CN101443360A - Gm-csf受体结合元件 - Google Patents
Gm-csf受体结合元件 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101443360A CN101443360A CNA2007800154169A CN200780015416A CN101443360A CN 101443360 A CN101443360 A CN 101443360A CN A2007800154169 A CNA2007800154169 A CN A2007800154169A CN 200780015416 A CN200780015416 A CN 200780015416A CN 101443360 A CN101443360 A CN 101443360A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- antibody
- territory
- binding member
- csf
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 261
- 108010092372 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 title description 4
- 102000016355 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptors Human genes 0.000 title description 4
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims abstract description 147
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims abstract description 147
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 309
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 187
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 137
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 90
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 84
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical group COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 62
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 50
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 49
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 40
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 36
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 claims description 34
- 101000916625 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 32
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 claims description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 31
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 31
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 31
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 31
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 30
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 25
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 24
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 claims description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 23
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 21
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 claims description 16
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 11
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 claims description 7
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 claims description 7
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 claims description 5
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 claims description 5
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 claims description 5
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 claims description 5
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 4
- 102220627452 Paired immunoglobulin-like type 2 receptor alpha_L95A_mutation Human genes 0.000 claims description 3
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 claims description 3
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 27
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 claims 12
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 claims 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 abstract description 5
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 abstract 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 68
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 66
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 66
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 66
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 56
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 45
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 42
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 38
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 30
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 29
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 26
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 24
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 24
- 230000008569 process Effects 0.000 description 23
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 21
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 21
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 21
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 20
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 20
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 19
- 239000000463 material Substances 0.000 description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 19
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 17
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 15
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 15
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 238000011160 research Methods 0.000 description 15
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 14
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 14
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 14
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 14
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 14
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 13
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 13
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 13
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 11
- 201000005992 juvenile myelomonocytic leukemia Diseases 0.000 description 11
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 11
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 11
- -1 Beracilline Chemical compound 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 9
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 9
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 9
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 8
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 8
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 8
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 8
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 7
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 7
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 7
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 7
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 230000029052 metamorphosis Effects 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 210000004493 neutrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 6
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 6
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 6
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 5
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 5
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 5
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 5
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 5
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 5
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 5
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 5
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 5
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Natural products CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 5
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 4
- 206010062717 Increased upper airway secretion Diseases 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 108010000123 Myelin-Oligodendrocyte Glycoprotein Proteins 0.000 description 4
- 102000002233 Myelin-Oligodendrocyte Glycoprotein Human genes 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000036428 airway hyperreactivity Effects 0.000 description 4
- 208000037883 airway inflammation Diseases 0.000 description 4
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 4
- 210000003725 endotheliocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 4
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 208000026435 phlegm Diseases 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 description 4
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 3
- 108010020195 FLAG peptide Proteins 0.000 description 3
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- 102000051628 Interleukin-1 receptor antagonist Human genes 0.000 description 3
- 108700021006 Interleukin-1 receptor antagonist Proteins 0.000 description 3
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 3
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 3
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 3
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 210000000497 foam cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 3
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229940000351 hemocyte Drugs 0.000 description 3
- 210000001357 hemopoietic progenitor cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 3
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 3
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 3
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710153593 Albumin A Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 2
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 2
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 2
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 2
- 208000028387 Felty syndrome Diseases 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- 101710177504 Kit ligand Proteins 0.000 description 2
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 2
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 101000746372 Mus musculus Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 2
- 208000014767 Myeloproliferative disease Diseases 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 206010039361 Sacroiliitis Diseases 0.000 description 2
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100024554 Tetranectin Human genes 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 2
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 2
- 239000003255 cyclooxygenase 2 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002175 goblet cell Anatomy 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 2
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 229940054136 kineret Drugs 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHOGYURTWQBHIL-UHFFFAOYSA-N leflunomide Chemical compound O1N=CC(C(=O)NC=2C=CC(=CC=2)C(F)(F)F)=C1C VHOGYURTWQBHIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940087875 leukine Drugs 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000002500 microbody Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 2
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 108010071584 oxidized low density lipoprotein Proteins 0.000 description 2
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 108010038379 sargramostim Proteins 0.000 description 2
- 102000014452 scavenger receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010078070 scavenger receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 2
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 2
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 108010013645 tetranectin Proteins 0.000 description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- UDQZPEAGXXTEAV-BYPYZUCNSA-N (2s)-2-(ethylamino)-3-hydroxypropanoic acid Chemical class CCN[C@@H](CO)C(O)=O UDQZPEAGXXTEAV-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- HMLGSIZOMSVISS-ONJSNURVSA-N (7r)-7-[[(2z)-2-(2-amino-1,3-thiazol-4-yl)-2-(2,2-dimethylpropanoyloxymethoxyimino)acetyl]amino]-3-ethenyl-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(C=C)CSC21)C(O)=O)=O)C(=O)\C(=N/OCOC(=O)C(C)(C)C)C1=CSC(N)=N1 HMLGSIZOMSVISS-ONJSNURVSA-N 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 3-Methylhistidine Natural products CN1C=NC(CC(N)C(O)=O)=C1 BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical group OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- JAJIPIAHCFBEPI-UHFFFAOYSA-N 9,10-dioxoanthracene-1-sulfonic acid Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=C1C=CC=C2S(=O)(=O)O JAJIPIAHCFBEPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010022579 ATP dependent 26S protease Proteins 0.000 description 1
- 108010066676 Abrin Proteins 0.000 description 1
- 101100230376 Acetivibrio thermocellus (strain ATCC 27405 / DSM 1237 / JCM 9322 / NBRC 103400 / NCIMB 10682 / NRRL B-4536 / VPI 7372) celI gene Proteins 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 206010003162 Arterial injury Diseases 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 241000219108 Bryonia dioica Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100338243 Caenorhabditis elegans hil-6 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 241001391944 Commicarpus scandens Species 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 108060002063 Cyclotide Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101150082070 Dab gene Proteins 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 206010061819 Disease recurrence Diseases 0.000 description 1
- 206010013971 Dyspnoea exertional Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 1
- 206010014950 Eosinophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000031637 Erythroblastic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000036566 Erythroleukaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 244000287680 Garcinia dulcis Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010054017 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101710108699 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 102100028113 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 102100020881 Interleukin-1 alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 108010082786 Interleukin-1alpha Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- UETNIIAIRMUTSM-UHFFFAOYSA-N Jacareubin Natural products CC1(C)OC2=CC3Oc4c(O)c(O)ccc4C(=O)C3C(=C2C=C1)O UETNIIAIRMUTSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000019298 Lipocalin Human genes 0.000 description 1
- 108050006654 Lipocalin Proteins 0.000 description 1
- 108010051335 Lipocalin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000013519 Lipocalin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010058398 Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 1
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000037039 Monarthritis Diseases 0.000 description 1
- 101001033276 Mus musculus Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N N(pros)-methyl-L-histidine Chemical compound CN1C=NC=C1C[C@H](N)C(O)=O JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N N-acetyl-L-methionine Chemical group CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001028048 Nicola Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 240000007643 Phytolacca americana Species 0.000 description 1
- 235000009074 Phytolacca americana Nutrition 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 101000762949 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Exotoxin A Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000271569 Rhea Species 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 108010005173 SERPIN-B5 Proteins 0.000 description 1
- 108010084592 Saporins Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102100030859 Tissue factor Human genes 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 102000002070 Transferrins Human genes 0.000 description 1
- 108010015865 Transferrins Proteins 0.000 description 1
- 102000018594 Tumour necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007852 Tumour necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 108010057266 Type A Botulinum Toxins Proteins 0.000 description 1
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003697 abatacept Drugs 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 150000008065 acid anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 208000021841 acute erythroid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229960004238 anakinra Drugs 0.000 description 1
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 230000003356 anti-rheumatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000003430 antimalarial agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003435 antirheumatic agent Substances 0.000 description 1
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229940059756 arava Drugs 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N azathioprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC=NC2=C1NC=N2 LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000012740 beta Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010079452 beta Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000002876 beta blocker Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- VQLYBLABXAHUDN-UHFFFAOYSA-N bis(4-fluorophenyl)-methyl-(1,2,4-triazol-1-ylmethyl)silane;methyl n-(1h-benzimidazol-2-yl)carbamate Chemical compound C1=CC=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=C1.C=1C=C(F)C=CC=1[Si](C=1C=CC(F)=CC=1)(C)CN1C=NC=N1 VQLYBLABXAHUDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 229940124630 bronchodilator Drugs 0.000 description 1
- 108010049223 bryodin Proteins 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000590 celecoxib Drugs 0.000 description 1
- RZEKVGVHFLEQIL-UHFFFAOYSA-N celecoxib Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C1=CC(C(F)(F)F)=NN1C1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 RZEKVGVHFLEQIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 101150071577 chi2 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 229940111134 coxibs Drugs 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- DCOPUUMXTXDBNB-UHFFFAOYSA-N diclofenac Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1NC1=C(Cl)C=CC=C1Cl DCOPUUMXTXDBNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001259 diclofenac Drugs 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 229940073621 enbrel Drugs 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000010502 episomal replication Effects 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- 210000002360 granulocyte-macrophage progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 230000002607 hemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 1
- 229940048921 humira Drugs 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 229940073062 imuran Drugs 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002505 iron Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000990 laser dye Substances 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 229960000681 leflunomide Drugs 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- NZWOPGCLSHLLPA-UHFFFAOYSA-N methacholine Chemical compound C[N+](C)(C)CC(C)OC(C)=O NZWOPGCLSHLLPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002329 methacholine Drugs 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 108010077055 methylated bovine serum albumin Proteins 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002969 morbid Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 208000004235 neutropenia Diseases 0.000 description 1
- 239000000041 non-steroidal anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229940035567 orencia Drugs 0.000 description 1
- 230000001009 osteoporotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000003909 pattern recognition Methods 0.000 description 1
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000010773 plant oil Substances 0.000 description 1
- 239000011505 plaster Substances 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 1
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 229940079889 pyrrolidonecarboxylic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940116176 remicade Drugs 0.000 description 1
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 239000013037 reversible inhibitor Substances 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011808 rodent model Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000011125 single therapy Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001940 sulfasalazine Drugs 0.000 description 1
- NCEXYHBECQHGNR-QZQOTICOSA-N sulfasalazine Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(\N=N\C=2C=CC(=CC=2)S(=O)(=O)NC=2N=CC=CC=2)=C1 NCEXYHBECQHGNR-QZQOTICOSA-N 0.000 description 1
- NCEXYHBECQHGNR-UHFFFAOYSA-N sulfasalazine Natural products C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(N=NC=2C=CC(=CC=2)S(=O)(=O)NC=2N=CC=CC=2)=C1 NCEXYHBECQHGNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001258 synovial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012049 topical pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/14—Antitussive agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体(GM-CSFR)的α链的结合元件,尤其抗体分子。本发明还公开了所述结合元件在治疗如风湿性关节炎、哮喘、过敏反应、多发性硬化、髓系白血病和动脉硬化的炎性和自体免疫疾病中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子受体α链(GM-CSFRα)的结合元件、尤其涉及抗-GMCSFRα抗体分子。本发明还涉及这些结合元件在治疗GMCSFRα介导的包括风湿性关节炎、慢性阻塞性肺疾病和多发性硬化的炎性、呼吸和自体免疫疾病中的应用。
背景技术
GM-CSF为I型促炎细胞因子,其增强包括嗜中性粒细胞、嗜酸性细胞、巨噬细胞及其祖细胞的大范围造血细胞类型的存活、增殖和/或分化。GM-CSF受体为造血因子(haematopoietin)受体超家族的成员。它是异二聚体,由α和β亚基组成。α亚基为GM-CSF高度特异性的,而β亚基为包括IL3和IL5的其它细胞因子受体所共有。β受体亚基的较广泛的组织分布反映了这点。α亚基(GM-CSFRα)主要在脊髓细胞和非造血细胞(如嗜中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性细胞、树突细胞、内皮细胞和呼吸上皮细胞)上表达。全长GM-CSFRα为400氨基酸的I型膜糖蛋白,其属于I型细胞因子受体家族,并且包括22个氨基酸的信号肽(1-22位置)、298个氨基酸的细胞外域(23-320位置)、321-345位的跨膜域和55个氨基酸的短的细胞内域。信号肽被切除以产生作为378个氨基酸蛋白的GM-CSFRα的成熟形式。人和鼠的GM-CSFRα的cDNA克隆是可获得的,并且在蛋白质水平上其受体亚基具有36%一致性。GM-CSFR能够以相对低的亲和力结合单独的α亚基(Kd1~5nM),但完全不与单独的β亚基结合。然而,α和β亚基的同时存在产生高亲和性配体-受体复合物(Kd≈100pM)。通过GM-CSF最初结合GM-CSFRα链、然后交联较大亚基(共用β链)以产生高亲和相互作用而产生GM-CSF信号发生,其磷酸化JAT-STAT途径。在参考文献[1]中论述了GM-CSFR与GMCSF的结合。这种相互作用也能够通过酪氨酸磷酸化和MAP激酶途径的激活而发生信号。
从病理学来说,GM-CSF已显示在加重炎性、呼吸和自体免疫疾病方面起作用。因而,对GM-CSF与GM-CSFRα结合的中和作用成为治疗GM-CSFR介导的疾病和状态的治疗途径。
Nicola等[2]描述了抗人GM-CSFRα的鼠抗体,命名为2B7-17-A或“2B7”,据报道其具有相对高的对人GM-CSFRα的亲和性、并且在多个不同的生物试验中是人GM-CSF生物活性的有效抑制因子。抗体2B7可从Chemicon以MAB1037的名称购得,且MAB1037的产品数据页注明其为GM-CSF生物活性的有效抑制因子。2B7也在WO94/09149中公开。
发明内容
通过利用天然scFv噬菌体库的选择、无规突变诱变和适当设计的生化和生物分析(参见以下试验部分)的组合,我们已鉴定了结合人GM-CSFRα、并且抑制人GM-CSF在其受体上的作用的高效抗体分子。此处给出的结果说明与已知抗-GM-CSFRα抗体2B7相比,我们的抗体结合GM-CSFRα的不同区或表位,并且令人惊奇的是,在各种生物试验中证明甚至比2B7更有效。
因此,本发明涉及结合人GM-CSFRα、并且抑制人GM-CSF与GM-CSFRα的结合的结合元件。本发明的结合元件可能为GM-CSFR的拮抗剂。所述结合元件可能是通过GM-CSFR的GM-CSF信号转导的竞争性可逆抑制剂。
本发明的抗体和其它结合元件在结合和中和GM-CSFRα方面是特别有意义的,因此,如此处包含的实验研究和其它支持技术文献所表明的,其在治疗GM-CSFRα介导的包括炎症和自体免疫疾病的疾病方面是有用的。例如,我们已在基于细胞的试验中证实,本发明的抗体能够抑制由天然GM-CSF结合其受体所诱导的细胞因子(如IL-6和TNFα)的释放。如以下更详细地解释的,通过阻断与GM-CSFRα的结合抑制GM-CSF活性是一种治疗如风湿性关节炎(RA)、哮喘、吸烟诱导的气道炎症、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、过敏反应、多发性硬化(MS)、髓系白血病或动脉硬化的疾病的治疗途径。
根据本发明的结合元件通常结合GM-CSFRα的细胞外域。优选地,本发明的结合元件结合位于成熟人GM-CSFRα(SEQ ID No:206)的226~230位的Tyr-Leu-Asp-Phe-Gln(YLDFQ)(SEQ ID NO:201)中至少一个残基。所述结合元件可以结合人GM-CSFRα的YLDFQ序列中的至少一个残基,例如其可以结合YLDFQ序列中的一个、两个、三个或四个残基。因此,所述结合元件可以识别该序列中的一个或多个残基,并且任选地,其也可以结合GM-CSFRα细胞外域中的附加侧翼残基或结构相邻的残基。
可以通过任何适当的方法确定结合,例如,可以使用如本发明其它部分所详细描述的肽结合扫描,如基于PEPSCAN的酶链免疫试验(ELISA)。在如PEPSCAN***提供的种类的肽结合扫描中,源自抗原的短重叠肽被***地针对其与结合元件的结合进行筛选。所述肽可以共价地连接于载体表面,以形成肽阵列。简言之,肽结合扫描(如“PEPSCAN”)包括鉴定(如使用ELISA)结合元件与其结合的一组肽,其中所述肽具有SEQ ID NO:206的片段(如约15个SEQ ID NO:206的连续残基的肽)所相应的氨基酸序列,以及定位(aligning)所述肽以确定结合元件结合的残基的足迹,其中所述足迹包括与重叠肽共用的残基。根据本发明,通过肽结合扫描或PEPSCAN鉴定的足迹可能包括相应于SEQ ID NO:206的226~230位的YLDFQ的至少一个残基。所述足迹可以包括YLDFQ的一个、两个、三个、四个或所有残基。如通过此处描述的肽结合扫描或PEPSCAN方法所确定的,根据本发明的结合元件可以结合包括一个或多个、优选全部相应于SEQID NO:206的226~230位的YLDFQ残基的SEQ ID NO:206的肽片段(如15个残基)。因此本发明的结合元件可以结合具有SEQ IDNO:206的15个连续残基的氨基酸序列的肽,其中所述15个残基序列包括SEQ ID NO:206的226~230位的YLDFQ中的至少一个残基、或者至少与YLDFQ部分重叠。在本说明书的其它部分详细描述了用于确定结合的肽结合扫描方法的细节。本领域中公知的、并且可以用于确定抗体结合的残基和/或确认肽结合扫描(如PEPSCAN)结果的其它方法包括定点突变、氢氘交换、质谱、NMR和X射线结晶学。
因此,本发明的结合元件优选地中和GM-CSFRα。中和意味着降低或抑制GM-CSFRα的生物活性,如通过GM-CSFRα介导的反应进行测量显示GM-CSF与GM-CSFRα的结合、或者通过GM-CSFRα的信号转导的减少或抑制。生物学活性的降低或抑制可以是部分的或者全部的。抗体中和GM-CSFRα的程度被称作其中和效力。所述效力可以使用一种或多种本领域普通技术人员已知的、和/或如此处所描述或引用的试验进行判断或测量。例如,结合元件可以在一个或多个以下试验中具有中和活性:
●生化配体结合试验
●TF-1增殖试验
●人粒细胞形态改变试验
●猕猴非人灵长类粒细胞形态改变试验
●单核细胞TNFα释放试验
●粒细胞存活试验
●集落形成试验(GM-CSF介导的血细胞祖细胞体外分化的抑制)
●体内(如具有表达人GM-CSFR的转基因骨髓的嵌合小鼠)GM-CSF生物活性的抑制
●外周血单核细胞细胞因子释放试验
除非另有说明,所述效力通常表示为以pM为单位的IC50值。在功能试验中,IC50为生物反应降低其最大值的50%的浓度。在配体结合研究中,IC50为受体结合降低最大特异结合水平的50%的浓度。通过绘制%最大生物反应(如在增殖试验中以细胞增殖表示,细胞增殖可以通过以cpm计的3H胸腺嘧啶掺入量测量;在形态改变试验中以形态变化表示;在TNFα释放试验中以TNFα释放表示;在存活试验中以存活率表示;在集落形成试验中以集落的数目表示;或者在生物活性测试中以具有表达人GM-CSFR的转基因骨髓的嵌合小鼠的脾重量增加或循环单核细胞的减少表示)或作为结合元件浓度的对数函数的%特异性受体结合图,并且使用如Prism(GraphPad)的软件程序将∑函数与产生IC50值的数据匹配,从而可以计算IC50。
IC50值可以表示多个测量的平均数。因此,例如,可以由三重试验的结果获得IC50值,并且然后可以计算平均IC50值。
在TF-1增殖试验中,本发明的结合元件通常具有不到1500pM的IC50。例如,IC50可以<300、<60、<10或<1.5pM,如约1.0pM。通常地,IC50为至少0.5或1.0nM。已知的鼠抗体2B7在该试验中具有约1600pM的IC50。此处使用的TF-1增殖试验使用7pM的人GM-CSF终浓度。因此,TF-1增殖试验中的IC50中和效力代表结合元件抑制由7pM人GM-CSF诱导的TF-1细胞增殖的能力。更详细的内容参见试验方法和材料部分。
本发明的结合元件在TF-1增殖试验中具有比-6、-7、-8、-9、-10、-10.5或-11更低的pA2。例如,pA2可以为约-10.5或-11。在试验方法和材料的试验部分详细讨论pA2值的计算和含义。
在人粒细胞形态改变试验中,本发明的结合元件通常具有不到100pM的IC50,如不到50pM或不到30、25、20、15或10pM的IC50。通常地,IC50至少为5、6或7pM。作为对照的已知鼠抗体2B7在该试验中具有477pM的IC50测量值的较低效力。此处使用的人粒细胞形态改变试验使用7pM人GM-CSF的终浓度。因此,人粒细胞形态改变试验中的IC50中和效力代表结合元件抑制由7pM人GM-CSF诱导的人粒细胞形态改变的能力。更多的细节参见试验方法和材料部分。
在猕猴粒细胞形态改变试验中,本发明的结合元件通常具有不到20pM的IC50,典型地不到10、5或2.5pM的IC50。IC50可以至少为0.5、1或1.5pM。已知的鼠抗体2B7在该试验中测试时具有26pM的IC50。此处使用的猕猴粒细胞形态改变试验具有7pM人GM-CSF终浓度。因此,猕猴粒细胞形态改变试验中的IC50中和效力代表结合元件抑制由7pM人GM-CSF诱导的猕猴粒细胞形态改变的能力。更详细的内容参见试验方法和材料部分。
本发明的结合元件在人和/或猕猴形态改变试验中具有比-6、-7、-8、-9、-10、-10.5或-11更低的pA2。优选地,pA2为约-10或-11。
在单核细胞TNFα释放试验中,本发明的结合元件通常具有不到150pM的IC50,典型地不到110pM,如不到100pM。IC50可以至少为30或40pM。此处使用的单核细胞TNFα释放试验具有1nM人GM-CSF终浓度。因此,单核细胞TNFα释放试验中的IC50中和效力代表结合元件抑制由1nM人GM-CSF刺激的人单核细胞TNFα释放的能力。更详细的内容参见试验方法和材料部分。
在粒细胞存活试验中,本发明的结合元件通常具有不到1000pM的IC50,典型地不到850pM的IC50。IC50可以小于500、250、150、100、50、30、20或10pM。IC50可以至少为5pM。在该试验中,已知的鼠抗体2B7直到83nM浓度仍为无活性的。此处使用的粒细胞存活试验具有7pM人GM-CSF终浓度。因此,粒细胞存活试验中的IC50中和效力代表结合元件抑制由7pM人GM-CSF诱导的粒细胞存活的能力。更详细的内容参见试验方法和材料部分。
在集落形成试验中,本发明的结合元件可能具有不到5、不到2.5、不到1或不到0.3μg/ml的IC50。优选地,IC50为0.25μg/ml或更低,如不到0.1μg/ml。IC50可以至少为0.05μg/ml。在该试验中,已知鼠抗体2B7直到10μg/ml(67nM)仍具有很低的活性(如果有的话)。此处使用的集落形成试验使用10ng/ml人GM-CSF终浓度。因此,集落形成试验中的IC50中和效力代表结合元件抑制由10ng/ml人GM-CSF诱导的集落形成的能力。更详细的内容参见试验方法和材料部分。
本发明的结合元件可以显示出剂量依赖性地抑制具有表达人GM-CSFR的转基因骨髓的嵌合鼠用人GM-CSF处理后的脾重量增加和/或抑制GM-CSF诱导的循环单核细胞降低的能力。抑制脾重量增加的IC50可以不到5、不到2.5、不到2、不到1或不到0.75mg/kg。在一些实施方式中IC50可以至少为0.5mg/kg。
此外,结合元件对人GM-CSFRα的结合动力学和亲和性可以通过表面等离子共振(如使用BIAcore)测定。本发明的结合元件通常具有不到5nM、更优选地不到4、3、2或1nM的KD。优选地,KD为不到0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.15nM。
除人GM-CSFRα外,本发明的结合元件通常结合如猕猴GM-CSFRα的非人灵长类GM-CSFRα。因为人和鼠GM-CSF受体之间具有低同源性(约36%),因此,本发明的结合元件一般不与鼠受体结合或发生交叉反应。
如以下更详细说明的,通常地,本发明的结合元件包括如完整抗体或抗体片段的抗体分子。优选地,本发明的抗体分子为人抗体分子。
本发明的结合元件通常包括抗体VH和VL域。结合元件的VH域和VL域也作为本发明的一部分被提供。互补决定区(“CDR”)和框架区(“FR”)在各个VH和VL域内。VH域包括一组HCDR,且VL域包括一组LCDR。抗体分子典型地包括包含VH CDR1、CDR2和CDR3及框架的抗体VH域。其可以替代地或同时包括含VL CDR1、CDR2和CDR3及框架的抗体VL域。VH或VL域框架包括以下结构的用CDR间隔的四个框架区FR1、FR2、FR3和FR4:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
根据本发明的抗体VH和VL域、FR和CDR的例子列于形成本公开内容的一部分的附加序列表中。所有此处公开的VH和VL序列、CDR序列、CDR组和HCDR组及LCDR组代表本发明的多个方面和实施方式。因此,本发明的一方面为根据本发明的结合元件的VH域。“CDR组”包括CDR1、CDR2和CDR3。因此,HCDR组意味着HCDR1、HCDR2和HCDR3,LCDR组意味着LCDR1、LCDR2和LCDR3。除非另有说明,“CDR组”包括HCDR和LCDR。本发明的结合元件典型地为单克隆抗体(mAb)。
如试验部分更详细地描述的,我们鉴定了结合GM-CSFRα的抗体分子的组(panel)。我们也鉴定了VH和VL域的互补决定区(CDR)中对于受体结合和中和效力尤其重要的特定残基。因为CDR主要负责决定结合元件的结合和特异性,所以如本发明其它处详细内容所述,一个或多个具有此处限定的适当残基的CDR可以用于或引入任何适当框架(如抗体VH和/或VL域框架)或非抗体蛋白质支架(scaffold)内。例如,一个或多个CDR或抗体的CDR组可以被接合到框架(如人框架)内以提供抗体分子或不同的抗体分子。例如,抗体分子可以包括此处所公开的CDR和人胚系基因片段序列的框架区。抗体在可被胚系化(germlining)的框架内具有CDR组,其中,改变该框架内一个或多个残基以匹配最相似的人胚系框架内的相应位置处的残基。因此,优选抗体框架区为胚系的和/或人的。
按照试验部分阐述的方法,我们进行了对于抗原识别重要的候选抗体残基的研究,然后对在生物试验中显示出比亲本抗体至少高5倍的效力的160个克隆进行了序列分析。结果表明以下位置有助于抗原结合:VL域中的Kabat残基27A、27B、27C、32、51、52、53、90、92和96,以及VH域中的Kabat残基17、34、54,57、95、97、99和100B。在本发明的优选实施方式中,这些Kabat残基中的一个或多个为其序列在附加序列表中公开的编码1、2和4~20的一个或多个抗体克隆在该位置出现的Kabat残基。在各个不同实施方式中,该残基可以与抗体3中该位置出现的残基相同或不同。
我们的分析显示在CDR中对受体结合有特别强的影响的4个残基位置:H97、H100B、L90和L92(Kabat编号)。优选地,VH CDR3的H97为S。在所有160个克隆中都观察到了该位置的丝氨酸残基,因此其表现为抗原识别的重要残基。
优选地,VH CDR3包括一个或多个以下残基:
在Kabat残基H95处的V、N、A或L,最优选V;
在Kabat残基H99处的S、F、H、P、T或W,最优选S;
在Kabat残基H100B处的A、T、P、S、V或H,最优选A或T。
优选地,VH CDR1中的Kabat残基H34为I。优选地VH CDR2包括Kabat残基H54处的E和/或Kabat残基H57处的I。
当结合元件包括抗体VH域时,在VH域框架中的Kabat残基H17优选为S。Kabat残基H94优选地为I或其保守置换(如L、V、A或M)。通常H94为I。
优选地,VL CDR3包括一个或多个以下残基:
在Kabat残基L90处的S、T或M,最优选S或T;
在Kabat残基L92处的D、E、Q、S、M或T,最优选D或E;
在Kabat残基L96处的A、P、S、T、I、L、M或V,最优选S、P、I或V,尤其是S。
在VL CDR3中的Kabat残基L95A优选为S。
优选地,VL CDR1包括一个或多个以下残基:
在Kabat残基27A处的S;
在Kabat残基27B处的N;
在Kabat残基27C处的I;
在Kabat残基32处的D。
优选地,VL CDR2包括一个或多个以下残基:
在Kabat残基51处的N;
在Kabat残基52处的N;
在Kabat残基53处的K。
在优选实施方式中,本发明的结合元件包含一个或多个选自VH和VL CDR的CDR,即,序列表所示抗体1、2或4~20中任一个、或亲本抗体3的VH CDR1、2和/或3和/或VL CDR1、2和/或3。在优选实施方式中,本发明的结合元件包含以下抗体分子中任一的VHCDR3:抗体1(SEQ ID NO 5);抗体2(SEQ ID NO 15);抗体3(SEQID NO 25);抗体4(SEQ ID NO 35);抗体5(SEQ ID NO 45);抗体6(SEQ ID NO 55);抗体7(SEQ ID NO 65);抗体8(SEQ ID NO 75);抗体9(SEQ ID NO 85);抗体10(SEQ ID NO 95);抗体11(SEQ ID NO105);抗体12(SEQ ID NO 115);抗体13(SEQ ID NO 125);抗体14(SEQ ID NO 135);抗体15(SEQ ID NO 145);抗体16(SEQ ID NO155);抗体17(SEQ ID NO 165);抗体18(SEQ ID NO 175);抗体19(SEQ ID NO 185);抗体20(SEQ ID NO 195)。优选地,所述结合元件另外包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:173的VH CDR1和/或SEQ IDNO:4的VH CDR2。优选地,包含SEQ ID NO:175的VH CDR3的结合元件包含SEQ ID NO:173的VH CDR1,但可以替代地包含SEQID NO:3的VH CDR1。
优选地,所述结合元件包括以下抗体之一的一组VH CDR:抗体1(SEQ ID 3~5);抗体2(SEQ ID 13~15);抗体3(SEQ ID 23~25);抗体4(SEQ ID 33~35);抗体5(SEQ ID 43~45);抗体6(SEQ ID 53~55);抗体7(SEQ ID 63~65);抗体8(SEQ ID 73~75);抗体9(SEQ ID83~85);抗体10(SEQ ID 93-95);抗体11(SEQ ID 103~105);抗体12(SEQ ID 113~115);抗体13(SEQ ID 123~125);抗体14(SEQ ID133~135);抗体15(SEQ ID 143~145);抗体16(SEQ ID 153~155);抗体17(SEQ ID 163~165);抗体18(SEQ ID 173~175);抗体19(SEQ ID183~185);抗体20 (SEQ ID 193~95)。任选地,其也可以包括这些抗体之一的一组VL CDR,并且所述VL CDR可以来自与VH CDR相同或不同的抗体。尽管在一些实施方式中,单独的VH或VL域可以被用于结合抗体,但是一般地,VH域与VL域配对以提供抗体抗原结合位点。在本领域中轻链广宿(promiscuity)已被很好确立,因此VH和VL域不必源自如此处所公开的相同的克隆。
结合元件可以包含在公开的H和/或L CDR组内具有一个或多个、例如10个或更少、如1、2、3、4或5个取代的抗体1~20任一的一组H和/或L CDR。优选的取代在VL域中的Kabat残基27A、27B、27C、32、51、52、53、90、92和96以及VH域中的Kabat残基34、54、57、95、97、99和100B以外的Kabat残基处。当在这些位置进行取代时,取代优选为在此处表明为该位置的优选残基的残基取代。
在优选实施方式中,本发明的结合元件为具有包含人源胚系框架(如来自重链VH1或VH3家族的人胚系框架)中的一组HCDR的VH域的分离的人抗体分子。在优选实施方式中,该分离的人抗体分子具有包含人胚系框架VH1 DP5或VH3 DP47中的一组HCDR的VH域。因此,VH域框架区可以包括人胚系基因片段VH1 DP5或VH3 DP47的框架区。VH FR1的氨基酸序列可以为SEQ ID NO:251。VH FR2的氨基酸序列可以为SEQ ID NO:252。VH FR3的氨基酸序列可以为SEQ ID NO:253。VH FR4的氨基酸序列可以为SEQ ID NO:254。
通常地,该结合元件也具有包含优选人胚系框架(如来自轻链Vλ1或Vλ6家族的人胚系框架)中的一组LCDR的VL域。在优选实施方式中,该分离的人抗体分子具有包含人胚系框架Vλ 1 DPL8或Vλ 1DPL3或Vλ6_6a中的一组LCDR的VL域。因此,VL域框架可以包含人胚系基因片段Vλ 1 DPL8、Vλ 1 DPL3或Vλ6_6a的框架区。VL域FR4可以包括人胚系基因片段JL2的框架区。VL FR1的氨基酸序列可以为SEQ ID NO:255。VL FR2的氨基酸序列可以为SEQ ID NO:256。VL FR3的氨基酸序列可以为SEQ ID NO:257。VL FR4的氨基酸序列可以为SEQ ID NO:258。
与胚系化(germlined)抗体相比,非胚系化抗体具有相同的CDR,但具有不同的框架。
本发明的结合元件可以与任何此处公开的任一结合元件(如抗体3或抗体1、2或4~20中任一种)竞争结合GM-CSFRα。因此,结合元件可以与包含抗体1、2或4~20中任一的VH域和VL域的抗体分子竞争结合GM-CSFRα。结合元件之间的竞争可以在体外方便地分析,例如通过将可以在一种或多种其它未标记结合元件存在时被检测的示踪分子(reporter molecular)标记到一种结合元件上,从而使能够鉴别与相同表位或重叠表位结合的结合元件。
可以例如使用ELISA测定竞争,其中如GM-CSFRα的细胞外域或该细胞外域的肽被固定于板上、并且第一标记的结合元件与一种或多种未标记的结合元件一起被加入到板中。通过标记的结合元件发射的信号的降低观察与标记的结合元件竞争的未标记结合元件的存在。类似地,表面等离子共振试验可以被用于测定结合元件之间的竞争。
在竞争检测中,可以使用抗原的肽片段,尤其是包括或主要由表位或目标结合区组成的肽。可以使用具有在任一端加上一个或多个氨基酸的表位或靶序列的肽。可以使得根据本发明的结合元件与抗原的结合被具有或包括给定序列的肽抑制。
例如,结合肽的结合元件可以通过用所述肽筛选(panning)从噬菌体呈现文库中分离。
本发明也提供了上述结合元件在竞争试验中测量抗原水平的应用,也就是说,通过在竞争试验中使用本发明提供的结合元件测量样品中的抗原水平的方法。这可以是不需要对结合的和未结合的抗原进行物理分离的情况。示踪分子与结合元件连接使得结合时发生物理或光学变化,这是一种可能性。示踪分子可以直接或间接产生可检测的、优选可测量的信号。示踪分子的连接可以为直接或间接的、共价(如通过肽键的)或非共价的。通过肽键的连接可以是编码抗体和示踪分子的基因融合进行重组表达的结果。
本发明也提供通过在例如生物传感器***中使用根据本发明的结合元件直接测量抗原水平的方法。
本发明提供一种包括引起或使得此处提供的结合元件与GM-CSFRα结合的方法。这种结合可以在体内发生,例如在施用结合元件或编码结合元件的核酸后,或者其可以在体外发生,例如在ELISA、蛋白质印迹、免疫细胞化学、免疫沉淀、亲和层析或如TF-1试验的基于细胞的试验中。
可以测定结合元件与GM-CSFRα结合的量。定量可能与测试样品中的抗原的量相关,其可能具有诊断或预后的意义。
包含根据本发明的任何方面或实施方式的结合元件或抗体分子的试剂盒也作为本发明的一个方面。在本发明的试剂盒中,结合元件或抗体分子可以被标记以使其在样品中的反应性能够被测定,如下面进一步所述的。试剂盒的组分通常是无菌的,并置于密封小瓶或其它容器内。可以在诊断分析或抗体分子可以使用的其它方法中使用试剂盒。试剂盒可以含有在某一方法(如根据本发明的方法)中使用该组分的说明书。本发明的试剂盒中可以包括参与该方法或使得该方法能够进行的辅助物质。
可以通过任何适当的手段测定样品中抗体的反应性。放射免疫试验(RIA)为一种可能。放射标记的抗原与未标记抗原(测试样品)混合,并且使其结合抗体。结合的抗原与未结合的抗原被物理分离,并且测定与抗体结合的放射抗原的量。测试样品中抗原越多,则越少的放射抗原结合到抗体上。通过使用与示踪分子连接的抗原或类似物,竞争结合试验也可以利用非放射抗原进行。示踪分子可以为具有光谱分离的吸收或发射特征的荧光染料、磷光体或激光染料。适合的荧光染料包括荧光素、罗丹明、藻红蛋白、和德克萨斯红(Texas Red)。适合的显色染料包括二氨基联苯胺。其它示踪物包括大分子胶体颗粒或如有色、磁性或顺磁性的乳胶珠的颗粒物质、以及可以直接或间接产生可以视觉观察、电检测或以其它方式记录的可检测信号的生物或化学活性物质。例如,这些分子可以为催化生色或变色或引起电学性质变化的反应的酶。它们可以是可分子激发的,从而能态之间的电子跃迁导致特征光谱吸收或发射。它们可以包括与生物传感器联合使用的化学体。可以使用生物素/亲和素或生物素/抗生蛋白链菌素和碱性磷酸酶检测***。
由个别的抗体-示踪物偶联物产生的信号可以用于得出样品(正常和测试)中相关抗体结合的可计量的绝对或相对数据。
在本发明的另一方面中,本发明提供了包括编码根据本发明的结合元件、VH域和/或VL域的序列的分离的核酸。该核酸可以包括DNA和/或RNA,并且可以全部或部分合成。如此处所述的核苷酸序列所指包括具有特定序列的DNA分子,并且包括具有其中,除非上下文特别要求外,以U代替T的特定序列的RNA分子。在优选的方面中,本发明提供了编码如此处限定的本发明的CDR或CDR组或VH域或VL域或抗体抗原结合位点或抗体分子(如scFv或IgG1或IgG4)的核酸。本发明也提供包括至少一种上述多核苷酸的质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体。
本发明的再一方面为用本发明的核酸转化的或含有本发明的核酸的宿主细胞。该宿主细胞可以为体外的、并且可以为培养中的。该宿主细胞可以为体内的。所述宿主细胞在体内的存在可以使得本发明的结合元件作为“内抗体”(intrabodies)或细胞内抗体进行细胞内表达。内抗体可以被用于基因治疗。
本发明的再另一方面提供包括将所述核酸引入宿主细胞的方法。引入可以使用任何可用的技术。对于真核细胞,适合的技术可能包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录酶病毒或其它病毒(如牛痘病毒或对于昆虫细胞的杆状病毒)的转导。在宿主细胞、尤其真核细胞中引入核酸可以使用基于病毒或质粒的***。质粒***可以保持为游离基因,或者可以整合到宿主细胞或人工染色体内。整合可以是在单个或多个位点随机或靶向整合一个或多个复本。对于细菌细胞,适合的技术可以包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。
引入后可以引发或使得核酸进行表达,例如通过在该基因表达的条件下培养宿主细胞。
在一个实施方式中,本发明的核酸被整合到宿主细胞的基因组(如染色体)中。可以根据标准技术通过包含促进基因组重组的序列来促进整合。
本发明也提供在表达***中使用上述构建体以表达上述结合元件或多肽的方法。因此,制备本发明的结合元件、VH域和/或VL域的方法为本发明的再一方面。方法可以包括在导致所述结合元件、VH域和/或VL域产生的条件下表达所述核酸、并进行回收。该方法可以包括在产生所述结合元件或抗体域的条件下培养宿主细胞。
制备方法可以包括分离和/或纯化产物的步骤。制备方法可以包括将产品配制为包括如药学可接受的赋形剂的至少一种附加组分的组合物。
在各种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的***是公知的。适合的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、酵母和杆状病毒***以及转基因植物和动物。抗体和抗体片段在原核细胞中的表达已在本领域中被很好地建立[3]。通用的优选细菌宿主为大肠杆菌(E.coli)。
在培养的真核细胞进行表达也可被本领域普通技术人员用作产生结合元件的可选方案[4、5、6]。本领域中可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、HeLa细胞、幼地鼠肾细胞、NS0小鼠黑色素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人胚肾细胞、人胚视网膜细胞以及许多其它细胞。
适合的载体可以经选择或构建为包含适当的调控序列,包括启动子序列、终止子序列、多聚腺苷酸序列、增强子序列、标记基因和其它适当的序列。载体可以为适当的质粒(如噬粒)或病毒(如噬菌体)[7]。例如,Ausubel等[8]详细描述了在例如核酸构建体制备、基因诱变、测序、DNA引入细胞和基因表达、以及蛋白质分析中的许多核酸操作的已知技术和方案。
本发明提供了获得一个或多个能够结合抗原的结合元件的方法,该方法包括使根据本发明的结合元件的库与所述抗原接触,以及选择所述库中一个或多个能够结合所述抗原的结合元件。
所述库可以在颗粒或分子复合物,例如可复制的遗传包(geneticpackage)(如酵母、细菌或如T7噬菌体颗粒)上呈现,或在共价的、核糖体或其它体外呈现***上呈现,各个颗粒或分子复合物包含编码在其上呈现的抗体VH可变域的核酸,并且任选地也包含呈现的VL域(如果存在)。在选择能够结合抗原并且在噬菌体或其它文库颗粒或者分子复合物上呈现的结合元件后,可以从呈现所述挑选的结合元件的噬菌体或其它颗粒或分子复合物获取核酸。这种核酸可以通过表达具有从呈现所述挑选的结合元件的噬菌体或其它颗粒或分子复合物获取的核酸序列的核酸而被用于随后的结合元件或抗体VH或VL可变域的制备。
具有所述选择的结合元件的抗体VH可变域氨基酸序列的抗体VH可变域可以以独立形式产生,也可以是包含该VH域的结合元件的形式。
具有所述选择的结合元件的抗体VL可变域氨基酸序列的抗体VL可变域可以以独立形式产生,也可以是包含该VL域的结合元件的形式。
结合GM-CSFRα的能力可以进一步测试,与抗体1~20(如scFv形式和/或IgG形式,如IgG1或IgG4)中任一竞争结合GM-CSFRα的能力也可以被进一步测试。中和GM-CSFRα的能力可以被测试。
包括具有此处所列氨基酸序列的本发明的VH和VL域以及CDR的突变体可以通过序列变换或突变以及筛选的方法获得,且可以用于GM-CSFRα的结合元件中。随着在多变量数据分析技术应用于结构/特性-活性关系中计算机化学的引导[9],可以使用如统计回归、模式识别和分类的公知数学技术推导抗体的定量活性-性质关系[10、11、12、13、14、15]。可以从抗体序列、功能和三维结构的经验和理论模型(例如,可能的接触残基或计算的理化性质的分析)推知抗体的性质,并且这些性质可以被单独或组合地考虑。
包括VH域和VL域的抗体抗原结合位点由六个多肽环形成:三个来自轻链可变域(VL)、三个来自重链可变域(VH)。已知原子结构的抗体的分析已经阐明了序列和抗体结合部位的三维结构之间的关系[16、17]。这些关系暗示,除了VH域的第三区(环)之外,结合位点环具有少数主链构象之一:正则结构。在特定环内形成的正则结构已表明是通过其大小和特定残基在环和框架区两者内的关键位点处的存在来确定[16、17]。
该序列-结构关系的研究可以被用于预测已知序列、但未知三维结构的抗体中那些对于维持其CDR环的三维结构重要的、进而维持结合的残基。这些预测可以得到所述预测与先导物优化试验的结果之间的对比的支持。在结构方法中,可以使用任何免费获得或者市售的包(如WAM)[19]建立抗体分子模型[18]。然后,可以使用如Insight II(Accelerys,Inc.)或Deep View[20]的蛋白可视化和分析软件包估计CDR中各个位置可能的取代。然后,该信息可以被用于进行很可能对活性有最小或有益影响的取代。
进行CDR、抗体VH或VL域以及结合元件的氨基酸序列中的取代所需的技术通常是可在本领域获得的。变异体序列可以利用可能或不能被预测对活性有最小的或有益的影响的取代产生,并且可以对其结合和/或中和GM-CSFRα的能力和/或任何其它所需性质进行测试。
如上所述,根据本发明,可以使用其序列在此处特别公开的任何VH和VL域的可变域氨基酸序列变异体。特定变异体可以包括一个或多个氨基酸序列变换(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或***),可以为少于约20个变换、少于约15个变换、少于约10个变换或少于约5个变换,可能是5、4、3、2或1个。可以在各个或多个框架区和/或一个或多个CDR中进行变换。
优选地,变换不导致功能丧失,从而包含这样变换的氨基酸序列的结合元件优选地保留结合和/或中和GM-CSFRα的能力。更优选地,例如,如此处所述试验中所测得的,其保留与其中未进行变换的结合元件一样的定量结合和/或中和能力。最优选地,例如,如此处所述试验中所测得的,与其中未进行变换的结合元件相比,包含这样变换的氨基酸序列的结合元件具有改善的结合或中和GM-CSFRα的能力。
变换可以包括用非天然形成的或非标准的氨基酸替代一个或多个氨基酸残基、将一个或多个氨基酸残基修饰为非天然形成或非标准的形式、或者在序列中***一个或多个非天然形成或非标准的氨基酸。本发明的序列中变换的优选数目和位置在其它处进行描述。天然形成的氨基酸包括由其标准单字母编码标明为G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E的20种“标准”L氨基酸。非标准氨基酸包括可以被整合到多肽骨架之中或由修饰已存在的氨基酸残基所得的任何其它残基。非标准氨基酸可为天然形成的或非天然形成的。几种天然形成的非标准氨基酸在本领域中是已知的,如4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、3-甲基组氨酸、N-乙基丝氨酸等[21]。那些在其N-α位置处衍生的氨基酸残基仅位于氨基酸序列的N末端。一般地,在本发明中,氨基酸为L氨基酸,但是在一些实施方式中,其可以为D-氨基酸。因而,变换可以包括将L-氨基酸改变为D-氨基酸、或用D-氨基酸取代L-氨基酸。氨基酸的甲基化、乙酰化和/或磷酸化形式也是已知的,并且在本发明中的氨基酸可以进行这样的修饰。
本发明的抗体域和结合元件中的氨基酸序列可以包括上述非天然或非标准氨基酸。在一些实施方式中,非标准氨基酸(如D-氨基酸)可以在合成过程中并入氨基酸序列中,而在其它实施方式中,可以在氨基酸序列合成后通过修饰或取代“原始”标准氨基酸引入非标准氨基酸。
非标准和/或非天然形成的氨基酸的使用增加结构和功能多样性,并且,因此能够增加实现本发明的结合元件所需的GM-CSFRα结合和中和性质的可能。此外,由于在给予动物后具L-氨基酸的多肽的体内降解,与标准L-氨基酸相比,D-氨基酸和类似物已显示具有更好的药物动力学性质。
如上所述,基本如此处所述的CDR氨基酸序列优选地作为CDR被负载在人抗体可变域或其主要部分中。基本如此处所述的HCDR3序列代表本发明的优选实施方式,并且优选其中各个作为HCDR3被负载在人重链可变域或其主要部分中。
本发明中使用的可变域可以从任何胚系或重排的人可变域获得或来源于此,或者可以为基于已知人可变域的通用或真实序列的合成可变域。使用重组DNA技术,本发明的CDR序列(如CDR3)可以被引入缺少CDR(如CDR3)的可变域的组成集合(repertoire)中。
例如,Marks等(1992)[22]描述了产生抗体可变域组成集合的方法,其中定位于可变域区的5’末端处或与其邻近的通用引物与人VH基因的第三框架区的通用引物联合使用,从而提供缺少CDR3的VH可变域的组成集合。Marks等进一步描述了该组成集合如何能与特定抗体的CDR3组合。使用类似技术,本发明的CDR3源序列可以与缺少CDR3的VH或VL域组成集合混合,并且该混合的完整VH或VL域与同源VL或VH域组合,从而提供本发明的结合元件。然后,该组成集合可以在如WO92/01047中的噬菌体呈现***或后面的参考文献的大部分(包括参考文献[23])中的任一种的合适的宿主***中呈现,从而可以选择适当的结合元件。组成集合可以由来自104以上个体成员(例如106至108或1010中成员)的任何部分组成。其它适合的宿主***包括酵母呈现、细菌呈现、T7呈现、病毒呈现、细胞呈现、核糖体呈现和共价呈现。类似的混合或组合技术也被Stemmer(1994)[24]公开,其除观察该技术可以被用于抗体的产生外,还描述了与β-内酰胺酶基因相关的技术。
进一步的替代方式为利用一个或多个选择的VH和/或VL基因的随机突变以在全可变域中产生突变,从而产生携带本发明的CDR源序列的新VH或VL区域。Gram等(1992)[25]描述了这种技术,其使用了易错PCR(error-prone PCR)。在优选实施方式中,在一组HCDR和/或LCDR内进行一个或两个氨基酸取代。另一可使用的方法是对VH或VL基因的CDR区域的引导基因突变。
本发明的再一方面提供了获得GM-CSFRα抗原的抗体抗原结合位点的方法,该方法包括通过在此处所述的VH域氨基酸序列中一个或多个氨基酸的添加、缺失、取代或***从而提供作为VH域的氨基酸序列变异体的VH域,任选地将如此获得的VH域与一种或多种VL域结合,以及测试VH域或VH/VL的组合或多个组合以鉴别任选地具有一种或多种优选性质(优选中和GM-CSFRα活性的能力)的GM-CSFRα抗原的结合元件或抗体抗原结合位点。所述VL域可具有基本为如此处所述的氨基酸序列。
可以使用其中一个或多个此处公开的VL域的序列变异体与一个或多个VH域组合的类似方法。
本发明的再一方面提供了制备GM-CSFRα抗原结合元件的方法,该方法包括:
(a)提供对包括待取代的CDR3或缺少CDR3编码区的VH域进行编码的核酸的起始组成集合;
(b)组合所述组成集合和编码基本如此处所述的VH CDR3氨基酸序列的供体核酸,从而所述供体核酸被***所述组成集合的CDR3区以提供编码VH域的核酸的产物组成集合;
(c)表达具有所述产物组成集合的核酸;
(d)选择GM-CSFRα结合元件;以及
(e)回收所述结合元件或编码所述结合元件的核酸。
同样,可以使用其中本发明的VL CDR3与编码包括待取代CDR3或缺少CDR3编码区的VL域的核酸组合的类似方法。
类似地,一种或多种、或者所有三种CDR可以被接合到随后被用于筛选GM-CSFRα的结合元件或多种结合元件的VH或VL域的组成集合中。
在优选实施方式中,可以使用一种或多种HCDR1、HCDR2和HCDR3,如抗体1(SEQ ID NOS:3~5);抗体2(SEQ ID NOS:13~15);抗体4(SEQ ID NOS:33~35);抗体5(SEQ ID NOS:43~45);抗体6(SEQ ID NOS:53~55);抗体7(SEQ ID NOS:63~65);抗体8(SEQ IDNOS:73~75);抗体9(SEQ ID NOS:83~85);抗体10(SEQ ID NOS:93~95);抗体11(SEQ ID NOS:103~105);抗体12(SEQ ID NOS:113~115);抗体13(SEQ ID NOS:123~125);抗体14(SEQ ID NOS:133~135);抗体15(SEQ ID NOS:143~145);抗体16(SEQ ID NOS:153~155);抗体17(SEQ ID NOS:163~165);抗体18(SEQ ID NOS:173~175);抗体19(SEQ ID NOS:183~185)或抗体20(SEQ ID NOS:193~195);或者任选地抗体3(SEQ ID NOS:23~25)的一组HCDR,和/或可以使用一种或多种LCD R1、LCDR2和LCDR3,如抗体1(SEQID NOS:8~10);抗体2(SEQ ID NOS:18~20);抗体4(SEQ ID NOS:38~40);抗体5(SEQ ID NOS:48~50);抗体6(SEQ ID NOS:58~60);抗体7(SEQ ID NOS:68~70);抗体8(SEQ ID NOS:78~80);抗体9(SEQ ID NOS:88~90);抗体10(SEQ ID NOS:98~100);抗体11(SEQ ID NOS:108~110);抗体12(SEQ ID NOS:118~120);抗体13(SEQ ID NOS:128~130);抗体14(SEQ ID NOS:138~140);抗体15(SEQ ID NOS:148~150);抗体16(SEQ ID NOS:158~160);抗体17(SEQ ID NOS:168~170);抗体18(SEQ ID NOS:178~180);抗体19(SEQ ID NOS:188~190)或抗体20(SEQ ID NOS:198~200);或者任选地抗体3(SEQ ID NOS:28~30)的一组LCDR。
免疫球蛋白可变域的主要部分包括至少三个CDR区以及其居间框架区。优选地,所述部分也包括至少约50%的第一和第四框架区之一或两者,该50%为第一框架区的C-末端50%和第四框架区的N-末端50%。可变域主要部分的N-末端或C-末端的附加残基可以为那些通常不与天然形成的可变域区相关的残基。例如,通过重组DNA技术进行本发明结合元件的构建可以导致引入由促进克隆或其它操作步骤的连接子所编码的N-或C-末端残基。其它操控步骤包括引入连接子以连接本发明的可变域和另外的蛋白序列,其包括抗体恒定区、其它可变域(例如在双体(diabody)的制备中)或如本发明的其它处的更详细内容所述的可检测的/功能性的标记。
尽管在本发明的优选方面中,优选的是包括一对VH和VL域的结合元件,但是基于VH或VL域序列的单结合域形成本发明的另一方面。已知单免疫球蛋白域、尤其VH域能够结合靶抗原。例如,参见本发明其它处的关于dAb的讨论。
当为单结合域之一时,这些域可以被用于筛选能够形成可结合GM-CSFRα的双域结合元件的互补域。这可以通过使用如WO92/01047中所公开的所谓等级双重组合方法(hierarchical dualcombinatorial approach)的噬菌体呈现筛选方法实现,其中含H或L链克隆的单独集落被用于感染编码另一链(L或H)的克隆的完整库,并且根据噬菌体呈现技术(如该参考文献和参考文献[22]所描述的噬菌体呈现技术)对所得双链结合元件进行选择。
本发明的再一方面提供了含本发明的结合元件和至少一种额外组分的组合物,例如包括结合元件和药物上可接受的赋形剂的组合物。该组合物可以在抑制或中和GM-CSFRα的方法(包括通过治疗处理人或动物体的方法)中使用。
本发明提供包括抗GM-CSFRα抗体分子的异质制剂。例如,该制剂可以为具有全长重链和缺少C末端赖氨酸的重链、具有不同程度糖基化和/或具有衍生氨基酸(如N-末端谷氨酸环化以形成焦谷氨酸残基)的抗体的混合物。
本发明的多个方面包括治疗方法(该方法包括给予所提供的结合元件)、包含该结合元件的药物组合物、和该结合元件在制备药物中的应用,如在包括将所述几何元件和药物可接受的赋形剂进行配制的制备药物或药物组合物的方法中的应用。
抗-GM-CSFRα治疗可以口服(如纳米抗体(nanobody))、通过注射(例如,皮下、静脉内、动脉内、关节内、腹膜内或肌肉内)、通过吸入、通过泡内途径(如膀胱内的灌输)、或局部(如眼内、鼻内、直肠、伤口内或皮肤上)进行。该治疗可以通过脉冲输入(pulse infusion)实施,特别是以结合元件的递减剂量。给药途径可以根据治疗的理化特性、对疾病的特殊考虑、或者使功效最优或使副作用最小的需要决定。可以设想抗GM-CSFRα治疗将不限于临床应用。因此,使用无针设备的皮下注射也是优选的。
根据需要治疗的状态,组合物可以单独或者与其它治疗组合(同时或顺序地)给予。组合治疗、尤其抗-GM-CSFRα结合元件与一种或多种其它药物的组合可以用于提供显著的协同效应。根据本发明的结合元件可以与以下物质中的一种或多种进行组合或作为它们的附加被提供:NSAID(例如,如塞来昔布的环氧合酶抑制剂和其它类似的cox2抑制剂)、皮质甾醇(如强的松)和缓解疾病的抗风湿药(DMARD)如修美乐(Humira)(阿达木单抗(adalimumab))、氨甲蝶呤、来氟米特(Arava)、依那西普(Enbrel)(依坦西普(Etanercept))、类克(Remicade)(英利昔单抗(Infliximab))、Kineret(阿那白滞素(Anakinra))、美罗华(Rituxan)(利妥昔单抗(Rituximab))、Orencia(阿巴他塞(abatacept))、氯金酸钠(gold salt)、抗疟药、柳氮磺胺吡啶(Ssulfasalazine)、D-青霉胺、环孢菌素A、双氯芬酸、环磷酰胺和咪唑硫嘌呤。
根据本发明,提供的组合物可以施用予个体。优选以“治疗有效量”施用,该量足以对病人显示有利效果。这种有利效果可以为至少一种症状的至少改善。给药的实际量和给药的速度和时间过程取决于治疗对象的状态和严重程度。治疗的处方,如决定剂量等,为一般执业医生和其它医生的责任范围,并且可能取决于症状的严重性和/或被治疗疾病的进展。抗体的适当剂量为本领域公知的[28、29]。可以使用此处表明的或如“Physician’s Desk Reference”(2003)所示的对于被给予药物的类型所适合的特定剂量。本发明的结合元件的治疗有效量或适当量可以通过对比其体外活性和在动物模型中的体内活性确定。将小鼠和其它测试动物中的有效剂量外推到人的方法是已知的。精准剂量取决于多个因素,包括抗体是用于诊断还是用于治疗、治疗部位的大小和位置、抗体的精确性质(如全抗体、片段或双体)、以及任何可检测标记或其它与抗体连接的分子的性质。典型的抗体剂量对于全身施用在100μg~1g的范围内、对于局部施用在1μg~1mg的范围内。典型地,抗体为全抗体,优选IgG1、IgG2或更优选IgG4。这是对成年患者单次治疗的剂量,其对于儿童和婴儿可以适当调整,并且对于其它抗体形式也可以按分子量成比例地调整。治疗可以按照医生的判断以每日、一周两次、每周或每月的间隔重复。在本发明的优选实施方式中,治疗为周期性的,并且给药之间的期间约为两周或更长、优选约3周或更长、更优选约4周或更长、或约每月一次。在本发明的其它优选实施方式中,可以在手术之前和/或之后给予治疗,并且更优选地,可以在手术治疗的切开位置直接给予或施用。
本发明的结合元件通常以药物组合物的形式被给予,该药物组合物可以包括至少一种结合元件以外的组分。因此,根据本发明的药物组合物以及用于本发明的应用的药物组合物除活性组分外还可以包括药物可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其它本领域普通技术人员公知的物质。该物质应为无毒的,并且不应干扰活性组分的效力。载体或其它物质的准确性质取决于给药途径,其可以为口服、或者通过如静脉内的注射。口服给药的药物组合物可以为片剂、胶囊、粉末、液体或半固体形式。片剂可以包括如凝胶或佐剂的固体载体。液体药物组合物通常包括如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油的液体载体。可以包括生理盐水、葡萄糖或其它糖类溶液或如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇的二醇类。对于静脉注射或病痛处的注射,活性组分为无热原并具有适当pH值、等渗性和稳定性的肠道外可接受的水溶液形式。例如,本领域相关技术人员能够使用如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸化林格氏注射液的等渗载体制备适当的溶液。可以根据需要包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。本发明的结合元件可以根据分子的理化性质和递送途径配制成液体、半固体或固体形式。制剂可以包括赋形剂或赋形剂的组合,例如:糖、氨基酸和表面活性剂。液体制剂可以包括宽范围的抗体浓度和pH。例如,固体制剂可以通过冷冻干燥、喷雾干燥或通过超临界流体技术的干燥进行制备。抗-GM-CSFRα的制剂取决于预定的递送途径:例如,用于肺部递送的制剂可以由具有确保在吸入时渗透到深肺部的物理性质的颗粒组成;局部制剂可以包括延长药物在作用部位滞留的时间的粘性改性剂。在特定实施方式中,结合元件可以采用防止结合元件快速释放的载体进行制备,例如包括植入物、透皮贴片和微胶囊化递送***的控释制剂。如乙烯醋酸乙烯酯、多聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸的生物可降解、生物相容的聚合物可以被使用。制备该制剂的许多方法对于本领域普通技术人员是已知的。例如参见Robinson,1978[30]。
根据本发明的结合元件可以在人或动物体的治疗或诊断方法中使用,如在治疗人类患者的疾病或病症(其可以包括预防治疗)的方法中,包括给予所述患者有效剂量的本发明的结合元件。根据本发明的可治疗的状态包括其中GM-CSFRα起作用的任何疾病。公开的技术文件显示了GM-CSF在总结如下的许多疾病中的作用。由于GM-CSF特异性结合GM-CSFRα,因此GM-CSF的病理和/或症状效应可以通过抑制GM-CSF与GM-CSFRα的结合被抵消。因此,除此处在试验部分所描述的抗体分子呈现的体内和体外药理学数据外,公开出版的证据显示本发明的结合元件可以在治疗如风湿性关节炎、哮喘、过敏反应、多发性硬化、髓系白血病和动脉硬化的自体免疫和/或炎性状态、疾病和病症中应用。关于这些状态的公开出版的证据总结如下:
哮喘和过敏反应
支气管哮喘是一种肺的常见的持久的炎性病症,特征为气道高反应性、粘液过量产生、纤维变性和升高的IgE水平。气道高反应性(AHR)为气道对非特异性刺激的过度收缩。AHR和粘液过量产生两者被认为是造成导致哮喘发作(恶化)的呼吸短促特征的可变气道阻塞的原因,并且是造成与该疾病相关的死亡(在英国每年约2000例死亡)的原因。
最近的研究已经证明在哮喘中GM-CSF及其受体在蛋白质和mRNA水平上都是上调的。此外,表达水平与疾病的严重程度相互关联。与非哮喘对象相比时,哮喘患者的支气管肺泡灌洗(BAL)液、BAL细胞、唾液、支气管上皮细胞和抗原刺激的外周血单核细胞中已测到GM-CSF产生增加[31、32]。此外,在过敏原激发后GM-CSF的气道表达水平显示出与组织嗜酸性细胞增多的水平和延期哮喘反应的严重程度相关[33]。随后的研究将上调的GM-CSFR表达与内源性或非变应性哮喘关联,将表达水平与非功能数据关联[34]。在小鼠卵清蛋白致敏和激发模型中,在卵清蛋白激发前通过鼻内给药产生的以羊多克隆抗体对GM-CSF活性的中和防止了气道高反应性并同时减少了气道内嗜酸性细胞的浸润和粘液分泌[35]。类似地,在通过鼻内给予柴油机废气颗粒引发的小鼠过敏性呼吸疾病模型中,再次通过鼻内给予羊多克隆抗体中和GM-CSF防止了对乙酰甲胆碱的气道高反应性、降低了BAL嗜酸性细胞计数并且也减少粘液产生杯形细胞在气道上皮上的表达[36]。
GM-CSF在过敏反应中的作用进一步在鼠诱导耐受模型中研究。暴露于每日反复剂量的雾状卵清蛋白而不进行预先致敏的小鼠形成对卵清蛋白的耐受并且不会引起气道的嗜酸性细胞炎症。GM-CSF通过腺病毒构建体在肺中表达改变了这些动物的反应,并且促进嗜酸性细胞流入BAL中、表型过敏组织学的产生和相关杯状细胞增生。该典型Th2反应的产生通过IL-5的血清和BAL浓度的增加和血清IL-4的增加进一步得到证实。在采用MHC II KO小鼠的该模型中进行进一步研究显示GM-CSF调节气道中抗原呈递细胞和T细胞之间的相互作用,从而促进T细胞介导的对卵清蛋白的反应[37]。值得注意的是,GM-CSF作为Th2反应的有效活化剂的活性也可以在缺少IL-3和/或IL-4的小鼠中被证实,说明GM-CSF活性的中和提供了完全不同于这些细胞因子的活性的可选择的治疗途径。
在另一鼠模型中已进行了类似的观察,其中鼻内反复暴露于豚草导致再暴露于抗原时的Th2型致敏和轻微气道炎症[38]。抗GM-CSF抗体与豚草联合给予减少了Th2相关的细胞因子产生,大概是通过内源GM-CSF的抑制。相反,向通过多次共同施用重组GM-CSF或单次递送携带GM-CSF转基因的腺病毒载体向富有GM-CSF的气道微环境递送豚草导致显著增强的嗜酸性细胞气道炎症和豚草特异性的Th2记忆性反应。
风湿性关节炎(RA)
RA为影响到工业化世界中约1%人口的慢性炎症和破坏性关节疾病。RA的特征为滑膜的增生和炎症、滑液内炎症、以及通常导致显著失能的周围骨骼和软骨的渐进破坏。
尽管RA的原因仍未知,但是有GM-CSF在RA的发展中起作用的累积证据。RA被认为通过T细胞介导的抗原特异性过程被引发和驱动。简言之,在易感宿主中的未鉴定抗原的存在被认为引发导致T细胞细胞因子产生的T细胞反应,结果增加了包括嗜中性粒细胞、巨噬细胞和B细胞的炎症细胞。
许多促炎症和抗炎症细胞因子在风湿性关节中产生。而且,疾病发展、复发和静息都由关节内细胞因子产生的动态变化介导。特别地,TNF-α和IL-1被认为在RA的发病过程中起关键作用,并且许多更新的已研究完成的或正在研制过程中的对该病的治疗方法注意到抑制这两种促炎症细胞因子的活性。
最近在啮齿类动物模型中的研究已显示GM-CSF在RA的发生和进展中发挥着中心的和非多余的作用。外源重组GM-CSF的使用在胶原诱导关节炎(CIA)[39]和单关节关节炎模型[40]的两种不同小鼠RA模型中增强了病理症状。除此之外,另外已证实GM-CSF敲除(GM-CSF-/-)小鼠对CIA发生具有抗性,并且与野生型小鼠相比,在滑膜关节液中发现的IL-1和肿瘤坏死因子(TNF-α)水平降低[41、42]。类似地,与野生型小鼠相比,在GM-CSF-/-小鼠中利用关节内注射甲基化牛血清白蛋白和IL-1诱导单关节炎产生的疾病严重程度降低[43]。
此外,给予鼠抗GM-CSF mAb显著改善CIA和单关节关节炎模型中的疾病严重程度。在CIA模型中,mAb治疗在处理已确立疾病的发展、组织病理学和显著降低关节IL-1和TNF-α水平方面是有效的。此外,在关节炎发作之前的mAb治疗减轻CIA疾病严重程度[44、43]。
许多研究已经分析了来自人体组织的关节滑液和膜活体组织样品中存在的细胞因子和受体的水平。通过使用PE标记的GM-CSF,对27位RA患者、13位健康志愿者和14位骨质疏松患者的循环***单核细胞的GM-CSFR水平进行了测定[45]。在该研究中证实与健康对照(20%)和经调查有骨质疏松的患者(25%)相比,在RA患者(53%)中检测到两倍之多的受体阳性细胞,因此说明单核细胞可能很容易对局部产生的GM-CSF作出反应。利用SF细胞的原位杂交,RA患者的细胞因子基因表达证明GM-CSF、IL-1、TNF-α和IL-6水平的提高。此外,分离和培养的源自正常志愿者的纤维原细胞的滑膜细胞显示出响应于IL-1α、IL-1β、TNF-α和TNF-β的GM-CSF蛋白水平的升高[47]。RA患者中GM-CSF血清水平的定量[48]显示,严重(366pg/ml,n=26)和中度(376pg/ml,n=58)RA患者的蛋白质水平与对照组(174pg/ml,n=43)相比增加,此外,也显示在患RA患者的SF中GM-CSF显著提高(1300pg/ml)。
以前已观察到在治疗嗜中性白血球减少症的患者中给予重组GM-CSF可能导致RA加重[49]。对费尔蒂综合征(Felty’s syndrome)治疗后的患者施用重组GM-CSF也观察类似的现象[50]。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)
慢性阻塞性肺疾病(COPD)被定义为以不可完全恢复的气流限制为特征的疾病状态。慢性气流限制通常为渐进性的并且与肺对毒性颗粒或气体的异常炎症反应相关。该气流限制由小的气道疾病(闭塞性支气管炎)和薄壁组织破坏(肺气肿)的混合导致,其对于COPD的相对影响因人而异。COPD的最终特征症状为咳嗽、生痰、以及用力时呼吸困难。COPD为重要的公众健康问题并且在美国为导致慢性病和死亡的第四位的原因。目前使用最初研制用于哮喘病的药物治疗该病,如带有或不带有支气管扩张剂(包括β拮抗剂)的皮质类甾醇。然而,这些药物中无一显示出减缓COPD的发展的功效[51]。例如,显著抑制哮喘中嗜酸性细胞炎症的皮质类甾醇未显示出对主要为中性粒细胞介导的COPD中所见炎症有任何作用[52]。因此,需要以该病的病理学为基础研制特异性以炎症过程为目标的新的COPD治疗药物。GM-CSF通过其在中性粒细胞和巨噬细胞功能方面的作用可能在COPD病理发生方面起重要作用。
在使用定量PCR的研究中,已显示出相对于非阻碍吸烟者的痰,在年龄匹配的COPD患者的痰中GM-CSF复本数显著提高[53]。此外,在吸烟诱导的肺炎症的啮齿类模型中,在烟雾暴露前2天、4小时和1小时用GM-CSF抗体鼻内处理的动物与同种型对照抗体对比,在激发后5天BAL的中性粒细胞、巨噬细胞和MMP-9水平显示出显著下降[54]。我们自己在大的COPD严重程度范围内的患者的诱导痰中GM-CSF水平的研究中观察的结果也支持这些研究。在这些研究中,我们表明,无论疾病的严重程度,在约40%测试的COPD患者的痰中GM-CSF增加,在某些情况下GM-CSF水平接近500pg/ml。在不吸烟或吸烟的匹配对照患者中GMCSF不表现出增加。这些数据暗示GM-CSF可能为吸烟诱导的气道炎症和COPD中的关键介体之一。
多发性硬化(MS)
GM-CSF参与到自体免疫疾病多发性硬化中。通过向啮齿类动物给予髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)抗原,可以诱导人多发性硬化模型,其显示了如中枢神经***炎症和能够导致MS样***髓鞘脱失的许多MS表型。在GM-CSF空白小鼠中,MOG不能诱导EAE表型[55]。此外,这些小鼠显示具有对MOG抗原的T细胞增殖反应降低和Th1细胞因子IL-6和IFN-γ的产生下降。在抗原激发的同时施用GM-CSF中和抗体在治疗后的10天内防止了疾病发作,同时具有明显的损伤减少。如果在疾病发作之后给药,小鼠在治疗的20天内完全康复[55]。
白血病
GM-CSF也与髓系白血病、幼年慢性髓系白血病(JCML)相关。该状态为主要侵袭不到四岁的患者的骨髓增生性疾病。在体外,JCML外周血粒细胞-巨噬细胞祖细胞(CFU-GM)显示了在低细胞密度下的自发增殖,这是先前对于其它骨髓增生性疾病未描述过的现象。此外,从这些培养物中耗竭单核细胞消除了该增殖。随后,已证实这种自发增殖由JCML祖细胞对单核细胞源的细胞因子GM-CSF的超敏性介导[56、57、58、59、60、61]。JCML祖细胞的超敏性表现为通过下调的GM-CSF诱导的Ras信号转导途径,而非在JCML患者中GM-CSF过量产生或水平升高[62]。最近利用GM-CSF类似物(E21R)(其拮抗GM-CSF在结合研究和功能分析两个方面中的作用)的研究已显示出通过抑制GM-CSF的作用可以在重度复合免疫缺陷/非肥胖糖尿病(SCID/NOD)小鼠的JCML异种移植模型中显著降低JCML细胞负载[63]。在移植时的E21R的预防性***给药防止在骨髓中建立JCML祖细胞、并且在移植后4周给予E21R导致JCML的缓解,同时细胞负载减少。此外,向以正常人骨髓和JCML骨髓共同移植的SCID/NOD小鼠给予E21R导致JCML负载下降,然而正常骨髓细胞保持未受影响。
动脉硬化症
缺血性心脏病为世界范围内最常见的死亡原因。近些年来,炎症在动脉硬化的病理形成中起重要作用的观点已得到加强,因为随着动脉壁的脂类积累同时发生炎症细胞积累。
一旦驻留于动脉壁中,炎症细胞(如单核细胞和巨噬细胞)就参与和保持局部炎症反应。这些巨噬细胞也表达各种脂蛋白的清道夫受体,因而有助于细胞分化为“泡沫细胞(foamy cell)”。正是这些“泡沫细胞”的死亡有助于形成脂质核,这是这些损伤的典型特征。由于炎症在这些动脉硬化样斑块内持续,因此,这些活化的炎症细胞释放促进平滑肌细胞(SMC)增殖和斑块纤维化的纤维发生介体和生长因子。除了促进纤维化外,这些细胞也释放有助于弱化纤维变性斑块的蛋白水解酶,如基质金属蛋白酶(MMPs),从而使其易于破裂。一旦这些斑块破裂,其释放细胞碎片和如组织因子的凝血因子到血管内,刺激凝血连锁和血栓块的形成。然后,所导致的动脉血栓能够导致心肌缺血或梗死。
最近发现,在动脉硬化的疾病发展的许多方面涉及GM-CSF。在胆固醇饲喂的兔的动脉硬化损伤中,GM-CSF被发现与巨噬细胞共同定位并且达到更低水平的内皮细胞和SMC[64]。此外,已显示在巨噬细胞积累处的人动脉硬化血管内及在中间SMC和内皮细胞内GM-CSF表达增加[65]。这种GM-CSF水平的增加部分由于在动脉硬化损伤形成和病理发生过程中单核细胞/巨噬细胞与内皮细胞的直接细胞-细胞接触[66]。动脉损伤(atherotic lesion)中另一关键因素为“泡沫细胞”,即已通过表面上的清道夫受体摄取氧化的低密度脂蛋白(LDL)的巨噬细胞。在体外,该Ox-LOD的摄取可以通过GM-CSF依赖的机制进一步刺激巨噬细胞增殖[67]。
由于动脉硬化为慢性炎症过程,已对如糖皮质激素的抗炎剂进行了研究。***(一种抗炎症糖皮质激素)在各种试验动物模型中抑制动脉硬化的形成[68、69、70、71]。其功效归因于抑制SMC迁移[72]和增殖[73]及循环单核细胞和白细胞的趋化性[74]。最近的研究显示ox-LDL可以诱导鼠腹膜巨噬细胞释放GM-CSF[75]。此外,在使用***治疗后,这种GM-CSF释放受到剂量依赖性的抑制,暗示***的抗炎症作用是通过抑制ox-LDL诱导的GM-CSF合成介导的。由于GM-CSF在动脉硬化中显示出具有核心作用,因此根据这一启示,替代糖皮质激素的方式可以抑制GM-CSF活性。
术语
此处使用的“和/或”被理解为明确公开两种特定特征或组分中的任一种而同时具有或不具有另一种。例如“A和/或B”理解为明确地公开了(i)A、 (ii)B和(iii)A和B中的各个情形,正如它们在此处单独给出。
GM-CSFRα和GM-CSF
GM-CSFRα为粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体的α链。人GM-CSFRα的全长序列以登录号S06945(gi:106355)进行保藏[76],并且此处作为SEQ ID NO:202列出。人GM-CSFRα的成熟形式,即剪去信号肽的形式在此处作为SEQ ID NO:206列出。除非上下文另有说明,此处对GM-CSFRα的引用指人或非人灵长类(如猕猴)的GM-CSFRα,通常指人的GM-CSFRα。GM-CSFRα可以为天然形成的GM-CSFRα或重组的GM-CSFRα。
人GM-CSF受体α的298个氨基酸的细胞外域具有SEQ ID NO:205所示氨基酸序列。
除非上下文另有说明,此处对GM-CSF的引用指人或非人灵长类(如猕猴)的GM-CSF,通常指人的GM-CSF。
GM-CSF通常结合成熟GM-CSF受体α链(SEQ ID NO:206)的细胞外域(SEQ ID NO:205)。如本发明其它内容所述,该结合被本发明的结合元件抑制。
天然形成的GM-CSFRα剪接变异体已被鉴定—参见例如参考文献[77和78]。在这些剪接变异体中细胞外域是高度保守的。本发明的结合元件可以结合或不结合一种或多种GM-CSFRα的剪接变异体,并且可以抑制或不抑制GM-CSF与一种或多种GM-CSFRα的结合变异体的结合。
结合元件
此处描述了一对互相结合的分子的一个成员。该结合对的成员可以天然形成或全部或部分合成产生。该分子对的一个成员其表面上具有与分子对的另一成员的特定空间和极性组织结合并因而互补的区域或孔穴。结合对的类型的例子为抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本发明涉及抗原-抗体型反应。
结合元件通常包括具有抗原结合位点的分子。例如,结合元件可以是抗体分子或包括抗原结合位点的非抗体蛋白。可以通过CDR在如人纤连蛋白或细胞色素B等的非抗体蛋白支架上的排列[80、81、82],或者通过使蛋白支架内的环的氨基酸残基随机化或发生突变而赋予与期望目标结合的能力来提供抗原结合位点。对蛋白质中新结合位点进行工程化的支架已被详细评述[82]。在WO/0034784中公开了用于抗体模拟物的蛋白支架,其中发明人描述了包括具有至少一个随机环的III型纤连蛋白域的蛋白质(抗体模拟物)。可以通过免疫球蛋白基因超家族的任何域成员提供其中接合一个或多个CDR(如一组HCDR)的合适支架。
非抗体蛋白支架的优点为其可以在比至少某些抗体分子更小和/或更易操作的支架分子中提供抗原结合位点。结合元件的小尺寸可以赋予其有利的生理特性,如进入细胞、渗透到组织内深处或到达其它结构内的目标的能力、或者结合到靶抗原的蛋白孔穴内的能力。
在参考文献[79]中综述了抗原结合位点在非抗体蛋白支架中的应用。典型的为具有稳定的骨架和一个或多个可变环的蛋白质,其中一个或多个环的氨基酸序列被特意地或随机地突变以产生结合靶抗原的抗原结合位点。这种蛋白质包括来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的蛋白A的IgG结合域、转铁蛋白、四连接素(tetranectin)、纤连蛋白(如第10 III型纤连蛋白域)和脂笼蛋白(lipocalin)。其它的途径包括合成的“微体”(Selecore GmbH),其基于植物大环寡肽(cyclotide)-具有分子内二硫键的小蛋白质。
除抗体序列和/或抗原结合位点外,根据本发明的结合元件可以包括如形成肽或多肽(如折叠域)的、或者赋予分子除结合抗原能力外的另一功能特性的其它氨基酸。本发明的结合元件可以携带可检测标记,或者可以与毒素或者靶向结构或酶偶联(如经肽键或连接物)。例如,结合元件可以包括催化位点(如在酶域内)以及抗原结合位点,其中抗原结合位点结合抗原,而因此将催化位点指向抗原。催化位点可以通过例如切割来抑制抗原的生物功能。
尽管如所述的,CDR可以由如纤连蛋白或细胞色素B的支架携带[80、81、82],但是携带本发明的CDR或CDR组的结构通常为抗体重或轻链序列或其基本部分,其中CDR或CDR组位于相应于由重排的免疫球蛋白基因所编码的天然形成VH和VL抗体可变域的CDR或CDR组的位置。免疫球蛋白可变域的结构和位置可以参照现在在互联网上可获得的(http://immuno.bme.nwu.edu或用任何搜索引擎寻找″Kabat″)文献kabat等,1987[98]及其更新来确定。
本发明的结合元件可以包括抗体恒定区或其部分、优选人抗体恒定区或其部分。例如,VL域可以在其C末端与包括人Cκ或Cλ链(优选Cλ链)的抗体轻链恒定域连接。类似地,基于VH域的结合元件可以在其C末端与源自如IgG、IgA、IgE和IgM的任何抗体同种型和任何同种型亚类(特别是IgG1、IgG2和IgG4)的免疫球蛋白重链的全部或部分(如CH1域)连接。优选为IgG1、IgG2或IgG4。因为IgG4不结合补体且不产生效应子功能,所以IgG4是优选的。具有这些特性且使可变区稳定的任何合成的或其它恒定区变异体在本发明的实施方式中的应用中也是优选的。
本发明的结合元件可以用可检测的或功能性的标记物标记。可检测的标记物包括如131I或99Tc的放射性标记物,其可以使用抗体成像领域中已知的常规化学方法连接于本发明的抗体。标记物也包括如辣根过氧化物酶的酶标记物。标记物进一步包括可以通过结合特定同源可检测结构(如标记的抗生物素蛋白)进行检测的化学结构(如生物素)。因此,本发明的结合元件或抗体分子可以为包括任选地经连接物(如肽)联接的结合元件和标记物的缀合物的形式。例如,结合元件可以与酶(如过氧化物酶、碱性磷酸酶)或包括,但不限于生物素、荧光色素、绿色荧光蛋白的荧光标记物偶联。此外,标记物可以包括毒素结构,如选自假单胞菌外毒素(PE或其细胞毒性片段或突变体)、白喉毒素(其细胞毒性片段或突变体)、肉毒杆菌毒素A~F、蓖麻毒素或其细胞毒性片段、相思豆毒素或其细胞毒性片段、皂草毒蛋白(saporin)或其细胞毒性片段、美洲商陆抗病毒毒素或其细胞毒性片段以及异株泻根毒蛋白1(bryodin 1)或其细胞毒性片段的组的毒素结构。当结合元件包括抗体分子时,标记的结合元件可被称作免疫缀合物(immunoconjugate)。
抗体分子
这描述了天然产生的或者部分或全部合成产生的免疫球蛋白。该术语也涵盖任何包括抗体抗原结合位点的多肽或蛋白。包括抗体抗原结合位点的抗体片段为如Fab、F(ab’)2、Fab’、Fab’-SH、scFV、Fv、dAb、Fd和双体的分子。
取得单克隆和其它抗体分子并且利用重组DNA技术制备其它抗体或保留原始抗体的特异性的嵌合分子是可能的。这种技术可以涉及向不同免疫球蛋白的恒定区(或恒定区加框架区)引入编码抗体的免疫球蛋白可变区(或CDR)的DNA。例如,参见EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400以及大量的后续文献。杂交瘤或其它产生抗体的细胞可以发生遗传突变或其它改变,这可能改变或不改变产生的抗体的靶结合。
因为抗体可以以许多方式被修饰,因此,术语“抗体分子”应理解为涵盖任何具有抗体抗原结合位点的结合元件或物质。因此,该术语涵盖抗体片段和衍生物,包括任何含抗体抗原结合位点的多肽,而无论其是天然的或全部或部分合成的。因而包括与另一多肽融合的包含抗体结合位点的嵌合分子、或者其等价物。在EP-A-0120694和EP-A-0125023以及大量的后续文献中描述了嵌合抗体的克隆和表达。
抗体工程领域中可获得的进一步的技术使得分离人和人源抗体成为可能。人和人源抗体为本发明的优选实施方式,并且可以使用任何适当的方法制备。例如,可以制备人杂交瘤[83]。噬菌体呈现(用于制备结合元件的另一种已建立技术)已在如参考文献[83]和WO92/01047(以下进一步讨论)的许多公开文献中进行了详细描述。其中小鼠抗体基因被灭活并且用人抗体基因功能性取代、而同时小鼠免疫***的其它组分保持完整的转基因小鼠可以被用于分离人抗体[84]。可以利用如在WO91/09967、US 5585089、EP592106、US 565332和WO93/17105中公开的本领域中的已知技术制备人源抗体。此外WO2004/006955描述了基于通过对比非人抗体的可变区CDR序列的正则CDR结构类型和来自人抗体序列库(如胚系抗体基因片段)的相应CDR的正则CDR结构类型从人抗体基因选择可变区框架序列的用于抗体人源化的方法。具有与非人CDR类似的正则CDR结构类型的人抗体可变区构成从其中选择人框架序列的人抗体序列成员子集。可以通过人和非人CDR序列之间的氨基酸类似性进一步对子集成员分级。在WO2004/006955的方法中,顶级的人序列被选择来提供用于利用选择的子集成员人框架构建以非人CDR对应部分功能性取代人CDR序列的嵌合抗体的框架序列,从而提供高亲和性和低免疫原性的人源化抗体而无需在非人和人抗体之间对比框架序列。根据本发明的方法制备的嵌合抗体也被公开。
通过表达由在适当的表达载体内合成和组装的寡核苷酸产生的基因可以制备合成抗体分子[85、86]。
已表明完整抗体的片段可以实行结合抗原的功能。结合片段的例子为(i)由VL、VH、CL和CH1域组成的Fab片段; (ii)由VH和CH1域组成的Fd片段; (iii)由单个抗体的VL和VH域组成的Fv片段; (iv)由VH或VL域组成的dAb片段[87,88,89];(v)分离的CDR区; (vi)F(ab’)2片段,为包括两个连接的Fab片段的双价片段; (vii)单链Fv分子(scFv),其中VH域和VL域通过使得两个域联合的肽连接物连接以形成抗原结合位点[90、91];(viii)双特异性的单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)“双体”,通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804;[92])。可以通过引入连接VH和VL域的二硫桥稳定Fv、scFV或双体分子[93]。包括与CH3域联接的scFv的微体也可以被制备[94]。
dAb(域抗体)为抗体的小型单体抗原结合片段,即抗体重或轻链的可变区[89]。VH dAb在驼类(如骆驼、美洲鸵)中自然形成,并且可以通过用特定抗原免疫骆驼、分离抗原特异性B细胞并直接克隆来自个体B细胞的dAb基因而被制备。dAb也在细胞培养中产生。其较小的尺寸、良好的溶解性和温度稳定性使其在生理上尤其有用,且适于选择和亲合力成熟。本发明的结合元件可以为包括基本如此处所示的VH或VL域或者包括包含基本如此处所示的一组CDR的VH或VL域的dAb。 “基本如所示”意味着本发明的相关CDR或者VH或VL域与序列在此被给出的特定区域相同或高度相似。“高度相似”意味着在CDR和/或VH或VL域内可以进行1~5个、优选1~4个(如1~3个,或1个、或2个、或3个或4个)氨基酸的取代。
当使用双特异性抗体时,其可以为通过多种方法[95]制备的(如化学或杂交瘤制备的)常规双特异性抗体,或者可以为任何上述双特异性抗体片段。双特异性抗体的例子包括BiTETM技术的双特异性抗体,其中具有不同特异性的两种抗体的结合域可以被使用和经短的柔性肽直接连接。这将两种抗体组合在短的单个多肽链上。通过仅使用可变域可构建双体和scFv而无Fc域,从而潜在地降低了抗个体型反应的效应。
因为其可以在大肠杆菌中容易地构建和表达,所以与双特异性全抗体相比,双特异性双体也可能是特别有利的。利用文库的噬菌体呈现(WO94/13804)可以容易地选择具有适当结合特异性的双体(和如抗体片段的许多其它多肽)。如果双体的一个臂保持恒定,例如对准GM-CSFRα,则可以形成其中另一臂被改变且选择具有适当目标结合的抗体的库。可以通过杵臼(knob-into-hole)工程产生双特异全抗体[96]。
抗原结合位点
这描述了与靶抗原的全部或部分结合并互补的分子的部分。在抗体分子中,其被称作抗体抗原结合位点,并且包括与靶抗原的全部或部分结合并互补的抗体部分。当抗原较大时,抗体可以仅结合抗原的特定部分,该部分被称为表位。抗体抗原结合位点可以由一个或多个抗体可变域提供。优选地,抗体抗原结合位点包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
Kabat编号
此处的抗体序列的残基通常利用如Kabat等,1971[97]中所定义的Kabat编号指称。也参见参考文献[98、99]。
分离的
这指其中本发明的结合元件或编码该结合元件的核酸按照本发明一般所处的状态。分离的元件和分离的核酸没有或基本没有其天然相关的物质,如在其自然环境或当通过体外或体内实施的重组DNA技术制备时在其被制备的环境(如细胞培养)中被发现的其它多肽或核酸。元件和核酸可以利用稀释液或辅剂进行配制,并且出于实际目的可以仍然是分离的—例如,如果在免疫试验中用于涂覆微滴定板,元件通常与凝胶或者其它载体混合,或者当用于诊断或治疗时与药物可接受的载体或稀释液混合。结合元件可以天然地或通过异源真核细胞***(如CHO或NSO(ECACC 85110503))被糖基化,或者其可以是未糖基化的(例如,如果通过在原核细胞中表达产生)。
附图简要说明
图1、在TF-1增殖试验中两种抗GM-CSFRα抗体的pA2分析。当存在浓度增加的两种优化IgG4(分别为抗体6(图1A)和抗体1(图1B))时,利用浓度增加的GM-CSF诱导TF-1细胞增殖。对于曲线图1A和曲线图1B所显示的数据,氚标记的胸腺嘧啶的掺入被测量,并且各抗体浓度下GM-CSF的EC50被计算。然后对于曲线图1C和曲线图1D中所显示的数据,通过schild回归对剂量比进行计算和分析以获得pA2值。
图2、在粒细胞形态变化试验中抗GM-CSFRα抗体,即抗体6的pA2分析。当存在浓度增加的IgG4时,用浓度增加的GM-CSF处理人(曲线图2A或2C)或猕猴(2B和2D)粒细胞。利用流式细胞仪测量粒细胞形态改变,并且各抗体浓度下GM-CSF的EC50被计算(曲线图2A和曲线图2B)。然后通过schild回归对剂量比进行计算和分析以获得pA2值。
图3、在测量由7pM人GM-CSF诱导的TF-1细胞增殖的试验中,两种作为IgG4的抗体(即分别为抗体1和抗体6)的拮抗效力。也显示了阳性对照IgG4 2B7和同种型对照IgG4的数据。数据代表在同一试验内三次测定的平均值加标准差条。
图4、在测量由7pM人GM-CSF诱导的人粒细胞形态变化的试验中,两种作为IgG4的抗体(即分别为抗体1和抗体6)的拮抗效力。也显示了对照IgG4 2B7和同种型对照IgG4的数据。数据代表在同一试验内三次测定的平均值加标准差条。
图5、在测量由1nM人GM-CSF刺激的人单核细胞TNFα释放的试验中,两种作为IgG4的抗体(即分别为抗体1和抗体6)的拮抗效力。也显示了对照抗体2B7和同种型对照IgG4的数据。数据代表在同一试验内三次测定的平均值加标准差条。
图6、在测量由7pM人GM-CSF诱导的人粒细胞存活的试验中,两种作为IgG4的抗体(即分别为抗体1和抗体6)的拮抗剂力。也显示了对照抗体2B7和同种型对照IgG4的数据。数据代表在同一试验内三次测定的平均值加标准差条。
图7、亲合力成熟的人mAb抗体1和抗体6,而不是亲本人mAb28G5(抗体3)或已知的鼠抗体2B7,抑制人的造血祖细胞的GM-CSF驱动分化。来自脱落(apheresis)样品的5 x 104个解冻单核细胞在存在10ng/ml GM-CSF和所示浓度的mAb的情况下在半固体琼脂中培养。在第14天进行集落计数。曲线图显示了对抗μg/ml浓度的mAb的集落数。
图8、在huGM-CSFR Tg嵌合小鼠中亲合力成熟的mAb的效力的剂量-反应分析。用500ng huGM-CSF(或PBS)处理5Tg嵌合小鼠的组(皮下注射,每天两次,共4天(D.1-D.4)),并在D.0施用对照(CAT001)或所示浓度的测试mAb(抗体6)。在D.5时测定脾重量。
图9、抗体6在人外周血单核细胞内源细胞因子释放试验中的效力的剂量-反应分析。1x106个细胞在存在和无抗体条件下培养72小时,并且对上清液进行IL-6和TNFα ELISA分析。数据代表在同一试验中两次测定的平均抑制加标准差条。
具体实施方式
试验部分
背景
人抗体片段可以在体外从在丝状噬菌体的表面上呈现的组成集合中选择。该过程称作噬菌体呈现并且提供了获得人抗体片段的方法。该过程可以用于分离人抗人特异性并且可以进行特别修饰以得到具有特定亲合特征的抗体。
仅由通过短肽连接物联合在一起的重链可变(VH)和轻链可变(VL)域组成的抗体片段包含确定抗原结合所需的全部信息。该片段已知为单链Fv(scFv)。当在噬菌体表面呈现时,scFv显示正确的折叠和与抗原的结合。通过该方法已经构建了大的人scFv组成集合,并且其提供了从其中分离用于开发为候选药物的单个克隆的来源。然后,候选的scFv被重组为用于治疗用途的全IgG(典型地人IgG)分子。
摘要
为了富集与人GM-CSFRα结合的噬菌体群,对源自人脾淋巴细胞的scFv噬菌体呈现库进行选择。我们分离了具有选择的特征的scFv抗体,并且将这些scFv转化为IgG4。利用各种试验,抗体组(panel)被分离、优化和胚系化以产生具有治疗抗体的适当规格的IgG4。
其序列在序列表中显示为抗体1、2和4~20的19个抗体克隆得自亲本抗体。该亲本在序列表中显示为抗体3,且在此也称为28G5。该19个克隆由于在如试验部分所描述的多种生物试验中显示出特别优良的性状而被选择,并且被赋予抗体号码1、2以及4~20。
生物试验设计为反映如风湿性关节炎的疾病的炎症性质。例如,将中性粒细胞募集到作用位点所必须的中性粒细胞的形态变化、单核细胞的促炎症因子释放和响应于特定信号的炎症细胞类型的存活增加。抗体在这些试验中显示有效的中和活性。
所用的试验方法的详细方案在下面名为“试验材料和方法”的部分中提供。
抗体引导分离
大的单链Fv(scFv)人抗体库被用于进行选择。这源自20位健康供体的脾淋巴细胞并且被克隆至噬粒载体内。识别GM-CSFRα的ScFv在对由HEK293T细胞中的受体的纯化标记、可溶、细胞外域的超表达得到的纯化GM-CSFRα进行的系列重复选择循环中从噬菌体呈现库中分离。这基本按照Vaughan等所述实行[102]。简言之,在生物素化的受体暴露于噬菌体库之后,在抗生蛋白链菌素包被的磁珠上捕获具有结合的噬菌体的蛋白。未结合的噬菌体被洗去。然后,如Vaughan等所述得到结合的噬菌体,并且重复选择过程。在降低抗原浓度的情况下下进行三轮选择。对来自选择循环输出的scFv的代表性部分进行DNA测序。
在这些对噬菌体呈现库的最初选择后,在被设计为确认能够抑制GM-CSF与纯化的GM-CSFRα细胞外域结合的噬菌体表达scFv抗体的配体结合试验中鉴定了独特的scFv组。在配体结合试验中这些scFv的中和效力为0.65~3.3nM。
在生化配体结合试验中有活性的抗体在TF-1增殖试验中测定其生物活性,F-1增殖试验通过测试抗体抑制GM-CSF刺激的TF-1细胞增殖的能力测量中和效力。TF-1为从红白血病患者建立的人前骨髓(premyeloid)细胞系。该细胞系的存活和增殖是因子依赖的,并且常规地在人GM-CSF中维持。通过测量在***细胞的新合成DNA中氚标记的胸腺嘧啶的掺入量的降低确定GM-CSF依赖的增殖的抑制。在该试验中,所有scFv都具有可测量的效力,IC50值范围为约180~1200nM。
最有效的scFv克隆被重排(reformat)为具人γ4重链恒定域和人λ轻链恒定域的人IgG4抗体分子。为了使抗体能够表达为经过一些修饰的Persic等描述的全IgG4抗体[100],对于最有效的scFv克隆构建载体。所述载体中包括oriP片段,以有利于与HEK-EBNA 293细胞一起应用并允许游离型复制。VH可变域被克隆至表达载体pEU8.1(+)的分泌前导序列和人γ4恒定域之间的多接头内。VL可变域被克隆至表达载体pEU4.1(-)的分泌前导序列和人λ恒定域之间的多接头内。HEK-EBNA 293细胞用表达重和轻链的构建体共转染,并且全抗体使用蛋白A亲和层析从条件培养基中纯化。纯化的抗体制剂被无菌过滤、并且在测试前在4℃下保存于磷酸缓冲盐水(PBS)中。通过使用BCA方法(Pierce)测量在280nm处的吸收值确定蛋白浓度。
在TF-1增殖试验中,重排的IgG与已知鼠抗体2B7进行比较。IgG4在该试验中保留或增加了活性,IC50值范围为6~约1600nM。
在炎性疾病中,中性粒细胞的形态变化对于其募集到作用位点是必须的。人粒细胞形态变化试验被设计为利用荧光活化细胞分选(FACS)测量从血液中分离的粒细胞在暴露于GM-CSF后的形态改变而模拟该生物反应。测定了抗GM-CSFRα IgG4抗体抑制中性粒细胞对GM-CSF的形态改变反应的能力,并且确定克隆的IC50值范围为约15~350nM。代表性抗体28G5在猕猴粒细胞形态改变试验中以约5nM的IC50中和猕猴GM-CSFR。已知的鼠抗体2B7也能够中和由GM-CSF结合猕猴受体所导致的生物反应。
然后,使用BIAcore测量抗体的受体结合亲和力。计算的KD值范围为32~377nM。
优化
为了提高28G5的效力,启动了优化程序。在完成VH或VL CDR3的随机诱突的情况下产生了抗体库。各个CDR3在两个6氨基酸的块中被随机化以覆盖整个CDR,从而产生H1(VH CDR3中的6aa的N末端块)、H2(VH CDR3中的6aa的C末端块)、L1(VL CDR3中的6aa的N末端块)和L2(VL CDR3中的6aa的C末端块)库。所获得的库进行人GM-CSFRα结合的重复选择循环。然后,由该选择过程分离的克隆被用于构建包含具有变异重链CDR3和变异轻链CDR3的scFv的组合噬菌体库。这些库也被进行相同的选择过程。
在优化过程的各个阶段,利用28G5和受体的表位竞争试验鉴定能够抑制28G5 IgG4结合GM-CSF受体的scFv,并且然后在如下所述的TF-1增殖试验中进行测试。
在28G5的重链CDR3序列的随机诱变后,scFv的组利用在TF-1试验中可测量的中和效力进行鉴定。当VH CDR3的3’末端被随机化时,获得了大多数效力改善。
在28G5的轻链CDR3序列的随机诱变后,scFv的组利用在TF-1试验中可测量的中和效力进行鉴定。当VL CDR3的3’末端被随机化时,获得了所有的效力改善。
在重和轻链CDR3随机突变库组合后,scFv的组利用在TF-1增殖试验中具有超过亲本scFv 28G5的较高效力进行确认。分离具有超过亲本>60000倍的效力提高的scFv。所有库组合产生改进的scFv,即H1/L1、H1/L2、H2/L1、H2/L2。因为没有从L1库分离出改进的scFv,所以这是特别有趣的现象。
使用上述方法,在28G5的优化过程中被鉴定的19个scFv的组被重排并表达为IgG4。所述组包括抗体克隆1、2和4~20。在该组中某些最有效的克隆从组合的H和L CDR3突变库获得。在TF-1增殖试验中测试该组中的IgG4抗体的活性,并且与已知鼠抗体2B7对比。在该试验中,所有优化的IgG4比2B7更有效。此时,2B7具有约1.6nM的计算IC50,而这些克隆具有约1pM~约1100pM的IC50计算值范围。数据列于以下表1中,并总结如下:
IC50<1500pM 抗体1、2和4~20
IC50<300pM 抗体1、2、4-12和14-20
IC50<60pM 抗体1、2、4-6、8-11、14和16-20
IC50<10pM 抗体1、5、6、11和20。
图3说明在TF-1增殖试验中,与已知的抗体2B7相比,本发明的两种代表性抗体,抗体1和抗体6的拮抗效力。
BIAcore2000***(Pharmacia Biosenser)被用于测定某些先导优化的IgG4与重组纯化标记的GM-CSF受体细胞外域的相互作用的动力学参数。抗体的亲和性被极大改进,具有0.127nM~约5nM的KD计算值。数据列于表2中。结合速率(on-rate)和解离速率(off-rate)都获得改进。IgG4对GM-CSFRα可溶性细胞外域的亲和性与其在TF-1试验中的性能之间的相关性是极好的,具有0.85(p<0.0001)的皮尔逊系数。通过对比,2B7的KD被单独计算并且显示为约7nM。
在28G5的优化过程中鉴定的IgG4抗体在人粒细胞形态改变试验中进行测试,并且与已知鼠抗体2B7比较。所有在该试验中测试的抗体(抗体1、2、5、6、9-11、16和20)都是非常有效的,具有7.8~90pM的IC50值范围。其中,抗体1、2、5、6、9、16和20具有不到50pM的IC50,且抗体1、2、6、16和20具有不到25pM的IC50。我们的抗体比具有477pM的IC50的2B7更有效。数据显示在表3中。图4说明在人粒细胞形态改变试验中,与已知抗体2B7相比,本发明的两个代表性抗体,抗体1和抗体6的拮抗效力。
在28G5的优化过程中鉴定的IgG4抗体在猕猴形态变化试验中进行测试。所有抗体能够中和GM-CSF对猕猴受体以及人受体的活性,并且所有抗体都比2B7更有效。2B7具有26pM的IC50,而抗体组中的代表性抗体(抗体6、抗体1和抗体2)分别具有1.73、2.03和3.2pM的IC50值。
在单核细胞TNFα释放试验中,对在28G5的优化过程中鉴定的IgG4组进行中和效力测试。该试验测试抑制人单核细胞在用GM-CSF处理时释放促炎症因子TNFα的能力。抗体1、2、5、6、9和10被测试,它们在该试验中都是有活性的,并且能够完全中和GM-CSF对受体的作用(IC50范围为约43~139),而333nM浓度的2B7仅能够实现GM-CSF诱导的TNFα释放的50%抑制,表明在该试验中该抗体仅为部分抑制因子。图5说明在单核细胞TNFα释放试验中,与已知抗体2B7相比,本发明的两个代表性抗体的拮抗效力。数据在表4中显示,并且总结如下:
<150pM 抗体1、2、5、6、9和10号
<110pM 抗体1、2、5、6和9号
<100pM 抗体1、5、6和9号
炎性疾病的特点为炎症细胞类型响应于特定信号而增加存活。粒细胞在GM-CSF存在时能够存活更长,因此,在粒细胞存活试验中测试在28G5优化过程中分离的IgG4抗体抑制该反应的能力。所有来自先导物优化的抗GM-CSFRαIgG4在该试验中都是有活性的,代表性中和效力(IC50)的范围为7.0~843.7pM。这与已知鼠抗体2B7相反,其直到83nM浓度时还是完全无活性的。图6说明在粒细胞存活试验中,与已知抗体2B7相比,本发明的两个代表性抗体,抗体1和抗体6的拮抗效力。
如图3~6所示的这些数据表明与已知鼠抗体2B7相比,我们的抗体具有显著不同的特性。例如,在粒细胞存活和TF-1增殖试验中,本发明的代表性抗体分别抑制用7pM GM-CSF刺激的粒细胞存活和TF-1增殖,而2B7不抑制粒细胞存活、但抑制TF-1增殖(虽然是比我们的抗体低的程度)。数据显示,与已知GM-CSFRα抗体相比,本发明的结合元件具有较高的亲和性和较高的抑制各种由GM-CSF-R介导的生物效应的能力。
28G5的衍生氨基酸序列及其衍生物与VBASE数据库中的已知人胚系序列比对,并且通过序列相似性鉴定最接近的胚系。28G5及其衍生物的VH域的最接近胚系被鉴定为VH1 DP5。28G5 VH在框架区内具有与VH 1-24(DP5)胚系相比的14个改变。
VL域的最接近胚系为Vλ VL 1-e(DPL8),其在框架区内仅具有胚系的5个改变。28G5及其衍生物的框架区通过定点突变返回胚系以同样地匹配天然的人抗体。除了一个氨基酸以外的所有这些氨基酸可以被转变为在抗体效力方面仅具有适当改变的胚系。重链的94位的氨基酸异亮氨酸(使用Kabat编号,Kabat等1971)不能被改变为胚系苏氨酸而不完全丧失活性。因此,在抗体框架区内保持胚系的该单一改变。
在TF-1增殖试验中进行抗-GM-CSFRα抗体中的两个,抗体6和抗体1,的全pA2分析。数据证实在该***中这些抗体是高度有效的拮抗剂,计算的pA2值分别为-11.3±0.2和-11.0±0.2(图1)。
在人和猕猴粒细胞形态改变试验中进行抗-GM-CSFRα抗体之一(抗体6)的全pA2分析。数据证实在这些***中该抗体是高度有效的拮抗剂,在人和猕猴试验中计算的pA2值分别为-10.58和-10.78(图2)。
在半固体琼脂试验中,CM-CSF驱动造血祖细胞分化为粒细胞和巨噬细胞集落。因此,在集落形成试验中,使用源自外周血的祖细胞测试亲和力成熟抗体6和抗体1、亲本mAb抗体3(28G5)和阴性对照(CAT001)的拮抗该GM-CSF特异性活性的能力。图7中显示的数据表明两种亲和力成熟的代表性mAb都为人GM-CSF介导的体外造血集落形成的有效抑制因子。
对于亲和力成熟的mAb,大致的IC50值为0.08μg/ml(抗体6)和0.25μg/ml(抗体1)。有趣的是已知的鼠抗体2B7在该试验中直到66nM浓度时仍表现出很少(如果有的话)的抑制活性。
在对照试验中,如所预想的,亲和力成熟的mAb对SCF+IL-3+G-CSF的组合所介导的集落形成没有影响,并且当无细胞因子时,集落形成可以忽略(<4个集落/培养物)。
对于huGM-CSFRα特异性mAb拮抗活性的体内分析,表达人GM-CFSR的α和β两条链的转基因(Tg)小鼠的骨髓移植至野生型小鼠中可以被用于产生嵌合动物,从而转基因的huGM-CSFR表达限于骨髓源的造血细胞、并且因此更类似内源受体的表达特征(expression profile)。在这些Tg嵌合小鼠中,给予huGM-CSF导致脾重量增加和循环血液单核细胞的边缘化。对亲和力成熟的抗体6和阴性对照mAb(CAT001)测试其拮抗这些GM-CSF介导的体内反应的能力。对于剂量反应分析,包括5只Tg嵌合鼠的6个组用500ng的huGM-CSFRα皮下注射,每天处理2次,共4天(第1-4天),则5只动物组成的第七对照组仅接受PBS。6组huGM-CSF处理的动物中的4组在D.0时以16mg/kg、5.3mg/kg、1.78mg/kg或0.59mg/kg的量接受测试mAb(抗体6),而第五组huGM-CSF处理的动物在D.0时以16mg/kg的量接受对照CAT001。图8中呈现的结果证明,与对照PBS相比,使用huGM-CSF处理诱导了脾重量的显著增加和循环血单核细胞的降低。如预想的,使用16mg/kg对照CAT001进行处理对脾重量的增加或血液单核细胞的降低都没有影响。相反,在以测试mAb抗体6处理后,具有清晰的剂量-反应效应,如在16mg/kg时,该抗体消除了脾重量的增加,尽管在使用0.59mg/kg的mAb时仍然有明显的反应,但效应被显著降低。IC50似乎在0.59mg/kg和1.78mg/kg之间的某处。对于GM-CSF诱导的循环单核细胞的减少观察到类似结果—使用16mg/kg的测试mAb抗体6的处理消除了降低,而0.59mg/kg的mAb对该反应仅有很小影响。这些数据显示抗-GM-CSFRα抗体为人GM-CSFRα的体内拮抗剂。
为了进一步研究这些抗-GM-CSFRα抗体的抗炎特性,在外周血单核细胞细胞因子释放试验中测试抗体6。在该试验中,TNFα和IL-6可以内源释放,这取决于供体。在该试验中,GM-CSF也是由细胞内源产生的,而非外源添加,并且因此在该试验中观察到的结果代表天然的内源GM-CSF结合其受体的生物学效应的抑制。
在给予抗体6后,如图9所示,这两种细胞因子都受到剂量依赖性的抑制。这些数据表明这些抗体可以抑制天然GM-CSF的活性,以及通过抑制GM-CSF信号发生,可以抑制如IL-6和TNFα的关键促炎症细胞因子,两者都与多种如风湿性关节炎的炎症指征相关。
此外,基于抗体6的这一结果,可以预计抗体1~20中每个在该试验中表现抑制作用,因为所有抗体1~20被认为结合GM-CSFRα的相同区域。
重要的抗原识别残基的定位、以及序列分析
为了鉴定哪个位置对于配体结合通常是保守的、以及在仍保留配体结合活性的抗体中哪个位置是可变的,我们确定了在胚系化抗体6scFv序列中多个位置的残基的可变性。
对抗原结合有作用的位置显示为VL域中的Kabat残基27A、27B、27C、32、51、52、53、90、92和96,以及VH域中的Kabat残基17、34、54、57、95、97、99和100B。
确认了7个显示为对抗原结合重要的位置:H95、H97、H99、H100B、L90、L92和L96。然后我们分析了在28G5抗体优化过程中分离的160个变异体的序列中这些位置处的残基,所有这些变异体在TF-1增殖试验中都显示出最少5倍的效力提高。
以下表5中的数据总结了在这些位置中的各处和L95A处观察到的不同氨基酸(来自可能的20种当中)。28G5和/或抗体6中这些位置的氨基酸是极保守的,这很好地证明了那些氨基酸对于结合抗原是关键的。例如,以下位置的氨基酸是极保守的:H97、H100B、L90、L92。
方法
基本如参考文献[101]所述,编码亲和力成熟的和胚系化抗体6scFv的DNA序列被转化为核糖体呈现形式。为了产生含随机点突变的变异体574D04序列的库,采用制造商的方案(BD Bioscience)中的高突变条件(7.2个突变/1000bp)对抗体6序列进行易错PCR。该库在核糖体上表达,并且与纯化示踪的GM-CSFRα共培养以使得结合发生。能够结合标记的GM-CSFRα的变异体被捕获,并且利用蛋白G(Dynal)包被的顺磁珠移除。群体中残留的未结合变异体被加入到四种生物素化的抗-个体型抗体的池中,其预先得自如参考文件[102]所述的大的人抗体噬菌体呈现库并且已知与抗体6scFv结合。生物素化的抗-个体型抗体结合的变异体利用抗生蛋白链菌素珠捕获,而未结合的变异体被洗去。根据参考文件[101]中的一般方法,该过程重复进行核糖体呈现选择的另两个循环。
使用与Edwards BM等(2003) Journal of Molecular Biology Vol334:103中所述相同的方法,来自选择结果的变异体的代表性部分被克隆至噬粒载体中,并且在噬菌体上表达scFv变异体以用于通过ELISA进行测试。那些不显示与纯化标记的GM-CSFRα结合的突变体被测试与在选择中使用的四种抗-个体型抗体池的结合。在抗-个体型结合试验中表现出等于或大于抗体6 scFv的结合的变异体被测序,并且对序列进行分析以发现具有高频突变的位置。
使用486个VH链序列和451个VL链序列,发现变异体群的平均突变率为每VH或VL链3.05个氨基酸。对他们分析突变热点,测绘与其沿scFv的位置相关的突变频率。该分析集中于每VH或VL具有至少一个CDR突变且每VH或VL具有不到4个突变的那些克隆。从该123个VH和148个VL序列的组中,热点被限定为具有5%或更高突变频率的位置。
使用核糖体呈现负选择方法,抗体6的VHCDR3和VLCDR3中的七个位置作为抗原结合重要的推定位置而受到特别关注。然后对在28G5抗体优化过程中分离的、其中VHCDR3和VLCDR3的整个序列被随机化且选择较高亲和性的160个序列变异体进行分析。
线性表位的确定
利用PEPSCAN方法,我们对抗体6和已知抗体2B7抗各代表GM-CSFRα细胞外部分氨基酸序列的短区域的2442个肽的信号进行了筛选。各抗体抗所有肽的结合信号被平均以产生平均的背景信号,并且对于各个肽计算信号/背景比。对于抗体6和2B7两者,4或更高的信号/背景比被记作特异性的阳性信号。分析产生特异性阳性信号的肽序列的保守结合基序,并且发现抗体6优先结合相应于成熟人GM-CSFRα的226~230残基的YLDFQ基序,且2B7优先结合相应于成熟的人GM-CSFRα的278~281残基的DVRI基序。对于成熟受体的氨基酸序列的编号如SEQ ID NO:206所示。
PEPSCAN方法(肽结合扫描)
如先前文献所述[103],合成具有源自GMCSF的序列的大部分重叠的15-mer合成肽,并且使用***式(credit-card format)mini-PEPSCAN卡(具有3μl孔的455-孔板)进行筛选。在基于PEPSCAN的酶联免疫试验(ELISA)中测试抗体与各个肽的结合。含共价连接肽的455-孔***式聚丙烯卡与样品(例如10μg/ml抗体,或以PBS溶液稀释1000倍的血清,其含5%马血清(v/v)和5%卵清蛋白(w/v))和1%Tween80,或者在PBS溶液中温和封闭的情况下,与4%马血清(v/v)和1%Tween80共孵育(40℃,过夜)。清洗后,肽与抗-抗体过氧化物酶共孵育(1/1000稀释液,例如兔-抗-小鼠过氧化物酶,Dako)(1小时,25℃),然后,在清洗后,加入过氧化物酶底物2,2’-连氮基-双-3-乙基苯并噻唑磺酸盐(ABTS)和2μl/ml的3%H2O2。一小时后,测量显色。用CCD相机和图像处理***定量ELISA的显色。装置包括CCD-相机和55mm镜头(Sony CCD Video CamaraXC-77RR,Nikon micro-nikkor 55mm f/2.8镜头)、相机适配器(Sony相机适配器DC-77RR)和图像处理软件包Optima 6.5版(MediaCybernetics,Silver Spring,MD 20910,U.S.A.)。Optima运行于奔腾计算机***上。
试验材料和方法
生化配体结合试验
如WO01/66754[104]的实施例3所述制备纯化的scFv制剂。使用BAC方法[105]确定纯化的scFv制剂的蛋白质浓度。以50μl/孔用PBS稀释到2.5μg/ml的抗人IgG4在4℃下涂覆FluoronucTM96孔微滴定板过夜。以300μl/孔的PBS/0.1% Tween-20清洗板3次,然后用300μl/孔的溶于PBS的3% BSA在室温下封闭一小时。该板用300μl/孔的PBS/0.1%Tween-20再清洗3次,然后向各个孔中加入50μl在1%BSA/PBS中稀释至62.5ng/ml的人GM-CSFRα,并且板在室温下孵育1小时。如上所述清洗3次后,向各个孔中加入25μl样品材料,然后加入25μl在1%BSA/PBS中稀释至2nM的生物素化GM-CSF。为了确定全结合,仅缓冲液被用作样品材料。为了确定非特异性结合,在1%BSA中稀释至100nM的未标记GM-CSF被用作样品材料。在如上所述清洗3次前,板在室温下孵育1小时。向板的各个孔中加入50μl在DELFIATM分析缓冲液中稀释至100ng/ml的铕标记抗生蛋白链菌素(PerkinElmer),并且在用DELFIATM清洗缓冲液清洗7次之前,在室温下孵育30~60分钟。向板中加入50μl/孔的DELFIATM增强液,在读板器上于615nm处对样品进行读数。
TF-1增殖试验
从R&D***获得的、并且常规地保持在RPMI1640、10%FBS、1mM丙酮酸钠和4ng/ml GM-CSF中的TF-1细胞通过在分析培养基(RPMI 1640、5% FBS、1mM丙酮酸钠)中清洗3次、在分析培养基中重悬、以及在37℃下5%CO2中孵育7~24小时而使细胞饥饿。然后将细胞以1×105/ml的浓度重悬在分析培养基中,并且向96孔平底组织培养板的各个孔中加入100μl。在用分析培养基稀释之前,测试样品通过无菌过滤原液样品进行制备。然后,向各个细胞孔中加入50μl测试材料,并且将其在37℃下5% CO2中孵育45~60分钟。然后,向各个孔中加入50μl的以分析培养基稀释至EC80值的GM-CSF(或者对于某些批次的GM-CSF为0.4ng/ml),将板在加湿室内在37℃下5%CO2中孵育16小时。这代表了7pM GM-CSF的终浓度。为了测量细胞的增殖,向板的各个孔中加入20μl在分析培养基中稀释到5.0μCi/ml的3H-胸腺嘧啶,并将板在37℃下5% CO2中孵育4小时±30分钟。然后使用板收集器在96孔GF/C UnifilterTM板上收获细胞,并且清洗。在向过滤板的各孔中加入50μl MicroScint 20TM后,密封板,并且在TopCount读板器上计数。
人粒细胞形态改变试验
人的血沉棕黄层(来自输血服务的人血包装)与溶于0.9%NaCl的3%Dextran T-500等体积混合。然后将混合物以竖直位置孵育直至形成界面。收集上层,并且在histopaque 1.077密度梯度顶上成层,然后以400g离心40分钟,并且使其无制动停止。去除该梯度的上层,留下粒细胞球。通过在20ml冰水中重悬细胞30秒、然后立即加入冰冷的1.8%氯化钠裂解该球粒中残留的任何红血球。然后以1200rpm使细胞重新成球,并且以1×106/ml的浓度在分析培养基(RPMI 1640、10% FBS、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、25mM HEPES)中重悬。然后向96孔平底组织培养板的各个孔中加入100μl细胞。测试样品通过无菌过滤原液样品、并且在分析培养基中适当稀释而制备。
对于先导分离(lead isolation),50μl的测试样品随后加入细胞中,且将板在37℃下5% CO2中孵育45~60分钟。这代表了7pM GM-CSF的终浓度。然后向各个孔内加入50μl在分析培养基中稀释到0.4ng/ml的GM-CSF,并且在加湿箱内、在37℃下5% CO2中孵育4小时。
对于先导物优化,在分析培养基中稀释的过滤IgG4与溶于分析培养基的0.4ng/ml GM-CSF等体积混合。这代表了7pM GM-CSF的终浓度。然后向各个孔内加入100μl抗体/GM-CSF混合物。然后在加湿箱内、在37℃下5%CO2中孵育3小时。
加入冷甲醛达到1.25%的终浓度,并且细胞在4℃固定过夜。每孔通过流式细胞仪分析2000~5000个事件。然后,使用CellQuest得出各个样品的前向散射(FSC)的几何平均值。当计算几何平均值时,细胞被屏蔽(gate)以排除不相关的群体(如死亡细胞/碎片)。
猕猴粒细胞形态改变试验
在测量用GM-CSF刺激后的猕猴粒细胞的形态改变的试验中对抗体进行测试。从猕猴全血中纯化粒细胞,并且基本如人粒细胞形态改变试验所述进行试验。
使用生物传感器分析的结合亲和力数据
BIAcore 200***(Pharmacia Biosensor)用于测定scFv和IgG4与重组受体之间相互作用的动力学参数。Biosensor利用表面等离子共振的光学效应研究分析物分子与共价连接到右旋糖酐基质上的配体分子的相互作用所导致的表面浓度变化。典型地,在自由溶液中的分析物物质放过偶联的配体,并且随着局部SPR信号增加检测到任何结合。然后进入清洗期,在此期间,随着SPR信号降低观察到分析物物质的解离,其后,任何保留的分析物与配体剥离并以几个不同的分析物浓度重复该过程。在试验期间通常使用系列对照以确保绝对结合能力或偶联配体的动力学特征不发生显著改变。专有的hepes缓冲盐水(HBS-EP)通常被用作分析样品的主稀释液和解离相溶剂。试验数据相对于时间以共振单位(直接对应于SPR信号)记录。共振单位直接与结合的分析物的大小和量成正比。然后,BIA评估软件包可以被用于指定解离相(解离速率单位s-1)和缔合相(缔合速率单位M-1s-1)的速率常数。然后,这些数字使得能够计算缔合和解离亲和常数。
使用其中IgG4通过氨基蛋白A表面非共价捕获的单个试验估计IgG4的亲和性。然后重组纯化-标记的GM-CSF受体细胞外域的系列稀释液(从100~6.25nM)顺序经过IgG4。利用浓度(Bradford)和预测的非翻译后修饰的成熟多肽质量(39.7kDa)计算受体的摩尔浓度。以相同的模式分析两个独立的数据集中的每一个。使用设置为对缔合和解离速率进行同时整体计算的1:1朗缪尔模型对参考细胞校正数据进行拟合,Rmax值设定为全局的(global)。测定在各个周期中捕获的IgG4的水平以确保捕获的量在整个试验过程中保持稳定。此外,IgG4的解离速率被测定以判断是否需要对于基线漂移进行校正。然而,两种蛋白A相互作用被证明是可充分再现的和足够稳定的。数据的有效性由计算出的chi2和T值(参数值/偏移量)限制,其分别必须为<2和>100。
纯化标记的GM-CSFRα细胞外域的制备:
整合编码人GM-CSF受体α细胞外域的序列(SEQ ID NO:205,代表成熟GM-CSF R的1-298氨基酸)和鼠IL-3信号序列并且加入N-末端纯化标记的pEFBOS表达载体[106]被用于产生重组的N末端标记的GM-CSF受体细胞外域(ECD)多肽。利用标准程序标记的ECD多肽在CHO细胞内使用pEFBOS载体表达。该多肽也可称作纯化的GM-CSFRα细胞外域、或称作GM-CSFRα的可溶性细胞外域。
如Flag肽(DYKDDDE-SEQ ID NO:204)、Fc、生物素或his标签的任何适当的纯化标签都可以使用。可以使用任何适当的技术进行纯化,例如,Flag标记的ECD多肽(SEQ ID NO:203)可以在M2亲和层析柱上纯化,并且用FLAG肽洗脱。
单核细胞TNFα释放试验
单核细胞的纯化(单核细胞分离试剂盒—MiltenyiBiotec-130-053-301):
人血沉棕黄层(来自输血服务的人血包装)在histopaque 1.077密度梯度(Sigma,货号1077-1)顶上成层,并且细胞以400×g离心40分钟。在停止离心时不施加制动。然后,由界面处收集PBMC细胞。细胞在PBS中清洗,并以300×g离心10分钟成球,然后残留的红血球通过在20ml冰水中重悬15秒,接着立即加入冰冷的1.8%氯化钠进行裂解。然后将细胞以1200rpm离心5分钟成球,并且在600μlMACS缓冲液(PBS,2mM EDTA)中重悬。在加入200μl半抗原-抗体混合体(Hapten-antibody cocktail)(也是由试剂盒提供的)并混合之前,200μl由试剂盒提供的Fc封闭试剂被加入到细胞中并且混合。然后,在50ml MACS缓冲液中清洗两次之前,将细胞于4℃孵育15分钟。在加入200μl半抗原-抗体混合体并混合之前,将细胞球重悬在600μl MACS缓冲液中,然后加入200μl MACS抗-半抗原微球并混合。细胞于4℃孵育45分钟,然后在50ml MACS缓冲液中清洗并在500μlMACS缓冲液中重悬。在将细胞悬浮液加到柱子上之前,通过用3mlMACS缓冲液清洗准备单柱(Miltenyi Biotec 130-042-401)。收集的流出液为富集的单核细胞部分。用2×3ml MACS缓冲液洗柱,并且收集流出液。使用标准的流式细胞仪方法,通过以抗-CD14-PE染色检查单核细胞纯度。最终将细胞以4×106/ml浓度重悬在分析培养基中(RPMI 1640、10% FBS、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素)。
单核细胞的刺激:
向Costar 96孔平底组织培养板的各个孔内加入50μl细胞。向所有孔内加入25μl的150μg/ml rhIFNγ(R&D systyems)。在分析培养基中稀释的过滤IgG4与溶于分析培养基的56ng/ml(4nM)GM-CSF等体积混合。这代表1nM的GM-CSF终浓度。然后,将75μl的抗体/GM-CSF混合物加入到各个孔内。对照为仅具有GM-CSF的孔、或无GM-CSF和无抗体的孔。然后,将板在加湿室内、在37℃下以5%CO2孵育18小时。然后收集上清液以通过ELISA测试TNFα水平。
TNFα ELISA(R&D Systems ELISA Development System DY210):
用100μl溶于PBS中的4μg/ml捕获抗体室温下涂覆FluoronuncImmunosorb ELISA板过夜。然后,用PBS/0.1%Tween清洗板三次,并且用300μl/孔的溶于PBS中的3% Marvel在室温封闭1小时。用PBS/0.1% Tween清洗板三次。100μl来自测试板的上清液被移至ELISA板,并且在分析培养基中稀释的TNF-α被滴定液被加入到对照孔内。在以PBS/0.1% Tween清洗4-5次之前,将板在室温下孵育2小时。100μl在1%Marvel/PBS中稀释至300ng/ml的检测抗体被加入到板的各个孔内,并在以PBS/0.1% Tween清洗4-5次之前,将板在室温下再孵育2小时。抗生蛋白链菌素-铕(PerkinElmer 1244-360)于DELFIA分析缓冲液(PerkinElmer 4002-0010)中以1:1000进行稀释,并且以100μl/孔加入,然后在室温下孵育45分钟。然后,将板在DELFIA清洗缓冲液中洗7次,然后加入100μl/孔增强液(PerkinElmer 4001-0010),并且使用读板器在615nm处读数。粒细胞存活试验
如中性粒细胞活化试验(形态改变试验)所述,从人血沉棕黄层中纯化细胞、在分析培养基(RPMI 1640、Glutamax、10% FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素)中清洗,并且以1×106/ml的浓度在分析培养基中重悬。100μl细胞被加入到Costar 96孔平底组织培养板的各个孔内。过滤的抗体原液在分析培养基中稀释,并且与0.4ng/ml的GM-CSF等体积混合。这代表7pM GM-CSF的终浓度。对照孔只含培养基或只含GM-CSF。然后,100μl测试样品/GM-CSF混合物被加入板的各个孔内,并且将细胞在加湿箱内37℃/5% CO2下孵育68小时。向各孔中加入20μl的AlamarBlue,并且板在加湿箱内37℃/5% CO2下再孵育24小时。然后,使用读板器在560nm和590nm处读数。
抗-GM-CSFRα抗体在TF-1增殖试验中及在人和猕猴粒细胞形态改变试验中的pA2分析
定量竞争性拮抗剂的亲和性的主要药学工具为Schild分析。使用该途径,可以确定在功能试验中估测拮抗剂亲和性的***独立的手段。该方法基于拮抗剂浓度及其亲和性决定激动剂反应的对抗作用的概念。因为对抗作用可以被量化并且拮抗剂的浓度是已知的,所以,拮抗剂的亲和性可以被确定。通过测量(在有或无拮抗剂时测量)激动剂的等活性浓度比值(称作剂量比(DR))对该对抗作用进行量化。
可以通过使用激动剂(典型地GM-CSF)在无结合元件时的EC50与该激动剂在有单浓度的结合元件存在时的EC50的比值计算剂量比。然后,表达为log(DR-1)的剂量比可以在关于log[结合元件]的线性回归中使用以产生Schild回归。因此,对于结合元件的每个浓度存在相应的DR值;将这些值绘制为关于log[结合元件]上的log(DR-1)的回归。如果对抗作用是竞争性的,则根据方程式如下的Schild公式在log(DR-1)和log[结合元件]之间具有线性关系:
Log(DR-1)=log[A]-log KA
在这些条件下,坐标的0值给出其中log[a]=log KA的X轴的截距。因此,给出log(DR-1)=0的结合元件浓度等于log KA,结合元件-受体复合物的平衡分离常数。这是与***无关的、对于每一个含该受体的细胞***都精准的结合元件亲和性定量方法。
因为KA值由对数曲线获得,因此其为log标准分布。该特定浓度的负对数被经验地称作pA2,产生激动剂剂量效应曲线的两倍移动的拮抗剂浓度。拮抗效力可以通过以下公式由产生单一剂量比值的单一拮抗剂浓度计算pA2进行量化,其中
pA2=log(DR-1)-log[a]
[a]=必须使拮抗剂浓度加倍以得到原始第二大反应的拮抗剂摩尔浓度。
DR=通过测量在有和无拮抗剂时测量的激动剂的等活性浓度的比值而定量的剂量比。
pA2可以从剂量效应试验数据计算。
在集落形成试验中GM-CSF介导的血细胞祖细胞体外分化的抑制
造血祖细胞富集的外周血单核细胞从进行祖细胞动员和脱落作为其标准临床处理的部分的供者获得。样品进行去识别化(de-identified),并且细胞在使用前不进行冷冻保藏。5×104单核细胞在终浓度为10ng/ml的人GM-CSF存在下在半固体琼脂中培养[107]。测试的亲和力成熟人mAb和已知的鼠抗体2B7以10、5、1、0.5、0.1或0.05μg/ml的终浓度被加到琼脂培养物内。亲本的人mAb 28G5和同种型匹配的阴性对照人mAb(CAT001)以10μg/ml的单一浓度进行测定。出于对照目的,mAb也测定其阻断由SCF、IL-3和G-CSF组合(Croker等2004)所激发的集落形成的能力以及在无细胞因子存在时其对集落形成的影响。在具有10% CO2的空气中孵育14天后评估集落形成(>40个细胞的聚集)。集落用戊二醛固定,并且使用解剖显微镜以35倍放大率进行计数。
人GM-CSFRαβ转基因小鼠中的GM-CSF体内生物活性的抑制
产生在MHC I类促进因子的调控下表达人GM-CSFR的α和β链两者的转基因(Tg)小鼠,并且已有文献描述了对于给予huGM-CSF的体内脾和血细胞反应[108]。为对huGM-CSFRα特异性mAb拮抗剂活性进行体内分析,从Tg小鼠移植骨髓至野生型鼠体内可以产生嵌合型动物,从而转基因huGM-CSFRαβ表达被限于骨髓来源的造血细胞,并且因此更类似于内源受体的表达特征。在这些huGM-CSFRαβTg嵌合小鼠中,给予huGM-CSF导致脾重量的增加和循环血单核细胞的边缘化。
Tg嵌合小鼠的产生
供体Tg鼠的股骨和胫骨被去除,并且以无菌PBS加3%小牛血清(FCS)冲洗骨髓。然后通过23G针抽取骨髓塞以获得单细胞悬浮液,然后用冷PBS+3% FCS清洗细胞一次,并且通过不锈钢丝网。然后通过在0.168M氯化铵缓冲液中裂解去除红细胞,之后用磷酸缓冲盐水(PBS)+3% FCS再清洗细胞2次,然后再次通过不锈钢丝网。为了进一步去除死细胞和细胞碎片,悬浮液通过FCS垫离心。活细胞以球粒回收,用PBS清洗一次,并且以2.5×107/ml在PBS中重悬。5-8周龄的接受体C57/BL6小鼠以3小时间隔的550Rad两次致死剂量进行照射。接受体小鼠被静脉(i.v.)注射0.2ml细胞悬浮液(即5×106细胞/小鼠),并且随后其饮用水中加入0.02M新霉素在带盖的盒中圈养3周。6周后,通过使用对huGM-CSFRα和β链特异性的mAb对外周血进行FACS分析以测定再造。
Tg嵌合小鼠的GM-CSF处理和后续分析:
Tg嵌合小鼠用500ng huGM-CSF经皮下途径(s.c)每日处理2次,处理4天。对于抗体拮抗剂活性的分析,在开始GM-CSF处理之前,在第一天,5只小鼠构成的组经腹膜(i.p)途径给予选择剂量的mAb(参见下文)。在第5天,抽取0.2ml血液用于使用ADVIA TM血液学***(Bayer Diagnotics)对循环白细胞群(特别是血单核细胞)进行分析。然后,致死动物,取出脾以进行重量测量。
人外周血单核细胞内源表达人TNFα和IL-6的抑制
人血沉棕黄层(来自输血服务的人血包装)在histopaque 1.077密度梯度(Sigma,货号1077-1)顶上成层,并且细胞以400×g离心40分钟。当停止离心时不施加制动。然后,由界面处收集PBMC细胞。细胞在PBS中清洗,并以300×g离心10分钟成球,然后通过在20ml冰水中重悬15秒,接着立即加入冰的1.6%氯化钠裂解残留的红细胞。然后将细胞以1200rpm离心5分钟成球,并且在10ml的10%FBS/RPMI和1%青霉素链霉素中重悬。然后将细胞稀释到5×106/ml浓度。每个孔分配110μl的细胞(5.5×105/孔),并使细胞在5% CO2中在37℃下放置1小时。以下试剂作为单一终浓度对照被加入:PHA(5μg/ml)、LPS(25μg/ml)、GM-CSF(10ng/ml)和同种型对照(50μg/ml)。抗体6以最终起始浓度达到50μg/ml的5倍稀释系列加入。然后,将板在5%CO2中、在37℃下孵育72小时。72小时后收集上清液,并且使用以下R&D ELISA试剂盒(hTNF-α R&D DuosetELISA development system DY210和hIL-6 R&D Duoset ELISAdevelopment system DY206)计算TNFα和IL-6的水平。根据供货商的建议进行ELISA。
表1:从28G5的优化分离得到的IgG4非胚系抗体对GM-CSF诱导的TF-1细胞增殖的抑制。在存在浓度增加的IgG4抗体的情况下,以单一浓度的GM-CSF诱导TF-1细胞的增殖。氚标记的胸腺嘧啶的掺入被测量,并且计算抗体的IC50值。数据为n≥3的代表数据。SEM(平均值的标准误)被显示。
IgG4 | IC50±SEM(pM) |
2B7抗体1抗体2抗体4抗体5抗体6抗体7抗体8抗体9抗体10抗体11抗体12抗体13抗体14抗体15抗体16抗体17抗体18抗体19抗体20 | 1575±490.55.3±0.3315.0±4.7148.0±8.339.3±5.390.97±0.03393.8±24.634.5±2.6340.8±7.1555.3±3.739.0±1.0246.3±19.81106.0±174.916.3±4.9163.8±7.312.8±3.314.3±2.813.3±3.423.8±4.39.8±2.8 |
表2:在28G5的优化过程中分离的抗-GM-CSFRα IgG4非胚系抗体的动力学分析。IgG4抗体被固定于蛋白-A覆盖的芯片的表面,并且一系列的纯化标记的GM-CSFRα ECD稀释液经过IgG4。使用允许质量传递的Langmuir1:1同时kakd对数据进行拟合。
IgG4 | KD(nM) |
抗体1 | 0.264 |
抗体2 | 0.376 |
抗体4 | 4.07 |
抗体5 | 0.847 |
抗体6 | 0.139 |
抗体7 | 3.93 |
抗体8 | 0.552 |
抗体10 | 1.50 |
抗体12 | 3.02 |
抗体14 | 0.502 |
抗体15 | 1.03 |
抗体16 | 1.14 |
抗体17 | 0.193 |
抗体19 | 0.388 |
抗体20 | 0.127 |
抗体9和11的数据是双相的。
表3:在28G5的优化过程中分离的IgG4非胚系抗体对GM-CSF诱导的人粒细胞形态改变的抑制。在存在浓度增加的IgG4抗体的情况下,以单一浓度的GM-CSF处理人粒细胞。使用流式细胞仪测量粒细胞的形态改变,并且计算抗体的IC50值。
IgG4 | IC50±SD(pM) |
2B7抗体1抗体2抗体5 | 477±49112.6±8.020.7±11.030.0 |
抗体6抗体9抗体10抗体11抗体16抗体20 | 13.3±11.844.062.090.016.07.8 |
表4:GM-CSF诱导的单核细胞TNFα释放的抑制。在存在浓度增加的IgG4非胚系抗体的情况下,以单一浓度的GM-CSF处理人单核细胞。通过ELISA测量TNFα的释放,并且计算抗体的IC50值。
IgG4 | IC50±SD(pM) |
抗体1 | 78.8±54.6 |
抗体2抗体5抗体6抗体9抗体10 | 103.3±63.167.043.0±19.774.0139.0 |
序列表的索引
在附加的序列表中,列出包括亲本克隆和19个来自优化组的克隆的20个抗体克隆的核酸和氨基酸(“PRT”)序列。抗体被编号为Ab1~Ab20。亲本克隆为抗体3,由SEQ ID NOS:21~23和SEQ IDNOS:211~212代表。
以下列表通过SEQ ID NOS号码定位,其中所示分子的序列显示如下:
(nt=核苷酸序列;aa=氨基酸序列)
1 抗体 01 VH nt 22 抗体 03 VH aa
2 抗体 01 VH aa 23 抗体 03 VH CDR1 aa
3 抗体 01 VH CDR1 aa 24 抗体 03 VH CDR2 aa
4 抗体 01 VH CDR2 aa 25 抗体 03 VH CDR3 aa
5 抗体 01 VH CDR3 aa 26 抗体 03 VL nt
6 抗体 01 VL nt 27 抗体 03 VL aa
7 抗体 01 VL aa 28 抗体 03 VL CDR1 aa
8 抗体 01 VL CDR1 aa 29 抗体 03 VL CDR2 aa
9 抗体 01 VL CDR2 aa 30 抗体 03 VL CDR3 aa
10 抗体 01 VL CDR3 aa 31 抗体 04 VH nt
11 抗体 02 VH nt 32 抗体 04 VH aa
12 抗体 02 VH aa 33 抗体 04 VH CDR1 aa
13 抗体 02 VH CDR1 aa 34 抗体 04 VH CDR2 aa
14 抗体 02 VH CDR2 aa 35 抗体 04 VH CDR3 aa
15 抗体 02 VH CDR3 aa 36 抗体 04 VL nt
16 抗体 02 VL nt 37 抗体 04 VL aa
17 抗体 02 VL aa 38 抗体 04 VL CDR1 aa
18 抗体 02 VL CDR1 aa 39 抗体 04 VL CDR2 aa
19 抗体 02 VL CDR2 aa 40 抗体 04 VL CDR3 aa
20 抗体 02 VL CDR3 aa 41 抗体 05 VH nt
21 抗体 03 VH nt 42 抗体 05 VH aa
43 抗体 05 VH CDR1 aa 72 抗体 08 VH aa
44 抗体 05 VH CDR2 aa 73 抗体 08 VH CDR1 aa
45 抗体 05 VH CDR3 aa 74 抗体 08 VH CDR2 aa
46 抗体 05 VL nt 75 抗体 08 VH CDR3 aa
47 抗体 05 VL aa 76 抗体 08 VL nt
48 抗体 05 VL CDR1 aa 77 抗体 08 VL aa
49 抗体 05 VL CDR2 aa 78 抗体 08 VL CDR1 aa
50 抗体 05 VL CDR3 aa 79 抗体 08 VL CDR2 aa
51 抗体 06 VH nt 80 抗体 08 VL CDR3 aa
52 抗体 06 VH aa 81 抗体 09 VH nt
53 抗体 06 VH CDR1 aa 82 抗体 09 VH aa
54 抗体 06 VH CDR2 aa 83 抗体 09 VH CDR1 aa
55 抗体 06 VH CDR3 aa 84 抗体 09 VH CDR2 aa
56 抗体 06 VL nt 85 抗体 09 VH CDR3 aa
57 抗体 06 VL aa 86 抗体 09 VL nt
58 抗体 06 VL CDR1 aa 87 抗体 09 VL aa
59 抗体 06 VL CDR2 aa 88 抗体 09 VL CDR1 aa
60 抗体 06 VL CDR3 aa 89 抗体 09 VL CDR2 aa
61 抗体 07 VH nt 90 抗体 09 VL CDR3 aa
62 抗体 07 VH aa 91 抗体 10 VH nt
63 抗体 07 VH CDR1 aa 92 抗体 10 VH aa
64 抗体 07 VH CDR2 aa 93 抗体 10 VH CDR1 aa
65 抗体 07 VH CDR3 aa 94 抗体 10 VH CDR2 aa
66 抗体 07 VL nt 95 抗体 10 VH CDR3 aa
67 抗体 07 VL aa 96 抗体 10 VL nt
68 抗体 07 VL CDR1 aa 97 抗体 10 VL aa
69 抗体 07 VL CDR2 aa 98 抗体 10 VL CDR1 aa
70 抗体 07 VL CDR3 aa 99 抗体 10 VL CDR2 aa
71 抗体 08 VH nt 100 抗体 10 VL CDR3 aa
101 抗体 11 VH nt 130 抗体 13 VL CDR3 aa
102 抗体 11 VH aa 131 抗体 14 VH nt
103 抗体 11 VH CDR1 aa 132 抗体 14 VH aa
104 抗体 11 VH CDR2 aa 133 抗体 14 VH CDR1 aa
105 抗体 11 VH CDR3 aa 134 抗体 14 VH CDR2 aa
106 抗体 11 VL nt 135 抗体 14 VH CDR3 aa
107 抗体 11 VL aa 136 抗体 14 VL nt
108 抗体 11 VL CDR1 aa 137 抗体 14 VL aa
109 抗体 11 VL CDR2 aa 138 抗体 14 VL CDR1 aa
110 抗体 11 VL CDR3 aa 139 抗体 14 VL CDR2 aa
111 抗体 12 VH nt 140 抗体 14 VL CDR3 aa
112 抗体 12 VH aa 141 抗体 15 VH nt
113 抗体 12 VH CDR1 aa 142 抗体 15 VH aa
114 抗体 12 VH CDR2 aa 143 抗体 15 VH CDR1 aa
115 抗体 12 VH CDR3 aa 144 抗体 15 VH CDR2 aa
116 抗体 12 VL nt 145 抗体 15 VH CDR3 aa
117 抗体 12 VL aa 146 抗体 15 VL nt
118 抗体 12 VL CDR1 aa 147 抗体 15 VL aa
119 抗体 12 VL CDR2 aa 148 抗体 15 VL CDR1 aa
120 抗体 12 VL CDR3 aa 149 抗体 15 VL CDR2 aa
121 抗体 13 VH nt 150 抗体 15 VL CDR3 aa
122 抗体 13 VH aa 151 抗体 16 VH nt
123 抗体 13 VH CDR1 aa 152 抗体 16 VH aa
124 抗体 13 VH CDR2 aa 153 抗体 16 VH CDR1 aa
125 抗体 13 VH CDR3 aa 154 抗体 16 VH CDR2 aa
126 抗体 13 VL nt 155 抗体 16 VH CDR3 aa
127 抗体 13 VL aa 156 抗体 16 VL nt
128 抗体 13 VL CDR1 aa 157 抗体 16 VL aa
129 抗体 13 VL CDR2 aa 158 抗体 16 VL CDR1 aa
159 抗体 16 VL CDR2 aa 188 抗体 19 VL CDR1 aa
160 抗体 16 VL CDR3 aa 189 抗体 19 VL CDR2 aa
161 抗体 17 VH nt 190 抗体 19 VL CDR3 aa
162 抗体 17 VH aa 191 抗体 20 VH nt
163 抗体 17 VH CDR1 aa 192 抗体 20 VH aa
164 抗体 17 VH CDR2 aa 193 抗体 20 VH CDR1 aa
165 抗体 17 VH CDR3 aa 194 抗体 20 VH CDR2 aa
166 抗体 17 VL nt 195 抗体 20 VH CDR3 aa
167 抗体 17 VL aa 196 抗体 20 VL nt
168 抗体 17 VL CDR1aa 197 抗体 20 VL aa
169 抗体 17 VL CDR2 aa 198 抗体 20 VL CDR1 aa
170 抗体 17 VL CDR3 aa 199 抗体 20 VL CDR2 aa
171 抗体 18 VH nt 200 抗体 20 VL CDR3 aa
172 抗体 18 VH aa 201 GM-CSFRα线性残基序列
173 抗体 18 VH CDR1 aa 202 人GM-CSFRα全长氨基酸
174 抗体 18 VH CDR2 aa 序列
175 抗体 18 VH CDR3 aa 203 FLAG-示踪人GM-CSFRα
176 抗体 18 VL nt 细胞外域
177 抗体 18 VL aa 204 FLAG肽
178 抗体 18 VL CDR1 aa 205 人GM-CSFRα细胞外域的
179 抗体 18 VL CDR2 aa 氨基酸序列
180 抗体 18 VL CDR3 aa 206 成熟GM-CSFRα
181 抗体 19 VH nt 207 抗体 1 VL nt
182 抗体 19 VH aa 208 抗体 1 VL aa
183 抗体 19 VH CDR1 aa 209 抗体 2 VL nt
184 抗体 19 VH CDR2 aa 210 抗体 2 VL aa
185 抗体 19 VH CDR3 aa 211 抗体 3 VL nt
186 抗体 19 VL nt 212 抗体 3 VL aa
187 抗体 19 VL aa 213 抗体 4 VL nt
214 抗体 4 VL aa 237 抗体16 VL nt
215 抗体 5 VL nt 238 抗体16 VL aa
216 抗体 5 VL aa 239 抗体17 VL nt
217 抗体 6 VL nt 240 抗体17 VL aa
218 抗体 6 VL aa 241 抗体18 VL nt
219 抗体 7 VL nt 242 抗体18 VL aa
220 抗体 7 VL aa 243 抗体19 VL nt
221 抗体 8 VL nt 244 抗体19 VL aa
222 抗体 8 VL aa 245 抗体20 VL nt
223 抗体 9 VL nt 246 抗体20 VL aa
224 抗体 9 VL aa 247 抗体6 VH nt
225 抗体 10 VL nt 248 抗体6 VH aa
226 抗体 10 VL aa 249 抗体6 VL nt
227 抗体 11 VL nt 250 抗体6 VL aa
228 抗体 11 VL aa 251 VH FR1 aa
229 抗体 12 VL nt 252 VH FR2 aa
230 抗体 12 VL aa 253 VH FR3 aa
231 抗体 13 VL nt 254 VH FR4 aa
232 抗体 13 VL aa 255 VL FR1 aa
233 抗体 14 VL nt 256 VL FR2 aa
234 抗体 14 VL aa 257 VL FR3 aa
235 抗体 15 VL nt 258 VL FR4 aa
236 抗体 15 VL aa
抗体1~20的VL域核苷酸序列不包括在SEQ ID NOS:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186和196中的3’末端所示的gcg密码子。相应地,VL域氨基酸序列各不包括SEQ ID NOS:7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187和197中的C末端Ala残基。Ala113残基和相应的gcg密码子不在抗体1~20中表达。书面序列与胚系片段、尤其JL2的对比表明Ala残基和相应gcg密码子不形成VL域的部分。
112位置处的Gly残基在表达的scFv和IgG序列中出现。然而,该残基并未在形成VL域的框架4区的人胚系j片段序列(如JL2)中出现。Gly残基不被认为是VL域的部分。
为了表达IgG的轻链,编码抗体轻链的核苷酸序列被提供,包括编码VL域的第一外显子、编码CL域的第二外显子和分隔第一外显子和第二外显子的内含子。在正常条件下,内含子通过细胞的mRNA加工机制剪切掉,从而将第一外显子的3’端与第二外显子的5’端连接。因此,当具有所述核苷酸序列的DNA表达为RNA时,第一和第二外显子被剪接到一起。剪接的RNA的翻译产生包括VL和CL域的多肽。剪接后,在112位的Gly由VL域框架4序列的最后一个碱基和CL域的前两个碱基编码。
抗体1~20的VL域序列为如上所示的SEQ ID NOS:186~246。VL域核苷酸序列以作为最终密码子的eta结束,并且Leu为相应的VL域氨基酸序列中的最终氨基酸残基。
除以SEQ ID NOS:51、52、56、57、216和217表示的胚系VH和VL域序列外,抗体6的非胚系VH和VL域序列在SEQ ID NOS:247~250中显示。
参考文献
在该公开内容中提及的所有文献都通过引用被包含于此。
1 Haman等,Journal of B iological Chemistry 274(48):34155-34163 1999
2 Nicola NA;Wycherley A;Boyd AW;Layton JE;Cary D;Metcalf D Blood,82(6)pl724-31(1993)
3 Plückthun,A.Bio/Technology 9:545-551(1991)
4 Chadd HE和Chamow SM(2001)Current Opinion inBiotechnology 12:188-194
5 Andersen DC和Krummen L(2002)Current Opinion inBiotechnology 13:117
6 Larrick JW和Thomas DW(2001)Current Opinion inBiotechnology 12:411-418
7 Sambrook和Russell,Molecular Cloning:a Laboratory Manual:3rd edition,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press
8 Ausubel等编辑,Short Protocols in Molecular Biology:ACompendium of Methodsfrom Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,第4版1999
9 Wold等Multivariate data analysis in chemistry.Chemometrics-Mathematics and Statistics in Chemistry(编辑:B.Kowalski),D.Reidel Publishing Company,Dordrecht,Holland,1984(ISBN 90-277-1846-6)
10 Norman等Applied Regression Analysis.Wiley-Interscience;第3版(April 1998)ISBN:0471170828
11 Kandel,Abraham & Backer,Eric.Computer-AssistedReasoning in Cluster Analysis.Prentice Hall PTR,(May 11,1995),ISBN:0133418847
12 Krzanowski,Wojtek.Principles of Multivariate Analysis:AUser′s Perspective(Oxford Statistical Science Series,No 22(Paper)).Oxford University Press;(December 2000),ISBN:0198507089
13 Witten,Ian H.& Frank,Eibe.Data Mining:Practical MachineLearning Tools and Techniques with Java Implementations.MorganKaufmann;(October 11,1999),ISBN:1558605525
14Denison David G.T.(编者),Christopher C.Holmes,Bani K.
15Ghose,Arup K.& Viswanadhan,Vellarkad N.CombinatorialLibrary Design and Evaluation Principles,Software,Tools,andApplications in Drug Discovery.ISBN:0-8247-0487-8
16 Chothia C.等Journal Molecular Biology(1992)227,799-817
17 Al-Lazikani等Journal Molecular Biology(1997)273(4),927-948
18 Chothia等Science,223,755-758(1986)
19 Whitelegg,N.R.u.和Rees,A.R(2000).Prot.Eng.,12,815-824
20 Guex,N.和Peitsch,M.C.Electrophoresis (1997)18,2714-2723
21 Voet & Voet,Biochemistry,第2版,(Wiley)1995.
22 Marks等Bio/Technology,1992,10:779-783
23 Kay,B.K.,Winter,J.,和McCafferty,J.(1996)Phage Displayof Peptides and Proteins:A Laboratory Manual,San Diego:AcademicPress.
24 Stemmer,Nature,1994,370:389-391
25 Gram等,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,89:3576-3580
26 Barbas等,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91:3809-3813
27 Schier等,1996,J.Mol.Biol.263:551-567
28 Ledermann J.A.等(1991)Int.J.Cancer 47:659-664
29 Bagshawe K.D.等(1991)Antibody,Immunoconjugates andRadiopharmaceuticals 4:915-922
30 Robinson,J.R.编辑,Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978
31 Ritz,S.A.,M.J.Cundall等(2002).Am J Respir Cell MolBiol 27(4):428-35.
32 Ritz,S.A.,M.R.Stampfli,等(2002).Trends Immunol 23(8):396-402.
33 Woolley,K.L.等(1995).Am J Respir Crit Care Med,151,1915-24.
34 Kotsimbos,A.T.,M.Humbert等(1997).J Allergy ClinImmunol 99(5):666-72.
35 Yamashita N.等,Cell.Immunol 2002 oct;219(2);92-97
36 Ohta K.等J Allergy Clin Immunol.1999 Nov;104(5):1024-30
37 Stampfli,M.R.,R.E.Wiley等(1998).J Clin Invest 102(9):1704-14.
38 Gates,E.C,B.U.Gajewska等(2003).J Allergy ClinImmunol 111(5):1076-86.
39 Campbell,I.K.等(1997)Annal Res Dis,56,364-368.
40 BlSCHOF,R.J.,D.ZAFIROPOULOS,J.A.HAMILTON和I.K.CAMPBELL(2000)Clin Exp Immunol,119,361-367.
41 Campbell,I.K.,M.J.Rich等(1998).J Immunol 161(7):3639-44.
42 Hamilton,J.A.(2002).Trends Immunol 23(8):403-8.
43 Yang,Y.H.和J.A.Hamilton(2001)Arthritis Rheumatol,44,111-119
44 Cook,A.D.,E.L.Braine等(2001).Arthritis Res 3(5):293-8.
45 Field,M.和L.Clinton(1993).The Lancet 342:1244.
46 Firestein GS,Alvaro-Gracia JM,Maki R.1990 J.Immunolmay 1;144(9):3347-53
47 Leizer T等1990 Blood 1990 Nov 15;76(10):1989-96
48 Fiehn C等,Z Rheumatol 1992 May-Jun;51(3):1221-126
49 de Vries,E.G.等(1991)Lancet,338,517-518.
50 Hazenberg BP等Blood 1989 Dec;74(8):2769-70
51 Barnes和Hansel(2004).Lancet,364:985-96.
52 Barnes,P.J.(2000).Chest,117:10S-14S
53 McManus,T.E.等(2005)American Thoracic SocietyMeeting,May 2005.
54 Vlahos,R.等(2005).″GM-CSF is a key pathogenic mediatorin experimental COPD.″European Respiratory Society Meeting,Sept2005
55 McQualter JL等(2001)J Exp Med.194:873-82
56 Bagby GC Jr等1988 J Clin Invest.4:1430-6.
57 Estrov Z等(1986)Cancer Res.46:6456-61.
58 Barak Y等1981 Am J Hematol.10:269-75.
59 Gualtieri RJ等1988 Exp Hematol.16:613-9.
60 Suda T等1982 Leuk Res.6:43-53.
61 Gualtieri RJ等1989 Blood.74:2360-7
62 Largaespada DA等(1996)Nat.Genet.12:137-43
63 Iversen,P.O.等(1997).Blood 90(12):4910-7.
64 Wang等,1994 Exp mol Pathol
65 Plenz等,Art.Thrombosis and Vascular biology 1997
66 Takashi等,1996 Circulation 93,1185-1193
67 Biwa T等,JBC 1998 273:28305-28313
68 Makheja等,Atherosclerosis 1989,76155-661
69 Naito等,1992 J Nutri sci Vitamin 38:255-264
70 Hayashi等,Atherosclerosis 1991 91:107-116
71 Villa等1994 J Clin Invest 93:1243
72 Van Put DJ等,1995 Eur J Pharmacol 294:753-761
73 Voisard等,1994 Int J Cardiol 43:257-267
74 Yamada等,1993:Artery 20:253-267
75 Sakai等,1999 Arterioscler Thromb vase biol 19:1726-1733
76 Gearing等EMBO J.8(12):3667-3676(1989)
77 Crosier,K.等PNAS 88:7744-7748 1991
78 Raines,M.等PNAS 88:8203-8207 1991
79 Wess,L.In:BioCentury,The Bernstein Report onBioBusiness,12(42),A1-A7,2004
80 Haan & Maggos(2004)BioCentury,12(5):A1-A6
81 Koide等(1998)Journal of Molecular Biology,284:1141-1151.
82 Nygren等(1997)Current Opinion in Structural Biology,7:463-469
83 Kontermann,R & Dubel,S,Antibody Engineering,Springer-Verlag New York,LLC;2001,ISBN:3540413545
84 Mendez,M.等(1997)Nature Genet,15(2):146-156
85 Knappik等J.Mol.Biol.(2000)296,57-86
86 Krebs等Journal of Immunological Methods 254 2001 67-84
87 Ward,E.S.等,Nature 341,544-546(1989)
88 McCafferty等(1990)Nature,348,552-554
89 Holt等(2003)Trends in Biotechnology 21,484-490
90 Bird等,Science,242,423-426,1988;
91 Huston等,PNAS USA,85,5879-5883,1988
92 Holliger,P.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448,1993
93 Reiter,Y.等,Nature Biotech,14,1239-1245,1996
94 Hu,S.等,Cancer Res.,56,3055-3061,1996.
95 Holliger,P.和Winter G.Current Opinion Biotechnol 4,446-449 1993
96 Ridgeway,J.B.B.等,Protein Eng.,9,616-621,1996
97 Ann N Y Acad Sci.1971 Dec 31,190:382-93.
98 Kabat,E.A.等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest.第4版 US Department of Health and Human Services.1987
99 Kabat,E.A.等(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版US Department of Health and HumanServices,Public Service,NIH,Washington.
100 Persic等1997Gene 187;9-18
101 Hanes J等(2000)Methods in Enzymology,Vol 328:24.
102 Vaughan TJ等(1996)Nature Biotechnology Vol 14:309
103 Slootstra-JW;Puijk-WC;Ligtvoet-GJ;Langeveld-JP;Meloen-RH(1996).Mol-Divers.1:87-96
104 WO01/66754 Cambridge Antibody Technology Limited;Vaughan;Wilton;Smith;Main
105 P.K.Smith,等,Anal.Biochem.150(1985),pp.76-85
106 S.Mizushima和S.Nagata Nucleic Acids Research,Vol 18;No 17 1990pp 5322
107 Clin Haematol.1979 Jun;8(2):263-85.Metcalf D.
108 Nishijima,I.,T.Nakahata,等(1997).Blood 90(3):1031-8.
序列表
<110>医学免疫有限公司 深思操作有限公司
E·S·科汉
R·R·明特
P·R·哈里森
M·A·斯利曼
A·D·纳什
L·J·法布里
<120>GM-CSF受体结合元件
<130>HMK/CP6442578
<140>PCT/GB2007/001108
<141>2007-03-27
<150>US 60/786569
<151>2006-03-27
<160>258
<170>Cambridge Antibody Technology patent software version 1.0
<210>1
<211>360
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab1
<400>1
<210>2
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab1
<400>2
<210>3
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab1
<400>3
<210>4
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab1
<400>4
<210>5
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab1
<400>5
<210>6
<211>339
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab1
<400>6
<210>7
<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab1
<400>7
<210>8
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab1
<400>8
<210>9
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab1
<400>9
<210>10
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab1
<400>10
<210>11
<211>360
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab2
<400>11
<210>12
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab2
<400>12
<210>13
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab2
<400>13
<210>14
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab2
<400>14
<210>15
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab2
<400>15
<210>16
<211>339
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab2
<400>16
<210>17
<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab2
<400>17
<210>18
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab2
<400>18
<210>19
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab2
<400>19
<210>20
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab2
<400>20
<210>21
<211>360
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab3
<400>21
<210>22
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab3
<400>22
<210>23
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab3
<400>23
<210>24
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab3
<400>24
<210>25
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab3
<400>25
<210>26
<211>339
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab3
<400>26
<210>27
<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab3
<400>27
<210>28
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab3
<400>28
<210>29
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab3
<400>29
<210>30
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab3
<400>30
<210>31
<211>360
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab4
<400>31
<210>32
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab4
<400>32
<210>33
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab4
<400>33
<210>34
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab4
<400>34
<210>35
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab4
<400>35
<210>36
<211>339
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab4
<400>36
<210>37
<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab4
<400>37
<210>38
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab4
<400>38
<210>39
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab4
<400>39
<210>40
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab4
<400>40
<210>41
<211>360
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab5
<400>41
<210>42
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab5
<400>42
<210>43
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab5
<400>43
<210>44
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab5
<400>44
<210>45
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab5
<400>45
<210>46
<211>339
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab5
<400>46
<210>47
<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab5
<400>47
<210>48
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab5
<400>48
<210>49
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab5
<400>49
<210>50
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab5
<400>50
<210>51
<211>360
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab6
<400>51
<210>52
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab6
<400>52
<210>53
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab6
<400>53
<210>54
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab6
<400>54
<210>55
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab6
<400>55
<210>56
<211>339
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab6
<400>56
<210>57
<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab6
<400>57
<210>58
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab6
<400>58
<210>59
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab6
<400>59
<210>60
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab6
<400>60
<210>61
<211>360
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab7
<400>61
<210>62
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab7
<400>62
<210>63
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab7
<400>63
<210>64
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab7
<400>64
<210>65
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab7
<400>65
<210>66
<211>339
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab7
<400>66
<210>67
<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab7
<400>67
<210>68
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab7
<400>68
<210>69
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab7
<400>69
<210>70
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab7
<400>70
<210>71
<211>360
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab8
<400>71
<210>72
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab8
<400>72
<210>73
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab8
<400>73
<210>74
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab8
<400>74
<210>75
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab8
<400>75
<210>76
<211>339
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab8
<400>76
<210>77
<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab8
<400>77
<210>78
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab8
<400>78
<210>79
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab8
<400>79
<210>80
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab8
<400>80
<210>81
<211>360
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab9
<400>81
<210>82
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab9
<400>82
<210>83
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab9
<400>83
<210>84
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab9
<400>84
<210>85
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab9
<400>85
<210>86
<211>339
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab9
<400>86
<210>87
<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab9
<400>87
<210>88
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab9
<400>88
<210>89
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab9
<400>89
<210>90
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab9
<400>90
<210>91
<211>360
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab10
<400>91
<210>92
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab10
<400>92
<210>93
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab10
<400>93
<210>94
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab10
<400>94
<210>95
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab10
<400>95
<210>96
<211>339
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab10
<400>96
<210>97
<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab10
<400>97
<210>98
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab10
<400>98
<210>99
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab10
<400>99
<210>100
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab10
<400>100
<210>101
<211>360
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab11
<400>101
<210>102
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab11
<400>102
<210>103
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab11
<400>103
<210>104
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab11
<400>104
<210>105
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab11
<400>105
<210>106
<211>339
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab11
<400>106
<210>107
<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab11
<400>107
<210>108
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab11
<400>108
<210>109
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab11
<400>109
<210>110
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab11
<400>110
<210>111
<211>360
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab12
<400>111
<210>112
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab12
<400>112
<210>113
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab12
<400>113
<210>114
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab12
<400>114
<210>115
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab12
<400>115
<210>116
<211>339
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab12
<400>116
<210>117
<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab12
<400>117
<210>118
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab12
<400>118
<210>119
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab12
<400>119
<210>120
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab12
<400>120
<210>121
<211>360
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab13
<400>121
<210>122
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab13
<400>122
<210>123
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab13
<400>123
<210>124
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab13
<400>124
<210>125
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab13
<400>125
<210>126
<211>339
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab13
<400>126
<210>127
<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab13
<400>127
<210>128
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab13
<400>128
<210>129
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab13
<400>129
<210>130
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab13
<400>130
<210>131
<211>360
<212>DNA
<213>Homo sapi ens
<220>
<223>Ab14
<400>131
<210>132
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab14
<400>132
<210>133
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab14
<400>133
<210>134
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab14
<400>134
<210>135
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab14
<400>135
<210>136
<211>339
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab14
<400>136
<210>137
<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab14
<400>137
<210>138
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab14
<400>138
<210>139
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab14
<400>139
<210>140
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab14
<400>140
<210>141
<211>360
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab15
<400>141
<210>142
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab15
<400>142
<210>143
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab15
<400>143
<210>144
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab15
<400>144
<210>145
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab15
<400>145
<210>146
<211>339
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
23>Ab15
<400>146
<210>147
<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab15
<400>147
<210>148
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab15
<400>148
<210>149
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab15
<400>149
<210>150
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab15
<400>150
<210>151
<211>360
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab16
<400>151
<210>152
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab16
<400>152
<210>153
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab16
<400>153
<210>154
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab16
<400>154
<210>155
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab16
<400>155
<210>156
<211>339
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab16
<400>156
<210>157
<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab16
<400>157
<210>158
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab16
<400>158
<210>159
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab16
<400>159
<210>160
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab16
<400>160
<210>161
<211>360
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab17
<400>161
<210>162
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab17
<400>162
<210>163
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab17
<400>163
<210>164
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab17
<400>164
<210>165
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab17
<400>165
<210>166
<211>339
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab17
<400>166
<210>167
<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab17
<400>167
<210>168
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab17
<400>168
<210>169
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab17
<400>169
<210>170
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab17
<400>170
<210>171
<211>360
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab18
<400>171
<210>172
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab18
<400>172
<210>173
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab18
<400>173
<210>174
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab18
<400>174
<210>175
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab18
<400>175
<210>176
<211>339
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab18
<400>176
<210>177
<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab18
<400>177
<210>178
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab18
<400>178
<210>179
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab18
<400>179
<210>180
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab18
<400>180
<210>181
<211>360
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab19
<400>181
<210>182
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab19
<400>182
<210>183
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab19
<400>183
<210>184
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab19
<400>184
<210>185
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab19
<400>185
<210>186
<211>339
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab19
<400>186
<210>187
<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab19
<400>187
<210>188
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab19
<400>188
<210>189
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab19
<400>189
<210>190
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab19
<400>190
<210>191
<211>360
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab20
<400>191
<210>192
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab20
<400>192
<210>193
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab20
<400>193
<210>194
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab20
<400>194
<210>195
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab20
<400>195
<210>196
<211>339
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab20
<400>196
<210>197
<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab20
<400>197
<210>198
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab20
<400>198
<210>199
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab20
<400>199
<210>200
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab20
<400>200
<210>201
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>201
<210>202
<211>385
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>202
<210>203
<211>316
<212>PRT
<213>Homo Sapiens
<220>
<223>Human sequence with FLAG tag
<400>203
<210>204
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>Synthetic FLAG peptide
<400>204
<210>205
<211>298
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>205
<210>206
<211>378
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>206
<210>207
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab1
<400>207
<210>208
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab1
<400>208
<210>209
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab2
<400>209
<210>210
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab2
<400>210
<210>211
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab3
<400>211
<210>212
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab3
<400>212
<210>213
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab4
<400>213
<210>214
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab4
<400>214
<210>215
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab5
<400>215
<210>216
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab5
<400>216
<210>217
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab6
<400>217
<210>218
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab6
<400>218
<210>219
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab7
<400>219
<210>220
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab7
<400>220
<210>221
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab8
<400>221
<210>222
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab8
<400>222
<210>223
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab9
<400>223
<210>224
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab9
<400>224
<210>225
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab10
<400>225
<210>226
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab10
<400>226
<210>227
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab11
<400>227
<210>228
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab11
<400>228
<210>229
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab12
<400>229
<210>230
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab12
<400>230
<210>231
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab13
<400>231
<210>232
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab13
<400>232
<210>233
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab14
<400>233
<210>234
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab14
<400>234
<210>235
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab15
<400>235
<210>236
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab15
<400>236
<210>237
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab16
<400>237
<210>238
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab16
<400>238
<210>239
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab17
<400>239
<210>240
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab17
<400>240
<210>241
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab18
<400>241
<210>242
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab18
<400>242
<210>243
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab19
<400>243
<210>244
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab19
<400>244
<210>245
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab20
<400>245
<210>246
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab20
<400>246
<210>247
<211>360
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab 6 Non Germlined
<400>247
<210>248
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab 6 Non Germlined
<400>248
<210>249
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab 6 Non Germlined
<400>249
<210>250
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab 6 Non Germlined
<400>250
<210>251
<211>30
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab 6
<400>251
<210>252
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab 6
<400>252
<210>253
<211>32
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab 6
<400>253
<210>254
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab 6
<400>254
<210>255
<211>22
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab 6
<400>255
<210>256
<211>15
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab 6
<400>256
<210>257
<211>32
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab 6
<400>257
<210>258
<211>10
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Ab 6
<400>258
Claims (54)
1、一种分离的人GM-CSFRα结合元件,其中,所述结合元件抑制GM-CSF与GM-CSFRα的结合,并且其中所述结合元件结合如SEQID NO:206所示人GM-CSFRα的226~230位的Tyr-Leu-Asp-Phe-Gln中的至少一个残基。
2、根据权利要求1的结合元件,在表面等离子共振试验中,其以5nM或更低的亲和性(KD)结合到人GM-CSFRα的细胞外域。
3、根据权利要求1或2的结合元件,其包括抗体分子。
4、根据权利要求3的结合元件,包括抗体VH域,所述抗体VH域包含一组互补决定区CDR1、CDR2和CDR3及框架,其中,所述互补决定区组包括具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:173的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR2、以及具有选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:185和SEQ ID NO:195的氨基酸序列的CDR3;
或者包含具有一个或两个氨基酸取代的该CDR序列组。
5、根据权利要求3或4的结合元件,包括包含互补决定区CDR1、CDR2和CDR3以及框架的抗体VH域,并且其中VH CDR3中的Kabat残基H97为S。
6、根据权利要求5的结合元件,其中VH CDR3进一步包含一个或多个以下残基:
在Kabat残基H95处的V、N、A或L;
在Kabat残基H99处的S、F、H、P、T或W;
在Kabat残基H100B处的A、T、P、S、V或H。
7、根据权利要求6的结合元件,其中Kabat残基H95为V。
8、根据权利要求6或7的结合元件,其中Kabat残基H99为S。
9、根据权利要求6~8任一项的结合元件,其中Kabat残基H100B为A或T。
10、根据权利要求6~9任一项的结合元件,其中,VH CDR3具有选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:185和SEQ ID NO:195的氨基酸序列。
11、根据权利要求5~10任一项的结合元件,其中,在VH CDR1中Kabat残基H34为I。
12、根据权利要求5~11中任一项的结合元件,其中VH CDR1具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
13、根据权利要求5~12中任一项的结合元件,其中VH CDR2包含位于Kabat残基H54处的E和/或位于Kabat残基H57处的I。
14、根据权利要求5~13中任一项的结合元件,其中VH CDR2具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
15、根据权利要求5~14中任一项的结合元件,其中在VH域框架中的Kabat残基H17为S。
16、根据权利要求5~15中任一项的结合元件,包含抗体VL域,所述抗体VL域包含互补决定区CDR1、CDR2和CDR3以及框架。
17、根据权利要求16的结合元件,其中VL CDR3包含一个或多个以下残基:
在Kabat残基L90处的S、T或M;
在Kabat残基L92处的D、E、Q、S、M或T;
在Kabat残基L96处的S、P、I或V。
18、根据权利要求17的结合元件,其中Kabat残基L90为S。
19、根据权利要求17或18的结合元件,其中Kabat残基L92为D或E。
20、根据权利要求17~19中任一项的结合元件,其中Kabat残基L95A为S。
21、根据权利要求17~20中任一项的结合元件,其中Kabat残基L96为S。
22、根据权利要求16或17任一项的结合元件,其中VL CDR3具有选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:170、SEQID NO:180、SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:200的氨基酸序列。
23、根据权利要求16~22中任一项的结合元件,其中VL CDR1包含一个或多个以下残基:
在Kabat残基27A处的S;
在Kabat残基27B处的N;
在Kabat残基27C处的I;
在Kabat残基32处的D。
24、根据权利要求16~23中任一项的结合元件,其中VL CDR1具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
25、根据权利要求16~24中任一项的结合元件,其中VL CDR2包含一个或多个以下残基:
在Kabat残基51处的N;
在Kabat残基52处的N;
在Kabat残基53处的K。
26、根据权利要求16~25中任一项的结合元件,其中VL CDR2具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
27、根据权利要求3~26中任一项的结合元件,包括其中Kabat残基H94为I的抗体VH域。
28、一种分离的人GM-CSFRα结合元件,其中所述结合元件抑制GM-CSF与GM-CSFRα的结合,并且其中在表面等离子共振试验中,所述结合元件以5nM或更低的亲和性(KD)结合人GM-CSFRα细胞外域。
29、根据权利要求28的结合元件,其包括抗体分子。
30、一种分离的人GM-CSFRα结合元件,其中所述结合元件抑制GM-CSF与GM-CSFRα的结合,并且其中所述结合元件包括与具有选自以下的氨基酸序列的VH域和VL域的抗体分子竞争结合人GM-CSFRα的细胞外域的人或人源化抗体分子:
VH域SEQ ID NO:2和VL域SEQ ID NO:7;
VH域SEQ ID NO:12和VL域SEQ ID NO:17;
VH域SEQ ID NO:22和VL域SEQ ID NO:27;
VH域SEQ ID NO:32和VL域SEQ ID NO:37;
VH域SEQ ID NO:42和VL域SEQ ID NO:47;
VH域SEQ ID NO:52和VL域SEQ ID NO:57;
VH域SEQ ID NO:62和VL域SEQ ID NO:67;
VH域SEQ ID NO:72和VL域SEQ ID NO:77;
VH域SEQ ID NO:82和VL域SEQ ID NO:87;
VH域SEQ ID NO:92和VL域SEQ ID NO:97;
VH域SEQ ID NO:102和VL域SEQ ID NO:107;
VH域SEQ ID NO:112和VL域SEQ ID NO:117;
VH域SEQ ID NO:122和VL域SEQ ID NO:127;
VH域SEQ ID NO:132和VL域SEQ ID NO:137;
VH域SEQ ID NO:142和VL域SEQ ID NO:147;
VH域SEQ ID NO:152和VL域SEQ ID NO:157;
VH域SEQ ID NO:162和VL域SEQ ID NO:167;
VH域SEQ ID NO:172和VL域SEQ ID NO:177;
VH域SEQ ID NO:182和VL域SEQ ID NO:187;或
VH域SEQ ID NO:192和VL域SEQ ID NO:197。
31、一种分离的人GM-CSFRα结合元件,其中所述结合元件抑制GM-CSF与GM-CSFRα的结合,并且其中所述结合元件包括含抗体VH域的抗体分子,所述抗体VH域包含一组互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3以及框架,其中所述互补决定区组包括具有SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:173的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR2和具有选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:185和SEQ ID NO:195的氨基酸序列的HCDR3。
32、根据权利要求3~27中任一项或权利要求29~31中任一项所述的结合元件,其中所述抗体分子为人或人源化抗体分子。
33、根据权利要求32所述的结合元件,其中所述VH域框架为人种系VH1DP5或VH3DP47框架。
34、根据权利要求32或33的结合元件,包括VL域,其中所述VL域框架为人种系Vλ1DPL8、Vλ1DPL3或Vλ6_6a框架。
35、一种分离的人GM-CSFRα抗体分子,其抑制GM-CSF与GM-CSFRα的结合,并且其包括:
具有如SEQ ID NO:52所示VH域氨基酸序列的VH域或具有一个或两个氨基酸改变的其变异体,和
具有如SEQ ID NO:57所示VL域氨基酸序列的VL域或具有一个或两个氨基酸改变的其变异体;
其中所述氨基酸改变选自替代、***和缺失。
36、根据权利要求3~27或29~34中任一项的结合元件,或者根据权利要求35的抗体分子,其中所述抗体分子为IgG4。
37、根据权利要求1~36中任一项的结合元件或抗体分子,其在表面等离子共振试验中,以1nM或更低的亲和性(KD)结合人GM-CSFRα细胞外域。
38、根据权利要求37的结合元件或抗体分子,其在表面等离子共振试验中,以0.5nM或更低的亲和性(KD)结合人GM-CSFRα细胞外域。
39、根据上述权利要求中任一项的结合元件或抗体分子,其在使用7pM人GM-CSF的TF-1细胞增殖试验中具有60pM或更低的IC50中和效力。
40、根据权利要求38的结合元件或抗体分子,在使用7pM人GM-CSF的TF-1细胞增殖试验中具有10pM或更低的IC50中和效力。
41、根据上述权利要求中任一项的结合元件或抗体分子,其在使用7pM人GM-CSF的人粒细胞形态改变试验中具有50pM或更低的IC50中和效力。
42、根据权利要求41的结合元件或抗体分子,其在使用7pM人GM-CSF的人粒细胞形态改变试验中具有25pM或更低的IC50中和效力。
43、根据上述权利要求中任一项的结合元件或抗体分子,其在使用1nM人GM-CSF的单核细胞TNFα释放试验中具有100pM或更低的IC50中和效力。
44、包含上述权利要求中任一项的结合元件或抗体分子和药物可接受的赋形剂的组合物。
45、一种包含编码权利要求1~43中任一项的结合元件或抗体分子的核酸序列的分离的核酸分子。
46、一种含权利要求43的核酸分子的体外宿主细胞。
47、一种制备权利要求1~43中任一项的结合元件或抗体分子的方法,包括培养权利要求46的宿主细胞。
48、根据权利要求47的方法,进一步包括纯化所述结合元件。
49、一种制备人GM-CSFRα抗体分子的方法,所述方法包括
通过包括HCDR1、HCDR2和HCDR3的亲本VH域的氨基酸序列中一个或多个氨基酸的***、缺失或取代提供为亲本VH域的氨基酸序列变异体的VH域;其中
所述亲本VH CDR1具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列;
所述亲本VH CDR2具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列;并且所述亲本VH CDR3具有选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:15、SEQID NO:25、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:185和SEQ IDNO:195的氨基酸序列;或者其中
所述亲本VH CDR1具有SEQ ID NO:173的氨基酸序列、所述亲本VH CDR2具有SEQ ID NO:174的氨基酸序列和所述亲本VHCDR3具有SEQ ID NO:175的氨基酸序列;
和
任选地组合如此提供的VH域和一个或多个VL域,从而提供一个或多个VH/VL组合;以及
检测所述VH域或所述VH/VL组合或多个组合,以识别人GM-CSFRα的抗体分子。
50、根据权利要求49所述的方法,其中通过在包括LCDR1、LCDR2和LCDR3的亲本VL域的氨基酸序列中一个或多个氨基酸的***、缺失或取代提供所述一个或多个VL域;其中
所述亲本VL CDR1具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列;
所述亲本VL CDR2具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列;并且
所述亲本VL CDR3具有选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:200的氨基酸序列。
51、根据权利要求49或权利要求50的方法,包括测试所述抗体分子抑制人GM-CSF与人GM-CSFRα的结合的能力。
52、一种制备抗体分子组合物的方法,包括使用权利要求49~51中任一项的方法获得抗体分子和将所述抗体分子配制为包含至少一种额外组分的组合物。
53、权利要求1~43中任一项的结合元件或抗体分子在制备用于治疗炎性、呼吸或自体免疫状态或疾病的药物中的用途。
54、根据权利要求53的用途,其中所述状态或疾病为风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、过敏反应、多发性硬化、髓系白血病或动脉硬化。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310558011.7A CN103641915B (zh) | 2006-03-27 | 2007-03-27 | Gm‑csf受体结合元件 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US78656906P | 2006-03-27 | 2006-03-27 | |
US60/786,569 | 2006-03-27 | ||
PCT/GB2007/001108 WO2007110631A1 (en) | 2006-03-27 | 2007-03-27 | Binding member for gm-csf receptor |
Related Child Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310558011.7A Division CN103641915B (zh) | 2006-03-27 | 2007-03-27 | Gm‑csf受体结合元件 |
CN201310562197.3A Division CN103641916A (zh) | 2006-03-27 | 2007-03-27 | Gm-csf受体结合元件 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101443360A true CN101443360A (zh) | 2009-05-27 |
CN101443360B CN101443360B (zh) | 2013-11-27 |
Family
ID=38293698
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2007800154169A Active CN101443360B (zh) | 2006-03-27 | 2007-03-27 | Gm-csf受体结合元件 |
CN201310562197.3A Pending CN103641916A (zh) | 2006-03-27 | 2007-03-27 | Gm-csf受体结合元件 |
CN201310558011.7A Active CN103641915B (zh) | 2006-03-27 | 2007-03-27 | Gm‑csf受体结合元件 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310562197.3A Pending CN103641916A (zh) | 2006-03-27 | 2007-03-27 | Gm-csf受体结合元件 |
CN201310558011.7A Active CN103641915B (zh) | 2006-03-27 | 2007-03-27 | Gm‑csf受体结合元件 |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (8) | US8506960B2 (zh) |
EP (3) | EP2423229B1 (zh) |
JP (2) | JP5335662B2 (zh) |
KR (2) | KR101451546B1 (zh) |
CN (3) | CN101443360B (zh) |
BR (1) | BRPI0709259B1 (zh) |
CA (1) | CA2647449C (zh) |
DK (3) | DK2423230T3 (zh) |
ES (3) | ES2395839T3 (zh) |
HK (2) | HK1166988A1 (zh) |
MX (2) | MX2008012291A (zh) |
PL (3) | PL2423230T3 (zh) |
PT (3) | PT1999152E (zh) |
RU (2) | RU2495050C2 (zh) |
SI (3) | SI1999152T1 (zh) |
WO (1) | WO2007110631A1 (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103193882A (zh) * | 2013-03-29 | 2013-07-10 | 浙江大学 | 胚胎干细胞特异性标志物GM-CSFRα及其应用 |
CN103906767A (zh) * | 2011-10-10 | 2014-07-02 | 米迪缪尼有限公司 | 对类风湿关节炎的治疗 |
CN108076629A (zh) * | 2015-02-25 | 2018-05-25 | 莱斯特大学 | 一种用于治疗、预防或改善主动脉病的gm-csf负调节剂 |
WO2020108423A1 (en) * | 2018-11-27 | 2020-06-04 | Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. | Antibodies specifically recognizing granulocyte-macrophage colony stimulating factor receptor alpha and uses thereof |
CN113453759A (zh) * | 2018-11-09 | 2021-09-28 | 基尼克萨制药有限公司 | 治疗巨细胞动脉炎 |
Families Citing this family (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PL2423230T3 (pl) * | 2006-03-27 | 2013-10-31 | Medimmune Ltd | Element wiążący dla receptora GM-CSF |
MX2009005398A (es) | 2006-11-21 | 2009-08-20 | Kalobios Pharmaceuticals Inc | Metodos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias cronicas usando antagonista de gm-csf. |
US8075885B2 (en) | 2008-04-07 | 2011-12-13 | Kalobios Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating heart failure using an anti-GM-CSF antibody |
AU2015224416B2 (en) * | 2008-12-22 | 2017-04-20 | The University Of Melbourne | Osteoarthritis treatment |
RU2630969C2 (ru) | 2008-12-22 | 2017-09-15 | Де Юниверсити Оф Мельбурн | Лечение боли |
ES2886063T3 (es) * | 2008-12-22 | 2021-12-16 | Univ Melbourne | Tratamiento de la artrosis |
US8609101B2 (en) | 2009-04-23 | 2013-12-17 | Theraclone Sciences, Inc. | Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) neutralizing antibodies |
KR20120011883A (ko) * | 2009-05-05 | 2012-02-08 | 모르포시스 아게 | 다발성 경화증의 치료 |
US20120165220A1 (en) * | 2009-09-03 | 2012-06-28 | Colgan Sean P | Uses of CD116 Expression Level |
KR20140103122A (ko) * | 2011-11-17 | 2014-08-25 | 넨키 인스티튜트 오브 익스페리멘탈 바이올로지 | 신경교종을 치료하기 위한 조성물 및 방법 |
EP2602264A1 (en) | 2011-12-05 | 2013-06-12 | Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka mbH | GDF-5 mutant for inducing cartilage formation |
WO2013090989A1 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Csl Limited | Method of treating inflammatory bowel disease |
AR093297A1 (es) | 2012-10-31 | 2015-05-27 | Amgen Res (Munich) Gmbh | Formulacion liquida que comprende un compuesto neutralizante de gm-csf |
WO2014068029A1 (en) | 2012-10-31 | 2014-05-08 | Takeda Gmbh | Lyophilized formulation comprising gm-csf neutralizing compound |
PL2932264T3 (pl) * | 2012-12-14 | 2019-09-30 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Nowe niezależne od MHC antygeny powiązane z nowotworem |
WO2015028657A1 (en) | 2013-08-30 | 2015-03-05 | Takeda Gmbh | Antibodies neutralizing gm-csf for use in the treatment of rheumatoid arthritis or as analgesics |
JP6769879B2 (ja) | 2014-05-07 | 2020-10-14 | タケダ・ゲー・エム・ベー・ハーTakeda GmbH | Gm−csf中和化合物を含む液体製剤 |
JP2017515828A (ja) * | 2014-05-19 | 2017-06-15 | メディミューン リミテッド | 関節リウマチのための治療 |
GB201519331D0 (en) * | 2015-11-02 | 2015-12-16 | Glaxosmithkline Ip Dev Ltd | Treatment paradigm |
AU2017270027B2 (en) | 2016-05-24 | 2024-07-11 | Medimmune Limited | Anti-PAD4 autoantibodies as clinical response biomarkers for the treatment of rheumatoid arthritis |
EP3797792A1 (en) | 2017-03-01 | 2021-03-31 | MedImmune Limited | Formulations of anti-gm-csfralpha monoclonal antibody |
US11655293B2 (en) | 2018-02-22 | 2023-05-23 | Universitat Zurich | Ligands to GM-CSF or GM-CSF-receptor for use in leukemia in a patient having undergone allo-HCT |
EP3623382A1 (en) | 2018-09-14 | 2020-03-18 | Universität Zürich | Ligands to gm-csf or gm-csf-receptor for use in leukemia in a patient having undergone allo-hct |
US11078264B2 (en) | 2018-10-17 | 2021-08-03 | University Of Connecticut | Inhibiting granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) prevents preterm birth |
WO2020096664A1 (en) | 2018-11-09 | 2020-05-14 | Kiniksa Pharmaceuticals, Ltd. | Treatment for giant cell arteritis |
JP2022535062A (ja) | 2019-06-03 | 2022-08-04 | キニクサ ファーマシューティカルズ, リミテッド | Gm-csf拮抗薬を用いたがんの治療 |
US20230030680A1 (en) * | 2020-01-07 | 2023-02-02 | St. Jude Children's Research Hospital, Inc | Chimeric gmcsf-il18 receptor |
WO2021188409A1 (en) * | 2020-03-15 | 2021-09-23 | Kiniksa Pharmaceuticals, Ltd. | Treatment of cytokine release syndrome with gm-csf antagonists |
WO2021204649A1 (en) | 2020-04-06 | 2021-10-14 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Gm-csf antagonists for use in the treatment of severe pulmonary covid-19, cytokine release syndrome and/or acute respiratory distress syndrome |
CN111690063A (zh) * | 2020-05-25 | 2020-09-22 | 北京大学 | 一种抗gm-csf纳米抗体及其制备方法和应用 |
KR20230095983A (ko) * | 2020-10-26 | 2023-06-29 | 키닉사 파마슈티컬스, 리미티드 | Gm-csf 길항제를 사용한 암의 치료 |
EP4263597A2 (en) | 2020-12-18 | 2023-10-25 | Kiniksa Pharmaceuticals, Ltd. | Protein compositions and methods for producing and using the same |
WO2023138499A1 (zh) * | 2022-01-20 | 2023-07-27 | 舒泰神(北京)生物制药股份有限公司 | 一种特异性地识别粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体的抗体制剂及其应用 |
Family Cites Families (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8308235D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
JPS61134325A (ja) | 1984-12-04 | 1986-06-21 | Teijin Ltd | ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法 |
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
US5629283A (en) * | 1989-08-11 | 1997-05-13 | Amrad Corporation Limited | Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor and derivatives thereof |
ATE161883T1 (de) * | 1989-08-11 | 1998-01-15 | Amrad Corp Ltd | Rezeptor für granulozyten-macrophagen- koloniestimulierungsfaktor und seine derivate |
GB8928874D0 (en) | 1989-12-21 | 1990-02-28 | Celltech Ltd | Humanised antibodies |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
US5747032A (en) | 1990-08-10 | 1998-05-05 | Amrad Corporation Limited | Monoclonal antibody to human granulocyte macrophage colony stimulating factor |
US5565332A (en) | 1991-09-23 | 1996-10-15 | Medical Research Council | Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach |
GB9203459D0 (en) | 1992-02-19 | 1992-04-08 | Scotgen Ltd | Antibodies with germ-line variable regions |
US5639641A (en) | 1992-09-09 | 1997-06-17 | Immunogen Inc. | Resurfacing of rodent antibodies |
WO1994011404A1 (en) * | 1992-11-19 | 1994-05-26 | Dana-Farber Cancer Institute | Antibodies for gm-csf receptor and uses thereof |
ATE199392T1 (de) | 1992-12-04 | 2001-03-15 | Medical Res Council | Multivalente und multispezifische bindungsproteine, deren herstellung und verwendung |
AUPN780096A0 (en) * | 1996-01-30 | 1996-02-22 | Medvet Science Pty. Ltd. | Cytokine antagonists and agonists |
ES2329959T5 (es) | 1998-12-10 | 2013-12-18 | Bristol-Myers Squibb Company | Armazones de proteína para miméticos de anticuerpo y otras proteínas de unión |
GB2361704C (en) | 2000-03-03 | 2006-08-02 | Cambridge Antibody Tech | Human antibodies against eotaxin and their use |
US7108852B2 (en) * | 2000-03-20 | 2006-09-19 | Warner-Lambert Company Llc | Methods of treating inflammation using antibodies to M-CSF |
EP2298809A3 (en) | 2001-07-12 | 2012-02-15 | FOOTE, Jefferson | Super humanized antibodies |
KR100453877B1 (ko) * | 2001-07-26 | 2004-10-20 | 메덱스젠 주식회사 | 연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 TNFR/Fc 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체 |
CN101824090B (zh) * | 2002-06-14 | 2013-01-02 | 免疫医疗公司 | 人源化单克隆抗体hPAM4 |
US7169904B2 (en) * | 2002-12-17 | 2007-01-30 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Immunocytokine sequences and uses thereof |
US20040146486A1 (en) * | 2003-01-24 | 2004-07-29 | Juan Sun | Hybrid vector system for use as a vaccine |
PL2423230T3 (pl) * | 2006-03-27 | 2013-10-31 | Medimmune Ltd | Element wiążący dla receptora GM-CSF |
US9209965B2 (en) | 2014-01-14 | 2015-12-08 | Microsemi Semiconductor Ulc | Network interface with clock recovery module on line card |
-
2007
- 2007-03-27 PL PL11167923T patent/PL2423230T3/pl unknown
- 2007-03-27 PT PT77129633T patent/PT1999152E/pt unknown
- 2007-03-27 CA CA2647449A patent/CA2647449C/en active Active
- 2007-03-27 ES ES07712963T patent/ES2395839T3/es active Active
- 2007-03-27 SI SI200731100T patent/SI1999152T1/sl unknown
- 2007-03-27 KR KR1020137029959A patent/KR101451546B1/ko active IP Right Grant
- 2007-03-27 ES ES11167912T patent/ES2424467T3/es active Active
- 2007-03-27 MX MX2008012291A patent/MX2008012291A/es active IP Right Grant
- 2007-03-27 CN CN2007800154169A patent/CN101443360B/zh active Active
- 2007-03-27 CN CN201310562197.3A patent/CN103641916A/zh active Pending
- 2007-03-27 DK DK11167923.9T patent/DK2423230T3/da active
- 2007-03-27 DK DK11167912.2T patent/DK2423229T3/da active
- 2007-03-27 EP EP11167912.2A patent/EP2423229B1/en active Active
- 2007-03-27 PT PT111679122T patent/PT2423229E/pt unknown
- 2007-03-27 PT PT111679239T patent/PT2423230E/pt unknown
- 2007-03-27 KR KR20087026232A patent/KR101481844B1/ko active IP Right Grant
- 2007-03-27 EP EP07712963A patent/EP1999152B1/en active Active
- 2007-03-27 EP EP11167923.9A patent/EP2423230B1/en active Active
- 2007-03-27 SI SI200731285T patent/SI2423229T1/sl unknown
- 2007-03-27 CN CN201310558011.7A patent/CN103641915B/zh active Active
- 2007-03-27 DK DK07712963.3T patent/DK1999152T3/da active
- 2007-03-27 RU RU2008137763/10A patent/RU2495050C2/ru active
- 2007-03-27 US US12/294,616 patent/US8506960B2/en active Active
- 2007-03-27 ES ES11167923T patent/ES2424468T3/es active Active
- 2007-03-27 JP JP2009502208A patent/JP5335662B2/ja active Active
- 2007-03-27 PL PL11167912T patent/PL2423229T3/pl unknown
- 2007-03-27 US US11/692,008 patent/US8263075B2/en active Active
- 2007-03-27 WO PCT/GB2007/001108 patent/WO2007110631A1/en active Application Filing
- 2007-03-27 BR BRPI0709259-8A patent/BRPI0709259B1/pt active IP Right Grant
- 2007-03-27 MX MX2015007466A patent/MX348827B/es unknown
- 2007-03-27 SI SI200731286T patent/SI2423230T1/sl unknown
- 2007-03-27 PL PL07712963T patent/PL1999152T3/pl unknown
-
2012
- 2012-08-02 HK HK12107633.4A patent/HK1166988A1/xx unknown
- 2012-08-03 HK HK12107671.7A patent/HK1166989A1/xx unknown
- 2012-12-26 RU RU2012157042A patent/RU2639546C2/ru active
-
2013
- 2013-01-10 JP JP2013002623A patent/JP5665894B2/ja active Active
- 2013-07-12 US US13/941,409 patent/US9085628B2/en active Active
-
2015
- 2015-06-29 US US14/753,792 patent/US20150376285A1/en not_active Abandoned
-
2018
- 2018-05-15 US US15/980,664 patent/US20190040145A1/en not_active Abandoned
-
2019
- 2019-01-08 US US16/242,850 patent/US20190309077A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-10-14 US US17/070,623 patent/US20210147559A1/en not_active Abandoned
-
2023
- 2023-10-31 US US18/499,051 patent/US20240124596A1/en active Pending
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103906767A (zh) * | 2011-10-10 | 2014-07-02 | 米迪缪尼有限公司 | 对类风湿关节炎的治疗 |
CN103193882A (zh) * | 2013-03-29 | 2013-07-10 | 浙江大学 | 胚胎干细胞特异性标志物GM-CSFRα及其应用 |
CN108076629A (zh) * | 2015-02-25 | 2018-05-25 | 莱斯特大学 | 一种用于治疗、预防或改善主动脉病的gm-csf负调节剂 |
CN108076629B (zh) * | 2015-02-25 | 2021-12-10 | 莱斯特大学 | 一种用于治疗、预防或改善主动脉病的gm-csf负调节剂 |
CN113453759A (zh) * | 2018-11-09 | 2021-09-28 | 基尼克萨制药有限公司 | 治疗巨细胞动脉炎 |
WO2020108423A1 (en) * | 2018-11-27 | 2020-06-04 | Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. | Antibodies specifically recognizing granulocyte-macrophage colony stimulating factor receptor alpha and uses thereof |
CN113348179A (zh) * | 2018-11-27 | 2021-09-03 | 舒泰神(北京)生物制药股份有限公司 | 特异性识别粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体α的抗体及其用途 |
US20230002496A1 (en) * | 2018-11-27 | 2023-01-05 | Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. | Antibodies specifically recognizing granulocyte-macrophage colony stimulating factor receptor alpha and uses thereof |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101443360B (zh) | Gm-csf受体结合元件 | |
EP1986688B1 (en) | Methods of using antibodies against human il-22 | |
EP2766394B1 (en) | Treatment for rheumatoid arthritis | |
AU2007231128B2 (en) | Binding member for GM-CSF receptor | |
AU2013200962B2 (en) | Binding member for GM-CSF receptor |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |