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Die
vorliegende Erfindung betrifft einen Molekulargewichtsmarker der
zur Analyse von Proteinen anhand ihrer unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit
im elektrischen Feld verwendet wird.
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Ferner
offenbart die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Molekulargewichtsmarkers.
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Eine
nahezu alltägliche
Aufgabe in der Biochemie ist es, eine oder mehrere biochemische
Verbindungen aus einem Gemisch unbekannter Zusammensetzung zu trennen
und zu isolieren. Für
solche Trennungen und Isolierungen werden häufig chromatographische und
elektrophoretische Arbeitsmethoden eingesetzt, wobei die Gel-Elektrophoresen
eine der meist genutzten Techniken zur routinemäßigen Untersuchung von Proteinen
darstellen. Der Stand der Technik kennt zahlreiche Proteintrennverfahren.
Beispiele sind auch in der
DE 100
56 838 A1 und der
DE
41 27 546 C2 offenbart.
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Das
Trennprinzip beruht im Wesentlichen darauf, dass fast alle biologischen
Moleküle,
wie Aminosäuren,
Peptide, Proteine und Nukleinsäuren,
ionisierbare Gruppen tragen und deshalb in Lösung als elektrisch geladene
Verbindungen, entweder als Kationen (+) oder Anionen (-) vorliegen
können.
Die Unterschiede in den Ladungsdichten zeigen sich in unterschiedlichen
Wanderungsgeschwindigkeiten im elektrischen Feld. Die Wanderungsgeschwindigkeit
hängt dabei
von der Kraft des elektrischen Feldes auf die Ionen und den Reibungs-
und elektrostati schen Widerständen
zwischen den Verbindungen und dem umgebenden Milieu ab.
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Verschiedene
Eigenschaften beeinflussen geladene Verbindungen in Proben auf unterschiedliche Weise:
- 1. Größe: Für größere Moleküle nimmt
die Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld ab, da Reibungs-
und elektrostatische Hemmungen der Wanderung durch das umgebende
Milieu zunehmen.
- 2. Ladung: Mit der Netto-Ladung der Moleküle (bei Proteinen die Zahl
der negativ und positiv geladenen Aminosäurereste) nimmt die Wanderungsgeschwindigkeit
zu, die Größe der Ladung
ist dabei nach der Henderson-Hasselbalch'schen Gleichung pH-Wert abhängig. Bei
physiologischen pH-Werten sind die meisten Proteine Anionen, da
die Zahl der negativen Ladungen überwiegt.
- 3. Form: Moleküle ähnlicher
Größe, aber
unterschiedlicher Form weisen verschiedene Wanderungseigenschaften
auf, da Reibungs- und elektrostatische Wechselwirkungen unterschiedlich
angreifen.
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Die
zu trennende Probe muß zur
Elektrophorese in einer Pufferlösung
gelöst
sein, ebenso müssen
alle Trägermaterialien
mit Pufferlösung
getränkt
sein, um den Strom weiterzuleiten. Alle zur Elektrophorese geeigneten
Trägermaterialien
weisen ein kapillares Netzwerk auf, dem Fachmann gebräuchlich
sind: Filterpapiere, Celluloseacetat, Dünnschichten von Kieselgel oder
Aluminiumoxid, Stärke-,
Agar- oder Polyacrylamid-Gele.
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Für die Trennung
von Proteinen mit guter Trennschärfe
ist besonders eine Matrix aus Polyacrylamid-Gel geeignet. Die Herstellung
eines Polyacrylamid-Geles aus dem Monomer Acrylamid und dem Quervernetzer
N,N'-Methylen-(bisacylamid)
in Gegenwart eines Katalysators ist dem Fachmann bekannt. Der prozentuale
Anteil an Acrylamid bestimmt die Porengröße des Geles, Gele zwischen
3 und 30% Acrylamid weisen eine Porengröße von 0,5 nm und 0,2 nm Durchmesser
auf. Zur Trennung von Proteinen mit einer Molekülmasse bis 104 Dalton
(Da) werden 30%-Gele verwendet, für die Trennung von Proteinen
bis 106 Da 3%-Gele. Zur besonderen Trennschärfe von
Proteinen mit sehr großen
Unterschieden in den Molekülmassen
eignen sich Gradienten-Gele,
da diese einen Konzentrationsgradienten an Acrylamid enthalten und
damit eine Veränderung
der Porengröße innerhalb
des Geles. In der Proteinanalytik wird häufig die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
in einem nach Laemmli (Nature, 1970) entwickelten diskontinuierlichen
Polyacrylamid-Gel verwendet. Dabei ist eine nach Schägger und
von Jagow (Analyt. Biochem. 1987) abgewandelte Form dieser Methode der
Polyacrylamid-Gelelektrophorese besonders zur Analyse kleiner Proteine
mit 5–20
kDa geeignet, da das anstelle von Glycin eingesetzte Tricine eine
schärfere
Auftrennung ermöglicht.
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Das
Gel wird gemäß einem
Standardprotokoll in eine Elektrophorese-Apparatur mit oberem und unterem Pufferreservoir
eingespannt, die Probe mit den zu trennenden Proteinen wird in die
Vertiefungen des Geles aufgetragen und über eine gewisse Zeit einer
Spannung ausgesetzt, in der die Proteine aus der Probe gemäß dem geschilderten
Trennprinzip während
ihrer Wanderung zur Anode aufgetrennt werden. Dabei ist es üblich, parallel
zur Probe mit den zu trennenden Proteinen einen Standardmarker mit
einer Mischung aus verschiedenen Eichproteinen bekannter Molekülmasse im
Gellauf mitzuführen.
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Die
meisten biologischen Moleküle
sind farblos und müssen
daher mit spezifischen Reagenzien zur Färbung behandelt werden. Der
Stand der Technik kennt zahlreiche Färbemethoden zum Nachweis verschiedener
Verbindungen auf Elektrophoreseträger. Für Proteine sind vor allem die
Coomassie-Brilliant-Blue-Färbung,
die Silberfärbung,
die Nigrosinfärbung,
die Färbung
mit Bromphenolblau, die Färbung
mit Lissamingrün in
wässriger
Essigsäure
und die Färbung
mit Fluoreszenzfarbstoffen geläufig.
Die Proteine aus der Probe sowie die Markerproteine des Standards
werden gleichermaßen
durch die Färbemethode
auf dem Träger
sichtbar gemacht. Sofern die verschiedenen Eichproteine der Standardmarker-Mischung
das gleiche oder zumindest ein ähnliches
Laufverhalten im Gel aufweisen wie die Proteine der zu bestimmenden
Probe, ist eine Schätzung
oder über
eine Eichkurve eine Bestimmung der Molekülmassen der Protein in der
Probe möglich. Die
Wanderungsstrecken sind dabei in etwa dem log10 der
Molekülmasse
umgekehrt proportional. Ein besonderes Problem ergibt sich aber,
wenn die Eichproteine der Standardmarker-Mischung aufgrund von Größe und Form
jeweils unterschiedliche Laufverhalten im Gel aufweisen und nicht
mehr zur Erstellung einer exakten Eichkurve geeignet sind, da die
Wanderungsstrecken nicht mehr dem log10 der
Molekülmasse
umgekehrt proportional sind.
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Die
EP 0 518 476 A1 offenbart
ein Verfahren zur Proteinbestimmung in der Kapillarelektrophorese,
wobei der zu untersuchenden Probe zwei externe Marker mit bekannten
Laufeigenschaften zugefügt
werden. Ein Verfahren zum Identifizieren von Bandenpositionen bei
einer elektrophoretischen Trennung einer Probe auf einem Gel mittels
einem internen Standard ist in der
DE 691 27 999 T2 beschrieben.
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Die
WO98/30684 A1 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen.
Der offenbarte Molekulargewichtsmarker wird aus mehreren unterschiedlichen
Proteinbestandteilen zusammengesetzt. Es ist nicht offenbart, dass
die Homo-Multimere ausschließlich
aus einem Mehrfachen der Zahl des Monomers bestehen. Ebenso ist
nicht erwähnt,
dass die Monomere zur Erzeugung der Homo-Multimere bei oxidativen
Bedingungen vorliegen.
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Die
WO 86/06383 offenbart eine Zusammensetzung, die zur Bestimmung des
Molekulargewichts eines Proteins verwendet werden kann. Es ist kein
Molekulargewichtsmarker offenbart, der aus einem einzi gen Monomer
besteht, aus dem die Homo-Multimere durch Polymerisation gebildet
werden.
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Die
Patentschrift
DD 138 873 offenbart
Verfahren und Mittel zur Bestimmung von Molekulargewichten. Die
Molekulargewichte enthalten nicht ausschließlich das Monomer.
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Die
Patentschrift
DD 121 839 offenbart
ebenfalls ein Verfahren und Mittel zur Bestimmung von Molekulargewichten.
Die Molekulargewichte enthalten nicht ausschließlich das Monomer. Es wird
ein Crosslinker verwendet, um die Hämoglobin zu polymerisieren.
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Die
Europäische
Patentschrift
EP 0
826 964 B1 zeigt die Bestimmung von Proteinen. Es handelt
sich hier um keine Homo-Multimere.
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Das
U.S. Patent 4,507,233 offenbart einen gefärbten Molekulargewichtsmarker.
Der Molekulargewichtsmarker besteht nicht aus einem einzigen Monomer,
das gemäß der Erfindung
polymerisiert wird. Es ist die Anbindung einer gefärbten Proteins
an ein nicht gefärbtes
Protein gezeigt. Die Molekülmassen
der beiden Proteine sind bekannt. Standardmarker, die kommerziell
erhältlich
sind, beispielsweise:
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Diesen
Standardmarkern ist gemeinsam, dass sie aus mehreren, meist 5–8 verschiedenen
hergestellten Proteine unterschiedlicher Größe und Form bestehen, die meist
rekombinant hergestellt, aufwendig isoliert, in entsprechendem Verhältnis gemischt
und als Mischung anwendungsbereit geliefert werden.
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Die
Standardmarker beinhalten damit zwar Proteine definierter Größen, allerdings
werden die Laufeigenschaften der einzelnen Proteine während der
Elektrophorese durch andere Kriterien, die nicht von der Größe abhängen – wie sterische
Konformation und Form der Proteine - unterschiedlich beeinflusst.
Die Reibungs- und elektrostatischen Wechselwirkungen greifen bei
jedem Markerprotein unterschiedlich an, so dass die Wanderungsstrecken
nicht mehr einheitlich umgekehrt proportional dem log10 der
Molekülmasse
sind. An einer daraus erstellten Standardkurve lässt sich die Molekülmasse eines
zu untersuchenden Proteins nicht ausreichend genau ablesen.
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Der
Erfindung liegt daher die zentrale Aufgabe zugrunde, einen Molekulargewichtsmarker
bereitzustellen, der zur Analyse von Proteinen anhand ihrer unterschiedlichen
Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld besser geeignet ist
und der die geschilderten Nachteile des Standes der Technik vermeidet.
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Des
Weiteren ist es Aufgabe der Erfindung, ein einfaches kostengünstiges
Verfahren zur Herstellung für
den erfindungsgemäßen Molekulargewichtsmarker
zu entwickeln.
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Die
Erfindung stellt spezielle Molekülkomplexe
bzw. Proteinkomplexe zur Verfügung,
die bezüglich
ihrer Wanderungsgeschwindigkeiten im elektrischen Feld besser geeignet
sind, da sekundäre
Einflüsse
keine Auswirkungen haben. Die erfindungsgemäßen Standardmarker (bzw. die
unterschiedlichen Molekulargewichte) werden dadurch erzeugt, dass
sich mehrere gleiche Moleküle
zusammenlagern, so dass die verschiedenen Molekulargewichte einstellbar
sind.
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Die
Aufgabe wird gelöst
mit einem Molekulargewichtsmarker für die elektrophoretische Analyse
von Proteinen bestehend aus einem Protein-Monomer und Homo-Multimeren
dieses Protein-Monomers, die unter oxidativen Bedingungen vorliegen,
wobei die Molekülmassen
der Homo-Multimere ausschließlich
ganzzahlige Mehrfache der Molekülmasse
des Protein-Monomers darstellen, wobei das Homo-Multimere bei oxidativen Bedingungen
aus den Monomeren durch Multimerisierung entstehen, und wobei die
Multimerisierung unter reduzierenden Bedingungen wieder rückgängig gemacht
werden kann.
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Des
Weiteren liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
eines Molekulargewichtsmarkers, welches folgende Schritte umfasst:
- – Mutation
eines DdTRX1-Proteins, das ein Protein-Monomer darstellt;
- – Überexpression
einer DdTRX1-Proteinmutante;
- – Isolierung
der DdTRX1-Proteinmutante aus einer Wirtszelle; und
- – Multimerisierung
des Protein-Monomers des Molekulargewichtsmarkers unter oxidativen
Bedingungen zum Dimer bis mindestens zum Dekamer.
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Das
Verfahren kann sehr einfach und kostengünstig durchgeführt werden,
da nur ein einziger Proteinbestandteil hergestellt werden muss,
anstelle von 5–8
verschiedenen Bestandteilen und deren Mischung im geeigneten Verhältnis. Darüber hinaus
sind zum gebrauchsfertigen Einsatz des Molekulargewichtsmarkers
zur Multimerisierung des Proteins einfache oxidative Bedingungen
erforderlich.
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Weitere
Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus den folgenden
Abbildungen und der Beschreibung ersichtlich. Dabei zeigt:
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1:
eine Abbildung der elektrophoretischen Auftrennung eines herkömmlichen
Molekulargewichtsmarkers im Vergleich zum er erfindungsgemäßen Molekulargewichtsmarker
in einem Elektrophoresegel nach Färbung;
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2:
eine schematische Darstellung der Mutation des DdTRX1-Proteins durch site-directed
mutagenesis; und
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3:
eine schematische Darstellung des Plasmids pGEM3ZDdTRX1.
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Überraschenderweise
wurde gefunden, dass ein Protein unter oxidierenden Bedingungen
eine auffällige
Multimerisierung aufweist, die unter reduzierenden Bedingungen wieder
rückgängig gemacht
werden kann. Unter der Bezeichnung Multimer werden in der vorliegenden
Erfindung Proteinkomplexe aus zwei bis mindestens zehn zusammengelagerten
Peptiden verstanden, die als Homo-Di-, -Tri, -Tetra-, -Penta- bis
mindestens Homo-Dekamer vorliegen.
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Im
Besonderen handelt es sich dabei um das Protein Thioredoxin, insbesondere
um eine Mono-Serin-Thioredoxin-Mutante.
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Thioredoxine
sind ubiquitäre
regulatorische Proteine jeder pro- und eucaryotischen Zelle, sie
sind kleine lösliche
hitzestabile Proteine einer Molmasse von 12 kDa bestehend aus 105–110 Aminosäuren. Ihr
aktives Zentrum ist hochkonserviert und besteht aus einem charakteristischen
Tetrapeptid Cys-Gly-Pro-Cys, oftmals flankiert von Trypthophan am
N-terminus und einer basischen Aminosäure am C-Terminus.
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Beispielhaft
ist hier die Aminosäuresequenz
des Thioredoxins 1 aus Dictyostelium discoideum (DdTRX1) im Ein-Buchstaben-Code
für Aminosäuren dargestellt.
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Die
beiden enthaltenen Cysteine (Cys 35 und Cys 32 im
umrahmten Kasten mit fetten Buchstaben markiert) können durch
reversiblen Wechsel zwischen der oxidierten Disulfid- und der reduzierten
Dithiolform als H-Donor oder -Akzeptor fungieren.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei der erfindungsgemäßen Mutation um eine Mono-Serin-Thioredoxin-Mutante besonders
bevorzugt um die Mono-Serin-Thioredoxin-Mutante DdTRX1-C35S, die
eine Substitutionsmutation im aktiven Zentrum des Thioredoxins aufweist,
wobei Cystein 35 gegen die redoxinaktive Aminosäure Serin
ausgetauscht wird.
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In
einer weiteren Ausführungsform
enthält
die Mono-Serin-Thioredoxin-Mutante
DdTRX1-C35S weitere Sequenzunterschiede, beispielsweise sogenannte
konservative Substitutionen, bei denen Aminosäuren gegeneinander ausgetauscht
werden, die aus der gleichen Klasse stammen. Dies bedeutet, dass
beispielsweise eine Aminosäure
mit einer polaren Seitenkette durch eine andere Aminosäure mit
einer gleichfalls polaren Seitenkette ersetzt wird. Mögliche Sequenzunterschiede
sind ebenfalls Insertion(en) oder Deletion(en), sofern sie nicht
das aktive Zentrum betreffen. Eine Sequenzhomologie von mindestens
70 % wird bevorzugt und besonders bevorzugt eine Sequenzhomologie
von 80 % zu der Sequenz der Mono-Serin-Thioredoxin-Mutante DdTRX1-C35S.
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Die
erfindungsgemäße Mono-Serin-Thioredoxin-Mutante
DdTRX1-C35S zeigt
unter einfachen oxidierenden Bedingungen sowie durch Zugabe von
Oxidationsmitteln, beispielsweise in Gegenwart von 10 mM Diamid,
eine Multimerisierung des Monomers zu Di-, Tri, Tetra-, Penta- bis
mindestens Dekamer, wobei die Molmasse jeweils ein Vielfaches des
Monomeres (13,8 kDa; theoretisch berechnet mit Hilfe eines Computerprogramms;
für praktische
Anwendungen ist die Molmasse des Monomers auf 14 kDa gerundet) beträgt. Bei
der Verwendung der Multimere auf dem Gel, geht man von der theoretisch
berechneten Molmasse aus und rundet entsprechend ab oder auf. In
der elektrophoretischen Auftrennung in einem Polyacrylamid-Gel entsteht
nach Anfärbung
eine Leiter, die Molmassen der einzelnen Banden weisen dabei jeweils
ein Vielfaches des Monomers von 13,8 kDa bis mindestens 138 kDa
auf. Damit ist die erfindungsgemäße Mono-Serin-Thioredoxin-Mutante DdTRX1-C35S
als Molekulargewichtsmarker zur Analyse von Proteinen anhand ihrer
unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld
geeignet. Da es sich jeweils um Homo-Multimere handelt, greifen die Reibungs-
und elektrostatischen Wechselwirkungen in gleicher Weise an, so
dass die Wanderungsstrecken exakt umgekehrt proportional dem log10 der Molekülmasse sind. Dieser Molekulargewichtsmarkerkit eignet
sich einerseits sehr gut zum Abschätzen der Molekülmasse einer
unbekannten Proteinprobe, und durch Erstellung einer Standardkurve
ist andererseits die Molekülmasse
des zu untersuchenden Proteins sehr genau ablesbar.
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Jede
Bande des erfindungsgemäßen Molekulargewichtsmarkers
ist darüber
hinaus bei den weiteren biochemischen Analysen (beispielsweise Western-Blot)
auch auf kommerziell erhältlichen
Membranen übertragbar.
Durch Modifikation des erfindungsgemäßen Thioredoxin- Proteins (beispielsweise
mit einem Strep-tag® der Firme IBA Göttingen)
ist der Molekulargewichtsmarker besonders gut zur Analyse biotinylierter Proteine
im Western-Blot geeignet. Der Nachweis auf der Membran erfolgt mittels
spezieller Antikörper
oder einfacher mittels Streptavidin-Alkalischer Phosphatase (oder
alternativ Streptactin-Phosphatase® der
Firme IBA Göttingen)
ohne den Einsatz von speziellen Antikörpern.
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1 zeigt
den erfindungsgemäßen Molekulargewichtsmarker
A im Vergleich zu einem herkömmlichen
Molekulargewichtsmarker B. Die Trennung der Bereiche mit dem Molekulargewichtsmarker
A und dem mit dem Molekulargewichtsmarker B ist durch eine gestrichelte
Linie 4 gekennzeichnet. Die Proteine werden unter nicht
reduzierenden Bedingungen (ohne Zugabe von DTT) auf einer Polyacrylamid-Matrix
aufgebracht und im elektrischen Feld (von Kathode – nach Anode
+) entsprechend ihrer Größe aufgetrennt
und anschließend
auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen
und mittels Streptactin-Phosphatase® (IBA,
Göttingen)
gefärbt.
Die Wanderungsrichtung im elektrischen Feld ist mit einem Pfeil 2 dargestellt.
Jede Bande repräsentiert dabei
ein Protein bestimmter Größe, die
an der jeder Seite in der SI-Einheit für Proteine in kDalton angegeben ist.
Der zum Vergleich verwendete Molekulargewichtsmarker(Proteinmarker „See blue
der Firma Invitrogen) beinhaltet sieben verschiedene Molekulargewichte,
was somit in sieben verschiedenen Banden 10 resultiert. Die
Banden 10 repräsentieren
Molekulargewichte von 6 kDa bis 105 kDa. Der erfindungsgemäße Molekulargewichtsmarker
umfasst mindestens 10 verschiedene Molekulargewichte, die von ca.
14 kDa bis mindestens 138 kDa reichen. Somit beinhaltet dieser Molekulargewichtsmarker
mindestens zehn verschiedene Banden 20, die im Bereich
von ca. 14 kDa bis mindestens 138 kDa das Monomer, die Di-, Tri-,
Tetra-, Penta- bis mindestens Dekamer-Form der Mono-Serin-Thioredoxin-Mutante
DdTRX1- C35S zeigen.
Es ist selbstverständlich das
von einem Benutzer auch eine geringere oder größere Anzahl von Molekulargewichtsunterschieden
gewählt
werden kann.
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Darüber hinaus
kann die Größe des Monomers
beliebig erweitert werden. Beispielsweise entsteht durch Fusion
des mutierten TRX-Gens mit dem offenen Leserahmen eines anderen,
möglichst
inerten Gens ein größeres Monomer,
das durch den TRX-Anteil ebenfalls multimerisiert. Aus einem beispielsweise
60 kDa Monomer entsteht so ein Molekulargewichtsmarker, der bis
mindestens 600 kDa reicht. Ein solcher Molekulargewichtsmarker findet
auch in der Gelfiltration Anwendung.
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Die
vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Herstellung
des erfindungsgemäßen Molekulargewichtsmarkers,
welches folgende Schritte umfasst:
- – Mutation
des DdTRX1-Proteins;
- – Überexpression
der DdTRX1-Proteinmutante;
- – Isolierung
der DdTRX1-Proteinmutante aus der Wirtszelle; und
- – Multimerisierung
des Molekulargewichtsmarkers unter oxidativen Bedingungen zum Dimer
bis mindestens zum Dekamer.
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Zur
Mutagenese eines Proteins kennt der Fachmann zahlreiche Standard-Methoden
(Sambrook et al.). Um eine gezielte Mutation beispielsweise im aktiven
Zentrum einzuführen
ist besonders die oligonukleotidgesteuerte Mutagenese, wie es mit
der site-directed mutagenesis (ortsspezifische Mutagenese) erzielt
wird, geeignet. Dem Fachmann stehen zur Durchführung kommerziell erhältliche
Kits zur Verfügung
(z.B. QuickChange®, Site directed Mutagenesis
Kit von Stratagene). 2 zeigt in schematisierter Form
die Schritte zum Einbringen einer Mutation in das DdTRX1-Protein
durch site-directed mutagenesis. Ausgangsmaterial bildet ein Plasmid 12 mit
der Wildtyp-Sequenz des DdTrx1-Thioredoxingenes und spezifische
Oligonukleotide (Mutagene se-Primer 1 und 2), die
die gewünschte
Mutation (hier: TGT GGC CCA TCT) und flankierende Nukleotide der
Wildtyp-Sequenz enthalten. 3 zeigt
in schematischer Darstellung das als Ausgangsmaterial für die site-directed
mutagenesis verwendete Plasmid pGEM 3Z-DdTrx1. Das Wildtyp DdTrx1-Gen
ist über
die Restriktionsschnittstellen Sac I und BamH I in Plasmid pGEM-3Z® (Promega)
einkloniert.
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Jedes
Plasmid (pGEM 3Z-DdTrx1) 12 enthält die zu mutierende Zielsequenz
14. Bei weniger stringenten Bedingungen hybridisieren die mutagenen
Oligonukleotide mit der Wildtyp-DNA, und in der PCR-Reaktion entstehen
DNA-Stränge
mit korrekt basengepaarter Mutationsstelle. An enthaltenen oder
eingebrachten spezifischen Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen
wird der DNA-Doppelstrang
anschließend
geschnitten, in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut, in
eine Wirtszelle transformiert und das Protein unter entsprechenden
Induktionsbedingungen überexprimiert.
Zu den genannten Verfahren wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarose-Gelelektrophorese,
Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf
Nitrocellulose und Nylon-Membran, Verknüpfung von DNA-Fragmenten, Transformation
von Escherichia coli Zellen, Anzucht von Bakterien und Sequenzanalyse
rekombinanter DNA kennt der Fachmann Verfahren im Stand der Technik
(Sambrook et al.).
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Auch
Expressionsvektoren sind in großem
Umfang in der Literatur beschrieben. Sie enthalten neben einem Selektionsmarker
und einem Replikationsursprung, einen Promotor, sowie meist ein
Terminationssignal für
die Transkription. Zwischen Promotor und Terminationssignal liegt
mindestens eine Restriktionsschnittstelle oder ein Polylinker, die
die Insertion einer codierenden DNA-Sequenz ermöglichen. Als Promotoren können solche
verwendet werden, die eine konstitutive Genexpression bewirken,
als auch induzierbare, die eine gezielte Genexpression ermöglichen.
Der T7-Promotor (Studier et al., 1990) er laubt z.B. eine sehr starke
Expression des nachgeschalteten Gens. Dieser führt zu einer hohen Ausbeute
an Protein. Besonders einfach und schnell erfolgt die Isolierung
des erfindungsgemäßen Molekulargewichtsmarkers,
wenn bei der Proteinüberexpression
eine Modifikation angebracht wird (Methode nach kommerziell erhältlichen
Modifikationskits) und das Protein direkt per Affinitätschromatographie
nach Herstellerangaben isoliert wird. Dies erfolgt beispielsweise in
Form eines Strep-Tag® (IBA GmbH, Göttingen),
der Nachweis der Proteine im Elektrophoresegel mit üblichen
Färbemethoden,
im Westernblot über
kommerziell erhältliche
Streptavidin-Alkalische Phosphatase, Strep-Tactin-Phosphatase® (IBA
GmbH, Göttingen)
oder über
spezielle Antikörper.
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Die
Kultivierung der Wirtszellen erfolgt jeweils in Nährmedien,
die den Bedürfnissen
der Wirtszellen nach pH-Wert, Temperatur, Salzkonzentration, Antibiotika,
Vitaminen, Spurenelementen und Belüftung entsprechend angepasst
sind.
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Zur
Isolierung der DdTRX1-Proteinmutante aus der Wirtszelle werden Standardverfahren
aus dem Stand der Technik verwendet, beispielsweise die Isolierung über Affinitätschromatographie
anhand des Strep-Tag®.
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Die
Multimerisierung des isolierten Proteins erfolgt durch Oxidation,
d.h. durch Zugabe eines Oxidationsmittels, wie Diamid oder indem
auf die sonst übliche
Zugabe eines Reduktionsmittels, wie DTT verzichtet wird.
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Ausführungsbeispiele
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1. Ortsspezifische Mutagenese
(site-directed mutagenesis) zur Herstellung der Punktmutation des DdTrx-1-Gens
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Die
ortsspezifische Mutagenese führt
zum gezielten Herstellen von Punktmutationen an definierter Stelle
eines Gens. Die Mutation wird dabei mit Hilfe von an der gewünschten
Stelle veränderten,
synthetisch hergestellten Oligonukleotiden erzeugt, die einer DNA-Polymerase
als Primer 16 dienen.
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Die
ortsspezifische Mutagenese erfolgt mittels eines kommerziell erhältlichen „QuickChangeTM Site Directed Mutagenesis Kits" der Firma Stratagene
nach Herstellerangaben.
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Ausgangskonstrukt
und Template ist Plasmid pGEM 3Z-Trx1 (in das von Promega erhältliche
Plasmid pGEM 3Z® wird über die
Restriktionsschnittstellen SacI und BamHI die Thioredoxin-Wildtyp-DNA-Sequenz aus Dictyostelium
discoideum einkloniert, beschrieben bei T. Brodegger, Molekularbiologische
Funktionsanalyse von Thioredoxinen aus Dictyostelium discoideum
und Identifizierung neuer Interaktionspartner durch das Two-Hybrid-System,
Dissertation Universität
Kassel 2002) in supercoiled Form aus einer Standard-Plasmid-Maxipräparation
(nach Herstellerangaben, Firma Qiagen, Hilden), die das DdTrx1-Wildtyp-Gen enthält und eine
Größe von 3053
bp besitzt. Die Primer 16 für die PCR-Reaktion enthalten
die Punktmutation C statt Wildtyp T, so daß die Aminosäure 35 Cystein
(Codon TGT) gegen Serin (Codon TCT) ausgetauscht wird. Zusätzlich wird
hierdurch eine neue Schnittstelle für die Endonuclease Xba I geschaffen,
die zur späteren
Identifizierung der mutierten Klone herangezogen wird. Zur eindeutigen
Identifizierung der die Mutation enthaltenden Plasmide wurde außerdem eine
stille Mutation in Aminosäure 33 vorgenommen
(GGT ausgetauscht gegen GGC, beide codieren für Glycin), die eine Schnittstelle
für das
Restriktionsenzym Ava II zerstört.
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Wildtyp-Sequenz des aktiven
Zentrums des DdTrx1-Gens:
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Mutagenese-Primer 1
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- 5' C TTT
AGT GCT GTA TGG TGT GGC CCA TCT AGA GCA ATA TCT CC 3'
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Mutagenese-Primer 2
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- 5' GG AGA
TAT TGC TCT AGA TGG GCC ACA CCA TAC AGC ACT AAA G 3'
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Die
Mutagenese-Primer sind exakt komplementär zueinander und weisen einen
Tm-Wert von mindestens 78°C
auf. Unterstrichen ist die Mutagenese-Position dargestellt, die
entsprechenden Nukleotide sind in fetten Buchstaben hervorgehoben.
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Die
PCR-Reaktion erfolgt mittels kommerziell erhältlicher Puffer und Polymerase
unter folgenden Bedingungen:
2 μl 10 × Reaktionspuffer für Taq DNA-Polymerase
1 μl ds DNA-Template
pGEM 3Z-Trx1 (ca. 500 ng)
1 μl
Mutagenese-Primer 1 (10 pmol/μl
bzw. 136 ng/μl)
1 μl Mutagenese-Primer
2 (10 pmol/μl
bzw. 136 ng/μl)
14 μl Mastermix
nach dem
Schema:
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Der
PCR-Ansatz wird im Anschluss an die Reaktion mit 1–2 μl Dpn I versetzt
für 1,5
h bei 37°C
inkubiert, so dass die methylierten ursprünglichen Templates durch die
Dpn I-Restriktionsendonuclease entfernt werden, damit ausschließlich die
DNA-Stränge
mit der Punktmutation vorliegen.
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2. Herstellung der rekombinanten
Mono-Serin-Thioredoxin-Mutante
DdTRX1-C35S in E. coli
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Die
DNA-Stränge
mit der Punktmutation werden nach Standardprotokoll in einen bakteriellen
Expressionsvektor kloniert, beispielsweise den Expressionsvektor
pET 15 b, der unter der Kontrolle des T7-Promotors steht, dabei
mit der Strep-tag®-Sequenz versehen und
zur Überexpression
des rekombinanten Proteins in einen E. coli Wirtsstamm transformiert
(beispielsweise BL21).
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Die Überexpression
erfolgt gemäß Herstellerangaben
des pET-Systems
der Firma Novagen in 100 bis 500 ml Bakterienkulturen, die bei 225
rpm und 30°C
geschüttelt
werden. Ca. 3 Stunden nach Beimpfen mit einer Über-Nacht-Kultur (1 ml pro
50 ml Kultur) ist in der Bakterienkultur eine optische Dichte OD600 von etwa 0,4 erreicht.
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Die
Induktion der Genexpression erfolgt durch Zugabe des Galaktosides
IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM, das vom bakteriellen
Expressionssystem als Lactose-Analogon erkannt wird und als Induktor
für die
Genexpression fungiert.
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Nach
4 weiteren Stunden bei 30°C
erreicht die Bakterienkultur eine optische Dichte von kleiner gleich OD600 = 1,4. Die Zellen werden durch Zentrifugation
in der Kühlzentrifuge über 15 min
bei 4000 rpm geerntet, das Zellpellet bei –80°C eingefroren und bis zur weiteren
Verwendung gelagert. Die Aufreinigung des überexprimierten Proteins erfolgt
unter Verwendung des kommerziell erhältlichen Strep-tag®-Systems,
da der erfindungsgemäße Molekulargewichtsmarker
zusätzlich
einen Streptag® trägt und über Affinitätschromatographie mittels
einer Strep-Tactin®-Sepharose®-Säule nach
Herstellerangaben einfach und schnell isoliert wird.
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Das
Ausgangsmaterial für
die Reinigung bildet in diesem Fall ein bei – 80°C gelagertes Zellpellet aus 100
ml Bakterienkultur. Beim Auftauen und der Lyse der Zellen werden
sie in 1 ml Puffer W (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8,0)
resuspendiert, dem als Reduktionsmittel 5 mM DTT zugesetzt wird.
Die vollständige
Zelllyse und Fragmentierung der Nukleinsäuren erfolgt mit Ultraschall.
Der Zellextrakt wird mit 20 μg Avidin
versetzt, um bakterieneigene biotinylierte Proteine, wie das BCCP
(Biotin Carboxyl Carrier Protein), zu blocken und deren unspezifische
Bindung an das Säulenmaterial
zu verhindern. Es folgt eine Inkubation für 30 min auf Eis und eine anschließende Zentrifugation
für 30–45 min
bei 14000 rpm in der Tischzentrifuge. Der zellfreie Überstand
wird abgenommen und durch einen Filter (Porengröße 0,2 μm) sterilfiltriert. Dieser zellfreie Extrakt
wird vollständig
auf die mit 5 ml Puffer W equilibrierte Strep-Tactin®-Säule aufgetragen.
Ungebundene Bestandteile werden durch Spülen mit 5 × 1 ml Puffer W entfernt, die
Elution des gebundenen Strep-tag®-Proteins
erfolgt mittels sechsmaligem Spülen
mit 0,5 ml Puffer E (Puffer W + 2,5 mM Desthiobiotin).
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Die
Mono-Serin-Thioredoxin-Mutante DdTRX1-C35S ist in der 3. bis 5.
Elutionsfraktion in hoher Reinheit enthalten. Das Monomer hat ein
Molekulargewicht von ca. 13,8 in der Abbildung ist der gerundete
Wert von 14 kDa eingezeichnet.
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Zur
Multimerisierung und Leiterbildung wird der Proteinpräparation
ein Oxidationsmittel beispielsweise Diamid in einer Konzentration
von 1–15
mM, bevorzugt 10 mM zugesetzt.
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3. Einsatz der Mono-Serin-Thioredoxin-Mutante
DdTRX1-C35S als Molekulargewichtsmarker in der Elektrophorese z.B.
der Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Tris-Tricine-Puffern
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Die
abgewandelte Form der denaturierenden, diskontinuierlichen Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach
Schägger
und von Jagow (1987) ist besonders zur Analyse kleiner Proteine
mit 5–20
kDa geeignet, da das anstelle von Glycin eingesetzte Tricine eine
schärfere
Auftrennung ermöglicht.
Die Gele werden beispielsweise als Minigel mit Hilfe einer Apparatur
der Firma Hoefer analysiert und entsprechend folgender Anleitung hergestellt:
Puffer:
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Probenvorbereitung:
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Der
Molekulargewichtsmarker sowie die zu analysierende Proteinprobe
wird mit der entsprechenden Menge Probenpuffer (4 fach) versetzt,
gut vermischt und zur Denaturierung und eventuellen Reduktion für 30–60 min
bei 40°C
inkubiert, bevor der Auftrag der gewünschten Menge auf das Gel erfolgt.
Bei der Analyse des erfindungsgemäßen Molekulargewichtsmarkers
ist unbedingt darauf zu beachten, dass der Probenpuffer kein Reduktionsmittel
wie DTT enthält,
da die Multimerisierung unter reduzierenden Bedingungen reversibel ist.
Eine geeignete Proteinmenge pro Probe liegt bei 10–50 μg. Das obere
Pufferreservoir wird mit Kathodenpuffer, das untere Pufferreservoir
mit Anodenpuffer gefüllt.
Der Gellauf erfolgt bei konstant 20 mA pro Mini-Gel über 2,5
bis 3 h. Anschließend
wird das Gel mit Coomassie-Blau (oder mit einem anderen Färbeverfahren) gefärbt oder
einer beliebigen Nachweismethode unterzogen.
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4. Anwendungsverfahren
der Mono-Serin-Thioredoxin-Mutante DdTRXi-C35S als Molekulargewichtsmarker zur
Bestimmung der Molekülmasse
eines Proteins
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Im
Anschluß an
die Elektrophorese des Molekulargewichtsmarkers und einer Probe
zu analysierender Proteine auf einem Polyacrylamidgel unter nicht
reduzierenden Bedingungen erfolgt die Färbung bzw. Detektion (beispielsweise
mit Phosphatase oder Antikörpern)
der Proteine und durch Vergleich der Bandenpositionen des Molekulargewichtsmarkers
mit den Banden der zu analysierender Proteine wird die Molekülmasse der zu
analysierenden Proteinprobe bestimmt und über eine Eichkurve exakt ermittelt.
Die Wanderungsstrecken der Banden des Molekulargewichtsmarkers sind
einheitlich umgekehrt proportional dem log10 der
Molekülmasse.
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Sämtliche
Banden des Molekulargewichtsmarkers werden bei weiteren biochemischen
Analysen (wie beispielsweise Western-Blot) auch auf kommerziell
erhältliche
Membranen übertragen
und sind über
Phosphatase und/oder spezielle Antikörper (z.B. anti-StrepTag Antikörper) detektierbar.
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Die
Größe des Molekulargewichtsmarkers
wird beliebig erweitert, indem durch Fusion des mutierten TRX-Gens
mit dem offenen Leserahmen eines anderen, möglichst inerten Gens ein größeres Monomer
entsteht, das durch den TRX-Anteil ebenfalls multimerisiert. Ein
beispielsweise 60 kDa Monomer liefert einen Molekulargewichtsmarker
mit Banden bis mindestens 600 kDa. Ein solcher Molekulargewichtsmarker
findet auch in der Gelfiltration Anwendung.
Puffer:
