BRPI0709259B1

BRPI0709259B1 - Molécula de anticorpo isolada para gm-csfra humano, composição, e uso

Info

Publication number: BRPI0709259B1
Application number: BRPI0709259-8A
Authority: BR
Inventors: Emma Suzanne Cohen; Ralph Raymond Minter; Paula Rosamund Harrison; Matthew Alexander Sleeman; Andrew Donald Nash; Louis Jerry Fabri
Original assignee: Zenyth Operations Pty. Ltd; Medimmune Limited
Priority date: 2006-03-27
Filing date: 2007-03-27
Publication date: 2022-05-31
Also published as: EP2423230A1; CN101443360A; US20210147559A1; EP1999152B1; CN103641916A; RU2008137763A; HK1166988A1; RU2012157042A; SI2423230T1; EP1999152A1; CN103641915A; WO2007110631A1; KR101481844B1; DK2423229T3; US20140079708A1; ES2424467T3; JP5335662B2; US20150376285A1; AU2007231128A1; DK1999152T3

Abstract

ELEMENTO DE LIGAÇÃO ISOLADO PARA GM-CSFR(ALFA) HUMANO, COMPOSIÇÃO, MOLÉCULA DE ANTICORPO ISOLADA PARA GM-CSFR(ALFA) HUMANO, CÉLULA HOSPEDEIRA IN VITRO, E, MÉTODO PARA PRODUZIR UM ELEMENTO DE LIGAÇÃO OU MOLÉCULA DE ANTICORPO. Elementos de ligação para cadeia alfa de receptor para fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF(alfa)), especificamente moléculas de anticorpos. Uso dos elementos de ligação no tratamento de doenças inflamatórias e autoimunes, p. ex. artrite reumatóide, asma, resposta alérgica, esclerose múltipla, leucemia mielóide e aterosclerose.

Description

[001] A presente invenção refere-se a elementos de ligação para a cadeia alfa do receptor de fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSFRα), particularmente moléculas de anticorpos anti-GMCSFRα. Ela também se refere ao uso destes elementos de ligação no tratamento de doenças inflamatórias, respiratórias e autoimunes mediadas com GMCSFRa, incluindo artrite reumatóide, doença pulmonar obstrutiva crônica e esclerose múltipla.

[002] GM-CSF é um citocina pró-inflamatória de tipo I que acentua a sobrevida, proliferação e/ou diferenciação de uma ampla faixa de tipos de células hematopoiéticas incluindo neutrófilos, eosinófilos, macrófagos e suas células progenitoras. O receptor de GM-CSF é um membro da superfamília de receptores de hematopoietina. Ele é heterodimérico, consistindo de uma subunidade alfa e uma beta. A subunidade alfa é altamente específica para GM-CSF, enquanto que a subunidade beta é compartilhada com outros receptores de citocina, incluindo IL3 e IL5. Isto é refletido numa distribuição mais ampla de tecidos da subunidade de receptor beta. A subunidade alfa, GM-CSFRa, é expressa primariamente em células mielóides e em células não- hematopoiéticas, como neutrófilos, macrófagos, eosinófilos, células dendríticas, células endoteliais e células endoteliais respiratórias. GM-CSFRa de comprimento pleno é uma glicoproteína de membrana de tipo I com 400 aminoácidos que pertence à família de receptores de citocina de tipo I, e consiste de um peptídeo-sinal de 22 aminoácidos (posições de 1 a 22), um domínio extracelular de 298 aminoácidos (posições de 23 a 320), um domínio de transmembrana das posições de 321 a 345 e um curto domínio intracelular de 55 aminoácidos. O peptídeo-sinal é clivado para proporcionar a forma madura de GM-CSFRa como uma proteína de 378 aminoácidos. Clones de cDNA do GM-CSFRa humano e murino encontram-se disponíveis, e, no nível de proteína, as subunidades de receptor apresentam 36% de identidade. GM-CSF é capaz de ligar-se com afinidade relativamente baixa à subunidade a apenas (Kd de 1 a 5 nM) mas nenhuma com a subunidade β apenas. No entanto, a presença de ambas as subunidades a e β resulta em um complexo ligante-receptor de alta afinidade (Kd " 100pM). A sinalização de GM- CSF ocorre através de sua ligação inicial à cadeia α do GM-CSFR e, então, reticulação com uma subunidade maior da cadeia β comum para gerar a interação de alta afinidade, que fosforila a via JAK-STAT. A ligação de GM-CSFR ao GMCSF é revista na ref. [1]. Esta interação também é capaz de sinalização através da fosforilação de tirosina e ativação da via de MAP quinase.

[003] Patologicamente, GM-CSF mostrou desempenhar um papel na exacerbação de doenças inflamatórias, respiratórias e autoimunes. Neutralização da ligação de GM-CSF a GM-CSFRa é, portanto, uma abordagem terapêutica para o tratamento de doença e condições mediadas com GM-CSFR.

[004] Nicola et al. [2] descreveram um anticorpo murino contra GM-CSFRα humano, denominado 2B7-17-A ou "2B7", que foi reportado como apresentando uma afinidade relativamente alta por GM-CSFRα humano, e como sendo um inibidor potente da ação biológica do GM-CSF humano em diversos ensaios biológicos diferentes. O anticorpo 2B7 encontra-se disponível comercialmente junto à Chemicon como MAB1037, e a folha de dados do produto [Product Data Sheet] para MAB1037 indica que é um inibidor potente da ação biológica do GM-CSF. 2B7 também foi revelado no WO94/09149.

[005] Mediante o uso de uma combinação de seleções de bibliotecas de fagos de scFv não tratados, mutagênese randômica e ensaios biológicos e bioquímicos projetados apropriadamente (ver a Parte Experimental abaixo), nós identificamos moléculas de anticorpos altamente potentes que se ligam a GM-CSFRα humano e inibem a ação do GM-CSF humano em seu receptor. Os resultados aqui apresentados indicam que nossos anticorpos ligam-se a uma região ou epitopo diferente de GM-CSFRα em comparação com o conhecido anticorpo anti-GM-CSFRα 2B7, e, surpreendentemente, são ainda mais potentes do que 2B7 como demonstrado numa variedade de ensaios biológicos.

[006] Assim, esta invenção refere-se a elementos de ligação que se ligam a GM-CSFRα humano e inibem a ligação de GM-CSF humano a GM-CSFRα. Elementos de ligação da invenção podem ser antagonistas de GM-CSFR. Os elementos de ligação podem ser inibidores reversíveis competitivos da sinalização de GM-CSF através de GM-CSFR.

[007] Anticorpos e outros elementos de ligação da invenção são particularmente valiosos na ligação e neutralização de GM-CSFRα, e, assim, são úteis nos tratamentos para doenças mediadas com GM- CSFRα, incluindo doenças inflamatórias e autoimunes, como indicado pela experimentação ali contida e corroborando adicionalmente a literatura técnica. Por exemplo, nós demonstramos em ensaios à base de células que anticorpos da invenção são capazes de inibir a liberação de citocinas (p. ex. IL-6 e TNFa) induzida por ligação de GM-CSF nativo a seu receptor. Como explicado mais detalhadamente abaixo, a inibição da atividade de GM-CSF por meio do bloqueio da ligação a GM-CSFRa é uma abordagem terapêutica ao tratamento de referidas doenças como artrite reumatóide (RA), asma, inflamação das vias aéreas induzida com fumaça, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), resposta alérgica, esclerose múltipla (MS), leucemia mielóide e aterosclerose.

[008] Elementos de ligação de acordo com a invenção geralmente ligam-se ao domínio extracelular do GM-CSFRa. De preferência, um elemento de ligação da invenção liga-se pelo menos a um radical de Tyr-Leu-Asp-Phe-Gln (YLDFQ), SEQ ID NO: 201, nas posições de 226 a 230 de GM-CSFRα humano maduro (SEQ ID NO: 206). O elemento de ligação pode ligar-se a pelo menos um resíduo na seqüência YLDFQ do GM-CSFRα humano, p. ex. ele pode ligar-se a um, dois, três ou quatro radicais da seqüência YLDFQ. Assim, o elemento de ligação pode reconhecer um ou mais radicais nesta seqüência, e opcionalmente ele pode ligar-se também a radicais flanqueadores adicionais ou radicais estruturalmente adjacentes no domínio extracelular de GM-CSFRa.

[009] A ligação pode ser determinada por meio de qualquer método vantajoso, por exemplo, é possível usar uma varredura de ligação de peptídeo, como um ensaio imunológico ligado a enzima (ELISA) baseado em PEPSCAN, como descrito detalhadamente alhures aqui. Em uma varredura de ligação de peptídeo, como do tipo proporcionado por Sistemas PEPSCAN, peptídeos curtos que se sobrepõem derivados do antígeno são selecionados sistematicamente quanto à ligação a um membro de ligação. Os peptídeos podem ser acoplados covalentemente a uma superfície de suporte para formar um conjunto de peptídeos. Em resumo, uma varredura de ligação de peptídeo (p. ex. "PEPSCAN") envolve a identificação (p. ex. usando ELISA) de um conjunto de peptídeos ao que o elemento de ligação se liga, sendo que os peptídeos apresentam seqüências de aminoácidos correspondentes a fragmentos da SEQ ID NO: 206 (p. ex. peptídeos de cerca de 15 radicais contíguos da SEQ ID NO: 206), e alinhando-se os peptídeos para determinar uma impressão molecular de radicais ligados pelo elemento de ligação, sendo que a impressão molecular compreende radicais comuns a peptídeos que se superpõem. De acordo com a invenção, a impressão molecular identificada pela varredura de ligação de peptídeo ou PEPSCAN pode compreender pelo menos um radical de YLDFQ correspondendo às posições de 226 a 230 da SEQ ID NO: 206. A impressão molecular pode compreender um, dois, três, quatro ou todos os radicais de YLDFQ. Um elemento de ligação de acordo com a invenção pode ligar-se a um fragmento de peptídeo (p. ex. de 15 radicais) da SEQ ID NO: 206 compreendendo um ou, mais preferivelmente, todos os radicais YLDFQ correspondentes às posições de 226 a 230 da SEQ ID NO: 206, p. ex. como determinado por uma varredura de ligação de peptídeo ou método PEPSCAN aqui descrito. Assim, um elemento de ligação da invenção pode ligar-se a um peptídeo apresentando uma seqüência de aminoácidos de 15 radicais contíguos da SEQ ID NO: 206, sendo que a seqüência de 15 radicais compreende pelo menos um radical de, ou, pelo menos, sobrepõe-se parcialmente com, YLDFQ nas posições de 226 a 230 da SEQ ID NO: 206. Detalhes de um método vantajoso de varredura de ligação de peptídeo para determinar a liquefação são indicados detalhadamente em outra parte desta descrição. Outros métodos que são bem conhecidos na arte e que poderiam ser usados para determinar os radicais ligados por um anticorpo, e/ou para confirmar resultados de varredura de ligação de peptídeo (p. ex. PEPSCAN), incluem mutagênese dirigida para sítio, troca de hidrogênio deutério, espectrometria de massa, RMN, e cristalografia de raios-X.

[0010] Assim, um elemento de ligação da invenção neutraliza, de preferência, GM-CSFRα. Neutralização significa redução ou inibição da atividade biológica do GM-CSFRα, p. ex. redução ou inibição da ligação do GM-CSF ao GM-CSFRa, ou da sinalização com GM- CSFRa, p. ex. como medido por meio de respostas mediadas com GM-CSFRa. A redução ou inibição da atividade biológica pode ser parcial ou total. O grau em que um anticorpo neutraliza o GM-CSFRa é referido como sua potência de neutralização. A potência pode ser determinada ou medida usando-se um ou mais ensaios conhecidos pela pessoa versada e/ou como descrito ou referido aqui. Por exemplo, o elemento de ligação pode apresentar atividade neutralizadora em um ou mais dos seguintes ensaios: • Ensaio bioquímico de ligação de ligante • Ensaio de proliferação de TF-1 • Ensaio de alteração de forma de granulócitos humanos • Ensaio de alteração de forma de granulócitos de primatas não-humanos cynomolgus • Ensaio de liberação de TNFα de monócitos • Ensaio de sobrevida de granulócitos • Ensaio de formação de colônias (inibição de diferenciação in vitro mediada com GM-CSF de progenitores de células sangüíneas) • Inibição da bioatividade de GM-CSF in vivo, p. ex. em camundongos quiméricos com medula óssea transgênica expressando GM-CSFR humano • Ensaio de liberação de citocinas de células mononucleares do sangue periférico

[0011] A potência é expressa normalmente como um valor IC50, em pM exceto se indicado de outra forma. Em ensaios funcionais, a IC50 é a concentração que reduz uma resposta biológica em 50% de sua máxima. Em estudos de ligação de ligante, a IC50 é a concentração que reduz a ligação de receptor em 50% do nível máximo de ligação específica. A IC50 pode ser calculada plotando-se o % máximo da resposta biológica (representado, p. ex., pela proliferação de células, que pode ser medida como incorporação de 3H timidina em cpm, em um ensaio de proliferação, pela alteração de forma em um ensaio de alteração de forma, por meio de liberação de TNFα em um ensaio de liberação de TNFα, por meio de sobrevida em um ensaio de sobrevida, pelo número de colônias em um ensaio de formação de colônias, ou pelo aumento do peso do baço ou pela diminuição dos monócitos circulantes em camundongos quiméricos com medula óssea transgênica expressando GM-CSFR humano em um teste de bioatividade) ou % de ligação de receptor específico como uma função do log da concentração do elemento de ligação, e usando um programa de software, como Prism (GraphPad) para adequar-se uma função sigmoidal aos dados para gerar valores IC50.

[0012] Um valor IC50 pode representar a média de uma pluralidade de medições. Assim, por exemplo, valores de IC50 podem ser obtidos dos resultados de experimentos em triplicata, e, então, é possível calcular um valor de IC50 médio.

[0013] No ensaio de proliferação de TF-1, elementos de ligação da invenção apresentam normalmente uma IC50 inferior a 1500 pM. Por exemplo, a IC50 pode ser < 300, < 60, < 10, ou < 1,5 pM, p. ex. de cerca de 1,0 pM. Normalmente, a IC50 é de pelo menos 0,5 ou 1,0 nM. O anticorpo murino conhecido 2B7 apresentou uma IC50 de cerca de 1600 pM neste ensaio. O ensaio de proliferação de TF-1 aqui usado foi com uma concentração final de 7 pM de GM-CSF humano. Assim, a potência de neutralização IC50 no ensaio de proliferação de TF-1 representa a capacidade de um elemento de ligação em inibir a proliferação de células TF-1 induzida por 7 pM de GM-CSF humano. Para mais detalhes, ver a seção de Métodos de Ensaio e Materiais.

[0014] Um elemento de ligação da invenção pode apresentar uma pA2 mais negativa do que -6, -7, -8, -9, -10, -10,5 ou -11 no ensaio de proliferação de TF-1. Por exemplo, pA2 pode ser de cerca de -10,5 ou - 11. O cálculo e a significância de valores de pA2 são discutidos detalhadamente na Parte Experimental sob Métodos de Ensaio e Materiais.

[0015] No ensaio de alteração de forma de granulócitos humanos, elementos de ligação da invenção normalmente apresentam uma IC50 inferior a 100 pM, p. ex. inferior a 50 pM ou inferior a 30, 25, 20, 15 ou 10 pM. Normalmente a IC50 é de pelo menos 5, 6 ou 7 pM. Em contraste, o anticorpo murino conhecido 2B7 é menos potente com uma IC50 medida de 477 pM neste ensaio. O ensaio de alteração de forma de granulócitos humanos usado aqui foi com uma concentração final de 7 pM de GM-CSF humano. Assim, a potência de neutralização IC50 no ensaio de alteração de forma de granulócitos humanos representa a capacidade de um elemento de ligação em inibir a alteração de forma de granulócitos humanos induzida por 7 pM de GM-CSF humano. Para maiores detalhes, ver a seção de Métodos de Ensaio e Materiais.

[0016] No ensaio de alteração de forma de granulócitos de cynomolgus, elementos de ligação da invenção normalmente apresentam uma IC50 inferior a 20 pM, tipicamente inferior a 10, 5 ou 2,5 pM. A IC50 pode ser de, pelo menos, 0,5, 1 ou 1,5 pM. O anticorpo murino conhecido 2B7 apresentou uma IC50 de 26 pM quando testado neste ensaio. O ensaio de alteração de forma de granulócitos de cynomolgus usado aqui foi com uma concentração final de 7 pM de GM-CSF humano. Assim, a potência de neutralização IC50 no ensaio de alteração de forma de granulócitos de cynomolgus representa a capacidade de um elemento de ligação em inibir a alteração de forma de granulócitos de cynomolgus induzida por 7 pM de GM-CSF humano. Para maiores detalhes, ver a seção de Métodos de Ensaio e Materiais.

[0017] Um elemento de ligação da invenção pode apresentar uma pA2 mais negativo do que -6, -7, -8, -9, -10, -10,5 ou -11 no ensaio de alteração de forma de humano e/ou de cynomologus. De preferência, a pA2é de cerca de -10 ou -11.

[0018] No ensaio de liberação de TNFα de monócitos, elementos de ligação da invenção normalmente apresentam uma IC50 inferior a 150 pM, tipicamente inferior a 110 pM, p. ex. inferior a 100pM. A IC50 pode ser de, pelo menos, 30 ou 40 pM. O ensaio de liberação de TNFα de monócitos usado aqui foi com uma concentração final de 1 nM de GM-CSF humano. Assim, a potência de neutralização IC50 no ensaio de liberação de TNFα de monócitos representa a capacidade de um elemento de ligação em inibir a liberação de TNFa de monócitos humanos estimulada com 1 nM de GM-CSF humano. Para maiores detalhes, ver a seção de Métodos de Ensaio e Materiais.

[0019] No ensaio de sobrevida de granulócitos, elementos de ligação da invenção normalmente apresentam uma IC50 inferior a 1000pM, tipicamente inferior a 850 pM. A IC50 pode ser inferior a 500, 250, 150, 100, 50, 30, 20 ou 10 pM. A IC50 pode ser de pelo menos 5 pM. O anticorpo murino conhecido 2B7 é inativo neste ensaio até uma concentração de 83 nM. O ensaio de sobrevida de granulócitos usado aqui foi com uma concentração final de 7 pM de GM-CSF humano. Assim, potência de neutralização IC50 no ensaio de sobrevida de granulócitos representa a capacidade de um elemento de ligação em inibir a sobrevida de granulócitos humanos induzida com 7 pM de GM- CSF humano. Para maiores detalhes, ver a seção de Métodos de Ensaio e Materiais.

[0020] No ensaio de formação de colônias, elementos de ligação da invenção podem apresentar uma IC50 inferior a 5, inferior a 2,5, inferior a 1 ou inferior a 0,3 μg/ml. De preferência, a IC50 é de 0,25 μg/ml ou menos, p. ex. inferior a 0,1 μg/ml. A IC50 pode ser de pelo menos 0,05 μg/ml. O anticorpo murino conhecido 2B7 apresenta pouca ou nenhuma atividade neste ensaio até uma concentração de 10 μg/ml (67nM). O ensaio de formação de colônias usado aqui foi com uma concentração final de 10 ng/ml de GM-CSF humano. Assim, a potência de neutralização IC50 no ensaio de formação de colônias representa a capacidade de um elemento de ligação em inibir formação de colônias induzida com 10 ng/ml de GM-CSF humano. Para maiores detalhes, ver a seção de Métodos de Ensaio e Materiais.

[0021] Um elemento de ligação da invenção pode apresentar uma capacidade dependente da dose para inibir aumento do peso do baço e/ou inibir uma diminuição induzida com GM-CSF em monócitos circulantes em camundongos quiméricos com medula óssea transgênica expressando GM-CSFR humano, que são tratados com GM-CSF humano. A IC50 para inibição do aumento do peso do baço pode ser inferior a 5, inferior a 2,5, inferior a 2, inferior a 1 ou inferior a 0,75 mg/kg. A IC50 pode ser de, pelo menos, 0,5 mg/kg em algumas concretizações.

[0022] Adicionalmente, determinou-se a cinética de ligação e de afinidade de elementos de ligação por GM-CSFRα humano, por exemplo, por meio de ressonância de plasmon de superfície, p. ex. usando BIAcore. Elementos de ligação da invenção normalmente apresenta uma KD inferior a 5 nM e, mais preferivelmente, inferior a 4, 3, 2 ou 1 nM. De preferência, KD é inferior a 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 ou 0,15 nM.

[0023] Elementos de ligação da invenção normalmente ligam-se a GM-CSFRα de primata não-humano, p. ex. GM-CSFRα de cynomologus adicionalmente ao GM-CSFRα humano. Como há uma baixa homologia entre receptor de GM-CSF humano e murino (aproximadamente 36%), elementos de ligação da invenção geralmente não se ligarão ou reagirão de maneira cruzada com o receptor murino.

[0024] Normalmente um elemento de ligação da invenção compreende uma molécula de anticorpo, p. ex. um anticorpo inteiro ou fragmento de anticorpo, como discutido mais detalhadamente abaixo. De preferência, uma molécula de anticorpo da invenção é uma molécula de anticorpo humano.

[0025] Um elemento de ligação da invenção compreende normalmente um domínio VH e/ou VL de anticorpo. Domínios VH e domínios VL de elementos de ligação também são proporcionados como parte da invenção. Dentro de cada um dos domínios VH e VL encontram-se regiões determinadoras de complementaridade ("CDRs"), e regiões de estrutura ("FRs"). Um domínio VH compreende um conjunto de HCDRs e um domínio VL compreende um conjunto de LCDRs. Uma molécula de anticorpo compreende tipicamente um domínio VH de anticorpo compreendendo uma VH de CDR1, CDR2 e CDR3 e uma estrutura. Ela também compreende alternativamente, ou adicionalmente, um domínio VL de anticorpo compreendendo uma VL de CDR1 VL, CDR2 e CDR3 e a estrutura. Uma estrutura de domínio VH ou VL compreende quatro regiões de estrutura, FR1, FR2, FR3 e FR4, interdispersadas com CDRs na estrutura a seguir: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4.

[0026] Exemplos de domínios VH e VL de anticorpos, FRs e CDRs de acordo com a presente invenção são como listados na listagem de seqüências anexa que integra a presente descrição. Todas as seqüências VH e VL, seqüências de CDR, conjuntos de CDRs e conjuntos de HCDRs e conjuntos de LCDRs aqui revelados representam aspectos e concretizações da invenção. Assim, um aspecto da invenção é um domínio VH de um elemento de ligação de acordo com a invenção. Um "conjunto de CDRs" compreende CDR1, CDR2 e CDR3. Assim, um conjunto de HCDRs significa HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e um conjunto de LCDRs significa LCDR1, LCDR2 e LCDR3. Exceto se indicado de outra forma, um "conjunto de CDRs" inclui HCDRs e LCDRs. Tipicamente, elementos de ligação da invenção são anticorpos monoclonais (mAb).

[0027] Como descrito mais detalhadamente na Parte Experimental, nós identificamos um conjunto de moléculas de anticorpos que se ligam a GM-CSFRa. Nós também identificamos determinados radicais nas regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) dos domínios VH e VL que são particularmente importantes para ligação de receptor e potência de neutralização. Como as CDRs são primariamente responsáveis para determinar a ligação e a especificidade de um elemento de ligação, sendo que é possível usar uma ou mais CDRs apresentam os radicais apropriados, como definido aqui, como definido aqui, e incorporadas em qualquer estrutura vantajosa, por exemplo, uma estrutura de domínio VH e/ou VL de anticorpo, ou uma estrutura de suporte de proteína não-anticorpo, como descrito mais detalhadamente alhures aqui. Por exemplo, uma ou mais CDRs ou um conjunto de CDRs de um anticorpo podem ser enxertadas em uma estrutura (p. ex. estrutura humana) dando uma molécula de anticorpo ou diferentes moléculas de anticorpos. Por exemplo, uma molécula de anticorpo pode compreender CDRs como revelado aqui e regiões de estrutura de seqüências de segmento de gene de linhagem germinal humana. É possível proporcionar um anticorpo com um conjunto de CDRs em uma estrutura que pode ser sujeita a terapia na linhagem germinal, onde um ou mais radicais na estrutura são alterados para equiparar-se aos radicais na posição equivalente na estrutura de linhagem germinal humana mais similar. Assim, regiões de estrutura de anticorpos são, de preferência, de linhagens germinativas e/ou humanas.

[0028] Foi realizada uma investigação em que radicais de um anticorpo candidato foram importantes para o reconhecimento de antígenos, de acordo com o método apresentado na seção experimental, e, então, realizamos análise de seqüências de 160 clones apresentando uma potência pelo menos 5 vezes maiores do que o clone de anticorpo parental em um ensaio biológico. Os resultados indicaram as posições a seguir como contribuindo para a ligação de antígenos: radicais Kabat 27A, 27B, 27C, 32, 51, 52, 53, 90, 92 e 96 no domínio VL e radicais Kabat 17, 34, 54, 57, 95, 97, 99 e 100B no domínio VH. Nas concretizações preferidas da invenção, um ou mais destes radicais Kabat é/são os radicais Kabat presentes na posição para um ou mais dos clones de anticorpos enumerados 1, 2 e de 4 a 20 cujas seqüências são reveladas na listagem de seqüências anexa. Em várias concretizações, o radical pode ser igual, ou pode diferir, do radical presente na posição no anticorpo 3.

[0029] Nossa análise indicou 4 posições de radicais nas CDRs que apresentam uma influência particularmente forte sobre a ligação do receptor: H97, H100B, L90 e L92 (numeração Kabat). de preferência, H97 de CDR3 VH é S. O radical serina nesta posição foi observado em todos os 160 clones e representam, portanto, um importante radical para reconhecimento de antígeno.

[0030] De preferência, uma CDR3 VH compreende um ou mais dos seguintes radicais:

[0031] V, N, A ou L no radical Kabat H95, da forma mais preferível, V;

[0032] S, F, H, P, T ou W no radical Kabat H99, da forma mais preferível, S;

[0033] A, T, P, S, V ou H no radical Kabat H100B, da forma mais preferível, A ou T.

[0034] De preferência, radical Kabat H34 na CDR1 VH é I. De preferência, CDR2 VH compreende E no radical Kabat H54 e/ou I no radical Kabat H57.

[0035] Onde o elemento de ligação compreende um domínio VH de anticorpo, radical Kabat H17 na estrutura de domínio VH é, de preferência, S. O radical Kabat H94 é, de preferência, I ou uma substituição conservativa do mesmo (p. ex. L, V, A ou M). Normalmente H94 é I.

[0036] De preferência, uma CDR3 VL compreende um ou mais dos seguintes radicais:

[0037] S, T ou M no radical Kabat L90, da forma mais preferível, S ou T;

[0038] D, E, Q, S, M ou T no radical Kabat L92, da forma mais preferível, D ou E;

[0039] A, P, S, T, I, L, M ou V no radical Kabat L96, da forma mais preferível, S, P, I ou V, particularmente S.

[0040] Radical Kabat L95A na CDR3 VL é, de preferência, S.

[0041] De preferência, uma CDR1 VL compreende um ou mais dos seguintes radicais: S no radical Kabat 27A; N no radical Kabat 27B; I no radical Kabat 27C; D no radical Kabat 32,

[0042] De preferência, uma CDR2 VL compreende um ou mais dos seguintes radicais: N no radical Kabat 51; N no radical Kabat 52; K no radical Kabat 53.

[0043] Em uma concretização preferida, um elemento de ligação da invenção compreende uma ou mais CDRs selecionadas dentre CDRS VH e VL, i.e. uma CDR1 VH, 2 e/ou 3 e/ou uma VL de CDR 1, 2 e/ou 3 de qualquer um dos anticorpos 1, 2 ou de 4 a 20 como mostrado na listagem de seqüências, ou do presente anticorpo 3. Em uma concretização preferida, um elemento de ligação da invenção compreende uma CDR3 VH de qualquer uma das moléculas de anticorpos a seguir: Anticorpo 1 (SEQ ID NO 5); Anticorpo 2 (SEQ ID NO 15); Anticorpo 3 (SEQ ID NO 25); Anticorpo 4 (SEQ ID NO 35); Anticorpo 5 (SEQ ID NO 45); Anticorpo 6 (SEQ ID NO 55); Anticorpo 7 (SEQ ID NO 65); Anticorpo 8 (SEQ ID NO 75); Anticorpo 9 (SEQ ID NO 85); Anticorpo 10 (SEQ ID NO 95); Anticorpo 11 (SEQ ID NO 105); Anticorpo 12 (SEQ Anticorpo 14 (SEQ Anticorpo 16 (SEQ Anticorpo 18 (SEQ ID NO 115); Anticorpo ID NO 135); Anticorpo ID NO 155); Anticorpo ID NO 175); Anticorpo 13 (SEQ ID NO 125); 15 (SEQ ID NO 145); 17 (SEQ ID NO 165); 19 (SEQ ID NO 185); Anticorpo 20 (SEQ ID NO 195). De preferência, o elemento de ligação compreende adicionalmente uma CDR1 VH da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 173 e/ou uma CDR2 VH da SEQ ID NO: 4. De preferência, um elemento de ligação compreendendo CDR3 VH da SEQ ID NO: 175 compreende uma CDR1 VH da SEQ ID NO: 173, mas pode compreender alternativamente uma CDR1 VH da SEQ ID NO: 3.

[0044] De preferência, o elemento de ligação compreende um conjunto de CDRs VH de um dos seguintes anticorpos: Anticorpo 1 (Seq ID 3-5); Anticorpo 2 (SEQ ID 13-15); Anticorpo 3 (SEQ ID 23-25); Anticorpo 4 (SEQ ID 33-35); Anticorpo 5 (SEQ ID 43-45); Anticorpo 6 (SEQ ID 53-55); Anticorpo 7 (SEQ ID 63-65); Anticorpo 8 (SEQ ID 73- 75); Anticorpo 9 (SEQ ID 83-85); Anticorpo 10 (SEQ ID 93-95); Opcionalmente ele também pode compreender um conjunto de CDRs VL de um destes anticorpos, e as CDRs VL podem ser do mesmo anticorpo ou de um anticorpo diferente relativamente às CDRs VH. De uma maneira geral, um domínio VH é pareado com um domínio VL para proporcionar um sítio de ligação de antígeno de anticorpo, embora, em algumas concretizações, seja possível usar um domínio VH ou VL sozinho para ligar antígeno. A promiscuidade de cadeia leve é bem estabelecida na arte, e, assim, o domínio VH e VL não precisa ser do mesmo clone como discutido aqui.

[0045] Um elemento de ligação pode compreender um conjunto de CDRs H e/ou L de qualquer um dos anticorpos de 1 a 20 com uma ou mais substituições, por exemplo, dez ou menos, p. ex. uma, duas, três, quatro ou cinco, substituições no conjunto de CDRs H e/ou L revelado. Substituições preferidas não são radicais Kabat diferentes de radicais Kabat 27A, 27B, 27C, 32, 51, 52, 53, 90, 92 e 96 no domínio VL, e radicais Kabat 34, 54, 57, 95, 97, 99 e 100B no domínio VH. Onde se realiza substituições nestas posições, a substituição é, de preferência, para um radical indicado aqui como sendo um radical preferido naquela posição.

[0046] Em uma concretização preferida, um elemento de ligação da invenção é uma molécula de anticorpo humana isolada apresentando um domínio VH compreendendo um conjunto de HCDRs em uma estrutura de linhagem germinal humana, p. ex. estrutura de linhagem germinal humana da família de cadeia pesada VH1 ou VH3. Em uma concretização preferida, uma molécula de anticorpo humana isolada tem um domínio VH compreendendo um conjunto de HCDRs em uma estrutura de linhagem germinal humana VH1 DP5 ou VH3 DP47. Assim, as regiões de estrutura de domínio VH podem compreender regiões de estrutura de segmento de gene de linhagem germinal humana VH1 DP5 ou VH3 DP47. A seqüência de aminoácidos de VH FR1 pode ser SEQ ID NO: 251. A seqüência de aminoácidos de VH FR2 pode ser SEQ ID NO: 252. A seqüência de aminoácidos de VH FR3 pode ser SEQ ID NO: 253. A seqüência de aminoácidos de VH FR4 pode ser SEQ ID NO: 254.

[0047] Normalmente o elemento de ligação também apresenta um domínio VL compreendendo um conjunto de LCDRs, de preferência, em uma estrutura de linhagem germinal humana, p. ex. uma estrutura de linhagem germinal humana da família de cadeia leve Vlambda 1 ou Vlambda 6. Em uma concretização preferida, a molécula de anticorpo humana isolada tem um domínio VL compreendendo um conjunto de LCDRs em uma estrutura de linhagem germinal humana VLambda 1 DPL8 ou VLambda 1 DPL3 ou VLambda 6_6a. Assim, a estrutura de domínio VL pode compreender regiões de estrutura de segmento de gene de linhagem germinal humana VLambda 1 DPL8, VLambda 1 DPL3 ou VLambda 6_6a. O domínio VL FR4 pode compreender uma região de estrutura de segmento de gene de linhagem germinal humana JL2. A seqüência de aminoácidos de VL FR1 pode ser SEQ ID NO: 255. A seqüência de aminoácidos de VL FR2 pode ser SEQ ID NO: 256. A seqüência de aminoácidos de VL FR3 pode ser 257. A seqüência de aminoácidos de VL FR4 pode ser SEQ ID NO: 258.

[0048] Um anticorpo não-linhagem germinal tem as mesmas CDRs, porém estruturas diferentes, em comparação com um anticorpo de linhagem germinal.

[0049] Um elemento de ligação da invenção pode competir pela ligação a GM-CSFRα com qualquer elemento de ligação revelado aqui, p. ex. anticorpo 3 ou qualquer um dos anticorpos 1, 2 ou de 4 a 20. Assim, um elemento de ligação pode competir pela ligação a GM- CSFRα com uma molécula de anticorpo compreendendo o domínio VH e domínio VL de qualquer um dos anticorpos 1, 2 ou de 4 a 20. A competição entre elementos de ligação pode ser analisada facilmente in vitro, por exemplo, por meio de marcação de uma molécula repórter a um elemento de ligação que pode ser detectada na presença de um ou mais outros elementos de ligação não marcados, para permitir a identificação de elementos de ligação que se ligam ao mesmo epitopo ou um epitopo de sobreposição.

[0050] A competição pode ser determinada, por exemplo, usando ELISA em que, p. ex., o domínio extracelular de GM-CSFRa, ou um peptídeo do domínio extracelular, é imobilizado em uma placa, e adiciona-se à placa um primeiro elemento de ligação marcado juntamente com um ou mais outros elementos de ligação não marcados. Observa-se a presença de um elemento de ligação não marcado que compete com o elemento de ligação marcado, por meio de uma diminuição do sinal emitido pelo elemento de ligação marcado. De maneira análoga, é possível usar um ensaio de ressonância de plasmon de superfície para determinar a competição entre elementos de ligação.

[0051] Em testes para a determinação de competição pode-se empregar um fragmento de peptídeo do antígeno, particularmente um peptídeo incluindo ou consistindo essencialmente de um epitopo ou região de ligação de interesse. É possível usar um peptídeo apresentando o epitopo ou seqüência-alvo mais um ou mais aminoácidos em qualquer ponta. Elementos de ligação de acordo com a presente invenção podem ser tais que sua ligação com antígeno é inibida por um peptídeo com, ou incluindo, a seqüência dada.

[0052] Elementos de ligação que se ligam a um peptídeo podem ser isolados, por exemplo, de uma biblioteca de apresentação de fago mediante investigação com o(s) peptídeo(s).

[0053] A presente invenção também proporciona o uso de um elemento de ligação como acima para a medição dos níveis de antígeno em um ensaio de competição, ou seja, um método de medir o nível de antígeno em uma amostra mediante o emprego de um elemento de ligação como proporcionado pela presente invenção em um ensaio de competição. Isto pode ocorrer onde a separação física de antígeno ligado de antígeno ligado não é necessária. A ligação de uma molécula repórter ao elemento de ligação de forma que venha a ocorrer uma alteração física ou óptica quando da ligação, é uma possibilidade. A molécula repórter pode gerar diretamente ou indiretamente sinais detectáveis e, de preferência, mensuráveis. A ligação de moléculas-repórter pode ser direta ou indireta, covalente, por exemplo, via uma ligação de peptídeo ou não-covalente. A ligação via uma ligação peptídica pode ser como um resultado de expressão recombinante de um gene que funde anticorpo codificante e molécula repórter.

[0054] A presente invenção também proporciona níveis de medição de antígeno diretamente, mediante o emprego de um elemento de ligação de acordo com a invenção, por exemplo, em um sistema de biossensor.

[0055] A presente invenção proporciona um método que compreende causar ou permitir a ligação de um elemento de ligação como proporcionado aqui a GM-CSFRa. Referida ligação pode ocorrer in vivo, p. ex. após administração de um elemento de ligação, ou ácido nucleico que codifica um elemento de ligação, ou pode ocorrer in vitro, por exemplo, em ELISA, Western blot, imunoquímica, imunoprecipitação, cromatografia de afinidade, ou ensaios à base de células, como um ensaio de TF-1.

[0056] É possível determinar a quantidade de ligação de elemento de ligação a GM-CSFRa. A quantificação pode ser relacionada com a quantidade do antígeno em uma amostra de teste, que pode ser de interesse diagnóstico ou prognóstico.

[0057] Um kit compreendendo um elemento de ligação ou molécula de anticorpo de acordo com qualquer aspecto ou concretização da presente invenção também é proporcionado como um aspecto da presente invenção. Em um kit da invenção, o elemento de ligação ou molécula de anticorpo pode ser marcado para permitir sua reatividade em uma amostra a ser determinada, p. ex. como descrito adicionalmente abaixo. Componentes de um kit são geralmente estéreis e encontram-se em frascos ou outros recipientes fechados hermeticamente. Kits podem ser empregados em análise diagnóstica ou outros métodos para os quais são úteis moléculas de anticorpos. Um kit pode conter instruções para uso dos componentes em um método, p. ex. um método de acordo com a presente invenção. É possível incluir, em um kit da invenção, materiais ancilares para auxiliar ou permitir a realização de um método do tipo referido.

[0058] As reatividades de anticorpos em uma amostra podem ser determinadas via qualquer meio apropriado. Ensaio rádio-imunológico (RIA) é uma possibilidade. Antígeno marcado radiativo é misturado com antígeno não-marcado (a amostra de teste) e deixado ligar-se ao anticorpo. Antígeno ligado é separado fisicamente de antígeno não ligado, e determina-se a quantidade de antígeno radiativo ligado ao anticorpo. Quanto mais antígeno há na amostra de teste, tanto menos antígeno radioativo se ligará ao anticorpo. Também é possível usar um ensaio de ligação competitiva com antígeno não-radioativo, usando antígeno ou um análogo ligado a uma molécula repórter. A molécula repórter pode ser um fluorocromo, corante de fósforo ou a laser com características de absorção ou emissão isoladas espectralmente. Fluorocromos vantajosos incluem fluoresceína, rodamina, ficoeritrina e vermelhos Texas Red. Corantes cromogênicos vantajosos incluem diaminobenzidina. Outros repórteres incluem partículas coloidais macromoleculares ou material particulado, como pérolas de látex que são coloridas, magnéticas ou paramagnéticas, e agentes biologicamente ou quimicamente ativos que podem causar diretamente ou indiretamente sinais detectáveis possíveis de serem observados visualmente, detectados eletronicamente ou registrados de outra forma. Estas moléculas podem ser enzimas, que catalisam reações que se desenvolvem, ou alteram cores ou causam alterações nas propriedades elétricas, por exemplo. Elas podem ser excitáveis molecularmente, de tal forma que transições eletrônicas entre estados de energia resultem em absorções ou emissões espectrais características. Elas podem incluir entidades químicas usadas em conjunto com biossensores. É possível empregar sistemas de detecção de biotina/avidina ou biotina/estreptavidina e fosfatase alcalina.

[0059] Os sinais gerados por conjugados anticorpo-repórter individuais podem ser usados para derivar dados absolutos ou relativos quantificáveis para ligação de anticorpo relevante em amostras (normal e teste).

[0060] Em aspectos adicionais, a invenção proporciona um ácido nucleico isolado que compreende uma seqüência que codifica um elemento de ligação, domínio VH e/ou domínio VL de acordo com a presente invenção. Ácido nucleico pode incluir DNA e/ou RNA, e pode ser totalmente ou parcialmente sintético. Referência a uma seqüência de nucleotídeos como apresentada aqui compreende uma molécula de DNA com a seqüência especificada, e compreende uma molécula de RNA com a seqüência especificada em que U é substituído por T, exceto se o contexto o exigir de outra forma. Em um aspecto preferido, a presente invenção proporciona um ácido nucleico que codifica para uma CDR ou conjunto de CDRs ou sítio de ligação de antígeno de anticorpo de domínio VH ou domínio VL, ou molécula de anticorpo, p. ex. scFv ou IgG1 ou IgG4, da invenção como definido aqui. A presente invenção também proporciona construções em forma de plasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou expressão que compreendem pelo menos um polinucleotídeo como acima.

[0061] Um aspecto adicional é uma célula hospedeira transformada com ou contendo ácido nucleico da invenção. Uma célula hospedeira do tipo referido pode ser in vitro e pode ser em cultura. Uma célula hospedeira do tipo referido pode ser in vivo. A presença in vivo da célula hospedeira pode permitir a expressão intracelular dos elementos de ligação da presente invenção como "intracorpos" ou intracelular anticorpos. Intracorpos podem ser usados para terapia gênica.

[0062] Um outro aspecto adicional proporciona um método que compreende introduzir referido ácido nucleico em uma célula hospedeira. A introdução pode empregar qualquer técnica vantajosa. No caso de células eucarióticas, técnicas vantajosas podem incluir transfecção de fosfato de cálcio, transfecção de fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, eletroporação, transfecção mediada com lipossomas e transdução usando retrovírus ou outro vírus, p. ex. vaccinia ou, no caso de células de inseto, baculovírus. A introdução de ácido nucleico na célula hospedeira, em particular uma célula eucariótica, pode usar um sistema viral ou baseado em plasmídeo. O sistema de plasmídeo pode ser mantido episomicamente ou pode ser incorporado na célula hospedeira ou em um cromossomo artificial. A incorporação pode ser via integração randômica ou objetivada de uma ou mais cópias em loci simples ou múltiplos. No caso de células bacterianas, técnicas vantajosas podem incluir transformação de cloreto de cálcio, eletroporação e transfecção usando bacteriófagos.

[0063] A introdução pode ser seguida causando ou permitindo expressão do ácido nucleico, p. ex. cultivando-se células hospedeiras em condições para expressão do gene.

[0064] Em uma concretização, o ácido nucleico da invenção é integrado no genoma (p. ex. cromossoma) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida por meio de inclusão de seqüências que promovem a recombinação com o genoma, de acordo com técnicas convencionais.

[0065] A presente invenção também proporciona um método que compreende usar uma construção como indicada acima em um sistema de expressão para expressar um elemento de ligação ou polipeptídeo como acima. Assim, métodos de preparar um elemento de ligação, um domínio VH e/ou um domínio VL da invenção, são aspectos adicionais da invenção. Um método pode compreender expressar referido ácido nucleico em condições tais a proporcionar a produção de referido elemento de ligação, domínio VH e/ou domínio VL, e recuperar o mesmo. Um método do tipo referido pode compreender cultivar células hospedeiras em condições para a produção de referido elemento de ligação ou domínio de anticorpo.

[0066] Um método de produção pode compreender uma etapa de isolamento e/ou purificação do produto. Um método de produção pode compreender formular o produto em uma composição incluindo pelo menos um componente adicional, como um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0067] Sistemas para a clonagem e expressão de um polipeptídeo numa variedade de células hospedeiras diferentes, são bem conhecidos. Células hospedeiras vantajosas incluem bactérias, células mamíferas, células de plantas, sistemas de leveduras e baculovírus e animais e plantas transgênicas. A expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpos em células procarióticas é bem estabelecida na arte [3]. Um hospedeiro bacteriano comum, preferido, é E. coli.

[0068] A expressão em células eucarióticas em cultura também pode ser obtida por aqueles com prática na arte, como uma opção para a produção de um elemento de ligação [4,5,6]. Linhagens de células mamíferas disponíveis na arte para expressão de um polipeptídeo heterólogo incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células de rim de bebê de hamster, células de melanoma de camundongo NS0, células de mieloma de rato YB2/0, células de rim embrionário humano, células de retina embrionária humana, e muitas outras.

[0069] Vetores vantajosos podem ser selecionados ou construídos, contendo seqüências reguladoras apropriadas, incluindo seqüências promotoras, seqüências terminadoras, seqüências de poliadenilação, seqüências acentuadoras, genes marcadores e outras seqüências, conforme apropriado. Vetores podem consistir de plasmídeos, p. ex., fagomídeos, ou podem ser virais, p. ex., 'fago, conforme apropriado [7]. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para a manipulação de ácido nucleico, por exemplo, na preparação de construções de ácido nucleico, mutagênese, seqüenciamento, introdução de DNA em células e expressão gênica, e análise de proteínas, encontram-se descritas detalhadamente em Ausubel et al. [8].

[0070] A presente invenção proporciona um método de obter um ou mais elementos de ligação capazes de ligar-se ao antígeno, sendo que o método inclui contatar uma biblioteca de elementos de ligação de acordo com a invenção e referido antígeno, e selecionar um ou mais elementos de ligação da biblioteca capazes de se ligarem a referido antígeno.

[0071] A biblioteca pode ser aplicada em partículas ou complexos moleculares, p. ex. pacotes genéticos replicáveis, como levedura, partículas bacterianas ou bacteriófagos (p. ex. T7), ou sistemas covalentes, ribossômicos ou outros sistemas de apresentação in vitro, sendo que cada partícula ou complexo molecular contém ácido nucleico que codifica o domínio variável VH do anticorpo apresentado sobre o mesmo, e opcionalmente também um domínio VL apresentado, se presente. A seleção de elementos de ligação capazes de se ligarem ao antígeno e apresentados em bacteriófagos ou outras partículas de biblioteca ou complexos moleculares, ácido nucleico pode ser obtido de um bacteriófago ou de outra partícula ou complexo molecular apresentando um elemento de ligação selecionado. Referido ácido nucleico pode ser usado na produção subseqüente de um elemento de ligação ou um domínio variável VH ou VL de anticorpo por meio de expressão de ácido nucleico com a seqüência de ácido nucleico obtida de um bacteriófago ou outra partícula ou complexo molecular apresentando um referido elemento de ligação selecionado.

[0072] Um domínio variável VH de anticorpo com a seqüência de aminoácidos de um domínio variável VH de anticorpo de um referido elemento de ligação selecionado pode ser proporcionado em forma isolada, como pode um elemento de ligação compreendendo referido domínio VH.

[0073] Um domínio variável VL de anticorpo com a seqüência de aminoácidos de um domínio variável VL de anticorpo de um referido elemento de ligação selecionado pode ser proporcionado em forma isolada, como o pode um elemento de ligação compreendendo um domínio VL do tipo referido.

[0074] A capacidade de ligar-se a GM-CSFRα pode ser testada adicionalmente, também a capacidade de competir por qualquer um dos anticorpos de 1 a 20 (p. ex. em formato scFv e/ou formato IgG, p. ex. IgG1 ou IgG4) para ligação a GM-CSFRa. A capacidade de neutralizar GM-CSFRa pode ser testada.

[0075] Variantes dos domínios VH e VL e CDRs da presente invenção, incluindo aquelas para as quais seqüências de aminoácidos são apresentadas aqui podem ser obtidas por meio de métodos de alteração ou mutação e seleção de seqüências, e podem ser empregadas em elementos de ligação para GM-CSFRa. Seguindo a orientação da química computacional na aplicação de técnicas de análise de dados multivariados nas relações quantitativas de atividade de propriedade/estrutura [9] de anticorpos podem ser derivadas usando-se técnicas matemáticas bem conhecidas, como regressão estatística, reconhecimento de padrões, e classificação [10,11,12,13,14,15]. As propriedades de anticorpos podem ser derivadas de modelos empíricos e teóricos (por exemplo, análise de radicais de contato provável ou propriedade físico-química calculada) de seqüência de anticorpos, estruturas funcionais e tridimensionais, e estas propriedades podem ser consideradas singelamente e em combinação.

[0076] Um sítio de ligação de antígeno de anticorpo constituído de um domínio VH e um domínio VL é formado por seis alças de polipeptídeo: três do domínio variável de cadeia leve (VL) e três do domínio variável de cadeia pesada (VH). A análise de anticorpos com estrutura atômica conhecida apresenta relações elucidadas entre a seqüência e estrutura tridimensional de sítios de combinação de anticorpo [16,17]. Estas relações implicam que, exceto quanto à terceira região (alça) em domínios VH, alças de sítios de ligação apresentam um de uma de um pequeno número de conformações de cadeia principal: estruturas canônicas. Mostrou-se que a estrutura canônica formada em uma alça particular é determinada por seu tamanho e pela presença de determinados radicais em sítios-chaves tanto nas regiões de alça como nas regiões de estrutura [16,17].

[0077] Este estudo de relação seqüência-estrutura pode ser usado para a predição daqueles radicais em um anticorpo de seqüência conhecida, mas com uma estrutura tridimensional desconhecida, que são importantes na manutenção da estrutura tridimensional de suas alças de CDR e, conseqüentemente, conservam a ligação. Estas predições podem ser corroboradas por meio de comparação das predições com os resultados de experimentos de otimização guia [lead]. Em uma abordagem estrutural, é possível criar um modelo da molécula de anticorpo [18] usando-se qualquer pacote comercial ou livremente acessível, como WAM [19]. É possível usar então um pacote de programas de análise e visualização de proteínas, como Insight II (Accelerys, Inc.) ou Deep View [20] para avaliar possíveis substituições em cada posição na CDR. Esta informação pode ser usada então para preparar substituições que provavelmente apresentam um efeito mínimo ou benéfico sobre a atividade.

[0078] As técnicas requeridas para preparar substituições em seqüências de aminoácidos de CDRs, domínios VH ou VL de anticorpo e elementos de ligação são geralmente disponíveis na arte. É possível preparar seqüências variantes com substituições que podem ou não ser preditas como apresentando um efeito mínimo ou benéfico sobre a atividade, e testadas quanto à capacidade de se ligarem a, e/ou neutralizarem, GM-CSFRα e/ou quanto a qualquer outra propriedade desejada.

[0079] Variantes de seqüências de aminoácidos de domínio variável de qualquer um dos domínios VH e VL cujas seqüências são divulgadas aqui especificamente podem ser empregadas de acordo com a presente invenção, como discutido. Variantes particulares podem incluir uma ou mais alterações de seqüências de aminoácidos (adição, deleção, substituição e/ou inserção de um radical de aminoácido), podem apresentar menos de cerca de 20 alterações, menos de cerca de 15 alterações, menos de cerca de 10 alterações ou menos de cerca de 5 alterações, podem ser 5, 4, 3, 2 ou 1. Alterações podem ser preparadas em uma ou mais regiões de estrutura e/ou uma ou mais CDRs.

[0080] De preferência, alterações não resultam em perda de função, de modo que um elemento de ligação compreendendo uma seqüência de aminoácido alterada desta forma conserva, de preferência, uma capacidade de ligar-se a, e/ou neutralizar, GM- CSFRα. Mais preferivelmente, ele conserva a mesma capacidade quantitativa de ligação e/ou de neutralização que o elemento de ligação em que a alteração não é realizada, p. ex. conforme medido em um ensaio aqui descrito. Da forma mais preferível, o elemento de ligação compreendendo uma seqüência de aminoácidos assim alterada apresenta uma capacidade incrementada de ligar-se a, ou neutralizar GM-CSFRa em comparação com um elemento de ligação em que a alteração não é realizada, p. ex. conforme medido em um ensaio aqui descrito.

[0081] A alteração pode compreender substituir um ou mais radicais de aminoácidos com um aminoácido não convencional ou não naturalmente ocorrente, modificando um ou mais radicais de aminoácidos em uma forma não convencional ou não naturalmente ocorrente, ou inserindo um ou mais aminoácidos não convencionais ou não naturalmente ocorrentes na seqüência. Números e locais preferidos de alterações em seqüências da invenção encontram-se descritos alhures aqui. Aminoácidos naturalmente ocorrentes incluem os 20 aminoácidos L "convencionais" identificados como G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E mediante o uso do código convencional de uma letra só. Aminoácidos não convencionais incluem qualquer outro radical que pode ser incorporado em uma espinha dorsal de polipeptídeo ou resultar da modificação de um radical de aminoácido existente. Aminoácidos não convencionais podem ser naturalmente ocorrentes ou não naturalmente ocorrentes. Diversos aminoácidos não convencionais naturalmente ocorrentes são conhecidos na arte, como 4-hidroxiprolina, 5-hidroxilisina, 3-metil- histidina, N-acetilserina, etc. [21]. Aqueles radicais de aminoácidos que são derivados em sua posição N-alfa só se encontrarão na ponta N de uma seqüência de aminoácidos. Normalmente, na presente invenção, um aminoácido é um aminoácido L, mas em algumas concretizações, ele pode ser um aminoácido D. A alteração pode compreender, portanto, a modificação de um aminoácido L em um aminoácido D, ou substituição por um aminoácido D. Formas metiladas, acetiladas e/ou fosforiladas de aminoácidos também são conhecidas, e aminoácidos na presente invenção podem ser sujeitos a modificação do tipo referido.

[0082] Seqüências de aminoácidos em domínios de anticorpo e elementos de ligação da invenção podem compreender aminoácidos não naturais ou não convencionais descritos acima. Em algumas concretizações é possível incorporar aminoácidos não-convencionais (p. ex. aminoácidos D) em uma seqüência de aminoácidos durante a síntese, enquanto que, em outras concretizações, os aminoácidos não-convencionais podem ser introduzidos por meio de modificação ou reposição dos aminoácidos convencionais "originais" após a síntese da seqüência de aminoácidos.

[0083] O uso de aminoácidos não convencionais e/ou não naturalmente ocorrentes aumenta a diversidade estrutural e funcional, e, portanto, pode aumentar o potencial para se obter as desejadas propriedades de ligação e neutralização de GM-CSFRa em um elemento de ligação da invenção. Adicionalmente, mostrou-se que aminoácidos D e análogos apresentam perfis farmacocinéticos melhores em comparação com aminoácidos L convencionais, em virtude da degradação in vivo de polipeptídeos apresentando aminoácidos L após a administração a um animal.

[0084] Como indicado acima, uma seqüência de aminoácidos de CDR substancialmente como apresentada aqui é realizada, de preferência, como uma CDR em um domínio variável de anticorpo humano ou uma porção substancial do mesmo. As seqüências de HCDR3 substancialmente como apresentadas aqui representam concretizações preferidas da presente invenção e prefere-se que cada uma destas seja realizada como uma HCDR3 em um domínio variável de cadeia pesada humana ou uma porção substancial da mesma.

[0085] Domínios variáveis empregados na invenção podem ser obtidos ou derivados de qualquer linhagem germinal ou domínio variável humano rearranjado, ou podem ser um domínio variável sintético baseado em seqüências consenso ou efetivas de domínios variáveis humanos conhecidos. Uma seqüência de CDR da invenção (p. ex. CDR3) pode ser introduzida em um repertório de domínios variáveis que não apresentam uma CDR (p. ex. CDR3), usando tecnologia de DNA recombinante.

[0086] Por exemplo, Marks et al. (1992) [22] descrevem métodos de produzir repertórios de domínios variáveis de anticorpos em que iniciadores consenso dirigidos, ou adjacentes, à ponta 5' da área de domínio variável são usados em conjunto com iniciadores consenso para a terceira região de estrutura de genes de VH humanos para proporcionar um repertório de domínios variáveis VH que não apresentam uma CDR3. Marks et al. descrevem adicionalmente como este repertório pode ser combinado com uma CDR3 de um anticorpo particular. Usando-se técnicas análogas, as seqüências derivadas de CDR3 da presente invenção podem ser embaralhadas com repertórios de domínios VH ou VL que não apresentam uma CDR3, e os domínios VH ou VL completos embaralhados combinados com um domínio VH ou VL completo embaralhado, combinado com um domínio VH ou VL cognato para proporcionar elementos de ligação da invenção. Em seguida, o repertório pode ser apresentado em um sistema hospedeiro vantajoso, como o sistema de apresentação de fago do WO92/01047 ou qualquer um de um grande corpo de literatura subseqüente, incluindo ref. [23], de forma que é possível selecionar elementos de ligação vantajosos. Um repertório pode consistir de qualquer quantidade, desde 104 elementos individuais até mais, por exemplo, de 106 a 108 ou 1010 elementos. Outros sistemas hospedeiros vantajosos incluem apresentação de levedura, apresentação bacteriana, apresentação de T7, apresentação viral, apresentação de células, apresentação de ribossoma e apresentação covalente. Técnicas análogas de embaralhamento ou combinatoriais também são divulgadas por Stemmer (1994)[24], que descreve a técnica com relação a um gene de β-lactamase, mas que observa que a abordagem pode ser usada para a geração de anticorpos.

[0087] Uma alternativa adicional consiste em gerar regiões VH ou VL inéditas portando seqüências derivadas de CDR da invenção usando mutagênese randômica de um ou mais genes VH e/ou VL selecionados para gerar mutações em todo o domínio variável. Uma técnica do tipo referido é descrita por Gram et al. (1992) [25], que usou PCR propensa a erro. Em concretizações preferidas prepara-se uma ou duas substituições de aminoácidos em um conjunto de HCDRs e/ou LCDRs. Outro método que pode ser usado consiste em dirigir mutagênese para regiões de CDR de genes VH ou VL [26,27].

[0088] Um aspecto adicional da invenção proporciona um método para se obter um sítio de ligação de antígeno de anticorpo para antígeno de GM-CSFRα, sendo que o método compreende proporcionar, como adição, deleção, substituição ou inserção de um ou mais aminoácidos na seqüência de aminoácidos de um domínio VH apresentado aqui, um domínio VH que é uma variante de seqüência de aminoácidos do domínio VH, opcionalmente combinando-se o domínio VH assim proporcionado com um ou mais domínios VL, e testando o domínio VH ou combinação ou combinações de VH/VL para identificar um elemento de ligação ou um sítio de ligação de antígeno de anticorpo para antígeno de GM-CSFRa e opcionalmente com uma ou mais propriedades preferidas, de preferência, a capacidade de neutralizar a atividade de GM-CSFRα. Referido domínio VL pode apresentar uma seqüência de aminoácidos que é substancialmente como apresentado aqui.

[0089] É possível empregar um método análogo em que uma ou mais variantes de seqüências de um domínio VL aqui divulgado são combinadas com um ou mais domínios VH.

[0090] Um aspecto adicional da invenção proporciona um método de preparar um elemento de ligação para antígeno de GM-CSFRα, sendo que referido método compreende: (a) proporcionar um repertório de partida de ácidos nucleicos codificando um domínio VH que inclui uma CDR3 a ser substituída, ou carecem de uma região codificante de CDR3; (b) combinar referido repertório com um ácido nucleico doador que codifica uma seqüência de aminoácidos substancialmente como indicada aqui para uma CDR3 VH de tal forma que referido ácido nucleico doador é inserido na região de CDR3 no repertório, de forma a proporcionar um repertório-produto de ácidos nucleicos codificando um domínio VH; (c) expressar os ácidos nucleicos de referido repertório- produto; (d) selecionar um elemento de ligação para GM-CSFRα; e (e) recuperar referido elemento de ligação ou ácido nucleico que codifica o mesmo.

[0091] Novamente, é possível empregar um método análogo em que uma CDR3 VL da invenção é combinada com um repertório de ácidos nucleicos codificando um domínio VL que inclui uma CDR3 a ser substituída ou não apresenta uma região codificante de CDR3.

[0092] De forma análoga, uma ou mais, ou todas as três CDRs podem ser enxertadas em um repertório de domínios VH ou VL que são, então, selecionados quanto a um elemento de ligação ou elementos de ligação para GM-CSFRa.

[0093] Em uma concretização preferida, é possível usar um ou mais de HCDR1, HCDR2 e HCDR3, p. ex. um conjunto de HCDRs de Anticorpo 1 (SEQ ID NOS: 3-5); Anticorpo 2 (SEQ ID NOS: 13-15); Anticorpo 4 (SEQ ID NOS: 33-35); Anticorpo 5 (SEQ ID NOS: 43-45); Anticorpo 6 (SEQ ID NOS: 53-55); Anticorpo 7 (SEQ ID NOS: 63-65); Anticorpo 8 (SEQ ID NOS: 73-75); Anticorpo 9 (SEQ ID NOS: 83-85); Anticorpo 10 (SEQ ID NOS: 93-95); Anticorpo 11 (SEQ ID NOS: 103105); Anticorpo 12 (SEQ ID NOS: 113-115); Anticorpo 13 (SEQ ID NOS: 123-125); Anticorpo 14 (SEQ ID NOS: 133-135); Anticorpo 15 (SEQ ID NOS: 143-145); Anticorpo 16 (SEQ ID NOS: 153-155); Anticorpo 17 (SEQ ID NOS: 163-165); Anticorpo 18 (SEQ ID NOS: 173-175); Anticorpo 19 (SEQ ID NOS: 183-185) ou Anticorpo 20 (SEQ ID NOS: 193-195); ou opcionalmente Anticorpo 3 (SEQ ID NOS: 2325), e/ou é possível usar um ou mais de LCDR1, LCDR2 e LCDR3, p. ex., um conjunto de LCDRs de Anticorpo 1 (SEQ ID NOS: 8-10); Anticorpo 2 (SEQ ID NOS: 18-20); Anticorpo 4 (SEQ ID NOS: 38-40); Anticorpo 5 (SEQ ID NOS: 48-50); Anticorpo 6 (SEQ ID NOS: 58-60); Anticorpo 7 (SEQ ID NOS: 68-70); Anticorpo 8 (SEQ ID NOS: 78-80); Anticorpo 9 (SEQ ID NOS: 88-90); Anticorpo 10 (SEQ ID NOS: 98 100); Anticorpo 11 (SEQ ID NOS: 108-110); Anticorpo 12 (SEQ ID NOS: 118-120); Anticorpo 13 (SEQ ID NOS: 128-130); Anticorpo 14 (SEQ ID NOS: 138-140); Anticorpo 15 (SEQ ID NOS: 148-150); Anticorpo 16 (SEQ ID NOS: 158-160); Anticorpo 17 (SEQ ID NOS: 168-170); Anticorpo 18 (SEQ ID NOS: 178-180); Anticorpo 19 (SEQ ID NOS: 188-190) ou Anticorpo 20 (SEQ ID NOS: 198-200); ou opcionalmente Anticorpo 3 (SEQ ID NOS: 28-30).

[0094] Uma porção substancial de um domínio variável de imunoglobulina compreenderá pelo menos as três regiões de CDR, em conjunto com suas regiões de estrutura intervenientes. De preferência, a porção também incluirá pelo menos cerca de 50% de um ou ambos dentre primeira e quarta regiões de estrutura, sendo que 50% são os 50% da ponta C da primeira região de estrutura e os 50% da ponta N da quarta região de estrutura. Radicais adicionais na ponta N ou C da parte substancial do domínio variável podem ser aqueles não associados normalmente com regiões de domínio variável naturalmente ocorrentes. Por exemplo, a construção de elementos de ligação da presente invenção preparados por meio de técnicas de DNA recombinante pode resultar na introdução de radicais N- ou C- terminais codificados por ligantes introduzidos para facilitar a clonagem ou outras etapas de manipulação. Outras etapas de manipulação incluem a introdução de ligantes para conjugar domínios variáveis da invenção a seqüências de proteínas adicionais incluindo regiões constantes de anticorpos, outros domínios variáveis (por exemplo, na produção de diacorpos) ou marcadores detectáveis/funcionais como discutido mais detalhadamente alhures aqui.

[0095] Embora em um aspecto preferido da invenção elementos de ligação compreendendo um par de domínios VH e VL sejam preferidos, domínios de ligação simples baseados em seqüências de domínios VH ou VL formam aspectos adicionais da invenção. É de conhecimento geral que domínios de imunoglobulina simples, particularmente domínios VH, são capazes de ligar antígenos-alvo. Por exemplo, ver a discussão de dAbs alhures aqui.

[0096] No caso de qualquer um dos domínios de ligação simples, estes domínios podem ser usados para selecionar domínios de complementaridade capazes de formar um elemento de ligação de dois domínios capaz de ligar-se a GM-CSFRa. Isto pode ser obtido por meio de métodos de seleção de apresentação de fago usando-se a assim-chamada abordagem combinatorial hierárquica dupla como revelado no WO92/01047, em que uma colônia individual contendo um clone de cadeia H ou L é usada para infectar uma biblioteca completa de clones codificando a outra cadeia (L ou H) e o resultante elemento de ligação de duas cadeias é selecionado de acordo com técnicas de apresentação de fago, como aquelas descritas naquela referência e [22].

[0097] Aspectos adicionais da presente invenção proporcionam composições contendo elementos de ligação da invenção e pelo menos um componente adicional, p. ex. uma composição compreendendo um elemento de ligação e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Referidas composições podem ser usadas em métodos de inibir ou neutralizar GM-CSFRa, incluindo métodos de tratamento do corpo humano ou animal por meio de terapia.

[0098] A invenção proporciona preparações heterogêneas compreendendo moléculas de anticorpos anti-GM-CSFRa. Por exemplo, referidas preparações podem ser misturas de anticorpos com cadeias pesadas de comprimento pleno e cadeias pesadas não apresentando a lisina C-terminal, com vários graus de glicosilação e/ou com aminoácidos derivados, como ciclização de um ácido glutâmico N-terminal para formar um radical de ácido piroglutâmico.

[0099] Aspectos da invenção incluem métodos de tratamento compreendendo a administração de um elemento de ligação como proporcionado, composições farmacêuticas compreendendo um elemento de ligação do tipo referido, e uso de um elemento de ligação do tipo referido na fabricação de uma droga, por exemplo, em um método de preparar uma droga ou composição farmacêutica, compreendendo formular o elemento de ligação com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00100] Tratamento anti-GM-CSFRa pode ser administrado oralmente (por exemplo, nanocorpos), por meio de injeção (por exemplo, subcutaneamente, intravenosamente, intra-arterialmente, intra-articularmente, intraperitonealmente ou intramuscularmente), por inalação, pela via intravesicular (instilação na bexiga urinária), ou topicamente (por exemplo, intraocular, intranasal, retal, em feridas, sobre a pele). O tratamento pode ser administrado por meio de infusão pulsada, particularmente com doses declinantes de elemento de ligação. A via de administração pode ser determinada pelas características físico-químicas do tratamento, mediante considerações especiais relativas à doença, ou à exigência de otimizar a eficácia ou minimizar efeitos colaterais. Considera-se que tratamento anti-GM- CSFRα não se restringirá ao uso na clínica. Portanto, prefere-se também injeção subcutânea empregando um dispositivo isento de agulha.

[00101] Uma composição pode ser administrada sozinho ou em combinação com outros tratamentos, dependentes simultaneamente ou seqüencialmente da condição a ser tratada. É possível usar tratamentos de combinação para proporcionar efeitos sinérgicos significativos, particularmente a combinação de um elemento de ligação anti-GM-CSFRα com uma ou mais outras drogas. Um elemento de ligação de acordo com a presente invenção pode ser proporcionado em combinação ou adição a um ou mais dos seguintes: NSAIDs (p. ex., inibidores de cox, como Celecoxib e outros inibidores de cox2 similares), corticosteróides (p. ex. prednisona) e drogas antirreumáticas modificadoras de doença (DMARDs) p. ex. Humira (adalimumab), metotrexato, Arava, Enbrel (Etanercept), Remicade (Infliximab), Kineret (Anakinra), Rituxan (Rituximab), Orencia (abatacept), sais de ouro, antimaláricos, sulfasalazina d-penicilamina, ciclosporina A, diclofenaco, ciclofosfamida e azatioprina.

[00102] De acordo com a presente invenção, composições proporcionadas podem ser administradas a indivíduos. A administração é, de preferência, numa "quantidade terapeuticamente efetiva", sendo que isto é suficiente para apresentar benefício a um paciente. Referido benefício pode ser, pelo menos, o melhoramento de pelo menos um sintoma. A quantidade efetiva administrada, e a taxa e duração da administração, dependerá da natureza e da gravidade do que está sendo tratado. A prescrição do tratamento, p. ex. decisões relativas à dosagem, etc., encontra-se dentro do âmbito da responsabilidade de praticantes gerais e de outros doutores médicos, e pode depender da gravidade dos sintomas e/ou da progressão de uma doença que está sendo tratada. Doses apropriadas de anticorpo são bem conhecidas na arte [28,29]. É possível usar dosagens específicas indicadas aqui, ou na obra Physician's Desk Reference (2003) como apropriadas para o tipo de droga sendo administrada. Uma quantidade terapeuticamente efetiva ou dose vantajosa de um elemento de ligação da invenção pode ser determinada comparando-se sua atividade in vitro e atividade in vivo em um modelo animal. Métodos para extrapolação de dosagens efetivas em camundongos e outros animais de teste para humanos já são conhecidos. A dose precisa dependerá de uma quantidade de fatores, incluindo se o anticorpo é para diagnóstico ou para tratamento, do tamanho e da localização da área a ser tratada, da natureza precisa do anticorpo (p. ex., anticorpo integral, fragmento ou diacorpo), e da natureza de qualquer marcador detectável ou outra molécula ligada ao anticorpo. Uma dose típica de anticorpo situa-se na faixa de 100 μg a 1 g, no caso de aplicações sistêmicas, e de 1 μg a 1 mg, no caso de aplicações tópicas. Tipicamente, o anticorpo será um anticorpo integral, de preferência, IgG1, IgG2 ou, mais preferivelmente, IgG4. Esta é uma dose para um tratamento único de um paciente adulto, que pode ser ajustada proporcionalmente para crianças e bebês, e também ajustada para outros formatos de anticorpos em proporção ao peso molecular. Os tratamentos podem ser repetidos em intervalos diários, bi-semanais, semanais ou mensais, dependendo do julgamento do médico. Em concretizações preferidas da presente invenção, o tratamento é periódico, e o período entre as administrações é de cerca de duas semanas ou mais, de preferência, de cerca de três semanas ou mais, mais preferivelmente de cerca de quatro semanas ou mais, ou cerca de uma vez por mês. Em outras concretizações preferidas da invenção, o tratamento pode ser dado antes, e/ou após a cirurgia, e, mais preferivelmente, pode ser administrado ou aplicado diretamente no sítio anatômico do tratamento cirúrgico.

[00103] Elementos de ligação da presente invenção serão administrados usualmente em forma de uma composição farmacêutica, que pode compreender pelo menos um componente adicionalmente ao elemento de ligação. Assim, composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, e para uso de acordo com a presente invenção, podem compreender, adicionalmente ao ingrediente ativo, um excipiente farmaceuticamente aceitável, veículo, tamponador, estabilizador ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos por aqueles com prática na arte. Referidos materiais deveriam ser não-tóxicos e não deveriam interferir com a eficácia do ingrediente ativo. A natureza precisa do veículo ou outro material dependerá da via de administração, que pode ser oral, ou por injeção, p. ex. intravenosa. Composições farmacêuticas para administração oral podem ser forma de tablete, cápsula, pó, líquido ou semi-sólido. Um tablete pode compreender um veículo sólido, como gelatina, ou um adjuvante. Composições farmacêuticas líquidas compreendem geralmente um veículo líquido, como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. É possível incluir solução salina fisiológica, dextrose ou outra solução de sacarídeos ou glicóis, como etileno glicol, propileno glicol ou polietileno glicol. No caso de injeção intravenosa, ou injeção no sítio de acometimento, o ingrediente ativo estará em forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável que é isenta de pirogênio e que apresenta pH, isotonicidade e estabilidade vantajosas. Aqueles com prática relevante na arte conhecem como preparar soluções vantajosas empregando, por exemplo, veículos isotônicos, como injeção de cloreto de sódio, injeção de Ringer, injeção de Ringer lactada. É possível incluir conservantes, estabilizadores, tamponantes, antioxidantes e/ou outros aditivos, conforme necessário. Elementos de ligação da presente invenção podem ser formulados em formas líquidas, semi-sólidas ou sólidas, dependendo das propriedades físico-químicas da molécula, e da via de fornecimento. Formulações podem incluir excipientes, ou combinações de excipientes, por exemplo: açúcares, aminoácidos e tensoativos. Formulações líquidas podem incluir uma ampla faixa de concentrações de anticorpos e pH. Formulações sólidas podem ser produzidas por meio de liofilização, secagem por pulverização, ou secagem por meio de tecnologia de fluido supercríticos, por exemplo. Formulações de anti-GM-CSFRa dependerão da via de fornecimento desejada: por exemplo, formulações para fornecimento pulmonar podem consistir de partículas com propriedades físicas que asseguram a penetração na parte profunda do pulmão mediante inalação; formulações tópicas podem incluir agentes modificadores de viscosidade, que prolongam o tempo em que a droga permanece no sítio de ação. Em determinadas concretizações, o elemento de ligação pode ser preparado com um veículo que protegerá o elemento de ligação contra liberação rápida, como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos, e sistemas de fornecimento microencapsulados. É possível usar polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, como acetato de vinil etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação de referidas formulações são conhecidos por aqueles com prática na arte. Ver, p. ex., Robinson, 1978 [30].

[00104] Elementos de ligação de acordo com a invenção podem ser usados em um método de tratamento ou diagnóstico do corpo humano ou animal, como um método de tratamento (que pode incluir tratamento profilático) de uma doença ou desordem em um paciente humano, que compreende administrar a referido paciente uma quantidade efetiva de um elemento de ligação da invenção. Condições tratáveis de acordo com a presente invenção incluem qualquer uma em que GM-CSFRα desempenha um papel. A literatura técnica publicada indica um papel para GM-CSF em vários doenças e condições, como resumido abaixo. Como GM-CSF se liga especificamente a GM-CSFRa, é possível encontrar efeitos patológicos e/ou sintomáticos do GM-CSF mediante a inibição do GM- CSF ao GM-CSFRa. Assim, a evidência publicada, adicionalmente aos dados farmacológicos in vivo e in vitro apresentados para as moléculas de anticorpos descritas aqui na Parte Experimental, indica que é possível usar elementos de ligação da invenção no tratamento de condições, doenças e desordens autoimunes e/ou inflamatórias, por exemplo, artrite reumatóide, asma, resposta alérgica, esclerose múltipla, leucemia mielóide e aterosclerose. Evidência publicada sobre estas condições encontra-se resumida abaixo: Asma e respostas alérgicas

[00105] Asma bronquial é uma desordem inflamatória persistente comum do pulmão, caracterizada por hiper-responsividade das vias aéreas, superprodução de muco, fibrose e níveis elevados de IgE. Hiper-responsividade das vias aéreas (AHR) é a constrição exagerada das vias aéreas a estímulos não-específicos. Tanto AHR como também a superprodução de muco são consideradas responsáveis pela obstrução variável das vias aéreas que leva às características de falta de ar dos ataques de asma (exacerbações) e que é responsável pela mortalidade associada com esta doença (em torno de 2000 mortes/ano no Reino Unido).

[00106] Estudos recentes demonstraram que o GM-CSF e seu receptor são regulados positivamente tanto no nível da proteína como no do mRNA, na asma. Adicionalmente, níveis de expressão correlacionam-se com a gravidade da doença. A produção incrementada de GM-CSF foi medida em fluido de lavagem bronquioalvelolar (BAL), células BAL, saliva, células epiteliais bronquiolares, e células mononucleares do sangue periférico estimuladas com antígeno de pacientes de asma, quando comparadas com sujeitos não-asmáticos [31,32]. Adicionalmente, mostrou-se que o nível de expressão, nas vias aéreas, do GM-CSF após exposição a alérgeno correlaciona-se com o grau de eosinofilia tissular e com a gravidade da resposta asmática de fase tardia [33]. Estudos posteriores ligaram a expressão regulada positivamente do GM-CSFR com asma intrínseca ou não-atópica, correlacionando níveis de expressão com dados da função pulmonar [34]. Em um modelo de camundongo de exposição e sensibilização à albumina, a neutralização da atividade do GM-CSF com um anticorpo policlonal de cabra, por meio de administração intranasal antes da exposição à ovalbumina, preveniu a hiper-responsividade das vias aéreas e reduziu tanto a infiltração de eosinófilos e a secreção de muco nas vias aéreas [35]. De maneira análoga, em um modelo de camundongo de doença respiratória alérgica iniciada com a administração intranasal de partículas de exaustão de diesel, neutralização do GM-CSF novamente por meio de administração intranasal de um anticorpo policlonal de cabra preveniu a hiper-responsividade das vias aéreas à metacolina, reduziu as contagens de eosinófilos BAL e também diminuiu a expressão de células de Goblet produtoras de muco no epitélio das vias aéreas [36].

[00107] O papel do GM-CSF em respostas alérgicas foi investigado adicionalmente em modelos murinos de tolerância induzida. Camundongos expostos a dose diárias repetidas de ovalbumina nebulizada sem sensibilização prévia desenvolvem tolerância à ovalbumina e falham em elicitar inflamação eosinofílica das vias aéreas. A expressão pulmonar do GM-CSF via uma construção adenoviral altera as respostas destes animais e favorece o influxo de eosinófilos em BAL, a geração de histologia fenotipicamente alérgica e hiperplasia de células de goblet associada. Esta geração de uma resposta Th2 típica é evidenciada adicionalmente por concentrações incrementadas, no soro e BAL, de IL-5 e IL-4 sérica. Trabalho adicional neste modelo, usando um mouse MHC II KO indica que GM- CSF modula a interação entre células apresentadoras de antígeno e células T nas vias aéreas, facilitando com isso a interação entre células apresentadoras de antígeno e células T nas vias aéreas, facilitando com isso respostas mediadas com células T nas vias aéreas, facilitando com isso respostas mediadas com células T à ovalbumina [37]. É significativo observar que a atividade do GM-CSF como um ativador potente das respostas de Th2 também pode ser demonstrada em camundongos que não apresentam IL-13 e/ou IL-4, indicando que a neutralização da atividade de GM-CSF apresenta uma terapêutica alternativa para as vias aéreas distintas da atividade destas citocinas.

[00108] Realizou-se observações similares em outro modelo murino em que a exposição intranasal repetida à erva-de-santiago resulta em sensibilização de tipo Th2 e inflamação branda das vias aéreas quando da re-exposição a antígeno [38]. A administração de anticorpos anti-GM-CSF em conjunto com produção diminuída de citocina associada com Th2 na erva-de-santiago, presumivelmente por meio de inibição de GM-CSF endógeno. Em contraste, o fornecimento de erva- de-santiago a um ambiente de vias aéreas enriquecido com GM-CSF, seja por meio de co-administrações múltiplas de GM-CSF recombinante ou de um fornecimento simples de um vetor adenoviral portando o transgene de GM-CSF, resultou em inflamação eosinofílica consideravelmente incrementada das vias aéreas e respostas de memória de Th2 específicas para erva-de-santiago. Artrite reumatóide (RA)

[00109] A RA é uma doença inflamatória crônica e destrutiva das juntas que afeta aproximadamente 1% da população no mundo industrializado. A RA é caracterizada por hiperplasia e inflamação da membrana sinovial, inflamação no fluido sinovial, e destruição progressiva da cartilagem e do osso circundante que leva comumente a incapacitação significativa.

[00110] Embora a causa da RA ainda permaneça desconhecida, há evidência acumulada do papel do GM-CSF na progressão da RA. Acredita-se que a RA é iniciada e impelida por um processo específico para antígeno, mediado com células T. Em resumo, considera-se que a presença de um antígeno não-identificado em um hospedeiro suscetível inicie uma resposta de células T que leva à produção de citocinas de células T com recrutamento conseqüente de células inflamatórias, incluindo neutrófilos, macrófagos e células B.

[00111] Muitas citocinas pró- e anti-inflamatórias são produzidas na junta reumatóide. Além disso, a progressão da doença, reativação e silenciamento são mediados por alterações dinâmicas na produção de citocinas na junta. Em particular, considera-se que TNF-α e IL-1 exerçam papéis centrais na patogênese da RA e em muitas das terapias mais novas desenvolvidas, ou no desenvolvimento, para que a doença pareça inibir a atividade destas duas citocinas pró- inflamatórias.

[00112] Estudos recentes em modelos de roedores sugeriram um papel central e não-redundante para o GM-CSF no desenvolvimento e progressão da RA. A administração de GM-CSF recombinante exógeno aumenta a patologia em dois modelos de camundongo diferentes de artrite induzida com colágeno de RA (CIA) [39] e em um modelo de artrite monoarticular [40]. Adicionalmente a isto demonstrou-se que camundongos com expressão inibida de GM-CSF (GM-CSF-/-) são resistentes ao desenvolvimento de CIA e que os níveis de IL-1 e de fator de necrose de tumor (TNFa) encontrados no fluido de juntas sinovial foi reduzido em comparação com os camundongos de tipo selvagem [41,42]. De maneira análoga, a indução de monoartrite usando injeção intra-articular de albumina de soro bovino metilado e IL-1 em camundongos GM-CSF-/- resulta em gravidade reduzida de doença, em comparação com camundongos de tipo selvagem [43].

[00113] Adicionalmente, a administração de mAb anti-GM-CSF murinos melhora significativamente a gravidade da doença em modelos de CIA e de artrite monoarticular. No modelo de CIA, tratamento com mAb foi efetivo no tratamento de progressão de doença estabelecida, histopatologia e diminuição significativa dos níveis de IL-1 e TNF-α nas juntas. Adicionalmente, tratamento com mAb antes do início da artrite diminuiu a gravidade da doença de CIA [44,43].

[00114] Diversos estudos analisaram os níveis de citocinas e de receptores presentes no fluido sinovial artrítico e em amostras de biópsia de membranas de tecido humano. Células mononucleares circulantes em 27 pacientes de RA, 13 voluntários saudáveis e 14 pacientes com osteoporose foram avaliadas quanto aos níveis de GM- CSFR por meio do uso de GM-CSF marcado com PE [45]. Neste estudo demonstrou-se que foi possível detectar duas vezes a quantidade de células positivas para receptor em pacientes de RA (53%), em comparação com controles saudáveis (20%) e pacientes sendo submetidos a investigação quanto a osteoporose (25%), sugerindo com isso que monócitos podem ser preparados para responderem a GM-CSF produzido localmente. A expressão de genes de citocina de pacientes de RA [46] usando hibridização in situ de células SF demonstrou níveis elevados de GM-CSF, IL-1, TNF-a e IL- 6. Adicionalmente, sinoviócitos derivados de fibroblastos isolados e cultivados obtidos de voluntários normais demonstraram níveis elevados de proteínas de GM-CSF em resposta a IL-1α, IL-1β, TNF-α e TNF-β [47]. A quantificação dos níveis séricos do GM-CSF em pacientes de RA [48] mostrou que níveis de proteína foram incrementados em pacientes de RA grave (366 pg/ml, n=26) e moderada (376 pg/ml, n=58) em comparação com o grupo de controle (174 pg/ml, n=43), e adicionalmente mostrou-se também que GM-CSF foi significativamente elevado no SF de pacientes com RA (1300 pg/ml).

[00115] Observou-se previamente que a administração de GM-CSF recombinante em pacientes sendo tratados de neutropenia poderia causar uma exacerbação da RA [50]. Realizou-se observações similares para um paciente com síndrome de Felty após tratamento com GM-CSF recombinante [50]. Doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD)

[00116] Doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) é definida como um estado de doença caracterizado por limitação do fluxo de ar que não é totalmente reversível. A limitação crônica de fluxo de ar é usualmente tanto progressiva como também associada com uma resposta inflamatória anormal dos pulmões a partículas ou gases nocivos. Esta limitação de fluxo de ar é causada por uma mistura de doença das vias aéreas pequenas (bronquiolite obstrutiva) e destruição parenquimal (enfisema), sendo que as suas contribuições relativas variam de pessoa para pessoa. Os sintomas característicos resultantes da doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) são a tosse, produção de esputo, e dispnéia ao exercício. A COPD é um problema de saúde pública e é a quarta causa principal de morbidez crônica e de mortalidade nos E.U.A. A doença é tratada correntemente com drogas desenvolvidas originalmente para a asma, como corticosteróides orais ou inalados, com ou sem broncodilatadores incluindo β agonistas. No entanto, nenhuma destas drogas mostrou diminuir a progressão da COPD [51]. Por exemplo, corticosteróides que suprimem marcantemente a inflamação eosinofílica na asma não parecem exercer qualquer efeito sobre a inflamação observada na COPD que é mediada predominantemente por neutrófilos [52]. Conseqüentemente, há uma necessidade de desenvolver novos tratamentos para COPD que objetivam especificamente os processos inflamatórios subjacentes à patofisiologia desta doença. GM-CSF, através de seu papel na função de neutrófilos e macrófagos, pode desempenhar um papel importante na patogênese da COPD.

[00117] Em um estudo que usa PCR quantitativa, mostrou-se que, em esputo de COPD comparado com esputo de fumantes não- obstruídos, o número de cópias do GMCSF foi significativamente elevado [53]. Adicionalmente, em um modelo de roedor de inflamação pulmonar induzida por fumaça de cigarro, animais tratados intranasalmente com um anticorpo para GM-CSF 2 dias, 4 h e 1 h antes da exposição à fumaça demonstraram uma redução significativa dos níveis de neutrófilos, macrófagos e MMP-9 do BAL, quando comparado com o anticorpo de controle de isótipo 5 dias após a exposição [54]. Estes estudos também são corroborados por nossas próprias observações em que se pesquisou níveis de GM-CSF em esputo induzido de pacientes com uma gama de gravidades de COPD. Nestes estudos, nós mostramos que o GM-CSF foi elevado no esputo de aproximadamente 40% dos pacientes de COPD testados independentemente da gravidade da doença, com níveis de GMCSF aproximando-se de 500 pg/ml em alguns casos. O GMCSF não pareceu ser elevado em pacientes não fumantes e em pacientes de controle fumantes equiparados. Estes dados sugerem que o GM-CSF pode ser um dos mediadores-chave na inflamação das vias aéreas induzida por fumaça, e na COPD. Esclerose múltipla (MS)

[00118] O GM-CSF foi implicado na doença autoimune esclerose múltipla. Mediante a administração de antígeno de glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG) a roedores, é possível induzir um modelo de esclerose múltipla humana que demonstra muitos dos fenótipos da MS, como inflamação do sistema nervoso central e desmielinação que pode resultar em uma paralisia similar à da MS. Em camundongos sem GM-CSF a MOG foi incapaz de induzir o fenótipo EAE [55]. Adicionalmente, mostrou-se que estes camundongos apresentaram proliferação diminuída de células T relativamente ao antígeno de MOG e uma produção diminuída das citocinas de Th1, IL- 6 e IFN-y. A administração de anticorpos neutralizadores de GM-CSF ao mesmo tempo como exposição de antígeno preveniu o início da doença durante 10 dias após o tratamento com evidência de lesões reduzidas. Se administrados após o início da doença, camundongos recuperaram-se completamente dentro de 20 dias do tratamento [55]. Leucemia

[00119] O GM-CSF também foi implicado na leucemia mielóide, leucemia mielóide crônica juvenil (JCML). Esta condição é uma desordem mieloproliferativa que afeta primariamente pacientes com menos de 4 anos de vida. Progenitores de macrófagos-granulócitos periféricos de JCML in vitro (CFU-GM) demonstram proliferação espontânea a baixas densidades de células, uma observação não previamente descrita para outras desordens mieloproliferativas. Adicionalmente, a depleção de monócitos destas culturas aboliu esta proliferação. Subseqüentemente, demonstrou-se que esta proliferação espontânea é mediada via uma hipersensibilidade dos progenitores de JCML ao GM-CSF de citocina derivado de monócitos [56,57,58,59,60,61]. Ao invés de uma superprodução ou de níveis elevados de GM-CSF em pacientes de JCML, a hipersensibilidade dos progenitores de JCML parece ser através de uma via de transdução de sinal de Ras induzida com GM-CSF desregulado [62]. Estudos recentes com um análogo de GM-CSF (E21R), que antagoniza a ação de GM-CSF tanto em estudos de ligação como em ensaios funcionais, mostrou que inibindo-se a ação de GM-CSF, é possível reduzir significativamente a carga de células de JCML em um modelo de enxerto exógeno de camundongo imunodeficiente/não obeso combinado grave diabético (SCID/NOD) de JCML [63]. A dosagem sistêmica profilática de E21R no momento do enxerto preveniu que progenitores de JCML se estabelecessem na medula óssea, e a dosagem de E21R 4 semanas após o enxerto induziu remissão de JCML, com uma redução da carga celular. Adicionalmente, a administração de E21R a camundongos SCID/NOD co-enxertados com medula óssea humana normal e medula óssea com JCML causou uma redução da carga de JCML, no entanto, células de medula óssea normal permaneceram não-afetadas. Aterosclerose

[00120] Doença do coração isquêmico é a causa mais comum de morte em todo o mundo. Ao longo dos anos mais recentes, fortaleceu- se o conceito de que a inflamação desempenha um papel significativo na patogênese da aterosclerose, com acúmulo de células inflamatórias ocorrendo par-e-passo com o acúmulo de lipídios nas paredes arteriais.

[00121] Uma vez residentes nas paredes arteriais, células inflamatórias, como monócitos e macrófagos, participam e perpetuam a resposta inflamatória local. Estes macrófagos também expressam receptores aglutinadores para uma gama de lipoproteínas e, assim, contribuem para a diferenciação de células em ‘células espumosas’. É a morte destas ‘células espumosas’ que contribui para o desenvolvimento do núcleo lipídico, uma característica clássica destas lesões. Como a inflamação continua no interiores destas placas ateroscleróticas, estas células inflamatórias ativadas liberam mediadores fibrogênicos e fatores de crescimento que promovem proliferação de células musculares lisas (SMC) e fibrose da placa. Além de promoverem fibrose, estas células também liberam enzimas proteolíticas, Metaloproteinases de matriz (MMPs), que contribuem para um enfraquecimento da placa fibrótica tornando-as, desta forma, propensas a rompimento. Uma vez rompidas, estas placas liberam fragmentos celulares e fatores de coagulação, como fator de tecido, no vaso, estimulando a cascata de coagulação e o desenvolvimento de trombos. A trombose arterial resultante pode levar, então, a isquemia miocárdica ou a infarto.

[00122] Recentemente o GM-CSF foi implicado em muitos aspectos da progressão de doença na aterosclerose. Em lesões ateroscleróticas de coelhos alimentados com colesterol, verificou-se que o GM-CSF encontra-se co-localizado com macrófagos e, em menor grau, com células endoteliais e células musculares lisas (SMC) [64]. Adicionalmente, mostrou-se também que a expressão de GM-CSF é aumentada em vasos ateroscleróticos humanos nos sítios de acúmulo de macrófagos e em SMCs mediais e células endoteliais [65]. Este aumento dos níveis de GM-CSF é atribuído, em parte, ao contato direto célula-a-célula de monócitos/macrófagos e células endoteliais durante a formação e patogênese da lesão aterosclerótica [66]. Outro elemento-chave na lesão aterótica é a ‘célula espumosa’, ou seja, macrófagos que absorveram lipoproteínas de baixa densidade (LDL) oxidadas via receptores de aglutinadores sobre a superfície. In vitro, esta absorção de Ox-LDL pode estimular ainda mais macrófagos a proliferarem via um mecanismo dependente de GM-CSF [67].

[00123] Como a aterosclerose é um processo inflamatório crônico, investigou-se agentes antiinflamatórios, como glucocorticóides. Dexametasona, um glucocorticóide antiinflamatório, suprime o desenvolvimento da aterosclerose em vários modelos animais experimentais [68,69,70,71]. A eficácia do que foi atribuído à inibição da migração de SMC [72] e proliferação [73], e redução da quimiotaxia de monócitos e leucócitos circulantes [74]. Estudos recentes mostram que ox-LDL pode induzir liberação de GM-CSF de macrófagos peritoneais de camundongo [75]. Adicionalmente, após tratamento com dexametasona esta liberação de GM-CSF foi inibida de uma forma dependente da dose, sugerindo que os efeitos antiinflamatórios da dexametasona são mediados pela inibição da produção de GM- CSF induzida com ox-LDL. Como parece que o GM-CSF possui um papel central na aterosclerose, uma alternativa aos glucocorticóides poderia ser a inibição da atividade de GM-CSF nesta indicação. TERMINOLOGIA

[00124] "E/ou" onde usado aqui deve ser considerado como revelação específica de cada uma das duas características ou componentes especificados com ou sem o outro. Por exemplo, "A e/ou B" deve ser considerado como uma revelação específica de cada um de (i) A, (ii) B e (iii) A e B, como se cada um fosse indicado individualmente aqui. GM-CSFRa e GM-CSF

[00125] GM-CSFRa é a cadeia alfa do receptor para fator estimulador de colônias de granulócitos macrófagos. A seqüência de comprimento pleno do GM-CSFRα humano é depositado sob o número de acesso S06945 (gi:106355) [76] e indicada aqui como na SEQ ID NO: 202. A forma madura do GM-CSFRα humano, i.e. com o peptídeo-sinal clivado, é indicada aqui como SEQ ID NO: 206. Exceto se indicado de outra forma no contexto, referências aqui a GM-CSFRa referem-se a GM-CSFRa de primatas humanos ou não-humanos (p. ex., [macacos] cynomolgus), normalmente humano. GM-CSFRa pode ser GM-CSFRa naturalmente ocorrente ou GM-CSFRa recombinarrte.

[00126] O domínio extracelular de 298 aminoácidos do receptor de GM-CSF humano α possui uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 205.

[00127] Exceto se indicado de outra forma no contexto, referências aqui a GM-CSF referem-se a GM-CSF de primatas humanos ou não- humanos (p. ex. cynomolgus), normalmente humano.

[00128] GM-CSF liga-se normalmente ao domínio extracelular (SEQ ID NO: 205) da cadeia α do receptor de GM-CSF maduro (SEQ ID NO: 206). Como descrito alhures aqui, esta ligação é inibida por elementos de ligação da invenção.

[00129] Variantes de recomposição naturalmente ocorrentes do GM-CSFRa foram identificadas - ver, por exemplo, refs. [77 e 78]. O domínio extracelular é altamente conservado nestas variantes de recomposição. Elementos de ligação da invenção podem ou não ligar- se a uma ou mais variantes de recomposição do GM-CSFRa, e podem ou não inibir a ligação de GM-CSF a uma ou mais variantes de recomposição do GM-CSFRa. Elemento de ligação

[00130] Isto descreve um elemento de um par de moléculas que se ligam uma à outra. Os elementos de um par de ligação podem ser derivados naturalmente ou produzidos totalmente ou parcialmente por via sintética. Um membro do par de moléculas apresenta uma área sobre sua superfície, ou uma cavidade, que se liga, e que, portanto, é complementar a uma organização espacial e polar particular do outro membro do par de moléculas. Exemplos de tipos de pares de ligação são antígeno-anticorpo, biotina-avidina, hormônio-receptor de hormônio, receptor-ligante, enzima-substrato. A presente invenção refere-se a reações de tipo antígeno-anticorpo.

[00131] Um elemento de ligação compreende normalmente uma molécula apresentando um sítio de ligação de antígeno. Por exemplo, um elemento de ligação pode ser uma molécula de anticorpo ou uma proteína não-anticorpo que compreende um sítio de ligação de antígeno. Um sítio de ligação de antígeno pode ser proporcionado por meio de arranjo de CDRs sobre suportes de proteína não-anticorpo, como fibronectina ou citocromo B etc. [80,81,82], ou por meio de randomização ou mutação de radicais de aminoácidos de uma alça dentro de uma estrutura de suporte de proteína para conferir ligação a um alvo desejado. Estruturas de suporte para a manipulação de sítios de ligação inéditos em proteínas foram revistos detalhadamente [82]. Estruturas de suporte de proteínas para emuladores de anticorpo encontram-se divulgadas no WO/0034784 em que os inventores descrevem proteínas (emuladores de anticorpo) que incluem um domínio de fibronectina de tipo III apresentando pelo menos uma alça randomizada. Uma estrutura de suporte vantajosa sobre a qual enxertar uma ou mais CDRs, p. ex. um conjunto de HCDRs, pode ser proporcionada por qualquer elemento de domínio da superfamília de genes de imunoglobulina. A estrutura de suporte pode ser uma proteína humana ou não-humana.

[00132] Uma vantagem de uma estrutura de suporte de proteína não-anticorpo é que ela pode proporcionar um sítio de ligação de antígeno em uma molécula de estrutura de suporte que é menor e/ou mais fácil de fabricar do que pelo menos algumas moléculas de anticorpos. O pequeno tamanho de um elemento de ligação pode conferir propriedades fisiológicas úteis, como uma capacidade de entrar em células, penetrar profundamente em tecidos ou atingir alvos em outras estruturas, ou de ligar-se em cavidades de proteína do antígeno-alvo.

[00133] O uso de sítios de ligação de antígeno em estruturas de suporte de proteína não-anticorpo é revista na ref. [79]. São típicas as proteínas apresentando uma espinha dorsal estável e uma ou mais alças variáveis, em que a seqüência de aminoácidos da alça ou alças é mutada especificamente ou randomicamente para criar um sítio de ligação de antígeno apresentando, para ligação ao antígeno-alvo. Referidas proteínas incluem os domínios de ligação de IgG de proteína A de S. aureus, transferrina, tetranectina, fibronectina (p. ex., domínio de tipo III da 10a fibronectina) e lipocalinas. Outras abordagens incluem "microcorpos" sintéticos (Selecore GmbH), que se baseiam em ciclotídeos - pequenas proteínas apresentando ligações dissulfeto intramoleculares.

[00134] Adicionalmente a seqüências de anticorpos e/ou um sítio de ligação de antígeno, um elemento de ligação de acordo com a presente invenção pode compreender outros aminoácidos, p. ex. formando um peptídeo ou polipeptídeo, como um domínio dobrado, ou para conferir à molécula outra característica funcional adicionalmente à capacidade de ligar-se a antígeno. Elementos de ligação da invenção podem portar um marcador detectável, ou podem ser conjugados a uma toxina ou a uma enzima ou porção de objetivação (p. ex. via uma ligação peptidila ou ligante). Por exemplo, um elemento de ligação pode compreender um sítio catalítico (p. ex. em um domínio de enzima) e também como um sítio de ligação de antígeno, sendo que o sítio de ligação de antígeno liga-se ao antígeno e, assim, objetiva o sítio catalítico ao antígeno. O sítio catalítico pode inibir a função biológica do antígeno, p. ex. por meio de clivagem.

[00135] No entanto, como indicado, CDRs podem ser portadas por estruturas de suporte, como fibronectina ou citocromo B [80,81,82], a estrutura para portar uma CDR ou um conjunto de CDRs da invenção será geralmente de uma seqüência de anticorpo de cadeia pesada ou leve ou porção substancial da mesma em que a CDR ou conjunto de CDRs encontra-se localizado em um local correspondente à CDR ou conjunto de CDRs de domínios variáveis VH e VL de anticorpos naturalmente ocorrentes codificados por genes de imunoglobulina rearranjados. As estruturas e localizações de domínios variáveis de imunoglobulina podem ser determinadas fazendo-se referência a Kabat, et al., 1987 [98], e suas atualizações, agora disponíveis na Internet (http://immuno.bme.nwu.edu ou procurar "Kabat" usando qualquer mecanismo de busca).

[00136] Elementos de ligação da presente invenção podem compreender regiões constantes de anticorpos ou partes dos mesmo, de preferência, regiões constantes de anticorpos humanos ou partes dos mesmo. Por exemplo, um domínio VL pode ser ligado a sua ponta C aos domínios constantes de cadeia leve de anticorpo incluindo cadeias CK ou CX humanas, de preferência, cadeias CX. De maneira análoga, um elemento de ligação baseado em um domínio VH pode ser ligado a sua ponta C-terminal a toda ou parte (p. ex. um domínio CH1) de uma cadeia pesada de imunoglobulina derivada de qualquer isótipo de anticorpo, p. ex., IgG, IgA, IgE e IgM e qualquer uma das subclasses de isótipos, particularmente IgG1, IgG2 e IgG4. IgG1, IgG2 ou IgG4 é preferida. IgG4 é preferida porque não se liga a complemento e não cria funções efetoras. Qualquer variante sintética ou variante de região constante que possui estas propriedades e estabiliza regiões variáveis também é preferida para uso em concretizações da presente invenção.

[00137] Elementos de ligação da invenção podem ser marcados com um marcador detectável ou funcional. Marcadores detectáveis incluem rádio-marcadores, como 131I ou 99Tc, que podem ser ligados a anticorpos da invenção usando-se química convencional conhecida na arte da visualização de anticorpos. Marcadores também incluem marcadores de enzimas, como peroxidase de rabanete. marcadores incluem adicionalmente porções químicas, como biotina, que podem ser detectadas via ligação a uma por meio de detectável cognata específica, p. ex. avidina marcada. Assim, um elemento de ligação ou molécula de anticorpo da presente invenção pode ser em forma de um conjugado compreendendo o elemento de ligação e um marcador, opcionalmente conjugado via um ligante, como um peptídeo. O elemento de ligação pode ser conjugado, por exemplo, a enzimas (p. ex. peroxidase, fosfatase alcalina) ou um marcador fluorescente incluindo, embora sem limitação, biotina, fluorocromo, proteína fluorescente verde. Adicionalmente, o marcador pode compreender uma porção de toxina, como uma porção de toxina selecionada do grupo que consiste de exotoxina de Pseudomonas (PE ou um fragmento citotóxico ou mutante do mesmo), toxina de Difteria (um fragmento citotóxico ou mutante do mesmo), uma toxina de botulinum de A até F, ricina ou um fragmento citotóxico da mesma, abrina ou um fragmento citotóxico da mesma, saporina ou um fragmento citotóxico da mesma, toxina antiviral da Phytolacca americana ou um fragmento citotóxico da mesma e briodina 1 ou um fragmento citotóxico da mesma. Onde o elemento de ligação compreende uma molécula de anticorpo, o elemento de ligação marcado pode ser referido como um imunoconjugado. Molécula de anticorpo

[00138] Descreve-se aqui uma imunoglobulina, quer seja natural, ou produzida parcialmente ou totalmente por via sintética. O termo também compreende qualquer polipeptídeo ou proteína compreendendo um sítio de ligação de antígeno de anticorpo. Fragmentos de anticorpos que compreendem um sítio de ligação de antígeno de anticorpo são moléculas, como Fab, F(ab’)2, Fab’, Fab’- SH, scFv, Fv, dAb, Fd; e diacorpos.

[00139] É possível preparar anticorpos monoclonais e outros anticorpos, e usar técnicas de tecnologia de DNA recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas que conservam a especificidade do anticorpo original. Referidas técnicas podem envolver introduzir DNA que codifica a região variável de imunoglobulina, ou as CDRs, de um anticorpo nas regiões constantes, ou regiões constantes mais regiões de estrutura, de uma imunoglobulina diferente. Ver, por exemplo, a EP-A-184187, GB 2188638A ou EP-A- 239400, e um grande corpo de literatura subseqüente. Um hibridoma ou outra célula produtora de um anticorpo pode ser sujeita a mutação genética ou outras alterações, que podem ou não alterar a ligação-a- alvo dos anticorpos produzidos.

[00140] Como anticorpos podem ser modificados de diversas maneiras, o termo "molécula de anticorpo" deveria interpretado como abrangendo qualquer elemento de ligação ou substância apresentando um sítio de ligação de antígeno de anticorpo. Assim, este termo abrange fragmentos de anticorpos e derivados, incluindo qualquer polipeptídeo compreendendo um sítio de ligação de antígeno de anticorpo, quer natural, ou totalmente ou parcialmente sintético. Inclui-se, portanto, moléculas quiméricas compreendendo um sítio de ligação de antígeno de anticorpo, ou equivalente, fundidas a outro polipeptídeo. A clonagem e expressão de anticorpos quiméricas são descritas na EP-A-0120694 e EP-A-0125023, e um grande corpo de literatura subseqüente.

[00141] Técnicas adicionais disponíveis na arte da manipulação de anticorpos tornaram possível isolar anticorpos humanos e humanizados. Anticorpos humanos e humanizados são concretizações preferidas da invenção, e podem ser produzidos usando-se qualquer método vantajoso. Por exemplo, é possível preparar hibridomas humanos [83]. Apresentação de fago, outra técnica estabelecida para gerar elementos de ligação foi descrita detalhadamente em muitas publicações, como ref. [83] e WO92/01047 (discutido adicionalmente abaixo). Camundongos transgênicos em que os genes de anticorpo de camundongo são inativados e substituídos funcionalmente por genes de anticorpos humanos, enquanto deixa intactos outros componentes do sistema imunológico de camundongo, podem ser usados para isolar anticorpos humanos [84]. Anticorpos humanizados podem ser produzidos usando-se técnicas conhecidas na arte, como aquelas divulgadas, por exemplo, nos WO91/09967, US 5,585,089, EP592106, US 565,332 e WO93/17105. Adicionalmente, WO2004/006955 descreve métodos para humanizar anticorpos, com base na seleção de seqüências de estrutura de região variável de genes de anticorpo humano por meio de comparação de tipos de estruturas de CDR canônicas para seqüências de CDR da região variável de um anticorpo não-humano, com tipos de estrutura de CDR canônicas para CDRs correspondentes de uma biblioteca de seqüências de anticorpos humanos, p. ex. segmentos de genes de anticorpos de linhagem germinal. Regiões variáveis de anticorpos humanos apresentando tipos de estrutura de CDR canônica similares às CDRs não-humanas formam um subconjunto de seqüências- membro de anticorpos humanos das quais se seleciona seqüências de estrutura humana. Os elementos de subconjunto podem ser classificados adicionalmente por meio de similaridade de aminoácidos entre as seqüências de CDR humana e não-humana. No método do WO2004/006955, seqüências humanas de classificação superior são selecionadas de forma a proporcionar as seqüências de estrutura para construir um anticorpo quimérico que substitui funcionalmente seqüências de CDR humanas pelas contra-partes de CDR não- humanas usando-se as estruturas humanas de elemento de subconjunto selecionadas, proporcionando com isso um anticorpo humanizado com alta afinidade e baixa imunogenicidade sem a necessidade de comparar seqüências de estrutura entre os anticorpos não-humanos e humanos. Divulga-se também anticorpos quiméricos preparados de acordo com o método.

[00142] Moléculas de anticorpos sintéticas podem ser criadas por meio de expressão de genes gerados por meio de oligonucleotídeos sintetizados e montados dentro de vetores de expressão vantajosos [85, 86].

[00143] Mostrou-se que fragmentos de um anticorpo inteiro podem realizar a função de antígenos de ligação. Exemplos de fragmentos de ligação são (i) o fragmento Fab que consiste de domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) o fragmento Fd que consiste dos domínios VH e CH1; (iii) o fragmento Fv que consiste dos domínios VL e VH de um anticorpo simples; (iv) o fragmento dAb [87,88,89] que consiste de um domínio VH ou um domínio VL; (v) regiões de CDR isoladas; (vi) fragmentos F(ab')2, um fragmento divalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados[;] (vii) moléculas de Fv de cadeia simples (scFv), sendo que um domínio VH e um domínio VL são ligados por um ligante peptídico que permite que os dois domínios se associem para formar um sítio de ligação de antígeno [90,91]; (viii) dímeros de Fv de cadeia simples biespecíficos (PCT/US92/09965) e (ix) "diacorpos", fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos por meio de fusão de gene (WO94/13804; [92]). Fv, scFv ou moléculas de diacorpos podem ser estabelecidas pela incorporação de pontes dissulfeto que ligam os domínios VH e VL [93]. Também é possível preparar minicorpos compreendendo um scFv conjugado a um domínio CH3 [94].

[00144] Um dAb (anticorpo de domínio) é um fragmento de imunoglobulina de antígeno monomérico pequeno de um anticorpo, nominalmente a região variável de uma cadeia pesada ou célula de anticorpo [89]. dAbs de VH ocorrem naturalmente em camelídeos (p. ex., camelo, lhama) e pode ser produzido imunizando-se um camelídeo com um antígeno-alvo, isolando-se células B específicas para antígeno, e clonando diretamente genes de dAb das células B individuais. dAbs também podem ser produzidos em cultura de células. Seu pequeno tamanho, boa solubilidade e estabilidade à temperatura torna-os particularmente úteis fisiologicamente e vantajosos para seleção e maturação por afinidade. Um elemento de ligação da presente invenção pode ser um dAb compreendendo um domínio VH ou domínio VL substancialmente como indicado aqui, ou um domínio VH ou domínio VL compreendendo um conjunto de CDRs substancialmente como indicado aqui. Por "substancialmente como indicado" compreende-se que o domínio VH ou domínio VL de CDR da invenção será idêntico ou muito similar às regiões especificadas cuja seqüência é indicada aqui. Por "muito similar" compreende-se que, é possível realizar de 1 a 5, de preferência, de 1 a 4, como de 1 a 3 ou 1 ou 2, ou 3 ou 4, substituições de aminoácidos na CDR e/ou domínio VH ou VL.

[00145] Onde se pretende usar anticorpos biespecíficos, estes podem ser anticorpos biespecíficos convencionais, que podem ser fabricados de diversas maneiras [95], p. ex., preparados quimicamente ou de hibridomas híbridos, ou podem ser quaisquer dos fragmentos de anticorpos biespecíficos descritos acima. Exemplos de anticorpos biespecíficos incluem aqueles da tecnologia BiTETM em que os domínios de ligação de dois anticorpos com uma especificidade diferente podem ser usados e ligados diretamente via peptídeos flexíveis curtos. Isto combina dois anticorpos em uma cadeia de polipeptídeo simples curta. Diacorpos e scFv podem ser construídos sem uma região Fc, usando-se apenas domínios variáveis, reduzindo potencialmente os efeitos de reação anti-idiotípica.

[00146] Diacorpos biespecíficos, em oposição a anticorpos inteiros biespecíficos, também podem ser particularmente úteis porque podem ser facilmente construídos e expressos em E.coli. Diacorpos (e muitos outros polipeptídeos, como fragmentos de anticorpos) com especificidades de ligação específicas podem ser selecionados facilmente usando-se apresentação de fago (WO94/13804) de bibliotecas. Se um braço do diacorpo tiver que ser mantido constante, por exemplo, dirigido contra GM-CSFRa, então é possível preparar uma biblioteca em que o outro braço é variado, e um anticorpo de ligação-alvo apropriado selecionado. Anticorpos inteiros biespecíficos podem ser preparados por meio de manipulação de tipo botões-em- furos [96]. Sítio de ligação de antígeno

[00147] Descreve-se aqui a parte de uma molécula que se liga a, e que é complementar a todo ou parte do antígeno-alvo. Em uma molécula de anticorpo, isto é referido como o sítio de ligação de antígeno de anticorpo, e compreende a parte do anticorpo que se liga a, e que é complementar a todo ou a parte do antígeno-alvo. Onde um antígeno é grande, um anticorpo só pode ser ligado a uma parte particular do antígeno, sendo que referida parte é denominada um epitopo. Um sítio de ligação de antígeno de anticorpo pode ser proporcionado por um ou mais domínios variáveis de anticorpo. De preferência, um sítio de ligação de antígeno de anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve (VL) de anticorpo e uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo. Numeração de Kabat

[00148] Radicais de seqüências de anticorpo aqui são referidos geralmente usando-se numeração Kabat como definido em Kabat et al., 1971 [97]. Ver também refs. [98,99]. Isolado

[00149] Refere-se aqui ao estado em que elementos de ligação da invenção, ou ácido nucleico que codifica referidos elementos de ligação, geralmente estará de acordo com a presente invenção. Elementos isolados e ácido nucleico isolado serão livres ou substancialmente livres de material com o qual eles se encontram naturalmente associados, como outros polipeptídeos ou ácidos nucleicos com os quais eles são encontrados em seu ambiente natural, ou o ambiente em que eles são preparados (p. ex., cultura de células) quando referida preparação é por meio de tecnologia de DNA recombinante praticada in vitro ou in vivo. Elementos e ácido nucleico podem ser formulados com diluentes ou adjuvantes e, ainda, para fins práticos, podem ser isolados - por exemplo, os elementos serão normalmente misturados com gelatina ou outros veículos se usado para revestir placas de microtitulação para uso em ensaios imunológicos, ou serão misturados com diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis quando usados no diagnóstico ou na terapia. Elementos de ligação podem ser glicosilados, quer naturalmente ou por meio de sistemas de células eucarióticas heterólogas (p. ex.. células CHO ou NSO (ECACC 85110503)), ou eles podem permanecer não-glicosilados (por exemplo, se produzidos por meio de expressão em uma célula procariótica).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00150] Figura 1. Análise de pA2 de dois anticorpos anti-GM-CSFRa no ensaio de proliferação de TF-1. A proliferação de células TF-1 foi induzida com concentrações crescentes de GM-CSF na presença de concentrações crescentes de duas IgG4 otimizadas, Anticorpo 6 (Figura 1A) e Anticorpo 1 (Figura 1B), respectivamente. Para dados mostrados no gráfico 1A e no gráfico 1B, mediu-se a incorporação de timidina tritiada, e calculou-se a EC50 de GM-CSF em cada concentração de anticorpo. Para dados mostrados no gráfico 1C e gráfico 1D, calculou-se então as relações de doses e analisou-se por meio de regressão de Schild para se obter valores de pA2.

[00151] Figura 2. Análise de pA2 de um anticorpo anti-GM-CSFRa, Anticorpo 6, nos ensaios de alteração de forma de granulócitos. Granulócitos humanos (gráfico 2A e 2C) ou de cynomolgus (2B e 2D) foram tratados com concentrações crescentes de GM-CSF na presença de concentrações crescentes de IgG4. A alteração de forma dos granulócitos foi medida usando-se citometria de fluxo, e calculou- se a EC50 do GM-CSF em cada concentração de anticorpo (gráfico 2A e gráfico 2B). Em seguida, as relações de dose foram calculadas e analisadas por meio de regressão de Schild para se obter valores de pA2 (gráfico 2C e gráfico 2D).

[00152] Figura 3. Potência antagonista de dois anticorpos, Anticorpos 1 e 6, respectivamente, como IgG4s em um ensaio que mede a proliferação de células TF-1 induzida por 7pM de GM-CSF humano. Mostra-se também dados para controle positivo IgG4 2B7 e para um isótipo de controle IgG4. Dados representam a média com barras de desvio padrão de determinações em triplicata no mesmo experimento.

[00153] Figura 4. Potência antagonista de dois anticorpos, Anticorpos 1 e 6, respectivamente, como IgG4s em um ensaio que mede a alteração de forma de granulócitos humanos induzida por 7 pM de GM-CSF humano. Mostra-se também dados para o controle de IgG4 2B7 e para um isótipo de controle IgG4. Dados representam a média com barras de desvio padrão de determinações em triplicata no mesmo experimento.

[00154] Figura 5. Potência antagonista de dois anticorpos, Anticorpos 1 e 6, respectivamente, como IgG4s em um ensaio que mede a liberação de TNFa de monócitos humanos estimulada com 1 nM de GM-CSF humano. Mostra-se também dados para anticorpo de controle 2B7 e para um controle de isótipo IgG4. Dados representam a média com barras de desvio padrão de determinações em triplicata no mesmo experimento.

[00155] Figura 6. Potência antagonista de dois anticorpos, Anticorpos 1 e 6, respectivamente, como IgG4s em um ensaio que mede a sobrevida de granulócitos humanos induzida por 7pM de GM- CSF humano. Mostra-se também dados para o anticorpo de controle 2B7 e para um isótipo de controle IgG4. Dados representam a média com barras de desvio padrão de determinações em triplicata no mesmo experimento.

[00156] Figura 7. mAbs humanos maturados por afinidade Anticorpo 1 e Anticorpo 6, mas não o mAb humano parental 28G5 (Anticorpo 3) ou o anticorpo murino conhecido 2B7, inibem diferenciação impelida por GM-CSF de progenitores hemopoiéticos humanos. 5x104 Células mononucleares descongeladas de uma amostra de aferese foram cultivadas em agar semi-sólido na presença de 10 ng/ml de GM-CSF e na concentração indicada de mAb. Colônias foram contadas no dia 14. Gráfico mostra número de colônias contra a concentração de mAb em μg/ml.

[00157] Figura 8. Análise dose-resposta da eficácia de mAb maturado por afinidade em camundongos quiméricos Tg huGM-CSFR. Grupos de 5 camundongos quiméricos Tg foram tratados com 500 ng de huGM-CSF (ou PBS) s.c. duas vezes ao dia durante 4 dias (D.1- D.4) e controle (CAT001) ou mAb de teste (Anticorpo 6) nas concentrações indicadas no D.0. Pesos dos baços foram avaliados no D.5.

[00158] Figura 9. Análise dose-resposta da eficácia do Anticorpo 6 em um ensaio de liberação de citocinas endógenas de células mononucleares de sangue periférico humano. 1x106 Células foram cultivadas durante 72 h. na presença e ausência de anticorpo e realizou-se um ELISA de IL-6 e TNFa nos sobrenadantes. Dados representam a inibição média com barras de desvio padrão de determinações em duplicata no mesmo experimento.

PARTE EXPERIMENTAL FUNDAMENTO

[00159] Fragmentos de anticorpos humanos podem ser selecionados in vitro a partir de repertórios apresentados sobre a superfície de bacteriófago filamentoso. Este processo é conhecido como apresentação de fago e proporciona um meio de derivar fragmentos de anticorpos humanos. O processo pode ser usado para isolar especificidades anti-humanas humanas e pode ser ajustado para derivar anticorpos com características de afinidade particulares.

[00160] Fragmentos de anticorpos consistindo apenas dos domínios variáveis de cadeia pesada (VH) e variáveis de cadeia leve (VL) conjugados por um ligante de peptídeo curto contêm toda a informação que é necessária para se determinar a ligação de antígeno. Referidos fragmentos são conhecidos como Fv de cadeia simples (scFv). Mostrou-se que quando apresentados na superfície do fago, scFv dobram-se corretamente e ligam-se ao antígeno. Repertórios grandes de scFv foram construídos desta maneira, e proporcionaram uma fonte da qual é possível isolar clones individuais para o desenvolvimento de candidatos a droga. ScFv candidatos são então formatados como moléculas de IgG integral (tipicamente IgG humana) para aplicações terapêuticas. SUMÁRIO

[00161] Realizou-se seleções em uma biblioteca de apresentação de fago de scFv derivada de linfócitos de baço humanos para enriquecer populações de fagos que se ligam a GM-CSFRα humano. Nós isolamos anticorpos scFv apresentando características selecionadas e convertemos estes scFv em IgG4. Usando-se uma variedade de ensaios, um painel de anticorpos foi isolado, otimizado e foi submetido a terapia de linhagem germinal para produzir IgG4 com especificação apropriada para um anticorpo terapêutico.

[00162] Clones de anticorpo, cujas seqüências são mostradas como anticorpos 1, 2 e de 4 a 20 na listagem de seqüências, foram derivados de um anticorpo parental. O parental é mostrado como anticorpo 3 na listagem de seqüências, e também é referido aqui como 28G5. Os 19 clones foram selecionados de acordo com o fato de mostrarem propriedades particularmente boas numa faixa de ensaios biológicos, como descrito na Parte Experimental, e foram designados com números de anticorpos 1, 2 e de 4 a 20.

[00163] Os bioensaios foram designados de forma a refletirem a natureza inflamatória de doenças, como artrite reumatóide. Por exemplo, a alteração de forma de neutrófilos necessária para o seu recrutamento ao sítio de ação, a liberação de fatores pró-inflamatórios por monócitos e a sobrevida incrementada de tipos de células inflamatórias em resposta a sinais particulares. Os anticorpos apresentam potente atividade de neutralização nestes ensaios.

[00164] Protocolos detalhados dos métodos de ensaio usados são apresentados abaixo na seção intitulada "Materiais e métodos de ensaio". Isolamento de anticorpos lead

[00165] Usou-se uma grande biblioteca de anticorpos humanos de FV de cadeia simples (scFv) para seleções. Isto foi derivado dos linfócitos de baço de 20 doadores saudáveis, e clonado em um vetor de fagomídeo. ScFvs que reconheceram GM-CSFRα foram isolados da biblioteca de apresentação de fago numa série de ciclos de seleção repetidos em GMCSF-Ra purificado derivado da superexpressão de um domínio extracelular, solúvel, marcado com purificação do receptor em células HEK293T. Isto foi obtido substancialmente como descrito por Vaughan et al [102]. De maneira resumida, após exposição do receptor biotinilado à biblioteca de fagos, a proteína com fago ligado foi capturada em pérolas magnéticas revestidas com estreptavidina. Fagos não ligados foram removidos por lavagem. Fagos ligados foram então resgatados como descrito por Vaughan et al e repetiu-se o processo de seleção. Realizou-se três ciclos de seleção em concentrações cada vez menores de antígenos. Uma proporção representativa de scFvs do output de ciclos de seleção foi submetida a seqüenciamento de DNA.

[00166] Após estas seleções iniciais da biblioteca de apresentação de fago, identificou-se um painel de scFv único em um ensaio de ligação de ligante, que foi projetado para se identificar anticorpos scFv expressando fago que foram capazes de inibir a ligação de GM-CSF a domínio extracelular de GM-CSFRa purificado. A potência de neutralização destes scFv no ensaio de ligação de ligante compreende de 0,65 a 3,3 nM.

[00167] Anticorpos que foram ativos no ensaio bioquímico de ligação de ligante foram avaliados quanto à atividade biológica em um ensaio de proliferação de TF-1, que mediu a potência de neutralização por meio da avaliação da capacidade dos anticorpos de inibirem a proliferação de células TF-1 estimuladas com GM-CSF. TF-1 é uma linhagem de células pré-mielóides humana estabelecida de um paciente com eritroleucemia. Esta linhagem de células é dependente- de-fator para a sobrevida e a proliferação, e é mantida rotineiramente no GM-CSF humano. A inibição da proliferação dependente de GM- CSF foi determinada medindo-se a redução da incorporação de timidina tritiada no DNA recentemente sintetizado de células que se dividem. Todos os scFv apresentaram potência mensurável neste ensaio, com valores de IC50 abrangendo de cerca de 180 a 1200 nM.

[00168] Os clones de scFv mais potentes foram reformatados como moléculas de anticorpos IgG4 humanas com um domínio constante de cadeia pesada gama 4 humana e um domínio constante de cadeia leve lambda humana. Construiu-se vetores para os clones de scFv mais potentes para permitir a expressão dos anticorpos como anticorpo IgG4 integral como descrito por Persic et al. [100] com algumas poucas modificações. Incluiu-se um fragmento oriP nos vetores para facilitar o uso com as células HEK-EBNA 293 e para permitir replicação epissômica. O domínio variável VH foi clonado no poli-ligante entre a seqüência líder de secreção e o domínio constante gama 4 humano do vetor de expressão pEU8.1(+). O domínio variável VL foi clonado no poli-ligante entre a seqüência líder de secreção e o domínio constante lambda humano do vetor de expressão pEU4.1(-). Células HEK-EBNA 293 foram co-transfectadas com as construções expressando cadeia pesada e cadeia leve, e anticorpo integral foi purificado do meio condicionado usando-se cromatografia de afinidade de proteína A. As preparações de anticorpo purificadas foram filtradas de forma estéril e armazenadas a 4oC em solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes da avaliação. A concentração de proteína foi determinada medindo-se a absorbância a 280 nm usando-se o método BCA (Pierce).

[00169] A IgG re-formatada foi comparada com o anticorpo murino conhecido 2B7 no ensaio de proliferação de TF-1. As IgG4s conservaram ou incrementaram atividade neste ensaio, com valores de IC50 compreendendo de 6 a cerca de 1600 nM.

[00170] Na doença inflamatória, a alteração de forma de neutrófilos é necessária para seu recrutamento no sítio de ação. Projetou-se um ensaio de alteração de forma de granulócitos humanos para emular esta resposta biológica usando-se separação de células ativada com fluorescência (FACS) para medir a alteração da forma dos granulócitos isolados do sangue após sua exposição a GM-CSF. Avaliou-se a capacidade de anticorpos IgG4 anti-GM-CSFRα em inibir a resposta de alteração de forma de neutrófilos relativamente ao GM-CSF, e valores de IC50 de clones selecionados compreenderam de cerca de 15 a 350 nM. Um anticorpo 28G5 representativo neutralizou GMCSF-R de cynomolgus no ensaio de alteração de forma de granulócitos de cynomologus com um IC50 de cerca de 5 nM. O anticorpo murino conhecido 2B7 também foi capaz de neutralizar a resposta biológica resultante de ligação de GM-CSF com o receptor de cynomolgus.

[00171] Em seguida, mediu-se a afinidade de ligação a receptor dos anticorpos usando BIAcore, com valores de KD calculados compreendendo de 32 a 377 nM.

OTIMIZAÇÃO

[00172] Em um esforço para aperfeiçoar a potência de 28G5 iniciou-se um programa de otimização. Produziu-se bibliotecas de anticorpos em que se realizou a mutagênese randômica das CDR3s de VH ou VL. Cada CDR3 foi randomizada em dois blocos de 6 aminoácidos para recuperar toda a CDR, produzindo bibliotecas H1 (bloco N-terminal de VH de CDR3 de 6 aa), H2 (bloco C-terminal de VH de CDR3 de 6 aa), L1 (bloco N-terminal de VL de CDR3 de 6 aa) e L2 (bloco C-terminal de VL de CDR3 de 6 aa). As bibliotecas resultantes foram submetidas a ciclos de seleção repetida para ligação ao GM-CSFRα humano. Clones isolados deste processo de seleção foram usados então para construir uma biblioteca de fago combinada que continha scFv tanto com CDR3s de cadeia pesada mutadas e CDR3s de cadeia leve mutadas. Estas bibliotecas também foram submetidas ao mesmo procedimento de seleção.

[00173] Em cada estágio do processo de otimização, scFv que foram capazes de inibir a ligação de IgG4 de 28G5 ao receptor de GM-CSF foram identificados usando-se um ensaio de competição por epitopo com 28G5 e o receptores, e foram então analisados no ensaio de proliferação de TF-1, como descrito abaixo.

[00174] Após mutagênese randômica de seqüências CDR3 de cadeia pesada de 28G5, identificou-se um conjunto de scFv com potência de neutralização mensurável no ensaio de TF-1. A maior parte dos melhoramentos de potência foi obtida quando a ponta 3' da VH de CDR3 foi randomizada.

[00175] Após mutagênese randômica de seqüências de CDR3 de cadeia leve de 28G5 identificou-se um conjunto de scFv com potência de neutralização mensurável no ensaio de TF-1. Todos os melhoramentos de potência foram obtidos quando a ponta 3’ da VL de CDR3 foi randomizada.

[00176] Após combinação das bibliotecas de mutagênese randômica de CDR3 de cadeia pesada e cadeia leve, identificou-se um conjunto de scFvs com potência incrementada no ensaio de proliferação de TF-1 relativamente ao scFv de 28G5 parental. ScFv com melhoramentos de potência de >60000 vezes relativamente ao 28G5 parental foram isolados. Todas as combinações das bibliotecas resultaram em scFv melhorado, i.e. H1/L1, H1/L2, H2/L1, H2/L2. Isto é particularmente interessante porque não se isolou scFvs melhorados da biblioteca de L1.

[00177] Um conjunto de 19 scFv identificados durante a otimização de 28G5 foram reformatados e expressos como IgG4s, usando-se os métodos descritos acima. O conjunto constitui-se dos clones de anticorpos 1, 2 e de 4 a 20. Alguns dos clones mais potentes neste conjunto foram obtidos das bibliotecas mutagenizadas de CDR3 H e L combinadas. Os anticorpos IgG4 neste conjunto foram avaliados quanto a sua atividade no ensaio de proliferação de TF-1 e foram comparados com o anticorpo murino conhecido 2B7. Todas as IgG4s otimizadas foram mais potentes do que 2B7 neste ensaio. Nesta ocasião, 2B7 apresentou um IC50 calculado de cerca de 1,6 nM, enquanto que os clones apresentaram valores de IC50 calculados compreendendo de cerca de 1 pm a cerca de 1100 pM. Dados são apresentados na Tabela 1 abaixo e resumidos como a seguir: IC50 <1500 pM Anticorpos 1, 2 e de 4 a 20 IC50 <300 pM Anticorpos 1, 2, de 4 a 12 e de 14 a 20 IC50 <60 pM Anticorpos 1, 2, de 4 a 6, de 8 a 11, 14 e de 16 a 20 IC50 <10 pM Anticorpos 1, 5, 6, 11 e 20

[00178] A Figura 3 ilustra a potência antagonista de dois anticorpos representativos da invenção, Anticorpo 1 e Anticorpo 6, em comparação com o conhecido anticorpo 2B7 no ensaio de proliferação de TF-1.

[00179] O sistema BIAcore 2000 (Pharmacia Biosensor) foi usado para avaliar os parâmetros cinéticos da interação de algumas das IgG4s otimizadas para lead com domínio extracelular de receptor de GM-CSF marcado com purificação recombinante. A afinidade dos anticorpos foi muito melhorada, com valores KD calculados de 0,127 nM a cerca de 5 nM. Dados são mostrados na Tabela 2. Obteve-se melhoramentos tanto nas taxas ativas e taxas inativas. A correlação entre a afinidade das IgG4s pelo domínio extracelular solúvel de GM- CSFR a, e seu desempenho no ensaio de TF-1 foi muito bom, com um coeficiente de Pearson de 0,85 (p<0,0001). A título de comparação, a KD de 2B7 calculada separadamente e mostrada como sendo de cerca de 7 nM.

[00180] Anticorpos IgG4 identificados durante a otimização de 28G5 foram avaliados no ensaio de alteração de forma de granulócitos humanos e foram comparados com o anticorpo murino conhecido 2B7. Todos os anticorpos que foram avaliados neste ensaio (anticorpos 1, 2, 5, 6, de 9 a 11, 16 e 20) se mostraram muito potentes com IC50s compreendendo de 7,8 a 90 pM. Dentre estes, anticorpos 1, 2, 5, 6, 9, 16 e 20 apresentaram IC50s inferiores a 50 pM, e anticorpos 1, 2, 6, 16 e 20 apresentaram IC50s inferiores a 25 pM. Nossos anticorpos foram mais potentes do que 2B7, que apresentaram uma IC50 de 477 pM. Dados são mostrados na Tabela 3. A Figura 4 ilustra a potência antagonista de dois anticorpos representativos da invenção, Anticorpo 1 e Anticorpo 6, em comparação com o conhecido anticorpo 2B7 no ensaio de alteração de forma de granulócitos humanos.

[00181] Anticorpos IgG4 identificados durante a otimização de 28G5 foram avaliados no ensaio de alteração de forma de granulócitos de cynomolgus. Todos os anticorpos foram capazes de neutralizar a atividade de GM-CSF no receptor de cynomolgus e também no receptor de humanos, e todos os anticorpos foram mais potentes do que 2B7. 2B7 apresentou uma IC50 de 26 pM, enquanto que anticorpos representativos (Anticorpo 6, Anticorpo 1 e Anticorpo 2) do conjunto apresentaram valores de IC50 de 1,73, 2,03 e 3,2 pM, respectivamente.

[00182] Um conjunto das IgG4s identificadas durante a otimização de 28G5 foi avaliado quanto a sua potência de neutralização no ensaio de liberação de TNFα de monócitos. Este ensaio testa a capacidade de se inibir a liberação do fator pró-inflamatório TNFα de monócitos humanos quando eles são tratados com GM-CSF. Anticorpos 1, 2, 5, 6, 9 e 10 foram testados, e todos se mostraram ativos neste ensaio e foram capazes de neutralizar totalmente a ação do GM-CSF em seu receptor (IC50 compreendendo de cerca de 43 a 139) enquanto que, na concentração de 333 nM, 2B7 só pôde proporcionar 50% de inibição da liberação de TNFα induzida com GM-CSF, indicando que este anticorpo é apenas um inibidor parcial neste ensaio. A Figura 5 ilustra a potência antagonista de dois anticorpos representativos da invenção em comparação com o conhecido anticorpo 2B7 no ensaio de liberação de TNFα de monócitos. Dados são mostrados na Tabela 4 e encontram-se resumidos como a seguir: <150 pM de Anticorpo nums. 1, 2, 5, 6, 9 e 10 <110 pM de Anticorpo nums. 1, 2, 5, 6 e 9 <100 pM de Anticorpo nums. 1, 5, 6 e 61

[00183] Uma característica da doença inflamatória é a sobrevida incrementada de tipos de células inflamatórias em resposta a sinais particulares. Granulócitos são capazes de sobreviver durante um tempo mais longo na presença de GM-CSF e, assim, avaliou-se a capacidade dos anticorpos IgG4 isolados durante a otimização de 28G5 para inibir esta resposta, em um ensaio de sobrevida de granulócitos. Todos os IgG4s anti-GM-CSFRα da otimização para lead foram ativos neste ensaio, e potências de neutralização representativas (IC50) compreenderam de 7,0 a 843,7 pM. Isto contrasta com o anticorpo murino conhecido 2B7 que foi completamente inativo até uma concentração de 83 nM. A Figura 6 ilustra a potência antagonista de dois anticorpos representativos da invenção, Anticorpo 1 e Anticorpo 6, em comparação com o conhecido anticorpo 2B7 no ensaio de sobrevida de granulócitos.

[00184] Estes dados, como ilustrado nas Figuras de 3 a 6, indicam que nossos anticorpos apresentam propriedades significativamente diferentes em comparação com o anticorpo murino conhecido 2B7. Por exemplo, anticorpos representativos da invenção inibiram a sobrevida de granulócitos e a proliferação de TF-1 estimulada com 7 pM de GM-CSF na sobrevida de granulócitos e nos ensaios de proliferação de TF-1, respectivamente, enquanto que 2B7 não inibiu a sobrevida de granulócitos, mas inibiu a proliferação de TF-1 (embora, em menor grau do que nossos anticorpos). Os dados indicam que elementos de ligação da invenção apresentam maior afinidade e melhor capacidade de inibir uma variedade de efeitos biológicos mediados por meio de GM-CSF-R em comparação com conhecidos anticorpos anrti-GM-CSFRα.

[00185] As seqüências de aminoácidos derivadas de 28G5 e seus derivados foram alinhadas com as seqüências de linhagem germinal humanas conhecidas no banco de dados VBASE, e a linhagem germinal mais próxima identificada por meio de similaridade de seqüência. A linhagem germinal mais próxima do domínio VH de 28G5 e seus derivados foi identificada como VH1 DP5. A VH de 28G5 apresenta 14 alterações relativamente à linhagem germinal VH 1-24 (DP5) em regiões de estrutura. A linhagem germinal mais próxima do domínio VL é Vlambda1 VL 1-e (DPL8), que apresenta apenas 5 alterações com relação à linhagem germinal nas regiões de estrutura. Regiões de estrutura de 28G5 e seus derivados foram retornadas à linhagem germinal por meio de mutagênese dirigida para sítio para equiparar identicamente anticorpos humanos nativos. Todos, exceto um aminoácido, puderam ser convertidos à linhagem germinal com alterações meramente modestas na potência do anticorpo. A isoleucina de aminoácido na posição 94 da cadeia pesada (usando numeração Kabat, Kabat et al. 1971) não pôde ser alterada à treonina de linhagem germinal sem uma completa perda de atividade. Portanto, esta alteração simples relativa à linhagem germinal foi mantida na região de estrutura do anticorpo.

[00186] Uma plena análise de dois dos anticorpos anti-GM-CSFRα, Anticorpo 6 e Anticorpo 1, foi realizada no ensaio de proliferação de TF-1. Os dados confirmam que estes anticorpos constituem antagonistas altamente potentes neste sistema com valores de pA2 calculados de -11,3±0,2 e -11,0±0,2, respectivamente (Figura 1).

[00187] Uma análise pA2 plena de um dos anticorpos anti-GM- CSFRα, Anticorpo 6, foi realizada nos ensaios de alteração de forma de granulócitos de humanos e de cynomolgus. Os dados confirmam que este anticorpo é um antagonista altamente potente nestes antagonista altamente potente nestes sistemas com valores pA2 calculados de -10,58 e -10,78 nos ensaios de humanos e de cynomolgus, respectivamente (Figura 2).

[00188] GM-CSF impele a diferenciação de células progenitoras hemopoiéticas em colônias de granulócitos e macrófagos em ensaios de agar semi-sólido. Portanto, anticorpo 6 e Anticorpo 1 maturados por afinidade, o anticorpo mAb parental 3 (28G5) e um controle negativo (CAT001) foram avaliados quanto a sua capacidade de antagonizar esta atividade específica de GM-CSF usando-se células progenitoras derivadas de sangue periférico, em um ensaio de formação de colônias. Dados apresentados na Figura 7 demonstram que ambos os mAbs representativos maturados por afinidade foram inibidores potentes da formação de colônias hemopoiéticas in vitro mediada por GM-CSF humano.

[00189] Valores de IC50 aproximados foram de 0,08 μg/ml (Anticorpo 6) e 0,25 μg/ml (Anticorpo 1) para o mAb maturado por afinidade. É interessante observar que o anticorpo murino conhecido 2B7 pareceu apresentar pouca ou nenhuma atividade inibidora neste ensaio até uma concentração de 66 nM.

[00190] Em experimentos de controle, o mAb maturado por afinidade não exerceu efeito sobre a formação de colônia mediada pela combinação de SCF + IL-3 + G-CSF como esperado e, na ausência de citocinas, a formação de colônias foi desprezível (<4 colônias/cultura).

[00191] Para a análise in vivo da atividade antagonista de mAb específico para huGM-CSFRa, é possível usar transplante de medula óssea de camundongos transgênicos (Tg) expressando ambas as cadeias, a e β, do GM-CSFR humano em camundongos de tipo selvagem, para gerar animais quiméricos de forma a limitar a expressão de huGM-CSFR transgênico a células hemopoiéticas derivadas de medula óssea células hemopoiéticas e, assim, assemelha-se mais estreitamente ao perfil de expressão do receptor endógeno. Nestes camundongos Tg quiméricos a administração de huGM-CSF leva a um aumento do peso do baço e à marginalização de monócitos circulantes do sangue. Anticorpo 6 maturado por afinidade e um mAb de controle negativo, CAT001, foram avaliados quanto a sua capacidade de antagonizar estas respostas in vivo mediadas com GM- CSF. Para a análise dose-resposta, 6 grupos de 5 camundongos Tg quiméricos foram tratados com 500 ng de huGM-CSF s.c duas vezes ao dia durante 4 dias (dia 1-4) e um sétimo grupo de controle de cinco animais recebeu apenas PBS. Quatro dos 6 grupos de animais tratados com huGM-CSF receberam mAb de teste (Anticorpo 6) a 16 mg/kg, 5,3 mg/kg, 1,78 mg/kg ou 0,59 mg/kg no dia 0 [D.0], enquanto que um quinto grupo dos animais tratados com huGM-CSF recebeu CAT001 de controle a 16 mg/kg no dia D.0. Resultados apresentados na Figura 8 demonstram que, em comparação com o controle de PBS, o tratamento com huGM-CSF induziu um aumento significativo do peso do baço e uma diminuição dos monócitos circulantes do sangue. Como esperado, tratamento com 16 mg/kg de controle CAT001 não exerceu qualquer efeito sobre o aumento do peso do baço ou sobre a diminuição dos monócitos do sangue. Em contraste, houve um claro efeito dose-resposta após o tratamento com o mAb de teste, Anticorpo 6, porque a 16 mg/kg este anticorpo anulou o aumento do peso do baço e, embora ainda aparente, o efeito foi muito reduzido a 0,59 mg/kg de mAb. A IC50 poderia parecer situar-se em algum ponto entre 0,59 mg/kg e 1,78 mg/kg. Observou-se um resultado similar para a diminuição induzida com GM-CSF em monócitos circulantes - tratamento com mAb de teste, Anticorpo 6, a 16 mg/kg anulou o aumento, enquanto que mAb a 0,59 mg/kg apresentou um impacto meramente menor sobre esta resposta. Estes dados mostram que o anticorpo anti-GM-CSFRα é um antagonista de GM-CSFRα humano in vivo.

[00192] Para investigar adicionalmente as propriedades antiinflamatórias destes anticorpos anti-GM-CSFRa, Anticorpo 6 foi avaliada em um ensaio de liberação de citocinas de células mononucleares do sangue periférico. Neste ensaio, TNFα e IL-6 podem ser liberados endogenamente, dependendo do doador. Neste ensaio, o GM-CSF também é produzido endogenamente pelas células, ao invés de adicionado exogenamente, e, portanto, resultados observados neste ensaio representam a inibição dos efeitos biológicos da ligação de GM-CSF endógeno nativo a seu receptor.

[00193] Após a administração do anticorpo 6, ambas estas citocinas foram inibidas de forma dependente da dose, como ilustrado na figura 9. Estes dados indicam que estes anticorpos podem inibir a atividade de GM-CSF nativo e que, mediante a inibição da sinalização de GM- CSF, é possível inibir citocinas pró-inflamatórias-chave, como IL-6 e TNFa, sendo que ambos estão implicados numa variedade de indicações inflamatórias, como artrite reumatóide.

[00194] Adicionalmente, com base neste resultado com Anticorpo 6 pode-se esperar que cada um dos anticorpos de 1 a 20 também poderia demonstrar a inibição neste ensaio, porque se acredita que todos os anticorpos de 1 a 20 ligam-se à mesma região de GM- CSFRa. MAPEAMENTO DE RADICAIS IMPORTANTES PARA O RECONHECIMENTO DE ANTÍGENO, E ANÁLISE DE SEQÜÊNCIA

[00195] Foi determinado que a variabilidade de radicais em posições na seqüência do scFv de Anticorpo 6 submetido a terapia na linhagem germinal para identificar quais posições são normalmente conservadas para ligação de ligante e sendo que referidas posições são variáveis no anticorpo que ainda conserva atividade de ligação de ligante.

[00196] Posições que contribuem para a ligação de antígeno foram verificadas como sendo os radicais Kabat 27A, 27B, 27C, 32, 51, 52, 53, 90, 92 e 96 no domínio VL, e radicais Kabat 17, 34, 54, 57, 95, 97, 99 e 100B no domínio VH.

[00197] Identificou-se sete posições que pareceram ser importantes para a ligação de antígeno: H95, H97, H99, H100B, L90, L92 e L96. Nós analisamos então os radicais nestas posições em seqüências de 160 variantes isoladas durante o processo de otimização do anticorpo 28G5, sendo que todas apresentaram um melhoramento mínimo de 5 vezes na potência no ensaio de proliferação de TF-1.

[00198] Dados na Tabela 5 abaixo resumem os diferentes aminoácidos (de, possivelmente, 20) que foram observados em cada uma destas posições, e em L95A. Onde as posições são fortemente conservadas com relação aos aminoácidos presentes no 28G5 e/ou Anticorpo 6, isto é boa evidência de que referidos aminoácidos são "chave" para a ligação do antígeno. Por exemplo, os radicais nas posições a seguir são fortemente conservados: H97, H100B, L90, L92. Método

[00199] A seqüência de DNA que codifica o scFv Anticorpo 6 maturado por afinidade e submetida a terapia na linhagem germinal foi convertida ao formato de apresentação de ribossoma, substancialmente como descrito na ref. [101]. Realizou-se PCR propensa a erro na seqüência do Anticorpo 6, usando-se as condições de elevada mutação (7,2 mutações por 1.000 bp [pares de bases]) de acordo com o protocolo do fabricante (BD Bioscience), para criar uma biblioteca de seqüências 574D04 variantes contendo mutações pontuais randômicas. Esta biblioteca foi expressa em ribossomas e incubada com GM-CSFRα marcado com purificação para permitir a ocorrência de ligação. Variantes capazes de se ligarem a GM-CSFRa marcado foram capturadas e removidas usando-se pérolas paramagnéticas revestidas com proteína G (Dynal). As variantes não- ligadas remanescentes na população foram adicionadas a um combinado de quatro anticorpos anti-idiotípicos biotinilados, que haviam sido derivados previamente da grande biblioteca de apresentação de fago de anticorpos humanos descrita na ref. [102] e que se sabia que se ligam ao scFv Anticorpo 6. Variantes ligadas pelos anticorpos anti-idiotípicos biotinilados foram capturadas com pérolas de estreptavidina, enquanto que variantes não-ligadas foram removidas por lavagem. Este processo foi repetido durante mais dois ciclos de seleção de apresentação de ribossoma, de acordo com a metodologia geral da ref. [101].

[00200] Uma proporção representativa de variantes das emissões de seleção foi clonada em um vetor de fagomídeo e as variantes de scFv foram expressas em fago para teste com ELISA, usando-se o mesmo método como descrito em Edwards BM et al (2003) Journal of Molecular Biology, vol. 334:103. Aquelas variantes que não apresentaram ligação a GM-CSFRa marcado com purificação foram testadas quanto à ligação com o combinado de quatro anticorpos anti- idiotípicos que foram usados na seleção. Variantes, que no ensaio de ligação de anti-idiotipo demonstraram ligação que foi igual ou maior do que o Anticorpo 6 scFv, foram seqüenciadas e as seqüências foram analisadas para encontrar posições em que havia uma elevada freqüência de mutação.

[00201] Verificou-se que a taxa média de mutação da população de variantes é de 3,05 aminoácidos por cadeia VH ou VL, usando-se 486 seqüências para as cadeias VH e 451 seqüências para as cadeias VL. Elas foram analisadas quanto a ''pontos quentes" mutacionais, freqüência de plotação de mutação em relação a sua posição ao longo do scFv. A análise focalizou aqueles clones com pelo menos uma mutação de CDR por VH e VL e menos de 4 mutações por VH e VL. A partir deste conjunto de 123 seqüências VH e 148 seqüências VL, ''pontos quentes" foram definidos como aqueles que apresentaram uma freqüência mutacional de 5% ou mais.

[00202] Sete posições entre VHCDR3 e VLCDR3 do Anticorpo 6 foram salientadas como posições putativas importantes para a ligação de antígeno usando-se o método de seleção negativo de apresentação de ribossoma. Realizou-se então uma análise em 160 variantes de seqüência isoladas durante o processo de otimização do anticorpo 28G5, em que as seqüências inteiras de VHCDR3 e VLCDR3 foram randomizadas e selecionadas para maior afinidade. Todas as seqüências (incluindo Anticorpo 6) são variantes do 28G5 que mostraram um melhoramento mínimo de 5 vezes na potência no ensaio de proliferação de TF-1.

DETERMINAÇÃO DE EPITOPO LINEAR

[00203] Foram selecionados o Anticorpo 6 e o conhecido anticorpo 2B7 contra 2442 peptídeos, cada um representando regiões curtas da seqüência de aminoácidos da porção extracelular do GM-CSFR-a, usando-se um método PEPSCAN. Calculou-se a média de sinais de ligação para cada anticorpo contra todos os peptídeos para gerar um sinal de fundo médio, e calculou-se para cada peptídeo uma relação sinal/fundo. Para ambos, Anticorpo 6 e 2B7, uma relação sinal/fundo de quatro ou mais foi contada como um sinal positivo específico. As seqüências de peptídeos que fornecem sinal positivo específico foram analisadas quanto a unidades repetitivas de ligação conservadas e verificou-se que o Anticorpo 6 ligou-se, de preferência, a uma unidade repetitiva YLDFQ, correspondendo aos radicais de 226 a 230 de GM- CSFRα humano maduro, e o 2B7 anticorpo ligou-se, de preferência, a uma unidade repetitiva DVRI, correspondendo aos radicais de 278 a 281 do GM-CSFRα humano maduro. A numeração da seqüência de aminoácidos para o receptor maduro é como apresentada na SEQ ID NO: 206. Método PEPSCAN (varredura de ligação de peptídeo)

[00204] A superposição de, na maior parte, peptídeos sintéticos 15- mer apresentando seqüências derivadas de GMCSF foram sintetizadas e selecionadas usando-se cartões mini-PEPSCAN com formato de cartão de crédito (placa de 455 poços com poços de 3 ul) como descrito previamente [103]. A ligação de anticorpos a cada peptídeo foi testada em um ensaio imunológico ligado a enzima (ELISA) à base de PEPSCAN. Cartões de polipeptídeo com formato de cartão de crédito de 455 poços contendo os peptídeos ligados covalentemente foram incubados com amostra (por exemplo, 10 ug/ml de anticorpo ou soro diluído a 1/1000 em uma solução de PBS que contém 5% de soro de cavalo (v/v) e 5% de ovalbumina (peso/volume)) e 1% de Tween80 ou em case de bloqueio brando em uma solução de PBS com 4% de soro de cavalo (v/v) e 1% de Tween80 (4oC, de um dia para o outro). Após a lavagem, os peptídeos foram incubados com uma peroxidase anti-anticorpo (diluição a 1/1000, por exemplo, peroxidase anti-camundongo de coelho, Dako) (1 h, 25oC), e subseqüentemente, após a lavagem, adicionou-se o substrato de peroxidase sulfonato de 2,2'-azino-di-3-etilbenzotiazolina (ABTS) e 2 ul/ml de H2O2 a 3%. Após 1 hora mediu-se o desenvolvimento de cor. O desenvolvimento de cor do ELISA foi quantificado com uma câmara de CCD e um sistema de processamento de imagem. A montagem consiste de uma câmara CCD e uma lente de 55 mm (Sony CCD Video Camara XC-77RR, Nikon micro-nikkor, lente de 55 mm f/2,8), um adaptador de câmara (Sony Camara adaptor DC-77RR) e o pacote de software de processamento de imagem Optimas, versão 6,5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910, E.U.A.). Optimas roda em um sistema de computador Pentium.

MATERIAIS E MÉTODOS DE ENSAIO Ensaio bioquímico de ligação de ligante

[00205] Realizou-se preparações de scFv purificado como descrito no Exemplo 3 do W001/66754 [104]. Concentrações de proteína de preparações de scFv purificado foram determinadas usando-se o método BCA [105]. Placas de microtitulação FluoronuncTM de 96 poços foram revestidas de um dia para o outro a 4oC com 50 μl/poço de IgG4 anti-humano diluído a 2,5 μg/ml em PBS. Placas foram lavadas 3 vezes com 300 μl/poço de PBS/0,1% de Tween-20 antes de bloquear durante 1 hora à temperatura ambiente com 300 μl/poço de 3% de BSA em PBS. Placas foram lavadas novamente 3 vezes com 300 μl/poço de PBS/0,1% de Tween-20 e, depois, adicionou-se 50 μl de GM-CSFRα humano diluído a 62,5 ng/ml em 1% de BSA/PBS em cada poço, e as placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem por 3 vezes como descrito acima, adicionou- se 25 μl de material de amostra em cada poço, seguido de 25 μl de GM-CSF biotinilado diluído a 2 nM em 1% de BSA/PBS. Para definir a ligação total, usou-se tamponador apenas como o material de amostra. Para definir ligação não-específica, usou-se GM-CSF biotinilado a 100 nM em 1% de BSA como o material de amostra. Placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente antes de lavagem por 3 vezes como descrito acima. Adicionou-se 50 μl de estreptavidina marcada com európio (PerkinElmer) diluído a 100 ng/ml em tamponador de ensaio DELFIATM a cada poço da placa e isto foi incubado durante de 30 a 60 minutos à temperatura ambiente antes de lavar 7 vezes com tamponador de lavagem DELFIATM. Adicionou-se 50 μl/poço de solução de incremento de DELFIATM às placas e as amostras foram lidas a 615 nm em uma leitora de placas. Ensaio de proliferação de TF-1

[00206] Células TF-1, obtidas da R&D Systems e conservadas rotineiramente em RPMI 1640, 10% de FBS, 1 mM de piruvato de sódio e 4 ng/ml de GM-CSF, foram privadas de nutriente por meio de lavagem por 3 vezes em meio de ensaio (RPMI 1640, 5% de FBS, 1 mM de piruvato de sódio), ressuspendendo-se em meio de ensaio e incubando-se durante de 7 a 24 horas a 37oC em 5% de CO2. Células foram então ressuspensas a 1x105/ml em meio de ensaio e adicionou- se 100 μl em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de fundo plano e 96 poços. Amostras de teste foram preparadas por meio de filtração estéril da amostra de estoque antes da diluição em meio de ensaio. Adicionou-se então 50 μl do material de teste em cada poço de células e estas foram incubadas durante de 45 a 60 min a 37oC em 5% de CO2. Adicionou-se então, em cada poço, 50 μl de GM-CSF diluído ao valor de EC80 em meio de ensaio (ou 0,4 ng/ml no caso de algumas bateladas de GM-CSF), e as placas foram incubadas durante 16 horas a 37OC em 5% de CO2 em uma câmara umedecida. Isto representa uma concentração final de 7 pM de GM-CSF. Para medir a proliferação das células, adicionou-se 20 μl de 3H-timidina diluída a 5,0 μCi/ml em meio de ensaio em cada poço da placa e as placas foram incubadas durante 4 horas ± 30 min a 37oC em 5% de CO2. Em seguida, células foram colhidas em placas 96 poços GF/C UnifilterTM usando-se um colheitador de placas e lavadas. Após adição de 50 μl de MicroScint 20TM em cada poço da placa de filtração, as placas foram fechadas hermeticamente e contadas em uma leitora de placas TopCount. Ensaio de alteração de forma de granulócitos humanos

[00207] Revestimentos tampão humanos (bolsa de sangue humano do Serviço de Transfusão de Sangue) foram misturados em um volume igual de 3% de Dextrano T-500 em 0,9% de NaCl. Em seguida, a mistura foi incubada numa posição ereta até formar-se uma interface. A camada superior foi colhida e aplicada em forma de camada sobre um gradiente de densidade 1,077 histopaque que, então, foi centrifugado a 400 g durante 40 minutos e deixado parar sem frenagem. As camadas superiores deste gradiente foram removidas deixando o pellet de granulócitos. Quaisquer células sangüíneas vermelhas remanescentes no pellet foram lisadas por meio de ressuspensão das células em 20 ml de água gelada durante 30 s, seguido de adição imediata de cloreto de sódio gelado a 1,8%. Células foram então re-pelotizadas a 1200 rpm e ressuspensas em meio de ensaio (RPMI 1640, 10% de FBS, 100 u/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 25 mM de HEPES) a 1x106/ml. Adicionou-se então 100 μl de células em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de fundo plano e 96 poços. Preparou-se amostras de teste por meio de filtração estéril das amostras de consumo e diluindo, conforme apropriado, em meio de ensaio.

[00208] Para isolamento de anticorpos lead, adicionou-se então 50 μl de amostra de teste às células, e as placas foram incubadas durante de 45 a 60 min a 37OC em 5% de CO2. Isto representa uma concentração final de 7 pM de GM-CSF. Isto foi seguido da adição de 50 μl de GM-CSF, diluído a 0,4 ng/ml em meio de ensaio, em cada poço, e de uma incubação de 4 horas a 37OC em 5% de CO2 numa câmara umedecida.

[00209] Para otimização para lead, IgG4s filtrados diluídos em meio de ensaio foram misturados com um volume igual de GM-CSF a 0,4 ng/ml em meio de ensaio. Isto representa uma concentração final de 7 pM de GM-CSF. Adicionou-se então 100 μl de anticorpo/GM-CSF em cada poço. Isto foi seguido de uma incubação de 3 horas a 37 °C em 5% de CO2 numa câmara umedecida.

[00210] Adicionou-se formaldeído frio a uma concentração final de 1,25% e as células foram fixadas de um dia para o outro a 4oC. Analisou-se 2000-5000 eventos por poço com a técnica de citometria de fluxo. A média geométrica do espalhamento direto (FSC) para cada amostra foi então derivada usando CellQuest. Células foram direcionadas de forma a excluir populações irrelevantes (p. ex., fragmentos/células mortas) quando se calcula a média geométrica. Ensaio de alteração de forma de granulócitos de Cynomolgus

[00211] Anticorpos foram avaliados em um ensaio que mede a alteração de forma de granulócitos de cynomolgus após estimulação com GM-CSF. Granulócitos foram purificados de sangue integral de cynomolgus e o ensaio foi realizado substancialmente como descrito para o ensaio de alteração de forma de granulócitos humanos. Dados de afinidade de ligação usando análise de biossensor

[00212] O sistema BIAcore 2000 System (Pharmacia Biosensor) foi usado para avaliar os parâmetros cinéticos da interação entre scFvs e IgG4s com os receptores recombinantes. O Biosensor usa os efeitos ópticos da ressonância de plasmon de superfície sobre alterações do estudo na concentração de superfície resultante da interação de uma molécula de um composto a ser analisado com uma molécula de ligante que é ligada covalentemente a uma matriz de dextrano. Tipicamente, a espécie de composto a ser analisado em solução livre é passada sobre o ligante acoplado, e qualquer ligação é detectada como um aumento do sinal de SPR local. Isto é seguido de um período de lavagem, durante o qual a dissociação da espécie de composto a ser analisado é observada como uma diminuição do sinal de SPR, após o que qualquer composto a ser analisado remanescente é extraído do ligante, e o procedimento é repetido com várias concentrações diferentes de composto a ser analisado. Empregou-se usualmente uma série de controles durante um experimento para assegurar que, nem a capacidade de ligação absoluta, nem o perfil cinético do ligante acoplado se alteram significativamente. Usa-se tipicamente uma solução salina proprietária de tamponador de herpes (HBS-EP) como o diluente principal de amostras de composto a ser analisado e solvente de fase de dissociação. Os dados experimentais são registrados em unidades de ressonância (correspondendo diretamente ao sinal de SPR) com relação ao tempo. As unidades de ressonância são diretamente proporcionais ao tamanho e à quantidade de composto a ser analisado ligado. É possível usar então o pacote de programas BIAevaluation para atribuir a constante de taxa à fase de dissociação (unidades de taxa de dissociação s-1) e fase de associação (unidades de taxa de associação M-1 s-1). Estes valores permitem, então, o cálculo das Constantes de Afinidade de Associação e Dissociação.

[00213] Avaliou-se a afinidade de IgG4 usando um ensaio simples em que a IgG4 foi capturada de maneira não-covalente por meio de superfície de proteína A de amina. Uma série de diluições de domínio extracelular de receptor de GM-CSF marcado com purificação recombinante, de 100 a 6,25 nM, foi passada então seqüencialmente sobre o IgG4. Calculou-se a molaridade do receptor usando-se a concentração (Bradford) e a massa predita de polipeptídeo maduro não-modificado após a tradução (39,7 kDa). Cada um dos dois conjuntos de dados separados foi analisado em formatos idênticos. Dados corrigidos com relação a células de referência foram submetidos a ajustamento usando-se o modelo de Langmuir a 1:1 ajustado para cálculo global simultâneo das taxas de associação e dissociação, com o valor Rmax ajustado para global. O nível de IgG4 capturado durante cada ciclo foi avaliado para assegurar que a quantidade capturada permaneceu estável durante todo o experimento. Adicionalmente, a taxa de dissociação do IgG4 foi avaliada para determinar se seria necessária uma correção do desvio da linhagem de base. No entanto, ambas as interações de proteína A provaram ser suficientemente reproduzíveis e estáveis. A validade dos dados foi restringida pelo valor T e chi2 calculado (parâmetro valor/desvio), que deveria ser <2 e >100 respectivamente. Produção de domínio extracelular de GM-CSFRg marcado com purificação:

[00214] Usou-se um vetor de expressão pEFBOS [106] incorporando uma seqüência codificando domínio extracelular α de receptor de GM- CSF humano (SEQ ID NO: 205, representando os aminoácidos de 1 a 298 do GM-CSF R maduro) com uma seqüência-sinal de IL-3 de murino e incorporando um marcador de purificação N-terminal, para produzir polipeptídeo de domínio extracelular (ECD) de receptor de GM-CSF marcado N-terminal recombinante. O polipeptídeo de ECD marcado foi expresso em células CHO usando-se o vetor pEFBOS com o uso de procedimentos convencionais. Este polipeptídeo também pode ser referido como domínio extracelular de GM-CSFRα purificado, ou como o domínio extracelular solúvel de GM-CSFRα.

[00215] É possível usar qualquer marcador de purificação vantajoso, p. ex., peptídeo Flag (DYKDDDE - SEQ ID NO: 204), Fc, biotina ou marcador his. A purificação pode ser conduzida empregando-se qualquer técnica apropriada, p. ex. um polipeptídeo de ECD marcado com Flag (SEQ ID NO: 203) pode ser purificado em uma coluna de cromatografia de afinidade M2 e eluído com peptídeo FLAG. Ensaio de liberação de TNFα de monócitos Purificação de Monócitos (Kit de Isolamento de Monócitos - Miltenyi Biotec - 130-053-301):

[00216] Revestimentos tampão humanos (bolsa de sangue humano do Serviço de Transfusão de Sangue) foram aplicados em forma de camada sobre um gradiente de densidade 1,077 histopaque (Sigma, número de catálogo 1077-1) e células foram centrifugados a 400xg durante 40 minutos. Não se aplicou frenagem ao parar a centrífuga. Em seguida, colheu-se células PBMC da interface. Células foram lavadas em PBS e pelotizadas a 300xg durante 10 min antes que as células sangüíneas vermelhas remanescentes sejam lisadas por meio de ressuspensão em 20 ml de água gelada durante 15 s, seguido de adição imediata de NaCl gelado a 1,8%. Células foram então pelotizadas a 1200 rpm durante 5 min e ressuspensas em 600 μl de tamponador MACS (PBS, 2 mM de EDTA). Adicionou-se às células 200 μl de reagente de bloqueio Fc fornecido com o kit e isto foi misturado antes de se adicionar 200 μl de coquetel de hapteno- anticorpo (também fornecido com o kit) e misturação. Em seguida, células foram incubadas a 4oC durante 15 min antes de serem lavadas duas vezes em 50 ml de tamponador MACS. O pellet de células foi ressuspenso em 600 μl de tamponador MACS antes de se adicionar 200 μl de reagente de bloqueio Fc e misturação, seguido de 200 μl de micro-pérolas anti-hapteno MACS e misturação. As células foram incubadas durante 45 min a 4oC antes de lavagem em 50 ml de tamponador MACS e ressuspensão em 500 μl de tamponador MACS. Preparou-se uma coluna simples (Miltenyi Biotec 130-042-401) por meio de lavagem de perfusão com 3 ml de tamponador MACS antes que a suspensão de células fosse aplicada na coluna. O efluente foi recolhido como a fração de monócitos enriquecida. A coluna foi lavada com 2x3ml de tamponador MACS e recolheu-se o efluente. A pureza dos monócitos foi verificada por meio de manchamento com anti- CD14-PE usando-se métodos convencionais de citometria de fluxo. Células foram ressuspensas finalmente a 4 x 106/ml em meio de ensaio (RPMI 1640, 10% de FCS, 100U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina). Estimulação de Monócitos:

[00217] 50 μl de células foram adicionados em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de fundo plano Costar com 96 poços. Adicionou-se em todos os poços 25 μl de 150 μg/ml de rhlFNy (R&D Systems). IgG4s filtrados diluídos em meio de ensaio foram misturados com um volume igual de GM-CSF a 56 ng/ml (4 nM) em meio de ensaio. Isto representa uma concentração final de 1 nM de GM-CSF. Adicionou-se então, em cada poço, 75 μl de mistura de anticorpo/GM-CSF. Controles consistiram de poços carregados apenas com GM-CSF ou sem GM-CSF e sem anticorpo. Placas foram então incubadas durante 18 horas a 37OC com 5% de CO2 numa câmara umedecida. O sobrenadante foi então colhido para testar níveis de TNF-a por meio de ELISA. ELISA de TNFg (R&D Systems ELISA Developing System DY210):

[00218] Placas de ELISA imunossorvente Fluoronunc foram revestidas de um dia para o outro à temperatura ambiente com 100 μl de anticorpo de captura a 4 μg/ml em PBS. Placas foram então lavadas três vezes com PBS/0,1% de Tween e bloqueadas com 300μl/poço de Marvel a 3% em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente. Placas foram lavadas 3 vezes com PBS/0,1% de Tween. 100 μl do sobrenadante das placas de ensaio foram transferidos para a placa de ELISA e adicionou-se, nos poços de controle, uma titulação de TNF-a diluído em meio de ensaio. Placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas antes de lavagem de 4 a 5 vezes com PBS/0,1% de Tween. Adicionou-se, em cada poço da placa, 100 μl de anticorpo de detecção diluído a 300 ng/ml em 1% de Marvel/PBS, e as placas foram incubadas durante mais 2 horas à temperatura ambiente antes de lavagem de 4 a 5 vezes com PBS/0,1% de Tween. Estreptavidina-európio (PerkinElmer 1244-360) foi diluído a 1:1000 em tamponador de ensaio DELFIA (PerkinElmer 4002-0010) e adicionado a 100μl/poço antes de se incubar durante 45 min à temperatura ambiente. Placas foram lavadas então 7 vezes em tamponador de lavagem DELFIA antes da adição de 100 μl/poço de solução de incremento (PerkinElmer 4001-0010) e leitura a 615 nm em uma leitora de placas. Ensaio de sobrevida de granulócitos

[00219] Células foram purificadas de revestimentos tampão humanos como descrito com referência ao ensaio de ativação de neutrófilos (ensaio de alteração de forma), lavadas em meio de ensaio (RPMI-1640 Glutamax, 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina) e ressuspensas a 1 x 106/ml em meio de ensaio. Adicionou-se 100 μl de células em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de fundo plano Costar de 96 poços. Estoques filtrados de anticorpo foram diluídos em meio de ensaio e misturados com um volume igual de GM-CSF a 0,4 ng/ml. Isto representa uma concentração final de 7 pM de GM-CSF. Poços de controle continham apenas meio ou GM-CSF apenas. Adicionou-se então 100 μl da mistura de amostra de teste/GM-CSF em cada poço na placa, e as células foram incubadas durante 68 horas a 37oC/5% de CO2 numa câmara umedecida. Adicionou-se 20 μl de AlamarBlue em cada poço e as placas foram incubadas durante mais 24 horas a 37oC/5% de CO2 numa câmara umedecida. Placas foram então lidas a 560 nm e 590 nm em uma leitora de placas. Análise pA2 de anticorpos anti-GM-CSFRα no ensaio de proliferação de TF-1 e nos ensaios de alteração de forma de granulócitos de humanos e cynomolgus

[00220] A principal ferramenta farmacológica para quantificar a afinidade de um antagonista competitivo é a análise de Schild. Usando esta abordagem é possível determinar meios independentes do sistema para estimar a afinidade antagonista em um ensaio funcional. O método baseia-se no conceito de que a concentração de antagonista e sua afinidade determina o antagonismo da resposta antagonista. Como o antagonista pode ser quantificado e a concentração do antagonista é conhecida, é possível determinar a afinidade do antagonista. Este antagonista é quantificado medindo-se a relação de concentrações equi-ativas de agonistas, sendo isto medido na presença e na ausência do antagonista, e referido como relações de dose (DR).

[00221] Relações de dose podem ser calculadas tomando-se a relação da EC50 do agonista (tipicamente GM-CSF) na ausência do elemento de ligação para a EC50 do agonista na presença de uma concentração simples de elemento de ligação. As relações de dose, expressas como log(DR-1) podem ser usadas então numa regressão linear no log [elemento de ligação] para produzir uma regressão de Schild. Assim, para cada concentração de elemento de ligação haverá um valor de DR correspondente; estes são plotados como a regressão de log(DR-1) relativamente a log [elemento de ligação]. Se o antagonismo for competitivo, haverá relação linear entre log (DR-1) e log [elemento de ligação] de acordo com a equação de Schild, sendo que a equação é como a seguir: Log(DR-1) = log [A] - log KA

[00222] Nestas circunstâncias, um valor de zero para a ordenada dará uma interceptação do eixo x em que log [a] = log KA. Portanto, a concentração de elemento de ligação que produz um log (DR-1) = 0 será igual ao log KA, a constante de dissociação de equilíbrio do complexo elemento de ligação - receptor. Esta é uma quantificação independente-do-sistema da afinidade do elemento de ligação que deveria ser precisa para cada sistema celular contendo o receptor.

[00223] Como os valores de KA são obtidos de um gráfico logarítmico, eles são distribuídos log normalmente. O logaritmo negativo desta concentração particular é referido empiricamente como pA2, a concentração de antagonista que produz um desvio de duas vezes a curva de resposta da dose de agonista. A potência antagonista pode ser quantificada calculando-se a pA2 de uma concentração simples de antagonista que produz um valor simples para a relação de dose da equação, sendo que pA2 = log (DR-1)-log[a] [a] = concentração molar de antagonista que torna necessário dobrar a concentração de agonista para elicitar a resposta submáxima original. DR = a relação de dose é quantificada medindo-se a relação de concentrações equi-ativas de agonista medida na presença e na ausência do antagonista. pA2 pode ser calculado a partir dos dados de ensaio dose- resposta. Inibição da diferenciação mediada com GM-CSF in vitro, de progenitores de células sangüíneas em um ensaio de formação de colônias

[00224] Células mononucleares do sangue periférico enriquecidas com células progenitoras hemopoiéticas foram obtidas de doadores que sofreram mobilização de células progenitoras e aferese como parte de seu tratamento clínico padrão. Amostras foram re- identificadas e células não foram crio-conservadas antes do uso. 5x104 Células mononucleares foram cultivadas em agar semi-sólido [107] na presença de GM-CSF humano a uma concentração final de 10 ng/ml. maBs humanos maturados por afinidade, de teste, e o anticorpo murino conhecido 2B7, foram adicionados às culturas em agar a uma concentração final de 10, 5, 1, 0,5, 0,1 ou 0,05 μg/ml. O mAb humano parental 28G5 e um mAb humano de controle negativo equiparado com isótipo, CAT001, foram avaliados a uma concentração simples de 10 μg/ml. Para fins de controle, mAbs também foram avaliados quanto a sua capacidade de bloquear a formação de colônias estimuladas por uma combinação de SCF, IL-3 e G-CSF (Croker et al., 2004) e quanto a seu impacto sobre a formação de colônias na ausência de citocinas. A formação de colônias (agregados > 40 células) foi incrementada após 14 dias de incubação a 37oC com 10% de CO2 em ar. Colônias foram fixadas com gluteraldeído e contadas usando-se um microscópio de dissecção com um aumento de 35X78 Inibição da atividade biológica do GM-CSF in vivo em camundongos transgênicos GM-CSFRαβ humanos

[00225] Gerou-se camundongos transgênicos (Tg) expressando ambas as cadeias, α e β, do GM-CSFR humano sob o controle de um promotor de MHC de classe I, e descreveu-se respostas de células sangüíneas e de baço in vivo à administração de huGM-CSF [108]. Para análise in vivo da atividade antagonista de mAb especifica para huGM-CSFRα, é possível usar transplante de medula óssea dos camundongos Tg em camundongos de tipo selvagem para gerar animais quiméricos de tal forma que a expressão de huGM-CSFRαβ transgênico se limite a células hemopoiéticas derivadas de medula óssea e, assim, assemelha-se mais estreitamente ao perfil de expressão do receptor endógeno. Nestes camundongos Tg huGM- CSFRαβ quiméricos, a administração de huGM-CSF leva a um aumento do peso do baço e à marginalização de monócitos circulantes do sangue. Geração de camundongos Tg quiméricos:

[00226] Fêmures e tíbias de camundongos Tg doadores foram removidos, e a medula óssea foi enxaguada com PBS estéril mais 3% de soro de bezerro fetal (FCS). Em seguida, os tampões de medula óssea foram sugados através de uma agulha 23G para se obter uma suspensão de células simples, depois células foram lavadas uma vez com PBS frio + 3% de FCS e passados através de uma tela de aço inoxidável. Removeu-se então células vermelhas por meio de lise em 0,168 M de tamponador de cloreto de amônio, após o que células foram lavadas mais duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) + 3% de FCS antes de serem passadas novamente através de uma tela de aço inoxidável. Para remover ainda mais células mortas e fragmentos de células, a suspensão foi centrifugada através de um leito de FCS. Células viáveis são recuperadas no pellet, lavadas uma vez com PBS e ressuspensas em PBS a 2,5 x 107/ml. Camundongos C57/BL6 recipientes com de 5 a 8 semanas de vida foram irradiados letalmente com 2 doses de 550 Rad, com intervalo de 3 horas. Camundongos recipientes foram injetados intravenosamente (i.v) com 0,2 ml de suspensão de células (i.e. 5 x 106 células/camundongo) e alojados subseqüentemente em caixas cobertas com 0,02 M de neomicina em sua água potável durante 3 semanas. A reconstituição foi avaliada após 6 semanas por meio de análise de FACS de sangue periférico usando-se mAbs específicos para as cadeias huGMCSFRα e β 79 Tratamento com GM-CSF e análise subseqüente de camundongos Tg quiméricos:

[00227] Camundongos Tg quiméricos foram tratados duas vezes ao dia pela via subcutânea (s.c.) com 500 ng de huGM-CSF durante 4 dias. Para análise da atividade antagonista do anticorpo, grupos de 5 camundongos receberam administração de doses selecionadas de mAb (ver abaixo) pela via intraperitoneal (i.p.) 1 dia antes do início do tratamento com GM-CSF. No dia 5, retirou-se amostras de 0,2 ml de sangue para análise de populações de leucócitos circulantes, em particular monócitos do sangue, usando um sistema de hematologia ADVIA™ (Bayer Diagnostics). Animais foram então sacrificados, e os baços removidos para medição dos pesos.

[00228] Inibição de IL-6 e TNFa expresso endogenamente de células mononucleares de sangue periférico humano.

[00229] Revestimentos tampão humanos (bolsa de sangue humano do Serviço de Transfusão de Sangue) foram aplicados em forma de camada sobre um gradiente de densidade de densidade 1,077 de histopaque (Sigma, número de catálogo 1077-1) e células foram centrifugadas a 400xg durante 40 minutos. Não se aplicou frenagem quando da parada da centrífuga. Células PBMC foram então colhidas da interface. Células foram lavadas em PBS e pelotizadas a 300xg durante 10 min antes que as células sangüíneas vermelhas remanescentes fossem lisadas por meio de ressuspensão em 20 ml de água gelada durante 15 s, seguido da adição imediata de NaCl gelado a 1,6%. Células foram então pelotizadas a 1200 rpm durante 5 min e ressuspensas em 10 ml de 10% de FBS/RPMI e 1% de penicilina estreptomicina. Células foram então diluídas a 5 x 106/ml. 110 μl de células foram aplicados em cada poço (5,5 x 105/poço) e células foram deixadas assentarem durante 1 h a 37oC, 5% de CO2. Adicionou-se os seguintes reagentes como controles de concentração final simples; PHA (5 μg/ml), LPS (25 μg/ml), GM-CSF (10 ng/ml) e isótipo de controle (50 μg/ml). Anticorpo 6 foi adicionado a uma concentração de partida final de 50 μg/ml com uma série de diluição de cinco vezes. Placas foram incubadas então durante 72 h a 37oC, 5% de CO2. Sobrenadantes foram recolhidos após 72 h, e os níveis de TNFa e IL-6 foram calculados usando-se os seguintes kits de ELISA R&D (hTNF-a R&D Duoset ELISA development system DY210 e hIL-6 R&D Duoset ELISA development system DY206). ELISA foram realizados de acordo com as recomendações dos fornecedores. TABELA 1: Inibição da proliferação induzida com GM-CSF de células TF-1 por meio de anticorpos IgG4 não-submetidos a terapia na linhagem germinal isolados a partir da otimização de 28G5. A proliferação de células TF-1 foi induzida com uma concentração simples de GM-CSF na presença de concentrações crescentes de anticorpos IgG4. Mediu-se a incorporação de timidina tritiada, e calculou-se os valores de IC50 para os anticorpos. Dados são representativos de n>3, SEM [erro padrão da média, EPM] é mostrado.

Tabela 2: Análise cinética de anticorpos IgG4 não-submetidos a terapia na linhagem germinal anti-GM-CSFRa isolados durante a otimização de 28G5. Anticorpos IgG4 foram imobilizados na superfície de um chip revestido com proteína A e uma série de diluições de GM-CSF Ra ECD marcado com purificação foram passados sobre a IgG4. Dados foram submetidos ao ajuste usando-se a Langmuir 1:1 simultânea ka kd com permissão de transporte de massa.

[00230] Dados para anticorpos 9 e 11 foram bifásicos TABELA 3: Inibição da alteração de forma induzida com GM-CSF de granulócitos humanos por meio de anticorpos IgG4 não-submetidos a terapia na linhagem germinal isolados durante a otimização de 28G5. Granulócitos humanos foram tratados com uma concentração simples de GM-CSF na presença de concentrações crescentes de anticorpo IgG4. A alteração de forma dos granulócitos foi medida usando-se citometria de fluxo e calculou-se os valores de IC50 para os anticorpos.

TABELA 4: Inibição da liberação induzida com GM-CSF de TNFa de monócitos. Monócitos humanos foram tratados com uma concentração simples de GM-CSF na presença de concentrações crescentes de anticorpo IgG4 não-submetidos a terapia na linhagem germinal. A liberação de TNFa foi medida com ELISA e calculou-se os valores de IC50 para os anticorpos.

Tabela 5

CHAVE PARA A LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

[00231] Na listagem de seqüências anexa encontram-se listadas seqüências de ácido nucleico e aminoácidos ("PRT") para 20 clones de anticorpo, compreendendo o clone parental e os 19 clones do conjunto otimizado. Anticorpos são numerados de Ab1 a Ab20. O clone parental é anticorpo 3, representado pelas SEQ ID NOS: de 21 a 30 e SEQ ID NOS: de 211 a 212.

[00232] A lista a seguir identifica, por número, as SEQ ID NOS em que se mostra seqüências das moléculas indicadas:

[00233] As seqüências de nucleotídeos de domínio VL de anticorpos de 1 a 20 não incluem o códon gcg mostrado na ponta 3' nas SEQ ID NOS: 6, 16, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 176, 186 e 196. Correspondentemente, as seqüências de aminoácidos de domínio VL não incluem o radical Ala C-terminal (resíduo 113) nas SEQ ID NOS: 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187 e 197, respectivamente. O radical Ala113 e códon gcg correspondente não foram expressos nos Anticorpos de 1 a 20. uma comparação das seqüências escritas com segmentos de genes de linhagem germinal, particularmente JL2, indica que o radical Ala e códon gcg correspondente não formam parte do domínio VL90

[00234] O radical Gly na posição 112 esteve presente nas seqüências scFv e IgG expressas. No entanto, este radical não está presente nas seqüências de segmento j de linhagem germinal humana que formam a região de estrutura 4 do domínio VL, p. ex. JL2. O radical Gly não é considerado como uma parte do domínio VL.

[00235] Para expressar a cadeia leve da IgG, proporcionou-se uma seqüência de nucleotídeos codificando a cadeia leve do anticorpo, compreendendo um primeiro éxon codificando o domínio VL, um segundo éxon codificando o domínio CL, e um íntron separando o primeiro éxon e o segundo éxon. Em circunstâncias normais, o íntron é recortado por meio de equipamento de processamento de mRNA celular, conjugando-se a ponta 3' do primeiro éxon com a ponta 5' do segundo éxon. Assim, quando DNA apresentando a referida seqüência de nucleotídeos foi expresso como RNA, o primeiro e segundo éxons foram recompostos. Tradução do RNA recomposto produz um polipeptídeo compreendendo o domínio VL e o domínio CL. Após recomposição, o Gly na posição 112 é codificado pela última base (g) da seqüência de estrutura 4 de domínio VL e as primeiras duas bases (gt) do domínio CL.

[00236] As seqüências de domínio VL dos Anticorpos de 1 a 20 são as SEQ ID NOS: de 186 a 246 como indicado acima. As seqüências de nucleotídeos de domínio VL terminam com cta como o códon final, e Leu é o radical de aminoácido final nas seqüências de aminoácidos de domínio VL correspondentes.

[00237] Seqüências de domínio VL e domínio VH não-submetidas a terapia na linhagem germinal de Anticorpo 6 são mostradas nas SEQ ID NOS: de 247 a 250, adicionalmente às seqüências de domínio VL e de domínio VH submetidas a terapia na linhagem germinal mostradas nas SEQ ID NOS: 51, 52, 56, 57, 216 e 217.

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Claims

1. Molécula de anticorpo isolada, caracterizado pelo fato de que a molécula de anticorpo compreende um conjunto de regiões determinadoras de complementaridade HCDR1, HCDR2 e HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que: HCDR1 é SEQ ID NO: 3, HCDR2 é SEQ ID NO: 4, HCDR3 é SEQ ID NO: 5, LCDR1 é SEQ ID NO: 8, LCDR2 é SEQ ID NO: 9 e LCDR3 é SEQ ID NO: 10; HCDR1 é SEQ ID NO: 3, HCDR2 é SEQ ID NO: 4, HCDR3 é SEQ ID NO: 15, LCDR1 é SEQ ID NO: 8, LCDR2 é SEQ ID NO: 9 e LCDR3 é SEQ ID NO: 20; HCDR1 é SEQ ID NO: 3, HCDR2 é SEQ ID NO: 4, HCDR3 é SEQ ID NO: 35, LCDR1 é SEQ ID NO: 8, LCDR2 é SEQ ID NO: 9 e LCDR3 é SEQ ID NO: 20; HCDR1 é SEQ ID NO: 3, HCDR2 é SEQ ID NO: 4, HCDR3 é SEQ ID NO: 45, LCDR1 é SEQ ID NO: 8, LCDR2 é SEQ ID NO: 9 e LCDR3 é SEQ ID NO: 20; HCDR1 é SEQ ID NO: 3, HCDR2 é SEQ ID NO: 4, HCDR3 é SEQ ID NO: 55, LCDR1 é SEQ ID NO: 8, LCDR2 é SEQ ID NO: 9 e LCDR3 é SEQ ID NO: 60; HCDR1 é SEQ ID NO: 3, HCDR2 é SEQ ID NO: 4, HCDR3 é SEQ ID NO: 65, LCDR1 é SEQ ID NO: 8, LCDR2 é SEQ ID NO: 9 e LCDR3 é SEQ ID NO: 20; HCDR1 é SEQ ID NO: 3, HCDR2 é SEQ ID NO: 4, HCDR3 é SEQ ID NO: 75, LCDR1 é SEQ ID NO: 8, LCDR2 é SEQ ID NO:9 e LCDR3 é SEQ ID NO: 20; HCDR1 é SEQ ID NO: 3, HCDR2 é SEQ ID NO: 4, HCDR3 é SEQ ID NO: 95, LCDR1 é SEQ ID NO: 8, LCDR2 é SEQ ID NO: 9 e LCDR3 é SEQ ID NO: 20; HCDR1 é SEQ ID NO: 3, HCDR2 é SEQ ID NO: 4, HCDR3 é SEQ ID NO: 115, LCDR1 é SEQ ID NO: 8, LCDR2 é SEQ ID NO: 9 e LCDR3 é SEQ ID NO: 120; HCDR1 é SEQ ID NO: 3, HCDR2 é SEQ ID NO: 4, HCDR3 é SEQ ID NO: 135, LCDR1 é SEQ ID NO: 8, LCDR2 é SEQ ID NO: 9 e LCDR3 é SEQ ID NO: 140; HCDR1 é SEQ ID NO: 3, HCDR2 é SEQ ID NO: 4, HCDR3 é SEQ ID NO: 145, LCDR1 é SEQ ID NO: 8, LCDR2 é SEQ ID NO: 9 e LCDR3 é SEQ ID NO: 150; HCDR1 é SEQ ID NO: 3, HCDR2 é SEQ ID NO: 4, HCDR3 é SEQ ID NO: 155, LCDR1 é SEQ ID NO: 8, LCDR2 é SEQ ID NO: 9 e LCDR3 é SEQ ID NO: 160; HCDR1 é SEQ ID NO: 3, HCDR2 é SEQ ID NO: 4, HCDR3 é SEQ ID NO: 165, LCDR1 é SEQ ID NO: 8, LCDR2 é SEQ ID NO: 9 e LCDR3 é SEQ ID NO: 170; HCDR1 é SEQ ID NO: 3, HCDR2 é SEQ ID NO: 4, HCDR3 é SEQ ID NO: 185, LCDR1 é SEQ ID NO: 8, LCDR2 é SEQ ID NO: 9 e LCDR3 é SEQ ID NO: 190; ou HCDR1 é SEQ ID NO: 3, HCDR2 é SEQ ID NO: 4, HCDR3 é SEQ ID NO: 195, LCDR1 é SEQ ID NO: 8, LCDR2 é SEQ ID NO: 9 e LCDR3 é SEQ ID NO: 200.

2. Molécula de anticorpo isolada, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que HCDR1 é uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3; HCDR2 é uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4; HCDR3 é uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 55; LCDR1 é uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8; LCDR2 é uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9; e LCDR3 é uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 60.

3. Molécula de anticorpo isolada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o elemento de ligação inibe a ligação de GM-CSF a GM-CSFRa, em que a molécula de anticorpo se liga ao domínio extracelular de GM-CSFRα com uma afinidade (KD) de menos que 1 nM em um ensaio de ressonância de plasmon de superfície, e em que o membro de ligação compreende um domínio VH com a sequência de aminoácidos do domínio VH mostrada na SEQ ID NO: 52, e um domínio VL com a sequência de aminoácidos do domínio VL mostrada na SEQ ID NO: 218.

4. Molécula de anticorpo isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de anticorpo lliga o domínio extracelular do GM-CSFRα humano com uma afinidade de 5 nM ou menos

5. Molécula de anticorpo isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio VH e um domínio VL selecionados a partir de: domínio VH SEQ ID NO: 2 e domínio VL SEQ ID NO: 208; domínio VH SEQ ID NO: 12 e domínio VL SEQ ID NO: 210; domínio VH SEQ ID NO: 32 e domínio VL SEQ ID NO: 210; domínio VH SEQ ID NO: 42 e domínio VL SEQ ID NO: 210; domínio VH SEQ ID NO: 52 e domínio VL SEQ ID NO: 218; domínio VH SEQ ID NO: 62 e domínio VL SEQ ID NO: 210; domínio VH SEQ ID NO: 72 e domínio VL SEQ ID NO: 210; domínio VH SEQ ID NO: 92 e domínio VL SEQ ID NO: 210; domínio VH SEQ ID NO: 22 e domínio VL SEQ ID NO: 230; domínio VH SEQ ID NO: 132 e domínio VL SEQ ID NO: 234; domínio VH SEQ ID NO: 142 e domínio VL SEQ ID NO: 236; domínio VH SEQ ID NO: 152 e domínio VL SEQ ID NO: 238; domínio VH SEQ ID NO: 152 e domínio VL SEQ ID NO: 240; domínio VH SEQ ID NO: 182 e domínio VL SEQ ID NO: 244; e domínio VH SEQ ID NO: 192 e domínio VL SEQ ID NO: 246.

6. Molécula de anticorpo isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a molécula de anticorpo é uma molécula de anticorpo humano ou humanizado.

7. Molécula de anticorpo isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a molécula de anticorpo é uma IgG4.

8. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de anticorpo como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a composição compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.

9. Uso de uma composição como definida na reivindicação 8, caracterizado pelo fato de ser para preparar um medicamento para tratar artrite reumatóide, asma, resposta alérgica, esclerose múltipla, leucemia mielóide e aterosclerose, doença pulmonar obstrutiva crônica ou leucemia mielóide.