JP2008119000A - タンパク質の産生方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】E.coliチオレドキシンまたは改変E.coliチオレドキシンのような封入パートナータンパク質の遺伝的配列に作動可能に連結された、ポリペプチドをコードする遺伝的配列を含む遺伝子構築物を形成することにより、遺伝子構築物を含む宿主細胞は細胞内封入体としてポリペプチドを産生する。該方法は、組換えタンパク質の迅速な単離および精製を容易にし、小さくそして代表的には発現させることが困難なポリペプチドまたはタンパク質、またE.coliのような宿主細胞に毒性のタンパク質の産生に有用であり得る。該方法はタンパク質分子量ラダーを産生し、タンパク質ゲル電気泳動で使用する。
【選択図】なし
Description
本発明は、第1のポリペプチドをコードする遺伝的配列が、チオレドキシンまたは改変されたチオレドキシンのような封入パートナータンパク質をコードする遺伝的配列に、作動可能に連結または融合され、発現時に宿主細胞中で封入体を形成し得る系を提供する。詳細には、本発明は、封入体の形態でポリペプチドを産生するための方法を提供し、この方法は、(a)封入パートナータンパク質をコードする第2の核酸分子に作動可能に連結される組換えポリペプチドをコードする第1の核酸分子を含む宿主細胞を得る工程であって、それによって遺伝子融合構築物を形成する、工程;および(b)宿主細胞中での封入体としてのポリペプチドの産生に好都合な条件下で、上記の宿主細胞を培養する工程、を包含する。本発明はまた、(c)宿主細胞から封入体を単離する工程;および(d)封入体からポリペプチドを放出する工程、をさらに包含する上記方法を提供する。本発明によれば、ポリペプチドをコードする第1の核酸分子は、原核生物細胞、詳細には細菌細胞、および最も詳細にはEscherichia coli細胞から、または真核生物細胞、詳細には動物細胞、植物細胞、もしくは酵母細胞、より詳細には哺乳動物細胞、および最も詳細にはヒト細胞から得られ得、そして封入パートナータンパク質をコードする第2の核酸分子は、細菌細胞、最も好ましくはEscherichia coli細胞から得られ得る。封入パートナータンパク質は、宿主細胞での発現の際に封入体を形成する任意のタンパク質であり得、そして好ましくは細菌タンパク質、より好ましくは細菌チオレドキシンまたは改変された細菌チオレドキシン、および最も好ましくはカルボキシ末端短縮型形態のE. coliチオレドキシンである。好ましくは、遺伝子融合構築物は、宿主細胞に導入される前にベクターに挿入される。本発明の1つの局面によれば、目的のポリペプチドは、遺伝子融合構築物によって形成される封入体から、臭化シアンのような化学薬品で、またはより好ましくはトロンビンもしくはエンテロキナーゼのような酵素での切断によって放出され得る。他の局面によれば、タンパク質特異的切断部位をコードする核酸配列は、遺伝子融合構築物中の封入パートナータンパク質と組換えポリペプチドとをコードする核酸配列の間に配置され得;宿主細胞において封入体としての融合タンパク質の発現時に、次いで、組換えポリペプチドは、タンパク質特異的切断部位で特異的に認識しそしてそこで切断する酵素または他の化学薬品で封入体を処理することによって、そこから放出され得る。本発明はまた、遺伝子融合構築物がプラスミドpTrcprl-モノマーを含む上記の方法を提供し、そしてプラスミドpTrcprl-モノマーを提供する。本発明はまた、宿主細胞が、細菌細胞、最も好ましくはEscherichia coli細胞であり、そして使用されるベクターが、発現ベクター、最も好ましくはプラスミドpTrc99AまたはpTrxfusである、上記の方法に関する。本発明はまた、これらのベクター、ならびにこれらのベクターを含む宿主細胞、詳細には細菌細胞、および最も詳細にはEscherichia coli細胞を提供する。本発明は、最も詳細には、バクテリオファージT4の遺伝子32タンパク質のフラグメント、KpnIメチラーゼのフラグメント、およびDead-Boxタンパク質のフラグメントの産生のための方法に関するが、任意の組換えポリペプチドが、本発明の方法によって産生され得る。本発明はまた、上記の方法によって産生される組換えポリペプチドを提供する。したがって、本発明の系は、宿主細胞において封入体として任意の異種タンパク質を産生するための信頼できる方法を提供し、それによって細菌宿主細胞中で産生される組換えタンパク質の迅速な単離および精製を容易にする。さらに、本発明によって提供される方法を用いて、小さいかまたは発現することが困難であるポリペプチド、ならびに宿主細胞(例えば、E. coli)に毒性であるポリペプチドを産生し得る。
(a)1つ以上のポリペプチドまたはタンパク質を含む試料を、1つ以上の染料と混合または接触させる工程;および
(b)同じまたは実質的に同じサイズを有する染色されたタンパク質またはポリペプチドを産生するために十分な条件下で、混合物をインキュベートする工程。このような方法は、染色されたタンパク質をサイズによって分離する工程をさらに包含し得る。サイズ分離は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを含む、任意の公知の技術によって達成され得る。
(a)1つ以上のポリペプチドまたはタンパク質を含む試料を、1つ以上の染料と混合または接触させる工程;および
(b)染色されたタンパク質またはポリペプチドを産生するために十分な条件下で、混合物をインキュベートする工程であって、ここで実質的にすべてのタンパク質またはポリペプチドが染料と複合体化される、工程。このような方法は、染色されたタンパク質を上記のような標準的技術を使用してサイズによって分離する工程を、さらに包含し得る。
(a)本発明のタンパク質分子量ラダー、および未知のサイズの1つ以上のタンパク質またはポリペプチドを、サイズによって分離する工程;および
(b)タンパク質またはポリペプチドのサイズおよび/または分子量を決定する工程。このような決定は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などのような標準的技術による未知のタンパク質またはポリペプチドの移動度の、本発明の分子量ラダーの移動度との比較によって行われ得る。
本特許の出願は、カラーで作製された少なくとも1枚の図面を含む。カラー図面を有する本特許のコピーは、請求書および必要な手数料の支払いによって、米国特許商標庁によって提供される。各図面の簡単な説明については後述する。
定義
以下に続く説明では、分子生物学およびタンパク質工学の分野で従来使用されている多くの用語が、広く利用される。明細書および請求の範囲、ならびにこのような用語で与えられるべき範囲の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
本発明は、宿主細胞から組換えポリペプチドを産生および単離するための方法を提供し、ここで、組換えポリペプチドは、宿主細胞において封入体として産生される。詳細には、この方法は、(a)封入パートナータンパク質をコードする第2の核酸分子に作動可能に連結される組換えポリペプチドをコードする第1の核酸分子を含む宿主細胞を得る工程であって、それによって遺伝子融合構築物を形成する、工程;および(b)宿主細胞中での封入体としてのポリペプチドの産生に好都合な条件下で、上記の宿主細胞を培養する工程、を包含する。本発明はまた、(c)最も好ましくは遠心分離によって、宿主細胞から封入体を単離する工程;および(d)封入体からポリペプチドを放出させる工程、をさらに包含する上記の方法を提供する。本発明によれば、ポリペプチドをコードする第1の核酸分子は、原核生物細胞、特定には細菌細胞、および最も特定にはEscherichia coli細胞から、あるいは真核生物細胞、特定には動物細胞、植物細胞、または酵母細胞、より特定には哺乳動物細胞、および最も特定にはヒト細胞から得られ得、そして封入パートナータンパク質をコードする第2の核酸分子は、任意の細胞、好ましくは細菌細胞、および最も好ましくはEscherichia coli細胞から得られ得る。本発明で使用される封入パートナータンパク質は、宿主細胞での発現の際に封入体を形成する任意のタンパク質であり得、そして好ましくは細菌タンパク質、より好ましくは細菌チオレドキシンまたは改変された細菌チオレドキシン、および最も好ましくは以下でより詳細に記載するようなカルボキシ末端短縮型のE. coliチオレドキシンである。好ましくは、遺伝子融合構築物は、宿主細胞に導入される前にベクターに挿入される。本発明の1つの局面によれば、目的のポリペプチドは、遺伝子融合構築物によって形成される封入体から、臭化シアンのような化学薬品で、またはより好ましくはトロンビンもしくはエンテロキナーゼのような酵素での切断によって放出され得る。別の局面によれば、タンパク質特異的切断部位をコードする核酸配列は、遺伝子融合構築物中の封入パートナータンパク質と組換えポリペプチドとをコードする核酸配列の間に配置され得;宿主細胞における封入体としての融合タンパク質の発現時に、組換えポリペプチドは、次いで、タンパク質特異的切断部位を特異的に認識しそしてそこで切断する酵素または他の化学薬品で封入体を処理することによって、そこから放出され得る。本発明はまた、遺伝子融合構築物がプラスミドpTrcprl-モノマーを含む上記の方法を提供し、そしてプラスミドpTrcprl-モノマーを提供する。本発明はまた、宿主細胞が、細菌細胞、最も好ましくはEscherichia coli細胞であり、そして使用されるベクターが、発現ベクター、最も好ましくはプラスミドpTrc99AまたはpTrxfusである、上記の方法に関する。本発明はまた、これらのベクター、ならびにこれらのベクターを含む宿主細胞、特定には細菌細胞、および最も特定にはEscherichia coli細胞を提供する。本発明は、さらに、上記の方法によって作製される組換えポリペプチド、プラスミドpTrcprl-モノマー、およびプラスミドpTrxA-concatを提供する。
本発明の方法は、封入パートナータンパク質をコードする第2の核酸分子に作動可能に連結された、第1のポリペプチドをコードする核酸分子を含む遺伝子融合構築物を産生するために、遺伝子融合技術を利用する。第1のポリペプチドをコードする核酸分子は、細菌細胞、特定にはE. coli細胞から;動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、および最も好ましくはヒト細胞から;植物細胞から;または酵母細胞から得られ得る。以下でより詳細に記載されるように、封入パートナータンパク質をコードする核酸分子は、任意の細胞から、好ましくは細菌細胞から、および最も好ましくはEscherichia coli細胞から得られ得る。
本発明はまた、本発明の単離されたDNA分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作された宿主、ならびにこれらのベクターおよび宿主細胞を使用する組換えポリペプチドの産生のための方法に関する。
封入パートナータンパク質をコードする改変型の遺伝子の使用により、細胞内封入体として、目的のポリペプチドを含む融合タンパク質を産生するように、宿主細胞が誘導されることが、本発明で思いがけずに発見された。本明細書で使用される場合、用語「改変型の遺伝子」とは、遺伝子の正常または最も普通に見いだされる配列の変更を含む遺伝子の型を意味し、これにより、融合または非融合状態で、宿主細胞における封入体中に、コードされたタンパク質が発現される。このような変更としては、欠失、置換、挿入、点変異などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明での使用のために、遺伝子融合構築物は、宿主細胞の染色体に挿入され得るか、または好ましくは発現ベクターであるベクター中に存在し得る。形質転換された宿主細胞を産生するための宿主細胞への遺伝子融合構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によって行われ得る。このような方法は、Davisら, Basic Methods In Molecular Biology (1986)のような、多くの標準的実験室マニュアルに記載される。一旦形質転換された宿主細胞が得られると、細胞は、宿主細胞増殖を支持する炭素、窒素、および必須ミネラルの吸収可能供給源を含む任意の適切な栄養培地中で、pHおよび温度の任意の生理学的に適合可能な条件下で培養され得る。組換えタンパク質産生培養条件は、宿主細胞を形質転換するために使用されるベクターの型に従って変化する。例えば、特定の発現ベクターは、組換えポリペプチドの産生を生じる遺伝子発現を開始するために、特定の温度での細胞増殖、または特定の化学薬品もしくは誘導剤の細胞増殖培地への添加を必要とする調節領域を含む。したがって、本明細書で使用される場合、用語「組換えポリペプチド産生条件」は、培養条件の任意の1セットに限定されることを意味しない。上記の宿主細胞およびベクターに適切な培養培地および条件は、当該技術分野で周知である。
当業者に周知であるように、組換えDNA技術によるポリペプチドの産生のための方法は、代表的には、封入体からのポリペプチドの単離における認識されたおよび実際の困難性のため、宿主細胞において封入体中のポリペプチドの産生を最小にするように設計される。しかし、本発明によれば、封入体中の組換えポリペプチドの産生は、ポリペプチドの迅速な単離および精製を提供するために有利に使用され得る。
別の局面では、本発明の方法は、電気泳動のようなタンパク質分析技術において分子量または分子サイジングスタンダードとして使用されるタンパク質分子量ラダーを調製するために使用され得る。実施例3〜9で以下により詳細に記載されるこの実施態様では、一連の融合タンパク質が作製され得、ここで封入パートナータンパク質は、1つ以上の組換えポリペプチドまたはそのフラグメントに連結される。例えば、改変されたチオレドキシン封入パートナータンパク質をコードする核酸分子は、プラスミドpTrxA-concatのような融合ベクターを形成するために、ベクター(好ましくは、発現ベクター)に挿入され得る(図4;配列番号8)。次いで、このベクターは、それぞれ選択されたサイズ(例えば、5kDまたは10kD)のチオレドキシン(図5;配列番号11)、E. coli Dead-Boxタンパク質(図6;配列番号14)、KpnIメチラーゼ(図7;配列番号17)、または264-bp改変T4遺伝子32タンパク質(図1;配列番号1)のような組換えポリペプチドの単一または複数のフラグメントに連結され得る。核酸分子またはベクターの宿主細胞への挿入(すなわち、宿主細胞の形質転換)後、次いで、ポリペプチドは、宿主細胞における核酸分子の発現によって産生され得る。いくつかの発現シナリオが可能であることは、当業者に明らかである。例えば、本発明の方法は、分子量ラダーを形成する複数のポリペプチドをコードする核酸分子を産生するために、またはそれぞれがラダーの種々の分子量のポリペプチドをコードする多数の核酸分子を産生するために使用され得る。次いで、宿主細胞は、複数のこのようなポリペプチドをコードする核酸で、または種々の分子量のポリペプチドをそれぞれコードする多数の核酸分子で、形質転換され得る。あるいは、多数の宿主細胞は、分子量ラダーの種々のポリペプチドをコードする単一の核酸分子でそれぞれ形質転換され得;このシナリオでは、宿主細胞によって産生されるポリペプチドは、分子量ラダーを形成するために混合される。これらのシナリオのそれぞれでは、これらの構築物の発現は、好ましくは、5〜10kDほどの小ささから250〜330kDほどの大きさまでのポリペプチドを含む宿主細胞において封入体を産生する。さらに、本発明の方法によって産生されるラダーの分子量の増分は、封入パートナータンパク質遺伝子融合構築物に連結された組換えポリペプチド遺伝子の長さまたはコピー数を単に変化させることによって規定され得る。したがって、例えば、5kD、10kD、20kD、25kD、50kD、100kD、またはそれより大きなkDずつ増加する、例えば、約5kD〜約300kD、好ましくは約5kD〜約250kD、およびより好ましくは約10kD〜約220kDの範囲のタンパク質の収集物を含むタンパク質ラダーを産生することは、本発明によって可能である。もちろん、他の分子量またはサイズ増加が、特定の適用により適切であり得、そして本発明の方法のほんのマイナーな改変によって(例えば、上記のように融合された組換えポリペプチドをコードする遺伝子の長さを増加または減少させることによって)調製され得ることは、当業者に理解され;したがって、このような方法および組成物は、本発明の範囲またはその任意の実施態様から逸脱せずに提供され得る。
特定の実施例で他に明記されなければ、以下の材料および方法を、実施例で一般的に使用した。
制限酵素、T4 DNAリガーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、および熱感受性アルカリホスファターゼを含むすべての酵素を、他に記載がなければ、Life Technologies, Inc. (LTI; Rockville, Maryland)から得た。E. coli発現ベクターpTrc99Aを、Pharmacia (Piscataway, New Jersey)から得た;pTrxfusを、Genetics Institute (Cambridge, Massachusetts)またはInvitrogen (San Diego, California)から得、pRE1を、McKenney博士(Reddyら, Nucl. Acids Res. 17:10473-10488 (1989))から得た。Toyo-Pearl AF キレート-650M樹脂を、TosoHaas (Montgomeryville, Pennsylvania)から購入した。pRK248cl(テトラサイクリンr)およびStbl2を含むかまたは含まないE. coli発現宿主DH10Bを、Life Technologies, Inc. (Rockville, Maryland)から得た。
264bp(配列番号1)AvaIフラグメントは、pPrL2107(米国特許第5,449,758号)に由来した。このフラグメントは、非常に改変されているT4遺伝子32タンパク質の一部である。このAvaIフラグメントを使用して、pPrL2001中にマルチマー(米国特許第5,449,758号を参照のこと)を作製した。12インサートを有するクローンを選択し、そしてpPrL2738と命名した。クローニングされたフラグメントを、以下のようにpTrc99Aに再クローニングした:組換えプラスミドを、EcoRIで切断し、そしてdNTPの存在下でクレノウフラグメントで平滑末端にし;NcoIで切断し、そしてこのフラグメントをGENE CLEANTM(Bio101)によって精製した。ベクターpTrc99Aを、SalIで切断し、クレノウフラグメントで平滑末端にし、そしてNcoIで切断した。ゲル精製したベクターを、ゲル精製したフラグメントと連結し、そしてDH10Bに形質転換した。クローンを、pTrcprlと命名した。
であった。オリゴヌクレオチドを、テンプレートとしてpTrxfusを使用して、PCRについて使用した。PCR産物を、NdeIおよびPstI(下線を引いたオリゴヌクレオチドに組み入れられる)で切断し、そしてNdeIおよびPstIで切断されたpTrxfusにクローニングした。このプラスミドを、pTrxfusprl10A(配列番号5)と命名した。
を使用して、以下のようにマルチマーを作製するために代わりのベクターを生成した:オリゴヌクレオチドを使用して、テンプレートとしてpTrxfusを使用してPCR産物を生成した。PCR産物を、NcoIおよびAvaIで切断し、そしてpTrcprl-モノマーにクローニングして、改変されたT4遺伝子32遺伝子のNcoI-AvaIフラグメントを置換した。このプラスミドを、pTrxA-concat(配列番号8)と命名した。この構築物は、チオレドキシンからのアミノ酸1〜75、76番目のアミノ酸としてのグリシン、および6カルボキシ末端ヒスチジン残基を含むpTrcprl-モノマーからのアミノ酸77〜90を含んだ。この構築物を、上記のようにAvaIフラグメントまたはAvaIフラグメントのマルチマーのインフレーム連結によって融合タンパク質を生成するために作製した。マルチマーを作製するために、本発明者らは、チオレドキシン、DEAD-box、またはKpnIメチラーゼのようないくつかのテスト遺伝子から、PCRによって生成したAvaIフラグメントを使用した。チオレドキシン遺伝子(Hoogら, Bioscience Reports 4:917-923 (1984))からAvaIフラグメントを生成するために使用したオリゴヌクレオチドは、
であった。PCR産物(配列番号11)を、AvaIで切断し、そして100pmolのインサートおよび1pmolのベクターを使用してAvaI切断して脱リン酸化したpTrxA-concatに連結した。単一または複数のインサートを有するクローンを、NcoIおよびPstIでの切断後のインサートのサイズを見積もることによって選択した。最終的に、所望のインサートを、NdeI-PstIフラグメントとしてpTrxfusにクローニングした。したがって、これらのクローンは、20kD、30kD、40kDなどとして、チオレドキシン-(チオレドキシン)n融合タンパク質を産生する。DEAD-box遺伝子(Tooneら, J. Bacteriol. 173(11):3291-3302 (1991))からAvaIフラグメントを生成するために使用されたオリゴヌクレオチドは、
であった。PCR産物(配列番号14)を、テンプレートとしてE. coli染色体を使用して生成した。PCR産物をAvaIで切断し、そして上記のようにpTrxA-concatで連結した。種々のインサートを有するクローンを選択し、そして上記のようにpTrxfusに再クローニングした。これらのクローンを、15kD、20kD、25kDなどとしてチオレドキシン-(DEAD-box)n融合タンパク質を産生するように設計した。チオレドキシン-KpnIメチラーゼ融合タンパク質を作製するために、使用されたオリゴヌクレオチドは、
であった。PCRに使用したテンプレートは、KpnIメチラーゼクローンであった(Chatterjeeら, Nucleic Acids Res. 19:6505-6509 (1991))。PCR産物(配列番号17)をAvaIで切断し、そしてpTrxA-concatに連結し、そして最終的にNdeI-PstIフラグメントを、pTrxfusプラスミドにサブクローニングした。このプラスミドを、40kDチオレドキシン-KpnIメチラーゼ融合タンパク質を産生するために生成した。
pTrcprl構築物を含むE. coli DH10BまたはStbl2(LTI; Rockville, Maryland)を、100μg/mlでアンピシリンを含む緩衝剤リッチ培地中で37℃にて増殖させた。クローンを、OD590=1.0まで増殖させ、そして1mMの最終濃度までのIPTGで3時間誘導した。クローンを、37℃にて3時間インキュベートした。pTrxfus構築物を、100μg/mlのアンピシリンおよび15μg/mlのテトラサイクリンを含む緩衝剤リッチ培地中で30℃にて増殖させた。クローンを、OD590=1.0まで増殖させ、そして42℃にて30分間加熱によって誘導し、続いて37℃にて3時間増殖させた。細胞を、1mlの超音波処理緩衝液(10mM Tris-HCl 7.5、1mM EDTA、および10mMβ-メルカプトエタノール)に再懸濁し、続いて3×10秒間超音波処理した。全細胞抽出物について100μlを取り出した。アリコートを取り出して、総タンパク質としてタンパク質を分析した。超音波処理した試料を、4℃にて10分間回転させ、そして上清をエッペンドルフチューブに移した(可溶性)。
細胞を、1g:2mL比の20mM Tris-HCl、2mM MgCl2, pH 8.0緩衝液でスラリーにした。American International Chemicalからの組換えエンドヌクレアーゼであるベンゾナーゼ(benzonase)を、1mLのスラリー当たり25ユニットの比で添加した。細胞を、高圧実験室ホモジナイザーModel MINI-LAB,7.30VH mm型(APV Rannieから)を、12,000psiで2回通して破砕した。次いで、試料を、RC-5遠心分離機で10,000×gにて30分間回転して、封入体をペレットにし、一方、細胞破片のほとんどを上清液体中に残した。次いで、封入体ペレットを、TekmarからのUltra Torrax Tissuemizerを使用して滅菌水で約20〜25℃にて2回洗浄して、ペレットを十分に懸濁した。次いで、ペレットを、8M尿素、100mM H2NaPO4、4mMイミダゾール、pH8.4緩衝液で可溶にし、そしてTosoHaasからのToyopearl AF Chelate-650M樹脂にロードした。試料をロードする前に、樹脂を、3カラム容量の1M 硫酸ニッケル溶液でチャージし、3カラム容量の水で洗浄し、次いで3カラム容量の8M尿素、100mM H2NaPO4、4mMイミダゾール、pH8.4(緩衝液)で平衡化した。試料をロードした後、カラムを、10カラム容量の緩衝液で洗浄し、次いでタンパク質を、8M尿素、100mM H2NaPO4、pH3.5で単一の画分に溶出させ、そして5mM EDTAを含む水に対する透析によって沈殿させた;EDTAは、長期保存時にタンパク質を変性させる遊離のニッケルイオンをキレート化するために含まれた。沈殿物を、RC-5遠心分離機で10,000×gにて遠心分離し、次いで1%SDS/水に可溶化した。
10、15、20、25、30、40、70、100、および160kDaタンパク質を、1%SDS H2Oで8A280ユニット/mlまで希釈した。各タンパク質溶液を、緩衝液280mMリン酸ナトリウム、160mM塩化ナトリウム、1%(w/v)SDS、pH9.2の等容量と合わせ、そして50℃にて15分間加温した。RBBRのストック溶液(20mg/mlおよび60mg/ml)を、140mMリン酸ナトリウム、80mM塩化ナトリウム、1%(w/v)SDS、pH9.2中で調製し、ボルテックスし、そして50℃にて15分間インキュベートした。次いで、10、15、20、30、70、および160kDaタンパク質溶液を、等容量の加温した60mg/ml RBBRストックと個々に混合し、ボルテックスし、そして50℃にて14〜18時間インキュベートした。40および100kDaタンパク質溶液を、等容量の加温した20mg/ml RBBRストックと個々に混合し、ボルテックスし、そして50℃にて14〜18時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、溶液を水浴から取り出し、室温まで平衡にし、0.8μm cameoフィルターを通して濾過して、あらゆる残りの粒子を除去し、そして使用まで4℃にて保存した。
1%SDS/H2O中の8A280/ml 50kDaストックを、等容量の280mMリン酸ナトリウム、160mM塩化ナトリウム、1%(w/v)SDS、pH9.7緩衝液と合わせ、混合し、そして50℃にて15分間加温した。エオシンイソチオシアネート(EITC)の70mg/mlストックを、使用の直前にジメチルホルムアミド中で調製し、そしてこの溶液の十分量を50kDaタンパク質溶液に添加して、7mg/ml EITCの最終濃度を達成した。次いで、溶液を混合し、暗中で14〜18時間50℃にてインキュベートし、室温まで平衡にし、0.8μm cameoフィルターカートリッジを通して濾過し、そして4℃にて暗中で保存した。
標識の質を、SDS-PAGE(Laemmli, E.K., Nature 227:680-685 (1970))上に各タンパク質ストックを流すことによって評価し、次いで、等しい強度を有することが可視的に明らかであるバンドを生じるようなタンパク質の量で、タンパク質のすべての混合物を調製した。次いで、混合物を、3,000分子量カットオフミニウルトラセットユニットを使用して、10%グリセロール、50mM TRIS、5mM EDTA(保存の際の調製物の安定性を増強するため)、pH6.8緩衝液で、ダイアフィルトレートした。Sephadex G-25カラムを使用して、ダイアフィルトレーション後に残った少量の未反応染料を除去した。Sephadexカラムを50mM Tris、1%(w/v)SDS、5mM EDTA、pH6.8で平衡化し、そしてカラムサイズは、試料の容量の15倍であった。SDS-PAGEを、混合物の質を評価するために、最終混合物で行った。
最初の目的は、10kDずつの増分の10kD〜250kDの範囲のタンパク質分子量スタンダードを作製することであった。それゆえ、カルボキシ末端に6ヒスチジン残基を含む87アミノ酸(261bp)を含むT4遺伝子32タンパク質の改変された部分(図1;配列番号1)(米国特許第5,449,758号を参照のこと)を使用した。フラグメントをクローニングし、そして発現させて10kDタンパク質を産生した。このクローンを、プラスミドpTrcprl-モノマーと命名した。この構築物は、CTCGGG配列を有する任意の所定のAvaIフラグメントのマルチマーを生成するために、独特のAvaI部位(CTCGGG)を含む。AvaIで切断した場合、クローンは、TCGG突出を生じる。したがって、両末端にTCGG突出を有するDNAフラグメントを、AvaI切断したpTrcprl-モノマーと連結する場合、フラグメントは、1方向のみに(頭から尾へ)連結される。適切な連結条件を使用して、所望のフラグメントのマルチマーを生成することが可能であった。例えば、単一のAvaIフラグメント(264bp)がpTrcprl-モノマーに連結される場合、20kDタンパク質を産生する;2つのフラグメントが連結される場合、30kDタンパク質を産生するなどである。
短縮型チオレドキシンとの融合タンパク質を作製するために、コンカテマーを作製するために使用される、独特のAvaI部位を含むベクターを開発し;このベクターを、pTrxA-concatと命名した(図4;配列番号8)。このベクターを使用して、一連の融合タンパク質を、チオレドキシン(図5;配列番号11)(チオレドキシン-チオレドキシン融合体)、E. coli DEAD-boxタンパク質(図6;配列番号14)、KpnIメチラーゼ(図7;配列番号17)、または264-bpの改変されたT4遺伝子32タンパク質(図1;配列番号1)の単一または多数のフラグメントにベクターを連結して作製した(米国特許5,449,758を参照のこと)。
その有用性を証明するために、本発明の系を使用して、染色されていないタンパク質分子量ラダーを作製した。実施例2に記載のように作製された、種々のサイズの精製されたタンパク質を混合し、SDS-PAGEによって分離し、そして種々のアクリルアミド濃度でのバンド分離パターンを観察した。
予備染色したタンパク質分子量ラダーは、2つの異なる形態で10年より長く市販されている。1つの形態では、タンパク質のすべてが単一の染料で染色され、そして第2の形態では、各タンパク質は異なる染料で染色される(多色型)。これらの2つの異なる形態は、いくつかの有利点および不利点を有する。単色マーカーは、例えば、代表的には、多色マーカーと比較してSDS-PAGEにおいて比較的鮮明なバンドを生じるように調製されるが、対応する分子量に各バンドを直接関連させることは、困難であり得る。なぜなら、単色に予備染色されたマーカーにおける唯一の評価基準は、最大または最小の分子量のバンドであるからである。これらの参照バンドのいずれかが保存中に消失するか、またはゲル上で分離されないならば、評価基準がないことにより、残りのバンドの同定が困難になる。同様に、多色マーカーでのバンドの同一性の決定は、各バンドが異なる色であるので容易であるが、バンドのいくつかはSDS-PAGEにおいて非常に幅広であり、そして色のいくつかは視覚的に検出することが困難である。
ゲルにおけるクーマシーブルー染色後に分子量を決定するために使用され得るだけでなく、ウェスタンブロッティングのようなメンブレントランスファー技術後の分子量マーカーとしても使用され得る、分子量マーカーを有することは有用である。本発明の方法によって産生される分子量マーカーは、これらの適用の両方について使用され得る。上記のように、染色されていない分子量マーカー混合物中のタンパク質成分のそれぞれは、カルボキシ末端に6ヒスチジン残基を含む。これらの6ヒスチジン残基は、Ni++と相互作用するので(Hochuli,E.およびPiesecki, S., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 4:68-72 (1992))、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド(NBT)/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート p-トルイジン塩(BCIP)とともにNi-NTA-アルカリホスファターゼ結合体を使用して、ウエスタンブロットにおいてタンパク質成分を検出および同定し得る。
本発明の系は、この困難性が、(1) タンパク質のサイズがより小さいこと(一般的に、より小さいタンパク質は、E. coliにおいてより低いレベルで発現される);(2)E. coli宿主に対する異種タンパク質の毒性;(3)E. coliにおける翻訳の効率の悪さ;または(4)mRNAの不安定性のためであるかどうかにかかわらず、E. coliにおいて発現させることが困難であるタンパク質を発現させるために特に有用である。上記の実施例で示されるように、本発明の方法は、封入体としての異種タンパク質の効率的な産生を可能にする。封入体は発現されたタンパク質の単離された形態であるので、この系は、そうでなければE. coliまたは他の細菌宿主細胞で産生されないかもしれない毒性タンパク質または小ペプチドを産生するために使用され得る。この系を使用して、5kDおよびより小さいペプチドが産生されている。この系はまた、250kDのサイズまたはそれより大きいポリペプチドを産生するために使用され得る。
一般的に、タンパク質の化学的改変または結合(例えば、染料でタンパク質を標識すること)には、タンパク質上の官能性反応性基の、標識上の対応する官能性反応性基との反応が含まれる。リジン残基を含むタンパク質のような、アミン含有分子とカップリングし得る反応性基は、染料のような架橋試薬上に存在する断然最も普通の官能基である。したがって、アミンカップリングプロセスは、ほぼすべてのタンパク質またはペプチドを他の分子と結合するために使用され得る。
上の実施例4に記載のように、複合タンパク質分子量ラダーにおける単一タンパク質バンド、特にRBBR標識した40kDバンドと70kDバンドとの間のバンドの、エオシン標識は、ラダーにおける他のタンパク質バンドのすべての迅速かつ正確な同定を可能にする、価値のある参照バンドを提供する。したがって、本発明のラダーにおける使用のために、30kD、40kD、50kD、および60kDのタンパク質をエオシンイソチオシアネートで標識するための最適条件を決定した。
種々の色で染色した参照バンドおよびタンパク質ラダーを提供するために、本発明のタンパク質ラダーを、RBBRおよびエオシンとは異なる色の染料(例えば、マラカイトグリーン)で染色することが有利である。したがって、30kD、40kD、50kD、および60kDのタンパク質をマラカイトグリーンイソチオシアネートで標識するための最適条件を決定した。
Claims (68)
- 封入体の形態でポリペプチドを作製する方法であって、
(a)封入パートナータンパク質をコードする第2の核酸分子に作動可能に連結された該ポリペプチドをコードする第1の核酸分子を含む宿主細胞を得る工程であって、それによって遺伝子融合構築物を形成する、工程;および
(b)該宿主細胞中における封入体としての該ポリペプチドの産生に好都合な条件下で、該宿主細胞を培養する工程、
を包含する、方法。 - (c)前記宿主細胞から前記封入体を単離する工程;および
(d)該封入体から前記ポリペプチドを放出させる工程、
をさらに包含する、請求項1に記載の方法。 - 前記第1の核酸分子が細菌細胞から得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の核酸分子が、動物細胞、植物細胞、または酵母細胞から得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項4に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項5に記載の方法。
- 前記第2の核酸分子が細菌細胞から得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記細菌細胞がEscherichia coli細胞である、請求項7に記載の方法。
- 前記封入パートナータンパク質がチオレドキシンまたは改変されたチオレドキシンである、請求項1に記載の方法。
- 前記改変されたチオレドキシンが短縮型チオレドキシンである、請求項9に記載の方法。
- 前記短縮型チオレドキシンが、配列番号8に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、カルボキシ末端短縮型のEscherichia coliチオレドキシンである、請求項10に記載の方法。
- 前記宿主細胞が細菌細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記細菌細胞がEscherichia coli細胞である、請求項12に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが前記宿主に対して毒性である、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、バクテリオファージT4の遺伝子32タンパク質のフラグメント、KpnIメチラーゼのフラグメント、Escherichia coli Dead-Boxタンパク質のフラグメント、またはEscherichia coliチオレドキシンタンパク質のフラグメントである、請求項1に記載の方法。
- 前記バクテリオファージT4の遺伝子32タンパク質のフラグメントが、配列番号1に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、請求項15に記載の方法。
- 前記KpnIメチラーゼのフラグメントが、配列番号17に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、請求項15に記載の方法。
- 前記Escherichia coli Dead-Boxタンパク質のフラグメントが、配列番号14に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、請求項15に記載の方法。
- 前記Escherichia coliチオレドキシンタンパク質のフラグメントが、配列番号11に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、請求項15に記載の方法。
- 前記遺伝子融合構築物が、pTrcprl-モノマーまたはpTrxA-concatを含む、請求項1に記載の方法。
- 遺伝子融合構築物を含むベクターであって、該遺伝子融合構築物において、ポリペプチドをコードする第1の核酸分子が、封入パートナータンパク質をコードする第2の核酸分子に作動可能に連結され、ここで、該遺伝子融合構築物が、宿主細胞に導入され、該宿主細胞が、封入体として該ポリペプチドを産生する、ベクター。
- 前記封入パートナータンパク質がチオレドキシンまたは改変されたチオレドキシンである、請求項21に記載のベクター。
- 前記改変されたチオレドキシンが短縮型チオレドキシンである、請求項22に記載のベクター。
- 前記短縮型チオレドキシンが、配列番号8に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、カルボキシ末端短縮型のEscherichia coliチオレドキシンである、請求項23に記載のベクター。
- 前記ベクターが発現ベクターである、請求項21に記載のベクター。
- 前記発現ベクターがpTrc99AまたはpTrxfusである、請求項25に記載のベクター。
- 請求項21に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 前記宿主細胞が細菌細胞である、請求項27に記載の宿主細胞。
- 前記細菌細胞がEscherichia coli細胞である、請求項28に記載の宿主細胞。
- ポリペプチドを産生する方法であって、請求項27に記載の宿主細胞を、該宿主細胞における封入体としての該ポリペプチドの産生に好都合な条件下で培養する工程を包含する、方法。
- (b)前記宿主細胞から前記封入体を単離する工程;および
(c)該封入体から前記ポリペプチドを放出させる工程、
をさらに包含する、請求項30に記載の方法。 - 前記封入体から前記ポリペプチドを放出させる工程が、化学的切断方法によって達成される、請求項2または31に記載の方法。
- 前記封入体から前記ポリペプチドを放出させる工程が、酵素的切断方法によって達成される、請求項2または31に記載の方法。
- 前記化学的切断方法が、前記封入体を、前記封入体からの前記ポリペプチドの放出に好都合な条件下でポリペプチド放出量の化学的切断剤と接触させる工程を包含する、請求項32に記載の方法。
- 前記化学的切断剤が、臭化シアンまたはヒドロキシルアミンである、請求項34に記載の方法。
- 前記酵素的切断方法が、前記封入体を、前記封入体からの前記ポリペプチドの放出に好都合な条件下でポリペプチド放出量の酵素的切断剤と接触させる工程を包含する、請求項33に記載の方法。
- 前記酵素的切断剤が、第Xa因子、トロンビン、またはエンテロキナーゼである、請求項36に記載の方法。
- 前記酵素的切断剤がエンテロキナーゼである、請求項37に記載の方法。
- 請求項1または請求項30に記載の方法によって産生されるポリペプチド。
- プラスミドpTrcprl-モノマー。
- プラスミドpTrxA-concat。
- 異なる分子量の複数のポリペプチドを含むタンパク質分子量ラダー組成物を作製する方法であって、
(a)1つ以上の核酸分子を得る工程であって、該核酸分子のそれぞれが、該分子量ラダーの異なる分子量の1つ以上のポリペプチドをコードする、工程;
(b)1つ以上の宿主細胞を1つ以上の該核酸分子で形質転換する工程;
(c)該分子量ラダーの該ポリペプチドのそれぞれの産生に好都合な条件下で、該宿主細胞を培養する工程;および
(d)該ポリペプチドのそれぞれを単離する工程、
を包含する、方法。 - 少なくとも1つの前記核酸分子が、前記分子量ラダーの異なる分子量の複数の前記ポリペプチドをコードする、請求項42に記載の方法。
- 前記核酸分子が、それぞれ、前記分子量ラダーの異なるポリペプチドをコードする、請求項42に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、前記分子量ラダーの前記複数のポリペプチドをコードする前記核酸分子を含む、請求項43に記載の方法。
- 前記宿主細胞のそれぞれが、前記分子量ラダーの異なるポリペプチドをそれぞれコードする異なる核酸分子を含む、請求項44に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、前記分子量ラダーの異なるポリペプチドをそれぞれコードする2つ以上の前記核酸分子を含む。請求項44に記載の方法。
- 前記方法が、前記異なるポリペプチドのそれぞれを混合して分子量ラダーを形成する工程をさらに含む、請求項46に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが封入体として産生される、請求項42に記載の方法。
- 前記核酸分子が、前記宿主細胞を形質転換する前にベクターに挿入される、請求項42に記載の方法。
- 前記ベクターが発現ベクターである、請求項50に記載の方法。
- 1つ以上の染色されたポリペプチドを作製する方法であって、該ポリペプチドを、該ポリペプチドを1つ以上のタンパク質結合染料と実質的に完全に複合体化するために十分なインキュベーション条件下で該染料とともにインキュベーションする工程を含む、方法。
- 前記インキュベーション条件が、前記ポリペプチドを、約7〜約12のpHを有する溶液中で前記1つ以上の染料とともにインキュベートする工程を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記インキュベーション条件が、前記ポリペプチドを、約7〜約10のpHを有する溶液中で前記1つ以上の染料とともにインキュベートする工程を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記インキュベーション条件が、前記ポリペプチドを、約8〜約10のpHを有する溶液中で前記1つ以上の染料とともにインキュベートする工程を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記インキュベーション条件が、前記ポリペプチドを、前記1つ以上の染料とともに約20℃〜約90℃の温度でインキュベートする工程を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記インキュベーション条件が、前記ポリペプチドを、前記1つ以上の染料とともに約40℃〜約80℃の温度でインキュベートする工程を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記インキュベーション条件が、前記ポリペプチドを、前記1つ以上の染料とともに約45℃〜約70℃の温度でインキュベートする工程を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記インキュベーション条件が、前記ポリペプチドを、前記1つ以上の染料とともに約50℃の温度でインキュベートする工程を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記インキュベーション条件が、前記ポリペプチドを、前記1つ以上の染料とともに約4〜約200時間インキュベートする工程を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記インキュベーション条件が、前記ポリペプチドを、前記1つ以上の染料とともに約12〜約24時間インキュベートする工程を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記インキュベーション条件が、前記ポリペプチドを、約12〜約18時間または一晩、前記1つ以上の染料とともにインキュベートする工程を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、分子量ラダー組成物を提供する、請求項52に記載の方法。
- 前記分子量ラダー組成物が、第1のタンパク質染色染料で染色した第1のポリペプチド、ならびに前記第1のポリペプチドとは異なり、かつ第2のタンパク質染色染料で染色した相互に異なる分子量の複数のポリペプチドを含む、請求項63に記載の方法。
- 前記第1のタンパク質染色染料が、レマゾールブリリアントブルーR、エオシンイソチオシアネート、およびマラカイトグリーンイソチオシアネートからなる群より選択される、請求項64に記載の方法。
- 前記第1のタンパク質染色染料が、エオシンイソチオシアネートである、請求項64に記載の方法。
- 請求項52に記載の方法によって作製される、染色されたタンパク質。
- 請求項63に記載の方法によって作製される、染色されたタンパク質分子量ラダー組成物。
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