JP2008069150A - ヒト化抗ｃｃｒ−２抗体およびその使用方法 - Google Patents

ヒト化抗ｃｃｒ−２抗体およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

【課題】炎症性疾患に効果の期待される医薬品として安全に用いうる、抗体またはその断片の提供。
【解決手段】哺乳動物ＣＣ−ケモカインレセプター２（ＣＣＲ２、ＣＫＲ−２、ＭＣＰ−１ＲＡまたはＭＣＰ−１ＲＢともいう）または該レセプターの一部に結合する抗体（イムノグロブリン）またはその機能的断片（例えば、抗原結合性断片）（抗−ＣＣＲ２）であって、１つの態様において、その抗体またはその断片は、ヒトまたはアカゲザルＣＣＲ２またはその一部に対して特異性を有し、他の態様において、その抗体または断片は、リガンド（例えば、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４）とレセプターとの結合を妨げ、該リガンドと該レセプターとの結合に関連する機能（例えば、白血球輸送）を阻害する、抗体または断片。
【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、１９９８年７月２３日提出の米国出願シリアル番号０９／１２１，
７８１の一部継続出願である１９９９年７月２２日提出の米国出願シリアル番号
０９／３５９，１９３の一部継続出願である２０００年２月３日提出の米国出願
シリアル番号０９／４９７，６２５の一部継続出願であり、これらの全教示は、
参照により本明細書に組み込まれる。
発明の背景
過去数年に渡って、ケモカインと称される白血球化学誘因物質／活性化因子の
増大するファミリー(growingfamily)が述べられている [オッペンハイム(Oppen
heim,J.J.)ら,Annu. Rev. Immunol., 9:617-648(1991); シュアル(Schall)およ
びベーコン(Bacon),Curr.Opin. Immunol., 6:865-873 (1994); バッジョリーニ
(Baggiolini,M.)ら, Adv. Immunol.,55:97-179(1994)]。本ファミリーのメンバ
ーは、ＩＬ−１βやＴＮＦα等の初期炎症メディエーターに応答して、多くの細
胞型により産生され、分泌される。ケモカインスーパーファミリーは、２つの主
要な派生物：α−ケモカイン（すなわち、ＣＸＣケモカイン）と、β−ケモカイ
ン（ＣＣケモカイン）とを含む。α−ケモカインの派生物としては、主として好
中球に対する誘発および活性化効果を有するものである、ＩＬ−８、好中球活性
化ペプチド−２（ＮＡＰ−２）、メラノーマ成長刺激活性(melanoma growth sti
mulatoryactivity)（ＭＧＳＡ／ｇｒｏまたはＧＲＯα）、ＥＮＡ−７８等のタ
ンパク質が挙げられる。β−ケモカインの派生物のメンバーは、単球、リンパ球
、好塩基球、好酸球等の他の細胞型に作用し[ オッペンハイム(Oppenheim,J.J.)
ら, Annu.Rev. Immunol., 9:617-648(1991); バッジョリーニ(Baggiolini, M.)
ら, Adv.Immunol.,55:97-179(1994);ミラー(Miller)およびクランゲル(Krangel
), Crit. Rev.Immunol., 12:17-46(1992); ホセ(Jose, P. J.) ら, J. Exp. Me
d.,179:881-118(1994);ポナス(Ponath, P. D.) ら, J. Clin. Invest., 97:604
-612 (1996)]、単球走化性タンパク質１−４（ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ
−３およびＭＣＰ−４）、ＲＡＮＴＥＳ、マクロファージ炎症性タンパク質（Ｍ
ＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β）等のタンパク質が挙げられる。近年、ＣＸ３Ｃケモ
カインと称される新しいクラスの膜結合ケモカインが同定されている [バザン(B
azan,J.F.)ら,Nature 385:640-644 (1997)]。ケモカインは、化学走化性の誘発
、脱顆粒、脂質メディエーターの合成、インテグリン活性化等の範囲の白血球へ
の前炎症効果を媒介しうる[ オッペンハイム(Oppenheim,J.J.)ら, Annu. Rev. I
mmunol.,9:617-648(1991); バッジョリーニ(Baggiolini, M.)ら, Adv. Immunol
.,55:97-179(1994);ミラー(Miller,M.D.)およびクランゲル(Krangel,M.S.), Cr
it. Rev.Immunol., 12:17-46(1992)]。最近、ある種のβ−ケモカインが、イン
・ビトロでヒトＴ細胞系のＨＩＶ−１感染を抑制することを示している [コッチ
(Cocchi,F.) ら,Science (Wash. DC), 270:1811-1815(1995)]。
ケモカインは、７回膜貫通型（７ＴＭＳ）Ｇタンパク質共役レセプターに結合
する [マーフィー(Murphy,P. M.), Annu. Rev. Immunol., 12:593-633(1994)]
。ＣＣケモカインまたはβケモカインのいくつかの公知のレセプターとしては、
ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳに結合するＣＣＲ１ [ネオト(Neote,K.)ら, Ce
ll,72:415-425(1993);ガオ(Gao,J. L.), J. Exp. Med., 171:1241-1427(1993)]
; ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４等のケモカインに結合する
ＣＣＲ２ [チャロ(Charo,I.F)ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:2752-2756
(1994); マイヤーズ(Myers,S. J.)ら, J. Biol. Chem., 270:5786-5792(1995);
ゴング(Gong)ら,J. Biol. Chem., 272:11682-11685 (1997); ガルシア−ゼペダ
(Garcia-Zepeda)ら, J. Immunol.,157:5613-5626(1996)]; エオタキシン、ＲＡ
ＮＴＥＳ、ＭＣＰ−３等のケモカインに結合するＣＣＲ３ [ポナス(Ponath, P.
D.) ら, J. Exp.Med., 183:2437-2448 (1996)];ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、Ｒ
ＡＮＴＥＳに応答してシグナル伝達することが見出されているＣＣＲ４ [パウエ
ル(Power,C. A.)ら, J. Biol. Chem., 270:19495-19500(1995)]; およびＭＩＰ
−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳに応答してシグナル伝達することが示
されているＣＣＲ５[ボーリング(Boring, L.)ら, J. Biol. Chem., 271(13):75
51-7558(1996);ラポート(Raport,C. J.), J. Biol. Chem., 271:17161-17166(1
996); およびサムソン(Samson,M.)ら, Biochemistry, 35:3362-3367(1996)] が
挙げられる。
ＣＣＲ２は、いくつかの白血球サブセットの表面に発現し、カルボキシル末端
領域をコードするｍＲＮＡの選択的スプライシングのため、２つのわずかに異な
る形態（ＣＣＲ２ａおよびＣＣＲ２ｂ）で発現すると思われる [チャロ(Charo)
ら, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91:2752-2756(1994)]。ＭＣＰ−１は、単球、
リンパ球および好塩基球に、走化性、顆粒放出、呼吸バースト、ヒスタミンおよ
びサイトカインの放出等、作用する。研究により、ＭＣＰ−１は、慢性関節リウ
マチ、アテローム性硬化症、肉芽腫性疾患、多発性硬化症等の疾患の病因に関係
することが示唆された [コッホ(Koch), J. Clin. Invest., 90:772-79(1992);ホ
サカ(Hosaka)ら,Clin. Exp. Immunol. 97:451-457(1994); シュバルツ(Schwart
z)ら, Am. J.Cardiol. 71(6):9B-14B(1993); シュインマー(Schimmer)ら, J. I
mmunol.160:1466-1471(1998);フローリー(Flory) ら，Lab. Invest. 69:396-40
4(1993);ゴング(Gong)ら,J. Exp. Med. 186:131-137(1997)] 。さらに、ＣＣＲ
２は、ＨＩＶのコレセプターとして作用しうる [コンノール(Connor)ら, J. Exp
. Med.185:621-628(1997)] 。したがって、ＣＣＲ２レセプターアンタゴニスト
は、新規な分類の重要な治療剤である。
本発明によって以下が提供される：
（１） 非ヒト起源の抗原結合領域とヒト起源のイムノグロブリンの
少なくとも一部とを含有してなり、ＣＣＲ２に対する結合特異性を有するヒト化
イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片。
（２） ヒト起源のイムノグロブリンの一部が、ヒト定常領域由来の
ものである、項目１記載のヒト化イムノグロブリンまたは抗原結合性断片。
（３） 該ヒト定常領域が、ガンマ型のものである、項目２記載の
ヒト化イムノグロブリンまたは抗原結合性断片。
（４） 該抗原結合領域が、げっ歯動物起源のものである、項目２
記載のヒト化イムノグロブリンまたは抗原結合性断片。
（５） 該抗原結合領域が、モノクローナル抗体１Ｄ９に由来するも
のである、項目２記載のヒト化イムノグロブリンまたは抗原結合性断片。
（６） 該抗原結合領域が、げっ歯動物起源の少なくとも１つの相補
性決定領域を含有し、かつ該ヒト起源のイムノグロブリンの一部が、ヒトフレー
ムワーク領域に由来するものである、項目１記載のヒト化イムノグロブリンま
たは抗原結合性断片。
（７） 該相補性決定領域が、モノクローナル抗体１Ｄ９に由来する
ものである、項目６記載のヒト化イムノグロブリンまたは抗原結合性断片。
（８） 該相補性決定領域が、
a) 配列番号：９のアミノ酸２４−３９；
b) 配列番号：９のアミノ酸５５−６１；
c) 配列番号：９のアミノ酸９４−１０２；
d) 配列番号：１０のアミノ酸３１−３５；
e) 配列番号：１０のアミノ酸５０−６８；および
f) 配列番号：１０のアミノ酸１０１−１０６
からなる群より選択されたものである、項目６記載のヒト化イムノグロブリン
または抗原結合性断片。
（９） 重鎖と軽鎖とを含有してなり、ここで、該軽鎖が、ＣＣＲ２
に結合する非ヒト起源の抗体に由来する少なくとも１つの相補性決定領域とヒト
起源の軽鎖に由来するフレームワーク領域とを含有するものであり、該重鎖が、
ＣＣＲ２に結合する非ヒト起源の抗体に由来する少なくとも１つの相補性決定領
域とヒト起源の重鎖に由来するフレームワーク領域とを含有するものである、Ｃ
ＣＲ２に対する結合特異性を有するヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合
性断片。
（１０） 該イムノグロブリンが、ＣＣＲ２への結合について、マウ
ス抗体１Ｄ９と競合しうるものである、項目９記載のヒト化イムノグロブリン
またはその抗原結合性断片。
（１１） 該軽鎖が、１Ｄ９抗体の軽鎖に由来する３つの相補性決定
領域を含有してなり、該重鎖が、１Ｄ９抗体の重鎖に由来する３つの相補性決定
領域を含有する、項目９記載のヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性
断片。
（１２） 該１Ｄ９の軽鎖に由来する相補性決定領域が、配列番号：
９のアミノ酸２４−３９、配列番号：９のアミノ酸５５−６１および配列番号：
９のアミノ酸９４−１０２であり、該１Ｄ９の重鎖に由来する相補性決定領域が
、配列番号：１０のアミノ酸３１−３５、配列番号：１０のアミノ酸５０−６８
および配列番号：１０のアミノ酸１０１−１０６である、項目１１記載のヒト
化イムノグロブリンまたは抗原結合性断片。
（１３） 該ヒト起源の軽鎖が、ＨＦ−２１／２８抗体の軽鎖である
、項目９記載のヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片。
（１４） ヒト起源の重鎖が、ヒト４Ｂ４’ＣＬ抗体である、項目
９記載のヒト化イムノグロブリン。
（１５） マウス１Ｄ９抗体の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ
Ｒ３とヒト軽鎖フレームワーク領域とを含有してなる、ヒト化イムノグロブリン
軽鎖またはその抗原結合性断片。
（１６） 該ヒトフレームワーク領域が、ＨＦ−２１／２８抗体の軽
鎖に由来するものである、項目１５記載のヒト化イムノグロブリン軽鎖または
その抗原結合性断片。
（１７） 配列番号：９の可変領域を含有してなる、項目１６記載
のヒト化イムノグロブリン軽鎖またはその抗原結合性断片。
（１８） 項目１７記載のヒト化イムノグロブリン軽鎖またはその
抗原結合性断片をコードしてなる単離された核酸分子。
（１９） 配列番号：９５の可変領域コード配列を含有してなる、請
求項１８記載の単離された核酸分子。
（２０） １Ｄ９抗体の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と
、ヒト重鎖フレームワーク領域とを含有してなる、ヒト化イムノグロブリン重鎖
またはその抗原結合性断片。
（２１） 該ヒトフレームワーク領域が、ヒト４Ｂ４’ＣＬ抗体の重
鎖に由来するものである、項目２０記載のヒト化イムノグロブリン重鎖または
その抗原結合性断片。
（２２） 配列番号：１０の可変領域を含有してなる、項目２１記
載のヒト化イムノグロブリン重鎖またはその抗原結合性断片。
（２３） 項目２２記載のヒト化イムノグロブリン重鎖またはその
抗原結合性断片をコードしてなる単離された核酸分子。
（２４） 配列番号：９６の可変領域コード配列を含有してなる、請
求項２３記載の単離された核酸分子。
（２５） 配列番号：９の軽鎖可変領域アミノ酸配列の機能的部分を
少なくとも含有したアミノ酸配列を有する、ヒト化イムノグロブリン軽鎖または
その抗原結合性断片。
（２６） 項目２５記載のヒト化イムノグロブリン軽鎖またはその
抗原結合性断片をコードする塩基配列を含有してなる単離された核酸分子。
（２７） 配列番号：９５の可変領域コード配列を含有してなる、請
求項２６記載の単離された核酸分子。
（２８） 配列番号：１０に示された重鎖可変領域アミノ酸配列の少
なくとも1 つの機能的部分を含有したアミノ酸配列を有する、ヒト化イムノグロ
ブリン重鎖またはその抗原結合性断片。
（２９） 項目２８記載のヒト化イムノグロブリン重鎖またはその
抗原結合性断片をコードした塩基配列を含有してなる単離された核酸分子。
（３０） 配列番号：９６の配列をコードした可変領域を含有してな
る、 項目２９記載の単離された核酸分子。
（３１） ヒト化イムノグロブリン軽鎖をコードした融合遺伝子であ
り、かつＣＣＲ２に対する結合特異性を有する非ヒト抗体の軽鎖に由来するＣＤ
Ｒと、ヒト起源の軽鎖に由来するフレームワーク領域とをコードした塩基配列を
含有した融合遺伝子を含有した発現ベクター。
（３２） 該非ヒト抗体が、マウス抗体１Ｄ９である、項目３１記
載の発現ベクター。
（３３） 項目３１記載の発現ベクターを含有してなる宿主細胞。
（３４） ヒト化イムノグロブリン重鎖をコードした融合遺伝子であ
り、かつＣＣＲ２に対する結合特異性を有する非ヒト抗体の重鎖に由来するＣＤ
Ｒと、ヒト起源の重鎖に由来するフレームワーク領域とをコードした塩基配列を
含有した融合遺伝子を含有した発現ベクター。
（３５） 該非ヒト抗体が、マウス抗体１Ｄ９である、項目３４記
載の発現ベクター。
（３６） 項目３４記載の発現ベクターを含有してなる宿主細胞。
（３７） ヒト化イムノグロブリン軽鎖をコードした第１の組換え核
酸分子と、ヒト化イムノグロブリン重鎖をコードした第２の組換え核酸分子とを
含有する宿主細胞であり、該第１の核酸分子が、マウス抗体１Ｄ９の軽鎖に由来
するＣＤＲとヒト起源の軽鎖に由来するフレームワーク領域とをコードする塩基
配列を含有し、該第２の核酸分子が、マウス抗体１Ｄ９の重鎖に由来するＣＤＲ
とヒト起源の重鎖に由来するフレームワーク領域とをコードする塩基配列を含有
するものである宿主細胞。
（３８） 項目３７記載の宿主細胞を、ヒト化イムノグロブリンの
発現に適した条件下に維持し、それにより、ヒト化イムノグロブリン鎖を発現さ
せ、ヒト化イムノグロブリンを産生させる工程を含む、ヒト化イムノグロブリン
の製造方法。
（３９） 該ヒト化イムノグロブリンを単離する工程をさらに含む、
項目３８記載の方法。
（４０） a) マウスモノクローナル抗体１Ｄ９由来の抗原結合領域
をコードした第1 の核酸配列；および
b) ヒト起源のイムノグロブリンの定常領域の少なくとも一部をコードした第２
の核酸配列
を含有してなる、 ヒト化イムノグロブリンの軽鎖または重鎖をコードした融合遺
伝子。
（４１） ＣＣＲ２を発現する細胞と、有効量の項目１記載のヒト
化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片とを接触させるステップを含む、
ＣＣＲ２を発現する細胞とＣＣＲ２のリガンドとの相互作用の阻害方法。
（４２） 該細胞が、リンパ球、単球、顆粒球、Ｔ細胞、好塩基球、
およびＣＣＲ２またはその一部をコードした組換え核酸を含有した細胞からなる
群より選択されたものである、項目４１記載の方法。
（４３） 該リガンドが、ケモカインである、項目４１記載の方法
。
（４４） 該ケモカインが、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、
ＭＣＰ−４およびその組合せからなる群より選択されたものである、項目４３
記載の方法。
（４５） 該リガンドが、ＨＩＶである、項目４１記載の方法。
（４６） 細胞と、項目１記載のヒト化イムノグロブリンまたはそ
の抗原結合性断片を含有した有効量の組成物とを接触させるステップを含む、細
胞のＨＩＶ感染の阻害方法。
（４７） 有効量の項目１記載のヒト化イムノグロブリンまたはそ
の抗原結合性断片を含有した組成物を患者に投与するステップを含む、患者のＨ
ＩＶの治療法法。
（４８） 有効量の項目１記載のヒト化イムノグロブリンまたはそ
の抗原結合性断片を含有した組成物患者に投与するステップを含む、患者のＨＩ
Ｖ感染の阻害方法。
（４９） ＣＣＲ２と、有効量の項目１記載のヒト化イムノグロブ
リンまたはその抗原結合性断片とを接触させるステップを含み、ここで、該ヒト
化イムノグロブリンが、該ケモカインと哺乳動物ＣＣＲ２との結合を阻害し、該
ケモカインとＣＣＲ２との結合に関連する１以上の機能を阻害する、ケモカイン
と哺乳動物ＣＣＲ２との結合に関連する機能の阻害方法。
（５０） 該ケモカインが、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、
ＭＣＰ−４およびその組合せからなる群より選択されたものである、項目４９
記載の方法。
（５１） 哺乳動物ＣＣＲ２またはＣＣＲ２の一部に結合し、かつリ
ガンドとレセプターとの結合を阻害する有効量の項目１記載のヒト化イムノグ
ロブリンまたはその抗原結合性断片を含有した組成物を患者に投与するステップ
を含む、患者における白血球輸送の阻害方法。
（５２） 該リガンドが、ケモカインである、項目５１記載の方法
。
（５３） 該ケモカインが、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、
ＭＣＰ−４およびその組合せからなる群より選択されたものである、項目５２
記載の方法。
（５４） 哺乳動物ＣＣＲ２またはその一部に結合する有効量の請求
項１記載のヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片を、患者に投与す
るステップを含む、 患者におけるＣＣＲ２介在疾患の治療方法。
（５５） 該疾患が、炎症性疾患である、項目５４記載の方法。
（５６） 哺乳動物ＣＣＲ２またはその一部に結合する有効量の請求
項１記載のヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片を患者に投与する
ステップを含む、患者における再狭窄の阻害方法。
（５７） 治療または診断に使用するための項目１記載のヒト化イ
ムノグロブリンまたはその抗原結合性断片。
（５８） ＣＣＲ２介在疾患の治療に使用するための項目１記載の
ヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片。
（５９） ＣＣＲ２介在疾患の治療用医薬の製造のための項目１記
載のヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片の使用。
（６０） 項目１記載のヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結
合性断片と生理学的に許容され得る担体とを含有した医薬組成物。
（６１） a) 配列番号：１２；
b) 配列番号：１３；
c) 配列番号：１４；および
d) 配列番号：１５
からなる群より選択されたアミノ酸配列を含有してなる、ＣＣＲ２に対する結合
特異性を有するヒト化イムノグロブリン軽鎖またはその抗原結合性断片。
（６２） a) 配列番号：１７；
b) 配列番号：１８；
c) 配列番号：１９；および
d) 配列番号：２０
からなる群より選択されたアミノ酸配列を含有してなる、ＣＣＲ２に対する結合
特異性を有するヒト化イムノグロブリン重鎖またはその抗原結合性断片。
（６３） 配列番号：９８を含有した核酸分子によりコードされてな
る、ＣＣＲ２に対する結合特異性を有するヒト化イムノグロブリン軽鎖またはそ
の抗原結合性断片。
（６４） 配列番号：９７を含有した核酸分子によりコードされてな
る、ＣＣＲ２に対する結合特異性を有するヒト化イムノグロブリン重鎖またはそ
の抗原結合性断片。
（６５） 非ヒト起源の軽鎖可変領域とヒト定常領域とを含有してな
る、ＣＣＲ２に対する結合特異性を有するキメライムノグロブリンまたはその抗
原結合性断片。
（６６） 非ヒト起源の重鎖可変領域とヒト定常領域とを含有してな
る、ＣＣＲ２に対する結合特異性を有するキメライムノグロブリンまたはその抗
原結合性断片。
（６７） 非ヒト起源の軽鎖可変鎖領域(light chain variable regi
on) と非ヒト起源の重鎖可変領域とさらにヒト定常領域とを含有してなる、ＣＣ
Ｒ２に対する結合特異性を有するキメライムノグロブリンまたはその抗原結合性
断片。
（６８） 該再狭窄が、該哺乳動物における血管介入に関連するもの
である、項目５６記載の方法。
（６９） 該血管介入が、血管形成術を含むものである、項目６８
記載の方法。
（７０） 該血管介入が、ステント留置を含むものである、項目６
８記載の方法。
（７１） 該血管介入が、血管形成術とステント留置とを含むもので
ある、項目６８記載の方法。
（７２） 哺乳動物ＣＣＲ２またはその一部に結合する項目１また
は項目９の有効量のヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片を哺乳
動物に投与するステップを含む、哺乳動物における血管の管腔の狭窄の阻害方法
。
（７３） 哺乳動物ＣＣＲ２またはその一部に結合する項目１また
は項目９記載の有効量のヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片を
哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物における血管の新生内膜肥大の阻
害方法。
（７４） 該新生内膜肥大が、該哺乳動物における血管介入に関連す
るものである、項目７３記載の方法。
（７５） 該血管介入が、血管形成術を含むものである、項目７４
記載の方法。
（７６） 該血管介入が、ステント留置を含むものである、項目７
４記載の方法。
（７７） 該血管介入が、血管形成術とステント留置とを含むもので
ある、項目７４記載の方法。
（７８） 該ＣＣＲ２介在疾患が、自己免疫疾患である、項目５４
記載の方法。
（７９） 該自己免疫疾患が、多発性硬化症および慢性関節リウマチ
からなる群より選択されたものである、項目７８記載の方法。
（８０） 該自己免疫疾患が、多発性硬化症である、項目７９記載
の方法。
（８１） 該ＣＣＲ２介在疾患が、アテローム発生およびアテローム
性動脈硬化症からなる群より選択されたものである、項目５４記載の方法。
（８２） 重鎖と軽鎖とを含有し、かつ該軽鎖が、マウスモノクロー
ナル抗体１Ｄ９に由来する少なくとも１つの相補性決定領域とヒト抗体ＨＦ−２
１／２８の軽鎖に由来するフレームワーク領域とを含有し、該重鎖が、マウスモ
ノクローナル抗体１Ｄ９に由来する少なくとも１つの相補性決定領域とヒト抗体
４Ｂ４’ＣＬの重鎖に由来するフレームワーク領域とを含有するものである、Ｃ
ＣＲ２に対する結合特異性を有するヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合
性断片。
（８３） 該軽鎖が、１Ｄ９抗体の軽鎖に由来する３つの相補性決定
領域を含有し、該重鎖が、１Ｄ９抗体の重鎖に由来する３つの相補性決定領域を
含有する、項目８２記載のヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片
。
（８４） １Ｄ９の軽鎖に由来する相補性決定領域が、配列番号：９
のアミノ酸２４−３９、配列番号：９のアミノ酸５５−６１および配列番号：９
のアミノ酸９４−１０２であり、１Ｄ９の重鎖に由来する相補性決定領域が、配
列番号：１０のアミノ酸３１−３５、配列番号：１０のアミノ酸５０−６８およ
び配列番号：１０のアミノ酸101-106 である、項目８３記載のヒト化イムノグ
ロブリンまたは抗原結合性断片。
（８５） 配列番号：１２を含有した可変領域を含有する軽鎖と相補
的な重鎖とを含有してなる、ＣＣＲ２に対する結合特異性を有するヒト化イムノ
グロブリンまたはその抗原結合性断片。
（８６） 配列番号：１７を含有した可変領域を含有する重鎖と相補
的な軽鎖とを含有してなる、ＣＣＲ２に対する結合特異性を有するヒト化イムノ
グロブリンまたはその抗原結合性断片。
（８７） 重鎖と軽鎖とを含有し、ここで、該軽鎖が、配列番号：12
を含有した可変領域を含有し、該重鎖が、配列番号：１７を含有した可変領域を
含有するものである、ＣＣＲ２に対する結合特異性を有するヒト化イムノグロブ
リンまたはその抗原結合性断片。
（８８） 該イムノグロブリンが、ＣＣＲ２への結合についてマウス
抗体１Ｄ９と競合しうる、項目８７記載のヒト化イムノグロブリンまたは抗原
結合性断片。
（８９） 該イムノグロブリンが、リガンドとＣＣＲ２との結合を阻
害する、項目８７記載のヒト化イムノグロブリンまたは抗原結合性断片。
（９０） 該リガンドが、ケモカインである、項目８９記載のヒト
化イムノグロブリンまたは抗原結合性断片。
（９１） 該ケモカインが、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、
ＭＣＰ−４およびその組合せからなる群より選択されたものである、項目９０
記載のヒト化イムノグロブリンまたは抗原結合性断片。
（９２） 項目８２〜８７いずれか１項に記載のヒト化イムノグロ
ブリンまたはその抗原結合性断片と生理学的に許容されうる担体とを含有してな
る医薬組成物。
（９３） ＣＣＲ２を発現する細胞に、有効量の項目８２〜８７い
ずれか１項に記載のヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片を接触さ
せるステップを含む、ＣＣＲ２を発現する細胞とＣＣＲ２のリガンドとの相互作
用の阻害方法。
（９４） 患者に、有効量の項目８２〜８７いずれか１項に記載の
ヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片を含有した組成物を投与する
ステップを含む、患者のＨＩＶ感染の阻害方法。
（９５） ＣＣＲ２と有効量の項目８２〜８７いずれか１項に記載
のヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片とを接触させるステップを
含み、ここで、該ヒト化イムノグロブリンが、ケモカインと哺乳動物ＣＣＲ２と
の結合を阻害し、該ケモカインとＣＣＲ２との結合に関連する１以上の機能を阻
害する、ケモカインと哺乳動物ＣＣＲ２との結合に関連する機能の阻害方法。
（９６） 患者に、哺乳動物ＣＣＲ２またはその一部に結合する有効
量の項目８２〜８７いずれか１項に記載のヒト化イムノグロブリンまたはその
抗原結合性断片を投与するステップを含む、患者におけるＣＣＲ２介在疾患の治
療方法。
（９７） 患者に、哺乳動物ＣＣＲ２またはその一部に結合する有効
量の項目８２〜８７いずれか１項に記載のヒト化イムノグロブリンまたはその
抗原結合性断片を投与するステップを含む、患者における再狭窄の阻害方法。
（９８） 治療または診断に使用するための項目８２〜８７いずれ
か１項に記載のヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片。
（９９） ＣＣＲ２介在疾患の治療に使用するための項目８２〜８
７いずれか１項に記載のヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片。
（１００） ＣＣＲ２介在疾患の治療用医薬の製造のための項目８
２〜８７いずれか１項に記載のヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断
片の使用。
（１０１） 配列番号：107 のアミノ酸配列を含有してなる、ＣＣＲ
２に対する結合特異性を有するヒト化イムノグロブリン軽鎖またはその抗原結合
性断片。
発明の要旨
本発明は、哺乳動物ＣＣ−ケモカインレセプター２（ＣＣＲ２、ＣＫＲ−２、
ＭＣＰ−１ＲＡまたはＭＣＰ−１ＲＢともいう）または該レセプターの一部に結
合する抗体（イムノグロブリン）またはその機能的断片（例えば、抗原結合性断
片）（抗−ＣＣＲ２）に関する。１つの態様において、本発明の抗体またはその
断片は、ヒトまたはアカゲザルＣＣＲ２またはその一部に対して特異性を有する
。他の態様において、本発明の抗体または断片は、リガンド（例えば、ＭＣＰ−
１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４）とレセプターとの結合を妨げ、該リ
ガンドと該レセプターとの結合に関連する機能（例えば、白血球輸送）を阻害す
る。例えば、本明細書に記載されるように、ヒトまたはアカゲザルＣＣＲ２若し
くはその一部に結合する本発明の抗体およびその断片は、ケモカイン（例えば、
ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４）とレセプターとの結合を妨
げることができ、該ケモカインと該レセプターとの結合に関連する機能を阻害す
ることができる。１つの態様において、前記抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡ
ｂ）ＬＳ１３２．１Ｄ９（１Ｄ９）、またはヒトＣＣＲ２若しくはヒトＣＣＲ２
の一部への結合に関して１Ｄ９と競合しうる抗体である。先の抗体の機能的断片
も想定される。
別の態様において、本発明の抗体または機能的断片は、ヒトＣＣＲ２若しくは
その一部に結合し、レセプターへのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の結合を阻
害し、それにより、ＨＩＶとレセプターとの結合に関連する機能（例えば、ＨＩ
Ｖ抗原放出および感染性）を阻害する。１つの態様において、該抗体は、モノク
ローナル抗体１Ｄ９、またはヒトＣＣＲ２若しくはヒトＣＣＲ２の一部への結合
に関して１Ｄ９と競合しうる抗体である。
また、本発明は、哺乳動物ＣＣＲ２または該レセプターの一部に結合し、他の
抗−ＣＣＲ２抗体に対して、ＣＣＲ２若しくはＣＣＲ２を含有する組成物の蛍光
染色強度の増加を提供する抗体またはその機能的断片（例えば、抗原結合性断片
等）に関する。１つの態様において、前記抗体は、モノクローナル抗体１Ｄ９若
しくはＬＳ１３２．８Ｇ２（８Ｇ２）、またはヒトＣＣＲ２若しくはヒトＣＣＲ
２の一部への結合に関して、１Ｄ９若しくは８Ｇ２と競合しうる抗体に関する。
また、本発明は、ＣＣＲ２への結合特異性を有するヒト化イムノグロブリンま
たはその抗原結合性断片に関し、該イムノグロブリンは、非ヒト起源（例えば、
げっ歯類）の抗原結合領域とヒト起源のイムノグロブリンの少なくとも一部分（
例えば、ヒトフレームワーク領域、ガンマ型のヒト定常領域）とを含有するもの
である。１つの態様において、本明細書に記載されたヒト化イムノグロブリンま
たはその断片は、ＣＣＲ２への結合に関して１Ｄ９と競合しうる。好ましい態様
では、ヒト化イムノグロブリンの抗原結合領域は、モノクローナル抗体１Ｄ９（
例えば、それぞれ、Ｆｉｇｕｒｅ ７（配列番号：９）およびＦｉｇｕｒｅ ８
（配列番号：１０）に示される軽鎖および重鎖の可変領域を含有するイムノグロ
ブリン等）に由来する。
例えば、ヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片は、非ヒト起源の
少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する抗原結合領域と、ヒトフ
レームワーク領域に由来するフレームワーク領域（ＦＲ）とを含有しうる。１つ
の側面において、ＣＣＲ２に対して結合特異性を有するヒト化イムノグロブリン
は、ＣＣＲ２に結合する非ヒト起源の抗体に由来する少なくとも１つのＣＤＲと
ヒト起源の軽鎖に由来する（例えば、ＨＦ−２１／２８由来）ＦＲとを含有した
軽鎖と、ＣＣＲ２に結合する非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲとヒト起源の重
鎖に由来する（例えば、４Ｂ４’ＣＬ由来）ＦＲとを含有した重鎖とを含有する
。他の側面において、軽鎖は、１Ｄ９抗体の軽鎖に由来する３つのＣＤＲを含有
し、重鎖は、１Ｄ９抗体の重鎖に由来する３つのＣＤＲを含有する。
また、本発明は、ヒト化イムノグロブリン軽鎖およびその抗原結合性断片（例
えば、１Ｄ９抗体の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とヒト軽鎖ＦＲと
を含有する）、並びにヒト化イムノグロブリン重鎖およびその抗原結合性断片（
例えば、１Ｄ９抗体の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とヒト重鎖ＦＲ
とを含有する）に関する。好ましい態様において、本発明は、本明細書に記載さ
れたヒト化重鎖および軽鎖（例えば、Ｆｉｇｕｒｅ ７（配列番号：９）に示さ
れる軽鎖の可変領域を含有するヒト化軽鎖、Ｆｉｇｕｒｅ ８（配列番号：１０
）に示される重鎖の可変領域を含有するヒト化重鎖等）に関する。１以上の軽鎖
および／または重鎖を含有するヒト化イムノグロブリンも包含される。
さらに、本発明の主題は、重鎖と軽鎖とを含有し、該軽鎖がマウスモノクロー
ナル抗体１Ｄ９に由来する少なくとも１つの相補性決定領域とヒト抗体ＨＦ−２
１／２８の軽鎖に由来するフレームワーク領域とを含有するものであり、該重鎖
が、マウスモノクローナル抗体１Ｄ９に由来する少なくとも１つの相補性決定領
域とヒト抗体４Ｂ４’ＣＬの重鎖に由来するフレームワーク領域とを含有するも
のである、ＣＣＲ２に対する結合特異性を有するヒト化ムノグロブリンまたはそ
の抗原結合性断片に関する。１つの態様において、前記軽鎖は、１Ｄ９抗体の軽
鎖に由来する３つの相補性決定領域を含有し、前記重鎖は、１Ｄ９抗体の重鎖に
由来する３つの相補性決定領域を含有する。別の態様において、１Ｄ９の軽鎖に
由来する相補性決定領域は、配列番号：９のアミノ酸２４−３９、配列番号：９
のアミノ酸５５−６１および配列番号：９のアミノ酸９４−１０２であり、１Ｄ
９の重鎖に由来する相補性決定領域は、配列番号：１０のアミノ酸３１−３５、
配列番号：１０のアミノ酸５０−６８および配列番号：１０のアミノ酸１０１−
１０６である。
さらに、本発明は、軽鎖と相補的な重鎖とを含有し、該軽鎖が、配列番号：１
２を含有した可変領域を含有するものである、ＣＣＲ２に対して結合特異性を有
するヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片に関する。また、本発明
は、重鎖と相補的な軽鎖とを含有し、該重鎖が、配列番号：１７を含有する可変
領域を含有するものであるＣＣＲ２に対して結合特異性を有するヒト化イムノグ
ロブリンまたはその抗原結合性断片に関する。好ましい態様において、本発明は
、重鎖と軽鎖とを含有し、該軽鎖が、配列番号：１２を含有した可変領域を含有
するものであり、該重鎖が、配列番号：１７を含有する可変領域を含有するもの
であるＣＣＲ２に対して結合特異性を有するヒト化イムノグロブリンまたはその
抗原結合性断片に関する。１つの態様において、前記ヒト化イムノグロブリンま
たは抗原結合性断片は、ＣＣＲ２への結合に関してマウス抗体１Ｄ９と競合しう
る。さらなる態様において、前記ヒト化イムノグロブリンまたは抗原結合性断片
は、リガンドとＣＣＲ２との結合を阻害する。
さらに、本発明は、本発明のヒト化イムノグロブリン（例えば、単鎖抗体）を
コードする核酸配列を含有した、単離された核酸分子、並びに本発明のヒト化イ
ムノグロブリン軽鎖（例えば、配列番号：９５のヌクレオチド５２−３９０を含
有する）または重鎖（例えば、配列番号：９６のヌクレオチド５８−４１１を含
有する）をコードする配列を含有した、単離された核酸分子に関する。例えば、
本発明は、マウス１Ｄ９モノクローナル抗体に由来する抗原結合領域をコードす
る第１の核酸配列とヒト起源のイムノグロブリンの定常領域の少なくとも一部を
コードする第２の核酸配列とを含有した、ヒト化イムノグロブリン軽鎖または重
鎖をコードする遺伝子（例えば、融合遺伝子等）を提供する。
さらに、本発明は、ＣＣＲ２に対して結合特異性を有するヒト化イムノグロブ
リンまたはかかるイムノグロブリンの鎖をコードする核酸分子を含有する構築物
に関する。例えば、ＣＣＲに対する結合特異性を有する非ヒト抗体の軽鎖に由来
するＣＤＲおよびヒト起源の軽鎖に由来するフレームワーク領域をコードした塩
基配列を含有したヒト化イムノグロブリン軽鎖をコードした遺伝子（例えば、融
合遺伝子等）を含有した発現ベクターが提供される。ＣＣＲ２に対して結合特異
性を有する非ヒト抗体の重鎖に由来するＣＤＲとヒト起源の重鎖に由来するフレ
ームワーク領域とをコードした塩基配列を含有したヒト化イムノグロブリン重鎖
をコードする遺伝子を含有した発現ベクターは、かかる構築物の他の例示である
。
また、本発明は、本発明の核酸分子を含有する１以上の構築物等の、本発明の
核酸分子を含有した宿主細胞に関する。１つの態様において、本発明は、ヒト化
イムノグロブリン軽鎖をコードする組換核酸であり、かつマウス１Ｄ９抗体の軽
鎖に由来するＣＤＲおよびヒト起源の軽鎖に由来するフレームワーク領域をコー
ドする塩基配列を含有した第１の組換核酸と、ヒト化イムノグロブリン重鎖をコ
ードする組換核酸であり、かつマウス１Ｄ９抗体の重鎖に由来するＣＤＲおよび
ヒト起源の重鎖に由来するフレームワーク領域をコードする塩基配列を含有した
第２の組換え核酸とを含有した宿主細胞に関する。
また、本発明は、本発明の宿主細胞をヒト化イムノグロブリンの発現に適した
条件下に維持し、それにより、１若しくは複数のヒト化イムノグロブリン鎖を発
現させ、ヒト化イムノグロブリンを生産させるステップを含む、ヒト化イムノグ
ロブリンの製造方法を提供する。本方法は、ヒト化イムノグロブリンを単離する
ステップをさらに含みうる。
本発明のヒト化イムノグロブリンは、それらのマウスまたは他の非ヒトカウン
ターパートよりもより低い免疫原性でありうる。したがって、本明細書に記載さ
れたヒト化イムノグロブリンは、ヒトにおいて、例えば、粘膜リンパ様組織への
リンパ球ホーミングを制御し、それにより、炎症性応答を減少させるための治療
剤として用いられうる。
さらに、本発明は、診断または治療（予防を含む）に使用するための本発明の
ヒト化イムノグロブリンに関する。１つの態様において、本発明は、組織の白血
球浸潤に関連する疾患の治療、例えば、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片拒絶
、ＨＩＶ感染およびアテローム性硬化症等の単球介在疾患の治療等に使用するた
めの本発明のヒト化イムノグロブリンに関する。
他の側面において、本発明は、組織の白血球浸潤に関連する疾患の治療、例え
ば、炎症性疾患、自己免疫疾患、例えば、アテローム性硬化症等の単球介在疾患
、移植片拒絶またはＨＩＶ感染の治療用の医薬の製造のための本発明のヒト化イ
ムノグロブリンの使用に関する。
さらに、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類動物またはマウス
等）ＣＣＲ２を有する細胞と、哺乳動物ＣＣＲ２若しくはＣＣＲ２の一部に結合
する有効量の抗体またはその機能的断片とを接触させるステップを含む、哺乳動
物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類動物またはマウス等）ＣＣＲ２を有する細胞と
そのリガンドとの相互作用の阻害方法に関する。適切な細胞としては、顆粒球；
単球、マクロファージ、好塩基球、好酸球等の白血球；マスト細胞；Ｔ細胞（例
えば、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ２５＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞等）
を含むリンパ球；並びにＣＣＲ２を発現する組換細胞等の他のＣＣＲ発現細胞（
例えば、トランスフェクト細胞等）が挙げられる。特定の態様において、前記抗
体は、１Ｄ９、またはヒトＣＣＲ２若しくはヒトＣＣＲ２の一部への結合に関し
て１Ｄ９と競合しうる抗体である。
本発明の別の態様は、哺乳動物ＣＣＲ２を有する細胞と、ＣＣＲ２若しくは該
レセプターの一部に結合する有効量の抗体またはその機能的断片とを接触させる
ステップを含む、哺乳動物ＣＣＲ２を有する細胞とケモカインとの相互作用の阻
害方法に関する。本方法の１つの態様において、前記抗体またはその機能的断片
は、１Ｄ９、１Ｄ９の抗原結合性断片または１Ｄ９と同じ若しくは類似したエピ
トープ特異性を有する抗体若しくはその断片のいずれか１以上である。さらに、
本発明は、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質若しくは該レセプターの一部に結合する
有効量の抗体またはその機能的断片を投与するステップを含む、ケモカインとＣ
ＣＲ２との結合に関連する機能の阻害方法に関する。本方法の１つの側面におい
て、前記抗体またはその機能的断片は、１Ｄ９、１Ｄ９の抗原結合性断片または
１Ｄ９と同じ若しくは類似したエピトープ特異性を有する抗体若しくはその断片
のいずれか１以上である。
本発明の他の側面は、細胞による、哺乳動物ＣＣＲ２または該レセプターの一
部の発現の同定方法である。本方法によれば、細胞またはその画分（例えば、膜
画分）を含有した組成物と、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質若しくは該レセプター
の一部に結合する抗体またはその機能的断片（例えば、１Ｄ９または８Ｇ２) と
を該抗体への結合に適した条件下に接触させ、該抗体若しくは断片と該タンパク
質またはその一部との間の複合体の形成を検出する。複合体の検出は、直接的ま
たは間接的に、細胞上の前記レセプターの存在を示す。また、本発明は、哺乳動
物ＣＣ−ケモカインレセプター２若しくは該レセプターの一部に結合する抗体ま
たはその機能的断片と、該抗体若しくは断片と該タンパク質若しくはその一部と
の間の複合体の存在を検出するに適した１以上の助剤とを含有した、生体試料中
におけるＣＣＲ２若しくはその一部の存在の検出に用いるためのキットに関する
。
また、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質に結合する別のリガンド、または、哺乳動
物ＣＣＲ２機能の阻害物質および／または促進物質等の他の物質の同定方法も本
発明に包含される。例えば、本発明の抗体若しくはその機能的断片と同じ若しく
は類似した結合特異性を有する物質が、該抗体若しくは断片との競合アッセイに
より同定されうる。したがって、本発明は、ＣＣＲ２レセプターに結合するリガ
ンド、またはレセプター機能の阻害物質（例えば、アンタゴニスト）若しくは促
進物質（例えば、アゴニスト）等の他の物質の同定方法をも包含する。１つの態
様において、ＣＣＲ２レセプタータンパク質を天然に発現する細胞またはＣＣＲ
２レセプター若しくは細胞に導入された核酸によりコードされたバリアントを発
現するように遺伝子工学的に作製された適切な宿主細胞は、リガンド、レセプタ
ー機能の阻害物質または促進物質の有効性を同定および評価するためのアッセイ
に用いられる。また、かかる細胞は、発現したレセプタータンパク質またはポリ
ペプチドの機能を評価するのに有用である。
したがって、本発明は、試験対象の薬剤と、本発明の抗体または抗原結合性断
片( 例えば、モノクローナル抗体１Ｄ９、１Ｄ９と同じまたは類似したエピトー
プ特異性を有する抗体、１Ｄ９の抗原結合性断片、モノクローナル抗体８Ｇ２、
８Ｇ２と同じまたは類似したエピトープ特異性を有する抗体、および８Ｇ２の抗
原結合性断片) と、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質またはリガンド結合バリアント
を含有した組成物とを混合するステップを含む、哺乳動物ＣＣＲ２またはリガン
ド結合バリアントに結合する薬剤の検出または同定方法にも関する。前記成分は
、抗体または抗原結合性断片と哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質またはリガンド結合
バリアントとの結合に適した条件下に混合され得、抗体または断片と哺乳動物Ｃ
ＣＲ２タンパク質またはリガンド結合バリアントとの結合は、本明細書に記載さ
れた方法若しくは他の適切な方法により、直接的または間接的に検出または測定
される。適切な対照(例えば、試験対象の薬剤の非存在下) に対して、形成した
複合体の量が減少することは、該薬剤が、該レセプターまたはバリアントに結合
することを示す。哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質またはリガンド結合バリアントを
含有した組成物は、組換えＣＣＲ２タンパク質またはリガンド結合バリアントを
有する細胞の膜画分でありうる。前記抗体またはその断片は、ラジオアイソトー
プ、スピン標識、抗原標識、酵素標識、蛍光基および化学発光基等の標識で標識
され得る。これらおよび類似のアッセイを用いて、リガンド( 例えば、ＣＣＲ２
と相互作用するケモカイン等) 等の薬剤、またはＣＣＲ２に結合し、レセプター
への結合について本明細書に記載された抗体と競合する、レセプター機能の阻害
物質または促進物質等の他の物質を検出することができる。
本発明によれば、リガンド、レセプター機能の阻害物質または促進物質は、適
切なアッセイで同定され、治療効果をさらに評価されうる。レセプター機能の阻
害物質は、レセプター活性を阻害（減少または予防）することに用いられ、リガ
ンドおよび／または促進物質は、示された場合の正常なレセプター機能を誘導（
誘発または増強）することに用いられ得る。また、本発明は、レセプター機能(
例えば、ケモカイン結合またはＨＩＶ結合) の阻害物質を個体( 例えば、ヒト等
の哺乳動物) に投与するステップを含む、炎症性疾患、自己免疫疾患、アテロー
ム性硬化症および移植片拒絶またはＨＩＶ感染の治療方法を提供する。さらに、
本発明は、個体への新規リガンドまたは促進物質に投与するステップによる、レ
セプター機能の刺激方法を提供し、例えば、感染性疾患および癌の治療に有用な
白血球機能の選択的刺激への新たなアプローチを提供する。
本発明の別の側面は、哺乳動物ＣＣＲ２またはその一部を発現する細胞と哺乳
動物ＣＣＲ２または該レセプターの一部に結合し、ＨＩＶ結合および感染を阻害
する有効量の抗体またはその機能的断片とを接触させるステップを含む、哺乳動
物ＣＣＲ２またはその一部を発現する細胞のＨＩＶ感染の阻害方法に関する。本
発明の特定の態様において、抗体またはその機能的断片は、１Ｄ９、１Ｄ９と同
じまたは類似したエピトープ特異性を有する抗体、ヒトＣＣＲ２への結合につい
て１Ｄ９と競合しうる抗体、およびその抗原結合性断片のいずれかである。
患者に、哺乳動物ＣＣＲ２または該レセプターの一部に結合し、ＣＣＲ２レセ
プターへのＨＩＶ結合を阻害する有効量の抗体またはその機能的断片を投与する
ステップを含む、患者におけるＨＩＶの阻害( 例えば、治療) 方法も本発明によ
り包含される。前記抗−ＣＣＲ２抗体または断片は、単独で投与または１以上の
さらなる治療薬、抗−ＣＣＲ３、抗−ＣＣＲ５、および／または抗−ＣＸＣＲ４
抗体等の、例えば、ＨＩＶ感染に対するコレセプターに結合し、コレセプターへ
の結合を阻害する１以上の抗体と組合せて投与されうる。
また、本発明の他の側面は、個体に、ＣＣＲ２に結合し、ＣＣＲ２へのＨＩＶ
結合を阻害する有効量の抗体またはその機能的断片を投与するステップを含む、
個体におけるＨＩＶ感染の予防または阻害方法に関する。本発明によれば、ＨＩ
Ｖ感染の予防としては、感染した個体における新たな細胞の感染を予防( 減少ま
たは除去) するためまたはＨＩＶに曝露されるであろう個体、ＨＩＶに曝露され
ていたであろう個体若しくはＨＩＶに曝露されている個体における感染を予防す
るための治療が挙げられる。例えば、ＨＩＶ感染個体、ＨＩＶ感染女性の胎児、
または医療従事者等の個体は、本発明の方法により、治療されうる。
本発明は、患者に、哺乳動物ＣＣＲ２または該レセプターの一部に結合し、リ
ガンドと該レセプターとの結合に関連する機能を阻害する有効量の抗体またはそ
の機能的断片を投与するステップを含む、患者における白血球輸送の阻害方法を
も包含する。
また、本発明は、患者に、哺乳動物ＣＣＲ２または該レセプターの一部に結合
し、ＣＣＲ２−媒介機能を阻害する有効量の抗体またはその機能的断片を投与す
るステップを含む、炎症性疾患等のＣＣＲ２介在疾患の阻害または治療方法に関
する。例えば、本発明は、患者に、哺乳動物ＣＣＲ２または該レセプターの一部
に結合し、ＣＣＲ２−媒介機能を阻害する有効量の抗体またはその機能的断片を
投与するステップを含む、脈管構造の狭窄または再狭窄の阻害または治療方法に
関する。
さらに、本発明は、治療( 予防を含む) または診断に用いるための本明細書に
記載された抗体またはその断片( 例えば、モノクローナル抗体１Ｄ９またはその
抗原結合性断片) およびＣＣＲ２介在疾患または本明細書に記載された他の疾患
若しくは炎症状態の治療用医薬の製造のためのかかる抗体または断片の使用に関
する。
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳動物のＣＣケモカインレセプター２（ＣＣＲ２、ＣＫＲ−２、
ＭＣＰ−１ＲＡもしくはＭＣＰ−１ＲＢ）またはＣＣＲ２の一部に結合する抗体
（抗ＣＣＲ２）またはその機能的断片に関する。一態様では、抗体はヒトＣＣＲ
２またはｒｈｅｓｕｓ ＣＣＲ２またはその一部に対する特異性を有する。一態
様では、抗体（イムノグロブリン）は単離されたおよび／または組換えの哺乳動
物のＣＣＲ２またはその一部（例えば、ペプチド）に対してあるいは、哺乳動物
のＣＣＲ２を発現する宿主細胞に対して産生される。好ましい一態様では、抗体
は、（１または複数の）ヒトＣＣＲ２レセプター（例えばＣＣＲ２ａおよび／ま
たはＣＣＲ２ｂ）またはその一部に特異的に結合し、また特に好ましい一態様で
は、該抗体は天然または内因性のヒトのＣＣＲ２に対して特異性を有する。本明
細書で使用するように、「ＣＣ−ケモカインレセプター２」（「ＣＣＲ２」）は
、ＣＣ−ケモカインレセプター２ａおよび／またはＣＣ−ケモカインレセプター
２ｂをいう。哺乳動物のＣＣＲ２に特有の１つ以上の機能、例えば結合活性（例
えば、リガンド、阻害物質および／または促進物質の結合）、シグナル伝達活性
（例えば、哺乳動物のＧタンパク質の活性化、細胞質ゾルの遊離カルシウム濃度
［Ｃａ2+］i の急速でそして一時的な増大の誘導）および／または細胞性の応答
の刺激（例えば、走化性の刺激、エキソサイトーシスまたは白血球による炎症メ
ディエーターの放出、インテグリン活性化）などを阻害できる抗体またはその機
能的断片も本発明に包含される。この抗体は、ＣＣＲ２に対するリガンド（すな
わち１つ以上のリガンド）の結合および／またはリガンドに応答してＣＣＲ２に
よって媒介される１つ以上の機能を阻害できる。例えば、一つの側面においては
、抗体またはその機能的断片は、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３および／
またはＭＣＰ−４などの天然リガンドとのレセプターの相互作用を阻害（減少ま
たは防止）し得る。別の側面においては、ＣＣＲ２に結合する抗体またはその機
能的断片は、哺乳動物のＣＣＲ２（例えばヒトのＣＣＲ２、非ヒト霊長類のＣＣ
Ｒ２、ネズミのＣＣＲ２）に対するＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３および
／またはＭＣＰ−４および／またはＨＩＶの結合を阻害し得る。本発明の抗体ま
たはその機能的断片は、白血球の輸送、細胞へのＨＩＶの侵入、Ｔ細胞の活性化
、炎症メディエーターの放出および／または白血球の脱顆粒を含む、ヒトのＣＣ
Ｒ２によって媒介される機能を阻害し得る。好ましくは、該抗体または断片は、
少なくとも約０．１×１０-9Ｍ、好ましくは少なくとも約１×１０-9Ｍ、より好
ましくは少なくとも約３×１０-9Ｍの親和性でＣＣＲ２に結合しうる。特定の態
様では、抗体またはその機能的断片は、約１５０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは約
１００μｇ／ｍｌ未満、より好ましくは約５０μｇ／ｍｌ未満、さらにより好ま
しくは約２０μｇ／ｍｌ未満で、ケモカイン誘導性（例えば、ＭＣＰ−１誘導性
）の細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の走化性の阻害を示す。
本発明のさらなる態様では、本発明の抗体またはその機能的断片は、ＣＣＲ２
へのＣＣＲ２リガンド（例えばケモカイン）の結合を、約１．０μｇ／ｍｌ未満
、好ましくは約０．０５μｇ／ｍｌ未満、より好ましくは約０．００５μｇ／ｍ
ｌ未満のＩＣ50で阻害できる。
ＣＣＲ２に対して特異的なネズミ(murine)モノクローナル抗体（１Ｄ９および
８Ｇ２と命名した）を本明細書に記載するように産生させた。好ましい一態様で
は、本発明の抗体はヒトのＣＣＲ２に結合し、本明細書に記載のネズミの１Ｄ９
または８Ｇ２抗体のものと同じもしくは類似のエピトープ特異性を有する。ネズ
ミの１Ｄ９モノクローナル抗体のものと同一または類似のエピトープ特異性を有
する抗体は、ヒトＣＣＲ２（例えば、ヒトのＣＣＲ２を有する細胞（例えば、Ｃ
ＣＲ２を有するトランスフェクタント、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤＲ４
５ＲＯ＋細胞、ＣＤ２５＋細胞、単球、樹状細胞、マクロファージおよび好塩基
球））に対する結合に関してネズミの１Ｄ９モノクローナル抗体と競合するそれ
らの能力によって同定できる。同様に、ネズミの８Ｇ２モノクローナル抗体のも
のと同じもしくは類似のエピトープ特異性を有する抗体は、ヒトのＣＣＲ２に対
する結合に関してネズミの８Ｇ２モノクローナル抗体と競合するそれらの能力に
よって同定できる。レセプターのキメラ（Ｒｕｃｋｅｒら，Ｃｅｌｌ ８７：４
３７−４４６（１９９６））を用いて、ｍＡｂ １Ｄ９および８Ｇ２の結合部位
を、ヒトＣＣ−ケモカインレセプター２のアミノ末端ドメイン、具体的には該タ
ンパク質のほぼアミノ酸１位からほぼアミノ酸３０位までを含有するエピトープ
にマッピングした。これらの技術または他の適切な技術を用いて、本発明の抗体
のものと同じまたは類似のエピトープ特異性を有する抗体を同定できる。ｍＡｂ
１Ｄ９および８Ｇ２は、ＣＣＲ２レセプターのアミノ末端ドメイン、例えば、
該レセプタータンパク質のほぼアミノ酸１位からほぼアミノ酸３０位までに対す
るエピトープ特異性を有する。したがって、本発明は、哺乳動物のＣＣ−ケモカ
インレセプター２のアミノ末端ドメインもしくはその一部、具体的には哺乳動物
のＣＣ−ケモカインレセプター２のほぼアミノ酸１位からほぼアミノ酸３０位ま
でを含有するエピトープに結合する抗体またはその機能的部分に関する。
また本発明は、本明細書に記載の抗体のうち少なくとも２種類と同一または類
似のエピトープ特異性を有する二重特異性抗体またはその機能的断片（例えばＦ
（ａｂ’）2 ）に関する（例えば、米国特許第５，１４１，７３６号（Ｉｗａｓ
ａら）、米国特許第４，４４４，８７８号、第５，２９２，６６８号、第５，５
２３，２１０号（すべてＰａｕｌｕｓら）および米国特許第５，４９６，５４９
号（Ｙａｍａｚａｋｉら）を参照されたい）。例えば本発明の二重特異性抗体は
ｍＡｂ １Ｄ９および８Ｇ２と同じもしくは類似のエピトープ特異性を有し得、
例えば哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質のアミノ末端ドメインまたはその一部と結
合する。
本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、１９９８年７月１７日にＬ
ｅｕｋｏＳｉｔｅ，Ｉｎｃ．，２１５ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｃａｍｂｒ
ｉｄｇｅ，ＭＡ ０２１４２，Ｕ．Ｓ．Ａ．（現在は、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，７５ Ｓｉｄｎｅｙ Ｓｔｒｅｅ
ｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ ０２１３９，Ｕ．Ｓ．Ａ）を代表してアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、１０８０１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏ
ｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０，Ｕ．Ｓ．
Ａ．に、登録番号ＨＢ−１２５４９（１Ｄ９）およびＨＢ−１２５５０（８Ｇ２
）で寄託された。本発明はまた、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１２５４９およびＡＴ
ＣＣ登録番号ＨＢ−１２５５０の下で寄託されたハイブリーマ細胞株、ならびに
ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１２５４９およびＨＢ−１２５５０の下で寄託されたハ
イブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体に関する。
本発明の抗体はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく、「
抗体」という用語はポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を包含する
ことが意図される。さらにまた、８Ｇ２を利用する本明細書に記載の方法では８
Ｇ２の機能的断片（例えば抗原結合性断片）、８Ｇ２と同一または類似のエピト
ープ特異性を有する抗体およびそれらの組み合わせも、必要であれば８Ｇ２とは
同じでなく類似してもいないエピトープ特異性を有する抗体または断片と組み合
わせて使用できる；同様に、１Ｄ９を利用すると記載されている方法では、１Ｄ
９の機能的断片、１Ｄ９と同一または類似のエピトープ特異性を有する抗体およ
びそれらの組み合わせも、必要であれば１Ｄ９とは同じでなく類似してもいない
エピトープ特異性を有する抗体または断片と組み合わせて使用することもできる
ことが理解される。本発明の抗体は適切な免疫原（例えば単離および／または組
換えの哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質もしくはその一部）または合成分子（例え
ば、合成ペプチド）に対して産生させることができる。好ましい一態様では、レ
セプターを発現する細胞（例えばトランスフェクト細胞）は免疫原としてまたは
レセプターに結合する抗体のスクリーニングに使用され得る。
本発明の抗体およびその断片は、本明細書に記載するように治療適用、診断適
用および研究適用において有用である。本発明は、治療（予防を含む）または（
例えば本明細書に記載するような特定の疾患または症状の）診断に使用するため
の本発明の抗体またはその機能的部分（例えばｍＡｂ １Ｄ９もしくは８Ｇ２ま
たはその抗原結合性断片）、および本明細書に記載するような疾患または症状の
治療に使用するための医薬品の製造のためのかかる抗体またはその機能的部分の
使用を包含する。
免疫化抗原の調製とポリクローナルおよびモノクローナル抗体の産生は本明細
書に記載のようにまたは他の適当な技術を使って行なうことができる。様々な方
法が記載されている（例えばＫｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−
４９７（１９７５）およびＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：５１１−５１９
（１９７６）；Ｍｉｌｓｔｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ ２６６：５５０−５５２
（１９７７）；Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉら、米国特許第４，１７２，１２４号；Ｈａ
ｒｌｏｗ，Ｅ．およびＤ． Ｌａｎｅ（１９８８），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（コールドスプリングハーバー研究所，
ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編
，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ Ｖｏｌ．２（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２７，１９９４年夏）（Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク州ニューヨーク）のＣｈａｐｔｅｒ
１１（１９９１）を参照されたい）。一般にハイブリドーマは適当な不死化細
胞株（例えばＳＰ２／０などの骨髄腫細胞株）を抗体産生細胞と融合させること
によって産生され得る。抗体産生細胞、好ましくは脾臓またはリンパ節由来の細
胞は、対象とする抗原で免疫した動物から得られる。融合細胞（ハイブリドーマ
）は選択培養条件を使って単離し、限界希釈法によってクローン化できる。望ま
しい結合特性をもつ抗体を産生する細胞は適切なアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）
によって選択し得る。
ＣＣＲ２に結合する抗体（ヒト抗体または人工的な抗体を含む）を産生または
単離する他の適切な方法が使用され得る。これは、例えば組換え抗体（例えば、
単鎖ＦｖまたはＦａｂ）をライブラリーから選択する方法や、ヒト抗体のレパー
トリーを産生できるトランスジェニック動物（例えばマウス）の免疫化による方
法を含む（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔ
ｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｌｏｎｂｅｒｇら
、米国特許第５，５４５，８０６号；Ｓｕｒａｎｉら、米国特許第５，５４５，
８０７号を参照されたい）。
単鎖抗体およびキメラ抗体、ヒト化抗体または霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅ
ｄ）（ＣＤＲ移植）抗体ならびに異なる種に由来する部分を含むキメラ抗体また
はＣＤＲ移植単鎖抗体なども、本発明および「抗体」という用語に包含される。
これらの抗体の種々の部分は従来の技術によって化学的に互いに連結されたり、
遺伝子操作技術を使って連続するタンパク質として製造されうる。例えば、キメ
ラ鎖またはヒト化鎖をコードする核酸は、連続したタンパク質を産生するように
発現され得る。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号、
Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許第０，１２５，０２３ Ｂ１号；Ｂｏｓｓら、米国
特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓら、欧州特許第０，１２０，６９４ Ｂ
１号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、国際公開第８６／０１５３３号パンフ
レット；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、欧州特許第０，１９４，２７６ Ｂ
１号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特
許第０，２３９，４００ Ｂ１号；ならびにＱｕｅｅｎら、米国特許第５，５８
５０８９号、第５，６９８，７６１号および第５，６９８，７６２号を参照され
たい。また、霊長類化抗体についてはＮｅｗｍａｎ，Ｒ．ら，ＢｉｏＴｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ，１０：１４５５−１４６０（１９９２）、単鎖抗体についてはＬａ
ｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号およびＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６（１９８８））も参照されたい。
また、抗体の機能的断片（キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体または単鎖
抗体の断片を含む）も産生され得る。上述した抗体の機能的断片は、それらの元
となる完全長抗体の少なくとも１つの結合機能および／または調節機能を保持し
ている。好ましい機能的断片は対応する完全長抗体の抗原結合機能（例えば哺乳
動物のＣＣＲ２を結合する能力）を保持している。特に好ましい機能的断片は、
哺乳動物のＣＣＲ２に特有な１つ以上の機能（例えば結合活性、シグナル伝達活
性および／または細胞性の応答の刺激など）を阻害する能力を保持している。例
えば、一態様では、機能的断片はＣＣＲ２と１つ以上のリガンド（例えばＭＣＰ
−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３および／またはＭＣＰ−４）との相互作用を阻害
しおよび／または１つ以上のレセプターが媒介する機能（例えば白血球の輸送、
細胞へのＨＩＶの侵入、Ｔ細胞の活性化、炎症メディエーターの放出および／ま
たは白血球の脱顆粒）を阻害することができる。
例えば、哺乳動物のＣＣＲ２レセプターまたはその一部に結合できる抗体断片
（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2 断片を含むが、これらに限定さ
れない）は本発明に包含される。このような断片は、例えば酵素的切断や組換え
技術によって産生し得る。例えばパパインまたはペプシンによる切断によってそ
れぞれＦａｂ断片またはＦ（ａｂ’）2 断片を生成することができる。抗体は、
１つ以上の停止コドンが天然の停止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を使
って種々の切断された形態で産生することもできる。例えばＦ（ａｂ’）2 重鎖
部分をコードするキメラ遺伝子は重鎖のＣＨ1 ドメインとヒンジ領域とをコード
するＤＮＡ配列を含むように設計することができる。
本発明は、非ヒト起源（例えばげっ歯類）の抗原結合領域と、ヒト起源のイム
ノグロブリンの少なくとも一部（例えば、ヒトのフレームワーク領域、ヒトの定
常領域またはそれらの一部）とを含む、ＣＣＲ２に対して結合特異性を有するヒ
ト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片に関する。一態様では、ヒト化
イムノグロブリンは、ＣＣＲ２に結合する非ヒト起源の抗原結合領域と、ヒト定
常領域に由来する定常領域とを含む。別の態様では、ＣＣＲ２に結合するヒト化
イムノグロブリンは、非ヒト起源の相補性決定領域と、ヒト起源の可変フレーム
ワーク領域と、任意にヒト起源の定常領域とを含む。例えば、ヒト化イムノグロ
ブリンは、ＣＣＲ２に結合する非ヒト起源の抗体に由来する相補性決定領域とヒ
ト起源の軽鎖に由来するフレームワーク領域とを含有する軽鎖、およびＣＣＲ２
に結合する非ヒト起源の抗体に由来する相補性決定領域とヒト起源の重鎖に由来
するフレームワーク領域とを含有する重鎖を含みうる。
一態様では、ヒト化イムノグロブリンは、ヒトのＣＣＲ２に対する結合に関し
てネズミの１Ｄ９または８Ｇ２モノクローナル抗体と競合しうる。好ましい態様
では、ヒト化イムノグロブリンの抗原結合領域は、（ａ）１Ｄ９モノクローナル
抗体に由来する（例えば、１Ｄ９軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およ
び／または１Ｄ９重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含有するヒト化イ
ムノグロブリンの場合のように）、または（ｂ）８Ｇ２モノクローナル抗体に由
来する（例えば、８Ｇ２軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／また
は８Ｇ２重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含有するヒト化イムノグロ
ブリンの場合のように）。キメラまたはＣＤＲ移植単鎖抗体もヒト化イムノグロ
ブリンという用語に包含される。
本発明はまた、ヒト化イムノグロブリン軽鎖もしくはその抗原結合性断片、ま
たはヒト化イムノグロブリン重鎖もしくはその抗原結合性断片に関する。一態様
では、本発明は、非ヒト起源の軽鎖ＣＤＲ（すなわち、１つもしくはそれ以上の
ＣＤＲ）とヒト軽鎖フレームワーク領域とを含有するヒト化軽鎖に関する。別の
態様では、本発明は、非ヒト起源の重鎖のＣＤＲ（すなわち、１つもしくはそれ
以上のＣＤＲ）とヒト重鎖のフレームワーク領域とを含有するヒト化イムノグロ
ブリン重鎖に関する。ＣＤＲは、非ヒトイムノグロブリンに由来しうる。
天然のイムノグロブリンは、２つの同一の軽鎖（約２４ｋＤ）と２つの同一の
重鎖（約５５または７０ｋＤ）とが四量体を形成している共通のコア構造を有す
る。各鎖のアミノ末端部分は、可変（Ｖ）領域として知られており、各鎖の残り
の部分のより保存的な定常（Ｃ）領域と区別されうる。軽鎖の可変領域内には、
Ｊ領域として知られるＣ末端部分がある。重鎖の可変領域内には、Ｊ領域に加え
てＤ領域がある。イムノグロブリンにおけるアミノ酸配列のバリエーションのほ
とんどは、抗原結合に直接関与する超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）
として知られるＶ領域内の３つの分離した位置に限定される。これらの領域を、
アミノ末端から順に、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と命名する。
ＣＤＲは、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）により定位置に保持され
る。これらの領域を、アミノ末端から順に、それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３お
よびＦＲ４と命名する。ＣＤＲおよびＦＲ領域の位置ならびに番号付けは、Ｋａ
ｂａｔら（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａ
ｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，
Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ（１９９１）
により定義されている。
ヒトイムノグロブリンは、重鎖のアイソタイプに応じてクラスおよびサブクラ
スに分けることができる。クラスには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよび
ＩｇＥが含まれ、それぞれ重鎖がガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）
、デルタ（δ）またはイプシロン（ε）型である。サブクラスには、ＩｇＧ１、
ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２が含まれ、それぞれ重
鎖がγ１、γ２、γ３、γ４、α１およびα２型である。選択したクラスまたは
サブクラスのヒトイムノグロブリン分子は、カッパ（κ）軽鎖またはラムダ（λ
）軽鎖のいずれかを含みうる。例えば、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗｏｎｓｉｅｗｉｃｚ， Ｍ．Ｊ．編、第
４５章、４１〜５０頁、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌ
ｐｈｉａ，ＰＡ（１９９１）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉ
ｏｎ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版、第４章、４
５〜６５頁、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒ
ｌａｎｄ，ＭＡ（１９８４）を参照されたい。
本明細書で使用する用語「イムノグロブリン」は、完全な抗体およびその生物
学的に機能的な断片を包含する。かかる生物学的に機能的な断片は、対応する完
全長の抗体の少なくとも１つの抗原結合機能（例えば、抗体１Ｄ９のＣＣＲ２に
対する特異性）を保持し、好ましくは、そのリガンド（例えば、ＨＩＶ、ＭＣＰ
−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４）の１つまたはそれ以上とＣＣＲ２
との相互作用を阻害する能力を保持する。使用しうる生物学的に機能的な抗体断
片の例には、単鎖抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2 断片など
のＣＣＲ２との結合能を有する断片が含まれる。かかる断片は酵素的切断により
、または組換え技術により作製し得る。例えば、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）
2 断片をそれぞれ生成するために、パパインによる切断またはペプシンによる切
断を用いることができる。抗体は、１つまたはそれ以上の停止コドンが天然の停
止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を使って種々の切断された形態で産生
することもできる。例えば、Ｆ（ａｂ’）2 断片の重鎖をコードするキメラ遺伝
子は重鎖のＣＨ1 ドメインとヒンジ領域とをコードするＤＮＡ配列を含むように
設計することができる。本明細書で使用するように、ヒト化イムノグロブリンの
重鎖または軽鎖の抗原結合性断片は、相補鎖と対になったとき抗原と結合する断
片を意味するものとする。すなわち、ヒト化軽鎖の抗原結合性断片は、可変領域
を含有する（例えば、ネズミ、キメラ、ヒト化）重鎖と対になったとき抗原と結
合し、ヒト化重鎖の抗原結合性断片は、可変領域を含有する（例えば、ネズミ、
キメラ、ヒト化）軽鎖と対になったとき抗原と結合する。
本明細書で使用される「ヒト化イムノグロブリン」という用語は、異なる起源
を持つイムノグロブリンの部分を含むイムノグロブリンであって少なくとも１つ
の部分がヒト起源のものをいう。例えば、ヒト化抗体は、必要な特異性を有する
非ヒト起源（例えばマウス）のイムノグロブリンに由来する部分とヒト起源のイ
ムノグロブリン配列に由来する部分とを含み得（例えば、キメライムノグロブリ
ン）、それらは互いに従来の技術（例えば合成）によって化学的に連結され、ま
たは遺伝子操作技術を使って連続したポリペプチドとして調製されうる（例えば
、キメラ抗体のタンパク質部分をコードするＤＮＡを発現させて連続したポリペ
プチド鎖を製造することができる）。本発明のヒト化イムノグロブリンの別の例
は、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲとヒト起源の軽鎖および／または重鎖由
来のフレームワーク領域とを含有する１つまたはそれ以上のイムノグロブリン鎖
を含有するイムノグロブリン（例えばフレームワークが変化したまたは変化して
いないＣＤＲ移植抗体）である。キメラまたはＣＤＲ移植単鎖抗体もヒト化イム
ノグロブリンという用語に包含される。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第
４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許第０，１２５，０２３ Ｂ
１号；Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓら、欧州特許第
０，１２０，６９４ Ｂ１号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、国際公開第８
６／０１５３３号パンフレット；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、欧州特許第
０，１９４，２７６ Ｂ１号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号
；Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００ Ｂ１号；Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．
Ａ．ら、欧州特許出願第０，５１９，５９６ Ａ１号を参照されたい。また、単
鎖抗体についてはＬａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｈｕｓｔ
ｏｎ，米国特許第５，４７６，７８６号；およびＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６（１９８８））も参照されたい。
例えば、ヒト化イムノグロブリンを、所望のヒト化鎖をコードする遺伝子（例
えば、ｃＤＮＡ）を調製するための合成および／または組換え核酸を用いて作製
することができる。例えば、ヒト化可変領域をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ
）配列は、ヒトまたはヒト化鎖をコードするＤＮＡ配列（例えば、予めヒト化さ
れた可変領域由来のＤＮＡ鋳型）を改変するためのＰＣＲ突然変異導入法を用い
て構築できる（例えばＫａｍｍａｎ，Ｍ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
，１７：５４０４（１９８９）；Ｓａｔｏ，Ｋ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ，５３：８５１−８５６（１９９３）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｂ．Ｌ．ら
，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９（９）：２４７１−２４７６（
１９９１）；ならびにＬｅｗｉｓ，Ａ．Ｐ．およびＪ．Ｓ． Ｃｒｏｗｅ，Ｇｅ
ｎｅ，１０１：２９７−３０２（１９９１）を参照されたい）。これらの方法ま
たは他の適切な方法を用い、バリアントもまた容易に作製することができる。一
態様では、クローン化された可変領域は、突然変異され得、所望の特異性を有す
るバリアントをコードする配列が選択され得る（例えばファージライブラリーか
ら；例えばＫｒｅｂｂｅｒら、米国特許第５，５１４，５４８号；１９９３年４
月１日に公開されたＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、国際公開第９３／０６２１３号パ
ンフレットを参照されたい）。
ヒト化イムノグロブリンの抗原結合領域（非ヒト部分）は、ＣＣＲ２に対する
結合特異性を有する非ヒト起源のイムノグロブリン（ドナーイムノグロブリンと
称する）に由来しうる。例えば、適切な抗原結合領域はネズミモノクローナル抗
体１Ｄ９に由来しうる。他の供給源には、齧歯類（例えば、マウス、ラット）、
ウサギ、ブタ、ヤギまたは非ヒト霊長類（例えば、サル）などの非ヒト起源から
得たＣＣＲ２特異的抗体が含まれる。さらにまた、１Ｄ９抗体と同じもしくは類
似のエピトープに結合する抗体などの他のポリクローナル抗体またはモノクロー
ナル抗体を作製しうる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９
５−４９７（１９７５）；Ｈａｒｌｏｗら、１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（ニューヨーク州コールドスプリン
グハーバー）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第２巻（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎ
ｔ ２７，１９９４年夏）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨー
ク州ニューヨーク）の第１１章（１９９１）を参照されたい）。
例えば、適当な哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギまたはヒツジ）に
おいて適切な免疫原に対する抗体を作製しうる。ＣＣＲ２を有する細胞、ＣＣＲ
２を含有する膜画分およびＣＣＲ２の免疫原性断片は、好適な免疫原の例である
。抗体産生細胞（例えば、リンパ球）は、例えば、免疫化した動物のリンパ節ま
たは脾臓から単離しうる。次いで、該細胞を適当な不死化細胞（例えば、骨髄腫
細胞株）と融合させ、それによりハイブリドーマを形成しうる。融合細胞を選択
培養技術を用いて単離しうる。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞を、適
当なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）により選択することができる。ＣＣＲ２に
対する結合特異性を有する非ヒト起源のイムノグロブリンはまた、抗体ライブラ
リー（例えば、非ヒトＦａｂ分子を含むファージライブラリー）から得ることが
できる。
一態様では、ヒト化イムノグロブリンの抗原結合領域は、非ヒト起源のＣＤＲ
を含有する。この態様では、ＣＣＲ２に対する結合特異性を有するヒト化イムノ
グロブリンは、非ヒト起源の少なくとも１つのＣＤＲを含有する。例えば、ＣＤ
Ｒは、ヒト化イムノグロブリンが非ヒト起源の１つまたはそれ以上のイムノグロ
ブリン由来の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３、および／また
は軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を実質的に含み、得られる
ヒト化イムノグロブリンがＣＣＲ２に対する結合特異性を有するように、非ヒト
起源のイムノグロブリンの軽鎖可変領域および重鎖可変領域から得られうる。好
ましくは、選択した鎖のすべての３つのＣＤＲが、ドナーの対応する鎖のＣＤＲ
と実質的に同じであり、より好ましくは、軽鎖および重鎖のすべての３つのＣＤ
Ｒが対応するドナー鎖のＣＤＲと実質的に同じである。一態様では、本発明は、
１Ｄ９抗体の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含有するヒト化軽鎖ま
たはその抗原結合性断片と、重鎖、例えばヒト重鎖とを含有してなる、ＣＣＲ２
に対する結合特異性を有するイムノグロブリンに関する。本発明はまた、１Ｄ９
抗体の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含有するヒト化重鎖またはそ
の抗原結合性断片と、軽鎖、例えばヒト軽鎖とを含有してなる、ＣＣＲ２に対す
る結合特異性を有するイムノグロブリンを含む。
本発明はまた、軽鎖および重鎖を含有する、ＣＣＲ２に対する結合特異性を有
するイムノグロブリンであって、該軽鎖が非ヒト起源の抗体（例えば、１Ｄ９）
の少なくとも１つのＣＤＲと、ヒト起源のフレームワーク領域および定常領域と
を有し（例えば、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号
：１５および配列番号：１０７）、該重鎖が非ヒト起源（例えば、１Ｄ９由来）
の可変領域とヒト起源の定常領域とを有する、イムノグロブリンに関する。本発
明はまた、これらのイムノグロブリンの抗原結合性断片を提供する。本発明はま
た、軽鎖および重鎖を含有する、ＣＣＲ２に対する結合特異性を有するイムノグ
ロブリンであって、該軽鎖が非ヒト起源（例えば、１Ｄ９由来）の可変鎖と、ヒ
ト起源の定常領域とを有し、該重鎖が非ヒト起源の抗体（例えば、１Ｄ９）の少
なくとも１つのＣＤＲと、ヒト起源のフレームワーク領域および定常領域とを有
する（例えば、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９および配列番
号：２０）イムノグロブリンに関する。本発明はまた、これらのイムノグロブリ
ンの抗原結合性断片を提供する。
ヒト起源であるヒト化イムノグロブリンまたはイムノグロブリン鎖の部分（ヒ
ト部分）は、任意の適切なヒトイムノグロブリンまたはイムノグロブリン鎖に由
来しうる。例えば、ヒト定常領域またはその部分は、存在する場合には、対立遺
伝子バリアントを含む、ヒト抗体のκまたはλ軽鎖、および／またはγ（例えば
、γ１、γ２、γ３、γ４）、μ、α（例えば、α１、α２）、δまたはε重鎖
に由来しうる。エフェクター機能を調整（ｔａｉｌｏｒ）するために、特定の定
常領域（例えば、ＩｇＧ１）、そのバリアントまたは部分を選択することができ
る。例えば、Ｆｃレセプターへの結合および／または補体と結合する能力を最小
にするため、変異させた定常領域（バリアント）を融合タンパク質に組み込むこ
とができる（例えば、実施例３を参照されたい；また、Ｗｉｎｔｅｒら、英国特
許第２，２０９，７５７Ｂ号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、国際公開第８９／０７１４
２号パンフレット；Ｍｏｒｇａｎら、国際公開第９４／２９３５１号パンフレッ
ト，１９９４年１２月２２日を参照されたい）。
ヒトフレームワーク領域（例えば、軽鎖の可変領域の）は、存在する場合には
、好ましくは、抗原結合領域ドナーの相同または同等領域（例えば、軽鎖の可変
領域）との配列類似性を有するヒト抗体の可変領域に由来する。ヒト化イムノグ
ロブリンのヒト起源の部分のためのフレームワーク領域の他の供給源には、ヒト
可変コンセンサス配列（例えば、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ、Ｃ．Ａ．ら、Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：７７３−７８３（１９９１）；１
９９４年３月３日に公開されたＣａｒｔｅｒら、国際公開第９４／０４６７９号
パンフレットを参照されたい）が含まれる。例えば、非ヒト部分を得るために使
用される抗体または可変領域の配列は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏ
ｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ
、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕ
ｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ
Ｏｆｆｉｃｅ（１９９１）に記載のようなヒト配列と比較しうる。特に好まし
い態様では、ヒト化イムノグロブリン鎖のフレームワーク領域は、非ヒトドナー
（例えば、ネズミ抗体１Ｄ９）の可変領域と、少なくとも約６０％の全配列同一
性、好ましくは少なくとも約７０％の全配列同一性、より好ましくは少なくとも
約８５％の全配列同一性を有するヒト可変領域に由来する。ヒト部分はまた、非
ヒトドナーの同等部分（例えば、ＦＲ）と比較すると、使用している特定部分（
例えば、ＦＲ）内で、少なくとも約６５％の配列同一性、好ましくは少なくとも
約７０％の配列同一性を有するヒト抗体に由来しうる。
一態様では、ヒト化イムノグロブリンは、ヒト起源の抗体の１つまたはそれ以
上の鎖に由来する少なくとも１つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含有する。し
たがって、ＦＲは、ヒト起源の１つまたはそれ以上の抗体に由来するＦＲ１およ
び／またはＦＲ２および／またはＦＲ３および／またはＦＲ４を包含しうる。好
ましくは、選択したヒト化鎖のヒト部分は、ヒト起源の可変領域由来（例えば、
ヒトイムノグロブリン鎖由来、ヒトコンセンサス配列由来）のＦＲ１、ＦＲ２、
ＦＲ３およびＦＲ４を含む。
本発明における使用のための非ヒト起源およびヒト起源のイムノグロブリン部
分は、それらが由来するイムノグロブリンもしくはイムノグロブリン部分と同じ
配列、またはそのバリアントと同じ配列を有する。かかるバリアントには、１つ
またはそれ以上の残基の付加、欠失または置換により異なる変異体が含まれる。
上述のように、非ヒト起源であるＣＤＲは、非ヒトドナーと実質的に同じ、好ま
しくは非ヒトドナーのＣＤＲと同一である。実施例２に記載のように、ヒト起源
のフレームワーク領域の残基を、ドナーの対応する位置由来の残基と置換する変
更などの、フレームワーク領域における変更を行なうことができる。フレームワ
ーク領域において、１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失、挿入および置換を含
む、１つまたはそれ以上の変異を行なうことができる。いくつかのこのような置
換を、実施例２のヒト化１Ｄ９抗体の設計において記載している。選択したヒト
化抗体または鎖について、本明細書に記載のようにしてフレームワーク変異を設
計することができる。好ましくは、ヒト化イムノグロブリンは、非ヒトドナーと
同様またはより良好な親和性でＣＣＲ２と結合しうる。バリアントは、非ヒトド
ナーまたはアクセプターヒト鎖の変異誘発を含む種々の適切な方法により作製す
ることができる。
本発明のヒト化イムノグロブリンは、ヒトＣＣＲ２に対する結合特異性を有す
る。好ましい態様では、本発明のヒト化イムノグロブリンは、結合機能（例えば
、ＣＣＲ２に対する特異性を有する、同じまたは類似のエピトープ特異性を有す
る）および／または阻害機能（例えば、ＣＣＲ２を有する細胞のそのリガンド（
例えば、ケモカイン）への結合を阻害する能力などのインビトロおよび／または
インビボでＣＣＲ２依存性機能を阻害する能力）などのネズミ抗体１Ｄ９の少な
くとも１つの機能的特徴を有する。したがって、好ましいヒト化イムノグロブリ
ンは、ネズミ抗体１Ｄ９の結合特異性、ネズミ抗体１Ｄ９のエピトープ特異性（
例えば、ＣＣＲ２（例えばＣＣＲ２を有する細胞上）に対する結合に関してネズ
ミ１Ｄ９、キメラ１Ｄ９抗体またはヒト化１Ｄ９と競合しうる）および／または
ネズミ抗体１Ｄ９の阻害機能を有し得る。
ＣＣＲ２に対する結合特異性を有するヒト化免疫の結合機能は、標準的な免疫
学的方法、例えば、ヒト化イムノグロブリンとＣＣＲ２（例えば、ＣＣＲ２を含
有する膜画分、ＣＣＲ２を有する細胞上、ＣＣＲ２を発現する、ＣＣＲ２をコー
ドする核酸を含むヒト細胞株または組換え宿主細胞）との間での複合体の形成を
モニターするアッセイの使用により検出することができる。結合アッセイおよび
／または接着アッセイあるいは他の適切な方法もまた、必要とされる特異性によ
り（例えば、ライブラリーからの）ヒト化イムノグロブリンの同定および／また
は単離のための手順（例えば、ＣＣＲ２を有する細胞とそのリガンド（例えば、
ＨＩＶ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４）との接着をモニタ
ーするアッセイ）または他の適切な方法）において使用することができる。
本発明における使用のための非ヒト起源またはヒト起源のイムノグロブリン部
分には、軽鎖、重鎖ならびに軽鎖および重鎖の部分が含まれる。これらのイムノ
グロブリン部分は、（例えば、部分のデ・ノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成により）
イムノグロブリンから得ることができるか、もしくはこれらから誘導することが
でき、または所望の性質（例えば、ＣＣＲ２への結合、配列類似性）を有するイ
ムノグロブリンまたはその鎖をコードする核酸分子を作製し、発現させることが
できる。ヒトおよび非ヒト起源の所望の部分（例えば、抗原結合領域、ＣＤＲ、
ＦＲ、Ｃ領域）を含有するヒト化イムノグロブリンは、所望のヒト化鎖をコード
する遺伝子（例えば、ｃＤＮＡ）を調製するための合成および／または組換え核
酸を用いて作製することができる。鎖の部分を調製するために、１つまたはそれ
以上の停止コドンを所望の位置に導入することができる。例えば、新たに設計し
たヒト化可変領域をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を、既存のＤＮＡ配
列を改変するためのＰＣＲ変異導入法（例えば、Ｋａｍｍａｎ，Ｍ．ら、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：５４０４（１９８９）を参照されたい）を用い
て構築することができる。新しいＣＤＲをコードするＰＣＲプライマーを、同じ
または非常に類似したヒト可変領域に基づく予めヒト化した可変領域（Ｓａｔｏ
，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：８５１−８５６（１９９３
））のＤＮＡ鋳型にハイブリダイズさせることができる。類似のＤＮＡ配列が鋳
型としての使用に利用可能でない場合、可変領域の配列をコードする配列を含有
する核酸を合成オリゴヌクレオチドから構築することができる（例えば、Ｋｏｌ
ｂｉｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８：９７１−
９８０（１９９３）を参照されたい）。シグナルペプチドをコードする配列もま
た、該核酸と一体化させることができる（例えば、合成時、ベクター内への挿入
時）。天然のシグナル配列が利用可能でない場合、別の抗体由来のシグナルペプ
チド配列を使用することができる（例えば、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．
Ａ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：７７３−７８３（１９９
１）を参照されたい）。これらの方法、本明細書に記載の方法または他の適切な
方法を用いて、バリアントを容易に作製することができる。一態様では、クロー
ン化された可変領域は突然変異され得、所望の特異性を有するバリアントをコー
ドする配列を選択しうる（例えば、ファージライブラリーから；例えばＫｒｅｂ
ｂｅｒら；米国特許第５，５１４，５４８号明細書；１９９３年４月１日に公開
されたＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、国際公開第９３／０６２１３号パンフレットを
参照されたい）。
本発明は、配列番号：９の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも機能的な
部分を含有するアミノ酸配列を含有するヒト化イムノグロブリン軽鎖またはその
抗原結合性断片に関する。好ましい態様では、該アミノ酸配列は、配列番号：９
のＣＤＲの少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つを含有する。
本発明はまた、配列番号：１０に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも
機能的な部分を含有するアミノ酸配列を含有するヒト化イムノグロブリン重鎖ま
たはその抗原結合性断片に関する。好ましい態様では、該アミノ酸配列は、配列
番号：１０のＣＤＲの少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つを
含有する。なお、本明細書に記載のすべてのネズミ配列はＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌ
ｕｓ由来である。
本発明の一実施形態によれば、ＣＣＲ２に対する結合特異性を有するヒト化イ
ムノグロブリン軽鎖またはその抗原結合性断片は、配列番号：１２、配列番号：
１３、配列番号：１４、配列番号：１５および配列番号：１０７からなる群より
選ばれるアミノ酸配列を含有しうる。本発明の別の態様によれば、ＣＣＲ２に対
する結合特異性を有するヒト化イムノグロブリン重鎖またはその抗原結合性断片
は、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９および配列番号：２０か
らなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有しうる。特定の態様では、本発明のヒ
ト化イムノグロブリンは、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、
配列番号：１５および配列番号：１０７からなる群より選ばれるアミノ酸配列を
含有する、ＣＣＲ２に対する結合特異性を有する軽鎖またはその抗原結合性断片
、および配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９および配列番号：２
０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有する、ＣＣＲ２に対する結合特異
性を有する重鎖またはその抗原結合性断片の両方を含有しうる。
一態様では、本発明は、配列番号：１２のアミノ酸配列を含有する軽鎖と相補
的重鎖とを含有する、ＣＣＲ２に対する結合特異性を有するヒト化イムノグロブ
リン、またはＣＣＲ２に対する結合特異性を有する該ヒト化イムノグロブリンの
抗原結合性断片に関する。別の態様では、本発明は、配列番号：１７のアミノ酸
配列を含有する重鎖と相補的軽鎖とを含有する、ＣＣＲ２に対する結合特異性を
有するヒト化イムノグロブリン、またはＣＣＲ２に対する結合特異性を有する該
ヒト化イムノグロブリンの抗原結合性断片に関する。相補的な軽鎖または重鎖は
、それぞれ選択された重鎖または軽鎖と会合し、該相補的な重鎖および軽鎖を含
有するイムノグロブリンにＣＣＲ２に対する結合特異性を有する能力をもたらす
ものである。好ましい態様では、本発明は、配列番号：１２のアミノ酸配列を含
有する軽鎖と、配列番号：１７のアミノ酸配列を含有する重鎖とを含有する、Ｃ
ＣＲ２に対する結合特異性を有するヒト化イムノグロブリン、またはＣＣＲ２に
対する結合特異性を有する該ヒト化イムノグロブリンの抗原結合性断片に関する
。
代替的な態様では、本発明のヒト化イムノグロブリンは、配列番号：１２のア
ミノ酸配列を含有する軽鎖、および配列番号：１８、配列番号：１９および配列
番号：２０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有する重鎖の両方、または
ＣＣＲ２に対する結合特異性を有する該イムノグロブリンの抗原結合性断片を含
有する。さらなる態様では、本発明のヒト化イムノグロブリンは、配列番号：１
３のアミノ酸配列を含有する軽鎖、および配列番号：１７、配列番号：１８、配
列番号：１９および配列番号：２０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有
する重鎖の両方、またはＣＣＲ２に対する結合特異性を有する該イムノグロブリ
ンの抗原結合性断片を含有する。さらなる態様では、本発明のヒト化イムノグロ
ブリンは、配列番号：１４のアミノ酸配列を含有する軽鎖、および配列番号：１
７、配列番号：１８、配列番号：１９および配列番号：２０からなる群より選ば
れるアミノ酸配列を含有する重鎖の両方、またはＣＣＲ２に対する結合特異性を
有する該イムノグロブリンの抗原結合性断片を含有する。別の態様では、本発明
のヒト化イムノグロブリンは、配列番号：１５のアミノ酸配列を含有する軽鎖、
および配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９および配列番号：２０
からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有する重鎖の両方、またはＣＣＲ２に
対する結合特異性を有する該イムノグロブリンの抗原結合性断片を含有する。代
替的な態様では、本発明のヒト化イムノグロブリンは、配列番号：１０７のアミ
ノ酸配列を含有する軽鎖、および配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：
１９および配列番号：２０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有する重鎖
の両方、またはＣＣＲ２に対する結合特異性を有する該イムノグロブリンの抗原
結合性断片を含有する。
別の態様では、本発明のヒト化イムノグロブリンは、配列番号：１３、配列番
号：１４、配列番号：１５および配列番号：１０７からなる群より選ばれるアミ
ノ酸配列を含有する軽鎖、および配列番号：１７のアミノ酸配列を含有する重鎖
の両方、またはＣＣＲ２に対する結合特異性を有する該イムノグロブリンの抗原
結合性断片を含有する。代替的な態様では、本発明のヒト化イムノグロブリンは
、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５および配
列番号：１０７からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有する軽鎖、および配
列番号：１８のアミノ酸配列を含有する重鎖の両方、またはＣＣＲ２に対する結
合特異性を有する該イムノグロブリンの抗原結合性断片を含有する。さらなる態
様では、本発明のヒト化イムノグロブリンは、配列番号：１２、配列番号：１３
、配列番号：１４、配列番号：１５および配列番号：１０７からなる群より選ば
れるアミノ酸配列を含有する軽鎖、および配列番号：１９のアミノ酸配列を含有
する重鎖の両方、またはＣＣＲ２に対する結合特異性を有する該イムノグロブリ
ンの抗原結合性断片を含有する。さらなる態様では、本発明のヒト化イムノグロ
ブリンは、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５
および配列番号：１０７からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有する軽鎖、
および配列番号：２０のアミノ酸配列を含有する重鎖の両方、またはＣＣＲ２に
対する結合特異性を有する該イムノグロブリンの抗原結合性断片を含有する。
一態様では、ＣＣＲ２に対する結合特異性を有するヒト化イムノグロブリン軽
鎖またはその抗原結合性断片は、配列番号：９８を含有する核酸分子によりコー
ドされうる。別の態様では、ＣＣＲ２に対する結合特異性を有するヒト化イムノ
グロブリン重鎖またはその抗原結合性断片は、配列番号：９７を含有する核酸分
子によりコードされうる。
本発明はまた、非ヒト起源の軽鎖可変領域とヒトの定常領域（例えば、軽鎖の
定常領域）とを含有する、ＣＣＲ２に対する結合特異性を有するキメライムノグ
ロブリンまたはその抗原結合性断片に関する。本発明はさらに、非ヒト起源の重
鎖可変領域とヒトの定常領域（例えば、重鎖定常領域）とを含有する、ＣＣＲ２
に対する結合特異性を有するキメライムノグロブリンまたはその抗原結合性断片
に関する。別の態様では、ＣＣＲ２に対する結合特異性を有するキメライムノグ
ロブリンまたはその抗原結合性断片は、非ヒト起源の軽鎖可変鎖領域と、非ヒト
起源の重鎖可変領域とを含有し、さらにヒトの定常領域（例えば、ヒトの軽鎖定
常領域および／またはヒトの重鎖定常領域）を含有する。
核酸および構築物
本発明はまた、本発明のヒト化イムノグロブリンまたはヒト化イムノグロブリ
ンの軽鎖または重鎖をコードする核酸配列を含有する、単離されたおよび／また
は組換え核酸分子（例えば、本質的に純粋なものを含む）に関する。
本明細書でいう「単離された」核酸分子は、その起源（例えば、細胞内、また
はライブラリーなどの核酸の混合物中に存在するなど）である供給源のゲノムＤ
ＮＡまたは細胞性ＲＮＡの核酸から分離された核酸分子であり、本質的に純粋な
核酸分子、化学的合成により作製された核酸分子、生物学的方法および化学的方
法の組み合せにより作製された核酸分子、ならびに単離された組換え核酸分子を
含む、本明細書に記載の方法または他の適切な方法により得られる核酸分子を包
含する（例えば、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｂ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．，１９（９）：２４７１−２４７６（１９９１）；Ｌｅｗｉｓ，Ａ
．Ｐ．およびＪ．Ｓ．Ｃｒｏｗｅ，Ｇｅｎｅ，１０１：２９７−３０２（１９９
１）を参照されたい）。
本明細書でいう「組換え」核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およ
び／または制限酵素を用いたベクターへのクローニングなどの、人工的な組換え
方法による手順により生成する核酸分子を含む、組換えＤＮＡ方法論により作製
された核酸分子である。「組換え」核酸分子は、細胞の自然な機構を介して起こ
る組換え事象により生じるものもあるが、所望の組換え事象を許容し、それが起
こりうるように設計された核酸分子の細胞への導入後に選択される。
本発明はまた、より具体的には、ヒト化１Ｄ９イムノグロブリン（すなわち、
非ヒト部分がネズミモノクローナル抗体１Ｄ９に由来する本発明のヒト化イムノ
グロブリン）またはその鎖をコードする塩基配列を含有する単離されたおよび／
または組換え核酸分子に関する。一態様では、軽鎖が、１Ｄ９抗体の軽鎖に由来
する３つの相補性決定領域を含有し、重鎖が、１Ｄ９抗体の重鎖に由来する３つ
の相補性決定領域を含有する。かかる核酸分子は、例えば、（ａ）ヒト化１Ｄ９
イムノグロブリンの重鎖可変領域（例えば、Ｆｉｇｕｒｅ ８および２１の重鎖
可変領域）のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードする配列を含有する
核酸分子（例えば、配列番号：９６のヌクレオチド５８〜４１１）；（ｂ）ヒト
化１Ｄ９イムノグロブリンの軽鎖可変領域（例えば、Ｆｉｇｕｒｅ ７および２
２の軽鎖可変領域）のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードする配列を
含有する核酸分子（例えば、配列番号：９５のヌクレオチド５２〜３９０）；（
ｃ）ヒト化１Ｄ９イムノグロブリンの軽鎖または重鎖の可変領域の少なくとも機
能的な部分（例えば、該鎖を含有するヒト化イムノグロブリンが抗原に結合する
のに充分な部分）をコードする配列を含有する核酸分子を包含する。遺伝コード
の縮重のため、選択したポリペプチドをコードする種々の核酸を作製しうる。一
態様では、該核酸は、二本鎖または一本鎖のポリヌクレオチドを含む、Ｆｉｇｕ
ｒｅ ２１に示す可変領域の塩基配列を含有するか、もしくは実質的に含有する
か、またはＦｉｇｕｒｅ ２２に示す可変領域の塩基配列を含有するか、もしく
は実質的に含有する。（それぞれのＦｉｇｕｒｅにおいて、可変領域よりも大き
なポリペプチドを示している（すなわち、シグナルペプチドコード配列または定
常領域コード配列の部分を含む）場合があるが、特定のＦｏｇｕｒｅの可変領域
に対する言及は、示された配列の可変領域の部分を含むことを意図する。）。こ
れらの基準を満たす単離されたおよび／または組換え核酸分子は、ヒト化１Ｄ９
抗体の配列と同一の配列をコードする核酸分子または上述のようなそのバリアン
トを含みうる。
本発明の核酸分子は、ＣＣＲ２に対する結合特異性を有するヒト化イムノグロ
ブリンの作製に使用することができる。例えば、本発明のヒト化イムノグロブリ
ンをコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ）を、配列のさらなる操作のために、
または、コードされたポリペプチドを適切な宿主細胞において産生させるために
、適切な構築物（例えば、ベクター）に組み込むことができる。
ターゲティング分子
本発明はまた、ＣＣＲ２発現細胞と標的細胞との相互作用を実現させることが
できるターゲティング分子に関する。ターゲティング分子は、哺乳動物のＣＣＲ
２に結合しうる第１結合部分と、標的細胞の表面上に発現される分子に結合しう
る第２結合部分とを含む。好ましい標的細胞には、腫瘍細胞およびウイルス感染
細胞が含まれる。腫瘍細胞上で高レベルで発現されたり、または腫瘍細胞特有に
発現される様々な分子（例えば、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ジシア
ロガングリオシド(disialoganglioside)Ｇ３、癌胎児性抗原、ＣＤ３０などの腫
瘍抗原）および／またはウイルス感染細胞（例えば、インフルエンザウイルス血
球凝集素、エプスタイン−バーウイルスＬＭＰ−１、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タ
ンパク質、ＨＩＶ ｇｐ １６０、ＨＩＶ ｇｐ １２０などのウイルス抗原）
が当該技術分野において公知である。ターゲティング分子は、所望の標的細胞上
に発現される分子と結合する任意の適切な結合第２部分を含みうる（例えば、Ｒ
ｉｎｇ、米国特許第５，９４８，６４７号明細書（その全教示は参照により本明
細書に取り込まれる）を参照されたい）。適切な結合部分には、例えば、タンパ
ク質およびペプチド（翻訳後修飾された形態、例えば、グリコシル化、リン酸化
、脂質化を含む）、糖類、脂質、ペプチド擬似物、小さな有機分子、核酸、およ
び哺乳動物のＣＣＲ２または標的細胞の表面上に発現される分子に結合するその
他の剤が含まれる。好適な結合部分は、本明細書に記載の結合アッセイなどの、
任意の適切な方法を用いて同定することができる。
好ましい態様では、第１の結合部分は、たとえば、哺乳動物ＣＣＲ２またはそ
の抗原結合性断片〔たとえば、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’2 〕に結
合する、本発明のヒト化イムノグロブリンでありうる。第２の結合部分は、たと
えば、標的細胞上に発現された分子またはその抗原結合性断片に結合する、抗体
（たとえば、第２のヒト化イムノグロブリン）またはその抗原結合性断片であり
うる。標的化分子がヒト化抗ＣＣＲ２イムノグロブリンまたはその抗原結合性断
片である第１の結合部分を含む場合、ヒト化抗ＣＣＲ２イムノグロブリンはＣＣ
Ｒ２へのリガンドの結合を阻害しないのが好ましい。
第１の結合部分は、種々の適切な連結を介して第２の結合部分に直接的にまた
は間接的に結合されうる。たとえば、第１の結合部分および第２の結合部分が共
にタンパク質またはペプチドである場合、当該部分は連続したポリペプチド（す
なわち、融合タンパク質）の一部でありうる。標的化分子が融合タンパク質であ
る場合、第１および第２の結合部分は任意の適切な立体配置で当該ポリペプチド
上に配置されうる。第１および第２の結合部分は（すなわち、１またはそれ以上
の）ペプチドリンカーを介して間接的に、またはペプチド結合を介して互いに直
接的に結合されうる。
結合分子が連続したポリペプチドの一部でない場合、それらは、第１の部分上
の官能基（またはその活性化誘導体）と第２の部分上の第２の官能基（またはそ
の活性化誘導体）との反応により形成される化学結合により直接的に結合されう
る。たとえば、２つのチオールは反応してジスルフィド結合を形成しえ、アミン
はカルボン酸またはハロゲン化アシルと反応してアミドを形成しうる。使用され
うる種々の他の適切な反応は当該分野において既知である〔たとえば、Hermanso
n, G. T.,Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)
参照〕。結合部分は適切なリンカー（たとえば、ペプチドリンカー）を介して間
接的に結合されうる。一般に、リンカーは、反応して第１の結合部分および／ま
たは第２の結合部分と結合を形成しうる２つの反応性基を含む。２つの異なる反
応性基を含むリンカー（たとえば、ヘテロ二官能性リンカー）を使用して、第１
の結合部分を第２の結合部分に選択的に結合することができる。タンパク質、核
酸、ペプチド、ビタミン、糖、脂質、小有機分子および他の適切な薬剤の間の結
合を形成するのに適切な多くのリンカーは既知である〔たとえば、米国特許第5,
856,571号、第5,880,270号；Hermanson,G. T., Bioconjugate Techniques, Aca
demic Press:San Diego, CA (1996)参照〕。
標的化分子の結合部分の個々の活性（たとえば、結合活性、化学誘因活性）は
、別個に存在する分子としての結合部分の活性と顕著に異なっていないのが好ま
しい。たとえば、第１の結合部分が、ＣＣＲ２に結合する、ヒト化イムノグロブ
リンまたは抗原結合性断片である場合、約１０００ファクター内の、好ましくは
１００ファクター内の、より好ましくは１０ファクター内の親和性、または遊離
の抗体もしくは抗原結合性断片の親和性と実質的に同じ親和性により、標的化分
子はＣＣＲ２に結合しうる。これらの好ましい特性を有する標的分子は任意の適
切な方法により調製されうる。次いで、得られた標的化分子を結合性（たとえば
、ＥＬＩＳＡにより）について、および化学誘因活性についてアッセイしうる。
１つの態様では、標的化分子は、哺乳動物ＣＣＲ２および標的細胞上に発現さ
れた分子（たとえば、腫瘍抗原、ウイルス抗原）に特異性を有する、二重特異性
（bispecific）ヒト化抗体またはその二重特異性抗原結合性断片〔たとえば、Ｆ
（ａｂ’）2 〕である。二重特異性抗体はトリオーマ（trioma）およびハイブリ
ッドハイブリドーマにより分泌されうる。トリオーマおよびハイブリッドハイブ
リドーマの上清を適切なアッセイ（たとえば、ＥＬＩＳＡ）を用いて二重特異性
抗体についてアッセイしえ、二重特異性抗体を従来の方法を用いて精製しうる。
次いで、これらの抗体は本明細書に記載の方法によりヒト化されうる。このよう
に、本発明は、ＣＣＲ２および標的細胞上に発現された抗原に結合特異性を有す
るヒト化二重特異性抗体、または該二重特異性抗体の二価抗原結合性断片である
標的化分子を提供する。本発明はまた、ＣＣＲ２および標的細胞上に発現された
抗原に結合特異性を有するヒト化二重特異性抗体、または該二重特異性抗体の二
価抗原結合性断片である標的化分子の有効量を患者に投与することを含む、患者
においてＣＣＲ２を有する細胞と標的細胞との相互作用を可能にする方法に関す
る。
ＣＣＲ２に特異性を有するヒト化イムノグロブリンの生産方法
本発明の別の側面は、ＣＣＲ２に結合特異性を有するヒト化イムノグロブリン
の生産方法に関する。たとえば、ヒト化イムノグロブリンは、たとえば、適切な
宿主細胞内でＣＣＲ２に結合特異性を有するヒト化イムノグロブリンをコードす
る１またはそれ以上の組換え核酸の発現により得ることができる。
ＣＣＲ２に結合特異性を有するヒト化イムノグロブリンの発現に適する構築物
または発現ベクターも提供する。該構築物は適切な宿主細胞に導入され得、本発
明のヒト化イムノグロブリンを発現する細胞が生産され、培養で維持されうる。
適切な宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌および または他の適切な細菌などの
細菌細胞を含む原核生物、あるいは真菌または酵母細胞〔たとえば、ピキア パ
ストリス（Pichiapastoris）、アスペルギルス（Aspergillus）種、サッカロミ
セス セレビシェ（Saccharomycescerevisiae）、シゾサッカロミセス ポンベ
（Schizosaccharomycespombe）、ニューロスポラ クラッサ（Neurospora cras
sa）〕などの真核生物、あるいは他の下等真核細胞、ならびに昆虫〔たとえば、
Ｓｆ９昆虫細胞（国際公開第94/26087号パンフレット、O'Connor、1994年11月24
日公開）〕または哺乳動物〔たとえば、ＣＯＳ−１（ATCC登録番号CRL-1650）お
よびＣＯＳ−７（ATCC登録番号CRL-1651）などのＣＯＳ細胞、ＣＨＯ（たとえば
、ATCC登録番号CRL-9096）、２９３（ATCC登録番号CRL-1573）、ＨｅＬａ（ATCC
登録番号CCL-2）、ＣＶ１（ATCC登録番号CCL-70）、ＷＯＰ〔Daileyら、J.Viro
l. 54:739-749(1985)〕、３Ｔ３、２９３Ｔ〔Pearら、Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A.,90:8392-8396 (1993)〕、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、ＨｕＴ７８細胞な
ど〔たとえば、Ausubel,F. M.ら編、Current Protocols in Molecular Biology
, GreenPublishing Associates and John Wiley & Sons Inc., (1993)参照〕由
来のものなどの高等真核生物の細胞でありうる。
ＣＣＲ２に結合特異性を有するヒト化イムノグロブリンを産生する宿主細胞は
以下のようにして生産されうる。たとえば、所望のヒト化イムノグロブリンのコ
ード配列の全部または一部をコードする核酸を核酸ベクター、たとえば、発現用
のプラスミド、ウイルスまたは他の適切なレプリコンなどのＤＮＡベクターに挿
入しうる。種々のベクターを入手可能である。当該ベクターとしては、単一コピ
ーまたは多コピーで維持されるベクターまたは宿主細胞の染色体に組み込まれる
ベクターが挙げられる。
適切な発現ベクターは多くの成分を含みうる。当該成分としては、それらに限
定されるものではないが以下の１またはそれ以上のものが挙げられる：複製起点
；選択マーカー遺伝子；転写制御エレメント（たとえば、プロモーター、エンハ
ンサー、ターミネーター）などの１またはそれ以上の発現制御エレメント、およ
び／または１またはそれ以上の翻訳シグナル；膜標的化または分泌のためのシグ
ナル配列またはリーダー配列。構築物において、シグナル配列はベクターまたは
他の供給源より提供されうる。たとえば、イムノグロブリンの転写および／また
は翻訳シグナルを用いて発現に向けうる。
プロモーターは適切な宿主細胞における発現のために提供されうる。プロモー
ターは構成的または誘導性でありうる。たとえば、プロモーターを、コードされ
たポリペプチドの発現が行われるように、ヒト化イムノグロブリンまたはイムノ
グロブリン鎖をコードする核酸に作動可能に連結しうる。原核生物宿主用の種々
の適切なプロモーター（たとえば、大腸菌用のｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロ
モーター）および真核生物宿主用の種々の適切なプロモーター（たとえば、酵母
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）、ＳＶ４０、ＣＭＶ）が入手可能であ
る。
さらに、発現ベクターは、通常、ベクターを保持する宿主細胞の選択のための
選択マーカーを含み、また、複製可能な発現ベクターの場合、起点もしくは複製
を含む。抗生作用もしくは薬物耐性を付与する産物をコードする遺伝子が一般に
選択マーカーであり、当該遺伝子は、原核細胞〔たとえば、β−ラクタマーゼ遺
伝子（アンピシリン耐性）、テトラサイクリン耐性のためのＴｅｔ遺伝子〕およ
び真核細胞〔たとえば、ネオマイシン〔Ｇ４１８もしくはゲネチシン（genetici
n）〕、ｇｐｔ（ミコフェノール酸）、アンピシリン、またはハイグロマイシン
耐性遺伝子〕で使用されうる。ジヒドロ葉酸レダクターゼマーカー遺伝子は種々
の宿主でメトトレキサートによる選択を可能にする。宿主の栄養要求性マーカー
の遺伝子産物をコードする遺伝子（たとえば、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）
はしばしば酵母で選択マーカーとして使用される。ウイルス（たとえば、バキュ
ロウイルス）ベクターまたはファージベクター、およびレトロウイルスベクター
などの、宿主のゲノムに組み込み可能なベクターの使用も考えられる。１つの態
様では、該ベクターはｐＬＫＴＯＫ３８である。本発明はまた、これらの発現ベ
クターを保持する細胞に関する。
ヒト化イムノグロブリン軽鎖をコードする融合遺伝子を含む発現ベクター。該
遺伝子は、ＣＣＲ２に結合特異性を有する非ヒト抗体の軽鎖に由来するＣＤＲお
よびヒト起源の軽鎖に由来するフレームワーク領域をコードする塩基配列を含む
。
このように、本発明は、ヒト化イムノグロブリン軽鎖をコードする遺伝子を含
む発現ベクターを含む。ここで、該遺伝子は、ＣＣＲ２に結合特異性を有する非
ヒト抗体の軽鎖に由来するＣＤＲおよびヒト起源の軽鎖に由来するフレームワー
ク領域をコードする塩基配列を含む。本発明はまた、ヒト化イムノグロブリン重
鎖をコードする遺伝子を含む発現ベクターに関する。ここで、該遺伝子は、ＣＣ
Ｒ２に結合特異性を有する非ヒト抗体の重鎖に由来するＣＤＲおよびヒト起源の
重鎖に由来するフレームワーク領域をコードする塩基配列を含む。オン（on）態
様では、非ヒト抗体はネズミ抗体１Ｄ９である。本発明はまた、本発明の発現ベ
クターを含む宿主細胞を含む。本発明はまた、ネズミモノクローナル抗体１Ｄ９
に由来する抗原結合領域をコードする第１の核酸配列；およびヒト起源のイムノ
グロブリンの定常領域の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列を含む、ヒ
ト化イムノグロブリン軽鎖または重鎖をコードする単離遺伝子または組換え遺伝
子に関する。
本発明はまた、ヒト化イムノグロブリン軽鎖もしくはその断片をコードする第
１の組換え核酸分子およびヒト化イムノグロブリン重鎖もしくはその断片をコー
ドする第２の組換え核酸分子を含む（たとえば、ＣＣＲ２に特異性を有するヒト
化イムノグロブリンもしくはその抗原結合性断片を発現する）宿主細胞に関する
。ここで、前記第１の核酸分子はネズミ抗体１Ｄ９の軽鎖に由来するＣＤＲおよ
びヒト起源の軽鎖に由来するフレームワーク領域をコードする塩基配列を含み、
また、前記第２の核酸分子はネズミ抗体１Ｄ９の重鎖に由来するＣＤＲおよびヒ
ト起源の重鎖に由来するフレームワーク領域をコードする塩基配列を含む。本発
明はまた、ヒト化イムノグロブリンの発現に好適な条件下で本発明の宿主細胞を
維持し、それにより、ヒト化イムノグロブリン鎖が発現され、ＣＣＲ２に特異性
を有するヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片が生産される工程を
含む、ヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片の調製方法を含む。該
方法はさらに、ヒト化イムノグロブリンまたはその断片の単離工程を含みうる。
たとえば、ＣＣＲ２に結合特異性を有するヒト化イムノグロブリンの重鎖およ
び軽鎖をコードする核酸分子（すなわち、１またはそれ以上の核酸分子）、また
は１または複数のかかる核酸分子を含む構築物（すなわち、１またはそれ以上の
構築物）を、選択された宿主細胞に適する方法（たとえば、形質転換、トランス
フェクション、エレクトロポレーション、感染）により、（たとえば、ベクター
中、細胞でのプロセスにより形成された構築物中、宿主細胞ゲノムに組み込まれ
て）１または複数の核酸分子が１またはそれ以上の発現制御エレメントに作動可
能に連結されるように適切な宿主細胞に導入しうる。宿主細胞は発現に適する条
件下（たとえば、誘導物質、好適な塩を添加した適切な培地、成長因子、抗生物
質、栄養補助剤などの存在下）で維持されえ、それにより、１または複数のコー
ドされたポリペプチドが生産される。所望により、コードされたタンパク質（た
とえば、ヒト化１Ｄ９抗体）を、たとえば、宿主細胞、培地、乳汁から単離しう
る。この工程はトランスジェニック動物の宿主細胞での発現を包含する（たとえ
ば、国際公開第92/03918号ハ゜ンフレット、GenPharmInternational、1992年 3月19日
公開参照）。
融合タンパク質を生産しえ、該融合タンパク質では、Ｎ末端の位置で、Ｃ末端
の位置で、もしくは該融合タンパク質の内部で、ヒト化イムノグロブリンまたは
イムノグロブリン鎖が非イムノグロブリン部分（すなわち、天然に存在するイム
ノグロブリンに存在しない部分）に連結されている。たとえば、いくつかの態様
が、ｐＥＴベクター（たとえば、ｐＥＴ−１５ｂ、Novagen）、ファージベクタ
ー（たとえば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ、Pharmacia）、または他のベクター（たと
えば、ｐＲＩＴ２ＴプロテインＡフュージョンベクター、Pharmacia）などの適
切な発現ベクターへのイムノグロブリン配列をコードする核酸の挿入により生産
されうる。得られた構築物は発現用の適切な宿主細胞に導入されうる。発現の際
、融合タンパク質には適切な親和性マトリックスにより細胞溶解物から単離もし
くは精製されうるものもある〔たとえば、Current Protocols in Molecular Bio
logy (Ausbel,F. M. ら編、Vol.2、補遺２６、16.4.1-16.7.8頁 (1991) 参照〕
。
治療方法および治療組成物
本発明は、（１）イン・ビトロおよび／またはイン・ビボでＣＣＲ２に結合し
うる；および／または（２）（ａ）結合機能（たとえば、ＣＣＲ２のリガンドへ
の結合能）および／または（ｂ）組織での白血球の招集および／または蓄積など
の白血球の輸送（leukocytetrafficking）などのＣＣＲ２の活性または機能を
調節しうるヒト化イムノグロブリンを提供する。ヒト化イムノグロブリンはイン
・ビトロおよび／またはイン・ビボで選択的にＣＣＲ２に結合しえ、ＣＣＲ２媒
介性相互作用を阻害しうるのが好ましい。１つの態様では、ヒト化イムノグロブ
リンはＣＣＲ２に結合しえ、ＣＣＲ２の１またはそれ以上のそのリガンド（たと
えば、ＨＩＶ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４）への結合を
阻害しうる。本発明のヒト化イムノグロブリンは、研究、診断および治療の用途
での種々の工程に有用である。たとえば、ヒト化イムノグロブリンを用い、（た
とえば、親和性精製または他の適切な方法により）ＣＣＲ２またはそのバリアン
トを検出、単離、および／または精製することができ、また、ＣＣＲ２の構造（
たとえば、立体配置）および機能を研究することができる。また、本発明のヒト
化イムノグロブリンを（たとえば、イン・ビトロ、エクス・ビボでの）診断用途
に用いることができ、または該ヒト化イムノグロブリンを用いて治療（予防を含
む）用途でＣＣＲ２の機能を調節することができる。
たとえば、本発明のヒト化イムノグロブリンを用いて試料（たとえば、組織、
または炎症性滲出物（inflammatory exudate）、血液、血清、腸液（bowel flui
d）などの体液、ＣＣＲ２を有する細胞上）中のＣＣＲ２のレベルを検出および
／または測定することができる。たとえば、試料（たとえば、組織および／また
は体液）は個体から得ることができ、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などの
方法や、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、および免疫組織学などの適
切な免疫学的方法を用いてＣＣＲ２の発現を検出および／または測定することが
できる。１つの態様では、ヒト化イムノグロブリンのＣＣＲ２への特異的結合に
適する条件下で試料を本発明のヒト化イムノグロブリンと接触させる工程および
形成される抗体−ＣＣＲ２複合体を検出する工程を含む、試料中の選択されたＣ
ＣＲ２を検出する方法が提供される。該方法の実施においては、ヒト化イムノグ
ロブリンを用いてＣＣＲ２反応性および／または発現について（たとえば、免疫
組織学的に）正常組織対炎症組織（たとえば、ヒト由来）を解析し、（たとえば
、冒された組織での）ＣＣＲ２の発現の増加と特定の症状との間の関係を検出し
うる。本発明のヒト化イムノグロブリンは正常組織対炎症組織でのＣＣＲ２の存
在の免疫学的評価方法を可能にする。それにより、疾患の存在、疾患の進行およ
び／または炎症性疾患での抗ＣＣＲ２インテグリン治療の有効性を評価しうる。
また、本発明のヒト化イムノグロブリンを用いて、ＣＣＲ２により調節される
、結合機能および／または白血球（たとえば、リンパ球、単球）の輸送を調節〔
たとえば、阻害（減少または防止）〕することができる。たとえば、ＣＣＲ２の
リガンド（すなわち、１またはそれ以上のリガンド）への結合を阻害するヒト化
イムノグロブリンを、組織の白血球（たとえば、リンパ球、単球）浸潤に関連す
る疾患の治療で該方法に従って投与することができる。さらに、ＣＣＲ２のリガ
ンド（すなわち、１またはそれ以上のリガンド）への結合を阻害するヒト化イム
ノグロブリンを、ＨＩＶの治療で該方法に従って投与することができる。本発明
のヒト化イムノグロブリン（すなわち、１またはそれ以上）の有効量をかかる疾
患を治療するために個体（たとえば、ヒトまたは他の霊長類などの哺乳動物）に
投与する。
ヒト化イムノグロブリンをＣＣＲ２のそのリガンドへの結合を阻害する有効量
で投与する。治療にとっては、有効量は所望の治療（予防を含む）効果を達成す
るのに充分（たとえば、ＣＣＲ２媒介性結合および／またはシグナル伝達を減少
または防止するのに充分な量など）であろう。ヒト化イムノグロブリンは単回投
与または複数回投与で投与されうる。投与量は当業者に既知の方法により決定さ
れえ、たとえば、個体の年齢、感受性、耐性および全体の状況に依存しうる。抗
体の適切な投与量としては、１回の処置当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０
．０ｍｇ／ｋｇ体重でありうる。
該方法によれば、ヒト化イムノグロブリンを個体（たとえば、ヒト）に単独で
またはその他の薬剤と共に投与することができる。ヒト化イムノグロブリンはさ
らなる薬剤の投与前、投与と共に、または投与の後に投与されうる。従って、本
発明は、本発明のヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片と適切な担
体を含む医薬組成物を含む。１つの態様では、ＣＣＲ２のそのリガンドへの結合
を阻害する１つを超えるヒト化イムノグロブリンを投与する。他の態様では、さ
らなるモノクローナル抗体を本発明のヒト化イムノグロブリンと共に投与する。
さらに他の態様では、さらなる薬理学的に活性な成分（たとえば、サルファサラ
ジンなどの抗炎症性化合物、他の非ステロイド抗炎症性化合物、またはステロイ
ド抗炎症性化合物）を本発明のヒト化イムノグロブリンと共に投与することがで
きる。
治療対象の疾患または症状に依存して種々の投与経路が可能であり、必ずしも
限定されるものではないが、非経口（たとえば、静脈内注射、動脈内注射、筋肉
内注射、皮下注射）、経口（たとえば、規定食）、局所、吸入（たとえば、気管
支内吸入、鼻腔内吸入または経口吸入、鼻腔内滴剤）、または直腸が挙げられる
。非経口投与は投与の好ましい方法である。
処方は選択された投与経路により変わるであろう（たとえば、液剤、乳剤）。
投与対象のヒト化抗体を含む適当な組成物を生理学的に許容されうるビヒクルま
たは担体中で調製することができる。液剤または乳剤にとって適切な担体として
は、たとえば、生理食塩水および緩衝化媒体などの、水溶液またはアルコール性
／水溶液、乳濁液または懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとしては塩化ナト
リウム溶液、リンゲルデキストロース（Ringer's dextrose）、デキストロース
および塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル油または固定油（lactated Ringer's or
fixed oil）を挙げることができる。静脈内ビヒクルとしては種々の添加物、保
存剤、または液体、栄養素もしくは電解質補給剤を挙げることができる（一般に
は、Remington'sPharmaceutical Sciences, 17th Edition, Mack Publishing C
o., PA, 1985参照）。吸入については、化合物を溶解し、投与のための適切なデ
ィスペンサー（たとえば、アトマイザー、ネブライザーまたは加圧エーロゾルデ
ィスペンサー）中に充填することができる。
このように、本発明は、本発明のヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合
性断片を含む組成物の有効量と細胞とを接触させることを含む、細胞のＨＩＶ感
染を阻害する方法を含む。また、本発明は、本発明のヒト化イムノグロブリンま
たはその抗原結合性断片の有効量を含む組成物を患者に投与することを含む、患
者においてＨＩＶ感染を治療する、またはＨＩＶ感染を阻害する方法に関する。
また、本発明は、本発明のヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片
の有効量とＣＣＲ２またはその一部を含む組成物とを接触させることを含む、哺
乳動物ＣＣＲ２またはＣＣＲ２の機能性部分へのケモカインの結合に関連する機
能を阻害する方法に関する。ここで、前記ヒト化イムノグロブリンは哺乳動物Ｃ
ＣＲ２へのケモカインの結合を阻害し、また、ＣＣＲ２へのケモカインの結合に
関連する１またはそれ以上の機能を阻害する。たとえば、ケモカインはＭＣＰ−
１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４およびその組合せからなる群より選択
することができる。
また、本発明は、哺乳動物ＣＣＲ２に結合し、該レセプターへのリガンドの結
合を阻害する、本発明のヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片の有
効量を含む組成物を患者に投与することを含む、患者において白血球の輸送を阻
害する方法に関する。たとえば、リガンドはケモカイン（たとえば、ＭＣＰ−１
、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４）またはＨＩＶでありうる。
また、本発明は、ＣＣＲ２を発現する第１の細胞とリガンド（たとえば、ＣＣ
Ｒ２のリガンドを発現する第２の細胞上）との相互作用を阻害する方法であって
、第１の細胞を本発明のヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片の有
効量と接触させることを含む方法に関する。ここで、特に前記イムノグロブリン
または断片はＣＣＲ２へのリガンドの結合を阻害する。たとえば、該細胞はリン
パ球、単球、顆粒球、Ｔ細胞、好塩基球、およびＣＣＲ２またはその一部をコー
ドする組換え核酸を含む細胞からなる群より選択することができる。１つの態様
では、該リガンドはケモカイン（たとえば、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−
３、ＭＣＰ−４）である。他の態様では、該リガンドはＨＩＶである。
また、本発明は、哺乳動物ＣＣＲ２に結合する、本発明のヒト化イムノグロブ
リンまたはその抗原結合性断片の有効量を患者に投与することを含む、患者にお
いてＣＣＲ２媒介性障害を治療する方法を含む。該障害としては、限定されるも
のではないが、アレルギー、アテローム発生、アナフィラキシー、悪性腫瘍、慢
性および急性炎症性障害、ヒスタミンおよびＩｇＥ媒介性アレルギー反応、卒中
、および慢性関節リューマチ、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、狭窄、
再狭窄、同種異系移植片拒絶、繊維症、喘息、および炎症性糸球体症（inflamma
toryglomerulopathies）を挙げることができる。
特定の態様では、本発明は、哺乳動物ＣＣＲ２に結合する、本発明のヒト化イ
ムノグロブリンまたはその抗原結合性断片の有効量を患者に投与することを含む
、患者において再狭窄を阻害する方法に関する。また、本発明は、治療もしくは
診断に使用するための、またはＣＣＲ２媒介性疾患もしくは障害の治療に使用す
るための、本発明のヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片を含む。
また、本発明は、ＣＣＲ２媒介性疾患を治療するための医薬の製造のための本発
明のヒト化イムノグロブリンまたはその抗原結合性断片の使用を含む。
抗イディオタイプ抗体も提供される。抗イディオタイプ抗体は別の抗体の抗原
結合部位に関わる抗原決定基を認識する。抗イディオタイプ抗体は、二次抗体を
産生するのに使用される動物と同じ種の、好ましくは同じ系統の動物を免疫化す
ることによって、二次抗体に対して産生させることができる。例えば米国特許第
４，６９９，８８０号を参照されたい。
また本発明は、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１２５４９およびＨＢ−１２５５０の
下で寄託されたハイブリドーマ細胞株ならびにＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１２５４
９およびＨＢ−１２５５０の下で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生
されるモノクローナル抗体に関する。本発明の細胞株はモノクローナル抗体の産
生の他にも用途を有する。例えば、本発明の細胞株をさらなるハイブリドーマを
作製するために、他の細胞（適当な薬物標識された（ｄｒｕｇ−ｍａｒｋｅｄ）
ヒトの骨髄腫、マウスの骨髄腫、ヒト−マウスヘテロ骨髄腫またはヒトのリンパ
芽球細胞など）と融合させて、モノクローナル抗体をコードする遺伝子の導入を
提供することができる。またこれらの細胞株は抗ＣＣＲ２イムノグロブリン鎖を
コードする核酸の供給源として使用することもできる。これは、単離し、発現さ
せることができる〔例えば任意の適切な技術を使って他の細胞に導入した場合（
例えばＣａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｗｉｎｔｅｒ、米
国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい）〕。例えば、再配列された抗Ｃ
ＣＲ２軽鎖または重鎖を含むクローンは（例えばＰＣＲによって）単離され得る
か、またはこれらの細胞株から単離されるｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを
作成して抗ＣＣＲ２イムノグロブリン鎖をコードするｃＤＮＡクローンが単離さ
れ得る。したがって、特異的なイムノグロブリン、イムノグロブリン鎖またはそ
のバリアント（例えばヒト化イムノグロブリン）を様々な宿主細胞中またはイン
・ビトロ翻訳系中で産生するために、抗体またはその一部の重鎖および／または
軽鎖をコードする核酸を組換えＤＮＡ技術に従って取得し使用することができる
。例えば、核酸（ｃＤＮＡ、またはヒト化イムノグロブリンもしくはイムノグロ
ブリン鎖などのバリアントをコードするその誘導体を含む）は、適切な原核生物
または真核生物ベクター（例えば発現ベクター）中に配置され得る。これを適切
な宿主細胞中に適当な方法（例えば形質転換、トランスフェクション、エレクト
ロポレーション、感染）によって導入することができる。その結果、核酸が（例
えばベクター中または宿主細胞のゲノム中に組み込まれ）１つ以上の発現制御因
子に作動可能な形で連結される。産生のためには、宿主細胞を発現に適した条件
下に（例えば誘導物質、適当な塩類が補足された適切な培地、成長因子、抗生物
質、栄養補充剤などの存在下に）維持することができ、それによりコードされた
ポリペプチドが産生される。所望であれば、コードされたタンパク質を（例えば
、宿主細胞、培地、乳汁から）回収および／または単離し得る。この産生方法に
トランスジェニック動物の宿主細胞中での発現が包含されることは理解されるだ
ろう（例えば、１９９２年３月１９日に公開された国際公開第９２／０３９１８
号，ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌを参照されたい）。
本明細書で記載されているように、本発明の抗体とその機能的断片はＣＣＲ２
に対するリガンドの結合をブロック（阻害）および／またはＣＣＲ２に対するそ
のリガンドの結合に関連する機能を阻害することができる。以下に述べるように
、ＣＣＲ２に対するリガンドの結合の阻害、および／または該レセプターに対す
るリガンドの結合に関連する機能を評価するためには、様々な方法を使用するこ
とができる。
結合アッセイ
本明細書で用いられる「哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質」とは、天然に生じる(n
aturallyoccuring)もしくは内因性の哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質、および天然
に生じるもしくは内因性の対応する哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質のものと同一で
あるアミノ酸配列を有するタンパク質（例えば、組換えタンパク質）をいう。従
って、本明細書において規定されるように、前記用語は、成熟レセプタータンパ
ク質、多型または対立遺伝子バリアント、および（例えば、オルタナティブスプ
ライシングまたは他の細胞プロセスによって産生された）哺乳動物ＣＣＲ２の他
のイソ型、および前記のものの修飾型または未修飾型（例えば、グリコシル化、
非グリコシル化）を含む。哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質は単離および／または組
換えタンパク質（合成により生産されたタンパク質など）でありうる。天然に生
じるまたは内因性の哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質としては、成熟ＣＣＲ２などの
野生型タンパク質、多型または対立遺伝子バリアントおよび哺乳動物（例えば、
ヒト、非ヒト霊長類）において天然に生じる、該タンパク質のカルボキシ末端の
オルタナティブスプライシングにより産生される該レセプタータンパク質のＣＣ
Ｒ２ａ型およびＣＣＲ２ｂ型などの他のイソ型が挙げられる。かかるタンパク質
は、例えば、天然に哺乳動物ＣＣＲ２を生じる供給源から回収または単離されう
る。これらのタンパク質および天然に生じるまたは内因性の対応する哺乳動物Ｃ
ＣＲ２と同一のアミノ酸配列を有する哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質を、対応する
哺乳動物の名称によって呼称する。例えば、対応する哺乳動物がヒトである場合
、タンパク質は、ヒトＣＣＲ２タンパク質（例えば、適切な宿主細胞で産生され
た組換えヒトＣＣＲ２）として表示される。
哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質の「機能的バリアント」としては、機能的断片、
機能的変異タンパク質、および／または機能的融合タンパク質（例えば、変異誘
発および／または組換え技術を介して産生されたもの）が挙げられる。一般に、
哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質の断片または一部としては、（Ｎ−末端、Ｃ−末端
または内部欠失などの）成熟哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質に関してアミノ酸（す
なわち、１以上のアミノ酸）の欠失（すなわち、１以上の欠失）を有するものが
挙げられる。成熟哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質に関して連続した(contiguous)ア
ミノ酸のみが欠失された断片もしくは部分、または非連続アミノ酸が欠失された
断片もしくは部分も考えられる。
一般に、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質の変異体としては、１以上の連続または
非連続アミノ酸残基の付加、欠失および／または置換だけ異なる哺乳動物ＣＣＲ
２タンパク質の天然または人工バリアント（例えば、レセプターキメラ）を含む
。かかる変異は、例えば、（他のＣＸＣおよび／またはＣＣケモカインレセプタ
ーと比較して）保存領域または非保存領域、細胞外領域、細胞質領域、または膜
貫通領域であり得る。
一般に、融合タンパク質は、ペプチド結合を介して、天然に見出される哺乳動
物ＣＣＲ２には存在しない第２の部分(moiety)に連結した、哺乳動物ＣＣＲ２（
例えば、ヒトＣＣＲ２）を第１の部分として含有したポリペプチドを包含する。
したがって、第２の部分は、アミノ酸、オリゴペプチドまたはポリペプチドであ
り得る。第１の部分は、融合タンパク質に対してＮ−末端位置、Ｃ−末端位置ま
たは内部であり得る。１つの態様において、融合タンパク質は、親和性リガンド
〔例えば、酵素、抗原、エピトープタグ（tage）〕を第１の部分とし、リンカー
配列とヒトＣＣＲ２またはその一部とを含有した第２の部分とを含有する。
哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質の「機能的断片または一部(portion) 」、「機能
的変異体」および／または「機能的融合タンパク質」とは、結合活性、シグナル
伝達活性および／または細胞応答を刺激する能力などの、本明細書に記載された
哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質の少なくとも１つの機能的特徴を有する単離された
および／または組換えタンパク質またはポリペプチドをいう。好ましい機能的バ
リアントは、リガンド（すなわち、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３および
／またはＭＣＰ−４などの１以上のリガンド）に結合することができ、本明細書
において、「リガンド結合バリアント」と称される。
１つの態様において、哺乳動物ＣＣＲ２の機能的バリアントは、該哺乳動物Ｃ
ＣＲ２と少なくとも約８５％の配列同一性、好ましくは、該哺乳動物ＣＣＲ２と
少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも約９５％の配列
同一性を有する。ヒトＣＣＲ２ａおよびＣＣＲ２ｂの核酸配列およびアミノ酸配
列は米国特許第5,707,815号に記載されている。配列同一性は、Ｂｌａｓｔｘプ
ログラム（バージョン１．４）などの適切なプログラムを用い、デフォルトパラ
メーターなどの適切なパラメーターを用いて決定することができる。１つの態様
において、Ｂｌａｓｔｘサーチについてのパラメーターは、スコアリングマトリ
ックスＢＬＯＳＵＭ６２、Ｗ＝３である。他の態様において、機能的バリアント
は、天然に生じる核酸分子と異なるが、遺伝子コードの縮重により、哺乳動物Ｃ
ＣＲ２またはその一部をコードする核酸配列を含有する。
単離されたおよび／または組換え哺乳動物ＣＣＲ２またはその機能的バリアン
トを含有した組成物(composition)を、結合に適した条件下に維持することがで
き、哺乳動物ＣＣＲ２またはバリアントと、試験対象抗体または断片とを接触さ
せ、結合を直接的または間接的に検出または測定する。１つの態様において、天
然にＣＣＲ２を発現する細胞または哺乳動物ＣＣＲ２またはそのバリアントをコ
ードする組換え核酸配列を含有した細胞が使用される。前記細胞を、レセプター
の発現に適した条件下に維持する。前記細胞を、結合に適した条件下で（例えば
、適切な結合緩衝液中で）、抗体または断片と接触させ、標準的な技術によって
、結合を検出する。結合を測定するには、結合の程度を適切な対照について測定
することができる（例えば、抗体の非存在下で測定されたバックグラウンドとの
比較、第２の抗体（すなわち、標準）の結合との比較、抗体の非トランスフェク
ト細胞への結合との比較）。レセプターを含有した膜画分またはレセプターを含
有したリポソームを含有した膜画分などの細胞画分を全細胞の代わりに使用する
ことができる。
１つの態様において、抗体を適切な標識（例えば、蛍光標識、同位体標識、抗
原またはエピトープ標識、酵素標識）で標識し、標識の検出により、結合を測定
する。他の態様において、結合した抗体を、標識された第２の抗体によって検出
することができる。結合の特異性は、例えば、コンペティターとしての非標識抗
体またはリガンドを用い、競合または置換によって評価することができる。
また、結合阻害アッセイを用いて、ＣＣＲ２に結合し、かつリガンド（例えば
、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３および／またはＭＣＰ−４）などの他の
化合物のＣＣＲ２または機能的バリアントへの結合を阻害する抗体またはその断
片を同定することができる。例えば、抗体の非存在下におけるリガンドの結合と
比較して、（抗体の存在下での）ＣＣＲ２のリガンドの結合の減少を検出または
測定する結合アッセイを行なうことができる。単離されたおよび／または組換え
哺乳動物ＣＣＲ２もしくはその機能的バリアントを含有した組成物を、リガンド
および抗体と同時に、または他方の後に一方を、いずれかの順序で接触させうる
。抗体の存在下におけるリガンドの結合の程度の低下は、抗体による結合の阻害
の指標である。例えば、リガンドの結合は減少または破壊(abolished) されうる
。
１つの態様において、リガンド（例えば、ＭＣＰ−１などのケモカイン）の哺
乳動物ＣＣＲ２またはそのバリアントへの結合の、抗体または断片による直接的
阻害をモニターする。例えば、125 Ｉ−標識ＭＣＰ−１、125 Ｉ−標識ＭＣＰ−
２、125Ｉ−標識ＭＣＰ−３または125 Ｉ−標識ＭＣＰ−４の哺乳動物ＣＣＲ２
への結合を阻害する抗体の能力をモニターすることができる。そのようなアッセ
イは、例えば、単離された血液細胞（例えば、Ｔ細胞、ＰＢＭＣ）または天然に
ＣＣＲ２を発現する適切な細胞株、または哺乳動物ＣＣＲ２をコードする核酸を
含有する細胞株、または該細胞からの膜画分などの、ＣＣＲ２またはその機能的
バリアントを生じる適切な細胞を用いて行なうことができる。
他の適切な結合アッセイ、またはシグナル伝達機能および／または細胞応答の
刺激（例えば、白血球の輸送）を含む、レセプター結合により引き起こされる事
象をモニターする方法などの、ＣＣＲ２に結合する抗体の存在を同定する他の方
法が利用できる。
本発明の抗体の阻害効果は、結合阻害アッセイで評価されうることが理解され
よう。レセプター結合のための抗体間の競合を、該方法で評価することもできる
。このようにして同定された抗体をさらに評価して、結合に続いて、それらがＣ
ＣＲ２の他の機能を阻害するように、および／またはそれらの治療利用性を評価
するように作用するか否かを判断することができる。
シグナル伝達アッセイ
アゴニストなどのリガンドまたは促進物質のＣＣＲ２への結合は、このＧタン
パク質−共役型レセプターによるシグナル伝達がもたらされ得、Ｇタンパク質な
らびに他の細胞内シグナル伝達分子の活性が刺激される。化合物（例えば、抗体
またはその断片）によるシグナル伝達機能の誘導は、いかなる適切な方法を用い
てもモニターすることができる。そのようなアッセイを用いて、ＣＣＲ２の抗体
アゴニストを同定することができる。抗体またはその機能的断片の阻害活性は、
アッセイにおいてリガンドまたは促進物質を用い、リガンドまたは促進物質によ
って誘導された活性を阻害する抗体の能力を評価し、測定することができる。
ＧＴＰのＧＤＰへの加水分解、または細胞内（細胞質）遊離カルシウム［Ｃａ
2+］i の濃度の迅速かつ一過性の増加の誘導などの、レセプター結合により引き
起こされる後のシグナル伝達事象のようなＧタンパク質活性は、当該分野で公知
の方法または他の適切な方法によってアッセイすることができる（例えば、Ｎｅ
ｏｔｅ， Ｋ．ら， Ｃｅｌｌ ７２：４１５−４２５ １９９３）； Ｖａｎ
Ｒｉｐｅｒら， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １７７：８５１−８５６（１９９
３）；Ｄａｈｉｎｄｅｎ， Ｃ．Ａ．ら， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １７９：
７５１−７５６（１９９４））。
例えば、ハイブリッドＧタンパク質結合レセプターを用いるＳｌｅｄｚｉｅｗ
ｓｋｉらの機能アッセイを用いて、レセプターに結合し、かつＧタンパク質を活
性化するリガンドまたは促進物質の能力をモニターすることができる（Ｓｌｅｄ
ｚｉｅｗｓｋｉら，米国特許第５，２８４，７４６号、その教示は、参照により
本明細書に取り込まれる）。
かかるアッセイは、評価対象である抗体またはその断片の存在下で行なうこと
ができ、リガンドまたは促進物質によって誘導された活性を阻害する抗体または
断片の能力は、公知の方法および／または本明細書に記載された方法を用いて測
定される。
走化性および細胞刺激のアッセイ
また、走化性アッセイを用いて、リガンドの哺乳動物ＣＣＲ２またはその機能
的バリアントへの結合をブロックする、および／またはリガンドのレセプターへ
の結合に関連する機能を阻害する抗体またはその機能的断片の能力を評価するこ
とができる。これらのアッセイは、化合物によって誘導されたイン・ビトロまた
はイン・ビボでの細胞の機能的移動に基づく。走化性は、例えば、９６穴走化性
プレートを用い、または走化性を評価するための他の当該分野で認識された方法
を用いるアッセイにおいて、実施例に記載したように評価しうる。例えば、イン
・ビトロ経内皮細胞走化性アッセイの使用はＳｐｒｉｎｇｅｒらによって記載さ
れている（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら，国際公開第９４／２０１４２号パンフレット，
１９９４年９月１５日公開、その教示は、参照により本明細書に取り込まれる；
また、Ｂｅｒｍａｎら， Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．， １７：６２５−
６７７（１９８８）参照）。内皮を通過するコラーゲンゲルへの移動もまた記載
されている（Ｋａｖａｎａｕｇｈら， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４６：４１
４９−４１５６（１９９１））。例えば、マウスＬ１−２プレ−Ｂ細胞の、また
は化学走化しうる他の適切な宿主細胞の安定なトランスフェクタントを走化性ア
ッセイで用いることができる。
一般に、走化性アッセイは、バリアー（例えば、内皮、フィルター）の中への
またはそれを通っての、化合物の増大したレベルに向けての、バリアーの第１の
表面から対向する第２の表面に向けての、〔白血球（たとえば、リンパ球、好酸
球、好塩基球）などの〕適切な細胞の方向性運動または移動をモニターする。膜
またはフィルターは、適切な細胞のフィルターへのまたはそれを通っての、化合
物の増大したレベルに向けての、フィルターの第１の表面からフィルターの対向
する第２の表面への方向性運動または移動がモニターされるように、便宜なバリ
アーを提供する。いくつかのアッセイにおいては、膜を、ＩＣＡＭ−１、フィブ
ロネクチンまたはコラーゲンなどの接着を容易にする物質で被覆する。そのよう
なアッセイは白血球「ホーミング(homing)」のイン・ビトロ近似を提供する。
例えば、試験対象の抗体を含み、膜によって第１のチャンバーから分割される
第２のチャンバーへの多孔性膜へのまたはそれを通っての第１のチャンバーから
の、適切な容器〔包含手段（containing means) 〕中の細胞の移動の阻害を検出
または測定することができる。例えば、ニトロセルロース、ポリカーボネートを
含めた、化合物に応答しての特異的移動をモニターするための適切なポアサイズ
を有する適切な膜を選択する。例えば、約３−８ミクロン、好ましくは約５−８
ミクロンのポアサイズを用いることができる。ポアサイズはフィルター上で均一
であるか、または適切なポアサイズの範囲内でありうる。
移動および移動の阻害を評価するには、フィルターへの移動の距離、フィルタ
ーの第２の表面に接着したままであるフィルターを横切る細胞の数、および／ま
たは第２のチャンバーに蓄積する細胞の数を、標準的な技術（例えば、顕微鏡）
を用いて測定することができる。１つの態様において、細胞を検出可能な標識（
例えば、放射性同位体、蛍光標識、抗原またはエピトープ標識）で標識し、移動
は、適切な方法を用い、膜に接着したおよび／または第２のチャンバーに存在す
る標識の存在を測定することによって（例えば、放射活性、蛍光の検出、イムノ
アッセイによって）、抗体または断片の存在および非存在下で評価することがで
きる。抗体アゴニストによって誘導された移動の程度は、適切な対照に対して測
定することができる（例えば、抗体の非存在下で測定したバックグラウンド移動
との比較、第２の化合物（すなわち、標準）によって誘導された移動の程度との
比較、抗体によって誘導された非トランスフェクト細胞の移動との比較）。
１つの態様において、特に、Ｔ細胞、単球、または哺乳動物ＣＣＲ２発現細胞
については、経内皮細胞移動をモニターすることができる。この態様において、
内皮細胞層を介する移動を評価する。細胞層を調製するために、内皮細胞を、所
望により、内皮細胞の付着を容易にするためのコラーゲン、フィブロネクチン、
または他の細胞外マトリックスタンパク質などの物質で被覆される多孔性フィル
ターまたは膜上で培養することができる。好ましくは、内皮細胞は、コンフルエ
ントな単層が形成されるまで培養する。例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｃｌｏ
ｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）などの、静脈、動脈
または微小血管内皮細胞などの種々の哺乳動物内皮細胞が単層形成のために利用
できる。特定の哺乳動物レセプターに応答しての走化性を評価するには、同一哺
乳動物の内皮細胞が好ましい；しかしながら、異種哺乳動物種または属からの内
皮細胞も使用できる。
一般に、前記アッセイは、第１の表面上に内皮細胞層を含むフィルターの第１
の表面からフィルターの対向する第２の表面に向けての、化合物の増大するレベ
ルに向けての方向での、膜またはフィルターへのまたはそれを通っての細胞の方
向性の移動を検出することによって行われる。方向性の移動は、第１の表面に隣
接する領域から、膜へのまたはそれを通っての、フィルターの対向する側に位置
する化合物に向けて起こる。第２の表面に隣接する領域に存在する化合物の濃度
が第１の表面に隣接する領域におけるものよりも大きい。
抗体阻害物質について試験するのに用いられる１つの態様において、移動でき
、かつ哺乳動物ＣＣＲ２レセプターを発現しうる細胞を含有した組成物が、第１
のチャンバーに配置されうる。第１のチャンバー中の細胞の走化性を誘導できる
１以上のリガンドまたは促進物質を含有した組成物（化学誘因機能を有する）を
第２のチャンバーに入れる。好ましくは、細胞を第１のチャンバーに入れる直前
または該細胞と同時に、試験対象の抗体を含有した組成物を、好ましくは、第１
のチャンバーに入れる。このアッセイにおいては、レセプターに結合し、哺乳動
物ＣＣＲ２発現細胞の走化性の、リガンドまたは促進物質による誘導を阻害でき
る抗体またはその機能的断片は、レセプター機能の阻害物質（例えば、刺激機能
の阻害物質）である。抗体または断片の存在下に、リガンドまたは促進物質によ
って誘導される移動の程度の低下は、阻害活性の指標である。別の結合試験（前
記参照）を行なって、阻害が、抗体のレセプターへの結合の結果であるか、異な
るメカニズムを介して生ずるのかを判断できる。
組織における化合物（例えば、ケモカインまたは抗体）の注入に応答した組織
の白血球侵潤をモニターするイン・ビボアッセイを後述する（炎症のモデル参照
）。イン・ビボホーミングのこれらのモデルは、炎症の部位への移動および走化
性によるリガンドまたは促進物質に応答する細胞の能力を測定し、およびこの移
動をブロックする抗体またはその断片の能力を評価する。
記載された方法に加えて、ＣＣＲ２の刺激機能に対する抗体または断片の効果
は、レセプターを含む適切な宿主細胞を用い、活性レセプターによって誘導され
た細胞応答をモニターすることにより評価されうる。
哺乳動物のＣＣＲ２機能のさらなるリガンド、阻害物質、および／または促進物
質の同定
本発明の抗体および断片の結合および機能を評価するために用いられうる上記
アッセイ法を調整し、哺乳動物ＣＣＲ２、またはその機能的バリアントに結合す
る別のリガンドまたはそれ以外の物質、ならびに哺乳動物ＣＣＲ２機能の阻害物
質および／または促進物質を同定することができる。例えば、本発明の抗体また
はその一部を用いた競合アッセイ法によって、本発明の抗体またはその機能的部
分の機能と同一ないし類似した結合特異性を有する薬剤を同定することができる
。したがって、本発明は、レセプターのリガンド、または哺乳動物ＣＣＲ２タン
パク質に結合する他の物質、および、レセプター機能の阻害物質（例えば、アン
タゴニスト）または促進物質（例えば、アゴニスト）の同定法をも包含する。１
つの態様において、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質、またはその機能的バリアント
を産生する細胞（例えば、細胞に導入された核酸によりコードされた哺乳動物Ｃ
ＣＲ２タンパク質または機能的バリアントを発現するよう操作された白血球、細
胞株または適切な宿主細胞）は、リガンドや、レセプター機能の阻害物質または
促進物質などの、レセプターに結合する他の物質の効力を同定および評価するア
ッセイ法に用いられる。かかる細胞はまた、発現されたレセプタータンパク質ま
たはポリペプチドの機能を評価するのに有用である。
本発明によれば、リガンド、およびレセプターに結合する他の物質、レセプタ
ー機能の阻害物質または促進物質を適切なアッセイ法によって同定し、さらに、
治療効果を評価することができる。レセプター機能の阻害物質は、レセプター活
性を阻害（低下または阻止）するのに用いられ得、リガンドおよび／または促進
物質は、示された正常なレセプター機能を誘導（開始または促進）するのに用い
られうる。したがって、本発明は、レセプター機能の阻害物質を個体（例えば、
哺乳動物）に投与することを含む、自己免疫疾患および移植片拒絶などの炎症疾
患を治療する方法を提供する。さらに、本発明は、レセプター機能の新規のリガ
ンドまたは促進物質を個体に投与することによって、レセプター機能を刺激する
方法を提供し、白血球機能を選択的に刺激するための新規のアプローチを提供す
るが、これは、例えば、感染症や癌の治療に役立つ。
本明細書に用いられるように、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質の「リガンド」と
は、天然のリガンド、ならびに天然のリガンドの合成型および／または組換型を
含む、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質に結合する物質の特定の分類群を意味する。
哺乳動物ＣＣＲ２陽性細胞に対する親和性を有する感染病原体（例えば、ＨＩＶ
などのウイルス）も、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質に結合することができる。選
ばれた哺乳動物のレセプターの天然のリガンドは、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質
のリガンド（例えば、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３および／またはＭＣ
Ｐ−４などのケモカインなど）と同じ哺乳動物由来である。好ましい態様では、
哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質のリガンド結合は、高い親和性で生じる。
本明細書に用いられるように、「阻害物質」とは、結合活性（例えば、リガン
ド結合、促進物質結合、抗体結合）、シグナル伝達活性（例えば、哺乳動物Ｇタ
ンパク質の活性化、細胞質中の遊離カルシウム［Ｃａ2+］i の急速かつ一過的な
濃度上昇の誘導など）、および／または細胞応答機能（例えば、白血球による走
化性、エキソサイトーシス、または炎症メディエーター放出の刺激）など、哺乳
動物ＣＣＲ２タンパク質（例えば、ヒトＣＣＲ２）に特徴的な機能の少なくとも
１つを阻害（低下または阻止）する物質である。阻害物質は、ＨＩＶが細胞の中
に侵入するのを阻害する物質でもある。阻害物質という語は、レセプターに結合
するアンタゴニスト（例えば、抗体、天然リガンドの変異体、低分子量の有機分
子、その他リガンド結合の競合阻害物質）、および、レセプターに結合すること
なく、レセプター機能を阻害する物質（例えば、抗イディオタイプ抗体）などの
物質を意味する。
本明細書に用いられるように、「促進物質」とは、結合活性（例えば、リガン
ド結合、促進物質結合、抗体結合）、シグナル伝達活性（例えば、哺乳動物Ｇタ
ンパク質の活性化、細胞質中の遊離カルシウム［Ｃａ2+］i の急速かつ一過的な
濃度上昇の誘導など）、および／または細胞応答機能（例えば、白血球による走
化性、エキソサイトーシス、または炎症メディエーター放出の刺激）など、哺乳
動物ＣＣＲ２タンパク質（例えば、ヒトＣＣＲ２）に特徴的な機能の少なくとも
１つを促進（誘導、惹起、亢進、または増加させる）物質である。促進物質とい
う語は、レセプターに結合するアゴニスト（例えば、抗体、別種由来の天然リガ
ンドのホモログなど）、および、レセプターに結合することなくレセプター機能
を（例えば、会合するタンパク質を活性化することによって）促進させる物質を
含む物質を意味する。好ましい態様においては、アゴニストは、天然のリガンド
のホモログ以外のものである。
したがって、本発明は、リガンド、阻害物質、促進物質、および哺乳動物ＣＣ
Ｒ２レセプターまたはその機能的バリアントに結合する他の物質などの哺乳動物
のＣＣ−ケモカインレセプター２またはそのリガンド結合バリアントに結合する
薬剤を検出または同定する方法にも関する。本方法によれば、試験対象の薬剤、
本発明の抗体または抗原結合断片（例えば、８Ｇ２、１Ｄ９、８Ｇ２または１Ｄ
９のエピトープ特異性と同一または類似のエピトープ特異性を有する抗体、およ
びこれらの抗原結合断片）、および哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２ま
たはそのリガンド結合バリアントを含有した組成物を組合わせることができる。
抗体または抗原結合断片が哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２またはその
リガンド結合バリアントに結合するのに適した条件下で上記成分を組合わせ、哺
乳動物ＣＣ−ケモカインレセプター２またはそのリガンド結合バリアントへの抗
体またはその断片の結合を、本明細書記載の方法または適切な他の方法により、
直接または間接的に検出または測定する。適切な対照（例えば、試験対象の薬剤
非存在下）に比べて、形成された複合体の量が減少すれば、薬剤が該レセプター
またはそのバリアントに結合することの指標となる。哺乳動物ＣＣ−ケモカイン
レセプター２またはそのリガンド結合バリアントを含有した組成物は、組換えケ
モカインレセプター２またはそのリガンド結合バリアントを産生する細胞の膜画
分でもよい。抗体またはその断片は、放射性同位元素、スピン標識、抗原または
エピトープ標識、酵素標識、蛍光基および化学発光基などの標識によって標識す
ることができる。
１つの態様において、本発明は、試験対象の薬剤、本発明の抗体または抗原結
合断片（例えば、１Ｄ９、８Ｇ２、１Ｄ９または８Ｇ２のエピトープ特異性と同
一または類似のエピトープ特異性をもつ抗体、またはその抗原結合断片）、およ
び哺乳動物のＣＣケモカインレセプター２またはそのリガンド結合バリアントを
産生する細胞を組み合わせることを含む、哺乳動物ＣＣ−ケモカインレセプター
２またはそのリガンド結合バリアントに結合する薬剤を検出または同定する方法
に関する。上記成分は、抗体または抗原結合断片がＣＣＲ２タンパク質またはそ
のリガンド結合バリアントに結合するのに適した条件下で組み合わせられ、該抗
体またはその断片による哺乳動物ケモカインレセプター２またはバリアントへの
結合を、本明細書記載の方法または適切な他の方法により、直接または間接的に
検出または測定する。適切な対照と比べて、形成された複合体の量が減少すれば
、薬剤が該レセプターまたはバリアントに結合することの指標となる。抗体また
はその断片は、放射性同位元素、スピン標識、抗原またはエピトープ標識、酵素
標識、蛍光基および化学発光基からなる群より選択された標識によって標識する
ことができる。これらのアッセイ、および同様のアッセイを用いて、ＣＣＲ２に
結合して、レセプター結合について、本明細書記載の抗体と競合する、リガンド
（例えば、ＣＣＲ２と相互作用するケモカインまたはＨＩＶ株）またはレセプタ
ー機能の阻害物質もしくは促進物質などの他の物質などの薬剤を検出することが
できる。
前記アッセイ法は、単独で、もしくはそれぞれを組み合わせて、または、適切
な別法と組み合わせて、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質に結合するリガンドまたは
他の物質、および哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質またはそのバリアントの阻害物質
または促進物質を同定するために用いることができる。本発明のインビトロ法は
、多数の試料を処理するハイスループットスクリーニング（例えば、９６穴方式
）を行うために調整することができる。ハイスループットスクリーニングを行な
うのに適した量の哺乳動物ＣＣＲ２（例えば、ヒトＣＣＲ２）を発現する細胞を
用いることができるため、このような細胞は、リガンドまたはレセプターに結合
する他の物質、および哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質の阻害物質または促進物質を
同定および／または単離するのに有用である。レセプターの発現は、さまざまな
方法でモニターすることができる。例えば、レセプターまたはその一部に結合す
る、本発明の抗体を用いて、発現を観察することができる。また、市販の抗体を
用いて、レセプタータンパク質またはポリペプチド（例えば、ＦＬＡＧでタグし
たレセプター）を含む、抗原またはエピトープでタグした融合タンパク質の発現
を検出することができ、所望の量を発現する細胞を選択することができる。
哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質またはその機能的バリアントをコードする核酸を
発現系に組み込んで、レセプタータンパク質またはポリペプチドを産生しうる。
哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質またはそのバリアントをコードする組換え核酸を含
有した構築物により、安定にまたは一過的にトランスフェクトされた細胞内、ま
たはレセプターを含む細胞画分（例えば、トランスフェクト細胞由来の膜画分、
レセプターを組み込んだリポソーム）の中で発現するレセプターなど、単離およ
び／または組換え哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質またはバリアントを、レセプター
機能を調べるために用いることができる。所望であれば、前記レセプターをさら
に精製することができる。レセプター機能の試験は、インビトロまたはインビボ
で行なわれうる。
ヒトＣＣＲ２などの、単離されたおよび／または組換え哺乳動物ＣＣＲ２タン
パク質またはその機能的バリアントを、本明細書に記載したように、レセプター
機能をモニターすることまたは他の適切な技術を用いることにより、化合物の効
果を判定する本方法で用いることができる。例えば、安定または一過的なトラン
スフェクタント（例えば、バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞、マウスＬ１／２プ
レＢ細胞の安定なトランスフェクタントなど）を、結合アッセイ法において用い
ることができる。例えば、ジャーカット細胞、または走化しうる他の適切な細胞
（例えば、マウスＬ１／２プレＢ細胞）の安定なトランスフェクタントを走化性
アッセイに用いうる。
本発明の方法によれば、化合物を個別にスクリーニングしたり、本明細書記載
の方法によって１種以上の化合物を同時に調べることもできる。化合物の混合物
を試験する場合、記載されたプロセスにより選択された化合物を適切な方法（例
えば、ＰＣＲ、シークエンシング、クロマトグラフィー、質量分析法）によって
、（適切に）分離し、同定することができる。試験対象の試料における１種以上
の化合物（例えば、リガンド、阻害物質、促進物質など）の存在も、これらの方
法によって決定することができる。
コンビナトリアル化学合成法または別法によって作出された化合物（例えば、
有機化合物、組換えまたは合成したペプチド、“ペプトイド”、核酸など）のラ
ージコンビナトリアルライブラリーを調べることができる（例えば、Ｚｕｃｋｅ
ｒｍａｎ，Ｒ．Ｎ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７：２６７８−２６８５（
１９９４）およびそこで引用されている文献を参照のこと；また、Ｏｈｌｍｅｙ
ｅｒ，Ｍ．Ｈ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０
：１０９２２−１０９２６（１９９３）、ならびに、タグされた化合物について
は、ＤｅＷｉｔｔ，Ｓ．Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ９０：６９０９−６９１３（１９９３）；Ｒｕｔｔｅｒ，Ｗ．Ｊ．ら、米国
特許第５，０１０，１７５号明細書；Ｈｕｅｂｎｅｒ，Ｖ．Ｄ．ら、米国特許第
５，１８２，３６６号明細書；およびＧｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．米国特許第４，８
３３，０９２号明細書参照）。本方法によりコンビナトリアルライブラリーから
選択された化合物がユニークなタグを持っていれば、クロマトグラフィー法によ
る各化合物の同定が可能になる。
１つの態様において、ファージディスプレイ法を用いる。例えば、哺乳動物Ｃ
ＣＲ２タンパク質またはその機能的バリアント、本発明の抗体またはその機能的
部分、およびポリペプチドを提示するファージ（例えば、ファージ、またはライ
ブラリーなどのファージのコレクション）を、抗体またはその一部が哺乳動物Ｃ
ＣＲ２タンパク質またはバリアントに結合するのに適した条件下（例えば、適切
な結合バッファー中）で組み合わせることができる。抗体またはその一部と競合
して、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質またはそのバリアントに結合するファージは
、標準的な技術または他の適切な方法を用いて検出または選択することができる
。結合したファージは、適切な溶出用バッファーを用いて、レセプターから分離
することができる。例えば、イオン強度またはｐＨを変えてファージの遊離をも
たらすことができる。または、溶出用バッファーは、遊離成分、または、化合物
の結合を破壊するように設計された成分（単数または複数）（例えば、結合を競
合阻害するリガンド、阻害物質、および／または促進物質など、提示されたペプ
チドがレセプターに結合するのを破壊できる１種以上の化合物）を含有する。任
意に、選択プロセスを繰り返したり、別の選択ステップを用いて、レセプターに
結合するファージをさらに富化することができる。提示されたポリペプチドの特
徴を（例えば、ファージＤＮＡの配列を決定して）調べることができる。同定さ
れたポリペプチドを産生させて、さらに結合について、および阻害物質または促
進物質の機能について調べることができる。かかるペプチドのアナログで、安定
性が増加したか、他の所望の性質を有するペプチドアナログを製造することがで
きる。
１つの態様において、ランダムな配列の核酸によってコードされたＮ末側ペプ
チドを有するコートタンパク質を含有する融合タンパク質を発現し提示するファ
ージを作出することができる。哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質またはバリアント、
および抗−ＣＣＲ２抗体またはその機能的部位を発現する適切な宿主細胞をファ
ージと一緒にして、結合したファージを選択し、回収して特徴を調べる。（例え
ば、Ｄｏｏｒｂａｒ，Ｊ．およびＧ．Ｗｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２
４４：３６１（１９９４）（Ｇタンパク質共役型レセプターとともに用いられる
ファージディスプレイ法を検討している）を参照のこと）。
哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質に結合するリガンドもしくは他の物質、またはそ
の阻害物質および／または促進物質の可能性のあるものが得られる他のソースと
しては、限定されないが、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３および／または
ＭＣＰ−４の天然、合成、または組換えバリアントなどのＣＣＲ２リガンドのバ
リアント、他の化学誘引物質またはケモカインなどの物質、それらのバリアント
、低分子量有機分子、他の阻害物質および／または促進物質（例えば、抗−ＣＣ
Ｒ２抗体、アンタゴニスト、アゴニストなど）、他のＧタンパク質共役型レセプ
ターリガンド、阻害物質および／または促進物質（例えば、アンタゴニストまた
はアゴニスト）、および、適切なレセプターペプチド、またはレセプター機能を
阻害することのできる適切なレセプターペプチドまたはアナログなど、哺乳動物
ＣＣＲ２レセプターの可溶性部分（例えば、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｒ．Ｂ．，国際公開
第９４／０５６９５号パンフレットを参照）などが挙げられる。
炎症のモデル
本発明の抗体および断片のインビボでの治療薬としての効果を判定するために
用いることのできるインビボの炎症モデルを利用することができる。例えば、ウ
サギ、マウス、ラット、モルモット、またはアカゲザルなど、適当な動物にケモ
カインと、哺乳動物ＣＣＲ２に反応する抗体またはその断片を皮内注射したとき
の白血球の浸潤をモニターすることができる（例えば、Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ、Ｊ
．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：５９−６５（１９９２）；Ｚａｃｈａｒ
ｉａｅ，Ｃ．Ｏ．Ｃ．ら、；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７１：２１７７−２１８
２（１９９０）；Ｊｏｓｅ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：８８
１−８８７（１９９４）参照）。一つの態様において、皮膚の生検を、白血球（
例えば、好酸球、顆粒球など）の浸潤について組織学的に判定する。別の態様に
おいて、走化性および血管外遊出能力をもつ標識された細胞（例えば、哺乳動物
ＣＣＲ２を発現する安定にトランスフェクトされた細胞で、111 Ｉｎで標識され
たもの）を動物に投与する。例えば、判定対象の抗体または断片は、リガンドま
たはアゴニストを試験動物に投与する前か後、またはこれと同時に投与すること
ができる。阻害物質不在下での浸潤の程度と較べた場合の、抗体存在下での浸潤
の程度の減少が阻害の指標となる。
診断および治療への適用
本発明の抗体および断片は、研究、診断、および治療への適用など、さまざま
な適用場面に役立つ。一つの態様において、適当な標識（例えば、蛍光標識、化
学発光標識、アイソトープ標識、抗原またはエピトープ標識、または酵素標識）
によって抗体を標識する。例えば、それらを用いて、レセプターまたはその一部
を単離および／または精製したり、レセプター構造（例えば、立体構造）および
機能を研究することができる。
さらに、本発明のさまざまな抗体を用いて、ＣＣＲ２を検出したり、例えば、
Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞）、単球、および／または
レセプター遺伝子でトランスフェクトされた細胞などの上でのレセプター発現を
測定することができる。したがって、診断や研究目的で、細胞分取（例えば、フ
ローサイトメトリー、蛍光標示式細胞分取）などに適用することもできる。
本発明の抗−ＣＣＲ２抗体は、診断に適用する上で価値がある。抗−ＣＣＲ２
抗体またはその断片は、抗−ＣＤ４を疾患の段階の診断指標として用いたときと
同様の方法で、ＨＩＶ感染個体におけるこのレセプターの発現をモニターするこ
とができる。
一般的に、診断アッセイでは、抗体またはその断片がＣＣＲ２に結合してでき
る複合体の形成を検出する必要がある。診断目的で、抗体または抗原結合断片を
標識したり、非標識化することができる。抗体または断片を直接標識することが
できる。放射性核種、蛍光剤、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害物質お
よびリガンド（例えば、ビオチン、ハプテンなど）などがあるが、これらに限定
されない、さまざまな標識を用いることができる。数多くの適切な免疫アッセイ
法が当業者に知られている（例えば、米国特許第３，８１７，８２７号；第３，
８５０，７５２号；第３，９０１，６５４号および第４，０９８，８７６号を参
照）。標識されていないときには、例えば、凝集アッセイ法など、適当な手段を
用いて、抗体または断片を検出することができる。非標識抗体または断片は、第
一の抗体と反応する標識抗体（例えば、二次抗体）など、抗体を検出するために
使用できる別の（すなわち、一つ以上の）適当な試薬（例えば、抗イディオタイ
プ抗体、または、非標識イムノグロブリンに特異的な別の抗体）、または他の適
当な試薬（例えば、標識されたプロテインＡ）と組み合わせて用いることもでき
る。
一つの態様において、本発明の抗体または断片は、酵素免疫測定法に利用する
ことができるが、その場合、本発明の抗体または断片、もしくは二次抗体は酵素
に結合している。哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質を含む生物学的試料を該抗体と合
わせると、抗体とＣＣＲ２タンパク質の間で結合が生じる。一つの態様において
、ヒト血液のように、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質を発現する細胞を含む試料を
該抗体と合わせると、抗体と、該抗体によって認識されるエピトープを含むヒト
ＣＣＲ２タンパク質を有する細胞との間で結合が生じる。これらの結合細胞を非
結合の試薬から分離し、例えば、試料を、酵素作用を受けると発色やその他検出
可能な変化を生じる酵素基質に接触させて、細胞に特異的に結合している抗体−
酵素結合物の存在を測定することができる。別の態様において、本発明の抗体を
標識せずに、該抗体を認識する標識二次抗体を加えることができる。
生物学的試料中に哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質が存在することを検出するとき
に使用するキットを調製することもできる。このようなキットには、哺乳動物Ｃ
Ｃ−ケモカインレセプター２または該レセプターの一部に結合する抗体またはそ
の機能的断片、および、抗体または断片とＣＣＲ２またはその一部との間の複合
体の存在を検出するのに適した一種類以上の補助試薬が含まれている。本発明の
抗体組成物は、単独、または、別のエピトープに特異的な別の抗体と組み合わせ
て、凍結乾燥した形で提供することができる。抗体は、標識されていてもいなく
てもよく、添加成分（例えば、トリス、リン酸および炭酸などの緩衝液、安定化
剤、賦形剤、殺生物剤、および／または、例えば、ウシ血清アルブミンなどの不
活性タンパク質）とともにキットに含まれうる。例えば、抗体は、添加成分との
凍結乾燥混合物として提供することができるが、もしくは使用者が組み合わせら
れるように添加成分を別に提供することもできる。一般的に、これらの添加物質
は、活性抗体量に基づいて約５重量％よりも少なく、通常は、全量で、抗体濃度
の約０．００１重量％以上存在する。モノクローナル抗体に結合できる二次抗体
を利用するとき、この抗体は、例えば、別のバイアル瓶または容器に入れて、キ
ット内に提供することができる。二次抗体が存在するときには、この二次抗体は
、一般的には標識されており、上記の抗体処方物と同様の方法で処方することが
できる。
同様に、本発明は、哺乳動物ＣＣＲ２またはこのレセプターの一部の細胞によ
る発現を検出および／または定量する方法で、抗体またはその断片が結合するの
に適した条件下で、細胞またはその画分（例えば、膜画分）を含む組成物を、哺
乳動物ＣＣＲ２またはこのレセプターの一部に結合する抗体またはその機能的断
片（例えば、１Ｄ９および／または８Ｇ２）に接触させ、結合をモニターする方
法にも関する。抗体と、ＣＣＲ２またはその一部との間で複合体を形成したこと
を示す、抗体の検出は、該レセプターの存在を示している。抗体の細胞への結合
は、例えば、「結合アッセイ」という見出しの下で上記したようにして測定する
ことができる。この方法を用いて、（例えば、血液、唾液などの体液などの試料
、またはその他適当な試料中の）個体由来の細胞上でのＣＣＲ２発現を検出する
ことができる。また、Ｔ細胞または単球の表面におけるＣＣＲ２発現量を、例え
ば、フローサイトメトリーによって測定することができ、発現量（例えば、染色
強度）が、病気感受性、病気の進行またはリスクと相関しうる。
ケモカインレセプターは、身体全体、特に、炎症部位に白血球が移動するとき
に機能する。脈管からの炎症細胞の遊出は、白血球および内皮細胞接着タンパク
質および細胞特異的化学誘引物質および活性化因子との相互作用を含む３段階の
プロセスによって制御されている（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｔ．Ａ．，Ｃｅｌｌ，７
６：３０１−３１４（１９９４）；Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．，Ｃｅｌｌ，６７
：１０３３−１０３６（１９９１）；Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．とＰｉｃｋｅｒ
，Ｌ．Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈ．ＤＣ），２７２：６０−６６（１９９
６））。これらは：（ａ）白血球のセレクチンと内皮細胞の炭水化物との間の低
親和性相互作用；（ｂ）白血球の化学誘引物質レセプターと化学誘引物質／活性
化因子との間の高親和性相互作用；ならびに（ｃ）白血球のインテグリンと、イ
ムノグロブリンスーパーファミリーの内皮細胞接着タンパク質との間の緊密な結
合である。白血球のサブセットが異なると、セレクチン、化学誘引物質レセプタ
ー、およびインテグリンの異なったレパートリーを発現する。さらに、炎症が起
きると、内皮接着タンパク質の発現、および化学誘引物質および白血球活性化因
子の発現が変わる。その結果、血管外部位に白血球を補充するときの選択性の制
御が非常に多様になる。第二の工程は、白血球化学誘引物質レセプターの活性化
が、セレクチン媒介性のセルローリング（cell rolling）からインテグリン媒介
性の緊密な結合への変化を引き起こすと考えられている点で重要である。この結
果、白血球が血管周囲部位に遊出する準備ができる。化学誘引物質／化学誘引物
質レセプター相互作用も、経内皮遊走、および組織内への局在化にとって重要で
ある（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３４：２
５５−２６６（１９９６）；Ｃａｒｒ，Ｍ．Ｗ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４：１
７９−１８７（１９９６））。この遊走は、炎症の中心に導く化学誘引物質の濃
度勾配によって誘発される。
ＣＣＲ２は、白血球輸送に重要な役割を果たしている。ＣＣＲ２は、一定の炎
症部位へのＴ細胞もしくはＴ細胞サブセット、または単球の遊走に関する重要な
ケモカインレセプターである可能性が高いため、抗−ＣＣＲ２ｍＡｂを用いて、
Ｔ細胞または単球の遊走、特に、自己免疫疾患またはアレルギー反応などのＴ細
胞機能異常、または、アテローム性動脈硬化症など、単球媒介性障害に関連する
遊走を阻害（減少または阻止）することができる。したがって、本発明の抗体お
よびその断片を用いて、研究や治療への適用場面で、レセプター機能を調節する
こともできる。例えば、本明細書記載の抗体および機能的断片は、（ａ）（例え
ば、リガンド、阻害物質、または促進物質の）レセプターへの結合、（ｂ）レセ
プターのシグナル伝達機能、および／または（ｃ）刺激機能を阻害（低下または
阻止）するための阻害物質として作用することができる。レセプター機能の阻害
物質として作用する抗体は、（例えば、立体構造の変化を生じさせることによっ
て）直接または間接的に、リガンドまたは促進物質の結合をブロックすることが
できる。例えば、抗体は、リガンドの結合を阻害することによって、または、（
リガンドの結合を阻害したり、阻害することなしに）脱感作することによってレ
セプター機能を阻害することができる。レセプターに結合する抗体は、レセプタ
ー機能のアゴニストとしても作用することができ、レセプターに結合して、レセ
プターのシグナル伝達機能および／または刺激機能（例えば、白血球の輸送）な
どのレセプター機能を開始または刺激する。
このように、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒトの患者）における白血球の輸
送を阻害する方法で、哺乳動物に本発明の抗体またはその機能的断片を有効量投
与することを含む方法を提供する。本発明の抗体または断片を投与すると、疾病
状態の改善または解消をもたらすことができる。
また、本発明の抗体またはその機能的断片は、ケモカインの結合によるＣＣＲ
２レセプターの活性化が関与している病気の治療に用いることができる。例えば
、抗体またはその機能的断片（例えば１Ｄ９および／または８Ｇ２またはその機
能的断片）を用いて、アレルギー、アテローム発生、アナフィラキシー、悪性腫
瘍、慢性および急性炎症、ヒスタミンおよびＩｇＥ媒介性のアレルギー反応、シ
ョック、および慢性関節リューマチ、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症，
同種移植片拒絶、線維症、喘息、および炎症性糸球体症を治療することができる
。
ＣＣＲ２レセプター機能の阻害物質（抗体またはその好適な断片など）を用い
て治療可能な、ヒトまたは他の生物種の病気または症状には以下のものがあるが
，それらに限定されない。すなわち：
● 喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患、過敏性肺炎、間質性肺疾患（Ｉ
ＬＤ）（例えば特発性肺線維症、または慢性関節リューマチと関連したＩＬＤ、
全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、全身性硬化症、シェーグレン症候群、
多発性筋炎または皮膚筋炎）等の呼吸器系統のアレルギー性疾患；アナフィラキ
シーまたは過敏性反応、（例えばペニシリン、セファロスポリンに対する）薬物
アレルギー、昆虫の刺毛アレルギー；クローン病および潰瘍性大腸炎等の炎症性
腸疾患；脊椎関節症；硬皮症；乾癬、および皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、
アレルギー性接触皮膚炎，蕁麻疹のような炎症性皮膚炎；血管炎（例えば壊死性
血管炎，皮膚血管炎および過敏性血管炎）を含む、炎症性またはアレルギー性の
疾患および症状；
● 関節炎（例えば慢性関節リューマチ、若年性関節リューマチ、乾癬性関節
炎）、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、若年性糖尿病、
糸球体腎炎等の腎炎，自己免疫性甲状腺炎、ベーチェット病等の自己免疫疾患；
● 同種移植片拒絶または移植片対宿主疾患、ならびに器官移植関連動脈硬化
症を含む移植片拒絶（例えば臓器移植における）；
● アテローム性動脈硬化症；
● 皮膚または器官の白血球の浸潤を伴う癌；
● 血管介入（例えば、外科的、治療的または機械的介入）により生じる狭窄
または再狭窄などの血管系、特に動脈、例えば、冠状動脈の狭窄または再狭窄、
ならびに脈管内膜過形成。例えば、再狭窄は、典型的には、血管の管腔の隙間を
狭くすることを引き起こし、限定されないが、血管移植手順、バルーン、アテレ
クトミー、レーザーまたは他の適切な方法（例えば、経皮的経管的冠状動脈形成
（ＰＴＣＡ））、ステント配置（例えば、機械的または生物学的血管内ステント
配置）、血管バイパス手順またはそれらの組み合わせにより行なわれる血管形成
を含む血管形成、ならびに狭窄または閉塞血管を治療するために使用される他の
手順により引き起こされる血管損傷により生じうる。
● 望ましくない炎症反応を阻害することで治療できる他の疾患または症状
（ＣＣＲ２媒介性疾患または症状を含む）には、再潅流障害，ある種の血液学的
な悪性腫瘍、サイトカインが誘発する毒性（例えば敗血症性ショック，内毒性シ
ョック）、多発性筋炎、皮膚筋炎、および全身性肉芽腫症を含む肉芽腫性疾患な
どがあるが、それらに限定されない
ＣＣＲ２レセプター機能の促進物質（抗体およびその断片を含む）を用いて治
療可能な疾患または症状には以下のものがあるが、それらに限定されない：
● たとえばＡＩＤＳのような免疫不全症候群に罹った個体、免疫抑制を生じ
る放射線治療、化学治療、自己免疫疾患の治療または他の薬物治療（例えば副腎
皮質ホルモン治療）を受けている個体における免疫抑制；およびレセプター機能
の先天的な不全または他の原因による免疫抑制。
本発明の抗−ＣＲＲ４抗体は、１種類以上のケモカインの結合をブロックする
ことができ、その結果、上述の障害をもたらす一つ以上の事象のカスケードの下
流をブロックすることができる。
ＣＣＲ２のアンタゴニストである抗体およびその機能的断片は、ＡＩＤＳ、な
らびに一定の炎症疾患に対する治療に使用されうる。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−
２は、ヒトにおける後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病因論的因子である。
ＡＩＤＳは、ＨＩＶ感染個体においてＣＤ４＋Ｔリンパ球の枯渇から部分的に生
じる。ＨＩＶ−１は、主としてＴリンパ球、単球／マクロファージ、樹状細胞、
および中枢神経系における小膠細胞に感染する。これらの細胞の全てはＣＤ４糖
タンパク質を発現し、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のレセプターとして役に立つ
。ＨＩＶの標的細胞への効率のよい侵入は、アミノ末端ＣＤ４ドメインへのウイ
ルスの外側のエンベロープ糖タンパク質であるｇｐ１２０の結合に依存している
。ウイルス結合の後、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質は、ウイルスと宿主
細胞膜の融合を媒介し、侵入プロセスを完了する。感染した細胞表面上で発現し
たＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質による膜融合は、細胞−細胞融合を導き
、シンシチウムをもたらす。
最近、ＣＤ４に加えて宿主細胞因子が、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質
媒介膜融合の効率を決定することが示唆されている。ＨＵＭＳＴＳＲ、ＬＥＳＴ
Ｒ、または「フュージョン（fusin ）」と呼ばれる７膜貫通レセプター（７ＴＭ
Ｒ）は、一連のＣＤ４発現細胞が実験室適合ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク
質により媒介される感染および細胞融合を補助することを可能にすることが示さ
れている（Ｆｅｎｇ，Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈ．ＤＣ）、２７２：８
７２−８７７（１９９６））。ＨＵＭＳＴＳＲに対する抗体は、実験室適合ＨＩ
Ｖ−１単離物による細胞融合および感染をブロックしたが、インビトロでのマク
ロファージ性一次ウイルスによる細胞融合および感染をブロックしなかった（Ｆ
ｅｎｇ，Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈ．ＤＣ）、２７２：８７２−８７７
（１９９６））。
一次臨床ＨＩＶ−１単離物の感染を促進するケモカインレセプターおよび関連
する分子の能力が、最近いくつかのグループにより報告されている（例えば、Ｂ
ａｔｅｓ，Ｐ．、Ｃｅｌｌ、８６：１−３（１９９６）；Ｃｈｏｅ，Ｈ．ら、Ｃ
ｅｌｌ、８５：１１３５−１１４８（１９９６）；Ｄｏｒａｎｚら、Ｃｅｌｌ
８５：１１４９−１１５８（１９９６））。これらの研究は、ＨＩＶ−１感染の
初期の段階におけるケモカインレセプターファミリーの様々なメンバーの関与が
、一次ＨＩＶ−１単離物のウイルス親和性およびβ−ケモカイン阻害を説明する
のを助けることを示した。
本発明はまた、哺乳動物ＣＣＲ２または該レセプターの一部に結合する抗体ま
たはその機能的断片の有効量を含有してなる組成物と細胞とを接触させることを
含む、哺乳動物ＣＣＲ２またはその一部を発現する細胞のＨＩＶ感染（例えば、
新しい感染および／またはシンシチウム形成）を阻害する方法を提供する。組成
物はまた、抗−ＣＣＲ３抗体、抗−ＣＣＲ５抗体および抗フュージョン抗体を含
むがこれらに限定されないＨＩＶに有効な１つ以上のさらなる薬剤を含有しうる
。
本発明の抗体の存在下での細胞へのＨＩＶの結合および／またはＨＩＶによる
細胞の感染を評価するために、種々の方法が使用されうる。例えば、レセプター
へのｇｐ１２０またはその一部の結合、ＨＩＶ感染およびシンシチウム形成を評
価するアッセイが使用されうる（例えば、Ｃｈｏｅ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ、８５：
１１３５−１１４８（１９９６）を参照のこと）。これらのプロセスを阻害する
本発明の抗体の能力は、これらまたは他の適切な方法を使用して評価されうる。
また、本発明は、哺乳動物のＣＣＲ２または該レセプターの一部に結合する抗
体またはその機能的断片の有効量を含有してなる組成物を患者に投与することを
含む、患者におけるＨＩＶを治療する方法を提供する。さらに、組成物はまた、
抗−ＣＣＲ３抗体、抗−ＣＣＲ５抗体および抗フュージョン抗体を含むがこれら
に限定されないＨＩＶに有効な１つ以上のさらなる薬剤を含有しうる。ＨＩＶを
治療するための抗体の治療的使用は、予防的使用を含む（例えば、ＨＩＶに曝露
されるかもしれないまたは曝露されているかもしれない患者の治療のため）。例
えば、ＨＩＶに曝露されるかもしれないまたは曝露されているかもしれない（例
えば、注射針を誤って刺してできた刺傷による）ヘルスケア提供者が、本方法に
より治療されうる。もう１つの例は、保護のない性的接触または保護の失敗の後
にウイルスに曝露された患者の治療である。
ＡＩＤＳにおいて、複数の薬物治療が最も有望であるようである。ＨＩＶ感染
を阻害する抗ケモカインレセプターアンタゴニストは、特に新しい細胞のウイル
ス感染をブロックすることにより、薬物治療養生法に追加されうる。したがって
、ヌクレオシドアナログ（例えば、ＡＺＴ、３ＴＣおよびｄｄＩ）および／また
はプロテアーゼ阻害物質等の１つ以上の他の治療用薬剤と組み合わせた本発明の
抗体または断片の投与が構想され、ＨＩＶ治療養生法への重要な追加を提供する
。１つの態様において、ヒト化抗−ＣＣＲ２ ｍＡｂは、新しい細胞の融合およ
び／または感染を妨げることにより、患者からウイルス荷重を低減する（すなわ
ち１つ以上の）治療用薬剤と組み合わせて使用される。かかる抗体は、周産期の
感染を防ぐのにも有用でありうる。
本発明のもう１つの側面は、ＣＣＲ２に結合する抗体またはその機能的断片の
有効量を個体に投与することを含む、個体におけるＨＩＶ感染を妨げる方法に関
する。本方法のＨＩＶ感染の阻止は、感染した個体における新しい細胞の感染を
阻止（低下または除去）するため、またはＨＩＶに曝露されるかもしれない、曝
露されているかもしれないもしくは曝露されている個体における感染を阻止する
ための治療を含む。例えば、ＨＩＶ感染個体、ＨＩＶ感染女性の胎児またはヘル
スケアワーカー等の個体は、本発明の方法により治療されうる。
投与法
本発明の一つ以上の抗体または断片は、適当な経路により、単独で、または別
の薬物もしくは薬剤と組み合わせて（その投与前に、同時に、もしくは投与後に
）、または外科的、機械的もしくは治療的介入の前に、同時に、もしくはその後
に、個体に投与することができる。例えば、本発明の抗体は、他のモノクローナ
ル抗体またはポリクローナル抗体と組み合わせて（例えば、ＣＣＲ３およびＣＣ
Ｒ５などであるがこれらに限定されない他のケモカインレセプターに結合する抗
体を組み合わせて）、または、予防処置または治療処置に用いる市販のガンマグ
ロブリン製剤およびイムノグロブリン製剤のような既存の血液血漿産物と組み合
わせて用いることもできる。本発明の抗体または断片は、抗生物質および／また
は抗菌剤と共に供される、別個に投与される組成物として用いることができる。
有効量の抗体または断片（すなわち１種類以上の抗体または断片）が投与され
る。有効量とは，ＣＣＲ２機能を阻害し、それによって、炎症反応またはＨＩＶ
感染を阻害するのに十分な量、または、上述のように、ＣＣＲ２機能を促進する
のに十分な量というように、投薬条件下で、所望の治療効果（予防も含む）を達
成するのに十分な量のことである。抗体または断片が単回用量または複数回用量
で投与されうる。投与量は、当該分野で既知の方法で決定され得、例えば、選択
された抗体または断片、被験者の年齢、薬物に対する感受性および耐性、ならび
に総合的な健康に依存する。ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体ならびに抗
原結合断片等の抗体およびその抗原結合断片は、しばしば他の型の治療より少な
い頻度で投与されうる。例えば、抗体の有効量は、毎日、毎週、２週間毎または
毎月の投与で約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５または１０ｍｇ／ｋｇの範囲でありう
る。
経口、摂食、局部、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、および皮下へ
の注射または注入）、吸入（例えば、気管支内、眼球内、鼻腔内または経口吸入
、点鼻）などであり、必ずしもこれらに限定されない、さまざまな投与経路が、
治療対象の疾患と症状に応じて可能である。他の適当な投与方法には、再充填可
能な、または生物分解性のデバイス（devices）や、緩徐放出ポリマーデバイス
などがある。本発明の医薬組成物は、他の薬剤との併用治療の一部として投与す
ることも可能である。
投与対象の抗体または断片の処方は、選択した投与経路および処方（例えば、
溶液、乳濁物、カプセルなど）によって様々である。投与対象の抗体またはその
機能的断片を含む、適当な医薬組成物を生理学的に許容できるビヒクル（vehicl
e）や担体に入れて調製することができる。抗体および／または断片の混合物を
用いることもできる。溶液または乳濁物の場合、適当な担体は、例えば、生理食
塩水や緩衝化媒体などの、水溶液もしくはアルコール／水溶液、乳濁物もしくは
懸濁物などである。非経口的なビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーの
デキストロース、デキストロース、および塩化ナトリウム、乳酸化リンガーのま
たは固定された油などがある。水、緩衝化された水、緩衝化生理食塩水、ポリオ
ール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコ
ールなど）、デキストロース液、およびグリシンなど、当業者には、さまざまな
適当な水性担体が知られている。静脈内ビヒクルとしては、さまざまな添加剤、
保存剤、または液剤、栄養素または電解質の補充剤などがある（一般的には、レ
ミントンの薬剤科学、第１６版、マック編、１９８０（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６ｔｈ，Ｅｄｉｔｉｏｎ
，Ｍａｃｋ，Ｅｄ．１９８０）を参照）。該組成物は、例えば、酢酸ナトリウム
、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および乳酸ナトリウムなど
のｐＨ調節剤、緩衝剤、および毒性調節剤のように、生理的条件に近づけるのに
必要な薬学的に許容される補助物質を任意に含むことができる。本発明の抗体お
よび断片は、当技術分野において既知の凍結乾燥および再構成の技術によって、
貯蔵するために凍結乾燥し、使用する前に適当な担体中で再構成することができ
る。選択した媒体中の活性成分の至適濃度は、所望の最終的な医薬製剤に応じて
、当業者に公知の手順によって経験的に決定される。吸入の場合には、抗体また
は断片を可溶化し、適当な投薬用容器（例えば、アトマイザー、ネブライザー、
または加圧エアロゾル投薬容器）に入れることができる。
ここで、以下の実施例によって、本発明をさらに具体的に説明するが、それら
は、いずれも制限するためのものではない。本明細書において引用されているす
べての文献が教示するところは、参照してここに組み込まれる。
実施例
実施例１
材料：
以下の材料を、示した供給源から得た：
ＰＥ−結合抗ＣＤ１６、ＰＥ−結合ストレプトアビジン、およびビオチン化抗
ヒトＩｇＥは、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）由来であっ
た。ＦＩＴＣ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）由来
であった。ＦＡＣＳ溶解緩衝液は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ（Ｍｏｕ
ｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）由来であり、［ 125Ｉ］−ＭＣＰ−1 は、ＮＥＮ
由来であった（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）。
細胞、細胞株、および細胞培養
１０％のＦｅｔａｌ Ｃｌｏｎｅ Ｉ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒ
ｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、５０ユニット／ｍＬのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、２ｍＭのＬ−
グルタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、および５５μＭのβ−メルカプトエタノー
ル（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０中に、マウスプレＢリ
ンパ腫細胞株Ｌ１／２を維持した。他の細胞株は、８００μｇ／ｍｌの活性Ｇ４
１８を補充した前記培養培地で増殖した、ＣＣＲ１（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．ら
、（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．、１３４：２５５−２６６）、ＣＣＲ５
（Ｗｕら、Ｎａｔｕｒｅ ３８４：１７９−１８３（１９９６））のいずれかを
発現するＬ１／２細胞のトランスフェクタントを含んだ。ＴＨＰ−１細胞（ＡＴ
ＣＣ番号ＴＩＢ２０２）をＡＴＣＣの指示に従って増殖した。Ｐｏｎａｔｈら、
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９７：６０４−６１２（１９９６）に記載のよ
うに、ＰＢＭＣをヘパリン処理血液から精製した。
ＣＣＲ２ｂ発現構築物および安定なトランスフェクタントの調製
ヒトＣＣＲ２ｂのコード領域（Ｃｈａｒｏら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：２７５２）を（Ｑｉｎ，Ｓ．ら（１９９６
）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２６：６４０−６４７）に記載のＲＴ−ＰＣ
Ｒ増幅により得た。ｃＤＮＡをオリゴ（ｄＴ）−プライミングを用いて作製し、
次に示すようにＣＣＲ２ｂ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０３９０
５；Ｃｈａｒｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２
７５２−２７５６（１９９４））の位置に対応する以下のプライマーセットを用
いるネスティッドＰＣＲにより、ＣＣＲ２ｂコード領域の増幅を達成した。
１） 5'プライマー： 5'-TGAGACAAGCCACAAGCTGAAC-3' （ヌクレオチド11〜32；
配列番号：１）；
3'プライマー：5'-TCTGTATTAGTACACACAGCCC-3' （ヌクレオチド1301〜12
80；配列番号：２）；
２） 5'プライマー： 5'-ATGCTGTCCACATCTCGTTCTCGG-3' （ヌクレオチド81〜10
4 ；配列番号：３）；
3'プライマー：5'-TTATAAACCAGCCGAGACTTCCTGCTC-3'（ヌクレオチド116
4 〜1137；配列番号：４）。
ＣＣＲ２Ｂ ｃＤＮＡコード領域をＣＤ５シグナルペプチドリーダー配列（Ａ
ｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ ６１：１３０３−１３１３（１９９０））を含むよう
に改変した。このペプチドの予測されるアミノ酸配列は下記である。
NH2-Met-Pro-Met-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Thr-Leu-Tyr-Leu-Leu-Gly-Met-
Leu-Val-Ala-Ser-Val-Leu-Ala...（配列番号：５）
鋳型としてＣＣＲ２ｂ ｃＤＮＡ、ならびにＢａｍＨＩ制限部位を含み、ＣＤ５
シグナルペプチド配列およびＣＣＲ２ｂのアミノ末端配列をコードする２つのオ
ーバーラップする５’プライマー、およびＣＣＲ２ｂコード領域の内部に位置す
る３’プライマーを使用するＰＣＲを用いる。
5' CD5 Seq1 プライマー
5'-GGGGATCCAGAAACCATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTG-3'（配列
番号：６）
5' CD5 Seq2 プライマー
5'-GCCACCTTGTACCTGCTGGGGATGCTGGTCGCTTCCGTGCTAGCGATGCTGTCCACATCTCGTTC-3'
（配列番号：７)
3' CCR2AB2プライマー - 5'-GACGACCAGCATGTTGCC-3' （配列番号：８；U03905
ヌクレオチド272〜255)
２７８塩基対の増幅断片をＢａｍＨＩおよびＡｐａＩで消化し、得られた２０
９塩基対の断片をＣＣＲ２ｂ ｃＤＮＡ（GenBank アクセッション番号U03905）
の２０６位のＡｐａＩ部位に挿入し、ＣＣＲ２の内因性５’塩基対断片を置換し
た。レセプターイニシエーターメチオニンの直前にＣＤ５シグナルペプチドリー
ダー配列を有するＣＣＲ２ｂをコードする得られた配列を、ｐｃＤＮＡ３（Invi
trogen, SanDiego, CA ）のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位に挿入し、哺乳動物
発現プラスミドｐＣＤ５ＭＣＰＲＢを作製した。ＣＤ５−ＣＣＲ２ｂ断片をｐＣ
ＤＥＦ３（Goldmanら、(1996) Biotechniques 21:1013-1015 ）のＢａｍＨＩ−
ＮｏｔＩ部位にサブクローン化し、この構築物をＣＣＲ２ｂＤＥＦ３と命名した
。この発現ベクターにおいて、挿入遺伝子の発現は、ＥＦ−１αプロモーターに
より駆動される。
エレクトロポレーションの前日に、５０ｍｌのＬ１／２細胞を４×１０5 個の
細胞／ｍＬで播種した。エレクトロポレーションの日に、１×１０6 ／ｍＬの密
度に増殖させた細胞を、遠心分離により培地から取り出し、８００μｌの室温エ
レクトロポレーション緩衝液（Zajac ら、DNA 7:509-513 ）に再懸濁させた。１
２０ｍＭのＬ−グルタミン酸（Sigma ）、７ｍＭの酢酸Ｍｇ（EM Science）、４
．３ｍＭのグルコース（Sigma ）、１７ｍＭのＫ Ｐｉｐｅｓ、ｐＨ６．９（Si
gma ）、１ｍＭのＥＧＴＡ（Sigma）、５ｍＭのＡＴＰ、ｐＨ７．０（Sigma ）
。２５μｇのＳｃａＩ線状化した、フェノール／クロロホルム／イソアミルアル
コール抽出し、イソプロパノール沈殿させたＣＣＲ２ｂＤＥＦ３プラスミドＤＮ
Ａを０．４ｃｍギャップのエレクトロポレーションキュベットに配置した。再懸
濁した細胞をキュベットに加え、シングルパルスを４５０ボルト、９６０μＦｄ
で印加した。次いで、細胞をキュベットから上記の１５ｍＬのＬ１／２増殖培地
を含有するＴ−７５フラスコに移し、３日間増殖させ、この時に、細胞を遠心分
離により培地から取り出し、さらに１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Gibco BRL
）および０．８ｍｇ／ｍＬの活性Ｇ４１８（Gibco BRL ）を補充したＬ１／２増
殖培地に再懸濁した。
走化性によるＣＣＲ２ｂ発現細胞の選択
トランスフェクトした細胞を、７日間増殖させ、この時に、新鮮な増殖培地に
１：２０に分割した。１６日目に、細胞を走化性により選択した。０．５％ＢＳ
Ａ（ＲＰＭＩ／ＢＳＡ）を補充したＲＰＭＩ１６４０中の６００μＬの１ｎＭ
ＭＣＰ−１を下部チャンバーに配置し、１００μｌのＲＰＭＩ／ＢＳＡ中の１×
１０6 個のＣＣＲ２ｂＤＥＦ３細胞を３．０ミクロン細孔の２４ウェル走化性プ
レート（BectonDickinson）の上部チャンバーに配置した。細胞を３７℃、５％
ＣＯ2 、加湿インキュベーター中で４時間２０分間走化（chemotax）させ、この
とき上部チャンバーを取り出した。このインキュベーション時間を実験時間に選
択した。なぜなら、それはＭＣＰ−１に応答する細胞が移動するのに充分な長さ
であるが、バックグラウンドを低く保つのに充分短いからであった。
ＦＡＣＳ分取によるＣＣＲ２ｂ発現細胞の第２の選択
膜を介して下部チャンバーに走化させた細胞を増殖させ、さらに無菌ＦＡＣＳ
分取によって精製した。１０００万個のＣＣＲ２ｂＤＥＦ３細胞を、遠心分離に
より培地から分離し、１％の熱不活化ウシ胎仔血清（「ＨＩ ＦＣＳ」）（Gibc
o BRL ）および２．５ｍＬの濾過滅菌した抗ＣＣＲ２ｂアミノ末端ペプチド抗体
上清５Ａ１１を補充した２．５ｍＬのＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）に再懸濁した。細
胞および抗体を混合し、氷上で３０分間インキュベートした。次いで、ＰＢＳ（
＋）（GibcoBRL ）で細胞を２回洗浄し、１％ＨＩ ＦＣＳを補充した５ｍＬの
ＰＢＳ（＋）中の濾過滅菌した、ＦＩＴＣ結合、アフィニティー精製Ｆ（ａｂ1
）2 ヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch Laboratories ）の１：２５
０希釈物に再懸濁させた。細胞を暗所で氷上にて３０分間インキュベートし、次
いでＰＢＳ（＋）（GIBCOBRL ）で２回洗浄した。細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕ
ｒ（登録商標）で分取し、最も明るい４％の細胞を収集した（ＦＬ１≧３×１０
2 ）。
分取した細胞を増殖させ、それらを上記と同じプロトコルを用いて再分取した
。最も明るい１％の細胞を収集した（ＦＬ１≧３×１０3 ）。
モノクローナル抗体産生
ＣＣＲ２ｂに対するｍＡｂを産生するために、発現のレベルが下がらないよう
に確認するためにトランスフェクタントを継続的にモニターした。トランスフェ
クタントにおけるレセプター発現を確認するために、抗ＣＣＲ２ｂ抗体上清５Ａ
１１および第２抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣを用いてＦＡＣＳ染色
を行った。
２０００万個のＣＣＲ２ｂＤＥＦ３．Ｌ１／２細胞をＲＰＭＩ１６４０（Gibc
o BRL ）において洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０＋０．２ｍｇ／ｍＬのマイトマイシ
ンＣ中で３７℃にて３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ（＋）
で２回洗浄し、０．５ｍＬのＰＢＳ（＋）中の２×１０7 個の細胞をＣ５７ＢＬ
／６雌マウスに腹腔内に注射した。これを２週間間隔で２回以上繰り返した。４
回目に、２×１０7 個の細胞を０．２５ｍＬに再懸濁し、静脈内に注射した。静
脈注射の３日後、マウスを屠殺し、脾臓を取り出し、記載のように（Current Pr
ococols inImmunology, John Wiley and sons, New York, 1992）細胞をＳＰ２
／０細胞株と融合させた。
このセットのマウスを、２つの異なる細胞株および合成ペプチドで何度も予め
免疫し、ＣＣＲ２陽性細胞を染色した抗体はいくつかの融合からは生じなかった
。高レベルのＣＣＲ２ｂを発現するＣＣＲ２ｂＤＥＦ３．Ｌ１／２細胞株を用い
た上記４つの免疫化は、上記抗体を得るために重要であった。
限界希釈によるＣＣＲ２トランスフェクタントの単一細胞クローンの選択
マウスに最後の注射を与えた後、２回分取した細胞を再び増殖させ、次いでそ
れらを限界希釈によりさらに精製した。細胞を、９６ウェルプレート中でウェル
当たり１個および０．５個の細胞でプレーティングした。ウェル当たり０．５個
の細胞希釈物からサブクローン化細胞を増殖させ、抗ＣＣＲ２ｂ抗体上清５Ａ１
１および二次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣを用いた間接免疫蛍光Ｆ
ＡＣＳ解析によりＣＣＲ２ｂ発現について試験した。手順は、染色容量が１００
μｌである以外は前記と同じであった。４つの陽性を選択し、凍結させた。
陽性モノクローナル抗体の同定
ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）（Becton Dickinson & Co., Mountain View, CA
）を用いた免疫蛍光染色解析を用いて、ＣＣＲ２ｂレセプターと反応性であるモ
ノクローナル抗体を同定した。ハイブリドーマ培養上清を、二次抗体としてヤギ
抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣを用いて９６ウェル形式でアッセイした。ＣＣＲ２ｂ
ＤＥＦ３．Ｌ１／２細胞を用いてＣＣＲ２ｂと反応性であるモノクローナル抗体
を同定し、非トランスフェクトＬ１／２細胞を用いて、他の細胞表面タンパク質
と反応性であるモノクローナル抗体を除去した。
ＦＡＣＳ染色−培養細胞
培養トランスフェクト細胞株の染色のために、５０μｌ中の０．５×１０6 個
の細胞を９６ウェルポリスチレンＶ底プレート中のＰＢＳ＋１％ＦＣＳに再懸濁
した。５０μｌの一次抗体上清またはＨＴ培地（陰性対照）を添加し、サンプル
を４℃で３０分間インキュベートした。１００μｌのＰＢＳを添加し、細胞を遠
心分離によりペレット化し、ＰＢＳで１回洗浄した。ペレットを、ＦＩＴＣ結合
ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：２５０希釈物）を含有する１００μｌのＰＢＳ＋
１％ＦＣＳに再懸濁し、暗所で４℃にて３０分間インキュベートした。細胞をＰ
ＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Bect
on-Dickenson）細胞を用いたＦａｃＳｃａｎサイトメーターでフローサイトメト
リーにより解析し、同じ日に解析しない場合には、細胞をＰＢＳ／１％ホルムア
ルデヒドで固定化した。モノクローナル抗体１Ｄ９および８Ｇ２株ＣＣＲ２トラ
ンスフェクタントであるが、ＣＣＲ１またはＣＣＲ５トランスフェクタントでは
ない（Ｆｉｇｕｒｅ１）。
ＦＡＣＳ染色−全血
１００μｌの全血を１００μＬの１Ｄ９抗体ハイブリドーマ上清またはＨＴ培
地（陰性対照）と混合し、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで１回洗
浄した後、１００μＬのＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：２５０希釈
物）を各サンプルに添加し、暗所で４℃にて３０分間インキュベートした。次い
で、２色染色を行う場合、サンプルをＰＢＳで１回洗浄し、そうでない場合には
ＰＢＳで２回以上洗浄した。２色染色のために、１回の洗浄の後、５μｌのマウ
ス血清を細胞ペレットに添加し、混合し、暗所で４℃にて５分間インキュベート
した。二次一次抗体（または陰性対照としてＰＢＳ）を添加し（１０μｌの抗Ｃ
Ｄ１６、抗ＩｇＥの１００μｌの１：２００希釈物）、暗所で４℃にて３０分間
インキュベートした。次いで、サンプルをＰＢＳで１回洗浄し、１００μＬのス
トレプトアビジンＰＥ（１：２００のＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）に再懸濁し、暗所で
４℃にて１５分間インキュベートした。２ｍｌのＦＡＣＳ溶解緩衝液を各サンプ
ルに添加することにより赤血球を溶解させ、暗所で室温にて１５分間またはサン
プルが透明になるまでインキュベートした。細胞を、遠心分離によりペレット化
し、全ての２００μｌの上清を吸引した。サンプルをフローサイトメトリーによ
り解析し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Becton-Dickenson）を用いるＦａ
ｃＳｃａｎにおいてフローサイトメトリーにより解析した。ＣＣＲ２ｂは、ほと
んどの単球、リンパ球のサブ集団および顆粒球のサブセットにおいて発現される
（Ｆｉｇｕｒｅ２）。ＣＣＲ２ｂは、末梢血（好塩基球）中のＩｇＥ陽性集団に
おいて発現される（Ｆｉｇｕｒｅ３）。
ＭＣＰ−１結合アッセイ
ＭＣＰ−１結合を、２．５μｇのＴＨＰ−１膜タンパク質または５０００，０
００個のＰＢＭＣおよび０．１ｎＭの［125 Ｉ］−ＭＣＰ−１のいずれかを含有
する最終容量０．１ｍｌの５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１ｍＭのＣａＣ
ｌ2 、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．０２％のアジ化ナトリウム、０．５％のＢＳＡ
（ＨＢＢ）中で行った。競合結合実験を、種々の濃度の非標識ＭＣＰ−１、１Ｄ
９抗体、または陰性対照ＩｇＧ２ａを含ませることにより行った。非特異的結合
を、２５００倍過剰の非標識ＭＣＰ−１の添加後に測定した。サンプルを室温で
６０分間インキュベートし、結合トレーサーおよび遊離トレーサーを、０．３％
ポリエチレングリコールに予浸した９６ウェルＧＦ／Ｂフィルタープレートによ
り濾過することにより分離した。フィルターを、０．５ＭのＮａＣｌをさらに補
充したＨＢＢで洗浄し、乾燥させ、液体シンチレーション計数により結合した放
射活性の量を測定した。ｍＡｂ １Ｄ９は、約０．００４μｇ／ｍｌのＩＣ50（
約０．０２ｎＭ；Ｆｉｇｕｒｅ４）でＴＨＰ−１細胞膜への［125 Ｉ］ＭＣＰ−
１の結合を阻害し、約０．０４μｇ／ｍｌのＩＣ50（約０．２ｎＭ；Ｆｉｇｕｒ
ｅ５）で新鮮なＰＢＭＣへの［125 Ｉ］ＭＣＰ−１の結合を阻害する。
ＰＢＭＣの走化性
走化性を、３μｍ細孔サイズの９６ウェル走化性プレート（Neuroprobe, Cabi
n John, MD）を用いてアッセイした。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠
心分離を用いた標準的な方法により単離したＰＢＭＣを、ＰＢＳ／０．５％ＢＳ
Ａで洗浄し、次いで１０×１０6 細胞／ｍｌの最終濃度で走化性アッセイ培地（
ＨＢＳＳ／１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／０．５％脂肪酸遊離ＢＳＡ）に再懸濁した。
細胞を、種々の濃度の抗ＣＣＲ２抗体、１Ｄ９、または非特異的マウスＩｇＧ２
ａとともに、走化性アッセイ培地中で室温で２０分間プレインキュベートした。
抗体の同一の希釈物をケモカインと混合し、３０μｌの混合物を走化性プレート
の各々の下部ウェルに添加した。下部ウェルをメンブレンで覆い、２５μｌの細
胞および抗体混合物をフィルターの上面に添加する。前記プレートを５％ＣＯ2
インキュベーター中で３７℃で約８０分間インキュベートする。移動の完了時に
、メンブレンを取り出し、下部ウェルを有するプレートを−８０℃で３０分間イ
ンキュベートし、内容物を凍結させる。プレートを、３７℃で１０分間解凍する
。供給会社により提供される溶解緩衝液中のＣｙＱｕａｎｔ試薬（Molecular Pr
obes, Eugene, OR）の１：４００希釈物の６μｌを各ウェルに添加し、細胞移動
を、ＣｙｔｏＦｌｏｕｒ蛍光プレートリーダーを４８５ｅｘ／５３５ｅｍで用い
て測定される蛍光強度により示されるように定量する。ｍＡｂ １Ｄ９は、新鮮
なＰＢＭＣのＭＣＰ−１誘導性走化性を阻害するが、ＲＮＴＥＳ誘導性走化性を
阻害しない（Ｆｉｇｕｒｅ６Ａおよび６Ｂ）。新鮮なＰＢＭＣのＭＣＰ−１誘導
性走化性の阻害は、１０μｇ／ｍｌ（約４０ｎＭ）で示された。
実施例２
モノクローナル抗体１Ｄ９のヒト化
１Ｄ９モノクローナル抗体は、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を強力に惹
起する、ヒトにおける免疫原であるようである。このＨＡＭＡ応答は、通常、身
体からのマウスモノクローナル抗体の迅速なクリアランスを生じ、従って、１Ｄ
９モノクローナル抗体が有し得るいかなる治療効果をも制限する。従って、この
抗体のヒトにおける免疫原性を減少し、その治療可能性を最大化する試みにおい
て、１Ｄ９マウスモノクローナル抗体のヒト化を行った。以下の実施例は、１Ｄ
９アミノ酸配列データの詳細な解析、マウス１Ｄ９Ｆv ドメインの分子モデルの
構築、および前記マウス抗体の首尾良いヒト化の設計ストラテジーを提供する。
この設計ストラテジーは、κ軽鎖可変（ＶK ）領域および重鎖可変（ＶH ）領域
の両方の多数のヒト化バージョンの設計を生じた。全体で、ヒト化ＶH 領域は、
選択されたヒトＶH 領域のＦＲ中に１６個までのアミノ酸変更を含んでいた。こ
れらの変更は、ヒト化ＶH 領域の４つのバージョンに細分化された。さらに、選
択されたヒトＶK 領域のＦＲ中の１２個のアミノ酸は、同様に設計されたヒト化
ＶK 領域の４つのバージョンに含まれた。
マウス１Ｄ９κ軽鎖可変領域の配列解析
１Ｄ９ＶK 領域のアミノ酸配列（Ｆｉｇｕｒｅ７）を、他のマウスκ軽鎖可変
領域、およびさらに可変領域がＫａｂａｔデータベース（Kabat ら、Sequence o
f proteins ofimmunological interest, 第５版、米国保健福祉省、米国政府出
版局（1991））に細分化されたサブグループのコンセンサス配列と比較した。こ
の解析から、１Ｄ９ＶK 領域は、マウスκサブグループＩＩのマウスコンセンサ
ス配列と最も密接にマッチすることが見出された（同一性＝７９．４６％、類似
性＝８２．１４％）。１Ｄ９κ軽鎖のＦＲのみがマウスサブグループＩＩにおい
て比較された場合、同一性パーセンテージは、８７．５％に上昇し、一方、類似
性パーセンテージは８８．７５％に上昇した。さらに、マウス１Ｄ９ＶK 領域は
、７０／３マウスＶK 生殖系列遺伝子（Ｆｉｇｕｒｅ１３）の翻訳に対して良好
な相同性を示した。全て合わせると、上記証拠は、１Ｄ９配列がマウスＶK 領域
の典型であったことを明確に証明した。
マウス１Ｄ９重鎖可変領域の配列解析
１Ｄ９ＶH 領域（Ｆｉｇｕｒｅ８）の類似性解析により、それがＫａｂａｔデ
ータベース（Kabatら、Sequence of proteins of immunological interest, 第
５版、米国保健福祉省、米国政府出版局（1991））のマウス重鎖サブグループＩ
ＩＩｃのコンセンサス配列に最も密接にマッチすることが見出された。１Ｄ９の
マウス重鎖可変領域アミノ酸配列とマウスサブグループＩＩＩＣのコンセンサス
配列との間の同一性は、７０．９４％であると測定され、一方、類似性は７６．
０７％であると計算された。１Ｄ９ＶH 領域のＦＲのみをマウスサブグループＩ
ＩＩと比較した場合、同一性パーセンテージは７５．８６％に上昇し、一方、類
似性は８０．４６％に上昇した。マウス１Ｄ９ＶH 領域はまた、とりわけ、ＭＬ
Ｒ−ＲＦ２４ＢＧマウスＶH 生殖系列遺伝子の翻訳物に対して良好な相同性を示
した（Ｆｉｇｕｒｅ１４）。従って、上記証拠は、１Ｄ９配列が、マウスＶH 領
域の典型であることを証明した。
１Ｄ９ドメインの分子モデリング
１Ｄ９抗体のヒト化可変領域の設計を補助するため、マウス１Ｄ９ＦV 領域お
よび８個のＣＤＲグラフトバリアントの一連の分子モデルを構築した。これは、
Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＯＭＬ）により供給され
、利用されるＡｂＭ分子モデリングパッケージを用いて行った。Ｂｒｏｏｋｈａ
ｖｅｎデータベースから入手可能な抗体Ｘ線結晶構造を、ＡｂＭを用いたモデリ
ングのために使用できるようにフォーマットした。
１Ｄ９可変領域のＦＲを、類似した、構造解析されたイムノグロブリン可変領
域のＦＲにおいて設計した。同定されたアミノ酸側鎖をそれらの本来の配向で維
持しながら、ミスマッチした側鎖を本来の１Ｄ９ＦV のように置換した。Ｆａｂ
Ｂｖ０４−０１ ＶK 領域のＦＲの骨格原子を、ＶK 鎖およびＶH 鎖の両方に
ついての１Ｄ９のＦｖフレームワーク領域の設計に使用した。Ｆａｂ Ｂｖ０４
−０１の配列は、マウス１Ｄ９の可変領域配列およびそのヒト化バリアントへの
良好な対応物（match）であった。Ｆａｂ Ｂｖ０４−０１とマウス１Ｄ９およ
びヒト化配列との間の同一性は、ＶK については７６％〜７８％の範囲であり、
ＶH 配列については７４％〜８４％の範囲であった。既知配列を有するＡｂＭの
試験により、ＦＲ骨格相同性が任意のモデルの質において重要な因子であること
を示した。なぜなら、モデルである配列にあまりマッチしないＦＲ構造の使用が
ＣＤＲループの位置および配向に対して有意に不都合に影響しうるからである。
ＣＤＲ Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１およびＨ２の骨格構造のために、全てのモデ
ルのコンホメーションを、Ｆｉｇｕｒｅ９および１０に示されるクラスを用いて
、改変することなくＡｂＭによって使用される基準分類から取得した。
Ｌ１ループの骨格構造のために、マウス１Ｄ９ ＶＫ領域のループコンホメー
ションを、ＡｂＭに由来する基準クラス４から取得した。この基準分類は、Chot
hia および彼の同僚達（ChothiaおよびLesk, J.Mol.Biol. 197:901 (1987); Ch
othia ら、Nature34:877 (1989); Tramontanoら、J.Mol.Biol. 215:175 (1990)
; およびChothia ら、J.Mol.Biol.227:799 (1992)）によって記載されたものを
基礎とするが、それらは、本来の文献が公開されてから利用可能になった構造を
考慮して改変された。既知のループ構造のＡｂＭ予測の性能の試験により、この
方法で作製されたＣＤＲループが非常に正確に、すなわち、１〜１．５Å ＲＭ
Ｓ偏差内に通常設計されることを示した。
１Ｄ９ＶH 領域内のＨ３ループは、６残基長で比較的短い。これは、Ｂｒｏｏ
ｋｈａｖｅｎデータバンクのＸ線構造からの骨格コンホメーションについてのサ
ーチを用いて設計した。このような短いループに関して、ループに利用可能なル
ープコンホメーションスペースを飽和するのに充分な既知のＸ線構造に由来する
ループコンホメーションがある。新規抗体の構造を有するＡｂＭによって作製さ
れる予測の試験（ここで前記構造は、前記プログラムによって使用されるデータ
ベースに含まれていない）は、このサイズのＣＤＲ Ｈ３ループに関して、正確
度は、少なくとも２．０Åであるようである。
明かな立体衝突について前記モデルの全体を調整した後、それを、MACROMODEL
において実行されるようなエネルギー極小化に供し、不都合な原子接触を軽減し
、ファンデルワールス力および静電気的相互作用を最適化する。
ヒト化１Ｄ９ＶK 抗体バリアントの設計
１Ｄ９抗体のヒト化可変領域の設計の第１ステップは、ヒト化１Ｄ９ＶK 領域
の基礎として働きうるヒトκ軽鎖可変領域の選択であった。このプロセスの補助
として、１Ｄ９ＶK 領域を、Ｋａｂａｔ（Kabat ら、Sequences ofproteins of
tmmunologicalinterest 、第５版、米国保健福祉省、米国政府出版局 (1991)
）により規定される４つのヒトκ軽鎖可変領域サブグループのコンセンサス配列
と最初に比較した。マウス１Ｄ９軽鎖可変領域は、ヒトκ軽鎖サブグループＩＩ
のコンセンサス配列に最も類似し、これは全可変領域にわたって７６．２％同一
およびＦＲ単独内で８２．５％の同一性を示した。類似性に関して測定した場合
、これらの値は、全体で７９．７％の同一性およびＦＲ単独内で８５．０％に上
昇した。結果的に、これは、一般に、κサブグループＩＩに由来するヒトκ軽鎖
可変領域配列に良好にマッチするようであった。
次いで、マウス１Ｄ９ＶK を、公に入手可能なヒト可変領域の個々の配列の記
録された例の全てと比較した。Ｆｉｇｕｒｅ１５は、この解析を通じて同定した
マウス１Ｄ９ＶK 領域に対する最良の１７個の対応物を示す。全体で、サーチア
ルゴリズムは、マウス１Ｄ９ＶK 領域に対する最良のマッチとして、ヒトＶK 領
域抗体０３６５２１（Rheinnecker ら、Journal of Immunology. 157 (7):2989-
97 (1996) ）を選択した。しかし、この抗体に関する原典となる論文の総説によ
り、マウスオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリドーマに由来する遺伝子を
レスキュー（rescue）するために使用されたことが示された。従って、Ｋａｂａ
ｔデータベースにより示唆されるように、この抗体が実際にマウス抗体でありヒ
ト抗体でないことを意味した。従って、データベース検索により選択されたマウ
ス１Ｄ９ＶK 領域への次の最良の対応物は、抗体ＨＦ−２１／２８に由来するヒ
トＶK 領域であった（Kabat データベースＩＤ番号005056；Chastagnerら、Gene
. 101 (2):305-6(1991)）。ヒト配列は、１Ｄ９ＶK 領域に対して７９．３％の
全体の同一性、およびＦＲ単独内で８５．０％の同一性を有していた。類似性に
関して測定した場合、これらの値は、全体で８３．９９％およびＦＲ単独内で８
７．５％に上昇した。さらに、鍵となるＦＲアミノ酸は、他の候補ヒトκ軽鎖可
変領域におけるよりも保存的にＨＦ−２１／２８ＶK 領域において保存されてい
た。従って、ＨＦ−２１／２８κ軽鎖可変領域ＦＲを、１Ｄ９抗体κ軽鎖可変領
域のヒト化のためのヒトアクセプター配列として選択した。
不運なことに、ヒトＨＦ−２１／２８ＶK 領域のＦＲ４の最後の残基（Kabat
ナンバリングシステムに従って１０７位）は、Ｋａｂａｔデータベースまたはこ
の可変領域配列を最初に単離した著者によって規定されていなかった。それゆえ
、Ｋａｂａｔヒトκ軽鎖サブグループκ−ＩＩ（Kabat ら、Sequences of prote
ins ofimmunological interest 、第５版、米国保健福祉省、米国政府出版局 (
1991) ）によって記載された可変領域配列内のこの位置で最も一般に見出される
アミノ酸を挿入することを決めた。従って、Ｋａｂａｔヒトκ軽鎖サブグループ
K −ＩＩの８５．７％の配列がこの位置にリジンを有することを見出したＫａｂ
ａｔデータベースの解析に基づいてＦＲ４の１０７位にリジンを加えた。次いで
、これは、１Ｄ９κ軽鎖の第１のヒト化バージョン（１Ｄ９ＲＫA ）の基礎とな
り、これは１Ｄ９ＶK 領域のＣＤＲおよびＨＦ−２１／２８ＶK 領域のＦＲを本
質的に含んでいた。Ｆｉｇｕｒｅ１９Ａ〜１９Ｃは、ヒト化１Ｄ９ＶK 領域のＣ
ＤＲ移植バージョンのアミノ酸配列を規定する。
設計プロセスの次の工程は、これらのアミノ酸残基のいずれかが抗原への結合
に不都合に影響するようであるかどうかを決定するために、ヒトアクセプターＨ
Ｆ−２１／２８ＶK 領域ＦＲのアミノ酸配列を研究することであった。これは、
抗原との相互作用を介して直接的に引き起こされうるか、またはＣＤＲループの
確認もしくは配向を変更させることにより間接的に引き起こされうる。これは、
１Ｄ９可変領域、すなわち、ＶK およびＶH 領域の両方のモデルが利用可能であ
ることによってのみ可能になる困難なプロセスであった。それにもかかわらず、
抗原結合に影響するようであるマウス１Ｄ９ＦＲ中の任意のアミノ酸を、次いで
、ヒト化１Ｄ９抗体における転換のために考慮した。マウス残基を転換する決定
において、以下の点に取り組んだ：
・高度可変性ループの規範的構造（Chothia およびLesk, J.Mol.Biol.197:901
(1987);Chothiaら、Nature 34:877 (1989); Tramontanoら、J.Mol.Biol. 215:
175 (1990); およびChothiaら、J.Mol.Biol. 227:799 (1992)）が保存されてい
ることが非常に重要であった。従って、ヒト化１Ｄ９可変領域内に、これらの規
範構造の一部である全てのマウスＦＲ残基を保存することが重要であった（Ｆｉ
ｇｕｒｅ９および１０）。
・１Ｄ９抗体可変領域の配列を、他のマウス抗体に由来する類似した配列と比
較して、抗原結合に重要な役割を示しうる異常なまたは稀な残基を同定した。次
いで、これを１Ｄ９可変領域遺伝子のマウスモデルを用いて調査した。
・前記モデルの直接解析もまた行い、ヒト化ＦＲに存在しない任意の他のマウ
スＦＲ残基がなんらかの方法で抗原結合に影響しうるかどうかを試し、予想した
。
・κ軽鎖および重鎖の可変領域についての個々のヒトアクセプター配列と前記
アクセプター配列が属するヒト可変領域サブグループのコンセンサス配列との比
較もまた行った。ヒトドナー配列内の任意の特異的アミノ酸の同定は重要である
。なぜなら、これらが不都合に影響を受けた抗原結合を有しうるからである。
・選択されたヒト軽鎖および重鎖の可変領域は、２つの異なるヒト抗体に由来
しうるので、ドナーおよびアクセプターの両方のκ軽鎖可変領域のドメイン間充
填残基の注意深い解析が行われるべきである（Chothia ら、J.Mol.Biol. 186:65
1 (1985)）。これは、ヒト化１Ｄ９抗体のＣＤＲループ構造のコンホメーション
に関わりなく、この領域におけるいかなる誤った充填も抗原結合の際に劇的な影
響を有しうるからであった。
ドナーマウス１Ｄ９ＶK 領域のＦＲとアクセプターヒトＨＦ−２１／２８ＶK
領域との間に１２アミノ酸の差異が存在するが、２個のマウス残基のみが、それ
らをヒト化ＦＲに保存するのに充分に、結合親和性のために重要であると考えた
。１Ｄ９ＲＫB に導入された第１のＦＲ変更は３６位に位置した。この残基は補
助（Vernier）残基（Foote and Winter, J.Mol.Biol. 224:487 (1992)）であり
、Chothia および彼の共同研究者により規定されたＬ１ループ構造の鍵となる構
造決定残基（ChothiaおよびLesk, J.Mol.Biol. 197:901 (1987); Chothia ら、
Nature 34:877(1989); Tramontanoら、J.Mol.Biol. 215:175 (1990); Chothia
ら、J.Mol.Biol.227: 799 (1992) ）であると予想される。両方の残基が疎水性
であるが、ヒトＰｈｅは、この位置でかさ高く（bulkier ）、この位置にＬｅｕ
およびＰｈｅを有するＸ線構造は、Ｐｈｅが存在する場合、立体障害により３４
Ａｓｎで側鎖が反対の方向を向くことを示している。従って、それは１Ｄ９κ軽
鎖の首尾良いヒト化に重要であると考えられた。
１Ｄ９ＲＫB ヒト化バージョンに取り込まれた第２の変更は、残基３７、すな
わち、Ｇｌｎ３７Ｌｅｕであった。これは、保存的変更であるが、ＣＤＲ１の基
礎の高度に保存された領域に生じた。このバージョンにこのマウスＬｅｕ残基を
保存することにより、３６位のマウスＬｅｕ残基のそばにヒト化抗体の親和性が
保存されうる。
ヒト化ＶK 領域の２つの他のバージョンをまた、ヒト化１Ｄ９抗体のＦＲを操
作することの構造のおよび結合親和性の結果を探索するための構築物のために考
慮した。１Ｄ９ＲＫc は、変異Ｇｌｎ１００Ｇｌｙ以外は１Ｄ９ＲＫB と本質的
に同一であった。これらの２つの残基の間の分子かさ高さには劇的な差異があり
、従って、このバージョンは、抗体構造および全体の抗体親和性における、作り
なおしたヒトκ軽鎖のＦＲに対するこの変更の結果を探索するために作製した。
１Ｄ９ＲＫD は、１Ｄ９ＲＫC に記載された変更を含み、さらに、ＦＲ変更Ｇｌ
ｎ１７Ｈｉｓを含んでいた。ＧｌｎおよびＨｉｓは、類似したサイズであり、両
方とも弱い極性であるが、この位置のマウス残基（Ｈｉｓ）は、全てのマウスＶ
K 配列間で非常に稀であり（全体で０．０７％であるが、Ｋａｂａｔサブグルー
プＩＩ配列では見られなかった）、いかなるヒトＶK 配列でも見られなかった。
逆に、Ｇｌｎ残基は、マウス（全体で１６．１６％、マウスＫａｂａｔサブグル
ープＩＩ配列で６．１２％）およびヒト（全体で５．００％、ヒトＫａｂａｔサ
ブグループＩＩ配列で３９．７％）配列の両方においてこの位置でより一般的に
見られる。従って、この位置でＨｉｓが単純に稀なことは、結合に重要であり得
るが、分子モデリングデータからはこのことを支持する明かな証拠はない。上記
で提案された全てのヒト化１Ｄ９抗体ＶK 領域バリアントのアミノ酸配列の記載
は、Ｆｉｇｕｒｅ１１に与えられている。
ヒト化１Ｄ９ＶH 抗体バリアントの設計
再び、マウス１Ｄ９抗体のヒト化ＶH 領域の設計における第１の工程は、ヒト
化１Ｄ９ＶH 領域の基礎として働きうるアクセプターヒト重鎖可変領域の選択で
あった。１Ｄ９ＶH 領域を最初に３つのヒト重鎖可変領域サブグループのコンセ
ンサス配列と比較した場合、６９．２３１％の全体の同一性およびＦＲ単独間で
の７８．１６１％の同一性で、ヒト重鎖サブグループＩＩのコンセンサス配列と
最も類似することを見出した。類似性に関して測定した場合、これらの値は、全
体で７４．３５９％およびＦＲ単独内で８２．７５９％に上昇した。
次いで、マウス１Ｄ９ＶH 領域を、公に入手可能なヒト可変領域の個々の配列
の全ての記録された例と比較した。Ｆｉｇｕｒｅ１７Ａ〜Ｂは、この解析を介し
て同定したマウス１Ｄ９ＶH 領域に対する２４個の最良の対応物を示す。全体で
、検索アルゴリズムは、マウス１Ｄ９ＶＨ領域に対する最良の対応物として、抗
体４Ｂ４’ＣＬ（ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号０００４９０；Sanzら、Jour
nal ofImmunology. 142:883 (1993) ）由来のヒトＶH 領域を選択した。このク
ローンのＶH 領域は、１Ｄ９ＶH 領域に対して６７．２％の全体の同一性を有し
、ＦＲ単独を比較した場合には８０．９５％に上昇した値を有した（Ｆｉｇｕｒ
ｅ１８Ａ〜Ｂ）。類似性に関して測定した場合、これらの値は全体で６９．６６
％に、ＦＲ単独で８４．５２％に上昇した。従って、再び、潜在的なヒトアクセ
プターＶH配列に最も相同ではないが、このヒトＦＲは、１Ｄ９重鎖のヒト化バ
ージョンの基礎になった。
設計プロセスにおける次の工程は、これらのアミノ酸残基のいずれかが抗原へ
の結合に不都合に影響しそうであるかどうかを決定するために、ヒトアクセプタ
ー４Ｂ４’ＣＬ ＶH 領域ＦＲのアミノ酸配列を研究することであった。再び、
ＯＭＬによって構築した分子モデルは、この設計プロセスに重要であり、そこか
らマウス１Ｄ９ＶH 領域ＦＲの多数のアミノ酸を、ヒト化１Ｄ９抗体の第１（１
Ｄ９ＲＨA）および引き続くバージョンにおける転換のために同定した（Ｆｉｇ
ｕｒｅ１２およびＦｉｇｕｒｅ２０Ａ〜Ｃ）。ドナーマウス１Ｄ９のＦＲとアク
セプターヒト４Ｂ４’ＣＬＶH 領域のＦＲとの間に１６アミノ酸の差異があり、
５個までのマウス残基がヒト化ＦＲにおける転換のために考慮された（Ｆｉｇｕ
ｒｅ１２）。
マウス１Ｄ９抗体ＶH 領域のＣＤＲからなる１Ｄ９ＲＨA を、ヒト４Ｂ４’Ｃ
Ｌ抗体ＶH領域のＦＲに遺伝的に挿入した。１Ｄ９ＲＨB は、２つのＦＲ１変異
、Ｔｈｒ２８ＳｅｒおよびＡｓｎ３０Ｓｅｒは別として、バージョン１Ｄ９ＲＨ
A に同一であった。これらの変更は、それらがＨ１ループコンホメーションに重
要であると考えられるFoote およびWinter（J.Mol.Biol.224:487 (1992) ）によ
り規定されるような補助アミノ酸を表すので作製した。残基２７〜３０は、Ｈ１
ループそれ自身の一部であると考えられ、それゆえ、このループのコンホメーシ
ョンおよび配向を訂正するのにより重要であり、それらの保存をより強固に正当
化する。従って、これらの２つの残基は、１Ｄ９ＲＨB におけるヒト４Ｂ４’Ｃ
Ｌ ＶH配列のＦＲに作製した変更の和を示した。１Ｄ９ＲＨC は、それが２つ
のさらなる変更をＧｌｙ４９Ａ１ａおよびＰｈｅ６７Ｔｙｒに含むこと以外は、
バージョン１Ｄ９ＲＨB に同一であった。Ｇｌｙ４９Ａｌａは保存的変更であっ
た。しかし、４９位の残基は、Ｈ２超可変性ループ構造に重要な、補助残基（Fo
ote およびWinter,J.Mol.Biol.224:487 (1992) ）であると同定され、それゆえ
、このバージョンにマウスＡｌａ残基を保存することを決めた。６７位の残基も
また、補助残基位置であり、ＣＤＲループコンホメーションを維持するのに重要
であると同定した。ＴｙｒはヒトＶH 配列において非常に稀にしか見られず（全
体で０．０８％）、マウスＶH 領域のこの位置では以前には見出されていなかっ
た。結果的に、これは体細胞性変異を介して生じたはずである。従って、分子モ
デルに従ってＣＤＲ２に密接したその位置およびその補助残基状態を考慮して、
この位置にマウスＴｙｒ残基を保存することを決めた。１Ｄ９ＲＨD は、Ｔｈｒ
９３Ｖａｌ変異以外は１Ｄ９ＲＨC と同一であった。この残基は、ＶH ／ＶK 充
填残基として重要であると同定されていた（Chothia ら、J.Mol.Biol. 186:651
(1985)）。さらに、分子モデルに従った、ＣＤＲループＨ１とＨ３との間に埋め
られたその位置は、この位置にマウスＴｙｒ残基を保存することを決めるのを支
持した。上記の全てのヒト化ＶH 領域バリアントのアミノ酸配列の記載は、Ｆｉ
ｇｕｒｅ１２に示されている。
１Ｄ９のヒト化バージョンによるＭＣＰ−１結合の阻害
Ｆｉｇｕｒｅ２５は、マウスｍＡｂ １Ｄ９、ならびに１Ｄ９ＲＨA ＶH 重鎖
（Ｆｉｇｕｒｅ１２）および１Ｄ９ＲＫA ＶK 軽鎖（Ｆｉｇｕｒｅ１１）を含有
するｍＡｂ １Ｄ９のヒト化バージョンの、全ＴＨＰ−１細胞への［125 Ｉ］−
ＭＣＰ−１の結合を阻害する能力を示す。０．５×１０6 個のＴＨＰ−１細胞を
、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＣａＣｌ2 、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．１％
のＢＳＡ、０．０５％のアジ化ナトリウム（結合緩衝液）中で抗体サンプルの種
々の希釈物とともに３７℃で１０分間インキュベートした。等量の結合緩衝液中
の［125Ｉ］−ＭＣＰ−１を、０．１ｎＭの最終濃度で添加し、３７℃でさらに
３０分間インキュベートした。細胞を希釈し、０．５ＭのＮａＣｌを有する等容
量の結合緩衝液（洗浄緩衝液）とともにボルテックスし、遠心分離（ベンチトッ
プ遠心分離、７０００ｒｐｍ、２分）によりペレット化した。上清の除去の後、
ペレットを２００μＬの洗浄緩衝液中でボルテックスし、前記と同様に遠心分離
し、上清を取り出した。細胞を、１００μＬの洗浄緩衝液に再懸濁させ、ガンマ
カウンター（Cobra,Packard Instruments）で計数した。データ解析をＧｒａｐ
ｈｐａｄソフトウェアを用いて行った。
本発明は、その好ましい態様に関して詳細に示され、記載されたが、形態およ
び細部における種々の変更が、特許請求の範囲により包囲される発明の範囲を逸
脱することなく行われ得ることを当業者は理解する。
Figure 2008069150
Figure 2008069150
Ｆｉｇｕｒｅ １は、ｍＡｂ １Ｄ９および８Ｇ２が、ＣＣＲ２トランスフェクタントを染色するがＣＣＲ５若しくはＣＣＲ１トランスフェクタントを染色しないことを示す蛍光活性化細胞走査(FACS)ヒストグラムプロファイルである。Ｌ１／２( 本明細書においては、Ｌ１．２ともいう)マウスプレＢリンパ腫宿主細胞を、示されたように、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＣＲ１でトランスフェクトし、異なるレセプター特異性を有する抗体で染色した。フローサイトメトリーにより染色を解析した。 Ｆｉｇｕｒｅ ２は、ほとんどの単球、リンパ球の亜集団および顆粒球の小サブセットにおけるＣＣＲ２の発現を示すＦＡＣＳドットプロットである。全血球細胞を、３つの抗−ＣＣＲ２ ｍＡｂ( ＣＣＲ２アミノ末端の最初の３２アミノ酸からなるペプチドを免疫原として用いて生じさせた５Ａ１１、本明細書に記載されたように、ＣＣＲ２ｂ Ｌ１／２細胞トランスフェクタントを免疫原として用いて生じさせた１Ｄ９および８Ｇ２) の１つで染色した。フローサイトメトリーにより染色を解析し、リンパ球、顆粒球および単球の集団を、前方および側方光散乱を用いて集めた(gate)。X 軸は、前方光散乱( 細胞サイズの尺度）を示し、Y 軸は、ＣＣＲ２の染色の蛍光強度を示す。陰性対照染色のレベルを線で示す。 Ｆｉｇｕｒｅ ３は、ｍＡｂ １Ｄ９が、ＩｇＥとＣＣＲ２とに対する２色染色を用いた末梢血(好塩基球) におけるＩｇＥ陽性集団を染色することを示すＦＡＣＳドットプロットである。全血液細胞を、第１に、示されたように、陰性対照抗体( 抗−Ｆｌａｇ)、抗−ＣＣＲ２抗体１Ｄ９、または抗−ＣＸＣＲ１抗体のいずれかで染色し、抗−マウス−ＦＩＴＣコンジュゲートで検出した。第２染色は、示されたように、ＰＢＳまたはＩｇＥ若しくはＣＤ１６に特異的なビオチン化抗体のいずれかを用いて行ない、ストレプトアビジン−フィコエリトリンで検出した。フローサイトメトリーで染色を解析した。 Ｆｉｇｕｒｅ ４は、ｍＡｂ １Ｄ９が、ＴＨＰ−１細胞膜への[125Ｉ] ＭＣＰ−１結合を阻害することを示す。３. ０μｇのＴＨＰ−１膜タンパク質を、種々の濃度の１Ｄ９またはイソタイプ適合抗−ＣＸＣＲ３抗体１Ｃ６の存在下に０. １ｎＭ [125Ｉ]ＭＣＰ−１とともにインキュベートした。結合したトレーサーの量をろ過およびシンチレーションカウンティングによる遊離物と結合物との分離により測定した。ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェアによる4-パラメーターロジスティック式を用いた非直線回帰によりデータを解析して、IC50値を決定した。 Ｆｉｇｕｒｅ ５は、ｍＡｂ １Ｄ９が、新しいヒトＰＢＭＣへの[125Ｉ] ＭＣＰ−１結合を阻害することを示す。新たに単離した末梢血単核細胞( ５００，０００）を種々の濃度の１Ｄ９またはイソタイプ適合抗−ＣＸＣＲ３抗体１Ｃ６の存在下に０．１ｎＭ [125Ｉ] ＭＣＰ−１とともにインキュベートした。結合したトレーサーの量をろ過およびシンチレーションカウンティングによる遊離物と結合物との分離により測定した。データをＦｉｇｕｒｅ ４と同様に解析してＩＣ50値を決定した。 Ｆｉｇｕｒｅ ６Ａおよび６Ｂは、ｍＡｂ １Ｄ９が、新しいＰＢＭＣのＭＣＰ−１−誘導された走化性を阻害するが、ＲＡＮＴＥＳ−誘導された走化性を阻害しないことを示すグラフである。Ｆｉｇｕｒｅ ６Ａは、抗体無しまたは０．１若しくは１０μｇ／ｍｌの１Ｄ９または非特異的マウスＩｇＧ２a を伴う１０ｎＭ ＭＣＰ−１に対するＰＢＭＣの走化性アッセイの結果を示す。自発性非特異的遊走も示す。Ｆｉｇｕｒｅ ６Ｂは、抗体無し、１０μｇ／ｍｌ １Ｄ９または１０μｇ／ｍｌ非特異的マウスＩｇＧ２ａを伴う１０ｎＭ ＲＡＮＴＥＳに対するＰＢＭＣの走化性アッセイの結果を示す。ＲＡＮＴＥＳ非存在下での自発性非特異的遊走も示す。 Ｆｉｇｕｒｅ ７は、マウス１Ｄ９抗体のκ軽鎖可変領域のアミノ酸配列( 配列番号：９) を示す。ＣＤＲを太字で強調した。 Ｆｉｇｕｒｅ ８は、マウス１Ｄ９抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列( 配列番号：１０) を示す。ＣＤＲを太字で強調した。 Ｆｉｇｕｒｅ ９は、マウス１Ｄ９ ＶK 領域におけるＣＤＲの規準分類を示す。「チョツィア(Chothia)規準分類」は、チョツィア(Chothia) および協力者達により定義された規準分類〔チョツィア(Chothia) およびレスク(Lesk), J. Mol. Biol.197:901 (1987); チョツィア(Chothia) ら, Nature 34:877 (1989); トラモンターノ(Tramontano)ら,J. Mol. Biol. 215:175 (1990); 並びにチョツィア(Chothia)ら, J. Mol. Biol. 227:799 (1992)〕を用いた場合を示し、「マーチン(Martin)規準分類」は、マーチン(Martin)およびゾーントン(Thornton)により定義された規準分類〔マーチン(Martin)およびゾーントン(Thornton), J. Mol. Biol.263:800 (1996)〕を用いた場合を示す。ＦＲ残基を太字で強調した。 Ｆｉｇｕｒｅ １０は、マウス１Ｄ９ ＶH 領域におけるＣＤＲの規準分類を示す。「チョツィア(Chothia)規準分類」は、チョツィア(Chothia) および協力者達により定義された規準分類〔チョツィア(Chothia) およびレスク(Lesk), J. Mol.Biol. 197:901 (1987); チョツィア(Chothia) ら, Nature 34:877 (1989); トラモンターノ(Tramontano)ら,J. Mol. Biol. 215:175 (1990); およびチョツィア(Chothia)ら, J. Mol. Biol. 227:799 (1992)〕を用いた場合を示し、「マーチン(Martin)規準分類」は、マーチン(Martin)およびゾーントン(Thornton)により定義された規準分類〔マーチン(Martin)およびゾーントン(Thornton), J. Mol.Biol. 263:800 (1996)〕を用いた場合を示す。ＦＲ残基を太字で強調した。 Ｆｉｇｕｒｅ １１は、種々のバージョンのヒト化１Ｄ９ ＶK 領域のアミノ酸配列( それぞれ、配列番号：１２−１５および１０７)を示す。１Ｄ９ ＶK 領域残基( 配列番号：９)およびヒトＨＦ−２１／２８ ＶK 領域 (配列番号：１１) 配列が適合する場合、ドット[.]で示す。特定残基位置にアミノ酸が存在しない場合、ダッシュ[-] で示す。ＨＦ−２１／２８ ＦＲにおけるアミノ酸がヒト化１Ｄ９ ＶK 領域で変化していない場合、太字で強調する。命名法[==L1==]の使用により、ＣＤＲを記載する。用いたナンバリングは、カバット(Kabat)ら, 免疫学的に重要なタンパク質の配列(Sequencesof proteins of immunological interest),Fifth edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S.Government Printing Office (1991)によるものである。 Ｆｉｇｕｒｅ １２は、種々のバージョンのヒト化１Ｄ９ ＶH 領域のアミノ酸配列( それぞれ、配列番号：１７−２０)を示す。１Ｄ９ ＶH 領域残基 (配列番号：１０) およびヒト４Ｂ４’ＣＬ ＶH領域配列 (配列番号：１６) が適合する場合、ドット[.]で示す。特定残基位置にアミノ酸が存在しない場合、ダッシュ[-] で示す。４Ｂ４’ＣＬにおけるアミノ酸が、ヒト化１Ｄ９ ＶH領域で変化しない場合、太字で強調する。ＣＤＲは、命名法 [==H1==] の使用により記載され、[-----]は、H1構造ループの部分を示す。用いたナンバリングは、カバット(Kabat)ら, 免疫学的に重要なタンパク質の配列(Sequences of proteins of immunologicalinterest), Fifth edition, U.S. Department of Health and HumanServices, U.S. Government Printing Office (1991)によるものである。 Ｆｉｇｕｒｅ １３は、マウス１Ｄ９ ＶK 領域( 配列番号：２１) の一部とマウス生殖系列ＶK 遺伝子配列( それぞれ、配列番号：２２−３３) との比較を示す。「同一残基」は、マウス１Ｄ９ ＶK 領域に対してマウス生殖系列VK領域における同一残基の数を示す。１Ｄ９ ＶK 領域配列およびマウス生殖系列ＶK 領域配列が適合する場合、ドット[.] で示す。特定残基位置にアミノ酸が存在しない場合、ダッシュ[-]で示す。 Ｆｉｇｕｒｅ １４は、マウス１Ｄ９ ＶH 領域 (配列番号：３４) の一部とマウス生殖系列ＶH 遺伝子配列( それぞれ、配列番号：３５−５３) との比較を示す。「同一残基」は、マウス１Ｄ９ ＶH 領域に対してマウス生殖系列ＶH 領域における同一残基の数を示す。１Ｄ９ ＶH 領域配列およびマウスＶH 領域配列が適合する場合、ドット[.] で示す。特定残基位置にアミノ酸が存在しない場合、ダッシュ[-]で示す。 Ｆｉｇｕｒｅ １５は、マウス１Ｄ９ ＶK 領域( 配列番号：９) と最も相同的な１７のヒトVKアミノ酸配列(それぞれ、配列番号：５４−７０) との比較を示す。「ＩＤ」は、マウス１Ｄ９ ＶK 領域に対するヒトＶK 配列の同一性の割合を示す。１Ｄ９ ＶK 領域残基およびヒトＶK 領域配列が適合する場合、ドット[.] で示す。特定残基位置にアミノ酸が存在しない場合、ダッシュ[-]で示す。「S 」は、ＦVドメインの表面におけるアミノ酸の位置を示す。「C 」は、ＦV ドメインのコア内に局在する残基を示す。ＣＤＲの５Å以内の残基を、大文字を用いて規定し、さらに離れて局在する残基を小文字で記載する。ＣＤＲ自体は、命名法= =L1= = の使用により記載される。「ｖ」は、ＦＲに局在するベルニエ残基〔フーテ(Foote)およびウィンター(Winter), J. Mol. Biol. 224:487 (1992)〕を示す。下線を付したヒトＶK領域配列におけるこれらの残基は、それらの最も近いヒトＶK 生殖系列遺伝子とは異なる。用いたナンバリングは、カバット(Kabat) ら,免疫学的に重要なタンパク質の配列(Sequences of proteins of immunologicalinterest), Fifth edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S.Government Printing Office (1991)によるものである。 Ｆｉｇｕｒｅ １６は、マウス１Ｄ９ ＶK 領域と最も相同的な１７のヒトＶK アミノ酸配列との比較を示す。「ID」は、マウス１Ｄ９ ＶK領域に対するヒトＶK 配列の同一性割合を示す。「表面」は、表面における同一残基の数を示す。「コア」は、ＦVドメインのコア内の同一残基の数を示す。「ＣＤＲ」は、ＣＤＲ内の同一残基の数を示す。「ＦＲ」は、ＦＲ内の同一残基の数を示す。「ＦＲ表面」は、表面に露出した同一残基を示す。「ＦＲコア」は、ＦV ドメインのコア内に局在する同一残基の数を示す。「ＣＤＲ近傍ＦＲ」は、ＣＤＲの５Å以内のＦＲアミノ酸における同一残基の数を示す。「ベルニエ」は、１４のベルニエアミノ酸〔フーテ(Foote)およびウィンター(Winter), J. Mol. Biol. 224:487 (1992)〕における同一残基の数を示す。「ＶK」は、ＶK 遺伝子内の同一残基の数を示す。「Ｊ鎖」は、Ｊ鎖遺伝子内の同一残基の数を示す。「Ｌ１ Ｌｅｎ」〜「Ｌ３ Ｌｅｎ」は、各ＣＤＲにおける残基の数を規定し、「Ｌ１クラス」〜「Ｌ３クラス」は、マーチン(Martin)およびゾーントン(Thornton)によるＣＤＲの規準分類〔マーチン(Martin)およびゾーントン(Thornton), J. Mol. Biol. 263:800 (1996)〕を記載する。 Ｆｉｇｕｒｅ １７Ａ−１７Ｂは、マウス１Ｄ９ ＶH 領域 (配列番号：１０) と最も相同的な２４のヒトＶHアミノ酸配列( それぞれ、配列番号：７１−９４) との比較を示す。「ＩＤ」は、マウス１Ｄ９ ＶH領域に対するヒトＶH 配列の同一性割合を示す。１Ｄ９ ＶH 領域残基およびヒトＶH 領域配列が適合する場合、ドット[.]で示す。特定残基位置にアミノ酸が存在しない場合、ダッシュ[-] で示す。「S」は、ＦV ドメインの表面におけるアミノ酸の位置を示す。「C 」は、ＦV ドメインのコア内に局在する残基を示す。ＣＤＲの５Å以内の残基を、大文字を用いて規定し、さらに離れて局在する残基を小文字で記載する。ＣＤＲ自体は、命名法= = Hl = =の使用により記載される。「ｖ」は、ＦＲに局在するベルニエ残基〔フーテ(Foote) およびウィンター(Winter), J. Mol. Biol. 224:487(1992)〕を示す。下線を付したヒトＶH 領域配列におけるこれらの残基は、それらの最も近いヒトＶH 生殖系列遺伝子とは異なる。用いたナンバリングは、カバット(Kabat)ら, 免疫学的に重要なタンパク質の配列(Sequences of proteins ofimmunological interest), Fifth edition, U.S. Department of Health and HumanServices, U.S. Government Printing Office (1991)によるものである。 Ｆｉｇｕｒｅ １７Ａ−１７Ｂは、マウス１Ｄ９ ＶH 領域 (配列番号：１０) と最も相同的な２４のヒトＶHアミノ酸配列( それぞれ、配列番号：７１−９４) との比較を示す。「ＩＤ」は、マウス１Ｄ９ ＶH領域に対するヒトＶH 配列の同一性割合を示す。１Ｄ９ ＶH 領域残基およびヒトＶH 領域配列が適合する場合、ドット[.]で示す。特定残基位置にアミノ酸が存在しない場合、ダッシュ[-] で示す。「S」は、ＦV ドメインの表面におけるアミノ酸の位置を示す。「C 」は、ＦV ドメインのコア内に局在する残基を示す。ＣＤＲの５Å以内の残基を、大文字を用いて規定し、さらに離れて局在する残基を小文字で記載する。ＣＤＲ自体は、命名法= = Hl = =の使用により記載される。「ｖ」は、ＦＲに局在するベルニエ残基〔フーテ(Foote) およびウィンター(Winter), J. Mol. Biol. 224:487(1992)〕を示す。下線を付したヒトＶH 領域配列におけるこれらの残基は、それらの最も近いヒトＶH 生殖系列遺伝子とは異なる。用いたナンバリングは、カバット(Kabat)ら, 免疫学的に重要なタンパク質の配列(Sequences of proteins ofimmunological interest), Fifth edition, U.S. Department of Health and HumanServices, U.S. Government Printing Office (1991)によるものである。 Ｆｉｇｕｒｅ １８Ａ−１８Ｂは、マウス１Ｄ９ ＶH 領域と最も相同的な24のヒトVHアミノ酸配列との比較を示す。「ＩＤ」は、マウスｌＤ９ ＶH領域に対するヒトＶH 配列の同一性割合を示す。「全」は、マウス１Ｄ９ ＶH 領域の全体に比べた場合のヒトＶH 領域の全体における同一残基の数を示す。「表面」は、表面における同一残基の数を示す。「コア」は、ＦV ドメインのコア内の同一残基の数を示す。「ＣＤＲ」は、ＣＤＲ(CDRs)内の同一残基の数を示す。「ＦＲ」は、ＦＲ（Frs）内の同一残基の数を示す。「ＦＲ表面」は、表面に露出した同一残基を示す。「ＦＲコア」は、ＦV ドメインのコア内に局在する同一残基の数を示す。「ＣＤＲ近傍ＦＲ」は、ＣＤＲの５Å以内のＦＲアミノ酸における同一残基の数を示す。「ベルニエ」は、１４のベルニエアミノ酸〔フーテ(Foote) およびウィンター(Winter),J. Mol. Biol. 224:487 (1992)〕における同一残基の数を示す。「ＶH 」は、ＶH 遺伝子内の同一残基の数を示す。「Ｊ鎖」は、Ｊ鎖遺伝子内の同一残基の数を示す。「H １サイズ」および「H ２サイズ」は、各ＣＤＲにおける残基の数を規定し、「Ｈ１クラス」および「Ｈ２クラス」は、マーチン(Martin)およびゾーントン(Thornton)によるＣＤＲの規準分類〔J.Mol. Biol. 263:800(1996)〕を記載する。 Ｆｉｇｕｒｅ １８Ａ−１８Ｂは、マウス１Ｄ９ ＶH 領域と最も相同的な24のヒトVHアミノ酸配列との比較を示す。「ＩＤ」は、マウスｌＤ９ ＶH領域に対するヒトＶH 配列の同一性割合を示す。「全」は、マウス１Ｄ９ ＶH 領域の全体に比べた場合のヒトＶH 領域の全体における同一残基の数を示す。「表面」は、表面における同一残基の数を示す。「コア」は、ＦV ドメインのコア内の同一残基の数を示す。「ＣＤＲ」は、ＣＤＲ(CDRs)内の同一残基の数を示す。「ＦＲ」は、ＦＲ（Frs）内の同一残基の数を示す。「ＦＲ表面」は、表面に露出した同一残基を示す。「ＦＲコア」は、ＦV ドメインのコア内に局在する同一残基の数を示す。「ＣＤＲ近傍ＦＲ」は、ＣＤＲの５Å以内のＦＲアミノ酸における同一残基の数を示す。「ベルニエ」は、１４のベルニエアミノ酸〔フーテ(Foote) およびウィンター(Winter),J. Mol. Biol. 224:487 (1992)〕における同一残基の数を示す。「ＶH 」は、ＶH 遺伝子内の同一残基の数を示す。「Ｊ鎖」は、Ｊ鎖遺伝子内の同一残基の数を示す。「H １サイズ」および「H ２サイズ」は、各ＣＤＲにおける残基の数を規定し、「Ｈ１クラス」および「Ｈ２クラス」は、マーチン(Martin)およびゾーントン(Thornton)によるＣＤＲの規準分類〔J.Mol. Biol. 263:800(1996)〕を記載する。 Ｆｉｇｕｒｅ １９Ａ−１９Ｃは、第１の( １Ｄ９ＲＫA ) および第２の (１Ｄ９ＲＫB) ヒト化バージョンの１Ｄ９抗体κ軽鎖可変領域のデザインを導くアミノ酸配列のアラインメントを示す。カラム7 の特定の残基位置のマウス１Ｄ９と同一のアミノ酸を示さない; 「- 」は、この残基の位置にアミノ酸がないことを示す。太字は、ヒトアミノ酸残基が対応するマウス残基に置換された場合のＦＲおよびＣＤＲにおける位置を示す。「Δ」は、１Ｄ９ＲＫA のヒトＦＲにおける変化のナンバリングを示す。「マウス１Ｄ９ ＶK 」は、マウス１Ｄ９κ軽鎖可変領域のＶK 領域のアミノ酸配列を示す。「マウスκ−ＩＩ」は、カバットサブグループκ−ＩＩのマウスVK領域のコンセンサス配列を示す。「ヒトκ−ＩＩ」は、カバットサブグループκ−ＩＩのヒトＶK 領域のコンセンサス配列を示す。「ＨＦ−２１／２８」は、ヒトＨＦ−２１／２８抗体〔チャスタナー(Chastagner)ら, Gene101(2):305-6 (1991)〕の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。丸括弧内の数(005056) は、カバットデータベースＩＤ番号である。「表面またはコア」は、抗体可変領域の両方の鎖における残りの残基に対するアミノ酸の位置を示す。ＣＤＲの５Å以内の残基は、大文字を用いて規定する。「１Ｄ９ＲＫA 」は、第１のバージョンのヒト化１Ｄ９ ＶK 領域のアミノ酸配列を示す。「１Ｄ９ＲＫB」は、第２のバージョンのヒト化１Ｄ９ ＶK 領域のアミノ酸配列を示す。 Ｆｉｇｕｒｅ １９Ａ−１９Ｃは、第１の( １Ｄ９ＲＫA ) および第２の (１Ｄ９ＲＫB) ヒト化バージョンの１Ｄ９抗体κ軽鎖可変領域のデザインを導くアミノ酸配列のアラインメントを示す。カラム7 の特定の残基位置のマウス１Ｄ９と同一のアミノ酸を示さない; 「- 」は、この残基の位置にアミノ酸がないことを示す。太字は、ヒトアミノ酸残基が対応するマウス残基に置換された場合のＦＲおよびＣＤＲにおける位置を示す。「Δ」は、１Ｄ９ＲＫA のヒトＦＲにおける変化のナンバリングを示す。「マウス１Ｄ９ ＶK 」は、マウス１Ｄ９κ軽鎖可変領域のＶK 領域のアミノ酸配列を示す。「マウスκ−ＩＩ」は、カバットサブグループκ−ＩＩのマウスVK領域のコンセンサス配列を示す。「ヒトκ−ＩＩ」は、カバットサブグループκ−ＩＩのヒトＶK 領域のコンセンサス配列を示す。「ＨＦ−２１／２８」は、ヒトＨＦ−２１／２８抗体〔チャスタナー(Chastagner)ら, Gene101(2):305-6 (1991)〕の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。丸括弧内の数(005056) は、カバットデータベースＩＤ番号である。「表面またはコア」は、抗体可変領域の両方の鎖における残りの残基に対するアミノ酸の位置を示す。ＣＤＲの５Å以内の残基は、大文字を用いて規定する。「１Ｄ９ＲＫA 」は、第１のバージョンのヒト化１Ｄ９ ＶK 領域のアミノ酸配列を示す。「１Ｄ９ＲＫB」は、第２のバージョンのヒト化１Ｄ９ ＶK 領域のアミノ酸配列を示す。 Ｆｉｇｕｒｅ １９Ａ−１９Ｃは、第１の( １Ｄ９ＲＫA ) および第２の (１Ｄ９ＲＫB) ヒト化バージョンの１Ｄ９抗体κ軽鎖可変領域のデザインを導くアミノ酸配列のアラインメントを示す。カラム7 の特定の残基位置のマウス１Ｄ９と同一のアミノ酸を示さない; 「- 」は、この残基の位置にアミノ酸がないことを示す。太字は、ヒトアミノ酸残基が対応するマウス残基に置換された場合のＦＲおよびＣＤＲにおける位置を示す。「Δ」は、１Ｄ９ＲＫA のヒトＦＲにおける変化のナンバリングを示す。「マウス１Ｄ９ ＶK 」は、マウス１Ｄ９κ軽鎖可変領域のＶK 領域のアミノ酸配列を示す。「マウスκ−ＩＩ」は、カバットサブグループκ−ＩＩのマウスVK領域のコンセンサス配列を示す。「ヒトκ−ＩＩ」は、カバットサブグループκ−ＩＩのヒトＶK 領域のコンセンサス配列を示す。「ＨＦ−２１／２８」は、ヒトＨＦ−２１／２８抗体〔チャスタナー(Chastagner)ら, Gene101(2):305-6 (1991)〕の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。丸括弧内の数(005056) は、カバットデータベースＩＤ番号である。「表面またはコア」は、抗体可変領域の両方の鎖における残りの残基に対するアミノ酸の位置を示す。ＣＤＲの５Å以内の残基は、大文字を用いて規定する。「１Ｄ９ＲＫA 」は、第１のバージョンのヒト化１Ｄ９ ＶK 領域のアミノ酸配列を示す。「１Ｄ９ＲＫB」は、第２のバージョンのヒト化１Ｄ９ ＶK 領域のアミノ酸配列を示す。 Ｆｉｇｕｒｅ ２０Ａ−２０Ｃは、第１の( １Ｄ９ＲＨA ) および第２の( １Ｄ９ＲＨB) ヒト化バージョンの１Ｄ９抗体κ軽鎖可変領域のデザインを導くアミノ酸配列のアラインメントを示す。カラム7 の特定の残基位置のマウス１Ｄ９と同一のアミノ酸を示さない; 「- 」は、この残基の位置にアミノ酸がないことを示す。太字は、ヒトアミノ酸残基が対応するマウス残基に置換された場合のＦＲおよびＣＤＲにおける位置を示す。「Δ」は、１Ｄ９ＲＨA のヒトＦＲにおける変化のナンバリングを示す。「マウス１Ｄ９ ＶH 」は、マウス１Ｄ９重鎖可変領域のＶH 領域のアミノ酸配列を示す。「マウスＩＩＩｃ」は、カバットサブグループＩＩＩｃのマウスＶH 領域のコンセンサス配列を示す。「ヒトＩＩＩ」は、カバットサブグループＩＩＩのヒトＶH 領域のコンセンサス配列を示す。「４Ｂ４’ＣＬ」は、ヒト４Ｂ４’ＣＬ抗体〔サンズ(Sanz)ら, Journal of Immunology 142:883(1989)〕の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。丸括弧内の数(000490)は、カバットデータベースＩＤ番号を示す。「表面またはコア」は、抗体可変領域の両方の鎖における残りの残基に対するアミノ酸の位置を示す。ＣＤＲの５Å以内の残基は、大文字を用いて規定する。「１Ｄ９ＲＨA 」は、第１のバージョンのヒト化１Ｄ９ VH領域のアミノ酸配列を示す。「１Ｄ９ＲＨB 」は、第２のバージョンのヒト化１Ｄ９ ＶH 領域のアミノ酸配列を示す。 Ｆｉｇｕｒｅ ２０Ａ−２０Ｃは、第１の( １Ｄ９ＲＨA ) および第２の( １Ｄ９ＲＨB) ヒト化バージョンの１Ｄ９抗体κ軽鎖可変領域のデザインを導くアミノ酸配列のアラインメントを示す。カラム7 の特定の残基位置のマウス１Ｄ９と同一のアミノ酸を示さない; 「- 」は、この残基の位置にアミノ酸がないことを示す。太字は、ヒトアミノ酸残基が対応するマウス残基に置換された場合のＦＲおよびＣＤＲにおける位置を示す。「Δ」は、１Ｄ９ＲＨA のヒトＦＲにおける変化のナンバリングを示す。「マウス１Ｄ９ ＶH 」は、マウス１Ｄ９重鎖可変領域のＶH 領域のアミノ酸配列を示す。「マウスＩＩＩｃ」は、カバットサブグループＩＩＩｃのマウスＶH 領域のコンセンサス配列を示す。「ヒトＩＩＩ」は、カバットサブグループＩＩＩのヒトＶH 領域のコンセンサス配列を示す。「４Ｂ４’ＣＬ」は、ヒト４Ｂ４’ＣＬ抗体〔サンズ(Sanz)ら, Journal of Immunology 142:883(1989)〕の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。丸括弧内の数(000490)は、カバットデータベースＩＤ番号を示す。「表面またはコア」は、抗体可変領域の両方の鎖における残りの残基に対するアミノ酸の位置を示す。ＣＤＲの５Å以内の残基は、大文字を用いて規定する。「１Ｄ９ＲＨA 」は、第１のバージョンのヒト化１Ｄ９ VH領域のアミノ酸配列を示す。「１Ｄ９ＲＨB 」は、第２のバージョンのヒト化１Ｄ９ ＶH 領域のアミノ酸配列を示す。 Ｆｉｇｕｒｅ ２０Ａ−２０Ｃは、第１の( １Ｄ９ＲＨA ) および第２の( １Ｄ９ＲＨB) ヒト化バージョンの１Ｄ９抗体κ軽鎖可変領域のデザインを導くアミノ酸配列のアラインメントを示す。カラム7 の特定の残基位置のマウス１Ｄ９と同一のアミノ酸を示さない; 「- 」は、この残基の位置にアミノ酸がないことを示す。太字は、ヒトアミノ酸残基が対応するマウス残基に置換された場合のＦＲおよびＣＤＲにおける位置を示す。「Δ」は、１Ｄ９ＲＨA のヒトＦＲにおける変化のナンバリングを示す。「マウス１Ｄ９ ＶH 」は、マウス１Ｄ９重鎖可変領域のＶH 領域のアミノ酸配列を示す。「マウスＩＩＩｃ」は、カバットサブグループＩＩＩｃのマウスＶH 領域のコンセンサス配列を示す。「ヒトＩＩＩ」は、カバットサブグループＩＩＩのヒトＶH 領域のコンセンサス配列を示す。「４Ｂ４’ＣＬ」は、ヒト４Ｂ４’ＣＬ抗体〔サンズ(Sanz)ら, Journal of Immunology 142:883(1989)〕の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。丸括弧内の数(000490)は、カバットデータベースＩＤ番号を示す。「表面またはコア」は、抗体可変領域の両方の鎖における残りの残基に対するアミノ酸の位置を示す。ＣＤＲの５Å以内の残基は、大文字を用いて規定する。「１Ｄ９ＲＨA 」は、第１のバージョンのヒト化１Ｄ９ VH領域のアミノ酸配列を示す。「１Ｄ９ＲＨB 」は、第２のバージョンのヒト化１Ｄ９ ＶH 領域のアミノ酸配列を示す。 Ｆｉｇｕｒｅ ２１は、マウス抗体１Ｄ９重鎖可変領域の塩基配列、相補配列およびコードされたアミノ酸配列を示す。リーダー配列および定常領域の一部も示す。記載された塩基配列は、配列番号：９６、相補配列は、配列番号：９９、アミノ酸配列は、配列番号：１００である。 Ｆｉｇｕｒｅ ２２は、マウス抗体１Ｄ９κ軽鎖可変領域の塩基配列、相補配列およびコードされたアミノ酸配列を示す。リーダー配列および定常領域の一部も示す。記載された塩基配列は、配列番号：９５、相補配列は、配列番号：１０１、アミノ酸配列は、配列番号：１０２である。 Ｆｉｇｕｒｅ ２３は、ヒト化重鎖１Ｄ９ＲＨA の塩基配列を示す。示された酵素部位をベクターｐＬＫＴＯＫ４１へのクローニングのために付加した。また、ベクターは、ヒトのリーダー配列および定常領域を有する。記載された塩基配列は、配列番号：９７、相補配列は、配列番号：１０３、アミノ酸配列は、配列番号：１０４である。 Ｆｉｇｕｒｅ ２４は、ヒト化軽鎖１Ｄ９ＲＫA の塩基配列を示す。示された酵素部位をベクターｐＬＫＴＯＫ４１へのクローニングのために付加した。また、ベクターは、ヒトのリーダー配列および定常領域を有する。角型括弧を付けたＹは、ｐＬＫＴＯＫ４１のＥｃｏＲＶクローニング部位にクローン化した場合にアスパラギン酸に変化する残基を示す。記載された塩基配列は、配列番号：９８、相補配列は、配列番号：１０５、アミノ酸配列は、配列番号：１０６である。 Ｆｉｇｕｒｅ ２５は、マウスｍＡｂ １Ｄ９とヒト化バージョンのｍＡｂ １Ｄ９( １Ｄ９ＲＨAＶH の重鎖、１Ｄ９ＲＫA ＶK の軽鎖) とにおける[125Ｉ] −ＭＣＰ−１と全ＴＨＰ−１細胞との結合を阻害する能力の比較を示す。マウス１Ｄ９(mus-１Ｄ９) のデータポイントを、黒三角で示す。ヒト化バージョンの１Ｄ９(hum-１Ｄ９) のデータポイントを黒四角で示す
（配列表）
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  1. 本明細書に記載されるような、ヒト化抗ＣＣＲ−２抗体およびその使用方法。
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