JP2008504008A - 改良された薬物動態を有するFc−エリスロポエチン融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、改良された薬物動態を有する新規な、通例として高度にシアル酸化されたFc-EPO融合タンパク質を提供する。詳細に述べると、Fc-EPOタンパク質は延長された血清半減期及び増大したin vivo効能を有する。BHK細胞において合成されたFc-EPO融合タンパク質は、例えば、NS/0細胞などの他の細胞株において産生された対応するFc-EPO融合タンパク質と比較した場合に、劇的に延長された血清半減期及び増加したin vivo効能を有する。本発明はFc-EPOにも関し、Fc部分に加えEPO部分の種々の改変が、更に改良された特性を伴う各分子を得るために実行される。
エリスロポエチンは、赤血球形成前駆細胞の赤血球への成熟に必要な糖タンパク質ホルモンである。これは、腎臓で生成され、循環内の赤血球細胞のレベルの調節に不可欠である。低レベルの組織酸素シグナルにより特徴付けられる状態は、エリスロポエチン生成を増大し、これは次に赤血球形成を刺激する。循環内のエリスロポエチンレベルは、赤血球が長期酸素欠乏にのみ反応して作られることを確実にするよう、厳密に調節されている。エリスロポエチンの70%は、受容体-媒介型エンドサイトーシスにより消失される。エリスロポエチンがその受容体へ結合する場合、この複合体はエンドサイトーシスされ、分解され、その結果シグナル伝達の範囲が制限される。エリスロポエチンの残余は、腎濾過を通じ尿中へクリアランスされる。結果的に、エリスロポエチンは、比較的短い血清半減期を有する。
従って、投与頻度の少ないより有効なエリスロポエチン療法が必要である。
本発明は、様々な態様において、野生型もしくは天然のエリスロポエチン、組換えエリスロポエチン、又は高グリコシル化されたエリスロポエチンアナログNESP(PCT国際公開公報第00/24893号)と比べ、改善された薬物動態を有するエリスロポエチン融合タンパク質を提供する。従って、エリスロポエチン療法を簡略化し、並びに造血障害又は欠損又は他のエリスロポエチン投与の適応症を伴うヒト又は他の哺乳動物の治療に関する経費を削減することは、本発明の目的である。
本明細書において「Fc-EPO融合タンパク質」は、Fc部分及びエリスロポエチン部分を有するポリペプチドを含むタンパク質を意味する。本明細書において「Fc部分」は、免疫グロブリン、好ましくはヒト免疫グロブリンの定常領域に由来したドメインを包含し、これは定常領域の断片、アナログ、変種、変異体又は誘導体を含む。本明細書において「エリスロポエチン部分」は、ヒト及び他の種由来の野生型又は天然のエリスロポエチン、組換えエリスロポエチン、及びエリスロポエチン-様分子を包含し、これは生物学的活性のあるエリスロポエチン断片、エリスロポエチンのアナログ、変種、変異体又は誘導体を含む。
ヒンジ領域、CH2及びCH3ドメインを含むヒトIgG分子の二量体Fc部分、並びにヒトエリスロポエチン(EPO)から本質的になる精製された二量体融合タンパク質であって、前記二量体Fc部分の各鎖がそのC-末端においてEPO分子のN-末端へ直接又はリンカーペプチドを介して連結しており、下記の特徴を有する、前記融合タンパク質:(i) 15〜28個のシアル酸残基を含むことにより、高度にシアル酸化されている;(ii)CH2ドメインがヒトIgG2に由来し、CH2ドメインの Gln-Phe-Asn-Ser配列内のアミノ酸残基Phe及びAsnが、Ala及びAsnで置換され、その結果CH2ドメイン内に配列Gln-Ala-Gln-Serが形成されることによってCH2ドメインが改変されている;および、(iii)CH3ドメインのC-末端近傍のLeu-Ser-Leu-Serアミノ酸配列がAla-Thr-Ala-Thrで置換されている。
・ヒンジ領域がヒトIgG1に由来する、各二量体Fc-EPO融合タンパク質。
・IgG1ヒンジ領域の Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys配列内のCysアミノ酸残基がSer残基によって置換され、その結果前記ヒンジ領域内に配列Pro-Lys-Ser-Ser-Asp-Lysが形成されることによってIgG1ヒンジ領域が改変されている、各二量体Fc-EPO融合タンパク質。
(i)EPO分子の29位の非-システイン残基、
(ii)EPO分子の33位の非-システイン残基、
(iii)EPO分子の88位のシステイン残基、及び
(iv)EPO分子の139位のシステイン残基。
・33位の非-Cysアミノ酸残基がProである、各二量体Fc-EPO融合タンパク質。
・EPO部分が以下の群から選択される1種又は複数の変異を含む、各二量体Fc-EPO融合タンパク質:
(i)Arg131→Glu131
(ii)Arg139→Glu139
(iii)His32→Gly32
(iv)Ser34→Arg34
(v)Pro90→Ala90。
・グリコシル化部位がAsn-Ala-Thrアミノ酸配列を含む、各二量体Fc-EPO融合タンパク質。
・更にCH1ドメインを含む、各二量体Fc-EPO融合タンパク質。
・CH2、CH3及び場合によりCH1を含む完全なIgG分子がIgG2に由来し、ヒンジ領域がIgG1に由来する、各Fc-EPO融合タンパク質。
・CH2、CH3及びヒンジ領域および場合によりCH1を含む完全なIgG分子がIgG1に由来する、各Fc-EPO融合タンパク質。
・18〜24個、好ましくは20〜22個のシアル酸残基を有する、各二量体Fc-EPO融合タンパク質。
EPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQAQSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSATATPGAAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR (配列番号:14)。
・以下の配列を含む、二量体Fc-EPO融合タンパク質:
EPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQAQSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSATATPGAAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEGPSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPCEALQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR (配列番号:15)。
・先に特定したか又は請求項のFc-EPO融合タンパク質を有効量含み、場合により医薬として許容できる担体、希釈剤又は賦形剤を含有する、哺乳動物における造血障害または欠損の治療に適した医薬組成物。
・Fc-EPO融合タンパク質のN-末端側にFc部分、及びFc-EPO融合タンパク質のC-末端側にエリスロポエチン部分を含むFc-EPO融合タンパク質の集団であって、精製されたFc-EPO融合タンパク質あたり平均15〜28個のシアル酸残基を有し、各Fc-EPO融合タンパク質をコードするDNA分子をBHK細胞へ導入し、対応するFc-EOP融合タンパク質を発現、単離及び精製することによって得られ、NS/0、PerC6、又は293細胞において合成された対応するFc-EPO融合タンパク質の集団と比較して、より長い血清半減期を有する、哺乳動物への投与に適した精製された高度にシアル酸化されたFc-EPO融合タンパク質の集団。
・BHK細胞が、無タンパク質培地又は懸濁液中で増殖するのに適応している、精製されたFc-EPO融合タンパク質の対応する集団。
(i)Fc-EPO融合タンパク質をコードしているDNA分子を構築する工程;
(ii)無タンパク質培地又は懸濁液中において該DNA分子でBHK細胞を形質転換する工程;
(iii)該DNA分子によりコードされたFc-融合タンパク質の集団を発現する工程、
(iv)Fc-EPO融合タンパク質の集団を収集、単離及び精製する工程、
を含む前記方法。
・Fc部分及びエリスロポエチン部分を含むFc-EPO融合タンパク質をコードする核酸配列を安定して維持しているBHK細胞を選択する方法であって:
(a)ハイグロマイシンBをコードしている核酸配列及びFc-EPO融合タンパク質をコードしている核酸配列をBHK細胞へ導入する工程;及び
(b)ハイグロマイシンBの存在下で前記BHK細胞を培養する工程、
を含む前記方法。
・ハイグロマイシンBをコードしている核酸配列及びFc-EPO融合タンパク質をコードしている核酸配列が単一のDNA分子内に存在する、対応する方法。
本発明は、改善された薬物動態を伴う、Fc-EPO融合タンパク質を提供する。特に、本発明により提供されるFc-EPOタンパク質は、延長された血清半減期及び増加したin vivo効能を有する。ひとつの局面において、本発明は、BHK細胞において合成されたFc-EPO融合タンパク質を提供する。BHK細胞において合成されたFc-EPO融合タンパク質は、例えばNS/0、PerC6、又は293細胞などの他の細胞株において生成された対応するFc-EPO融合タンパク質と比べた場合に、劇的に延長された血清半減期及び増加したin vivo効能を有する。別の局面において、本発明は、高度にシアル酸化されたFc-EPO融合タンパク質の集団を提供する。高度にシアル酸化されたFc-EPO融合タンパク質の集団は、より少ないレベルのシアル酸化を伴う対応するFc-EPO融合タンパク質の集団と比べ、より長い血清半減期を有する。本発明に従い、Fc-EPO融合タンパク質は、Fc受容体結合活性の実質的減少もしくは除去又は補体結合活性を低下する改変などにより、Fc融合タンパク質の血清半減期を延長するFc部分のアミノ酸改変を含むことができる。加えてFc-EPO融合タンパク質は、EPO受容体-媒介型エンドサイトーシスを減少するか又はエリスロポエチンの生物学的活性を増加するエリスロポエチン部分のアミノ酸改変も含む。
本明細書において「Fc-EPO融合タンパク質」は、そのポリペプチドに通常は存在しない少なくともふたつの部分、すなわちFc部分及びエリスロポエチン部分を有するポリペプチドを含むタンパク質を意味する。本発明の好ましい態様において、Fc部分及びエリスロポエチン部分を有するポリペプチドは、ホモ二量体を形成し;従って、Fc-EPO融合タンパク質は一般に、1個又は複数のジスルフィド結合により一緒に保持された二量体タンパク質であり、各ポリペプチド鎖は、Fc部分及びエリスロポエチン部分を含む。しかし本発明のFc-EPO融合タンパク質は、エリスロポエチン部分が、Fc部分と安定して会合することを可能にしつつ、エリスロポエチン活性を維持するようないかなる配置をも有し得る。例えばこのような配置は、ふたつのFc部分及びふたつのエリスロポエチン部分を含む単一のポリペプチド、ふたつのFc部分及びひとつのエリスロポエチン部分を含む単一のポリペプチド、Fc部分及びエリスロポエチン部分を含むひとつのポリペプチドと、Fc部分を含む別のポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質、並びに他の適当な配置を含むが、これらに限定されるものではない。
本明細書において、「Fc部分」は免疫グロブリン、好ましくはヒト免疫グロブリンの定常領域由来のドメインを包含し、これは定常領域の断片、アナログ、変種、変異体又は誘導体を含む。適当な免疫グロブリンは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、及び他のクラスを含む。免疫グロブリンの定常領域は、免疫グロブリンC-末端領域と相同な天然又は合成により生成されたポリペプチドと定義され、これはCH1ドメイン、ヒンジ、CH2ドメイン、CH3ドメイン、又はCH4ドメインを、個別に又はいずれかの組合せで含むことができる。ヒトIgG1、IgG2及びIgG4の定常領域の配列アラインメントを、図1A及び1Bに示している。Paulの論文(Fundamental Immunology、第4版、Lippincott-Raven、(1999))によると、CH1ドメインは、アミノ酸118-215を含み;ヒンジ領域は、アミノ酸216-230を含み;CH2ドメインは、アミノ酸231-340を含み;及び、CH3ドメインはアミノ酸341-447を含む(アミノ酸位置はIgG1配列を基にしている)。ヒンジ領域はCH1ドメインをCH2及びCH3ドメインへ連結する。
免疫グロブリンの定常領域は、Fc受容体(FcR)結合及び補体結合を含む多くの重要な抗体機能に関与する。重鎖定常領域には5種の主なクラスがあり、これはIgA、IgG、IgD、IgE、及びIgMに分類され、各々、アイソタイプにより指定される特徴的エフェクター機能を伴う。例えば、IgGは4種のγサブクラス:γ1、γ2、γ3、及びγ4に分類され、これらは各々、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4としても知られている。
本明細書において「エリスロポエチン部分」は、ヒト及び他の種に由来する野生型又は天然のエリスロポエチン、組換えエリスロポエチン、及び生物学的活性のあるエリスロポエチン断片、エリスロポエチンのアナログ、変種、変異体もしくは誘導体を含む、エリスロポエチン-様分子を包含している。
野生型又は天然のエリスロポエチンは、エリスロポエチン前駆細胞からの赤血球の増殖及び発達を刺激する、34KD糖タンパク質ホルモンである。野生型又は天然のエリスロポエチンは、低酸素症(例えば、貧血による赤血球喪失)に応答して腎臓で産生され、その同族細胞受容体との相互作用を介して、赤血球の増殖及び分化を調節する。野生型又は天然のエリスロポエチンは、血液から(Miyake T.ら、J. Biol. Chem.、252: 5558-5564 (1977))、又は血漿から(Goldwasser, E.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、68: 697-698 (1971))、又は尿から単離及び精製することができる。
EPO受容体への結合親和性を低下するため;タンパク質安定性を増強するため;正確な活性のある立体構造の選定を強化するため;薬物動態特性を増強するため;合成を増強するため;又は、他の有利な特徴を提供するために、本発明のエリスロポエチン部分にアミノ酸改変が導入される。例えば、EPO受容体-媒介したエンドサイトーシスは、エリスロポエチンとEPO受容体の間の結合親和性により決定される。ヒトエリスロポエチンとEPO受容体の複合体の三次元構造は、エリスロポエチンのその受容体への結合がエリスロポエチン表面上の正電荷及びEPO受容体上の負電荷により支配されることを明らかにしている。Syedら、Nature、395: 511 (1998)。結合の速度(on-rate)を低下させるために、変異を導入し、エリスロポエチン-EPO受容体接触表面近傍に位置する正に荷電したアミノ酸を置換することができる。例えばひとつの態様において、ヒトエリスロポエチンのArg131及びArg139の一方又は両方を置換することができる(EPO配列のアミノ酸番号付けは、成熟型ヒトEPOを基にしている)。好ましくは、Arg131及びArg139は、グルタミン酸、アスパラギン酸、又は他の非-正荷電したアミノ酸に置換される。ヒトエリスロポエチンのArg131及びArg139に対応するアミノ酸を置換するように、他の種のエリスロポエチンに変異を導入することができる。しかし、EPOアミノ酸配列において改変を行う場合、EPO生物学的活性を保存するために、EPO-EPO受容体相互作用の中心に位置する残基は避けなければならない。
エリスロポエチンに変異を導入する方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば変異は、位置指定突然変異導入技術により導入することができる。広範な部位特異的突然変異導入技術を、利用することができ、及び同様の結果を実現するための代替として使用することができることに注目することは重要である。他の技術は、ランダム及びセミ-ランダム突然変異誘発を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明のFc-EPO融合タンパク質は、Fc部分とエリスロポエチン部分の間に、リンカー分子、好ましくはペプチドリンカーを含むことができる。リンカーを伴う融合タンパク質は、増加した生物学的活性のような、改善された特性を有することができる。リンカーは一般に、1〜25個のアミノ酸(例えば、5〜25個又は10〜20個のアミノ酸)を含む。リンカーは、プロテアーゼ切断部位を含まないように設計することができる。更にリンカーは、タンパク質分解を立体的に阻害するために、N-結合型された又はO-結合型されたグリコシル化部位を含むことができる。従ってひとつの態様において、リンカーは、Asn-Ala-Thrアミノ酸配列を含む。
追加の適当なリンカーは、Robinsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、95 5929 (1998);及び、米国特許出願第09/708,506号に開示されている。
天然のヒトエリスロポエチン及び哺乳動物細胞において発現された組換えエリスロポエチンは、3個のN-結合型及び1個のO-結合型オリゴ糖鎖を含む。N-結合グリコシル化は、24、38及び83位に位置したアスパラギン残基で生じるのに対し、O-結合グリコシル化は、126位のセリン残基で生じる(Laiら、J. Biol. Chem.、261: 3116 (1986);Broudyら、Arch. Biochem. Biophys.、265: 329 (1988))。オリゴ糖鎖は、末端シアル酸残基により改変されることが示されている。N-結合型鎖は典型的には、1本の鎖あたり最大4個のシアル酸を有し、O-結合型鎖は典型的には、最大2個のシアル酸を有する。従ってエリスロポエチンポリペプチドは合計最大14個のシアル酸を収容することができる。
赤血球形成-刺激剤のin vivo生物学的活性を決定する最も重要な因子のひとつは、タンパク質の血清濃度が、赤血球形成に必要な閾値を上回り続ける時間の長さであり、これは赤血球形成-刺激剤の薬物動態により決定される。高度にシアル酸化されたFc-EPO融合タンパク質の薬物動態プロファイルは、天然の又は組換えエリスロポエチンのプロファイルとは異なる。大きな差異は、高度にシアル酸化されたFc-EPO融合タンパク質は、はるかに長い血清半減期及び遅いクリアランスを有し、これは増加したin vivo生物学的効能につながることである。理論に拘束されることを欲するものではないが、シアル酸残基はエリスロポエチン分子上の負電荷を増加し、負に荷電したEPO受容体結合の速度減少及びEPO受容体に媒介されたエンドサイトーシスの減少を生じさせ、血清半減期を長期化すると考えられている。更にシアル酸は、エリスロポエチンタンパク質が、露出したガラクトース残基に糖タンパク質を結合するアシアロ糖タンパク質受容体によりエンドサイトーシスを受けることも阻害する。
一般にエリスロポエチンのような、治療的分子のほとんどの薬物動態プロファイルは、血清濃度の初期低下(α相)と、それに続く投与後のより段階的な低下(β相)を示す。
小型-分子の薬物動態理論に従い、α相は血液の外側のコンパートメントへ分子がどのように分配されるかを記述する、分布の容積を規定する。α相において認められる減衰は、種々の細胞株において合成された種々のFc-EPO融合タンパク質について広範に変動する。理論的には、この差異は、分布容積の変動又はコンパートメント間の通行の変動が原因である。しかし、シアル酸化の程度とマウスにおけるFc-EPOタンパク質の薬物動態挙動の間には相関関係が存在することが認められている。例えば、BHK細胞において合成されたFc-EPO融合タンパク質は、高度にシアル酸化され、最良の薬物動態プロファイルを示す。NS/0細胞において合成されたFc-EPO融合タンパク質は、若干シアル酸化され、中間の薬物動態プロファイルを有する。293及びPerC6細胞において合成されたFc-EPO融合タンパク質は、ほとんど又は全くシアル酸化されず、最初の30分間における約1/100の血清濃度減衰で特徴付けられる劣った薬物動態プロファイルを有する。従って特定のFc-EPO融合タンパク質のα相に影響を及ぼす重要な因子は、グリコシル化種の分布及びシアル酸化のレベルである。少なくシアル酸化されているFc-EPO融合タンパク質は、迅速に消失する。
β相におけるFc-EPO融合タンパク質の血清濃度の減衰は、α相における減衰と比べて緩やかな勾配である。例えばマウスにおいて、投与後8〜24時間の間に、Fc-EPO融合タンパク質の血清濃度の1/2〜1/3倍の減衰が認められる。β相の間の減衰の差異も、異なる細胞株で合成された異なるFc-EPOタンパク質間では劇的さが少ない。しかしα相におけるように、シアル酸化の程度はβ相における薬物動態挙動と相関している。例えば、BHK細胞において合成されたFc-EPO融合タンパク質は、NS/0細胞で合成されたその他は同じであるFc-EPOタンパク質と比べて有意に改善されたβ相を有する。EPO受容体-媒介エンドサイトーシスは、β相の間のFc-EPO融合タンパク質の血清濃度の減衰に少なくとも部分的に寄与しているように見える。正常なヒトエリスロポエチンと比べ、EPO受容体への結合親和性が低下したAranesp(登録商標)は、同様のα相プロファイルにも関わらず、正常なヒトエリスロポエチンと比べて有意に改善されたβ相を有する。
エリスロポエチンタンパク質分子を体から排出するいくつかの可能性のある経路が存在する。野生型又は天然のエリスロポエチンタンパク質分子は、腎濾過及び受容体-媒介されたエンドサイトーシスにより体から排出される。エンドサイトーシスされたエリスロポエチンは、効率的に分解される。図3に示したように、Fc部分のエリスロポエチン部分への追加は、本質的にFc-EPO融合タンパク質の腎臓を通る排出を除去することが期待される。結果的に受容体-媒介エンドサイトーシスがFc-EPO融合タンパク質の排出の主要経路となる。更にFc部分のエリスロポエチン部分への追加は、インターナリゼーション後の分解を低下することも予想される。その理由は、FcRnエンドソーム受容体はこの融合タンパク質を細胞の外側へ再循環させると予想されるからである。
NDS変異は、エリスロポエチン構造を安定化する作用を有し、その結果、インターナリゼーション後のFc-EPO融合タンパク質の分解を低下すると予想される。NDS変異を含むFc-EPO融合タンパク質は薬物動態特性を改善し、血清半減期を延長する。
Fc部分の追加、Fc及びエリスロポエチン部分の置換、並びにシアル酸化は、各々、Fc-EPO融合タンパク質のクリアランスを低下させる。クリアランス及び血清半減期に対する組合せ作用は相加的又は相乗的である。
Fc-EPOタンパク質のin vitro活性は、細胞-ベースのアッセイにおいて試験することができる。特に、Fc-EPOとEPO受容体の間の相互作用は、TF-1細胞増殖アッセイを基に行うことができる。TF-1細胞はEPO受容体を発現し、その結果、トリチウム標識されたチミジンの組込みにより決定されるTF-1細胞の増殖はエリスロポエチン活性の関数である(Hammerllingら、J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis、14: 1455 (1996);Kitamuraら、J. Cellular Physiol.、140: 323 (1989))。本発明において、TF-1細胞の増殖は、エリスロポエチン部分とEPO受容体の間の相互作用の関数である。特にFc-EPO融合タンパク質のエリスロポエチン部分がEPO受容体に対して低下した結合速度を有する場合、Fc-EPOタンパク質は一般に、細胞-ベースのアッセイにおいて低下した活性を有する(増加したED50値により示される)。
網状赤血球は通常、前駆体がRBCとなるべく運命づけられた後、4日目に骨髄から出現する。しかし高レベルのエリスロポエチンの存在下では、網状赤血球は投与後1〜3日で骨髄から離れることが多いであろう。
本発明のFc-EPO融合タンパク質は、ヒト又は他の哺乳動物細胞株のような適当な細胞又は細胞株において生成することができる。適当な細胞株は、ベビーハムスター腎(BHK)細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)-欠損細胞を含む)、及びCOS細胞を含むが、これらに限定されるものではない。好ましい態様において、BHK細胞が使用される。
GCCCCACCACGCCTCATCTGTGACAGCCGAGTGCTGGAGAGGTACCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAATATCACGACCGGCTGTGCTGAACACTGCAGCTTGAATGAGAACATCACCGTGCCTGACACCAAAGTGAATTTCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTTGGCCAGCAGGCCGTAGAAGTGTGGCAGGGCCTGGCCCTGCTGTCGGAAGCTGTCCTGCGGGGCCAGGCCCTGTTGGTCAACTCTTCCCAGCCGTGGGAGCCCCTGCAACTGCATGTGGATAAAGCCGTGAGTGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAGGAAGCCATCTCCCCTCCAGATGCGGCCTCAGCTGCTCCCCTCCGCACAATCACTGCTGACACTTTCCGCAAACTCTTCCGAGTCTACTCCAATTTCCTCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCCTGCCGGACAGGGGACAGATGA (配列番号:1)
一般に、Fc-EPO融合タンパク質をコードしている核酸配列はシグナルペプチドをコードしている核酸配列(リーダー配列)を含む。このリーダー配列は分泌プロセッシング時に切断される。リーダー配列を伴わない成熟型Fc-EPOタンパク質をコードしている核酸配列の例(配列番号:2)を図7に示している。
一過性発現は、Fc-EPO融合タンパク質の小規模タンパク質生成及び迅速な分析に有用である。Fc-EPO融合タンパク質をコードしている核酸配列を含む宿主細胞は、コードされたFc-EPO融合タンパク質の発現に適した条件下で維持される。標準の細胞培養の方法、条件及び培地を、Fc-EPO融合タンパク質を発現している宿主細胞を維持するために使用することができる。
Fc-EPOの精製は、当業者に公知の標準GMP手法に従い行われる。このタンパク質は一般に、均質又はほぼ均質に精製される。カラムクロマトグラフィーに関連するもののような、クロマトグラフィー精製が一般に好ましい。一般にFc-EPO融合タンパク質の精製スキームは、最初のタンパク質捕獲工程;ウイルス失活工程;一又は複数のポリッシュ(polishing)工程;ウイルス除去工程;及び、タンパク質濃縮及び/又は製剤工程を含むが、これらに限定されるものではない。例えば融合タンパク質のFc部分に結合するクロマトグラフィー用の樹脂材料を使用し、Fc-EPOタンパク質を捕獲することができる。適当な樹脂材料は、プロテインAに結合された樹脂を含むが、これらに限定されるものではない。夾雑成分を除去するためにポリッシュ工程を含んでもよい。例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、Sepharose Qクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、又は疎水相互作用クロマトグラフィーを使用し、夾雑物を除去することができる。Fc部分に結合し及びFc-EPO融合タンパク質を精製するためのプロテインA-ベースのカラムクロマトグラフィーを使用するひとつの精製法は、ウイルス失活及び除去の任意的方法として実施例12に説明されている。精製されたタンパク質は一般に、限外濾過;適当な配合の緩衝液への透析;滅菌濾過;及び、バイアルへの分注を用いて所望の濃度へ濃縮される。
医薬組成物及び投与経路
本発明は、本発明に従い作製されたFc-EPOタンパク質を含有する医薬組成物も提供する。これらの医薬組成物は、赤血球形成を刺激し、並びに貧血を予防及び治療するために使用することができる。本発明により治療可能な状態は中でも、腎機能の低下又は喪失(慢性腎不全)に随伴した貧血、化学療法もしくは抗-ウイルス薬(AZTなど)のような骨髄抑制療法に随伴した貧血、非-骨髄性癌の進行に随伴した貧血、ウイルス感染症(例えばHIV)に随伴した貧血、及び慢性疾患の貧血を含む。手術時の予想外の失血のような、それ以外は健康な個人において貧血につながり得る状態も同じく治療可能である。一般にrHuEpoにより治療可能ないずれの状態も、本発明のFc-EPO融合タンパク質により治療することができる。
一般に製剤は、液体又は固体の剤形で、Fc-EPOタンパク質、緩衝液及び界面活性剤を含有する。固形製剤は、凍結乾燥された、噴霧凍結乾燥された、又は噴霧乾燥された製剤も含むが、これらに限定されるものではない。液体製剤は、好ましくは水を基剤にしているが、いくつか例を挙げると、エタノール、プロパノール、プロパンジオール、又はグリセロールなどの他の成分を含むことができる。
Fc-EPOタンパク質は、当業者に公知の標準GMP手法に従い、水溶液中に製剤される。一般に製剤は、適当な成分を適当な濃度で含む指定された容量の水溶液の混合により、作製される。例えば製剤は典型的には、Fc-EPOタンパク質を濃度0.1〜200mg/ml、好ましくは0.2〜10mg/ml、より好ましくは0.5〜6mg/mlで含有する。
Fc-EPO製剤のための界面活性剤は、医薬組成物において界面活性剤として使用される任意の賦形剤であることができ、好ましくはポリエチレン-ソルビタン-エステル(Tweens(登録商標))、例えばポリオキシエチレン(20)-ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン(20)-ソルビタンモノパルミテート、及びポリオキシエチレン(20)-ソルビタンモノステアレート、並びにポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン-コポリマーである。製剤は典型的には、界面活性剤を濃度0.001〜1.0%w/v、好ましくは0.005〜0.1%w/v、より好ましくは0.01〜0.5%w/vで含有する。
加えて製剤は、ショ糖、トレハロース、ソルビトールなどの、糖;アスコルビン酸又はグルタチオンなどの、抗酸化剤;フェノール、m-クレゾール、メチル-もしくはプロピルパラベンなどの、保存剤;クロロブタノール;チメロサール;塩化ベンザルコニウム;ポリエチレングリコール;シクロデキストリン及び他の適当な成分を含むことができる。
本発明に従い製造されたFc-EPO融合タンパク質を含有する治療的組成物は、哺乳動物宿主へ任意の経路により投与することができる。従って、適当ならば、投与は、経口又は非経口(例えば、i.v.、i.a.、s.c.、i.m.)であってよく、これは静脈内及び腹腔内投与経路を含む。加えて投与は、ボーラスの治療薬の定期的注射によるか、又は外部にある貯蔵庫(例えば静注バッグ)からの静脈内又は腹腔内投与によりより連続して行うことができる。ある態様において、本発明の治療薬は、医薬-等級であることができる。すなわちある態様は、ヒトへの投与に必要な純度及び品質管理基準に従う。獣医学用途も、本明細書に使用される意図された意味に含まれる。
一般に、本発明に従い作製されたFc-EPO融合タンパク質を含有する治療薬は、例えば治療有効量、すなわち望ましい作用を誘導するのに十分な時間、標的組織へ薬剤の適当な濃度を提供する量でヒト又は他の哺乳動物へ非経口投与又は経口投与用に製剤することができる。より詳細に述べると、本明細書において「治療有効量」は、目標ヘマトクリット、又は患者へ恩恵をもたらす目標ヘマトクリット範囲までのヘマトクリットの増大をもたらすか、あるいは目標ヘマトクリットに、もしくは目標ヘマトクリット範囲内に患者を維持するような、Fc-EPO融合タンパク質の量を意味する。この量は、個人毎に変動し、並びに患者の全身の生理的条件、貧血の重症度及び基礎となる原因、並びに個々の患者に関する最終的な目標ヘマトクリットを含む、多くの要因に左右されるであろう。目標ヘマトクリットは、典型的には少なくとも約30%、又は30%〜38%の範囲であり、好ましくは38%を上回り、より好ましくは40%〜45%である。rHuEpoに関する目標ヘマトクリット範囲に関する全般的指針は、1996年12月23日付けのEPOGEN(登録商標)の添付文書においても認められ、これはそこに記されているように、30%〜36%、あるいは32%〜38%である。そのような目標は個人毎に変動し、その結果、所定の患者について実際の目標ヘマトクリットの決定においては医師の判断が適当であろうことが理解される。しかしながら、目標ヘマトクリットの決定は十分に当業者の能力範囲内である。
本発明の治療薬は、「プロドラッグ」誘導体も含む。用語プロドラッグは、活性成分を放出もしくは活性化するために、生体内で自発的又は酵素的のいずれかの生体転換を必要とする、親分子の薬理学的に不活性(又は部分的に不活性)の誘導体を意味する。プロドラッグは、代謝条件下で切断可能な基を有する、本発明の治療薬の変種又は誘導体である。プロドラッグは、生理的条件下で加溶媒分解を受けるか又は酵素分解を受ける場合に、in vivoにおいて医薬活性のある本発明の治療薬となり始める。本発明のプロドラッグは、生体内での活性のある薬剤成分の放出又は活性化に必要な生体転換工程の数に応じてシングル、ダブル、トリプルなどと称され、これは前駆体型に存在する官能基の数を示す。プロドラッグ型は、哺乳動物生体において、溶解度、組織適合性、又は遅延した放出の利点を提供することが多い(Bundgard、Design of Prodrugs、7-9頁、21-24頁(1985)、Elsevier, Amsterdam;Silverman、The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action、352-401頁(1992)、Academic Press、サンディエゴ、CA)。更に本発明のプロドラッグ誘導体は、バイオアベイラビリティを増強するために、他の特徴と組合せることができる。
本発明のFc-EPO融合タンパク質はin vivo発現法により提供することができる。例えば、Fc-EPO融合タンパク質をコードしている核酸は、有利なことに造血障害又は欠損を罹患した患者へ直接投与することができるか、又は細胞へex vivoで提供し、その後生存細胞を患者へ投与することができる。当該技術分野において公知であるin vivo遺伝子療法は、精製されたDNA(例えば、プラスミド内)を提供すること、ウイルスベクター内のDNAを提供すること、又はリポソームもしくは他のベシクル内のDNAを提供することを含む(例えば、遺伝子療法において使用する脂質担体を開示している、米国特許第5,827,703号、及び遺伝子療法において有用なアデノウイルスベクターを提供する、米国特許第6,281,010号を参照のこと)。
In vivo発現法は、精製することなく、タンパク質の標的組織又は細胞コンパートメントへの直接の送達に特に有用である。本発明において、Fc-EPOをコードしている配列を使用する遺伝子療法は、貧血を含む、血液系の不調の様々な病態、障害及び状態における、特に慢性腎不全などに随伴した型の貧血の調整における用途が認められる。Fc-EPO融合タンパク質をコードしている核酸配列は、適当な転写又は発現カセットに挿入し、宿主哺乳動物へ裸のDNAとして又は適当な担体と複合して導入することができる。活性Fc-EPOタンパク質の生成のモニタリングは、核酸ハイブリダイゼーション、ELISA、ウェスタンハイブリダイゼーション、及び当業者に公知の他の適当な方法により行うことができる。
米国特許第6,627,615号に説明されたin vivo遺伝子療法の送達技術は、動物において無毒であり、並びに導入遺伝子発現は、単回投与後少なくとも60日間最後まで示される。導入遺伝子は、サザン分析により測定して、in vivoにおいて検出可能なレベルで、宿主細胞DNAへ組込まれるようには見えず、このことは、遺伝子治療に関するこの技術は、癌を惹起する癌遺伝子を活性化するか、又は癌を予防する腫瘍抑制遺伝子を停止するように、正常な細胞遺伝子の発現を変更することにより、宿主哺乳動物に問題を引き起こさないことを示唆している。
実施例1. Fc-EPO融合タンパク質をコードしている構築物
正常なエリスロポエチン部分を含むFc-EPO融合タンパク質をコードしているプラスミドphC10-Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPO及びNDS変異を伴うFc-EPO融合タンパク質をコードしているプラスミド phC10-Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPO(NDS)を以下のように構築した。
ヒトエリスロポエチンをコードしている核酸配列を、哺乳動物細胞における高発現のためにコドン-最適化した。例えば配列番号:3は翻訳を最適化するように改変されたコドンを伴う、成熟型ヒトエリスロポエチンのコード配列の例を示している。5'末端の配列は、サブクローニングを容易にするためにSmaI部位を含むように改変した。
CCCGGGtGCCCCACCACGCCTCATCTGTGACAGCCGAGTgCTGGAGAGGTACCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAATATCACGACcGGCTGTGCTGAACACTGCAGCTTGAATGAGAAcATCACcGTgCCtGACACCAAAGTgAATTTCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTtGGcCAGCAGGCCGTAGAAGTgTGGCAGGGCCTGGCCCTGCTGTCGGAAGCTGTCCTGCGGGGCCAGGCCCTGTTGGTCAACTCTTCCCAGCCGTGGGAGCCCCTGCAaCTGCATGTGGATAAAGCCGTgAGTGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTGgGAGCCCAGAAGGAAGCCATCTCCCCTCCAGATGCGGCCTCAGCTGCTCCcCTCCGcACAATCACTGCTGACACTTTCCGCAAACTCTTCCGAGTCTACTCCAATTTCCTCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCCTgcCGGACAGGGGACAGATGActcgag
(小文字は、野生型ヒトエリスロポエチンコード配列と異なる塩基を示す。これらの変更は、哺乳動物細胞における発現レベルを増加させると期待されるが、発現されたタンパク質配列を変化させない。)
ある形のエリスロポエチンをコードしているXmaI-XhoI DNA断片を、プラスミドベクター、例えばpdCs-Fc-Xへ挿入したが、このベクターは、CH3 C-末端領域におけるアミノ酸置換を生じる2セットの変異(ここではM1セット変異と称される)が存在することを除き、IgG1由来の変更されたヒンジ領域並びにIgG2由来のCH2及びCH3領域をコードしており、その結果CH3 C-末端及びEPO N-末端の接合部の配列は、以下である:
更に、PCR突然変異誘発により、IgG2重鎖のCH2ドメイン内のGln-Phe-Asn-Serアミノ酸配列内に可能性のあるT-細胞エピトープ及びFc部分内のN-結合グリコシル化を除去する二重アミノ酸置換「FN>AQ」を生じさせる変異を導入した。変異導入プライマー5'-AGCAGGCCCAGAGCACGTTCCGTGTGGT-3' (配列番号:10)及び5'-GAACGTGCTCTGGGCCTGCTCCTCCCGT-3' (配列番号:11)を、各々、SacII部位を含む下流プライマー5'-CCCCGCGGGTCCCACCTTTGG-3' (配列番号:12)及びPvuII部位を含む上流プライマー5'-CCCAGCTGGGTGCTGACACGT-3' (配列番号:13)と組み合わせ、ふたつの重複するDNA断片を鋳型DNA pdC10-Fcg2h-M1-EPO(NDS)から増幅した。第二の増幅ラウンドにおいて、変異(FN→AQ)を含むPvuII/SacII断片を、第一の増幅ラウンドのPCR産物から、上流プライマー(配列番号:13)及び下流プライマー(配列番号:12)を用いて増幅した。PvuII/SacII断片を、TAベクターpCR2.1 (Invitrogen)へクローニングし、その配列を検証した。構築物pdC10-Fcg2h(FN>AQ)-M1-EPO(NDS)を、pdC10-Fcg2h-M1-EPO由来のPvuII/SacII断片、XhoI/SacII断片、並びにpdC10-Fcg2h-M1-EPO(NDS)由来のXhoI/PvuII断片のトリプルライゲーションから作製した。
[EPKSSDKTHTCPPCP]APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQAQSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSATATPGAAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR (配列番号:14)
[EPKSSDKTHTCPPCP]APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQAQSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSATATPGAAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEGPSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPCEALQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR (配列番号:15)
下線を付けた配列トラックはEPO部分を表し、下線を付けた[]内配列は、IgG1ヒンジを表し、下線を付けていない配列は改変されたIgG鎖のCH2及びCH3ドメインを表し、ここで点線を付した配列はCH3ドメインを表す。
融合タンパク質の即時分析のために、標準の一過性トランスフェクション法、例えば、リン酸カルシウム-媒介型DNA共沈法(Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、 (1989))、又はLipofectamine Plus (Life Technologies)を製造業者のプロトコールに従い使用するリポフェクション法により、プラスミドphC10-Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPO(NDS)又はphC10-Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPOを、適当な組織培養細胞へ導入した。
BHKは、一般に例えばMEM+10%熱-失活したウシ胎仔血清(FBS)のような血清-含有培地において増殖される接着細胞株である。BHK細胞を維持および拡張(増殖)するために、これらは定期的に(例えば4日間隔で)、典型的にはトリプシン-EDTA溶液の作用によりそれらの基質から剥離し、新鮮培地に希釈し、適当な容器に再播種される。しかしBHK細胞は、以下の手順により、懸濁液並びに無血清及び/又は無タンパク質培地における増殖に適応させることができる。
無血清培地VP-SFMに適応されたBHK細胞は、75:25(v/v)、50:50(v/v)、25:75(v/v)、最後に0:100(v/v)のVP-SFM:DMEM/F-12混合液中で、BHK細胞を適当な細胞密度で逐次培養することにより、無タンパク質培地、例えばDMEM/F-12 (Invitrogen Corp., カタログ番号11039-021)における増殖に更に適応した。無タンパク質培地DMEM/F-12には、グルタミン(最終6mM)、2g/l HyPep 4601 (Quest International, シカゴ, IL, カタログ番号5Z10419)、2g/l HyPep 1510 (Quest International, シカゴ, IL, カタログ番号5X59053)、10μl/l(v/v)エタノールアミン(Sigma, カタログ番号E0135)、及び5μM Tropolone (Sigma, カタログ番号T7387)を補充した。補充したDMEM/F-12における増殖に対しコンピテントなFc-EPO融合タンパク質を安定して発現しているBHK細胞株をこの方法により得、高い細胞生存率で維持した。
分析のために、Fc-EPO融合タンパク質を、細胞-培養上清から、Fc部分のプロテインAへの親和性を基に、プロテインAクロマトグラフィーにより精製した。Fc-EPOタンパク質を発現している細胞の馴化した上清を、予め平衡化したファストフロー・プロテインA Sepharoseカラムに装加した。カラムをリン酸ナトリウム緩衝液(150mMリン酸ナトリウム、100mM NaCl、中性pH)で十分洗浄した。結合したタンパク質を低pH(pH2.5〜3)のリン酸ナトリウム緩衝液(前記組成)で溶離し、溶離された画分を即座に中和した。
ヒトエリスロポエチンのセリン126は、O-グリコシル化と適合性のある配列内であり、全ての哺乳動物エリスロポエチンタンパク質において保存されている。しかしセリン126は、そのタンパク質の残余に対し密にパックされない「フロッピー-ループ(floppy loop)」内にある。O-グリコシル化が存在しない場合、エリスロポエチンのこの領域はタンパク質分解に特に感受性がある。
NS/0、BHK、293、及びPerC6細胞において合成されたFc-EPO融合タンパク質のシアル酸化の程度を等電点(IEF)ゲル電気泳動により比較した。簡単に述べると、2mg/mlに濃縮し及び必要ならば脱塩した試料を、等量のIEF試料緩衝液(pH3-7)に添加し、垂直の予め成形されたNovex pH 3-7 IEFゲル(Novex, カタログ番号EC6655B/B2)上で2.5時間、最初の1時間は100V、次の1時間は200Vで及び最後の30分間は500Vで流した。その後ゲルを固定、染色及び脱染色した。
1. NS/0由来のFcg2h-EPO(NDS)
2. BHK-21由来のFcg2h-EPO(NDS)
3. BHK-21由来のFcg2h-EPO
4. BHK-21由来のFcg2h(“Delta Lys”)-EPO
5. BHK-21由来のFcg4h(FN→AQ “Delta Lys”)-EPO
6. BHK-21由来のFcg4h(“Delta Lys”)-EPO
補充したDMEM/F-12無タンパク質培地において合成されたFc-EPO融合タンパク質の試料も、IEFゲル電気泳動により同様に特徴決定した。タンパク質生成物は、VP-SFMのような無血清培地において増殖された細胞から得られた対応する生成物よりも、より程度が大きくシアル酸化され、かつ、より均質なシアル酸化を示したことがわかった。
種々のFc-EPOタンパク質のin vitro活性を細胞-ベースのアッセイにおいて試験した。TF-1細胞株はEPO受容体を発現しており、従って適当な培養条件下におけるそのトリチウム標識されたチミジンの取込みは、EPO又はEPO-様タンパク質活性の関数である(Hammerllingら、J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis、14: 1455 (1996);Kitamuraら、J. Cellular Physiol.、140: 323 (1989))。具体的には、活発な対数相にあるTF-1細胞をEPOを含まない培地において2回洗浄し、マイクロタイタープレートへ約104個細胞/ウェルで播種した。その後これらの細胞を、Fc-EPO変種の滴定した連続希釈を伴う培地において、48時間インキュベーションした。3H-チミジン0.3μCiをウェルに添加し、その10時間後に細胞増殖をアッセイした。対照として、TF-1細胞を、組換えヒトEPO、及び高グリコシル化されたEPOアナログAranesp(登録商標)の存在下でもインキュベーションした。放射性チミジンの取込みは、総TCA-沈降可能な数として測定した。表2に示したように、Fcg2h-M1-EPO分子の活性は組換えヒトEPOの活性と同等であった。
様々な細胞株において合成された様々なFc-EPOタンパク質の薬物動態プロファイルを、以下のin vivo実験を基に特徴付けた。ひとつの実験において、図8に示したように、NS/0細胞及びBHK細胞において合成されたFcg2h(N>Q)-EPOタンパク質約14μgを、Swiss-Websterマウスへ静脈内投与した。投与後様々な時点(例えば、T=投与後0、1/2、1、2、4、8、及び24時間)で、血液試料を採取し、血清を遠心により調製した。Fc-EPOの血清濃度を、抗-Fc抗体を用いるELISAにより決定した。図8に示したように、投与後24時間で、BHK-由来のFc-EPOの初期血清濃度の10%より多くが血清中に残存したのに対し、NS/0-由来のFc-EPOの初期血清濃度の0.1%未満しか血清中に残存しなかった。
様々なFc-EPO変種のin vivo生物学的活性を、マウス及びラットにおけるヘマトクリット(HCT)アッセイ及び網状赤血球アッセイにより測定した。
ひとつのHCT実験において、CD1マウスに、BHK細胞において合成されたFcg2h(FN→AQ)-EPOタンパク質を投与量20μg/kg及び10μg/kgで腹腔内注射した。血液試料をマウスから第4、7、11及び14日目に採取し、毛細管で遠心した。沈降したRBCの量を総容積の割合として測定した。図4に示したように、Fcg2h(FN>AQ)-EPOタンパク質注射に応答してヘマトクリットは初めに劇的に増加し、その後定常状態を維持し、最後に漸減した。
1. Fcg2h-EPO
2. Fcg2h-EPO(NDS)
3. Fcg4h-EPO
4. Fcg4h(N>Q)-EPO
HCTアッセイを、前述のように注射したマウスから採取した血液試料について行った。図5に示したように、Fcg2h-EPO(NDS)及びFcg2h-EPOに応答して、注射したラットにおけるヘマトクリットの量は延長された期間定常状態を維持した。このことは、Fcg2h-EPO(NDS)及びFcg2h-EPOの両タンパク質は延長された血清半減期及び強力なin vivo生物学的活性を有することを示している。図5に示されたように、Fcg4h-EPO及びFcg4h(N→Q)-EPOは、Fcg2h-EPO(NDS)及びFcg2h-EPOタンパク質と比べてより短い定常状態の期間及びより迅速な血清濃度の低下を示すことも認められた。
1. BHK細胞由来のFcg2h-EPO(NDS)、投与量85μg/kg、42.5μg/kg、及び21.25μg/kg
2. NS/0細胞由来のFcg2h-EPO(NDS)、投与量85μg/kg、42.5μg/kg、及び21.25μg/kg
3. Aranesp(登録商標)(すなわち、NESP)、投与量50μg/kg、25μg/kg、及び12.5μg/kg
これらのタンパク質の量は、糖鎖を伴わないタンパク質分子量を基に算出した。この実験において、Fcg2h-EPO(NDS)タンパク質の分子量は単量体ポリペプチドを基にしている。従ってFcg2h-EPO(NDS)のNESPに対する分子量の比は、約1.71〜1であった。従って、この実験において各タンパク質の投与量範囲はほぼ等しかった。
様々なFc-EPOタンパク質の細胞-ベースのエリスロポエチン活性の比較は、IgG4由来のCH2及びCH3ドメインを伴う融合タンパク質は一般に、IgG2由来のCH2及びCH3ドメインを伴う対応するタンパク質よりも活性が低いことを明らかにした。この結論は、少なくとも3種のFc-EPOタンパク質、すなわち、エリスロポエチン部分にNDS変異を伴い、及びNS/0細胞において合成されたタンパク質(表3)、BHK細胞において合成されたNDS変異を伴うタンパク質(表4)、及びBHK細胞において合成された正常なエリスロポエチンを伴うタンパク質(表5)について、当てはまった。
Fc部分のグリコシル化部位の除去の、in vitro活性、薬物動態、及びin vivo効能に対する作用を試験するために実験を行った。特にIgG2-由来のCH2及びCH3ドメイン又はIgG4-由来のCH2及びCH3ドメインのいずれかを含むFc-EPO融合タンパク質を試験した。IgG1のAsn297に相当する、IgG2又はIgG4のGln-Phe-Asn-Serアミノ酸配列内のアスパラギンをグルタミンに置換した。ほとんどの実験において、Gln-Phe-Asn-Serアミノ酸配列のフェニルアラニンをアラニンに置換し、アスパラギンの変異の結果として生ずる可能性のある非-自己T-細胞エピトープを除去した。表6に示されるように、細胞-ベースのin vitroアッセイにおいて、Fc部分のN-結合グリコシル化部位を除去するFN>AQ変異を伴うFc-EPOタンパク質のED50値は、一般にこの変異を伴わないFc-EPOタンパク質の約1/5倍であり、このことはN-結合グリコシル化部位の除去が細胞-ベースのアッセイにおいてin vitro活性を減少させることを示した。
Fc-EPO融合タンパク質のヘマトクリット、網状赤血球数、及び他の血液パラメーターに対する作用を試験するために、Fc-EPO融合タンパク質をビーグル犬に投与した。具体的には、Fcg2h(FN→AQ)-EPOタンパク質を、2種の個別に安定的にトランスフェクションされたBHK細胞株であるクローン65及びクローン187から精製し、ビーグル犬に静脈内投与した。1匹のオス及び1匹のメスのビーグル犬に、以下のスケジュールで各調製物を注射した:
0日目:3μg/kg
16日目:10μg/kg
23日目:100μg/kg
処置後のヘマトクリット反応を、図11に示した。Fc-EPO融合タンパク質3μg/kgの投与後、血液パラメーターは正常範囲から増加しなかった。10μg/kgの投与後1週間以内に、網状赤血球数は、4匹の動物中3匹において、総血液体積の3%を超えて増加し、ヘマトクリットは1匹において51に増加した。他の血液パラメーターは正常な範囲から増加しなかった。100μg/kgの投与後、ヘマトクリット数は急激に上昇し、57〜62のピークレベルに到達し、5〜6週間にわたり正常な範囲を上回り続けた。網状赤血球数は、2〜3週間上昇し続けた。
各動物について、1dl当たりのg数で測定した血液1μl当たりの赤血球数及びヘモグロビン数はヘマトクリット量に比例した。これらの結果は、Fc-EPOタンパク質は正常なヘモグロビン含量の正常なサイズの赤血球形成を刺激することを示した。
Fc-EPOタンパク質は、当業者に公知の標準GMP手法に従い精製した。バンクで作出したクローンからのBHK-21細胞を、追加の2.5mM L-グルタミン(Invitrogen)、2g/lの各HyPep1501及びHyPep 4601(Quest International, シカゴ, IL)、10μl/lエタノールアミン(Sigma)、及び5μM Tropolone(Sigma)を補充したDMEM/F-12培地(Invitrogen)において、7〜10日間、バッチ培養し、その間高細胞生存率(例えば、80%を上回る)を維持した。馴化培地を収集し、ノーマル-フロー-濾過により清澄化し、予め-平衡としたプロテインA Sepharoseファスト-フローカラム(Pharmacia)に載せた(Fc部分に関するプロテインAの親和性を基に融合タンパク質を捕獲する)。このカラムを中性pHの150mMリン酸ナトリウム及び100mM NaClを含有するリン酸ナトリウム緩衝液15カラム容量で十分に洗浄した。結合したタンパク質を、更に150mMリン酸ナトリウム及び100mM NaClを含有する酸性リン酸ナトリウム緩衝液(pH2.5〜3)15カラム容量により、低pHで溶離した。
例証のための試料Fc-EPO製剤又は参照Fc-EPO製剤を含有するバイアルを、40℃で相対湿度75%で、指定された貯蔵期間(例えば、0週、4週、8週など)貯蔵した。一定の貯蔵期間の後、各バイアルからアリコート試料を採取し、分析した。これらの試料は、濁度について、冷光源による直接照射下で目視により評価した。更に、濁度を吸光度350nm及び550nmで測定することにより決定した。加えて試料中のFc-EPOタンパク質の条件及びタンパク質分解産物の存在を、分析用サイズ排除クロマトグラフィー(HPLC-SEC)により分析した。0.5mg/ml Fc-EPO、10mMクエン酸塩(pH6.2)、100mMグリシン、100mM NaCl、0.01%w/vポリソルベート20を含有する製剤は、参照溶液と比べて安定性を有意に増加したことがわかった。
ヒトにおけるFcg2h(FN>AQ)-M1-EPO融合タンパク質の第I相臨床試験は、下記のように実施されている。薬物動態パラメーターは、本質的にAranesp(登録商標)について、MacDougallら(J. Am. Soc. Nephrol.、10: 2392-2395 (1999))により説明されたように決定したが、この論文の教示は本明細書に引用により取り込まれるものとする。ヒトに静脈内注射されたFcg2h(FN→AQ)-M1-EPO融合タンパク質(用量1μg/kg)の終末血清半減期は、約20〜30時間であることがわかった。従って、用量1μg/kg、又は成人貧血患者における約70μgは、初期血清濃度約10ng/mlをもたらした。正常なヒトエリスロポエチン濃度は、約0.04〜0.25ng/mlであるので(Cazzolaら、Blood、91: 2139-2145 (1998))、Fc-EPOタンパク質の薬理学的に活性なレベルは患者の全身において少なくとも5〜10日間維持される。
Fcg2h(FN>AQ)-M1-EPO融合タンパク質について、透析を受けている慢性腎不全(CRF)患者へ皮下又は静脈内注射により投与した場合の最適用量及び投与スケジュールを調べるために、多施設無作為化逐次用量漸増試験を開始する。
臨床の実践において、以下の指針に従い、Fcg2h(FN→AQ)-M1-EPO融合タンパク質の投与を個々の貧血患者に合わせて調節することは一般に都合がよい。初回量を投与し、ヘマトクリット、ヘモグロビン、網状赤血球数、及び血小板数などの血液パラメーターをモニタリングする。初回量は、典型的には約0.3〜3μg/kgである。都合の良い初回量は1μg/kgである。治療の8週間後にヘマトクリットの増加が血液体積の5〜6%未満である場合には、用量が増加されなければならない。2週間のヘマトクリットの増加が血液体積の4%を上回るか、又はヘマトクリットが36%に達する場合、用量を減少させなければならない。
週1回投与:0.075、0.225、0.45、0.75、1.5及び4.5μg/kg/投与。
2週に1回投与:0.075、0.225、0.45、0.75、1.5及び4.5μg/kg/投与。
1ヶ月に1回投与:0.45、0.75、1.5及び4.5μg/kg/投与。
Claims (25)
- ヒンジ領域、CH2及びCH3ドメインを含むヒトIgG分子の二量体Fc部分、並びにヒトエリスロポエチン(EPO)から本質的になる、精製された二量体融合タンパク質であって、前記二量体Fc部分の各鎖は、そのC-末端でEPO分子のN-末端へ直接又はリンカーペプチドを介して連結しており、下記の特徴を有する前記二量体融合タンパク質:
(i) 15〜28個のシアル酸残基を有することにより高度にシアル酸化されている;;
(ii) 前記CH2領域がヒトIgG2に由来し、前記CH2領域中のGln-Phe-Asn-Ser配列内のPheおよびAsnがAlaおよびAsnで置換され、その結果前記CH2領域内に配列Gln-Ala-Gln-Serが形成されることによって前記CH2領域が改変されている;および、
(iii)CH3ドメインのC-末端近傍のLeu-Ser-Leu-Serアミノ酸配列が、Ala-Thr-Ala-Thrで置換されている。 - 更に、CH3ドメインのC-末端Lys残基がAlaに置換されている、請求項1記載の二量体Fc-EPO融合タンパク質。
- ヒンジ領域がヒトIgG1に由来する、請求項1又は2記載の二量体Fc-EPO融合タンパク質。
- IgG1ヒンジ領域中のPro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys配列内のCysアミノ酸残基がSer残基に置換され、前記ヒンジ領域中に配列Pro-Lys-Ser-Ser-Asp-Lysが形成されることによって、I前記ヒンジ領域が改変されている、請求項3記載の二量体Fc-EPO融合タンパク質。
- エリスロポエチン部分が少なくとも以下のアミノ酸置換の一つを含む、請求項1〜4のいずれか1項記載のFc-EPO融合タンパク質:
(i)EPO分子の29位における非システイン残基;
(ii)EPO分子の33位における非システイン残基;
(iii)EPO分子の88位におけるシステイン残基;
(iv)EPO分子の139位におけるシステイン残基。 - EPO分子の33位のCys残基の代わりに非-Cysアミノ酸残基が存在し、EPO分子の88位のTrpの代わりにCys残基が存在し、それによって融合タンパク質内のEPO 部分がCys29-Cys88ジスルフィド結合を形成することが可能である、請求項5記載の二量体Fc-EPO融合タンパク質。
- 33位の非-Cysアミノ酸残基がProである、請求項6記載の二量体Fc-EPO融合タンパク質。
- EPO部分が以下から選ばれる1以上の変異を含む請求項1〜7のいずれか1項記載の二量体Fc-EPO融合タンパク質:
(i)Arg131→Glu131;
(ii)Arg139→Glu139;
(iii)His32→Gly32
(iv)Ser34→Arg34;
(v)Pro90→Ala90。 - リンカーペプチドがグリコシル化部位を含む、請求項1〜8のいずれか1項記載の二量体Fc-EPO融合タンパク質。
- グリコシル化部位がAsn-Ala-Thrアミノ酸配列を含む、請求項9記載の二量体Fc-EPO融合タンパク質。
- 完全なIgG分子がIgG2に由来し、ヒンジ領域がIgG1に由来する、請求項1〜10のいずれか1項記載の二量体Fc-EPO融合タンパク質。
- 更にCH1ドメインを含む、請求項1〜11のいずれか1項記載の二量体Fc-EPO融合タンパク質。
- 融合タンパク質が、20〜22個のシアル酸残基を有する、請求項1〜12のいずれか1項記載の二量体Fc-EPO融合タンパク質。
- 配列:
EPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQAQSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSATATPGAAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR (配列番号:14)
を含む、二量体Fc-EPO融合タンパク質。 - 配列:
EPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQAQSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSATATPGAAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEGPSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPCEALQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR (配列番号:15)
を含む、二量体Fc-EPO融合タンパク質。 - 請求項1〜15のいずれか1項記載の融合タンパク質をコードするDNA分子。
- 請求項1〜15のいずれか1項記載の融合タンパク質を効果的量で含み、場合により製薬的に許容される単体、希釈剤または賦形剤とを含む、哺乳動物の造血疾患または不全の治療に適した医薬組成物。
- N-末端側にFc部分を含みC-末端側にエリスロポエチンを含む、哺乳動物への投与に適した高度にシアル酸化された精製されたFc-EPO融合タンパク質の集団であって、前記精製されたFc-EPO融合タンパク質1分子あたり平均15〜28個のシアル酸残基を有し、それぞれのFc-EPO融合タンパク質をコードするDNA分子をBHK細胞に導入し、対応する前記Fc-EPO融合タンパク質を発現、単離及び精製することによって得られ、NS/0、PerC6または293細胞中で合成された対応するFcーEPO融合タンパク質の集団に比較して長い血清半減期を有する前記Fc-EPO融合タンパク質の集団。
- 精製されたFc-EPO融合タンパク質1分子あたり平均20〜22個のシアル酸残基を有する、請求項18記載のFc-EPO融合タンパク質の集団。
- BHK細胞が無タンパク質培地又は懸濁液中での増殖に適応している、請求項18又は19記載の精製されたFc-EPO融合タンパク質の集団。
- 以下の工程を含む、N-末端側にFc部分を含みC-末端側にエリスロポエチンを含む、哺乳動物への投与に適した高度にシアル酸化された精製されたFc-EPO融合タンパク質の集団を作製する方法:
(i)Fc-EPO融合タンパク質をコードするDNA分子を構築する工程;
(ii)無タンパク質培地中または懸濁状態で、前記DNA分子でBHK細胞を形質転換する工程;
(iii)前記DNA分子よってコードされるFc-EPO融合タンパク質の集団を発現させる工程;
(iv)前記Fc-EPO融合タンパク質の集団を回収、単離および精製する工程。 - 作製された融合タンパク質の集団が、精製されたFc-EPO融合タンパク質あたり平均15〜28個のシアル酸残基を有する、請求項21記載の方法。
- 作製された融合タンパク質の集団が、精製されたFc-EPO融合タンパク質あたり平均20〜22個のシアル酸残基を有する、請求項22記載の方法。
- 以下の工程を含む、Fc部分およびエリスロポエチン部分を含むFc-EPO融合タンパク質をコードする核酸配列を安定に維持するBHK細胞を選抜する方法:
(a)ハイグロマイシンBをコードする核酸配列および前記Fc-EPO融合タンパク質をコードする核酸配列をBHK細胞に導入する工程;
(b)前記BHK細胞をハイグロマイシンBの存在下で培養する工程。 - ハイグロマイシンBをコードしている核酸配列及びFc-EPO融合タンパク質をコードする核酸配列が単一のDNA分子中に存在する、請求項24記載の方法。
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