができる。このような核酸は、前記選択された結合構造要素をディスプレイするバクテリオファージまたは他の粒子または分子複合体から取り出した核酸配列を有する核酸からの発現による、結合構造要素または抗体VHもしくはVL可変ドメインのその後の製造に使用できる。
前記選択された結合構造要素の抗体VL可変ドメインのアミノ酸配列を有する抗体VL可変ドメインは、このようなVLドメインを含む結合構造要素と同様に単離形で提供できる。
GM-CSFRαに結合する能力をさらに試験することができる。同様に、抗体1〜20(例えばscFvフォーマットおよび/またはIgGフォーマット、例えばIgG1またはIgG4で)のいずれかとGM-CSFRαへの結合を競合する能力もまた試験する事ができる。GM-CSFRαを中和する能力を試験することができる。
VHドメインおよびVLドメインからなる抗体抗原結合部位は、ポリペプチドの6個のループ、すなわちL鎖可変ドメイン(VL)からの3個およびH鎖可変ドメイン(VH)からの3個から形成される。公知の原子構造の抗体の分析により、配列と抗体結合部位の3次元構造間との相関が解明されている[16、17]。VHドメインにおける第3領域(ループ)を除き、結合部位ループは少数の主鎖配座である正準構造(canonical structure)の1つを有することをこれらの相関は示唆している。特定のループにおいて形成される正準構造は、そのサイズおよび、そのループおよびレームワーク領域の両方における重要部位での特定の残基の存在により決定されることが示されている[16、17]。
CDR、抗体VHまたはVLドメインおよび結合構造要素のアミノ酸配列における置換を行うために必要とされる技術は、一般に当該技術分野で利用可能である。活性に対して最小の効果または有益な効果を有すると予測できるまたは予測できない置換を有する変種配列を作製し、GM-CSFRαに結合および/またはGM-CSFRαを中和する能力ならびに/または任意の他の望ましい特性を試験することができる。
好ましくは、改変は機能喪失をもたらさず、従ってこのように改変されたアミノ酸配列を含む結合構造要素は、好ましくは、GM-CSFRαに結合する能力および/またはGM-CSFRαを中和する能力を保持している。より好ましくは、結合構造要素は、例えば本明細書記載のアッセイで測定するとき、改変がなされていない結合構造要素と同じ定量的な結合および/または中和能力を保持している。最も好ましくは、例えば本明細書記載のアッセイで測定するとき、改変がなされていない結合構造要素と比較して、このように改変されたアミノ酸配列を含む結合構造要素は、改善されたGM-CSFRαに結合する能力またはGM-CSFRαを中和する能力を有する。
上で述べたように、本明細書に実質的に記載されたCDRアミノ酸配列は、好ましくはヒト抗体可変領域またはその実質的な部分におけるCDRとして含まれる。本明細書に実質的に記載されたHCDR3配列は、本発明の好ましい実施形態を表し、これらのそれぞれがヒトH鎖可変ドメインまたはその実質的な部分にHCDR3として含まれることが好ましい。
例えば、Marksら(1992)[22]は、可変ドメイン領域に対するまたは可変ドメイン領域の5'末端に隣接したコンセンサスプライマーをヒトVH遺伝子の第3フレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと共に用いてCDR3を欠くVH可変ドメインのレパートリーを得る、抗体可変領域のレパートリーの製造方法を記載している。Marksらは、さらに、このレパートリーと特定の抗体のCDR3とを組み合わせる方法を記載している。類似の技術を用い、本発明のCDR3由来配列を、CDR3を欠くVHまたはVLドメインのレパートリーとシャッフルし、シャッフルした全VHまたはVLドメインをコグネイトVLまたはVHドメインと組み合わせて本発明の結合構造要素を得ることができる。ついで、適切な宿主システム、例えばWO92/01047または引用文献[23]を含む以下の多数の文献のいずれかのファージディスプレイ系でレパートリーをディスプレイすることができ、それにより適切な結合構造要素を選択することができる。レパートリーは、104を超える個々の要素、例えば106〜108または1010要素の任意のものからなることができる。他の適切な宿主系は、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、T7ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、細胞ディスプレイ、リボソームディスプレイおよび共有ディスプレイを含む。類似のシャフリングまたはコンビナトリアル技術はStemmer (1994) [24]によっても開示されており、彼は、β-ラクタマーゼ遺伝子に関連する技術を記載しているが、そのアプローチは抗体の作製にも使用しうることも観察している。
本発明のさらなる側面は、GM-CSFRα抗原の抗体抗原結合部位を得る方法であって、本明細書に記載のVHドメインのアミノ酸配列における1以上のアミノ酸の付加、欠失、置換または挿入により、VHドメインのアミノ酸配列変種であるVHドメインを得、場合によりこのようにして得られたVHドメインを1以上のVLドメインと組み合わせ、VHドメインまたはVH/VL組み合わせ(単数または複数)を試験して、場合により1以上のより好ましい特性、好ましくはGM-CSFRα活性を中和する能力を有する、結合構造要素またはGM-CSFRα抗原の抗体抗原結合部位を同定する前記方法を提供する。前記VLドメインは、本明細書に実質的に記載されたアミノ酸配列を有することができる。
本明細書に記載のVLドメインの1以上の配列変種が1以上のVHドメインと組み合わされる類似の方法を用いることができる。
(a)置換すべきCDR3を含むかまたはCDR3をコードする領域を欠くVHドメインをコードする核酸の出発レパートリーを提供すること
(b)前記レパートリーとVH CDR3について本明細書に実質的に記載されたアミノ酸配列をコードするドナー核酸を組み合わせて前記ドナー核酸をレパートリー内のCDR3領域に挿入し、それによりVHドメインをコードする核酸の産物レパートリーを得ること;
(c)前記産物レパートリーの核酸を発現させること;
(d)GM-CSFRαに対する結合構造要素を選択すること;
(e)前記結合構造要素またはそれをコードする核酸を回収すること、
を含む前記方法を提供する。
さらに、類似の方法を用いて本発明のVL CDR3と、置換されるCDR3を含むかまたはCDR3をコードする領域を欠くVLドメインをコードする核酸のレパートリーとを組み合わせることができる。
同様に、1以上または全3CDRをVHまたはVLドメインのレパートリーに移植し、次いでそれをGM-CSFRαに対する結合構造要素(単数または複数)に関してスクリーニングすることができる。
単一の結合ドメインのいずれかの場合は、GM-CSFRαに結合できる2ドメイン結合構造要素を形成することができる相補的ドメインをスクリーニングするためにこれらのドメインを使用することができる。このことは、WO92/01047に開示されているように、いわゆる階層的二元コンビナトリアルアプローチを用いるファージディスプレイスクリーニング法により達成できる。この方法において、HまたはL鎖クローンのいずれかを含む各コロニーを、他の鎖(LまたはH)をコードするクローンの全ライブラリーを感染するために用い、前記引用または[22]に記載されているように、ファージディスプレイ法技術に従って得られた2本鎖結合構造要素が選択される。
本発明は、抗GM-CSFRα抗体分子を含む異成分調製物を提供する。例えば、このような調製物は、完全長H鎖および、C末端リジンを欠くH鎖であって、種々の程度のグリコシル化および/または誘導体化アミノ酸、たとえばN末端グルタミン酸の環化によりピログルタミン酸残基を形成する誘導体化アミノ酸を有する前記H鎖の混合物であり得る。
抗GM-CSFRα治療薬は、経口(例えばナノボディ)、注射(例えば、皮下、静脈内、動脈内、関節内、腹腔内または筋肉内)、吸入、膀胱内経路(膀胱への点滴)または局所(例えば眼内、鼻腔内、直腸、創傷内、皮膚上)で投与することができる。治療薬は、特に減少していく投与量の本結合構造要素を用いてパルス注入により投与することができる。疾患に特に配慮し、あるいは効力を最適化するかまたは副作用を最小化する必要性に応じて、治療薬の物理化学的性質により投与経路を決定することができる。抗GM-CSFRα治療薬は医院での使用に限定されないことが想定されるので、無針装置を用いる皮下注射もまた好ましい。
本発明に従って、提供される組成物を個体に投与することができる。投与は、好ましくは“治療的有効量”で行われ、これは患者に便益をもたらすのに十分な量である。このような便益は、少なくとも、少なくとも1つの症状の改善であり得る。投与の実際量ならびに投与の速度および時間的経過は、治療をうけるものの性質と重篤度に左右される。治療の処方、例えば投与量の決定などは、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、症状の重篤度および/または治療を受ける疾患の進行によって決めることができる。抗体の適切な投与量は当該分野で公知である[28、29]。投与される医薬のタイプに応じた、本明細書またはDoctor's Desk Reference(2003)に示される特定の投与量を用いることができる。本発明の結合構造要素の治療的有効量または適切な投与量は、動物モデルにおけるin vitro活性およびin vivo活性を比較することにより決定できる。マウスおよび他の試験動物における有効量のヒトへの外挿法は公知である。正確な投与量は、抗体が診断用であるか治療用であるかということ、治療される領域のサイズおよび位置、抗体の正確な性質(例えば全長抗体、フラグメントまたはダイアボディ)および抗体に結合している任意の検出可能な標識または他の分子の性質を含む多くの要素によって決まる。典型的な抗体投与量は、全身投与で100μg〜1gであり、局所投与で1μg〜1mgである。一般的には、抗体は全長抗体であり、好ましくはIgG1、IgG2であり、より好ましくはIgG4である。これは成人患者の1回の治療のための投与量であり、これは小児および乳児に比例的に調整することができ、分子量に比例させて他の抗体フォーマットに適用することもできる。治療は、医師の判断に応じて1日1回、週2回、週1回または月1回の間隔で繰り返すことができる。本発明の好ましい実施形態において、治療は定期的であり、投与の間の期間は約2週間以上であり、好ましくは約3週間以上であり、より好ましくは約4週間以上であり、あるいは1ヶ月に1回である。本発明の他の好ましい実施形態において、治療薬は術前および/または術後に投与することができ、より好ましくは、外科治療の解剖学的位置に直接に投与または適用することができる。
気管支喘息は、気道過敏性、粘液過剰産生、線維症およびIgEレベル上昇により特徴付けられる、よくある肺の持続性炎症性疾患である。気道過敏性(AHR)は、非特異的刺激に対する気道の過剰な収縮である。AHRおよび粘液過剰産生は共に、一過性の気道閉塞に関与すると考えられており、それにより喘息発作(急性増悪)の息切れの特徴が引き起こされ、これはこの疾患に関連する死亡率に関与している(英国においては年間におよそ2000名死亡)。
喘息においては、GM-CSFおよびその受容体は、タンパク質およびmRNAレベルの両方で上方制御されていることが最近の研究で明らかにされている。さらにまた、発現量は疾患の重症度に相関している。非喘息被験者と比較して喘息患者からの気管支肺胞洗浄(BAL)液、BAL細胞、痰、気管支上皮細胞および抗原によって刺激された末梢血単核細胞におけるGM-CSFの産生増加が測定されている[31、32]。さらにまた、アレルゲンチャレンジ後のGM-CSFの気道発現レベルは、組織の好酸球増加症の程度および遅発型喘息反応の重篤度に関連していることが示されている[33]。より最近の研究は、内因性または非アトピー性喘息と上方制御されたGM-CSFR発現を結びつけ、肺機能データと発現レベルを関連付けた[34]。卵白アルブミンによる感作およびチャレンジのマウスモデルにおいて、卵白アルブミンチャレンジ前の鼻腔内投与による、ヤギポリクローナル抗体を用いるGM-CSFの活性の中和は、気道過敏性を予防し、好酸球の浸潤および気道への粘液分泌を共に低下させた[35]。同様に、ディーゼル排気微粒子の鼻腔内投与により始まるアレルギー性呼吸器疾患のマウスモデルにおいて、ヤギポリクローナル抗体の鼻腔内投与によるGM-CSFの中和は、再び、メタコリンに対する気道過剰反応性を予防し、BAL好酸球数を低下させ、気道上皮上の粘液産生杯状細胞の発現もまた低下させた[36]。
同様な所見が他のマウスモデルにおいて得られており、この所見において、ブタクサへの繰り返しの鼻腔内暴露により、Th2タイプの感作が引き起こされ、抗原への再暴露により軽度の気道炎症が引き起こされる[38]。ブタクサと共に抗GM-CSF抗体を投与することにより、おそらくは内因性GM-CSFによる阻害により、Th2関連サイトカイン産生を低下させた。それに引き換え、組換えGM-CSFの複数回の同時投与またはGM-CSF導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターの1回の送達のいずれかによる、GM-CSFに富む気道微小環境へのブタクサの送達は、かなり亢進した好酸球性気道炎症およびブタクサ特異的Th2記憶反応を引き起こした。
RAは先進国の人工のおおよそ1%が侵されている慢性炎症性および破壊性関節疾患である。RAは、滑膜の過形成および炎症、滑液内の炎症ならびに通例著しい能力障害を引き起こす、周囲骨および軟骨の進行性破壊を特徴とする。
RAの原因はまだ分かっていないが、RAの進行におけるGM-CSFの役割の証拠が蓄積されつつある。RAは、T細胞媒介性で抗原特異的プロセスにより始めれら、促進されると考えられている。手短に言えば、感受性宿主における未確認の抗原の存在により、T細胞サイトカインの産生を引き起こすT細胞応答が開始され、結果として好中球、マクロファージおよびB細胞を含む炎症細胞が動員されると考えられる。
リウマチ様関節において多くの炎症誘発性および抗炎症性サイトカインが産生される。さらに、疾患進行、再活性化およびサイレンシングは、関節内のサイトカイン産生の動的変動により媒介される。特に、TNF-αおよびIL-1は、RAの病因においてきわめて重要な役割を発揮すると考えられ、この疾患のために開発された、または開発中の新規な療法の多くはこれら2つの炎症誘発性サイトカインの活性を阻害することを期待するものである。
さらにまた、マウス抗GM-CSF mAbの投与により、CIAおよび単関節炎モデルにおける疾患の重症度は著しく改善される。CIAモデルにおいて、mAb処理は既存の疾患の進行、組織変化の治療に有効であり、関節IL-1およびTNF-αレベルを著しく低下させた。加えて、関節炎発症前のmAb処理により、CIA疾患の重症度は低下した[44、43]。
以前に、好中球減少症の治療を受けている患者における組換えGM-CSFの投与はRAの増悪を引き起こしうることが観察された[49]。組換えGM-CSF投与後のFelty症候群患者に関して同様な所見が得られた[50]。
慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、完全には可逆的ではない気流制限を特徴とする疾病状態として定義される。慢性気流制限は、通例進行性であり、有害な粒子またはガスに対する肺の異常は炎症反応と関連している。この気流制限は、末梢気道病変(閉塞性気管支炎)および実質の破壊(気腫)の組み合わせで引き起こされ、相対的な寄与は、ヒトによって異なる。結果として生じるCOPDの特徴的な症状は、咳、喀痰および激しい活動時の呼吸困難である。COPDは重大なヒトの健康問題であり、米国では慢性罹患率・死亡率の原因の4番目である。この疾患は、現在のところ、βアゴニストを含む気管支拡張薬の有り無しで、経口または吸入コルチコステロイドなどの喘息のために最初開発された医薬で治療される。しかしながら、これらの医薬のどれもCOPDの進行を抑制しないことが示されている[51]。例えば、喘息において好酸球炎症を著しく抑制するコルチコステロイドは、主に好中球により媒介されるCOPDにおいて見られる炎症には効果を有さないと推定される[52]。従って、この疾患の病態生理学の基礎をなす炎症過程を特異的に標的とする、COPDの新規な治療薬の開発が求められている。GM-CSFは、好中球およびマクロファージ機能におけるその役割とは別に、COPDの病因において重要な役割を果たすことができる。
GM-CSFは、自己免疫疾患である多発性硬化症に関連付けられてきた。げっ歯動物にミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)抗原を投与することにより、麻痺などのMSをもたらしうる、中枢神経系炎症および脱髄などのMSの表現型の多くを示すヒト多発性硬化症のモデルを誘発することができる。GM-CSFヌルマウスにおいて、MOGはEAE表現型を誘発する事ができなかった[55]。さらにまた、これらのマウスにおいてはMOG抗原に対するT細胞増殖が低下し、Th1サイトカインであるIL-6およびIFN-γの産生が低下していることが示された。抗原チャレンジと同時のGM-CSF中和抗体の投与は、疾患の発症を予防し、治療10日後に障害の低下が認められた。疾患の発症後に投与した場合、治療の20日以内にマウスは完全に回復した[55]。
GM-CSFは、骨髄性白血病である若年型慢性骨髄性白血病(JCML)にも関連付けられてきた。この状態は、主として4歳未満の患者を襲う脊髄増殖性疾患である。in vitroのJCML末梢血顆粒球-マクロファージ前駆細胞(CFU-GM)は、低い細胞密度での自発的増殖を示し、これは他の脊髄増殖性疾患では記載されていない所見である。さらにまた、これらの培養物からの単球の枯渇は、この増殖を終わらせた。続いて、この自発的増殖が単球由来サイトカインであるGM-CSFに対するJCML前駆細胞の過敏性により媒介されることが明らかにされた[56、57、58、59、60、61]。JCML患者におけるGM-CSFの過剰産生または上昇したレベルというよりはむしろ、JCML前駆細胞の過敏性は、GM-CSFに誘導されるRas情報伝達経路の脱制御によるものと推定される[62]。結合研究および機能アッセイの両方においてGM-CSFの活性に拮抗するGM-CSFアナログ(E21R)を用いる最新の研究は、GM-CSFの活性を阻害することにより、JCMLの重症複合免疫不全/非肥満糖尿病(SCID/NOD)マウス異種移植モデルにおけるJCML細胞量を著しく低下させることができることが示している[63]。移植時にE21Rの予防的全身投与を行うことにより、骨髄におけるJCML前駆細胞の樹立が予防され、移植の4週間後にE21Rを投与することにより、JCMLの寛解が引き起こされ、細胞量は減少した。さらにまた、正常ヒト骨髄およびJCML骨髄で同時移植したSCID/NODマウスにE21Rを投与することにより、JCML量の低下が見られたが、正常骨髄細胞は影響を受けなかった。
虚血性心疾患は、世界的に最も共通した死因である。ここ数年、動脈壁における脂質蓄積と提携して生じる炎症性細胞集積を伴う炎症は、アテローム性動脈硬化症の病因の重要な役割を果たしているという概念は強まった。
ひとたび動脈壁に常在すれば、単球およびマクロファージなどの炎症細胞は局所炎症反応に関与し、局所炎症反応を永続化する。これらのマクロファージは、一連のリポタンパク質に対してスカベンジャー受容体も発現し、それにより「泡沫細胞」への細胞分化に寄与する。これらの病変の古典的特徴である脂質コアの発症に寄与するのは、これらの「泡沫細胞」の死である。これらのアテローム斑内で炎症が継続するので、これらの活性化した炎症細胞は平滑筋細胞(SMC)増殖およびプラークの線維症を促進する線維形成性メディエーターおよび増殖因子を放出する。線維症の促進に加えて、これらの細胞はまた、線維性プラークの弱体化に寄与し、それにより線維性プラークを破壊しやすくするマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)などのタンパク質分解酵素を放出する。ひとたび破裂したこれらのプラークは、血管中に細胞残屑および凝固因子、たとえば組織因子を放出し、凝固カスケードを刺激して血栓を形成させる。結果として生じた動脈血栓症は、心筋虚血または梗塞形成をもたらす。
本明細書においては、“および/または”は、2つの特定の特徴または成分のそれぞれの特定の開示が、もう一方の有り無しで解釈されるべきである。例えば“Aおよび/またはB”は、それぞれが個別に本明細書に記載されている場合と同様に、(i)A、(ii)Bのいずれかならびに(iii)AおよびBのぞれぞれの開示として解釈されるべきである。
GM-CSFRαは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子に対する受容体のα鎖である。ヒトGM-CSFRαの完全長配列は、アクセッション番号S06945(gi:106355)[76]として寄託されており、本明細書においては配列番号202として記載されている。ヒトGM-CSFRαの成熟体、すなわちシグナルペプチドが切断されたものは、本明細書においては配列番号206として記載されている。特記しない限り、本明細書におけるGM-CSFRαへの言及は、ヒトまたはヒト以外の霊長類(例えばカニクイザル)い、通常はヒトGM-CSFRαのことを言う。GM-CSFRαは天然に存在するGM-CSFRαであることもでき、組換えGM-CSFRαであることもできる。
ヒトGM-CSF受容体αの298アミノ酸の細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号205を有する。
特記しない限り、本明細書におけるGM-CSFへの言及は、ヒトまたはヒト以外の霊長類(例えばカニクイザル)GM-CSFのことを言い、通常ヒトGM-CSFのことを言う。GM-CSFは、通常成熟GM-CSF受容体α鎖(配列番号206)の細胞外ドメイン(配列番号205)に結合する。本明細書の他の部分で記載のように、この結合は、本発明の結合構造要素により阻害される。
天然に存在するGM-CSFRαのスプライシング変種は同定されている。例えば文献を参照のこと[77、78]。これらのスプライシング変種において、細胞外ドメインは高度に保存されている。本発明の結合構造要素は、GM-CSFRαの1以上のスプライシング変種に結合できる場合もあり、結合できない場合もあり、GM-CSFのGM-CSFRαの1以上のスプライシング変種への結合を阻害できる場合もあり、阻害できない場合もある。
結合構造要素は、互いに結合する1対の分子の構成員を意味する。結合ペアの構成員は天然由来であることもでき、あるいは全合成的または部分合成的に作製することもできる。分子対の構成員の1つは、その表面または空洞上に領域を有し、この領域は分子対の他の構成員の特定の空間および極性構造に結合し、従ってこれらに相補的である。結合対タイプの例は、抗原-抗体、ビオチン-アビジン、ホルモン-ホルモン受容体、受容体-リガンド、酵素-基質である。本発明は、抗原-抗体型反応に関する。
結合構造要素は、通常、抗原結合部位を有する分子を含む。例えば、結合構造要素は抗原結合部位を含む抗体分子または非抗体タンパク質であり得る。抗原結合部位は、フィブロネクチンまたはシトクロムBなどの非抗体タンパク質骨格上のCDRの配置による[80,81,82]かまたはタンパク質骨格内のループのアミノ酸残基を無作為化または変異させて望ましい標的に対する結合を付与することにより提供できる。タンパク質における新規結合部位を操作するための骨格については詳細に概説されている[82]。抗体模倣体のためのタンパク質骨格は、国際公開番号WO/0034784に開示されており、そこにおいて発明者は少なくとも1つの無作為化させたループを有するフィブロネクチンタイプIIIドメインを含むタンパク質(抗体模倣体)を記載している。1以上のCDR、例えば1組のHCDRを移植するための適切な骨格は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの任意のドメインメンバーにより提供されることができる。この骨格はヒトまたはヒト以外のタンパク質であり得る。
非抗体タンパク質骨格における抗原結合部位の使用は引用文献[79]に概説されている。安定な主鎖および1以上の可変ループを有するタンパク質であって、ループ(単数または複数)のアミノ酸配列が特異的または無作為に変異されて標的抗原に結合するための抗原結合部位を生じる前記タンパク質が典型的である。このようなタンパク質は、黄色ブドウ球菌由来プロテインA、トランスフェリン、テトラネクチン、フィブロネクチン(例えば10thフィブロネクチンタイプIIIドメイン)およびリポカリンのIgG-結合ドメインを含む。他のアプローチは、サイクロチド(cyclotide)(分子内ジスルフィド結合を有する小さなタンパク質)に基づく合成“ミクロボディ(Microbodies)”(Selecore GmbH)を含む。
前述のように、CDRはフィブロネクチンまたはシトクロムBなどの骨格に含まれることができるが[80、81、82]、本発明のCDRまたは1組のCDRを保持する構造は、一般に抗体H鎖もしくはL鎖配列またはそれらの実質的な部分であり、該構造中、CDRまたは1組のCDRは、再構成免疫グロブリン遺伝子によりコードされる天然に存在するVHおよびVL抗体可変領域のCDRまたは1組のCDRに対応する位置に位置する。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、(Kabatら、1987 [98]およびその最新版 、現在インターネットで入手できる(http://immuno.bme.nwu.edu または 任意の検索エンジンを用いて“Kabat”を検索されたい)を参照することにより決定できる。
抗体分子は、天然のものであれ、部分もしくは全合成的に製造されるものであれ、免疫グロブリンを意味する。この用語はまた、抗体抗原結合部位を含む任意のポリペプチドまたはタンパク質も含む。抗体抗原結合部位を含む抗体フラグメントは、Fab、F(ab’)2、Fab’、Fab’-SH、scFv、Fv、dAb、Fdなどの分子およびダイアボディである。
モノクローナル抗体および他の抗体を利用し、組換えDNA技術を用いて、元の抗体の特異性を保持している他の抗体またはキメラ分子を製造することは可能である。このような技術は、異なる免疫グロブリンの定常領域または定常領域+フレームワーク領域に、抗体の免疫グロブリン可変領域またはCDRをコードするDNAを導入することを含むことができる。例えば、EP-A-184187、GB2188638AまたはEP-A-239400および多数の以下の文献を参照のこと。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞は遺伝的変異または他の変化を受けることができ、それらは産生される抗体の標的結合を変えることも、変えないこともできる。
多くの方法で抗体を改変できるので、用語“抗体分子”は、抗体抗原結合部位を有する任意の結合構造要素または物質を含むとして解釈されるべきである。従って、この用語は、天然のものであれ、全合成もしくは部分合成のものであれ、抗体抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを含む抗体フラグメントおよび誘導体を含む。従って、他のポリペプチドに融合させた、抗体抗原結合部位または等価物を含むキメラ分子は含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、EP-A-0120694およびEP-A-0125023ならびに多数の以下の文献に記載されている。
完全な抗体のフラグメントは、抗原に結合する機能を発揮できることが明らかにされた。結合フラグメントの例は、(i)VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなるFabフラグメント;(ii)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;(iii)1つの抗体のVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント;(iv)VHまたはVLドメインからなるdAbフラグメント[87、88、89];(v)単離されたCDR領域;(vi)2つの結合されたFabフラグメントを含む二価のフラグメントであるF(ab')2フラグメント;(vii)VHドメインおよびVLドメインがペプチドリンカーにより結合され、それにより2つのドメインが結合して抗原結合部位を形成することが可能となる一本鎖Fv分子(scFv)[90、91];(viii)2重特異性一本鎖Fv二量体(PCT/US92/09965)および(ix)遺伝子融合により構築される多価または多重特異的フラグメントである"ダイアボディ"(WO94/13804;[92])である。Fv、scFvまたはダイアボディ分子は、VHおよびVLドメインを連結するジスルフィド架橋の導入により安定化できる[93]。CH3ドメインに結合したscFvを含むミニボディもまた製造できる[94]。
抗原結合部位は、標的抗原に結合し、かつ標的抗原の全部または一部に相補的な分子の一部のことをいう。抗体分子において、抗原結合部位は抗体抗原結合部位と呼ばれ、標的抗原に結合し、かつ標的抗原の全部または一部に相補的な抗体の一部を含む。抗原が大きい場合、抗体は抗原の特定の部分にのみ結合でき、その部分はエピトープと呼ばれる。抗体抗原結合部位は、1以上の抗体可変領域により提供されうる。好ましくは、抗体抗原結合部位は抗体L鎖可変領域(VL)および抗体H鎖可変領域(VH)を含む。
本明細書において、抗体配列の残基は、一般にKabatら、1971[97]によるKabat番号付けを用いて言及している。同様に引用文献[98、99]を参照のこと。
これは、本発明の結合構造要素またはこのような結合構造要素をコードする核酸が一般に本発明に記載のものである状態のことを言う。単離された要素および単離された核酸は、このような製剤がin vitroまたはin vivoで実施された組換えDNA技術によるものである場合、天然に付随する他のポリペプチドまたは核酸などの物質であって、それらの自然環境またはそれらが調製された環境(例えば細胞培養)において見いだされる物質を含まないかまたは実質的に含まない。本要素および核酸は希釈剤またはアジュバントと共に配合できるが、なお実用的には単離されている。例えば本結合要素は、イムノアッセイに使用するマイクロタイタープレートをコートするために使用する場合、通常ゼラチンまたは他の担体と混合され、診断または治療に使用される場合、薬学的に許容される担体または希釈剤と混合される。結合構造要素は、天然にまたは異種真核細胞(例えばCHOまたはNS0(ECACC85110503))細胞システムによりグリコシル化されていることができ、あるいは(例えば原核細胞内での発現により産生される場合)グリコシル化されていないこともできる。
背景
ヒト抗体フラグメントは、繊維状バクテリオファージの表面にディスプレイされたレパートリーからin vitroで選択できる。この方法はファージディスプレイ法として知られ、ヒト抗体フラグメントを誘導する手段を提供する。この方法はヒト抗ヒト特異性を単離するために使用でき、特定の親和特性の抗体を誘導するのに合わせることができる。
ヒトGM-CSFRαに結合するファージの集団を濃縮するために、ヒト脾臓リンパ球由来のscFvファージディスプレイライブラリーの選択を行った。我々は、特徴を選択したscFv抗体を単離し、これらのscFvをIgG4に変換した。種々のアッセイを用い、抗体のパネルを単離し、最適化し生殖系列化して治療抗体の適切な仕様を有するIgG4を製造した。
関節リウマチなどの疾患の炎症性の性質を反映するようにバイオアッセイを設計した。例えば、好中球のその活性部位への動員に必要な形態変化、単球による炎症促進因子の放出および特定のシグナルに応じての炎症性細胞型の生存性増大などである。本抗体はこれらのアッセイにおいて強力な中和活性を示す。用いたアッセイ法の詳細なプロトコルは、"アッセイ材料および方法"と題する以下のセクションで提供されている。
選択のために、大きな一本鎖FV(scFv)ヒト抗体ライブラリーを用いた。これは20名の健常ドナーからの脾臓リンパ球由来であり、ファージミドベクターにクローニングした。HEK293T細胞における受容体の精製タグ付き可溶性細胞外ドメインの過剰発現由来の精製GMCSF-Rαに対する一連の繰り返し選択サイクルにおいてファージディスプレイライブラリーからGM-CSFRαを認識するScFvを単離した。これは、本質的にVaughanら[102]に記載されているようにして行った。手短に言えば、ファージライブラリーへのビオチン化受容体の暴露に続いて、ファージに結合したタンパク質を、ストレプトアビジンを被覆した磁気ビーズで捕獲し、非結合ファージを洗い流した。ついでVaughanらによる記載に従って結合したファージをレスキュー(rescue)し、ついでこの選択プロセスを繰り返した。抗原濃度を減少させて選択を3ラウンド繰り返した。選択ラウンドのアウトプットからのscFvの代表的な部分をDNA配列決定にかけた。
生化学的リガンド結合アッセイにおいて活性であった抗体を、GM-CSFで刺激されたTF-1細胞の増殖を阻害する抗体の能力をアッセイすることにより中和能を測定するTF-1増殖アッセイにおける生物活性について評価した。TF-1は、赤白血病患者から樹立されたヒト前骨髄性細胞株である。この細胞株は生存および増殖に関して因子依存性であり、ヒトGM-CSFでルーチンに維持される。GM-CSF依存性増殖の阻害は、***している細胞の新しく合成されたDNA中へのトリチウム化チミジンの取り込みの減少を測定することにより測定した。本アッセイにおいて、前記scFvのすべてが適度の効力を示し、IC50値は約180〜1200nMであった。
TF-1増殖アッセイにおいて、再フォーマットしたIgGを公知のマウス抗体2B7と比較した。本アッセイにおいて、前記IgG4は活性を保持または獲得し、IC50値は6〜約1600nMであった。
ついで本抗体の受容体結合親和性をBIAcoreを用いて測定し、32〜377nMのKD計算値を得た。
28G5の効力を改善する目的で最適化プログラムを開始した。VHまたはVL CDR3のランダム変異導入を行った抗体ライブラリーを作製した。全CDRを包含するために2つの6アミノ酸ブロックにおいて各CDR3をランダム化し、ライブラリーH1(VH CDR3における6aaのN末端ブロック)、H2(VH CDR3における6aaのC末端ブロック)、L1(VL CDR3における6aaのN末端ブロック)およびL2(VL CDR3における6aaのC末端ブロック)を作製した。得られたライブラリーを、ヒトGM-CSFRαへの結合に関して繰り返し選択サイクルにかけた。次に、この選択プロセスから単離されたクローンを、変異H鎖CDR3および変異L鎖CDR3の両方を有するscFvを含む組み合わせたファージライブラリーを構築するために用いた。これらのライブラリーも同じ選択手順にかけた。
最適化プロセスの各段階において、28G5および受容体を用いるエピトープ競合アッセイを用いて、GM-CSF受容体への28G5IgG4の結合を阻害することができるscFvを同定し、ついでTF-1増殖アッセイにおいて下記のように評価した。
28G5のH鎖CDR3配列のランダム変異導入後に、TF-1アッセイにおいて適度の中和能を有するscFvのパネルが同定された。大部分の効力改良はVH CDR3の3'末端がランダム化された場合に得られた。
28G5のL鎖CDR3配列のランダム変異導入後に、TF-1アッセイにおいて適度の中和能を有するscFvのパネルを同定した。すべての効力改良はVL CDR3の3’末端がランダム化された場合に得られた。
28G5の最適化中に同定した19scFvのパネルを再フォーマットし、前述の方法を用いてIgG4として発現した。このパネルは、抗体クローン1、2および4〜20から構成された。このパネルにおける最も強力なクローンのいくつかは、組み合わせたHおよびL CDR3変異ライブラリーから得られた。このパネルにおけるIgG4抗体を、TF-1増殖アッセイにおいてそれらの活性に関して評価し、公知のマウス抗体2B7と比較した。本アッセイにおいて、すべての最適化したIgG4は2B7よりも強力であった。この場合、2B7は約1.6nMのIC50計算値を有し、一方で前記クローンは約1pm〜約1100pMのIC50計算値を有していた。データを以下の表1に示すが、概略は次のとおりである:
IC50<1500pM (抗体1、2および4〜20)
IC50<300pM (抗体1、2、4〜12および14〜20)
IC50<60pM (抗体1、2、4〜6、8〜11、14および16〜20)
IC50<10pM (抗体1、5、6、11および20)。
BIAcore 2000 System (Pharmacia Biosensor)を用いて、リード化合物を最適化したIgG4のいくつかと組換え精製タグ付きGM-CSF受容体細胞外ドメインとの相互作用の速度論的パラメータを評価した。抗体の親和性は大きく改善され、KD計算値は0.127nM〜約5nMであった。データを表2に示す。結合速度および解離速度の両方において改良が得られた。GM-CSFRαの可溶性細胞外ドメインに対するIgG4の親和性とそれらのTF-1アッセイにおける性能との間の相関は大変よく、ピアソン係数は0.85(p<0.0001)であった。比較として、2B7のKDを別に算出し、約7nMであることが示された。
28G5の最適化中に同定されたIgG4抗体をヒト顆粒球形態変化アッセイで評価し、公知のマウス抗体2B7と比較した。本アッセイで評価した抗体のすべて(抗体1、2、5、6、9〜11、16および20)は大変強力であり、7.8〜90pMのIC50を有していた。これらの中で、抗体1、2、5、6、9、16および20は50pM未満のIC50を有し、抗体1、2、6、16および20は25pM未満のIC50を有していた。我々の抗体は2B7よりも強力であった。2B7は477pMのIC50を有していた。データを表3に示す。図4は、ヒト顆粒球形態変化アッセイにおける、公知の抗体2B7と比較した、本発明の2つの代表的抗体である抗体1および抗体6のアンタゴニスト能を示す。
28G5の最適化中に同定されたIgG4抗体をカニクイザル顆粒球形態変化アッセイで評価した。前記抗体のすべてはカニクイザル受容体ばかりでなくヒト受容体でのGM-CSFの活性を中和することができ、前記抗体のすべては2B7よりも強力であった。2B7が26pMのIC50を有していたのに対し、本パネルからの代表的抗体(抗体6、抗体1および抗体2)は、それぞれ1.73、2.03および3.2pMのIC50値を有していた。
<150pM (抗体番号1、2、5、6、9&10)
<110pM (抗体番号1、2、5、6&9)
<100pM (抗体番号1、5、6&9)。
導き出された28G5およびその誘導体のアミノ酸配列を、VBASEデータベースにおける公知のヒト生殖系列配列に対してアラインメントし、配列類似性により最も近い生殖系列を同定した。28G5およびその誘導体のVHドメインに対して最も近い生殖系列はVH1 DP5であると同定された。28G5VHは、フレームワーク領域内でVH1-24(DP5)生殖系列からの14変異を有する。VLドメインに対する最も近い生殖系列は、Vλ 1VL1-e(DPL8)であり、これはフレームワーク領域内で、生殖系列からの5変異のみを有する。28G5およびその誘導体のフレームワーク領域は部位特異的突然変異誘発により生殖系列に復帰され、天然ヒト抗体に完全に一致した。1つを除くすべてのアミノ酸を生殖系列に変換でき、抗体効力においてわずかの変化だけが認められた。H鎖の位置94(Kabat番号付けを用いて、Kabatら1971)におけるアミノ酸イソロイシンは、活性の完全な消失なしには生殖系列トレオニンと交換できなかった。従って、生殖系列からのこの単一の変異は抗体フレームワーク領域中に維持された。
抗GM-CSFRα抗体の1つである抗体6の完全pA2分析をヒトおよびカニクイザル顆粒球形態変化アッセイにおいて行った。これらの系においてこの抗体は極めて強力なアンタゴニストであることをこのデータは裏付けている。ヒトおよびカニクイザルアッセイにおけるpA2計算値はそれぞれ-10.58および-10.78である(図2)。
GM-CSFは、半固体寒天アッセイにおいて、造血前駆細胞の顆粒球およびマクロファージコロニーへの分化を促進する。従って、親和性成熟抗体6および抗体1、親mAb抗体3(28G5)ならびに陰性対照(CAT001)を、コロニー形成アッセイにおいて、末梢血由来の前駆細胞を用いるこのGM-CSF比活性に拮抗するそれらの能力を評価した。親和性成熟代表的mAbは共に、ヒトGM-CSFに媒介されるin vitro造血コロニー形成の強力な阻害剤であったことを図7に示すデータは明らかにしている。
親和性成熟mAbに関しては、おおよそのIC50値は0.08μg/ml(抗体6)および0.25μg/ml(抗体1)であった。興味あることに、公知のマウス抗体2B7は、本アッセイにおいて66nMの濃度までほとんど阻害活性を有さないと思われた。
図9に示すように、抗体6の投与後、これらの両方のサイトカインは用量依存的に阻害された。これらの抗体は天然GM-CSFの活性を阻害することができ、GM-CSFによる情報伝達を阻害することにより、IL-6およびTNFaなどの重要な炎症性サイトカインを阻害する事ができることをこれらのデータは示している。IL-6およびTNFaは共に多くの炎症性徴候、例えば関節リウマチに関係していると考えられている。
さらにまた、抗体6でのこの結果に基づいて、抗体1〜20のそれぞれは、抗体1〜20のすべてがGM-CSFRaの同じ領域に結合すると考えられることから、本アッセイにおいて同様に阻害を示すと予期することができる。
どの位置が通常リガンド結合のために保存され、どの位置が抗体中でリガンド結合活性を維持するにもかかわらず可変であるかを同定するするために、我々は、生殖系列抗体6scFv配列における残基の位置の可変性を測定した。
抗原結合性に寄与する位置は、VLドメインにおけるKabat残基27A、27B、27C、32、51、52、53、90、92および96であり、VHドメインにおけるKabat残基17、34、54、57、95、97、99および100Bであると推定された。
抗原結合性に重要と推定される7つの位置(H95、H97、H99、H100B、L90、L92およびL96)を同定した。次いで我々は、28G5抗体最適化プロセス中に単離された160変種の配列のこれらの位置における残基を分析し、そのすべてはTF-1増殖アッセイにおいて最小5倍の効力改善を示した。
これらの位置のそれぞれおよびL95Aにおいて観察された種々のアミノ酸(可能な20の中から)を以下の表5のデータに要約する。28G5および/または抗体6に存在するアミノ酸に位置が強く保存されている場合、これはこれらのアミノ酸が抗原を結合させるために重要であるよい証拠である。例えば、以下の位置における残基は強く保存されている:H97、H100B、L90、L92。
親和性成熟および生殖系列抗体6scFvをコードするDNA配列を、本質的に引用文献[101]に記載されているようにしてリボソームディスプレイフォーマットに変換した。ランダム点変異を含む変種574D04配列のライブラリーを作製するために、製造業者のプロトコル(BD Bioscience)中の変異率の高い条件(1,000bpにつき7.2変異)を用いて抗体6配列に変異導入PCR法を行った。このライブラリーをリボソーム上で発現させ、精製タグ付きGM-CSFRαと共にインキュベートし、結合を生じさせた。タグをつけたGM-CSFRαに結合できる変種を捕捉し、タンパク質G(Dynal)を被覆した常磁性ビーズを用いて除去した。集団中に残った非結合変種を、引用文献[102]に記載されている大きなヒト抗体ファージディスプレイライブラリーから前もって誘導され、抗体6scFvに結合する事が知られている4つのビオチン化抗イディオタイプ抗体のプールに加えた。ビオチン化抗イディオタイプ抗体に結合している変種をストレプトアビジンビーズで捕捉し、非結合変種を洗い流した。引用文献[101]の一般的方法に従って、リボソームディスプレイによる選択のこのプロセスをさらに2ラウンド繰り返した。
リボソームディスプレイのネガティブ選択法を用いて、抗原結合性に重要な推定上の位置として抗体6のVH CDR3およびVL CDR3内の7つの位置を明らかにした。ついで全VH CDR3およびVL CDR3配列を無作為化しより高い親和性に関して選択する28G5抗体最適化プロセス中に単離された160配列変種について分析を行った。すべての配列(抗体6を含めて)は、TF-1増殖アッセイにおいて最小5倍の効力改善を示した。
我々は、それぞれがGM-CSFR-αの細胞外部分からのアミノ酸配列の短い領域に相当する2442ペプチドに対して、PEPSCAN法を用いて抗体6および公知の抗体2B7をスクリーニングした。すべてのペプチドに対する各抗体の結合シグナルを平均して平均バックグラウンドシグナルを得、各ペプチドに関してシグナル/バックグラウンド比を算出した。抗体6および2B7の両方に対して、4倍以上のシグナル/バックグラウンド比を特異的な正のシグナルとして数えた。特異的な正のシグナルを与えるペプチドの配列を保存された結合モチーフに関して分析し、抗体6は、成熟ヒトGM-CSFRαの残基226-230に対応するYLDFQモチーフに選択的に結合し、2B7抗体は成熟ヒトGM-CSFRαの残基278-281に対応するDVRIモチーフに選択的に結合する事が見出された。成熟受容体に対するアミノ酸配列の番号付けは配列番号206に記載されている。
GMCSF由来の配列を有する大部分オーバーラップする15-mer合成ペプチドを合成し、前述の[103]ように、クレジットカードフォーマットミニPEPSCANカード(3ulウェルの455ウェルプレート)を用いてスクリーニングした。PEPSCANベースのエンザイムイムノアッセイ(ELISA)で、各ペプチドへの抗体の結合を試験した。共有結合されたペプチドを含有する455ウェルクレジットカードフォーマットポリプロピレンカードをサンプルと共にインキュベートした(例えば5%ウマ血清(v/v)および5%卵白アルブミン(w/v))および1%Tween80を含むPBS溶液、あるいは軽いブロッキング条件では、4%ウマ血清(v/v)および1%Tween80を含むPBS溶液に1/1000に希釈した、10ug/mlの抗体または血清(4℃、終夜))。洗浄後、ペプチドを抗抗体ペルオキシダーゼと共にインキュベートし(希釈度1/1000、例えばウサギ-抗マウスペルオキシダーゼ、Dako)(1時間、25℃)、続いて、洗浄後、ペルオキシダーゼ基質である2,2'-アジノ-ジ-3-エチルベンゾチアゾリンスルホナート(ABTS)および2ul/ml 3%H2O2を加えた。1時間後、発色を測定した。CCD-カメラおよび画像処理システムによりELISAの発色を定量した。セットアップは、CCD-カメラおよび55mmレンズ(Sony CCD ビデオカメラ XC-77RR, Nikon マイクロニッコール 55 mm f/2.8レンズ )、カメラアダプター (Sony Camara adaptor DC-77RR)および画像処理ソフトウェアパッケージ Optimas 、バージョン 6.5 (Media Cybernetics, Sylver Spring, MD 20910, U.S.A.)からなる。Optimasはコンピュータシステムを用いる。
生化学的リガンド結合アッセイ
精製scFv調製品は、WO01/66754[104]に記載されているように製造した。精製scFv調製品のタンパク質濃度は、BCA法[105]を用いて測定した。PBSで2.5μg/mlに希釈した抗ヒトIgG4を、50μl/ウェルで、終夜4℃でFluoronunc(登録商標)96ウェルマイクロタイタープレートにコーティングした。PBS/0.1%ツイーン20 300μl/ウェルでプレートを3回洗浄し、ついで3%BSAを含むPBS溶液300μl/ウェルを用いて、室温で1時間ブロッキングした。プレートをPBS/0.1%ツイーン20 300μl/ウェルで再度3回洗浄し、1%BSA/PBSで62.5ng/mlに希釈したヒトGM-CSFRα50μlを各ウェルに加え、室温1時間プレートをインキュベートした。前述のように3回洗浄した後、サンプル物質25μlを各ウェルに加え、ついで1%BSA/PBSで2nMに希釈したビオチン化GM-CSF25μlを加えた。全結合を明らかにするために、緩衝液のみをサンプル物質として用いた。非特異的結合を明らかにするために、1%BSAで100nMに希釈した非標識GM-CSFをサンプル物質として用いた。プレートを室温で1時間インキュベートし、ついで前述のように3回洗浄した。DELFIA(登録商標)アッセイ緩衝液で100ng/mlに希釈したユーロピウム標識ストレプトアビジン(PerkinElmer)50μlをプレートの各ウェルに加え、室温で30〜60分インキュベートし、ついでDELFIA(登録商標)洗浄用緩衝液で7回洗浄した。DELFIA(登録商標)エンハンスメント溶液50μl/ウェルをプレートに加え、プレートリーダーを用いて615nmでサンプルを読み取った。
R&D Systemsから入手し、RPMI1640、10%FBS、1mMピルビン酸ナトリウムおよび4ng/ml GM-CSFで継続的に維持したTF-1細胞を、アッセイ培地(RPMI1640、5%FBS、1mMピルビン酸ナトリウム)で3回洗浄することにより飢餓状態におき、アッセイ培地に再懸濁し、37℃、5%CO2で7〜24時間インキュベートした。ついで細胞をアッセイ培地に1x105/mlで再懸濁し、96ウェル平底組織培養プレートの各ウェルに100μl加えた。アッセイ培地に希釈する前に、原液サンプルを無菌濾過することにより試験サンプルを調製した。ついで細胞の各ウェルに試験物質50μlを加え、これらを37℃、5%CO2で45〜60分間インキュベートした。ついで、アッセイ培地でEC80値に希釈したGM-CSF(またはGM-CSFのいくつかのバッチに対して0.4ng/ml)50μlを各ウェルに加え、加湿チャンバー中、37℃、5%CO2で16時間プレートをインキュベートした。これは最終濃度7pMのGM-CSFに相当する。細胞の増殖を測定するために、アッセイ培地で5.0μCi/mlに希釈した3H-チミジン20μlをプレートの各ウェルに加え、37℃、5%CO2で4時間±30分プレートをインキュベートした。ついでプレートハーベスターを用いて、96ウェルGF/C Unifilter(登録商標)プレート上に細胞を採取し、洗浄した。フィルタープレートの各ウェルにMicroScint20(登録商標)50μl加えた後、プレートをシールしてトップカウントプレートリーダーでカウントした。
ヒトバフィーコート(輸血管理室からのヒト血液パック)を、等容量の3%デキストランT-500を含む0.9%NaCl溶液に混合した。ついでこの混合物を、界面が形成されるまで直立位置でインキュベートした。上層を採取し、ヒストパック1.077密度勾配の上部に層状に重ね、ついで400gで40分間遠心分離し、ブレーキを用いずに止まらせた。この勾配の上層を除き、顆粒球ペレットを残した。ペレット中に残っている赤血球を、細胞を20mlの氷水に30秒間再懸濁することにより溶解し、続いて氷冷した1.8%塩化ナトリウムを直ちに加えた。ついで細胞を1200rpmで再ペレット化し、アッセイ培地(RPMI1640、10%FBS、100u/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、25mM HEPES)に1x106/mlで再懸濁した。ついで96ウェル平底組織培養プレートの各ウェルに細胞100μlを加えた。原液サンプルを無菌濾過し、必要に応じてアッセイ培地で希釈して、試験サンプルを調製した。
リード化合物の最適化のために、濾過し、アッセイ培地で希釈したIgG4を、アッセイ培地で0.4ng/mlに希釈した等容量の GM-CSFを混合した。これは最終濃度 7 pMの GM-CSFに相当する。ついで抗体/GM-CSF混合物100μlを各ウェルに加えた。ついでこれを、加湿 チャンバー中、37℃、 5% CO2で3時間インキュベートした。
冷ホルムアルデヒドを最終濃度1.25%まで加え、細胞を終夜4℃で固定した。フローサイトメトリーにより2000〜5000イベント/ウェルを分析した。ついで各サンプルに関する前方散乱(FSC)の幾何平均をCellQuestを用いて導いた。幾何平均を算出するとき、無関係な集団(例えば死細胞/破片)を除外するために細胞をゲートで制御した。
GM-CSFでの刺激後にカニクイザル顆粒球の形態変化を測定するアッセイで抗体を評価した。カニクイザル全血から顆粒球を精製し、本質的にヒト顆粒球形態変化アッセイに記載されているようにしてアッセイを行った。
scFvおよびIgG4と組換え受容体との相互作用の速度論的パラメータを評価するためにBIAcore 2000 System (Pharmacia Biosensor)を用いた。このバイオセンサーは、表面プラズモン共鳴の光学効果を利用して、検体分子とデキストランマトリックスに共有結合したリガンド分子との相互作用から生じる表面濃度の変化を調べる。典型的には、自由溶液中の検体種は結合リガンド上を経過し、任意の結合は局所SPRシグナルの増加として検出される。これに続いて、洗浄の期間があり、洗浄中、検体種の解離はSPRシグナルの減少として観察され、その後残った検体はリガンドから取り除かれ、この手順がいくつかの異なる検体濃度で繰り返される。結合リガンドの絶対結合能または速度論プロフィールのいずれもが大きく変わらないことを確かめるために、通例、実験中一連の対照が用いられる。検体サンプルの主な希釈剤および解離相溶媒として、典型的には、hepes緩衝生理食塩水(HBS-EP)が用いられる。実験データは、時間に対する共鳴単位(resonance unit)(SPRシグナルに直接に対応する)で記録される。共鳴単位は、結合した検体のサイズおよび量に直接に比例する。ついで、解離相(解離速度単位s-1)および会合相(会合速度単位M-1s-1)に速度定数を帰属するためにBIAevaluationソフトウェアパッケージを用いることができる。ついでこれらの図から会合および解離親和定数の算出が可能となる。
マウスIL-3シグナル配列を含むヒトGM-CSF受容体α細胞外ドメイン(配列番号205、成熟GM-CSF Rのアミノ酸1-298を示す)をコードする配列を組み込み、N末端精製タグを組み込んだpEFBOS発現ベクター[106]を用いて、組換えN末端タグをつけたGM-CSF受容体細胞外ドメイン(ECD)ポリペプチドを製造した。標準手順を用い、pEFBOSベクターを用いてCHO細胞内でタグをつけたECDポリペプチドを発現させた。このポリペプチドは、精製GM-CSFRα細胞外ドメインまたはGM-CSFRαの可溶性細胞外ドメインとも呼ぶことができる。
任意の適切な精製タグを用いることができ、例えばFlagペプチド(DYKDDDE-配列番号204)、Fc、ビオチンまたはHisタグを用いることができる。任意の適切な技術を用いて精製を行うことができ、例えばFlagタグをつけたECDポリペプチド(配列番号203)はM2アフィニティークロマトグラフィーカラムで精製し、FLAGペプチドで溶出することができる。
単球の精製(Monocyte Isolation Kit - Miltenyi Biotec - 130-053-301):
ヒストパック1.077密度勾配(Sigma、Cat. No.1077-1)の上部にヒトバフィーコート(輸血管理室からのヒト血液パック)を層状に重ね、400xgで40分間細胞を遠心分離した。遠心機を停止するとき、ブレーキをかけなかった。ついで界面からPBMC細胞を採取した。細胞をPBSで洗浄し、300xgで10分間ペレット化し、ついで氷水20mlで15秒間再縣濁することにより残った赤血球を溶解し、次に直ちに氷冷した1.8%NaClを加えた。ついで1200rpmで5分間細胞をペレット化し、MACS緩衝液(PBS、2mM EDTA)600μlに再懸濁した。キットで提供されるFc阻止試薬200μlを細胞に加え、混合した後、ハプテン-抗体カクテル(キットでも提供される)200μlを加え、混合した。ついで4℃で15分間細胞をインキュベートし、次にMACS緩衝液50mlで2回洗浄した。細胞ペレットをMACS緩衝液600μlに再懸濁し、ついでFc阻止試薬200μlを加え、混合し、次にMACS抗ハプテンマイクロビーズ200μlを加え、混合した。細胞を4℃で45分間インキュベートし、ついでMACS緩衝液50mlで洗浄し、MACS緩衝液500μlに再懸濁した。MACS緩衝液3mlで洗浄して単一のカラム(Miltenyi Biotec130-042-401)を調製し、ついで細胞浮遊液をカラムに加えた。濃縮単球画分として溶出液を回収した。カラムをMACS緩衝液2x3mlで洗浄し、溶出液を回収した。標準的なフローサイトメトリー法を用い、抗CD14-PEで染色することにより単球の純度をチェックした。最後に、アッセイ培地(RPMI1640、10%FCS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)に4x106/mlで細胞を再懸濁した。
Costar96ウェル平底組織培養プレートの各ウェルに細胞50μlを加えた。150μg/ml rhIFNγ(R&D systyems)25μlを全ウェルに加えた。濾過し、アッセイ培地で希釈したIgG4をアッセイ培地で56ng/ml(4nM)に希釈した等容量のGM-CSFと混合した。これは最終濃度1nMのGM-CSFに相当する。ついで抗体/GM-CSF混合物75μlを各ウェルに加えた。対照には、GM-CSFのみのウェルまたはGM-CSFおよび抗体なしのウェルを用いた。ついで、加湿チャンバー中、37℃、5%CO2で18時間プレートをインキュベートした。ついで上清を採取し、ELISAによりTNF-αレベルを試験した。
PBS中4μg/mlの捕捉用抗体100μlを用い、Fluoronunc Immunosorb ELISAプレートを室温で終夜被覆した。ついでプレートをPBS/0.1%ツイーンで3回洗浄し、3%Marvelを含むPBS溶液300μl/ウェルを用い、室温で1時間ブロックした。PBS/0.1%ツイーンでプレートを3回洗浄した。アッセイプレートからの上清100μlをELISAプレートに移し、アッセイ培地で希釈したTNF-αの滴定を対照ウェルに加えた。室温で2時間プレートをインキュベートし、ついでPBS/0.1%ツイーンで4〜5回洗浄した。1%Marvel/PBSで300ng/mlに希釈した検出抗体100μlをプレートの各ウェルに加え、プレートを室温でさらに2時間インキュベートし、ついでPBS/0.1%ツイーンで4〜5回洗浄した。ストレプトアビジン-ユーロピウム(PerkinElmer1244-360)をDELFIAアッセイ緩衝液 (PerkinElmer 4002-0010)で1:1000に希釈し、100μl/ウェルで加え、ついで室温で45分間インキュベートした。ついでプレートをDELFIA洗浄用緩衝液で7回洗浄し、ついでエンハンスメント溶液(PerkinElmer4001-0010)100μl/ウェルを加え、プレートリーダーにより615nmで読み取った。
好中球活性化アッセイ(形態変化アッセイ)のために記載したようにヒトバフィーコートから細胞を精製し、アッセイ培地(RPMI-1640 Glutamax、10%FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)で洗浄し、アッセイ培地に1x106/mlで再懸濁した。Costar96ウェル平底組織培養プレートの各ウェルに細胞100μlを加えた。濾過した抗体原液をアッセイ培地で希釈し、0.4ng/mlの等容量のGM-CSFで混合した。これは最終濃度7pMのGM-CSFに相当する。対照ウェルは培地単独またはGM-CSF単独を含んでいた。ついでプレート上の各ウェルに試験サンプル/GM-CSF混合物100μlを加え、加湿チャンバー中、37℃/5%CO2で68時間細胞をインキュベートした。各ウェルにAlamarBlue20μlを加え、加湿チャンバー中、37℃/5%CO2でさらに24時間プレートをインキュベートした。ついでプレートリーダーを用い、560nmおよび590nmでプレートを読み取った。
競合的アンタゴニストの親和性を定量するための主な薬理学的ツールはシルド(Schild)分析である。このアプローチを用いることにより、機能アッセイにおけるアンタゴニストの親和性を予測するためのシステムに独立した手段である。この方法は、アンタゴニスト濃度およびその親和性は、アゴニスト反応の拮抗作用を決定するという概念に基づいている。拮抗作用は定量でき、アンタゴニストの濃度は既知であるため、アンタゴニストの親和性は定量できる。この拮抗作用は、用量比(DR)と呼ばれる、アンタゴニストのありなしで測定したアゴニストの等活性濃度(equiactive concentration)の比を測定することにより定量される。
Log(DR-1)=log[A]-log KA
これらの条件下で、縦座標に関するゼロの値は、x軸の切片を与え、ここでlog[a]=log KAである。従って、log(DR-1)=0を生じる結合構造要素の濃度は、本結合構造要素受容体複合体の平衡解離定数であるlog KAに等しい。これは、受容体を含むすべての細胞システムに対して正確であるべき、結合構造要素親和性の定量化と独立したシステムである。
pA2=log(DR-1)-log[a]
(式中、[a]は、もとの最大未満の応答を誘発するアゴニスト濃度を2倍にするのを必要にさせるアンタゴニストのモル濃度であり、DR(用量比)は、アンタゴニストのありなしで測定される、アゴニストの等活性濃度の比を測定することにより定量される)。
pA2は用量応答アッセイデータから算出できる。
標準的な臨床管理の一部として前駆細胞動員およびアフェレーシスを受けたドナーから造血前駆細胞に富む末梢血単核細胞を得た。サンプルは同定せず、細胞は、使用前に冷凍保存はしなかった。最終濃度10ng/mlのヒトGM-CSFの存在下で、半固体寒天[107]中、5x104単核細胞を培養した。試験親和性成熟ヒトmAbsおよび公知のマウス抗体2B7を寒天培地に10、5、1、0.5、0.1または0.05μg/mlの最終濃度で加えた。親ヒトmAb28G5およびイソタイプ適合陰性対照ヒトmAbであるCAT001を単一濃度10μg/mlで評価した。対照目的で、mAbについても、SCF、IL-3およびG-CSFの組み合わせで刺激されるコロニー形成を遮断するそれらの能力(Crokerら、2004)ならびにサイトカインの非存在下でのコロニー形成に対するそれらの影響を評価した。37℃、大気中10%C02で14日間インキュベートした後、コロニー形成(>40細胞の凝集体)を評価した。グルタルアルデヒドでコロニーを固定し、35Xの倍率で解剖顕微鏡を用いて計数した。
MHCクラスIプロモーターの調節下にあるヒトGM-CSFRのαおよびβ鎖の両方を発現しているトランスジェニック(Tg)マウスが作製され、huGM-CSFの投与に対するin vivo脾臓および血球反応が記載されている[108]。huGM-CSFRα特異的mAb拮抗活性のin vivo分析のために、Tgマウスから野生型マウスマウスへの骨髄移植を、トランスジェニックhuGM-CSFRαβ発現が骨髄由来造血細胞に限定され、それにより内因性受容体の発現プロフィールと良く似るキメラ動物を作製するために使用できる。これらのhuGM-CSFRαβTgキメラマウスにおいて、huGM-CSFの投与により脾臓質量の増加と循環血液単球のマージナリゼーションが引き起こされる。
ドナーTgマウスから大腿骨および脛骨を取り除き、無菌PBS+3%仔牛胎児血清(FCS)で骨髄を流し出した。ついで23G針で骨髄間質を抜き取り、単一の細胞浮遊液を得、ついで冷PBS+3%FCSで細胞を1回洗浄し、ステンレススチールメッシュを通過させた。ついで0.168M塩化アンモニウム緩衝液中での溶菌により赤血球を除去し、次にリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)+3%FCSで2回以上細胞を洗浄し、ついで再度ステンレススチールメッシュを通過させた。さらに死細胞および細胞残滓を取り除くために、FCSクッションで懸濁液を遠心分離した。生存細胞をペレットで回収し、PBSで1回洗浄し、2.5x107/mlでPBSに再懸濁した。5〜8週齢レシピエントC57/BL6マウスを、3時間離して550Radで2回、致死量放射線照射した。0.2ml細胞浮遊液(すなわち5x106細胞/マウス)をレシピエントマウスに静脈内(i.v)注射し、続いて、フード付ボックス内で0.02Mネオマイシンを含む飲料水で3週間飼育した。6週間後に、huGMCSFRαおよびβ鎖に特異的なmAbを用いて、末梢血のFACS分析により再構成を評価した。
Tgキメラマウスに、1日2回4日間皮下(s.c)経路でhuGM-CSF500ngを投与した。5匹のマウスの抗体拮抗活性群の分析のために、GM-CSF処理の開始の1日前に腹腔内(i.p)経路で特定の投与量のmAb(以下を参照)を投与した。5日目に、ADVIA(登録商標)Hematology System(Bayer Diagnostics)を用いて、循環白血球集団、特に血液単球の分析のために0.2mlの血液を採血した。ついで動物を犠牲にし、脾臓を除去して質量を測定した。
ヒトバフィーコート(輸血管理室からのヒト血液パック)をヒストパック1.077密度勾配(Sigma、Cat No.1077-1)の上部に層状に重ね、400xgで40分間細胞を遠心分離した。遠心機を止めるとき、ブレーキをかけなかった。界面からPBMC細胞を採取した。細胞をPBSで洗浄し、300xgで10分間ペレット化し、残った赤血球を氷水20mlに15秒間再縣濁することにより溶解し、ついで氷冷した1.6%NaClを直ちに加えた。ついで1200rpmで5分間細胞をペレット化し、10%FBS/RPMIおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含む10mlに再懸濁した。ついで5x106/mlに細胞を希釈した。各ウェルに細胞110μlを分配し(5.5x105/ウェル)、37℃、5%CO2で1時間細胞を沈殿させた。単一の最終濃度対照として以下の試薬を加えた:PHA(5μg/ml)、LPS(25μg/ml)、GM-CSF(10ng/ml)およびイソタイプ対照(50μg/ml)。抗体6を加えて、5倍希釈系列で最終出発濃度50μg/mlにした。ついで37℃、5%CO2で72時間プレートをインキュベートした。72時間後、上清を採取し、以下のR&D ELISA キット(hTNF-a R&D Duoset ELISA development system DY210 および hIL-6 R&D Duoset ELISA development system DY206)を用いて、TNFa およびIL-6のレベルを算出した。ELISAは供給業者の推奨に従って行った。
添付の配列表において、親クローンおよび最適化したパネルからの19クローンを含む20抗体クローンについて核酸およびアミノ酸(“PRT”)配列を記載した。抗体は、Ab1からAb20まで番号付けした。親クローンは抗体3であり、配列番号21〜30および配列番号211〜212で表される。
以下のリストにより、示された分子の配列が記載されている配列番号が識別される(nt=ヌクレオチド配列;aa=アミノ酸配列)。
1 抗体 01 VH nt
2 抗体 01 VH aa
3 抗体 01 VH CDR1 aa
4 抗体 01 VH CDR2 aa
5 抗体 01 VH CDR3 aa
6 抗体 01 VL nt
7 抗体 01 VL aa
8 抗体 01 VL CDR1 aa
9 抗体 01 VL CDR2 aa
10 抗体 01 VL CDR3 aa
11 抗体 02 VH nt
12 抗体 02 VH aa
13 抗体 02 VH CDR1 aa
14 抗体 02 VH CDR2 aa
15 抗体 02 VH CDR3 aa
16 抗体 02 VL nt
17 抗体 02 VL aa
18 抗体 02 VL CDR1 aa
19 抗体 02 VL CDR2 aa
20 抗体 02 VL CDR3 aa
21 抗体 03 VH nt
22 抗体 03 VH aa
23 抗体 03 VH CDR1 aa
24 抗体 03 VH CDR2 aa
25 抗体 03 VH CDR3 aa
26 抗体 03 VL nt
27 抗体 03 VL aa
28 抗体 03 VL CDR1 aa
29 抗体 03 VL CDR2 aa
30 抗体 03 VL CDR3 aa
31 抗体 04 VH nt
32 抗体 04 VH aa
33 抗体 04 VH CDR1 aa
34 抗体 04 VH CDR2 aa
35 抗体 04 VH CDR3 aa
36 抗体 04 VL nt
37 抗体 04 VL aa
38 抗体 04 VL CDR1 aa
39 抗体 04 VL CDR2 aa
40 抗体 04 VL CDR3 aa
41 抗体 05 VH nt
42 抗体 05 VH aa
43 抗体 05 VH CDR1 aa
44 抗体 05 VH CDR2 aa
45 抗体 05 VH CDR3 aa
46 抗体 05 VL nt
47 抗体 05 VL aa
48 抗体 05 VL CDR1 aa
49 抗体 05 VL CDR2 aa
50 抗体 05 VL CDR3 aa
51 抗体 06 VH nt
52 抗体 06 VH aa
53 抗体 06 VH CDR1 aa
54 抗体 06 VH CDR2 aa
55 抗体 06 VH CDR3 aa
56 抗体 06 VL nt
57 抗体 06 VL aa
58 抗体 06 VL CDR1 aa
59 抗体 06 VL CDR2 aa
60 抗体 06 VL CDR3 aa
61 抗体 07 VH nt
62 抗体 07 VH aa
63 抗体 07 VH CDR1 aa
64 抗体 07 VH CDR2 aa
65 抗体 07 VH CDR3 aa
66 抗体 07 VL nt
67 抗体 07 VL aa
68 抗体 07 VL CDR1 aa
69 抗体 07 VL CDR2 aa
70 抗体 07 VL CDR3 aa
71 抗体 08 VH nt
72 抗体 08 VH aa
73 抗体 08 VH CDR1 aa
74 抗体 08 VH CDR2 aa
75 抗体 08 VH CDR3 aa
76 抗体 08 VL nt
77 抗体 08 VL aa
78 抗体 08 VL CDR1 aa
79 抗体 08 VL CDR2 aa
80 抗体 08 VL CDR3 aa
81 抗体 09 VH nt
82 抗体 09 VH aa
83 抗体 09 VH CDR1 aa
84 抗体 09 VH CDR2 aa
85 抗体 09 VH CDR3 aa
86 抗体 09 VL nt
87 抗体 09 VL aa
88 抗体 09 VL CDR1 aa
89 抗体 09 VL CDR2 aa
90 抗体 09 VL CDR3 aa
91 抗体 10 VH nt
92 抗体 10 VH aa
93 抗体 10 VH CDR1 aa
94 抗体 10 VH CDR2 aa
95 抗体 10 VH CDR3 aa
96 抗体 10 VL nt
97 抗体 10 VL aa
98 抗体 10 VL CDR1 aa
99 抗体 10 VL CDR2 aa
100 抗体 10 VL CDR3 aa
101 抗体 11 VH nt
102 抗体 11 VH aa
103 抗体 11 VH CDR1 aa
104 抗体 11 VH CDR2 aa
105 抗体 11 VH CDR3 aa
106 抗体 11 VL nt
107 抗体 11 VL aa
108 抗体 11 VL CDR1 aa
109 抗体 11 VL CDR2 aa
110 抗体 11 VL CDR3 aa
111 抗体 12 VH nt
112 抗体 12 VH aa
113 抗体 12 VH CDR1 aa
114 抗体 12 VH CDR2 aa
115 抗体 12 VH CDR3 aa
116 抗体 12 VL nt
117 抗体 12 VL aa
118 抗体 12 VL CDR1 aa
119 抗体 12 VL CDR2 aa
120 抗体 12 VL CDR3 aa
121 抗体 13 VH nt
122 抗体 13 VH aa
123 抗体 13 VH CDR1 aa
124 抗体 13 VH CDR2 aa
125 抗体 13 VH CDR3 aa
126 抗体 13 VL nt
127 抗体 13 VL aa
128 抗体 13 VL CDR1 aa
129 抗体 13 VL CDR2 aa
130 抗体 13 VL CDR3 aa
131 抗体 14 VH nt
132 抗体 14 VH aa
133 抗体 14 VH CDR1 aa
134 抗体 14 VH CDR2 aa
135 抗体 14 VH CDR3 aa
136 抗体 14 VL nt
137 抗体 14 VL aa
138 抗体 14 VL CDR1 aa
139 抗体 14 VL CDR2 aa
140 抗体 14 VL CDR3 aa
141 抗体 15 VH nt
142 抗体 15 VH aa
143 抗体 15 VH CDR1 aa
144 抗体 15 VH CDR2 aa
145 抗体 15 VH CDR3 aa
146 抗体 15 VL nt
147 抗体 15 VL aa
148 抗体 15 VL CDR1 aa
149 抗体 15 VL CDR2 aa
150 抗体 15 VL CDR3 aa
151 抗体 16 VH nt
152 抗体 16 VH aa
153 抗体 16 VH CDR1 aa
154 抗体 16 VH CDR2 aa
155 抗体 16 VH CDR3 aa
156 抗体 16 VL nt
157 抗体 16 VL aa
158 抗体 16 VL CDR1 aa
159 抗体 16 VL CDR2 aa
160 抗体 16 VL CDR3 aa
161 抗体 17 VH nt
162 抗体 17 VH aa
163 抗体 17 VH CDR1 aa
164 抗体 17 VH CDR2 aa
165 抗体 17 VH CDR3 aa
166 抗体 17 VL nt
167 抗体 17 VL aa
168 抗体 17 VL CDR1 aa
169 抗体 17 VL CDR2 aa
170 抗体 17 VL CDR3 aa
171 抗体 18 VH nt
172 抗体 18 VH aa
173 抗体 18 VH CDR1 aa
174 抗体 18 VH CDR2 aa
175 抗体 18 VH CDR3 aa
176 抗体 18 VL nt
177 抗体 18 VL aa
178 抗体 18 VL CDR1 aa
179 抗体 18 VL CDR2 aa
180 抗体 18 VL CDR3 aa
181 抗体 19 VH nt
182 抗体 19 VH aa
183 抗体 19 VH CDR1 aa
184 抗体 19 VH CDR2 aa
185 抗体 19 VH CDR3 aa
186 抗体 19 VL nt
187 抗体 19 VL aa
188 抗体 19 VL CDR1 aa
189 抗体 19 VL CDR2 aa
190 抗体 19 VL CDR3 aa
191 抗体 20 VH nt
192 抗体 20 VH aa
193 抗体 20 VH CDR1 aa
194 抗体 20 VH CDR2 aa
195 抗体 20 VH CDR3 aa
196 抗体 20 VL nt
197 抗体 20 VL aa
198 抗体 20 VL CDR1 aa
199 抗体 20 VL CDR2 aa
200 抗体 20 VL CDR3 aa
201 GM-CSFRα 線状 残基 配列
202 ヒト GM-CSFRαの完全長 アミノ酸配列
203 FLAGタグをつけた ヒト GM-CSFRα 細胞外ドメイン
204 FLAG ペプチド
205 ヒト GM-CSFRα 細胞外ドメインのアミノ酸配列
206 成熟 GM-CSFRα
207 抗体 1 VL nt
208 抗体 1 VL aa
209 抗体 2 VL nt
210 抗体 2 VL aa
211 抗体 3 VL nt
212 抗体 3 VL aa
213 抗体 4 VL nt
214 抗体 4 VL aa
215 抗体 5 VL nt
216 抗体 5 VL aa
217 抗体 6 VL nt
218 抗体 6 VL aa
219 抗体 7 VL nt
220 抗体 7 VL aa
221 抗体 8 VL nt
222 抗体 8 VL aa
223 抗体 9 VL nt
224 抗体 9 VL aa
225 抗体 10 VL nt
226 抗体 10 VL aa
227 抗体 11 VL nt
228 抗体 11 VL aa
229 抗体 12 VL nt
230 抗体 12 VL aa
231 抗体 13 VL nt
232 抗体 13 VL aa
233 抗体 14 VL nt
234 抗体 14 VL aa
235 抗体 15 VL nt
236 抗体 15 VL aa
237 抗体 16 VL nt
238 抗体 16 VL aa
239 抗体 17 VL nt
240 抗体 17 VL aa
241 抗体 18 VL nt
242 抗体 18 VL aa
243 抗体 19 VL nt
244 抗体 19 VL aa
245 抗体 20 VL nt
246 抗体 20 VL aa
247 抗体 6 VH nt
248 抗体 6 VH aa
249 抗体 6 VL nt
250 抗体 6 VL aa
251 VH FR1 aa
252 VH FR2 aa
253 VH FR3 aa
254 VH FR4 aa
255 VL FR1 aa
256 VL FR2 aa
257 VL FR3 aa
258 VL FR4 aa
発現されたscFvおよびIgG配列において、位置112におけるGly残基は存在しなかった。しかしながら、この残基はVLドメインのフレームワーク4領域を形成するヒト生殖系列jセグメント配列、例えばJL2には存在しない。Gly残基はVLドメインの一部ではないと考えられる。
抗体1〜20のVLドメイン配列は前述の配列番号186〜246である。VLドメインヌクレオチド配列は最後のコドンとしてctaで終了し、Leuは対応するVLドメインのアミノ酸配列における最後のアミノ酸残基である。
配列番号51、52、56、57、216および217に示される生殖系列VHおよびVLドメイン配列に加えて、抗体6の非生殖系列VHおよびVLドメイン配列を配列番号247〜250に示す。
本開示の任意の場所で言及したすべての文書は、参照により本願に組み込まれる。
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Claims (54)
- ヒトGM-CSFRαに対する単離された結合構造要素であって、GM-CSFRαへのGM-CSFの結合を阻害し、配列番号206に示すヒトGM-CSFRαの位置226-230のTyr-Leu-Asp-Phe-Glnの少なくとも1つの残基に結合する前記結合構造要素。
- 表面プラズモン共鳴アッセイにおいて5nM以下の親和性(KD)でヒトGM-CSFRα細胞外ドメインに結合する、請求項1記載の結合構造要素。
- 抗体分子を含む、請求項1または請求項2記載の結合構造要素。
- 1組の相補性決定領域CDR1、CDR2およびCDR3ならびにフレームワークを含む抗体VHドメインであって、前記1組の相補性決定領域が、アミノ酸配列配列番号3または配列番号173を有するCDR1、アミノ酸配列配列番号4を有するCDR2ならびに配列番号5;配列番号15;配列番号25;配列番号35;配列番号45;配列番号55;配列番号65;配列番号75;配列番号85;配列番号95;配列番号105;配列番号115;配列番号125;配列番号135;配列番号145;配列番号155;配列番号165;配列番号175;配列番号185;および配列番号195;からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するCDR3を含むかあるいは1個または2個のアミノ酸置換を有する前記1組のCDR配列を含む前記抗体VHドメインを含む、請求項3記載の結合構造要素。
- 相補性決定領域CDR1、CDR2およびCDR3ならびにフレームワークを含み、VH CDR3におけるKabat残基H97がSである抗体VHドメインを含む、請求項3または請求項4記載の結合構造要素。
- VH CDR3が以下の残基:
Kabat残基H95におけるV、N、AまたはL;
Kabat残基H99におけるS、F、H、P、TまたはW;
Kabat残基H100BにおけるA、T、P、S、VまたはH
の1以上をさらに含む、請求項5記載の結合構造要素。 - Kabat残基H95がVである、請求項6記載の結合構造要素。
- Kabat残基H99がSである、請求項6または請求項7記載の結合構造要素。
- Kabat残基H100BがAまたはTである、請求項6〜8のいずれかに記載の結合構造要素。
- VH CDR3が、配列番号5、配列番号15、配列番号35、配列番号45、配列番号55、配列番号65、配列番号75、配列番号85、配列番号95、配列番号105、配列番号115、配列番号125、配列番号135、配列番号145、配列番号155、配列番号165、配列番号175、配列番号185および配列番号195からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項6のいずれかに記載の結合構造要素。
- VH CDR1におけるKabat残基H34がIである、請求項5〜10のいずれかに記載の結合構造要素。
- VH CDR1がアミノ酸配列配列番号3を有する、請求項5〜11のいずれかに記載の結合構造要素。
- VH CDR2がKabat残基H54におけるEおよび/またはKabat残基H57におけるIを含む、請求項5〜12のいずれかに記載の結合構造要素。
- VH CDR2がアミノ酸配列配列番号4を有する、請求項5〜13のいずれかに記載の結合構造要素。
- VHドメインフレームワークにおけるKabat残基H17がSである、請求項5〜14のいずれかに記載の結合構造要素。
- 相補性決定領域CDR1、CDR2およびCDR3ならびにフレームワークを含む抗体VLドメインを含む、請求項5〜15のいずれかに記載の結合構造要素。
- VL CDR3が以下の残基:
Kabat残基L90におけるS、TまたはM;
Kabat残基L92におけるD、E、Q、S、MまたはT;
Kabat残基L96におけるS、P、IまたはV
の1以上を含む、請求項16記載の結合構造要素。 - Kabat残基L90がSである、請求項17記載の結合構造要素。
- Kabat残基L92がDまたはEである、請求項17または請求項18記載の結合構造要素。
- Kabat残基L95AがSである、請求項17〜19のいずれかに記載の結合構造要素。
- Kabat残基L96がSである、請求項17〜20のいずれかに記載の結合構造要素。
- VL CDR3が配列番号10、配列番号20、配列番号40、配列番号50、配列番号60、配列番号70、配列番号80、配列番号90、配列番号100、配列番号110、配列番号120、配列番号130、配列番号140、配列番号150、配列番号160、配列番号170、配列番号180、配列番号190および配列番号200からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項16または17のいずれかに記載の結合構造要素。
- VL CDR1が、以下の残基:
Kabat残基27AにおけるS;
Kabat残基27BにおけるN;
Kabat残基27CにおけるI;
Kabat残基32におけるD;
の1以上を含む、請求項16〜22のいずれかに記載の結合構造要素。 - VL CDR1がアミノ酸配列配列番号8を有する、請求項16〜23のいずれかに記載の結合構造要素。
- VL CDR2が以下の残基:
Kabat残基51におけるN;
Kabat残基52におけるN;
Kabat残基53におけるK
の1以上を含む、請求項16〜24のいずれかに記載の結合構造要素。 - VL CDR2がアミノ酸配列配列番号9を有する、請求項16〜25のいずれかに記載の結合構造要素。
- Kabat残基H94がIである抗体VHドメインを含む、請求項3〜26のいずれかに記載の結合構造要素。
- ヒトGM-CSFRαに対する単離された結合構造要素であって、GM-CSFRαへのGM-CSFの結合を阻害し、表面プラズモン共鳴アッセイにおいて5nM以下の親和性(KD)でヒトGM-CSFRα細胞外ドメインに結合する、前記結合構造要素。
- 抗体分子を含む、請求項28記載の結合構造要素。
- ヒトGM-CSFRαに対する単離された結合構造要素であって、GM-CSFRαへのGM-CSFの結合を阻害し、ヒトGM-CSFRαの細胞外ドメインとの結合に関して、以下:
VHドメイン配列番号2およびVLドメイン配列番号7;
VHドメイン配列番号12およびVLドメイン配列番号17;
VHドメイン配列番号22およびVLドメイン配列番号27;
VHドメイン配列番号32およびVLドメイン配列番号37;
VHドメイン配列番号42およびVLドメイン配列番号47;
VHドメイン配列番号52およびVLドメイン配列番号57;
VHドメイン配列番号62およびVLドメイン配列番号67;
VHドメイン配列番号72およびVLドメイン配列番号77;
VHドメイン配列番号82およびVLドメイン配列番号87;
VHドメイン配列番号92およびVLドメイン配列番号97;
VHドメイン配列番号102およびVLドメイン配列番号107;
VHドメイン配列番号112およびVLドメイン配列番号117;
VHドメイン配列番号122およびVLドメイン配列番号127;
VHドメイン配列番号132およびVLドメイン配列番号137;
VHドメイン配列番号142およびVLドメイン配列番号147;
VHドメイン配列番号152およびVLドメイン配列番号157;
VHドメイン配列番号162およびVLドメイン配列番号167;
VHドメイン配列番号172およびVLドメイン配列番号177;
VHドメイン配列番号182およびVLドメイン配列番号187;または
VHドメイン配列番号192およびVLドメイン配列番号197
から選択されるアミノ酸配列を有するVHドメインおよびVLドメインを有する抗体分子と競合するヒト抗体分子またはヒト化抗体分子を含む前記結合構造要素。 - ヒトGM-CSFRαに対する単離された結合構造要素であって、GM-CSFRαへのGM-CSFの結合を阻害し、1組の相補性決定領域HCDR1、HCDR2およびHCDR3ならびにフレームワークを含む抗体VHドメインを含む抗体分子を含み、前記1組の相補性決定領域がアミノ酸配列配列番号3または配列番号173を有するHCDR1、アミノ酸配列配列番号4を有するHCDR2ならびに配列番号5;配列番号15;配列番号25;配列番号35;配列番号45;配列番号55;配列番号65;配列番号75;配列番号85;配列番号95;配列番号105;配列番号115;配列番号125;配列番号135;配列番号145;配列番号155;配列番号165;配列番号175;配列番号185;および配列番号195からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するHCDR3を含む、前記結合構造要素。
- 抗体分子がヒト抗体分子またはヒト化抗体分子である、請求項3〜27のいずれかまたは請求項29〜31のいずれかに記載の結合構造要素。
- VHドメインフレームワークがヒト生殖系列のVH1 DP5またはVH3 DP47フレームワークである、請求項32記載の結合構造要素。
- VLドメインフレームワークがヒト生殖系列のVλ 1 DPL8、Vλ 1 DPL3またはVλ 6_6aフレームワークであるVLドメインを含む、請求項32または請求項33記載の結合構造要素。
- GM-CSFRαへのGM-CSFの結合を阻害し、配列番号52で示されるVHドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインまたは1個もしくは2個のアミノ酸改変を有するそれらの変種および配列番号57で示されるVLドメインのアミノ酸配列を有するVLドメインまたは1個もしくは2個のアミノ酸改変を有するそれらの変種を含み、前記アミノ酸改変が置換、挿入および欠失からなる群から選択される、ヒトGM-CSFRαに対する単離された抗体分子。
- 抗体分子がIgG4である、請求項3〜27もしくは29〜34のいずれかに記載の結合構造要素または請求項35記載の抗体分子。
- 表面プラズモン共鳴アッセイにおいて1nM以下の親和性(KD)でヒトGM-CSFRα細胞外ドメインに結合する、請求項1〜36のいずれかに記載の結合構造要素または抗体分子。
- 表面プラズモン共鳴アッセイにおいて0.5nM以下の親和性(KD)でヒトGM-CSFRα細胞外ドメインに結合する、請求項37記載の結合構造要素または抗体分子。
- 7pMヒトGM-CSFを用いるTF-1細胞増殖アッセイにおいて60pM以下のIC50中和能を有する、前記請求項のいずれかに記載の結合構造要素または抗体分子。
- 7pMヒトGM-CSFを用いるTF-1細胞増殖アッセイにおいて10pM以下のIC50中和能を有する、請求項38記載の結合構造要素または抗体分子。
- 7pMヒトGM-CSFを用いるヒト顆粒球形態変化アッセイにおいて50pM以下のIC50中和能を有する、前記請求項のいずれかに記載の結合構造要素または抗体分子。
- 7pMヒトGM-CSFを用いるヒト顆粒球形態変化アッセイにおいて25pM以下のIC50中和能を有する、請求項41記載の結合構造要素または抗体分子。
- 1nMヒトGM-CSFを用いる単球TNFα放出アッセイにおいて100pM以下のIC50中和能を有する、請求項1〜42のいずれかに記載の結合構造要素または抗体分子。
- 請求項1〜43のいずれかに記載の結合構造要素または抗体分子および薬学的に許容される賦形剤を含む組成物。
- 請求項1〜43のいずれかに記載の結合構造要素または抗体分子をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子。
- 請求項43記載の核酸分子を含むin vitroの宿主細胞。
- 請求項46記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項1〜43のいずれかに記載の結合構造要素または抗体分子を製造する方法。
- 結合構造要素を精製することをさらに含む、請求項47記載の方法。
- ヒトGM-CSFRαに対する抗体分子を製造する方法において、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む親VHドメインのアミノ酸配列における1以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換により、親VHドメインのアミノ酸配列変種であるVHドメインを得ることを含む前記方法であって、ここで
親VH CDR1はアミノ酸配列配列番号3を有し;
親VH CDR2はアミノ酸配列配列番号4を有し;
親VH CDR3は配列番号5;配列番号15;配列番号25;配列番号35;配列番号45;配列番号55;配列番号65;配列番号75;配列番号85;配列番号95;配列番号105;配列番号115;配列番号125;配列番号135;配列番号145;配列番号155;配列番号165;配列番号185;および配列番号195からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し;あるいは、
親VH CDR1はアミノ酸配列配列番号173を有し、親VH CDR2はアミノ酸配列配列番号174を有し、親VH CDR3はアミノ酸配列配列番号175を有し;
場合によりこのように得られたVHドメインと1以上のVLドメインとを組み合わせて1以上のVH/VL組み合わせを得;
VHドメインまたは1つの若しくは複数のVH/VL組み合わせを試験してヒトGM-CSFRαに対する抗体分子を同定する前記方法。 - 前記1以上のVLドメインが、LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含む親VLドメインのアミノ酸配列における1以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換によって得られ;
親VL CDR1はアミノ酸配列配列番号8を有し;
親VL CDR2はアミノ酸配列配列番号9を有し;
親VL CDR3は、配列番号10、配列番号20、配列番号30、配列番号40、配列番号50、配列番号60、配列番号70、配列番号80、配列番号90、配列番号100、配列番号110、配列番号120、配列番号130、配列番号140、配列番号150、配列番号160、配列番号170、配列番号180、配列番号190および配列番号200からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項49記載の方法。 - ヒトGM-CSFRαへのヒトGM-CSFの結合を阻害する抗体分子の能力を試験することを含む、請求項49または請求項50記載の方法。
- 抗体分子組成物を製造する方法であって、請求項49〜51のいずれかに記載の方法を用いて抗体分子を得、少なくとも1つのさらなる成分を含む組成物に抗体分子を処方することを含む前記方法。
- 炎症性、呼吸器または自己免疫状態または疾患の治療薬の製造における、請求項1〜43のいずれかに記載の結合構造要素または抗体分子の使用。
- 状態または疾患が、関節リウマチ、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー反応、多発性硬化症、骨髄性白血病またはアテローム性動脈硬化症である、請求項53記載の使用。
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