DE60130538T2

DE60130538T2 - Humanisierte antikörper gegen ccr2 und verfahren zur deren verwendung

Info

Publication number: DE60130538T2
Application number: DE60130538T
Authority: DE
Inventors: Gregory J. Newton LAROSA; Christopher Taunton HORVATH; Walter Boston NEWMAN; S. Tarran Radlett JONES; Siobhan Finchley O'BRIEN; Theresa Waltham O'KEEFE
Original assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2000-02-03
Filing date: 2001-02-02
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2021-02-03
Also published as: ES2293973T3; MXPA02007449A; DE60130538D1; WO2001057226A1; JP2008069150A; CA2399080A1; AU2009201216A1; CA2399080C; JP4398620B2; ATE373719T1; AU2009201216A8; JP2003521927A; EP1255844A1; AU3327701A; EP1255844B1; AU2001233277B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In den letzten Jahren wurde eine größer werdende Familie von Leukozyt-aktivierenden Faktoren/chemischen Lockstoffen für Leukozyten beschrieben, die als Chemokine bezeichnet werden (Oppenheim, J.J. et al., Annu. Rev. Immunol., 9: 617–648 (1991); Schall und Bacon, Curr. Opin. Immunol., 6: 865–873 (1994); Baggiolini, M., et al., Adv. Imunol., 55: 97–179 (1994)). Mitglieder dieser Familie werden durch viele Zelltypen als Antwort auf frühe Entzündungsmediatoren, wie beispielsweise auf IL-1β oder TNFα, hergestellt und abgesondert. Die Chemokin Superfamilie umfasst zwei Hauptzweige: Die α-Chemokine (oder CXC Chemokine) und die β-Chemokine (CC Chemokine). Der α-Chemokin-Zweig enthält Proteine, wie beispielsweise IL-8, Neutrophiler bzw. neutrophile Granulozyten aktivierendes Peptid-2 (NAP-2), Melanom-Wachstumsstimulierungsaktivität (MGSA/gro oder GROα) und ENA-78, von denen jedes vorwiegend auf Neutrophile anziehende und aktivierende Effekte aufweist. Die Mitglieder des β-Chemokin-Zweigs beeinflussen andere Zelltypen, wie beispielsweise Monozyten, Lymphozyten, Basophile und Eosinophile bzw. eosinophile Leukozyten (Oppenheim; J.J. et al., Annu. Rev. Immunol., 9: 617–648 (1991); Baggiolini, M., et al., Adv. Imunol., 55: 97–179 (1994); Miller und Krangel, Crit. Rev. Immunol., 12: 17–46 (1992); Jose, P.J., et al., J. Exp. Med., 179: 881–118 (1994); Ponath, P.D., et al., J. Clin. Invest., 97: 604–612 (1996)) und enthalten Proteine, wie beispielsweise die chemotaktischen Monozyt-Proteine 1–4 (MCP-1, MCP-2, MCP-3 und MCP-4), RANTES und Makrophagen Entzündungsproteine (MIP-1α, MIP-1β). Vor kurzem wurde eine neue Klasse von membrangebundenen Chemokinen identifiziert, die als CX3C Chemokine bezeichnet werden (Bazan, J.F., et al., Nature 385: 640–644 (1997)). Chemokine können eine Auswahl an pro-entzündlichen Effekten an Leukozyten vermitteln, wie beispielsweise Auslösen von Chemotaxis, Degranulation, Synthese von Lipidmediatoren und Integrin-Aktivierung (Oppenheim, J.J. et al., Annu. Rev. Immunol., 9: 617–648 (1991); Baggiolini, M., et al., Adv. Imunol., 55: 97–179 (1994); Miller, M.D. und Krangel, M.S., Crit. Rev. Immunol., 12: 17–46 (1992)). Kürzlich wurde gezeigt, dass bestimmte β-Chemokine eine HIV-1 Infektion von humanen T-Zelllinien in vitro unterdrücken (Cocchi, F., et al., Science (Wash. DC), 270: 1811–1815 (1995)).
Chemokine binden an 7-mal die Membran durchspannende (7TMS) G-Protein gekoppelte Rezeptoren (Murphy, P.M., Annu. Rev. Immunol., 12: 593–633 (1994)). Einige bekannte Rezeptoren für die CC oder β-Chemokine beinhalten CCR1, das MIP-1α bindet, und RANTES (Neote, K., et al., Cell, 72: 415–425 (1993); Gao, J.L., J. Exp. Med., 177: 1421–1427 (1993)), CCR2, das Chemokine einschließlich MCP-1, MCP-2, MCP-3 und MCP-4 bindet (Charo, I.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2752–2756 (1994); Myers, S.J., et al., J. Biol. Chem., 270: 5786–5792 (1995); Gong et al., J. Biol Chem 272: 11682–11685 (1997); Garcia-Zepeda et al., J. Immunol. 157: 5613–5626 (1996)), CCR3, das Chemokine einschließlich Eotaxin, RANTES und MCP-3 bindet (Ponath, P.D., et al., J. Exp. Med., 183: 2437–2448 (1996)), CCR4, von dem gefunden wurde, dass es als Antwort auf MCP-1, MCP-1α und RANTES Signale abgibt (Power, C.A., et al., J. Biol. Chem., 270: 19495–19500 (1995)) und CCR5, von dem gezeigt wurde, dass es als Antwort auf MCP-1α, MCP-1β und RANTES Signale abgibt (Boring, L., et al., J. Biol. Chem., 271 (13): 7551–7558 (1996); Raport, C.J., J. Biol. Chem., 271: 17161–17166 (1996); and Samson, M. et al., Biochemistry, 35: 3362–3367 (1996)).
CCR2 wird auf der Oberfläche von mehreren Leukozyten-Subpopulationen exprimiert und scheint in zwei leicht unterschiedlichen Formen (CCR2a und CCR2b) aufgrund von alternativem Spleißen der mRNA, die die carboxyterminale Region kodiert, exprimiert zu werden (Charo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2752–2756 (1994)). MCP-1 wirkt auf Monozyten, Lymphozyten und Basophile und induziert Chemotaxis, Freisetzung von Granula, plötzlichen starken O₂-Verbrauch (respiratory burst), und Freisetzung von Histamin und Cytokin. In Studien wurde angedeutet, dass MCP-1 mit der Pathologie von Erkrankungen wie beispielsweise rheumatoider Arthritis, Arteriosklerose, granulomatösen Erkrankungen und multipler Sklerose in Verbindung steht (Koch, J. Clin. Invest. 90: 772–79 (1992); Hosaka et al., Clin. Exp. Immunol. 97: 451–457 (1994); Schwartz et al., Am. J. Cardiol. 71(6): 98–14B (1993); Schimmer et al., J. Immunol. 160: 1466–1471 (1998); Flory et al., Lab. Invest. 69: 396–404 (1993); Gong et al., J. Exp. Med. 186: 131–137 (1997)). Zusätzlich kann CCR2 als Co-Rezeptor für HIV wirken (Connor et al., J. Exp. Med. 185: 621–628 (1997)). Daher können CCR2-Rezeptorantagonisten eine neue Klasse wichtiger therapeutischer Mittel darstellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Antikörper (Immunglobulin) oder ein funktionales Fragment davon (beispielsweise ein Antigen-bindendes Fragment), das an einen Säugetier CC-Chemokin Rezeptor 2 bindet (auch als CCR2, CKR-2, MCP-1RA oder MCP-1RB bezeichnet) oder an Regionen des Rezeptors (anti-CCR2). In einer Ausführungsform weist der Antikörper der vorliegenden Erfindung oder ein Fragment davon eine Spezifität für einen humanen oder Rhesus CCR2 oder einer Region davon auf. In einer weiteren Ausführungsform blockiert der Antikörper oder das Fragment der Erfindung das Binden eines Liganden (beispielsweise MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4) an den Rezeptor und inhibiert die mit dem Binden des Liganden an den Rezeptor verbundenen Funktionen (beispielsweise den/die Leukozyten-Verkehr bzw. Leukozyten-Wanderung (trafficking). Wie vorstehend beschrieben, können beispielsweise Antikörper der vorliegenden Erfindung und Fragmente davon, die an den humanen oder Rhesus CCR2 oder an eine Region davon binden, die Bindung eines Chemokins (beispielsweise MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4) an den Rezeptor blockieren und die mit dem Binden des Liganden an den Rezeptor verbundenen Funktionen inhibieren. In einer Ausführungsform ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper (mAb) LS132.1D9 (1D9) oder ein Antikörper, der mit 1D9 um die Bindung an den humanen CCR2 oder an eine Region von dem humanen CCR2 konkurriert. Funktionale Fragmente der vorstehenden Antikörper sind auch vorgesehen.
In einer weiteren Ausführungsform bindet der Antikörper oder das funktionale Fragment der vorliegenden Erfindung den humanen CCR2 oder an eine Region davon und inhibiert das Binden des HI-Virus (HIV) an den Rezeptor, dabei inhibiert er die mit dem Binden des HI-Virus an den Rezeptor verbundenen Funktionen (beispielsweise Freisetzung des HIV-Antigens und Infektiösität). In einer Ausführungsform ist der Antikörper der monoklonale Antikörper 1D9 oder ein Antikörper, der mit 1D9 um die Bindung an den humanen CCR2 oder an eine Region von dem humanen CCR2 konkurriert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Antikörper oder funktionales Fragment davon (beispielsweise ein Antigen-bindendes Fragment), der an einen Säugetier-CCR2 oder an einer Region des Rezeptors bindet und eine erhöhte Fluoreszenz-Markierungsintensität von CCR2 oder von Zusammensetzungen bereitstellt, die CCR2 relativ zu anderen anti-CCR2 Antikörpern umfassen. In einer Ausführungsform ist der Antikörper der monoklonale Antikörper 1D9 oder LS132.8G2 (8G2) oder ein Antikörper, der mit 1D9 oder 8G2 um den humanen CCR2 oder um eine Region des humanen CCR2 konkurrieren kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist, worin das Immunglobulin eine Antigen-bindende Region nicht humaner Herkunft (beispielsweise eines Nagetiers) aufweist und mindestens eine Region eines Immunglobulins humaner Herkunft (beispielsweise eine humane Gerüstregion, eine humane konstante Region des Gammatyps). In einer Ausführungsform kann das vorstehend beschriebene humanisierte Immunglobulin oder Fragment davon mit 1D9 um die Bindung an CCR2 konkurrieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Antigen-bindende Region des humanisierten Immunglobulins abgeleitet vom monoklonalen Antikörper 1D9 (beispielsweise ein Immunglobulin, das die variablen Regionen der leichten und schweren Ketten umfasst, wie in 7 (Seq. ID Nr. 9) bzw. in 8 (Seq. ID Nr. 10) gezeigt).
So kann beispielsweise das humanisierte Immunglobulin oder das Antigen-bindende Fragment davon eine Antigen-bindende Region umfassen, die mindestens eine für die Erkennung eines Antigens verantwortliche Region bzw. einen Komplementaritätsbestimmenden Bereich (CDR) nicht humaner Herkunft umfasst und eine Gerüstregion bzw. Gerüstbereich (FR), die von einer humanen Gerüstregion abgeleitet ist. In einer Ausführungsform umfasst das humanisierte Immunglobulin, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist, eine leichte Kette, die mindestens eine von einem Antikörper nicht humaner Herkunft abstammende CDR aufweist, die CCR2 bindet, und eine FR, die von einer leichten Kette humaner Herkunft abstammt (beispielsweise von HF-21/28), und eine schwere Kette, die eine von einem Antikörper nicht humaner Herkunft abstammende CDR umfasst, die CCR2 bindet, und eine FR, die von einer schweren Kette humaner Herkunft abstammt (beispielsweise von 4B4'CL). In einer weiteren Ausführungsform umfasst die leichte Kette drei CDRs, die von der leichten Kette des 1D9 Antikörpers abstammen, und die schwere Kette umfasst drei CDRs, die von der schweren Kette des 1D9 Antikörpers abstammen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch leichte Ketten von humanisiertem Immunglobulin und Antigen-bindende Fragmente davon (beispielsweise umfassend CDR1, CDR2 und CDR3 der leichten Ketten des 1D9 Antikörpers und eine humane leichte Ketten FR) und schwere Ketten von humanisiertem Immunglobulin und Antigen-bindende Fragmente davon (beispielsweise umfassend CDR1, CDR2 und CDR3 der schweren Ketten des 1D9 Antikörpers und eine humane schwere Ketten FR). In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die hier beschriebenen humanisierten schweren und leichten Ketten (beispielsweise eine humanisierte leichte Kette, die die variable Region der in 7 (Seq. ID. Nr. 9) gezeigten leichten Kette umfasst, eine humanisierte schwere Kette, die die variable Region der in 8 (Seq. ID. Nr. 10) gezeigten schweren Kette umfasst).
Die Erfindung betrifft weiter ein Bindungsspezifität für CCR2 aufweisendes, humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon, das eine schwere Kette und eine leichte Kette umfasst, worin die leichte Kette mindestens eine von dem monoklonalen Maus Antikörper 1D9 abstammende verantwortliche Region für die Erkennung eines Antigens und eine von der leichten Kette des humanen Antikörpers HF-21/28 abstammende Gerüstregion aufweist, und worin die schwere Kette mindestens eine von dem monoklonalen Maus Antikörper 1D9 abstammende und für die Erkennung eines Antigens verantwortliche Region und eine von der schweren Kette des humanen Antikörpers 4B4'CL abstammende Gerüstregion aufweist. In einer Ausführungsform umfasst die leichte Kette drei von der leichten Kette des 1D9 Antikörpers abstammende und für die Erkennung eines Antigens verantwortliche Regionen und die schwere Kette umfasst drei von der schweren Kette des 1D9 Antikörpers abstammende und für die Erkennung eines Antigens verantwortliche Regionen. In einer weiteren Ausführungsform sind die für die Erkennung eines Antigens verantwortlichen Regionen, die von der leichten Kette von 1D9 abstammen, die Aminosäuren 24–39 der Seq. ID. Nr. 9, die Aminosäuren 55–61 der Seq. ID. Nr. 9 und Aminosäuren 94–102 der Seq. ID. Nr. 9, und die für die Erkennung eines Antigens verantwortlichen Regionen, die von der schweren Kette abstammen, sind Aminosäuren 31–35 der Seq. ID. Nr. 10, Aminosäuren 50–68 der Seq. ID. Nr. 10 und Aminosäuren 101–106 der Seq. ID. Nr. 10.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist und eine leichte Kette und eine komplementäre schwere Kette umfasst, worin die leichte Kette eine variable Region umfasst, die die Seq. ID. Nr. 12 umfasst. Die Erfindung betrifft auch ein humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon, das eine Bindungs spezifität für CCR2 aufweist und eine schwere Kette und eine komplementäre leichte Kette umfasst, worin die schwere Kette eine variable Region umfasst, die die Seq. ID. Nr. 17 umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist und eine schwere Kette und eine leichte Kette umfasst, worin die leichte Kette eine variable Region umfasst, die die Seq. ID. Nr. 12 umfasst, und worin die schwere Kette eine variable Region umfasst, die die Seq. ID. Nr. 17 umfasst. In einer Ausführungsform kann das humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon mit dem Maus Antikörper 1D9 um die Bindung an CCR2 konkurrieren. In einer weiteren Ausführungsform inhibiert das humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon die Bindung eines Liganden an CCR2. Die Erfindung betrifft weiterhin isolierte Nukleinsäuremoleküle, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ein humanisiertes Immunglobulin der vorliegenden Erfindung codiert (beispielsweise einen Einzelketten-Antikörper), sowie isolierte Nukleinsäuremoleküle, die eine Sequenz umfassen, die eine leichte Kette eines humanisierten Immunglobulins (beispielsweise die Nukleotide 52–390 von Seq. ID. Nr. 95 umfassend) oder eine schwere Kette (beispielsweise die Nukleotide 58–411 von Seq. ID. Nr. 96 umfassend) der vorliegenden Erfindung codiert. Beispielsweise stellt die vorliegende Erfindung ein Gen bereit (beispielsweise ein fusioniertes Gen), dass eine leichte oder schwere Kette eines humanisierten Immunglobulins codiert, die eine erste Nukleinsäuresequenz umfasst, die eine von dem monoklonalen Maus Antikörper 1D9 abstammende Antigen-bindende Region codiert, und eine zweite Nukleinsäuresequenz, die mindestens einen Bereich einer konstanten Region von einem Immunglobulin humanen Ursprungs codiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Konstrukt, das ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das ein humanisiertes Immunglobulin mit einer Bindungsspezifität für CCR2 oder eine Kette eines derartigen Immunglobulins codiert. Beispielsweise wird ein Expressionsvektor bereitgestellt, der ein Gen umfasst (beispielsweise ein fusioniertes Gen), das eine leichte Kette eines humanisierten Immunglobulins codiert, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die eine von einer leichten Kette eines nicht-humanen Antikörpers mit Bindungsspezifität für CCR2 abstammende CDR codiert und eine von einer leichten Kette humaner Herkunft abstammende Gerüstregion. Ein Expressionsvektor, der ein Gen umfasst, das eine schwere Kette eines humanisierten Immunglobulins codiert, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die eine von einer schweren Kette eines nicht-humanen Antikörpers mit Bindungsspezifität für CCR2 abstammende CDR codiert und eine von einer schweren Kette humaner Herkunft abstammende Gerüstregion, ist ein weiteres Beispiel eines derartigen Konstrukts.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung umfasst, einschließlich ein oder mehrere Konstrukte, die ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung umfassen. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Wirtszelle, die eine erste rekombinante Nukleinsäure umfasst, die eine leichte Kette eines humanisierten Immunglobulins codiert, und eine zweite rekombinante Nukleinsäure, die eine schwere Kette codiert, worin die erste Nukleinsäure eine von der leichten Kette des Maus Antikörpers 1D9 abstammende CDR codierende Nukleotidsequenz umfasst und eine von einer leichten Kette humaner Herkunft abstammende Gerüstregion, und die zweite Nukleinsäure eine von der schweren Kette des Maus Antikörpers 1D9 abstammende CDR codierende Nukleotidsequenz umfasst und eine von einer schweren Kette humaner Herkunft abstammende Gerüstregion.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Anfertigung eines humanisierten Immunglobulins bereit, das das Halten einer Wirtszelle der vorliegenden Erfindung unter den für die Expression des humanisierten Immunglobulins angebrachten Bedingungen umfasst, wobei (eine) Kette(n) des humanisierten Immunglobulins exprimiert wird (werden) und ein humanisiertes Immunglobulin hergestellt wird. Das Verfahren kann weiterhin den Schritt des Isolierens des humanisierten Immunglobulins umfassen.
Die humanisierten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung können weniger immunogen sein, als deren Maus oder nicht-humanen Gegenstücke. Deshalb können die hier beschriebenen humanisierten Immunglobuline als therapeutische Mittel in Menschen verwendet werden, beispielsweise zur Steuerung des Lymphozyten Homings an lymphoide Schleimgewebe, dabei reduzieren sie die Entzündungsantworten.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein humanisiertes Immunglobulin der vorliegenden Erfindung für die Verwendung in der Diagnose oder der Therapie (einschließlich der Prophylaxe). In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein humanisiertes Immunglobulin der vorliegenden Erfindung für die Verwendung in der Behandlung von Erkrankungen, die mit Leukozyteninfiltration in Geweben in Verbindung gebracht werden, beispielsweise in der Behandlung von Entzündungserkrankungen, Autoimmunerkrankungen, Abstoßungsreaktion, HIV Infektion und Monozyten-vermittelte Störungen, wie beispielsweise Arteriosklerose.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines humanisierten Immunglobulins der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Erkrankungen, die mit Leukozyteninfiltration in Geweben in Verbindung gebracht werden, beispielsweise in der Behandlung von Entzündungserkrankungen, Autoimmunerkrankungen, Monozyten-vermittelte Störungen, wie beispielsweise Arteriosklerose, Abstoßungsreaktion oder HIV Infektion.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Inhibition der Interaktion einer Zelle, die einen Säugetier CCR2 trägt (beispielsweise humanen, nicht-humanen Primaten oder Maus), mit einem Liganden davon, umfassend dem in Kontakt bringen der Zelle mit einer wirksamen Menge eines Antikörpers oder funktionalen Fragments davon, der an ein Säugetier CCR2 oder an einen Bereich von CCR2 bindet. Geeignete Zellen schließen Granulozyten, Leukozyten, wie beispielsweise Monozyten, Makrophagen, Basophile, und Eosinophile, Mastzellen und Lymphozyten, einschließlich T-Zellen (beispielsweise CD8+ Zellen, CD4+ Zellen, CD25+ Zellen, CD45RO+ Zellen) und andere Zellen, die CCR2 exprimieren, wie beispielsweise eine rekombinante CCR2 exprimierende Zelle (beispielsweise transfizierte Zellen) ein. In einer besonderen Ausführungsform ist der Antikörper 1D9 oder ein Antikörper, der mit 1D9 um die Bindung an humanen CCR2 oder an einen Bereich des humanen CCR2 konkurrieren kann.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Inhibition der Interaktion einer Zelle, die einen Säugetier CCR2 trägt, mit einem Chemokin, umfassend dem in Kontakt bringen der Zelle mit einer wirksamen Menge eines Antikörpers oder funktionalen Fragment davon, der an ein CCR2 oder an einen Bereich des Rezeptors bindet. In einer Ausführungsform des Verfahrens ist der Antikörper oder das Fragment davon jeglicher oder mehrere von 1D9, einem Antigen-bindendes Fragment von 1D9 oder einem Antikörper oder einem Fragment davon, das eine Epitopspezifität aufweist, die mit der von 1D9 übereinstimmt oder ihr ähnlich ist. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Inhibition einer mit der Bindung eines Chemokins an CCR2 in Verbindung stehenden Funktion, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Antikörpers oder funktionalen Fragments davon, der/das an ein Säugetier CCR2 Protein oder an einen Bereich des Rezeptors bindet. In einer Ausführungsform des Verfahrens ist der Antikörper oder das funktionale Fragment davon jeglicher oder mehrere von 1D9, einem Antigen-bindendes Fragment von 1D9 oder einem Antikörper oder einem Fragment davon, das eine Epitopspezifität aufweist, die mit der von 1D9 übereinstimmt oder ihr ähnlich ist.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Ermittlung der Expression eines Säugetier CCR2 oder eines Bereichs des Rezeptors durch eine Zelle. Gemäß dem Verfahren wird eine Zusammensetzung, die eine Zelle oder Fraktion davon (beispielsweise Membranfraktion) umfasst, mit einem Antikörper oder funktionalen Fragment davon (beispielsweise 1D9 oder 8G2) in Verbindung gebracht, der/das an ein Säugetier CCR2 Protein oder Bereich des Rezeptors unter Bedingungen bindet, die für die Bindung des Antikörpers daran angemessen sind, und die Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper oder Fragment und dem Protein oder Bereich davon wird nachgewiesen. Der Nachweis des Komplexes, direkt oder indirekt, deutet auf die Gegenwart des Rezeptors auf der Zelle hin. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Kit zur Verwendung in dem Nachweis der Gegenwart von CCR2 oder eines Bereichs davon in einer biologischen Probe, das einen Antikörper oder funktionales Fragment davon umfasst, der/das an einen Säugetier CC-Chemokin Rezeptor 2 oder einen Bereich des Rezeptors bindet, und ein oder mehrere ergänzende Reagenzien, die für den Nachweis der Gegenwart eines Komplexes zwischen dem Antikörper oder Fragment und dem Protein oder Bereich davon geeignet sind.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verfahren zur Ermittlung zusätzlicher Liganden oder anderer Substanzen, die an ein Säugetier CCR2 Protein binden, einschließlich Inhibitoren und/oder Promotoren der Säugetier CCR2 Funktion. Beispielsweise können Mittel, die die gleiche oder eine ähnliche Bindungsspezifität wie die des Antikörpers der vorliegenden Erfindung oder des funktionalen Fragments davon aufweisen, durch einen Konkurrenz-Assay mit dem Antikörper oder Fragment ermittelt werden. Daher umfasst die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Ermittlung von Liganden oder anderen Substanzen, die den CCR2 Rezeptor binden, einschließlich Inhibitoren (beispielsweise Antagonisten) oder Promotoren (beispielsweise Agonisten) der Rezeptorfunktion. In einer Ausführungsform werden Zellen, die natürlich das CCR2 Rezeptorprotein exprimieren, oder geeignete Wirtszellen, die zur Expression eines CCR2 Rezeptors oder einer durch eine in die Zellen eingeführte Nukleinsäure codierte Variante entwickelt wurden, in einem Assay verwendet, um die Wirksamkeit von Liganden, Inhibitoren oder Promotoren der Rezeptorfunktion zu ermitteln und zu bewerten. Derartige Zellen sind auch zur Bewertung der Funktion des exprimierten Rezeptorproteins oder Polypeptids nützlich.
Daher betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Ermittlung und zum Nachweis eines Mittels, das an einen Säugetier CCR2 oder an eine Ligand-bindende Variante davon bindet, umfassend das Kombinieren eines zu testenden Mittels, eines Antikörpers oder Antigen-bindendes Fragment der vorliegenden Erfindung (beispielsweise monoklonaler Antikörper 1D9, ein Antikörper, der eine Epitopspezifität aufweist, die die gleiche oder ähnlich der von 1D9 ist, Antigen-bindende Fragmente von 1D9, monoklonaler Antikörper 8G2, ein Antikörper, der eine Epitopspezifität aufweist, die die gleiche oder ähnlich der von 8G2 ist und Antigen-bindende Fragmente von 8G2) und einer Zusammensetzung, die ein Säugetier CCR2 Protein oder eine Ligand-bindende Variante davon umfasst. Die vorstehenden Verbindungen können unter den für die Bindung des Antikörpers oder des Antigen-bindenden Fragments an das Säugetier CCR2 Protein oder an eine Ligand-bindende Variante davon geeigneten Bedingungen kombiniert werden, und die Bindung des Antikörpers oder Fragments an das Säugetier CCR2 Protein oder an die Ligand-bindende Variante wird gemäß der hier beschriebenen Verfahren oder anderen geeigneten Verfahren entweder direkt oder indirekt nachgewiesen oder erfasst. Eine Abnahme in der Menge des Komplexes, der relativ zu einer geeigneten Kontrolle gebildet wird (beispielsweise in der Abwesenheit des zu testenden Mittels), deutet darauf hin, dass das Mittel an den Rezeptor oder die Variante bindet. Die ein Säugetier CCR2 Protein oder eine Ligand-bindende Variante davon umfassende Zusammensetzung kann eine Membranfraktion einer Zelle sein, die ein rekombinantes CCR2 Protein oder eine Ligand-bindende Variante davon trägt. Der Antikörper oder das Fragment davon kann mit einer Markierung wie beispielsweise einem Radioisotop, einer Spin-Markierung (spin label), Antigen-Markierung, Enzym-Markierung, mit fluoreszenten Gruppen und chemilumineszenten Gruppen markiert werden. Diese und ähnliche Assays können zum Nachweis von Mitteln verwendet werden, einschließlich von Liganden (beispielsweise Chemokine, die mit CCR2 Wechselwirken) oder anderen Substanzen, einschließlich Inhibitoren und Promotoren der Rezeptorfunktion, die an CCR2 binden können und mit den hier beschriebenen Antikörpern um die Bindung an den Rezeptor konkurrieren.
Erfindungsgemäß können Liganden, Inhibitoren oder Promotoren der Rezeptorfunktion in einem geeigneten Assay ermittelt und für therapeutische Zwecke weiter bewertet werden. Inhibitoren der Rezeptorfunktion können zur Inhibition (reduzieren oder verhindern) der Rezeptoraktivität verwendet werden, und Liganden und/oder Promotoren können dort wo es angedeutet ist zur Einleitung (auslösen oder erhöhen) der normalen Rezeptorfunktion verwendet werden. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen, Arteriosklerose und Abstoßungsreaktionen oder HIV-Infektionen bereit, umfassend die Verabreichung einer Inhibitor- oder Rezeptorfunktion (beispielsweise Chemokinbindung oder HIV-Bindung) an ein Individuum (beispielsweise ein Säugetier, wie beispielsweise ein Mensch). Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Stimulation der Rezeptorfunktion durch Verabreichung eines neuen Liganden oder Promotor an ein Individuum bereit, und stellt einen neuen Ansatz zur selektiven Stimulation der Leukozytenfunktion bereit, der beispielsweise in der Behandlung von infektiösen Erkrankungen und Krebs nützlich ist.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Inhibition der HIV-Infektion einer Zelle, die einen Säugetier CCR2 oder einen Bereich davon exprimiert, das ein in Verbindung bringen der Zelle mit einer wirksamen Menge eines Antikörpers oder funktionalen Fragments davon umfasst, das an einen Säugetier CCR2 oder Bereich des Rezeptors bindet und die HIV-Bindung und Infektion inhibiert. In einer bestimmten Ausführungsform der Erfindung ist der Antikörper oder das funktionale Fragment davon jeglicher von 1D9, einem Antikörper, der eine Epitopspezifität aufweist, die die gleiche oder ähnlich der von 1D9 ist, einem Antikörper der mit 1D9 um die Bindung an humanen CCR2 konkurrieren kann und Antigen-bindende Fragmente davon.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Inhibition (beispielsweise behandeln) von HIV in einem Patienten, das die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Antikörpers oder funktionalen Fragments davon an den Patienten umfasst, der/das an einen Säugetier CCR2 oder einen Bereich des Rezeptors bindet und die Bindung von HIV an den CCR2 Rezeptor inhibiert. Der anti-CCR2 Antikörper oder das Fragment kann allein oder in Kombination mit einem oder mehreren zusätzlichen therapeutischen Mitteln verabreicht werden, beispielsweise mit einem oder mehreren Antikörpern, die einen Co-Rezeptor für die HIV-Infektion binden und die Bindung an den Co-Rezeptor inhibieren, wie beispielsweise ein anti-CCR3, anti-CCR5 und/oder anti-CXCR4 Antikörper.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Verhindern oder Inhibieren einer HIV-Infektion in einem Individuum, das die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Antikörpers oder funktionalen Fragments davon an das Individuum umfasst, der/das an CCR2 bindet und eine HIV-Bindung an CCR2 inhibiert. Gemäß dem Verfahren schließt die Verhinderung einer HIV-Infektion eine Behandlung ein, um eine Infektion von neuen Zellen in einem infizierten Individuum zu verhindern (reduzieren oder eliminieren) oder um eine Infektion in einem Individuum zu verhindern, das eventuell HIV ausgesetzt ist, eventuell ausgesetzt gewesen ist oder ausgesetzt gewesen ist. Beispielsweise können Individuen, wie beispielsweise ein HIV-infiziertes Individuum, ein Fötus einer HIV-infizierten Frau oder ein Arbeiter im Gesundheitssystem, gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Inhibition des Leukozytentrafficking in einem Patienten, das die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Antikörpers oder funktionalen Fragments davon an den Patienten umfasst, der/das an einen Säugetier CCR2 oder einen Bereich des Rezeptors bindet und die mit der Bindung eines Liganden an den Rezeptor in Verbindung stehenden Funktionen inhibiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Inhibition oder Behandlung von CCR2-vermittelten Störungen, wie beispielsweise von entzündlichen Störungen, das die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Antikörpers oder funktionalen Fragments davon an den Patienten umfasst, der/das an einen Säugetier CCR2 oder einen Bereich des Rezeptors bindet und CCR2-vermittelte Funktionen inhibiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen wie hier beschriebenen Antikörper oder Fragment davon (beispielsweise monoklonalen Antikörper 1D9 oder Antigen-bindendes Fragment davon) zur Verwendung in der Therapie (einschließlich Prophylaxe) oder der Diagnose, und die Verwendung eines derartigen Antikörpers oder Fragments zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer CCR2-vermittelten Störung oder anderen Erkrankung oder einem wie hier beschriebenen entzündlichen Zustand.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die 1A–1O sind FACS (Fluoreszenz aktiviertes Zellscanning) Histogrammprofile, die zeigen, dass mAbs 1D9 und 8G2 CCR2-Transfektanten färben, nicht aber CCR5 oder CCR1-Transfektanten. L1/2 (hier auch als L1.2 bezeichnet) Maus pre-B Lymphom Wirtszellen wurden wie angedeutet mit CCR2, CCR5 und CCR1 transfisziert und mit Antikörpern mit unterschiedlichen Rezeptorspezifitäten gefärbt. Die Färbung wurde durch Fluß-Cytometrie analysiert.
Die 2A–2L sind FACS Punktausdrucke (dot plots), die die Expression von CCR2 auf den meisten Monozyten, einer Lymphozyten-Subpopulation und einer kleinen Untermenge von Granulozyten zeigen. Vollblut-Zellen wurden mit einem der drei anti-CCR2 mAbs gefärbt (5A11, erzeugt durch Verwenden eines Peptids, das aus den ersten 32 Aminosäuren des CCR2 Aminoterminus besteht, als Immunogen, und 1D9 und 8G2, erzeugt wie hier beschrieben durch Verwenden von CCR2b L1/2 Zelltransfektanten als Immunogen). Die Färbung wurde durch Fluß-Cytometrie analysiert und die Lymphozyten, Granulozyten und Monozyten Populationen wurden unter Verwendung der Vorwärts- und Seiten-Lichtstreuung gerastert bzw. gegated. Die X-Achse zeigt die Vorwärts-Lichtstreuung (ein Maß für die Zellgröße) und die Y-Achse die Fluoreszenzintensität der Färbung für CCR2. Das Niveau der Negativkontroll-Färbung ist durch eine Linie angedeutet.
3A–3I sind FACS Punktausdrucke, die zeigen, dass mAb 1D9 eine IgE positive Population im peripheren Blut (Basophile) unter der Verwendung einer zwei-Farben Färbung für IgE und CCR2 färbt. Vollblut-Zellen wurden zuerst entweder mit einem Negativkontroll-Antikörper (anti-Flag), einem anti-CCR2 Antikörper 1D9 oder einem anti-CXCR1 Antikörper wie angedeutet gefärbt und durch ein anti-Maus-FITC Konjugat nachgewiesen. Wie angedeutet wurde eine zweite Färbung entweder mit PBS oder einem biotinylierten Antikörper gemacht, der spezifisch für IgE oder CD 16 ist, und mit einem Streptavidin-Phycoerythrin nachgewiesen. Die Färbung wurde durch Fluß-Cytometrie analysiert.
4 erläutert, dass mAb 1D9 die Bindung von [¹²⁵I]MCP-1 an THP-1 Zellmembranen inhibiert. 3,0 μg des THP-1 Membranproteins wurde mit 0,1 nM [¹²⁵I]MCP-1 in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von 1D9 oder dem Isotypen angepassten anti-CXCR3 Antikörper 1C6 inkubiert. Die Menge der gebundenen Tracer wurde durch die Trennung von freien und gebundenen Tracern durch Filtration und Szintillationszählung nachgewiesen. Die Daten wurden zur Bestimmung des IC₅₀-Wertes durch nicht-lineare Regression unter Verwendung einer 4-Parameter logistischen Gleichung mit der Kaleida- Graph Software analysiert.
5 erläutert, dass mAb 1D9 die [¹²⁵I]MCP-1 Bindung an frisches human PBMC inhibiert. Frisch isolierte mononukleare Zellen (500.000) aus peripherem Blut wurden mit 0,1 nM [¹²⁵I]MCP-1 in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von 1D9 oder dem Isotypen angepassten anti-CXCR3 Antikörper 1C6 inkubiert. Die Menge der gebundenen Tracer wurde durch die Trennung von freien und gebundenen Tracern durch Filtration und Szintillationszählung nachgewiesen. Die Daten wurden zur Bestimmung des IC₅₀-Wertes durch nicht-lineare Regression unter Verwendung einer 4-Parameter logistischen Gleichung mit der KaleidaGraph Software analysiert.
6A und 6B sind Graphen, die aufzeigen, dass mAb 1D9 die MCP1-induzierte Chemotaxis von frischem PBMC inhibiert, aber nicht die RANTES-induzierte Chemotaxis. 6A zeigt das Ergebnis eines Chemotaxis Assays von PBMC bis 10 nM MCP-1 ohne Antikörper oder 0,1 bis 10 μg/ml von 1D9 oder des unspezifischen Maus IgG2a. Die spontane unspezifische Migration ist auch angedeutet. 6B zeigt das Ergebnis eines Chemotaxis Assays von PBMC bis 10 nM RANTES ohne Antikörper 10 μg/ml 1D9 10 μg/ml des unspezifischen Maus IgG2a. Die spontane unspezifische Migration in Abwesenheit von RANTES ist auch angedeutet.
7 zeigt die Aminosäuresequenz (Seq. ID. Nr. 9) der variablen Region Kappa der leichten Kette des Maus 1D9 Antikörpers. Die CDRs sind durch Fettschrift hervorgehoben.
8 zeigt die Aminosäuresequenz (Seq. ID. Nr. 10) der variablen Region der schweren Kette des Maus 1D9 Antikörpers. Die CDRs sind durch Fettschrift hervorgehoben.
9 erläutert die kanonischen Klassen von CDRs in der V_K Region des Maus Antikörpers 1D9. "Chothia kanonische Klassen" deutet darauf hin, wo die kanonischen Klassen verwendet wurden, wie sie durch Chothia und seine Kollegen definiert wurden (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 197: 901(1987); Chothia et al., Nature 34: 877 (1989); Tramontane et al., J. Mol. Biol. 215: 175 (1990); and Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799 (1992)), während "Martin kanonische Klassen" darauf hindeutet, wo die durch Martin und Thornton definierten kanonischen Klassen verwendet wurden (Martin and Thornton, J. Mol. Biol. 263: 800 (1996)). FR-Reste sind durch Fettschrift hervorgehoben.
10 erläutert die kanonischen Klassen von CDRs in der Maus 1D9 V_H Region. "Chothia kanonische Klassen" deutet darauf hin, wo die kanonischen Klassen verwendet wurden, wie sie durch Chothia und seine Kollegen definiert wurden (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 197: 901(1987); Chothia et al., Nature 34: 877 (1989); Tramontane et al., J. Mol. Biol. 215: 175 (1990); and Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799 (1992)), während "Martin kanonische Klassen" darauf hindeutet, wo die durch Martin und Thornton definierten kanonischen Klassen verwendet wurden (Martin and Thornton, J. Mol. Biol. 263: 800 (1996)). FR-Reste sind durch Fettschrift hervorgehoben.
11 zeigt die Aminosäuresequenzen von verschiedenen Versionen der humanisierten 1D9 V_K Region (Seq. ID. Nr. 12–15 bzw. 107). Dort wo die Reste der 1D9 V_K Region (Seq. ID. Nr. 9) und die humane HF-21/28 V_K Region (Seq. ID. Nr. 11) übereinstimmen, ist ein Punkt [.] gezeigt. Dort wo keine Aminosäure an einer spezifischen Resteposition anwesend ist, ist ein Strich [–] gezeigt. Dort wo eine Aminosäure in den HF-21/28 FRs in die humanisierte 1D9 V_K Region gewechselt ist, ist sie durch Fettschrift hervorgehoben. Die CDRs sind durch die Verwendung der Nomenklatur [=L1=] beschrieben. Die verwendete Nummerierung entspricht Kabat et al., Sequences of Proteins of immunological interest, 5. Ausgabe, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991).
12 zeigt die Aminosäuresequenzen von verschiedenen Versionen der humanisierten 1D9 V_H Region (Seq. ID. Nr. 17–20). Dort wo die Reste der 1D9 V_H Region (Seq. ID. Nr. 10) und die humane 4B4'CL V_H Region (Seq. ID. Nr. 16) übereinstimmen, ist ein Punkt [.] gezeigt. Dort wo keine Aminosäure an einer spezifischen Resteposition anwesend ist, ist ein Strich [–] gezeigt. Dort wo eine Aminosäure in der 4B4'CL in die humanisierte 1D9 V_H Region gewechselt ist, ist sie durch Fettschrift hervorgehoben. Die CDRs sind durch die Verwendung der Nomenklatur [=H1=] beschrieben, während [ ] einen Teil des H1 Struktur-Loops anzeigt. Die verwendete Nummerierung entspricht Kabat et al., Sequences of Proteins of immunological interest, 5. Ausgabe, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991).
13 zeigt einen Vergleich eines Bereichs der Maus 1D9 V_K Region (Seq. ID. Nr. 21) mit Maus Keimbahn V_K Gensequenzen (Seq. ID. Nr. 22–33). "Identische Reste" bezeichnet die Anzahl an identischen Resten in einer Maus Keimbahn V_K Region verglichen mit einer Maus 1D9 V_K Region. Dort wo die Reste der 1D9 V_K Region und die Maus Keimbahn V_K Regionsequenzen übereinstimmen, ist ein Punkt [.] gezeigt. Dort wo keine Aminosäure an einer spezifischen Resteposition anwesend ist, ist ein Strich [–] gezeigt.
14 zeigt einen Vergleich eines Bereichs der Maus 1D9 V_H Region (Seq. ID. Nr. 34) mit Maus Keimbahn V_H Gensequenzen (Seq. ID. Nr. 35–53). "Identische Reste" bezeichnet die Anzahl an identischen Resten in einer Maus Keimbahn V_H Region verglichen mit einer Maus 1D9 V_H Region. Dort wo die Reste der 1D9 V_H Region und die Maus Keimbahn V_H Regionsequenzen übereinstimmen, ist ein Punkt [.] gezeigt. Dort wo keine Aminosäure an einer spezifischen Resteposition anwesend ist, ist ein Strich [–] gezeigt.
15 zeigt einen Vergleich eines Bereichs der Maus 1D9 V_K Region (Seq. ID. Nr. 9) mit den 17 am meisten homologen humanen V_K Aminosäuresequenzen (Seq. ID. Nr. 54–70). "ID" bezeichnet die Identität der humanen V_K Sequenzen verglichen mit der Maus 1D9 V_K Region in Prozent. Dort wo die Reste der 1D9 V_K Region und die humane V_K Region übereinstimmen, ist ein Punkt [.] gezeigt. Dort wo keine Aminosäure an einer spezifischen Resteposition anwesend ist, ist ein Strich [–] gezeigt. "S" bezeichnet die Aminosäureposition auf der Oberfläche der F_V Domäne. "C" deutet auf Reste hin, die sich innerhalb des Kerns der F_V Domäne befinden. Reste innerhalb von 5 × 10^–10 m (5 Å) einer CDR werden durch Großbuchstaben definiert, während solche, die sich weiter entfernt befinden, mit Kleinbuchstaben beschrieben werden. Die CDRs selbst werden durch Verwendung der Nomenklatur ==L1== beschrieben. "v" bezeichnet die Vernier-Reste (Foote und Winter, J. Mol. Biol. (1992), 224: 487), die sich in den FRs befinden. Diese Reste in den humanen V_K Region Sequenzen, die unterstrichen sind, unterscheiden sich von ihrem nächsten humanen V_K Keimlinien Gen. Die verwendete Nummerierung entspricht Kabat et al., Sequences of Proteins of immunological interest, 5. Ausgabe, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991).
16 zeigt einen Vergleich der Maus 1D9 V_K Region mit den 17 am meisten homologen humanen V_K Aminosäuresequenzen. "ID" bezeichnet die Identität der humanen V_K Sequenzen verglichen mit der Maus 1D9 V_K Region in Prozent. "Oberfläche" bezeichnet die Anzahl von identischen Resten auf der Oberfläche. "Kern" bezeichnet die Anzahl von identischen Resten innerhalb des Kerns der F_V Domäne. "CDR" bezeichnet die Anzahl von identischen Resten innerhalb der CDRs. "FR" bezeichnet die Anzahl von identischen Resten innerhalb der FRs. "FR Oberfläche" bezeichnet die Anzahl von identischen Resten, die oberflächenexponiert sind. "FR Kern" bezeichnet die Anzahl von identischen Resten, die innerhalb des Kerns der F_V Domäne angeordnet sind. "FR Nahe CDR" bezeichnet die Anzahl von identischen Resten unter den FR Aminosäuren innerhalb von 5 × 10^–10 m (5 Å) einer CDR. "Vernier" bezeichnet die Anzahl von identischen Resten unter den 14 Vernier Aminosäuren (Foote and Winter, J. Mol. Biol. 224: 487 (1992)). "V_K" bezeichnet die Anzahl von identischen Resten innerhalb des V_K Gens. "J Kette" bezeichnet die Anzahl von identischen Resten innerhalb des J Ketten Gens. "L1 Len" bis "L3 Len" definiert die Anzahl von Resten in jeder CDR, während "L1 Klasse" bis "L3 Klasse" die kanonischen Klassen der CDR nach Martin und Thornton beschreibt (Martin and Thornton, J. Mol. Biol. 263: 800 (1996)).
17A–17B zeigen einen Vergleich der Maus 1D9 V_H Region (Seq. ID. Nr. 10) mit den 24 am meisten homologen humanen V_H Aminosäuresequenzen (Seq. ID. Nr. 71–94). "ID" bezeichnet die Identität der humanen V_H Sequenzen verglichen mit der Maus 1D9 V_H Region in Prozent. Dort wo die Reste der 1D9 V_H Region und die humane V_H Region übereinstimmen, ist ein Punkt [.] gezeigt. Dort wo keine Aminosäure an einer spezifischen Resteposition anwesend ist, ist ein Strich [–] gezeigt. "S" bezeichnet die Aminosäureposition auf der Oberfläche der F_V Domäne. "C" deutet auf Reste hin, die sich innerhalb des Kerns der F_V Domäne befinden. Reste innerhalb von 5 × 10^–10 m (5 Å) einer CDR werden durch Großbuchstaben definiert, während solche, die sich weiter entfernt befinden, mit Kleinbuchstaben beschrieben werden. Die CDRs selbst werden durch Verwendung der Nomenklatur ==H1== beschrieben. "v" bezeichnet die Vernier-Reste (Foote and Winter, J. Mol. Biol. (1992), 224: 487), die sich in den FRs befinden. Diese Reste in den humanen V_H Region Sequenzen, die unterstrichen sind, unterscheiden sich von ihrem nächsten humanen V_H Keimlinien Gen. Die verwendete Nummerierung entspricht Kabat et al., Sequences of Proteins of immunological interest, 5. Ausgabe, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991).
18A–18B zeigen einen Vergleich der Maus 1D9 V_H Region mit den 24 am meisten homologen humanen V_H Aminosäuresequenzen. "ID" bezeichnet die Identität der humanen V_H Sequenzen verglichen mit der Maus 1D9 V_H Region in Prozent. "Oberfläche" bezeichnet die Anzahl von identischen Resten auf der Oberfläche. "Kern" bezeichnet die Anzahl von identischen Resten innerhalb des Kerns der F_V Domäne. "CDR" bezeichnet die Anzahl von identischen Resten innerhalb der CDRs. "FR" bezeichnet die Anzahl von identischen Resten innerhalb der FRs. "FR Oberfläche" bezeichnet die Anzahl von identischen Resten, die oberflächenexponiert sind. "FR Kern" bezeichnet die Anzahl von identischen Resten, die innerhalb des Kerns der F_V Domäne angeordnet sind. "FR Nahe CDR" bezeichnet die Anzahl von identischen Resten unter den FR Aminosäuren innerhalb von 5 × 10^–10 m (5 Å) einer CDR. "Vernier" bezeichnet die Anzahl von identischen Resten unter den 14 Vernier Aminosäuren (Foote and Winter, J. Mol. Biol. 224: 487 (1992)). "V_H" bezeichnet die Anzahl von identischen Resten innerhalb des V_H Gens. "J Kette" bezeichnet die Anzahl von identischen Resten innerhalb des J Ketten Gens. "H1 Größe" bis "H3 Größe" definiert die Anzahl von Resten in jeder CDR, während "H1 Klasse" und "H2 Klasse" die kanonischen Klassen der CDR nach Martin und Thornton beschreibt (Martin and Thornton, J. Mol. Biol. 263: 800 (1996)).
19A–19C zeigen einen Abgleich bzw. ein Alignment von Aminosäuresequenzen, die zur Gestaltung der ersten (1D9RK_A) und zweiten (1D9RK_B) humanisierten Version der variablen Region Kappa der leichten Kette des 1D9 Antikörpers geführt haben. Aminosäuren, die an einer bestimmten Resteposition identisch mit dem Maus 1D9 sind, sind in Spalte 7 nicht gezeigt; "–" bedeutet, dass sich an dieser Stelle keine Aminosäure befindet. Fett geschriebene Drucktypen bezeichnen Positionen in FRs und CDRs, an denen der humane Aminosäurerest durch den entsprechenden Maus-Rest ersetzt wurde. "Δ" bezeichnet die Anzahl der Ersetzungen/Auswechselungen in den humanen FRs von 1D9RK_A. "Maus 1D9 V_K" bezeichnet die Aminosäuresequenz der V_K Region der variablen Region Kappa der leichten Kette von Maus 1D9. "Maus κ-II" bezeichnet die Konsensussequenz der Maus V_K Regionen der Kabat Untergruppe κ-II. "Human κ-II" bezeichnet die Konsensussequenz der humanen V_K Regionen der Kabat Untergruppe κ-II. "HF-21/18" bezeichnet die Aminosäuresequenz der variablen Region der leichten Kette des humanen HF-21/28 Antikörpers (Chastagner et al., Gene 101 (2): 305–6 (1991)). Die Nummer in Klammern (005056) ist die Kabat Datenbank ID-Nummer. "Oberfläche oder Kern" bezeichnet die Position der Aminosäure im Verhältnis zu dem Rest der Reste in beiden Ketten der variablen Regionen des Antikörpers. Reste innerhalb von 5 × 10^–10 m (5 Å) einer CDR werden durch Großbuchstaben definiert. "1D9RK_A" bezeichnet die Aminosäuresequenz der ersten Version der humanisierten 1D9 V_K Region. "1D9RK_B" bezeichnet die Aminosäuresequenz der zweiten Version der humanisierten 1D9 V_K Region.
20A–20C zeigen das Alignment von Aminosäuresequenzen, die zu der Gestaltung der ersten (1D9RH_A) und zweiten (1D9RK_B) humanisierten humanen Version der variablen Region Kappa der leichten Kette des 1D9 Antikörpers geführt haben. Aminosäuren, die an einer bestimmten Resteposition identisch mit dem Maus 1D9 sind, sind in Spalte 7 nicht gezeigt; "–" bedeutet, dass sich an dieser Stelle keine Aminosäure befindet. Fett geschriebene Drucktypen bezeichnen Positionen in FRs und CDRs, an denen der humane Aminosäurerest durch den entsprechenden Maus-Rest ersetzt wurde. "Δ" bezeichnet die Anzahl der Ersetzungen/Auswechselungen in den humanen FRs von 1D9RH_A. "Maus 1D9 V_H" bezeichnet die Aminosäuresequenz der V_H Region der variablen Region Kappa der schweren Kette von Maus 1D9. "Maus IIIc" bezeichnet die Konsensussequenz der Maus V_H Regionen der Kabat Untergruppe IIIc. "Human III" bezeichnet die Konsensussequenz der humanen V_H Regionen der Kabat Untergruppe III. "4B4'CL" bezeichnet die Aminosäuresequenz der variablen Region der schweren Kette des humanen 4B4'CL Antikörpers (Sanz et al., Journal of Immunology 142: 883 (1989)). Die Nummer in Klammern (000490) ist die Kabat Datenbank ID-Nummer. "Oberfläche oder Kern" bezeichnet die Position der Aminosäure im Verhältnis zu dem Rest der Reste in beiden Ketten der variablen Regionen des Antikörpers. Reste innerhalb von 5 × 10^–10 m (5 Å) einer CDR werden durch Großbuchstaben definiert. "1D9RH_A" bezeichnet die Aminosäuresequenz der ersten Version der humanisierten 1D9 V_H Region. "1D9RH_B" bezeichnet die Aminosäuresequenz der zweiten Version der humanisierten 1D9 V_H Region.
21 zeigt die Nukleotidsequenz, die komplementäre und die codierte Aminosäuresequenz der variablen Region der schweren Kette des Maus Antikörpers 1D9. Die Leitsequenz und ein Bereich der konstanten Region sind auch gezeigt. Die erläuterte Nukleotidsequenz ist Seq. ID. Nr. 96, die komplementäre Sequenz ist Seq. ID. Nr. 99 und die Aminosäuresequenz ist Seq. ID. Nr. 100.
22 zeigt die Nukleotidsequenz, die komplementäre und die codierte Aminosäuresequenz der variablen Region Kappa der leichten Kette des Maus Antikörpers 1D9. Die Leitsequenz und ein Bereich der konstanten Region sind auch gezeigt. Die erläuterte Nukleotidsequenz ist Seq. ID. Nr. 95, die komplementäre Sequenz ist Seq. ID. Nr. 101 und die Aminosäuresequenz ist Seq. ID. Nr. 102.
23 zeigt die Nukleotidsequenz der humanisierten schweren Kette 1D9RH_A. Die angedeuteten Enzymstellen wurden zum Klonieren in den Vektor pLKTOK41 zugefügt. Der Vektor weist auch humane Leitregionen und konstante Regionen auf. Die erläuterte Nukleotidsequenz ist Seq. ID. Nr. 97, die komplementäre Sequenz ist Seq. ID. Nr. 103 und die Aminosäuresequenz ist Seq. ID. Nr. 104.
24 zeigt die Nukleotidsequenz der humanisierten leichten Kette 1D9RK_A. Die angedeuteten Enzymstellen wurden zum Klonieren in den Vektor pLKTOK41 zugefügt. Der Vektor weist auch humane Leitregionen und konstante Regionen auf. Das eingeklammerte Y bezeichnet einen Rest, der sich in Aspartat wandelt, wenn er in die Eco RV Klonierungsstelle von pLKTOK41 kloniert wird. Die erläuterte Nukleotidsequenz ist Seq. ID. Nr. 98, die komplementäre Sequenz ist Seq. ID. Nr. 105 und die Aminosäuresequenz ist Seq. ID. Nr. 106.
25 erläutert einen Vergleich der Fähigkeiten von dem Maus mAb 1D9 mit denen einer humanisierten Version des mAb 1D9 (schwere Kette von 1D9RH_AV_H, leichte Kette von 1D9RK_AV_K), die Bindung von [¹²⁵I]MCP-1 an ganze THP-1 Zellen zu inhibieren. Datenpunkte für Maus 1D9 (mus-1D9) sind als geschlossene Dreiecke gezeigt. Datenpunkte für die humanisierte Version von 1D9 (hum-1D9) sind als geschlossene Quadrate gezeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Antikörper (anti-CCR2) oder funktionales Fragment davon, der/das an den Säugetier CC-Chemokin Rezeptor 2 (CCR2, CKR-2, MCP-1RA oder MCP-1RB) oder an einen Bereich davon bindet. In einer Ausführungsform weist der Antikörper eine Spezifität für einen humanen oder Rhesus CCR2 oder Bereich davon auf. In einer Ausführungsform sind die Antikörper (Immunglobuline) gegen einen isolierten und/oder rekombinanten Säugetier CCR2 oder Bereich davon (beispielsweise Peptid) oder gegen eine Säugetier CCR2 exprimierende Wirtszelle gezüchtet. In einer bevorzugten Ausführungsform binden die Antikörper spezifisch humane(n) CCR2 Rezeptor(en) (beispielsweise CCR2a und/oder CCR2b) oder einen Bereich davon, und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die Antikörper eine Spezifität für einen natürlich vorkommenden oder endogenen humanen CCR2 auf. Wie hier verwendet, bezieht sich "CC-Chemokin Rezeptor 2" ("CCR2") auf CC-Chemokin Rezeptor 2a und/oder CC-Chemokin Rezeptor 2b. Antikörper oder funktionale Fragmente davon, die eine oder mehrere für einen Säugetier CCR2 charakteristische Funktionen inhibieren können, wie eine Bindungsaktivität (beispielsweise Liganden-, Inhibitoren- und/oder Promotorenbindung), eine Signalaktivität (beispielsweise Aktivierung eines Säugetier G Proteins, Induktion einer schnellen und dauerhaften Erhöhung der Konzentration von cytosolisch freiem Calcium [Ca²⁺]i) und/oder Stimulation einer zellularen Antwort (beispielsweise Stimulation von Chemotaxis, Exocytose oder Freisetzung von Entzündungsmediatoren durch Leukozyten, Integrin Aktivierung) werden auch durch die vorliegende Erfindung umfasst, wie ein Antikörper, der die Bindung eines Liganden (d.h. eines oder mehrerer Liganden) an CCR2 und/oder mehrere durch CCR2 als Antwort auf einen Liganden vermittelte Funktionen inhibiert. In einer Ausführungsform beispielsweise können die Antikörper oder funktionalen Fragmente davon die Interaktion eines Rezeptors mit einem natürlichen Liganden, wie MCP-1, MCP-2, MCP-3 und/oder MCP-4 inhibieren (reduzieren oder verhindern). In einer weiteren Ausführungsform kann ein Antikörper oder funktionales Fragment davon, der/das an CCR2 bindet, die Bindung von MCP-1, MCP-2, MCP-3 und/oder MCP-4 und/oder HIV an den Säugetier CCR2 (beispielsweise humaner CCR2, nicht-humaner Primaten CCR2, Maus CCR2) inhibieren. Die Antikörper oder funktionalen Fragmente davon der vorliegenden Erfindung können Funktionen inhibieren, die durch humanen CCR2 vermittelt werden, einschließlich Leukozyten-trafficking, Eintritt von HIV in eine Zelle, T-Zellen Aktivierung, Freisetzten von Entzündungsmediatoren und/oder Leukozyten Degranulation. Vorzugsweise können die Antikörper oder funktionalen Fragmente davon CCR2 mit einer Affinität von mindestens ungefähr 0,1 × 10^–9 M binden, vorzugsweise mit mindestens ungefähr 1 × 10^–9 M und mehr bevorzugt mit mindestens ungefähr 3 × 10^–9 M. In einer bestimmten Ausführungsform zeigen die Antikörper oder funktionalen Fragmente davon eine Inhibition der Chemokin-induzierten (beispielsweise MCP-1 induzierten) Chemotaxis von Zellen (beispielsweise PBMC) bei weniger als ungefähr 150 μg/ml, vorzugsweise bei weniger als ungefähr 100 μg/ml, mehr bevorzugt bei weniger als ungefähr 50 μg/ml und am meisten bevorzugt bei weniger als ungefähr 20 μg/ml.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die Antikörper der Erfindung oder funktionalen Fragmente davon die Bindung eines CCR2 Liganden (beispielsweise eines Chemokins) an CCR2 mit einer IC₅₀ von weniger als ungefähr 1,0 μg/ml inhibieren, vorzugsweise von weniger als ungefähr 0,05 μg/ml und mehr bevorzugt von weniger als ungefähr 0,005 μg/ml.
Monoklonale Maus-Antikörper, die für CCR2 spezifisch sind und als 1D9 und 8G2 bezeichnet werden, wurden wie hier beschrieben hergestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform binden die Antikörper der vorliegenden Erfindung humanen CCR2 und weisen eine Epitopspezifität auf, die die gleiche oder ähnlich der von hier beschriebenen Maus 1D9 oder 2G8 Antikörpern ist. Antikörper mit einer Epitopspezifität, die die gleiche oder ähnlich der des monoklonalen Maus Antikörpers 1D9 ist, können durch ihre Fähigkeit identifiziert werden, mit dem monoklonalen Maus Antikörper 1D9 um die Bindung an humanen CCR2 zu konkurrieren (beispielsweise an Zellen, die den humanen CCR2 tragen, wie Transfektanten, die CCR2 tragen, CD8+ Zellen, CD4+ Zellen, CDR45RO+ Zellen, CD25+ Zellen, Monozyten, dendritische Zellen, Makrophagen und Basophile). Gleichermaßen können Antikörper mit einer Epitopspezifität, die die gleiche oder ähnlich der des monoklonalen Maus Antikörpers 8G2 ist, durch ihre Fähigkeit identifiziert werden, mit dem monoklonalen Maus Antikörper 8G2 um die Bindung an humanen CCR2 zu konkurrieren. Unter Verwendung von Rezeptor-Chimären (Rucker et al., Cell 87: 437–446 (1996)) wurde die Bindungsstelle von mAb 1D9 und 8G2 der aminoterminalen Domäne des humanen CC-Chemokin Rezeptors 2 zugeordnet, spezifisch einem Epitop, das von dem Protein ungefähr Aminosäure 1 bis ungefähr Aminosäure 30 umfasst. Unter Verwendung dieser oder ähnlicher geeigneter Methoden konnten Antikörper identifiziert werden, die eine Epitopspezifität aufweisen, die die gleiche oder ähnlich der eines Antikörpers der vorliegenden Erfindung ist. Die mAbs 1D9 und 8G2 weisen eine Epitopspezifität für die aminoterminale Domäne des CCR2 Rezeptors auf, beispielsweise von ungefähr Aminosäure Nummer 1 bis ungefähr Aminosäure Nummer 30 des Rezeptorproteins. Daher betrifft die Erfindung einen Antikörper oder funktionales Fragment davon, der/das an die aminoterminale Domäne oder an einen Bereich davon eines Säugetier CC-Chemokin Rezeptors 2 bindet, und insbesondere ein Epitop, das von dem Säugetier CC-Chemokin Rezeptor 2 ungefähr Aminosäure 1 bis ungefähr Aminosäure 30 umfasst.
Die Erfindung betrifft auch einen bispezifischen Antikörper oder funktionales Fragment davon (beispielsweise F(ab')₂), der/das die gleiche oder eine ähnliche Epitopspezifität aufweist, wie mindestens zwei der hier beschriebenen Antikörper (siehe beispielsweise U.S. Patent Nr. 5,141,736 (Iwasa et al.), U.S. Patent Nr. 4,444,878 , 5,292,668 , 5,523,210 (alle von Paulus et al.) und U.S. Patent Nr. 5,496,549 (Yamazaki et al.). Beispielsweise kann ein bispezifischer Antikörper der vorliegenden Erfindung die gleiche oder eine ähnliche Epitopspezifität wie mAb 1D9 und 8G2 aufweisen, so bindet er beispielsweise die aminoterminale Domäne des Säugetier CCR2 Proteins oder einen Bereich davon.
Hybridom Zelllinien, die erfindungsgemäße Antikörper produzieren, wurden am 17. Juli 1998 im Auftrag von LeukoSite, Inc., 215 First Street, Cambridge, MA 02142, U.S.A. (jetzt Millennium Pharmaceuticals, Inc., 75 Sidney Street, Cambridge, MA 02139, U.S.A.), bei der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110, U.S.A., unter den Zugangsnummern HB-12549 (1D9) und HB-12550 (8G2) hinterlegt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die unter den ATCC Zugangsnummern HB-12549 und HB-12550 hinterlegten Hybridom Zelllinien, sowie die von den unter den ATCC Zugangsnummern HB-12549 und HB-12550 hinterlegten Hybridom Zelllinien produzierten Antikörper.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können polyklonal oder monoklonal sein, und die Bezeichnung "Antikörper" soll beide Antikörper, polyklonale und monoklonale, umfassen. Weiterhin versteht sich, dass die hier beschriebenen Verfahren, die 8G2 verwenden, auch funktionale Fragmente (beispielsweise Antigen-bindende Fragmente) von 8G2, Antikörper, die die gleiche oder eine ähnliche Epitopspezifität wie 8G2 aufweisen und Kombinationen davon, verwenden können, wahlweise in Kombination mit Antikörpern oder Fragmenten, die eine Epitopspezifität aufweisen, die nicht die gleiche oder ähnlich der von 8G2 ist; gleichermaßen können Verfahren, die 1D9 verwenden, auch funktionale Fragmente (beispielsweise Antigen-bindende Fragmente) von 1D9, Antikörper, die die gleiche oder eine ähnliche Epitopspezifität wie 1D9 aufweisen, und Kombinationen davon, verwenden, wahlweise in Kombination mit Antikörpern oder Fragmenten, die eine Epitopspezifität aufweisen, die nicht die gleiche oder ähnlich der von 1D9 ist. Antikörper der vorliegenden Erfindung können gegen ein angemessenes Immunogen gezüchtet werden, wie gegen ein isoliertes und/oder rekombinantes Säugetier CCR2 Protein oder Bereich davon oder gegen synthetische Moleküle, wie synthetische Peptide. In einer bevorzugten Ausführungsform können Zellen, die einen Rezeptor exprimieren, wie transfizierte Zellen, als Immunogene verwendet werden oder in einem Screen für einen Antikörper, der den Rezeptor bindet.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung und Fragmente davon sind in den hier beschriebenen therapeutischen, diagnostischen und Untersuchungsverfahren nützlich. Die vorliegende Erfindung umfasst einen Antikörper oder funktionales Fragment davon der vorliegenden Erfindung (beispielsweise mAb 1D9 oder 8G2 oder Antigen-bindendes Fragment davon) zur Verwendung in der Therapie (einschließlich Prophylaxe) oder der Diagnose (beispielsweise von bestimmten hier beschriebenen Erkrankungen oder Zuständen), und die Verwendung derartiger Antikörper oder funktionalen Bereichen davon zur Herstellung eines Medikaments für die Verwendung in der Behandlung von hier beschriebenen Erkrankungen oder Zuständen.
Die Herstellung eines immunisierenden Antigens und die polyklonale und monoklonale Antikörperproduktion kann wie hier beschrieben durchgeführt werden oder unter der Verwendung anderer geeigneter Methoden. Eine Vielfalt an Verfahren wurde beschrieben (siehe beispielsweise Kohler et al., Nature, 256: 495497 (1975) und Eur. J. Immunol. 6: 511–519 (1976); Milstein et al., Nature 266: 550–552 (1977); Koprowski et al., U.S. Patent No. 4,172,124 ; Harlow, E. and D. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY); Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 2 (Supplement 27, Summer '94), Ausubel, F. M. et al., Eds., (John Wiley & Sons: New York, NY), Chapter 11, (1991)). Im Allgemeinen kann ein Hybridom durch Fusionieren einer geeigneten unsterblich gemachten Zelllinie (beispielsweise eine Myelom Zelllinie wie SP2/0) mit Antikörper produzierenden Zellen hergestellt werden. Die Antikörper produzierenden Zellen, vorzugsweise die der Milz oder der Lymphknoten, werden aus Tieren erhalten, die mit dem Antigen von Interesse immunisiert wurden. Die fusionierten Zellen (Hybridome) können unter Verwendung von selektiven Kulturbedingungen isoliert werden und durch Begrenzen der Verdünnung kloniert werden. Zellen, die die Antikörper mit den gewünschten Bindungseigenschaften herstellen, können mittels eines geeigneten Assays selektiert werden (beispielsweise mittels ELISA).
Es können andere geeignete Verfahren zur Herstellung oder Isolierung von Antikörpern, die CCR2 binden, einschließlich humane oder künstliche Antikörper, verwendet werden, einschließlich beispielsweise Verfahren, die einen rekombinanten Antikörper (beispielsweise Einzelkette Fv oder Fab) aus einer Bank (library) selektieren oder Verfahren, die auf die Immunisierung von transgenen Tieren (beispielsweise Mäusen) angewiesen sind, und die in der Lage sind, ein Repertoire an humanen Antikörpern herzustellen (siehe beispielsweise Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551–2555 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255–258 (1993); Lonberg et al., U.S. Patent No. 5,545,806 ; Surani et al, U.S. Patent No. 5,545,807 ).
Einzelketten Antikörper und chimärische, humanisierte oder primatisierte (CDR-veredelte) Antikörper, sowie chimärische oder CDR-veredelte Einzelketten Antikörper und ähnliche, die Bereiche umfassen, die von verschiedenen Arten abgeleitet sind, werden auch von der vorliegenden Erfindung und der Bezeichnung "Antikörper" umfasst. Die unterschiedlichen Bereiche dieser Antikörper können chemisch durch herkömmliche Methoden zusammengefügt werden oder sie können als ein zusammenhängendes Protein unter Verwendung von Genmanipulationsmethoden hergestellt werden. Beispielsweise können Nukleinsäuren, die eine chimärische oder humanisierte Kette codieren, zur Herstellung eines zusammenhängenden Proteins exprimiert werden. Siehe beispielsweise Cabilly et al., U.S. Patent Nr. 4,816,567 ; Cabilly et al., European Patent Nr. 0,125,023 B1 ; Boss et al., U.S. Patent Nr. 4,816,397 ; Boss et al., European Patent Nr. 0,120,694 B1 ; Neuberger, M.S. et al., WO 86/01533 ; Neuberger, M.S. et al., European Patent Nr. 0,194,276 B1 ; Winter, U.S. Patent Nr. 5,225,539 ; Winter, European Patent Nr. 0,239,400 B1 ; und Queen et al., U.S. Patent Nr. 5,585,089 , 5,698,761 und 5,698,762 . Siehe auch Newman, R. et al., BioTechnology, 10: 1455–1460 (1992), betreffend den primatisierten Antikörper und Ladner et al., U.S. Patent Nr. 4,946,778 und Bird, R.E. et al., Scierace, 242: 423–426 (1988)) betreffend die Einzelketten Antikörper.
Zusätzlich können auch funktionale Fragmente von Antikörpern, einschließlich Fragmente von chimärischen, humanisierten, primatisierten oder Einzelketten Antikörpern hergestellt werden. Funktionale Fragmente der vorstehenden Antikörper behalten mindestens eine Bindungsfunktion und/oder Modulationsfunktion des Gesamtlängen Antikörpers, von dem sie abgeleitet sind. Bevorzugte funktionale Fragmente behalten eine Antigen-bindende Funktion eines entsprechenden Gesamtlängen Antikörpers (beispielsweise die Fähigkeit, einen Säugetier CCR2 zu binden). Besonders bevorzugte funktionale Fragmente behalten die Fähigkeit, eine oder mehrere charakteristische Funktionen eines Säugetier CCR2 zu inhibieren, wie eine Bindungsaktivität, eine Signalaktivität und/oder eine Stimulation einer zellulären Antwort. Beispielsweise kann in einer Ausführungsform ein funktionales Fragment die Interaktion von CCR2 mit einem oder mehrerer seiner Liganden (beispiels weise MCP-1, MCP-2, MCP-3 und/oder MCP-4) inhibieren und/oder eine oder mehrere Rezeptor-vermittelte Funktion(en) inhibieren, wie Leukozyten-trafficking, Eintritt von HIV in eine Zelle, T-Zellen Aktivierung, Freisetzten von Entzündungsmediatoren und/oder Leukozyten-Degranulation.
Von der Erfindung sind beispielsweise Antikörperfragmente erfasst, die in der Lage sind, an einen Säugetier CCR2 zu binden, oder Bereiche davon, einschließlich aber nicht begrenzt auf Fv, Fab, Fab' und F(ab')₂. Derartige Fragmente können beispielsweise durch enzymatische Spaltung oder durch rekombinante Methoden hergestellt werden. Beispielsweise kann die Spaltung von Papain oder Pepsin Fab bzw. F(ab')₂ Fragmente erzeugen. Antikörper können auch in einer Vielzahl verkürzter Formen unter Verwendung von Antikörpergenen hergestellt werden, in die ein oder mehrere Stop-Codons in 5'-Richtung von der natürlichen Stop-Stelle eingefügt wurden. Beispielsweise kann ein chimärisches Gen, das einen Bereich einer schweren Kette von F(ab')₂ codiert, so gestaltet sein, dass es die DNA-Sequenz enthält, die die CH₁ Domäne und die Gelenk-(Hinge-)Region der schweren Kette codiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist und eine Antigen-bindende Region nicht-humanen Ursprungs (beispielsweise Nagetier) und mindestens einen Bereich eines Immunglobulins humanen Ursprungs (beispielsweise eine humane Gerüstregion, eine humane konstante Region oder Bereich davon) umfasst. In einer Ausführungsform enthält das humanisierte Immunglobulin eine CCR2 bindende Antigen-bindende Region nicht-humanen Ursprungs und eine konstante Region, abgeleitet von einer humanen konstanten Region. In einer anderen Ausführungsform umfasst das CCR2 bindende humanisierte Immunglobulin eine für die Erkennung eines Antigens verantwortliche Region nicht-humanen Ursprungs und eine variable Gerüstregion humanen Ursprungs und wahlweise eine konstante Region humanen Ursprungs. Beispielsweise kann das humanisierte Immunglobulin eine schwere Kette und eine leichte Kette umfassen, wobei die leichte Kette eine von einem CCR2 bindenden Antikörper nicht-humanen Ursprungs abgeleitete und für die Erkennung eines Antigens verantwortliche Region und eine Gerüstregion umfasst, die von einer leichten Kette humanen Ursprungs abgeleitet ist, und wobei die schwere Kette eine von einem CCR2 bindenden Antikörper nicht-humanen Ursprungs abgeleitete und für die Erkennung eines Antigens verantwortliche Region und eine Gerüstregion umfasst, die von einer schweren Kette humanen Ursprungs abgeleitet ist.
In einer Ausführungsform kann das humanisierte Immunglobulin mit dem monoklonalen Maus Antikörper 1D9 oder 2G8 um die Bindung an den humanen CCR2 konkurrieren. In einer bevorzugten Ausführungsform leitet sich die Antigen-bindende Region des humanisierten Immunglobulins ab von (a) dem monoklonalen Antikörper 1D9 (beispielsweise wie in einem humanisierten Immunglobulin, das CDR1, CDR2 und CDR3 der leichten Kette von 1D9 oder CDR1, CDR2 und CDR3 der schweren Kette von 1D9 umfasst) oder von (b) dem monoklonalen Antikörper 8G2 (beispielsweise wie in einem humanisierten Immunglobulin, das CDR1, CDR2 und CDR3 der leichten Kette von 8G2 oder CDR1, CDR2 und CDR3 der schweren Kette von 8G2 umfasst). Chimärische oder CDR-veredelte Einzelketten Antikörper werden auch durch den Begriff humanisiertes Immunglobulin erfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine leichte Kette eines humanisierten Immunglobulins oder Antigen-bindendes Fragment davon oder eine schwere Kette eines humanisierten Immunglobulins oder Antigen-bindendes Fragment davon. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine humanisierte leichte Kette, die eine leichte Ketten CDR (beispielsweise eine oder mehrere CDRs) nicht humanen Ursprungs und eine humane leichte Ketten Gerüstregion umfasst. In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine schwere Kette eines humanisierten Immunglobulins, die eine schwere Ketten CDR (beispielsweise eine oder mehrere CDRs) nicht humanen Ursprungs und eine humane leichte Ketten Gerüstregion umfasst. Die CDR kann von einem nicht-humanen Immunglobulin abgeleitet sein.
Natürlich vorkommende Immunglobuline weisen eine gemeinsame Kernstruktur auf, in der zwei identische leichte Ketten (ungefähr 24 kDa) und zwei identische schwere Ketten (ungefähr 55 oder 70 kDa) einen Tetramer bilden. Der aminoterminale Bereich jeder Kette ist als die variable (V) Region bekannt und kann von den mehr konservierten konstanten (C) Regionen des Restes jeder Kette unterschieden werden. Innerhalb der variablen Region der leichten Kette gibt es einen C-terminalen Bereich, der als J Region bekannt ist. Innerhalb der variablen Region der schweren Kette gibt es zusätzlich zu der J Region eine D Region. Die meisten der Aminosäuresequenzänderungen beschränken sich auf drei voneinander getrennte Orte in den V Regionen, die als hypervariable Regionen oder für die Erkennung eines Antigens verantwortliche Regionen (CDRs), die direkt an der Antigenbindung beteiligt sind, bekannt sind. Fortschreitend von dem Aminoterminus werden diese Regionen als CDR1, CDR2 bzw. CDR3 bezeichnet. Die CDRs werden an ihrem Platz durch mehr konservierte Gerüstregionen (FRs) gehalten. Fortschreitend von dem Aminoterminus werden diese Regionen als FR1, FR2, FR3 bzw. FR4 bezeichnet. Die Lokalisierungen der CDR und FR Regionen und ein Nummerierungssystem wurden durch Kabat et al. definiert (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Ausgabe, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)).
Humanisierte Immunglobuline können abhängig von dem Isotyp der schweren Kette in Klassen und Unterklassen unterteilt werden. Die Klassen enthalten IgG, IgM, IgA, IgD und IgE, in denen die schweren Ketten dem γ, μ, α, δ bzw. ε Typ entsprechen. Unterklassen enthalten IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 und OgA2, in denen die schweren Ketten dem γ1, γ2, γ3, γ4, α1 bzw. α2 Typ entsprechen. Humane Immunglobulinmoleküle aus einer ausgewählten Klasse oder Unterklasse können entweder κ oder λ leichte Ketten enthalten. Siehe beispielsweise Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M.J., Ed., Chapter 45, pp. 41–50, W. B. Saunders Co, Philadelphia, PA (1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2^nd Ed., Chapter 4, pp. 45–65, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984).
Der hier verwendete Begriff "Immunglobulin" schließt ganze Antikörper und biologisch funktionale Fragmente davon ein. Derartige biologisch funktionale Fragmente behalten mindestens eine Antigen-bindende Funktion eines entsprechenden Gesamtlängen Antikörpers (beispielsweise die Spezifität des Antikörpers 1D9 für CCR2) und vorzugsweise behalten sie die Fähigkeit, die Interaktion von CCR2 mit einem oder mehreren seiner Liganden (beispielsweise HIV, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4) zu inhibieren. Beispiele von biologisch funktionalen Antikörper Fragmenten, die verwendet werden können, schließen Fragmente ein, die in der Lage sind, CCR2 zu binden, wie Einzelketten Antikörper, Fv, Fab, Fab' und F(ab')₂ Fragmente. Derartige Fragmente können durch enzymatische Spaltung oder durch rekombinante Methoden hergestellt werden. Beispielsweise kann die Spaltung von Papain oder Pepsin Fab bzw. F(ab')₂ Fragmente erzeugen. Antikörper können auch in einer Vielzahl verkürzter Formen unter Verwendung von Antikörpergenen hergestellt werden, in die ein oder mehrere Stop-Codons in 5'-Richtung von der natürlichen Stop-Stelle eingefügt wurden. Beispielsweise kann ein chimärisches Gen, das einen Bereich einer schweren Kette von F(ab')₂ codiert, so gestaltet sein, dass es die DNA-Sequenz enthält, die die CH, Domäne und Gelenk-(Hinge-)Region der schweren Kette codiert. Der hier verwendete Begriff ein Antigen-bindendes Fragment einer schweren oder leichten Kette eines humanisierten Immunglobulins soll ein Fragment bezeichnen, das an ein Antigen bindet, wenn es mit einer komplementären Kette gepaart wird. D.h. ein Antigen-bindendes Fragment einer leichten Kette eines humanisierten Immunglobulins wird ein Antigen binden, wenn es mit einer schweren Kette (beispielsweise Maus, chimärisch, humanisiert) gepaart wird, die eine variable Region umfasst, und ein Antigen-bindendes Fragment einer schweren Kette eines humanisierten Immunglobulins wird ein Antigen binden, wenn es mit einer leichten Kette (beispielsweise Maus, chimärisch, humanisiert) gepaart wird, die eine variable Region umfasst.
Der hier verwendete Begriff "humanisiertes Immunglobulin" bezieht sich auf ein Immunglobulin, das Bereiche von Immunglobulinen unterschiedlichen Ursprungs umfasst, worin mindestens ein Bereich von humanem Ursprung ist. Beispielsweise kann der humanisierte Antikörper Teile mit der erforderlichen Spezifität umfassen, die von einem Immunglobulin nicht-humanen Ursprungs abgeleitet sind, wie von einer Maus, und von Immunglobulinsequenzen humanen Ursprungs (beispielsweise von einem chimärischen Immunglobulin), die chemisch miteinander durch herkömmliche Methoden (beispielsweise synthetisch) verbunden wurden oder als zusammenhängendes Polypeptid hergestellt wurden, das unter Verwendung von Genmanipulationsmethoden (beispielsweise kann die einen Bereich des chimärischen Antikörpers codierende DNA zur Herstellung einer zusammenhängenden Peptidkette exprimiert werden) hergestellt wurde. Ein weiteres Beispiel eines humanisierten Immunglobulins der vorliegenden Erfindung ist ein Immunglobulin, das eine oder mehrere Immunglobulinketten enthält, die eine von einem Antikörper nicht-humanen Ursprungs abgeleitete CDR und eine von einer leichten und/oder schweren Kette humanen Ursprungs abgeleitete Gerüstregion (beispielsweise CDR-veredelte Antikörper mit oder ohne Änderungen in der Gerüstregion) umfasst/umfassen. Chimärische oder CDR-veredelte Einzelketten Antikörper werden auch durch den Begriff humanisiertes Immunglobulin umfasst. Bezogen auf Einzelketten Antikörper siehe beispielsweise Cabilly et al., U.S. Patent No. 4,816,567 ; Cabilly et al., Europäisches Patent Nr. 0,125,023 B1 ; Boss et al., U.S. Patent Nr. 4,816,397 ; Boss et al., European Patent Nr. 0,120,694 B1 ; Neuberger, M.S. et al., WO 86/01533 ; Neuberger, M.S. et al., European Patent Nr. 0,194,276 B1 ; Winter, U.S. Patent Nr. 5,225,539 ; Winter, European Patent Nr. 0,239,400 B1 ; Padlan, E.A. et al., European Patent Application Nr. 0,519,596 A1 . Siehe auch, Ladner et al., U.S. Patent Nr. 4,946,778 ; Huston, U.S. Patent Nr. 5,476,786 ; und Bird, R.E. et al., Science, 242: 423–426 (1988)).
So können beispielsweise humanisierte Immunglobuline hergestellt werden, indem synthetische und/oder rekombinante Nukleinsäuren zur Herstellung von Genen (beispielsweise cDNA), die die gewünschte humanisierte Kette codieren, verwendet werden. Beispielsweise können Nukleinsäuresequenzen (beispielsweise DNA), die die humanisierten variablen Regionen codieren, hergestellt werden, indem PCR Mutationsverfahren verwendet werden, um die DNA-Sequenzen zu verändern, die eine humane oder humanisierte Kette codieren, wie eine DNA-Matrize (template) einer zuvor humanisierten variablen Region (siehe beispielsweise Kamman, M., et al., Nucl. Acids Res., 17: 5404 (1989); Sato, K., et al., Cancer Research, 53: 851–856 (1993); Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acids Res., 19 (9):2471–2476 (1991); und Lewis, A.P. and J.S. Crowe, Gene, 101: 297–302 (1991)). Unter Verwendung dieser oder anderer geeigneter Verfahren können auch Varianten leicht hergestellt werden. In einer Ausführungsform können klonierte variable Regionen mutagenisiert werden und es können Sequenzen selektiert werden, die Varianten mit der gewünschten Spezifität codieren (beispielsweise aus einer Phagenbank; siehe beispielsweise Krebber et al., U.S. 5,514,548 ; Hoogenboom et al., WO 93/06213 , published April 1^st, 1993)).
Die Antigen-bindende Region des humanisierten Immunglobulins (der nicht-humane Bereich) kann von einem Immunglobulin nicht-humanen Ursprungs (bezeichnet als Spender-Immunglobulin) abgeleitet sein, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist. So kann beispielsweise eine geeignete Antigen-bindende Region von dem monoklonalen Maus Antikörper 1D9 abgeleitet sein. Andere Quellen schließen aus nicht-humanen Quellen abgeleitete CCR2-spezifische Antikörper mit ein, wie von Nagetieren (beispielsweise Maus, Ratte), Hasen/Kaninchen, Schweinen, Ziegen oder nicht-humanen Primaten (beispielsweise Affen). Zusätzlich können andere polyklonale oder monoklonale Antikörper hergestellt werden, wie Antikörper, die an das gleiche oder an ein ähnliches Epitop wie der 1D9 Antikörper binden (beispielsweise Kohler et al., Nature, 256: 495–497 (1975); Harlow et al., 1988, Antibodies: A Laborstory Manual, (Cold Spring Harbor, NY); und Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2 (Supplement 27, Summer 1994), Ausubel et al., Eds. (John Wiley & Sons: New York, NY), Chapter 11 (1991)).
Beispielsweise können Antikörper gegen ein entsprechendes Immunogen in einem geeigneten Säugetier (beispielsweise in einer Maus, Ratte, einem Kaninchen oder Schaf) gezüchtet werden. Beispiele von geeigneten Immunogenen sind CCR2-tragende Zellen, CCR2-enthaltende Membranfraktionen und immunogenische Fragmente von CCR2. Antikörper produzierende Zellen (beispielsweise ein Lymphozyt) können beispielsweise aus den Lymphknoten oder der Milz eines immunisierten Tieres isoliert werden. Die Zellen können dann mit einer geeigneten unsterblich gemachten Zelle (beispielsweise mit einer Myelom-Zelllinie) fusioniert werden; dabei wird ein Hybridom gebildet. Fusionierte Zellen können durch die Anwendung von selektiven Kulturbedingungen isoliert werden. Zellen, die Antikörper mit der gewünschten Spezifität produzieren, können durch einen geeigneten Assay (beispielsweise ELISA) selektiert werden. Auch können Immunglobuline nicht-humanen Ursprungs, die eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweisen, aus Antikörperbanken erhalten werden (beispielsweise aus einer Phagenbank, die nicht-humane Fab-Moleküle umfasst).
In einer Ausführungsform umfasst die Antigen-bindende Region des humanisierten Immunglobulins eine CDR nicht-humanen Ursprungs. In dieser Ausführungsform umfasst das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweisende humanisierte Immunglobulin mindestens eine CDR nicht-humanen Ursprungs. Beispielsweise können die CDRs von den variablen Regionen der leichten und schweren Ketten der Immunglobuline nicht-humanen Ursprungs abgeleitet sein, so dass ein humanisiertes Immunglobulin im Wesentlichen die schwere Ketten CDR1, CDR2 und/oder CDR3 und/oder die leichte Ketten CDR1, CDR2 und/oder CDR3 von einem oder mehreren Immunglobulinen nicht-humanen Ursprungs enthält und wobei das sich daraus ergebende humanisierte Immunglobulin eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist. Vorzugsweise sind alle drei CDRs einer ausgewählten Kette im Wesentlichen die gleichen, wie die CDRs der entsprechenden Kette eines Spenders, und mehr bevorzugt sind alle drei CDRs der leichten und schweren Ketten im Wesentlichen die gleichen, wie die CDRs der entsprechenden Spenderkette. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Bindungsspezifität für CCR2 aufweisendes Immunglobulin, das eine humanisierte leichte Kette oder Antigen-bindendes Fragment davon umfasst, die/das CDR1, CDR2 und CDR3 der leichten Kette des 1D9 Antikörpers und eine schwere Kette, beispielsweise eine humane schwere Kette, aufweist. Die Erfindung schließt auch ein Bindungsspezifität für CCR2 aufweisendes Immunglobulin ein, das eine humanisierte schwere Kette oder Antigen-bindendes Fragment davon umfasst, das/die CDR1, CDR2 und CDR3 der schweren Kette des 1D9 Antikörpers und eine leichte Kette, beispielsweise eine humane leichte Kette, aufweist.
Die Erfindung betrifft auch ein Bindungsspezifität für CCR2 aufweisendes Immunglobulin, das eine leichte und eine schwere Kette umfasst, worin die leichte Kette mindestens eine CDR eines Antikörpers nicht-humanen Ursprungs (beispielsweise 1D9) und eine Gerüstregion und konstante Regionen humanen Ursprungs (beispielsweise Seq. ID. Nr. 12, Seq. ID. Nr. 13, Seq. ID. Nr. 14, Seq. ID. Nr. 15 und Seq. ID. Nr. 107) aufweist, und worin die schwere Kette eine variable Region nicht-humanen Ursprungs (beispielsweise von 1D9) und eine konstante Region humanen Ursprungs aufweist. Die Erfindung stellt auch Antigen-bindende Fragmente dieser Immunglobuline bereit. Die Erfindung betrifft auch ein Bindungsspezifität für CCR2 aufweisendes Immunglobulin, das eine leichte und eine schwere Kette umfasst, worin die leichte Kette mindestens eine variable Kette nicht-humanen Ursprungs (beispielsweise von 1D9) und eine konstante Region humanen Ursprungs aufweist, und worin die schwere Kette mindestens eine CDR eines Antikörpers nicht-humanen Ursprungs (beispielsweise 1D9) und eine Gerüstregion und konstante Regionen humanen Ursprungs (beispielsweise Seq. ID. Nr. 17, Seq. ID. Nr. 18, Seq. ID. Nr. 19 und Seq. ID. Nr. 20) aufweist. Die Erfindung stellt auch Antigen-bindende Fragmente dieser Immunglobuline bereit.
Der Bereich humanen Ursprungs des humanisierten Immunglobulins oder der Immunglobulinkette (der humane Bereich) kann von jedem geeigneten humanen Immunglobulin oder Immunglobulinkette abgeleitet sein. So kann beispielsweise eine humane konstante Region oder ein Bereich davon, wenn sie/er vorhanden ist, von den κ oder λ leichten Ketten und/oder den γ (beispielsweise γ1, γ2, γ3, γ4), μ, α (beispielsweise α1, α2), δ oder ε schweren Ketten von humanen Antikörpern abgeleitet sein, einschließlich der Allelvarianten. Eine besondere konstante Region (beispielsweise IgG1), Variante oder Bereiche davon kann/können selektiert werden, um Effektorfunktionen zuzuschneidern. So kann beispielsweise eine mutierte konstante Region (Variante) in ein Fusionsprotein aufgenommen werden, um die Bindung an Fc-Rezeptoren und/oder die Fähigkeit Komplement zu fixieren zu verringern (siehe beispielsweise Beispiel 3, siehe auch Winter et al., GB 2,209,757 B ; Morrison et al., WO 89/07142 ; Morgan et al., WO 94/29351 , Dezember 22, 1994).
Humane Gerüstregionen (beispielsweise von der variablen Region der leichten Kette), wenn sie vorhanden sind, sind vorzugsweise von einer variablen Region eines humanen Antikörpers abgeleitet, die eine Sequenzähnlichkeit mit der analogen oder äquivalenten Region (beispielsweise der variablen Region der leichten Kette) des Spenders der Antigenbindenden Region aufweist. Andere Quellen von Gerüstregionen für Bereiche humanen Ursprungs eines humanisierten Immunglobulins schließen human variable Konsensussequenzen ein (siehe beispielsweise Kettleborough, C.A. et al., Protein Engineering 4: 773–783 (1991); Carter et al., WO 94/04679 , veröffentlicht 3. März 1994)). So kann beispielsweise die zum Erhalten des nicht-humanen Bereichs verwendete Sequenz des Antikörpers oder der variablen Region mit den humanen Sequenzen verglichen werden, wie in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Ausgabe, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991) beschrieben. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Gerüstregionen eines humanisierten Immunglobulins von einer humanen variablen Region abgeleitet, die eine Gesamtsequenzübereinstimmung von mindestens ungefähr 60%, vorzugsweise eine Gesamtsequenzübereinstimmung von mindestens ungefähr 70% und am meisten bevorzugt eine Gesamtsequenzübereinstimmung von mindestens ungefähr 85% mit der variablen Region des nicht-humanen Spenders (beispielsweise Maus Antikörper 1D9) aufweist. Ein humaner Bereich kann auch von einem humanen Antikörper abgeleitet sein, der eine Sequenzübereinstimmung von mindestens ungefähr 65% und vorzugsweise eine Sequenzübereinstimmung von mindestens ungefähr 70% innerhalb des verwendeten bestimmten Bereichs (beispielsweise FR) aufweist, wenn er mit dem äquivalenten Bereich (beispielsweise FR) des nicht-humanen Spenders verglichen wird.
In einer Ausführungsform umfasst das humanisierte Immunglobulin mindestens eine der von einer oder mehreren Kette(n) des Antikörpers humanen Ursprungs abgeleiteten Gerüstregionen (FR). Daher kann die FR eine von einem oder mehreren Antikörper(n) humanen Ursprungs abgeleitete FR1 und/oder FR2 und/oder FR3 und/oder FR4 enthalten. Vorzugsweise enthält der humane Bereich einer ausgewählten humanisierten Kette FR1, FR2, FR3 und FR4, die von einer variablen Region humanen Ursprungs (beispielsweise von einer humanen Immunglobulinkette, von einer humanen Konsensussequenz) abgeleitet sind.
Die Immunglobulinbereiche nicht-humanen und humanen Ursprungs zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung weisen Sequenzübereinstimmungen mit Immunglobulinen oder Immunglobulinbereichen, von denen sie abgeleitet sind, oder mit Varianten davon auf. Derartige Varianten schließen Mutanten ein, die sich durch die Addition, Deletion oder Substitution von einem oder mehreren Resten unterscheiden. Wie vorstehend angedeutet ist, sind die CDRs nicht humanen Ursprungs im Wesentlichen die gleichen wie in dem nicht-humanen Spender, und vorzugsweise sind sie mit den CDRs des nicht-humanen Spenders identisch. Wie in Beispiel 2 beschrieben ist, können Änderungen in der Gerüstregion erfolgen, wie bei solchen, bei denen ein Rest der Gerüstregion humanen Ursprungs gegen einen Rest der entsprechenden Position des Spenders substituiert wird. Es können eine oder mehrere Mutationen in der Gerüstregion erfolgen, einschließlich Deletionen, Insertionen und Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäure(n). Viele solcher Substitutionen sind in der Gestaltung der humanisierten 1D9 Antikörper in Beispiel 2 beschrieben. Es können für einen ausgewählten humanisierten Antikörper oder eine Kette Mutationen der Gerüstregion wie hier beschrieben entworfen werden. Vorzugsweise können die humanisierten Immunglobuline CCR2s mit einer Affinität aufweisen, die gleich der oder besser als die des nicht-humanen Spenders ist. Varianten können durch eine Vielzahl an geeigneten Verfahren hergestellt werden, einschließlich durch Mutagenese von nicht-humanen Spender- oder humanen Empfängerketten.
Die humanisierten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung weisen eine Bindungsspezifität für humanen CCR2 auf. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das humanisierte Immunglobulin der vorliegenden Erfindung mindestens ein funktionales Charakteristikum des Maus Antikörpers 1D9 auf, wie Bindungsfunktion (beispielsweise eine Spezifität für CCR2, die die gleiche oder eine ähnliche Epitopspezifität aufweist) und/oder inhibitorische Funktion (beispielsweise die Fähigkeit, eine CCR2-abhängige Funktion in vitro und/oder in vivo zu inhibieren, wie die Fähigkeit, die Bindung einer CCR2-tragenden Zelle an einen Liganden davon (beispielsweise ein Chemokin) zu inhibieren). Daher können bevorzugte humanisierte Immunglobuline die Bindungsspezifität des Maus Antikörpers 1D9, die Epitopspezifität des Maus Antikörpers 1D9 (beispielsweise können sie mit Maus 1D9, einem chimärischen 1D9 Antikörper oder mit dem humanisierten 1D9 um die Bindung an CCR2 konkurrieren (beispielsweise auf einer CCR2-tragenden Zelle)) und/oder die inhibitorische Funktion von dem Maus Antikörper 1D9 aufweisen.
Die Bindungsfunktion eines humanisierten Immunglobulins, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist, kann durch standardmäßige immunologische Verfahren erfasst werden, beispielsweise durch Assays, die die Bildung eines Komplexes zwischen humanisiertem Immunglobulin und CCR2 überwachen (beispielsweise eine CCR2 umfassende Membranfraktion auf einer CCR2-tragenden Zelle, eine humane Zelllinie oder rekombinante Wirtszelle, die eine CCR2-codierende Nukleinsäure umfasst und CCR2 exprimiert). Es können auch Bindungs- und/oder Adhäsionsassays oder andere geeignete Verfahren in den Verfahren zur Identifizierung und/oder Isolierung von humanisierten Immunglobulinen (beispielsweise aus einer Bank) mit der erforderlichen Spezifität (beispielsweise ein Assay, der die Adhäsion zwischen einer CCR2-tragenden Zelle und einem Liganden davon (beispielsweise HIV, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4) überwacht) oder andere geeignete Verfahren verwendet werden.
Die Immunglobulinbereiche nicht-humanen und humanen Ursprungs zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen leichte Ketten, schwere Ketten und Bereiche von leichten und schweren Ketten ein. Diese Immunglobulinbereiche können von Immunglobulinen (beispielsweise durch de novo Synthese) erhalten oder abgeleitet werden oder es können Nukleinsäuremoleküle, die ein Immunglobulin oder eine Kette davon mit der gewünschten Eigenschaft (beispielsweise CCR2 Bindung, Sequenzähnlichkeit) aufweisen, hergestellt und exprimiert werden. Humanisierte Immunglobuline humanen und nicht-humanen Ursprungs, die die gewünschten Bereiche umfassen (beispielsweise Antigen-bindende Region, CDR, FR, C Region), können durch die Verwendung von synthetischen und/oder rekombinanten Nukleinsäuren zur Herstellung von Genen (beispielsweise cDNA), die die gewünschte humanisierte Kette codieren, hergestellt werden. Zur Herstellung eines Bereichs einer Kette können ein oder mehrere Stop-Codons in die gewünschten Positionen eingeführt werden. So können beispielsweise Nukleinsäure-(beispielsweise DNA) Sequenzen, die neu gestaltete humanisierte variable Regionen codieren, unter Verwendung von PCR Mutationsverfahren zur Veränderung bestehender DNA-Sequenzen hergestellt werden (siehe beispielsweise Kamman, M., et al., Nucl. Acids Res. 17: 5404 (1989)). Es können PCR-Primer, die für die neuen CDRs codieren, an eine DNA Matrize einer vorher humanisierten variablen Region hybridisiert werden, die auf einer gleichen oder sehr ähnlichen humanen variablen Region basiert (Sato, K., et al., Cancer Research 53: 851–856 (1993)). Falls eine ähnliche DNA-Sequenz als Matrize nicht zur Verfügung steht, kann eine Nukleinsäure aus synthetischen Oliginukleotiden erstellt werden, die eine Sequenz umfasst, die eine Sequenz einer variablen Region codiert (siehe beispielsweise Kolbinger, F., Protein Engineering 8: 971–980 (1993)). Eine Signalpeptid codierende Sequenz kann auch in die Nukleinsäure aufgenommen werden (beispielsweise während der Synthese, nach dem Einbringen in einen Vektor). Falls die natürliche Signalpeptidsequenz nicht zur Verfügung steht, kann eine Signalpeptidsequenz eines anderen Antikörpers verwendet werden (siehe beispielsweise Kettleborough, C.A., Protein Engineering 4: 773–783 (1991)). Durch die Verwendung dieser Verfahren, der hier beschriebenen Verfahren oder anderer geeigneter Verfahren können Varianten leicht hergestellt werden. In einer Ausführungsform können die klonierten variablen Regionen mutagenisiert werden und Sequenzen, die die Varianten mit der gewünschten Spezifität codieren, können selektiert werden (beispielsweise aus einer Phagenbank, siehe beispielsweise Krebber et al., U.S. 5,514,548 ; Hoogenboom et al., WO 93/06213 , veröffentlicht 1. April, 1993)).
Die Erfindung betrifft eine leichte Kette eines humanisierten Immunglobulins oder eines Antigen-bindenden Fragments davon, worin die leichte Kette oder das Antigen-bindende Fragment davon eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens einen funktionalen Bereich der Aminosäuresequenz der variablen Region der leichten Kette von Seq. ID. Nr. 9 umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Aminosäuresequenz mindestens einen, vorzugsweise zwei und mehr bevorzugt drei der CDRs von Seq. ID. Nr. 9. Die Erfindung betrifft auch eine schwere Kette eines humanisierten Immunglobulins oder ein Antigen-bindendes Fragment davon, worin die schwere Kette oder das Antigen-bindende Fragment davon eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens einen funktionalen Bereich der Aminosäuresequenz der variablen Region der schweren Kette von Seq. ID. Nr. 10 umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Aminosäure sequenz mindestens einen, vorzugsweise zwei und mehr bevorzugt drei der CDRs von Seq. ID. Nr. 10. Es soll darauf hingewiesen werden, dass alle hier beschriebenen Maus Sequenzen von Mus musculus abgeleitet sind.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann eine leichte Kette eines humanisierten Immunglobulins oder eines Antigen-bindenden Fragments davon mit einer Bindungsspezifität für CCR2 eine Aminosäuresequenz umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt wurde bestehend aus Seq. ID. Nr. 12, Seq. ID. Nr. 13, Seq. ID. Nr. 14, Seq. ID. Nr. 15 und Seq. ID. Nr. 107. Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann eine schwere Kette eines humanisierten Immunglobulins oder Antigen-bindenden Fragments davon mit einer Bindungsspezifität für CCR2 eine Aminosäuresequenz umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt wurde bestehend aus Seq. ID. Nr. 17, Seq. ID. Nr. 18, Seq. ID. Nr. 19 und Seq. ID. Nr. 20. In einer besonderen Ausführungsform kann ein humanisiertes Immunglobulin der Erfindung beides umfassen, eine leichte Kette oder Antigen-bindendes Fragment davon mit einer Bindungsspezifität für CCR2, die/das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt wurde bestehend aus Seq. ID. Nr. 12, Seq. ID. Nr. 13, Seq. ID. Nr. 14, Seq. ID. Nr. 15 und Seq. ID. Nr. 107 und eine schwere Kette oder Antigen-bindendes Fragment davon mit einer Bindungsspezifität für CCR2, die/das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt wurde bestehend aus Seq. ID. Nr. 17, Seq. ID. Nr. 18, Seq. ID. Nr. 19 und Seq. ID. Nr. 20.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein humanisiertes Immunglobulin mit einer Bindungsspezifität für CCR2, das eine leichte Kette, die die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 12 und eine komplementäre schwere Kette oder ein Antigen-bindendes Fragment des humanisierten Immunglobulins umfasst, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist. In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein humanisiertes Immunglobulin mit einer Bindungsspezifität für CCR2, das eine schwere Kette umfasst, die die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 17 und eine komplementäre leichte Kette oder ein Antigen-bindendes Fragment des humanisierten Immunglobulins, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist, umfasst. Eine komplementäre leichte oder schwere Kette ist eine, die in der Lage ist, sich mit einer ausgewählten schweren bzw. leichten Kette zu verbinden, was zu der Fähigkeit eines Immunglobulins führt, welches die komplementären schweren und leichten Kette umfasst, eine Bindungsspezifität für CCR2 aufzuweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein humanisiertes Immunglobulin mit einer Bindungsspezifität für CCR2, das eine leichte Kette umfasst, die die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 12 umfasst, und eine schwere Kette, die die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 17 umfasst, oder ein Antigen-bindendes Fragment des humanisierten Immunglobulins, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist.
In einer alternativen Ausführungsform umfasst ein humanisiertes Immunglobulin der Erfindung beides, eine leichte Kette, die die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 12 umfasst, und eine schwere Kette, die die Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq. ID. Nr. 18, Seq. ID. Nr. 19 und Seq. ID. Nr. 20, oder ein Antigen-bindendes Fragment des Immunglobulins, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist. In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein humanisiertes Immunglobulin der Erfindung beides, eine leichte Kette, die die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 13 umfasst, und eine schwere Kette, die die Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq. ID. Nr. 17, Seq. ID. Nr. 18, Seq. ID. Nr. 19 und Seq. ID. Nr. 20, oder ein Antigen-bindendes Fragment des Immunglobulins, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist. In einer zusätzlichen Ausführungsform umfasst ein humanisiertes Immunglobulin der Erfindung beides, eine leichte Kette, die die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 14 umfasst, und eine schwere Kette, die die Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq. ID. Nr. 17, Seq. ID. Nr. 18, Seq. ID. Nr. 19 und Seq. ID. Nr. 20, oder ein Antigen-bindendes Fragment des Immunglobulins, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist. In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein humanisiertes Immunglobulin der Erfindung beides, eine leichte Kette, die die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 15 umfasst, und eine schwere Kette, die die Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq. ID. Nr. 17, Seq. ID. Nr. 18, Seq. ID. Nr. 19 und Seq. ID. Nr. 20, oder ein Antigen-bindendes Fragment des Immunglobulins, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist. In einer alternativen Ausführungsform umfasst ein humanisiertes Immunglobulin der Erfindung beides, eine leichte Kette, die die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 15 umfasst, und eine schwere Kette, die die Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq. ID. Nr. 107, Seq. ID. Nr. 18, Seq. ID. Nr. 19 und Seq. ID. Nr. 20, oder ein Antigen-bindendes Fragment des Immunglobulins, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein humanisiertes Immunglobulin der Erfindung beides, eine leichte Kette, die die Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq. ID. Nr. 13, Seq. ID. Nr. 14, Seq. ID. Nr. 15 und Seq. ID. Nr. 107, und eine schwere Kette, die die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 17 umfasst, oder ein Antigen-bindendes Fragment des Immunglobulins, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist. In einer alternativen Ausführungsform umfasst ein humanisiertes Immunglobulin der Erfindung beides, eine leichte Kette, die die Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq. ID. Nr. 12, Seq. ID. Nr. 13, Seq. ID. Nr. 14, Seq. ID. Nr. 15 und Seq. ID. Nr. 107, und eine schwere Kette, die die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 18 umfasst, oder ein Antigen-bindendes Fragment des Immunglobulins, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist. In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein humanisiertes Immunglobulin der Erfindung beides, eine leichte Kette, die die Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq. ID. Nr. 12, Seq. ID. Nr. 13, Seq. ID. Nr. 14, Seq. ID. Nr. 15 und Seq. ID. Nr. 107, und eine schwere Kette, die die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 19 umfasst, oder ein Antigen-bindendes Fragment des Immunglobulins, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist. In einer zusätzlichen Ausführungsform umfasst ein humanisiertes Immunglobulin der Erfindung beides, eine leichte Kette, die die Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq. ID. Nr. 12, Seq. ID. Nr. 13, Seq. ID. Nr. 14, Seq. ID. Nr. 15 und Seq. ID. Nr. 107, und eine schwere Kette, die die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 20 umfasst, oder ein Antigen-bindendes Fragment des Immunglobulins, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist.
In einer Ausführungsform kann die leichte Kette des humanisierten Immunglobulins oder das Antigen-bindende Fragment davon, die/das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist, durch ein Nukleinsäuremolekül codiert sein, das die Seq. ID. Nr. 98 umfasst. In einer anderen Ausführungsform kann die schwere Kette des humanisierten Immunglobulins oder das Antigen-bindende Fragment davon, die/das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist, durch ein Nukleinsäuremolekül codiert sein, das die Seq. ID. Nr. 97 umfasst.
Die Erfindung betrifft auch ein chimärisches Immunglobulin oder ein Antigen-bindendes Fragment davon, die/das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist und die/das eine variable Region einer leichten Kette nicht-humanen Ursprungs und eine humane konstante Region (beispielsweise eine konstante Region einer leichten Kette) umfasst. Die Erfindung betrifft weiterhin ein chimäres Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist und das eine variable Region einer schweren Kette nicht-humanen Ursprungs und eine humane konstante Region (beispielsweise eine konstante Region einer schweren Kette) umfasst. In einer anderen Ausführungsform umfasst das chimärische Immunglobulin oder Antigen-bindende Fragment davon, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist, eine variable Kettenregion einer leichten Kette nicht-humanen Ursprungs und eine variable Region einer schweren Kette nicht-humanen Ursprungs und umfasst weiter eine humane konstante Region (beispielsweise eine konstante Region einer humanen leichten Kette und/oder eine konstante Region einer humanen schweren Kette).
NUKLEINSÄUREN UND KONSTRUKTE
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte und/oder rekombinante (einschließlich beispielsweise hauptsächlich reine) Nukleinsäuremoleküle, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die ein humanisiertes Immunglobulin oder eine leichte oder schwere Kette eines humanisierten Immunglobulins der vorliegenden Erfindung codieren.
Die hier als "isoliert" bezeichneten Nukleinsäuremoleküle sind Nukleinsäuremoleküle, die von den Nukleinsäuren der genomischen DNA oder der zellulären RNA von ihrer Quelle des Ursprungs entfernt wurden (beispielsweise wie sie in Zellen vorkommen oder in einem Gemisch aus Nukleinsäuren, wie in einer Bank), und sie enthalten Nukleinsäuremoleküle, die durch hier beschriebene Verfahren erhalten wurden, einschließlich reine Nukleinsäuremoleküle, Nukleinsäuremoleküle, die durch chemische Synthese, durch Kombinationen von biologischen und chemischen Verfahren hergestellt wurden und rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die isoliert wurden (siehe beispielsweise Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acids Res., 19 (9): 2471–2476 (1991); Lewis, A.P. und J.S. Crowe, Gene, 101: 297–302 (1991)).
Die hier als "rekombinant" bezeichneten Nukleinsäuremoleküle sind Nukleinsäuremoleküle, die durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt wurden, einschließlich der Nukleinsäuremoleküle, die durch Verfahren erzeugt wurden, die auf ein Verfahren der künstlichen Rekombination angewiesen sind, wie der Polymerase Kettenreaktion (PCR) und/oder Klonierung in einen Vektor durch Verwenden von Restriktionsenzymen. "Rekombinante" Nukleinsäuremoleküle sind auch solche, die aus Rekombinationsereignissen entstehen, die durch die natürlichen Mechanismen der Zelle auftreten, die aber nach dem Einfügen von Nukleinsäuren in die Zellen, die zum Ermöglichen eines gewünschten Rekombinationsereignis gestaltet wurden, ausgewählt wurden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch besonders isolierte und/oder rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die ein humanisiertes 1D9 Immunglobulin (beispielsweise ein humanisiertes Immunglobulin der vorliegenden Erfindung, in dem der nicht-humane Bereich von dem monoklonalen Maus Antikörper 1D9 abgeleitet ist) oder eine Kette davon codiert. In einer Ausführungsform umfasst die leichte Kette drei für die Erkennung eines Antigens verantwortliche Regionen, die von der leichten Kette des 1D9 Antikörpers abgeleitet sind, und die schwere Kette umfasst drei für die Erkennung eines Antigens verantwortliche Regionen, die von der schweren Kette des 1D9 Antikörpers abgeleitet sind. Derartige Nukleinsäuremoleküle beinhalten beispielsweise (a) ein Nukleinsäuremolekül, das eine Sequenz umfasst, die ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz der variablen Region der schweren Kette eines humanisierten 1D9 Immunglobulins (beispielsweise die variable Region der schweren Kette aus 8 und 21) (beispielsweise Nukleotide 58–411 von Seq. ID. Nr. 96) umfasst; (b) ein Nukleinsäuremolekül, das eine Sequenz umfasst, die ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz der variablen Region der leichten Kette eines humanisierten 1D9 Immunglobulins (beispielsweise die variable Region der schweren Kette aus den 7 und 22) (beispielsweise Nukleotide 52–390 von Seq. ID. Nr. 95) umfasst; (c) ein Nukleinsäuremolekül, das eine Sequenz umfasst, die mindestens einen funktionalen Bereich des variablen Bereichs der leichten oder schweren Kette eines humanisierten Immunglobulins codiert (beispielsweise einen Bereich, der für die Antigenbindung eines die Kette umfassenden humanisierten Immunglobulins ausreichend ist). Aufgrund der Degenerierung des genetischen Codes kann eine Vielzahl an Nukleinsäuren hergestellt werden, die ein ausgewähltes Polypeptid codieren. In einer Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure die Nukleotidsequenz der variablen Region, wie in 21 dargelegt oder im Wesentlichen dargelegt ist, oder wie in 22 dargelegt oder im Wesentlichen dargelegt ist, einschließlich doppel- oder einzelsträngigen Polynukleotiden. (Obwohl verschiedene Figuren Polypeptide erläutern können, die größer sind als die variablen Regionen (beispielsweise enthalten sie eine Signalpeptid-codierende Sequenz oder einen Bereich einer codierenden Sequenz für eine konstante Region), soll der Bezug auf die variable Region einer besonderen Figur den Bereich der variablen Region der gezeigten Sequenz enthalten). Wie vorstehend erläutert wurde, können isolierte und/oder rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die diese Kriterien erfüllen, Nukleinsäuremoleküle umfassen, die Sequenzen codieren, die zu Sequenzen auf dem humanisierten Antikörper 1D9 oder zu Varianten davon identisch sind.
Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung können in der Herstellung von humanisierten Immunglobulinen, die eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweisen, verwendet werden. So kann beispielsweise ein Nukleinsäuremolekül (beispielsweise DNA), das ein humanisiertes Immunglobulin der vorliegenden Erfindung codiert, in ein geeignetes Konstrukt (beispielsweise einen Vektor) zur weiteren Veränderung von Sequenzen oder zur Herstellung des codierten Polypeptids in einer geeigneten Wirtszelle eingefügt werden.
TARGETING-MOLEKÜLE
Die Erfindung betrifft auch Targeting-Moleküle, die die Interaktion einer CCR2-exprimierenden Zelle mit einer Zielzelle herbeiführen können. Das Targeting-Molekül enthält einen ersten Bindungsanteil, der an Säugetier CCR2 binden kann, und einen zweiten Bindungsanteil, der ein auf der Oberfläche einer Zielzelle exprimiertes Molekül binden kann. Bevorzugte Zielzellen schließen Tumorzellen und Virus-infizierte Zellen ein. Eine Vielzahl von Molekülen, die stärker oder gleichmäßig auf Tumorzellen exprimiert sind (beispielsweise Tumorantigene wie Lewis Y, HER-2/neu, Disialoganglliosid G3, carcinoembryogenes Antigen, CD30) und/oder Virus-infizierte Zellen (beispielsweise virale Antigene, wie Influenza Virus Hemagglutinin, Epstein-Barr Virus LMP-1, Hepatitis C Virus E2 Glykoprotein, HIV gp160, HIV gp120), sind im Stand der Technik bekannt. Das Targeting-Molekül kann jeden geeigneten zweiten Bindungsanteil enthalten, der an ein auf einer gewünschten Zielzelle exprimiertes Molekül bindet (siehe beispielsweise Ring, U.S. Patent Nr. 5,948,647 , auf dessen gesamte Lehre hier Bezug genommen wird). Geeignete Bindungsanteile schließen beispielsweise Proteine und Peptide (einschließlich posttranslational veränderte Formen, beispielsweise glycosylierte, phosphorylierte, lipidierte), Zucker, Lipide, peptidmimetische, kleine organische Moleküle, Nukleinsäuren und andere Mittel ein, die Säugetier CCR2 oder ein auf einer Oberfläche einer Zielzelle exprimiertes Molekül binden. Geeignete Bindungsanteile können durch Verwendung jedes geeigneten Verfahrens identifiziert werden, wie durch die hier beschriebenen Bindungs-Assays.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann der erste Bindungsanteil beispielsweise ein humanisiertes Immunglobulin der Erfindung sein, das einen Säugetier CCR2 oder Antigen-bindendes Fragment davon (beispielsweise Fab, Fv, Fab', F(ab)'₂) bindet. Der zweite Bindungsanteil kann beispielsweise ein Antikörper (beispielsweise ein zweites humanisiertes Immunglobulin) oder Antigen-bindendes Fragment davon sein, der/das an ein auf einer Zielzelle exprimiertes Molekül oder Antigen-bindendes Fragment davon bindet. Falls das Targeting-Molekül einen ersten Bindungsanteil umfasst, der ein humanisiertes anti-CCR2 Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon ist, ist es bevorzugt, dass das humanisierte anti-CCR2 Immunglobulin die Bindung eines Liganden an CCR2 nicht inhibiert.
Der erste Bindungsanteil kann direkt oder indirekt mit dem zweiten Bindungsanteil durch eine Vielzahl an geeigneten Verbindungen verbunden werden. So können die Bindungsanteile beispielsweise Teil eines zusammenhängenden Polypeptids (beispielsweise eines Fusionsproteins) sein, wenn der erste Bindungsanteil und der zweite Bindungsanteil Proteine oder Peptide sind. Wenn das Targeting-Molekül ein Fusionsprotein ist, können der erste und zweite Bindungsanteil auf dem Polypeptid in jeder geeigneten Konfiguration angeordnet sein. Die ersten und zweiten Bindungsanteile können indirekt durch einen (beispielsweise einen oder mehrere) Peptid-Linker oder direkt aneinander durch eine Peptidbindung verbunden werden.
Wenn die Bindungsanteile nicht Teil eines zusammenhängenden Polypeptids sind, können sie direkt durch eine chemische Bindung verbunden werden, die durch die Reaktion einer funktionalen Gruppe (oder eines aktiven Derivats davon) auf dem ersten Bindungsanteil mit einer zweiten funktionalen Gruppe (oder eines aktiven Derivats davon) auf dem zweiten Bindungsanteil gebildet wird. So können beispielsweise zwei Thiole zur Bildung einer Disulfidbindung reagieren und ein Amin kann mit einer Carboxylsäure oder einem Acylhalogenid zur Bildung eines Amids reagieren. Eine Vielzahl anderer geeigneter Reaktionen, die verwendet werden können, sind im Stand der Technik bekannt (siehe beispielsweise Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)). Die Bindungsanteile können indirekt durch einen geeigneten Linker verbunden werden (beispielsweise einen Peptid-Linker). Allgemein enthält ein Linker zwei reaktive Gruppen, die zur Bildung einer Bindung mit dem ersten Bindungsanteil und/oder dem zweiten Bindungsanteil reagieren können. Linker, die zwei unterschiedliche reaktive Gruppen enthalten (beispielsweise ein heterobifunktionaler Linker), können zum selektiven Konjugieren des ersten Bindungsanteils an den zweiten Bindungsanteil verwendet werden. Es sind viele Linker bekannt, die zur Bildung von Konjuagten zwischen Proteinen, Nukleinsäuren, Peptiden, Vitaminen, Zuckern, Lipiden, kleinen organischen Molekülen und anderen geeigneten Mitteln geeignet sind (siehe beispielsweise U.S. Patent Nr. 5,856,571 , 5,880,270 ; Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)).
Vorzugsweise sind die unabhängigen Aktivitäten der Bindungsanteile (beispielsweise Bindungsaktivitäten, chemoattraktans Aktivität) der Targeting-Moleküle nicht wesentlich verschieden von den Aktivitäten der Bindungsanteile als getrennt molekulare Einheiten. So kann beispielsweise das Targeting-Molekül mit einer Affinität an CCR2 binden, die innerhalb eines Faktors von ungefähr 1000, vorzugsweise innnerhalb eines Faktors von 100, mehr bevorzugt innerhalb eines Faktors von 10 liegt oder die im Wesentlichen die gleiche ist, wie die Affinität des freien Antikörpers oder des Antigen-bindenden Fragments, wenn der erste Bindungsanteil ein humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon ist. Targeting-Moleküle mit diesen bevorzugten Eigenschaften können durch Verwenden jedes geeigneten Verfahrens hergestellt werden. Das resultierende Targeting-Molekül kann dann auf Bindung (beispielsweise durch ELISA) und auf Chemoattraktans getestet werden.
In einer Ausführungsform ist das Targeting-Molekül ein bispezifischer humanisierter Antikörper oder bispezifisches Antigen-bindendes Fragment davon (beispielsweise F(ab')₂), der/das eine Spezifität für Säugetier CCR2 und für ein auf einer Zielzelle exprimiertes Molekül aufweist (beispielsweise Tumorantigen, virales Antigen). Bispezifische Antikörper können durch Triome und Hybrid-Hybridome sezerniert werden. Die Überstände von Triomen und Hybrid-Hybridomen können unter Verwendung von geeigneten Assays (beispielsweise ELISA) auf bispezifische Antikörper getestet werden, und bispezifische Antikörper können unter Verwendung herkömmlicher Verfahren aufgereinigt werden. Diese Antikörper können dann gemäß den hier beschriebenen Verfahren humanisiert werden. Daher stellt die Erfindung ein Targeting-Molekül bereit, das ein humanisierter bispezifischer Antikörper ist, der eine Bindungsspezifität für CCR2 und für ein auf einer Zielzelle exprimiertes Molekül aufweist, oder ein bivalentes Antigen-bindendes Fragment des bispezifischen Antikörpers ist. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Herbeiführen einer Interaktion einer CCR2-tragenden Zelle mit einer Zielzelle in einem Patienten, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Targeting-Moleküls an einen Patienten umfasst, das ein humanisierter bispezifischer Antikörper ist, der eine Bindungsspezifität für CCR2 und für ein auf einer Zielzelle exprimiertes Molekül aufweist, oder ein bivalentes Antigen-bindendes Fragment des bispezifischen Antikörpers ist.
VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON HUMANISIERTEN IMMUNGLOBULINEN, DIE EINE SPEZIFITÄT FÜR CCR2 AUFWEISEN
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines humanisierten Immunglobulins, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist. Das humanisierte Immunglobulin kann beispielsweise durch die Expression einer oder mehrerer rekombinanter Nukleinsäuren beispielsweise in einer Wirtszelle erhalten werden, die ein humanisiertes Immunglobulin codieren, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist.
Konstrukte oder Expressionsvektoren, die für die Expression eines humanisierten Immunglobulins mit einer Bindungsspezifität für CCR2 geeignet sind, werden auch bereitgestellt. Die Konstrukte können in eine geeignete Wirtszelle eingebracht werden, und Zellen, die ein erfindungsgemäßes humanisiertes Immunglobulin exprimieren, können hergestellt und in Kulturen gehalten werden. Geeignete Wirtszellen können prokaryotisch sein, einschließlich Bakterienzellen wie E. coli, B. subtilis und/oder andere geeignete Bakterien, oder eukaryotisch, wie Pilz- oder Hefezellen (beispielsweise Pichiapastoris, Aspergillus Arten, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa), oder andere niedere eukaryotische Zellen und Zellen höherer Eukaryoten, wie solche von Insekten (beispielsweise Insektenzellen ( WO 94/26087 , O'Connor, veröffentlicht 24. November, 1994)) oder von Säugetieren (beispielsweise, COS Zellen, wie COS-1 (ATCC Zugangsnummer CRL-1650) und COS-7 (ATCC Zugangsnummer CRL-1651), CHO (beispielsweise ATCC Zugangsnummer CRL-9096), 293 (ATCC Zugangsnummer CRL-1573), HeLa (ATCC Zugangsnummer CCL-2), CV1 (ATCC Zugangsnummer CCL-70), WOP (Dailey et al., J. Virol. 54: 739–749 (1985)), 3T3, 293T (Pear et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 8392–8396 (1993)), NSO Zellen, SP2/0, HuT78 Zellen, und ähnliche (siehe beispielsweise Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc., (1993)).
Wirtszellen, die ein Bindungsspezifität für CCR2 aufweisendes humanisiertes Immunglobulin herstellen, können wie folgt hergestellt werden. Beispielsweise kann eine Nukleinsäure, die alles oder einen Teil der codierenden Sequenz für das gewünschte humanisierte Immunglobulin codiert, in einen Nukleinsäurevektor eingefügt werden, beispielsweise in einen DNA-Vektor wie ein Plasmid, Virus oder in ein für die Expression geeignetes Replikon. Es steht eine Vielzahl an Vektoren zur Verfügung, einschließlich Vektoren, die in einfacher oder vielfacher Kopie erhalten bleiben oder die in das Wirtszellenchromosom integriert werden.
Geeignete Expressionsvektoren können eine Anzahl an Verbindungen enthalten, einschließlich, aber nicht begrenzt auf eine oder mehrere der folgenden Verbindungen: einen Replikationsstartpunkt, ein wählbares Markergen, ein oder mehrere Expressionssteuerelemente, wie ein Transkriptionssteuerelement (beispielsweise ein Promotor, ein Enhancer, Terminator) und/oder ein oder mehrere Translationssignale, eine Signalsequenz oder Leitsequenz für das Membran-Targeting oder für die Sekretion. In einem Konstrukt kann die Signalsequenz durch den Vektor oder durch eine andere Quelle bereitgestellt werden. So können beispielsweise die Transkriptions- und/oder Translationssignale eines Immunglobulins zur Steuerung der Expression verwendet werden.
Ein Promotor kann für die Expression in einer geeigneten Wirtszelle bereitgestellt werden. Promotoren können konstitutiv oder induzierbar sein. Beispielsweise kann ein Promotor operativ mit einer Nukleinsäure verbunden sein, die ein humanisiertes Immunglobulin oder eine Immunglobulinkette codiert, so dass er die Expression des codierten Polypeptids steuert. Es sind viele geeignete Promotoren für prokaryotische (beispielsweise lac, tac, T3, T7 Promotoren für E. coli) und eukaryotische (beispielsweise Hefe Alkoholdehydrogenase (ADH1), SV40, CMV) Wirte erhältlich.
Zusätzlich umfassen die Expressionsvektoren typischerweise einen wählbaren Marker zur Selektion von Vektor-tragenden Wirtszellen, und im Falle eines replizierbaren Expressionsvektors einen Replikationsstartpunkt. Gene, die Produkte codieren, die Antibiotika- oder Chemikalienresistenz gewähren, sind gebräuchliche Selektionsmarker und können in prokaryotischen (beispielsweise β-Laktamase-Gen (Ampicillin Resistenz), Tet-Gen für Tetracyclin Resistenz) und eukaryotischen (beispielsweise Neomycin (G418 oder Geneticin), gpt (Mycophenolsäure), Ampicillin oder Hygromycin Resistenzgene) Zellen verwendet werden. Dihydrofolsäurereduktase Markergene erlauben die Selektion mit Methotrexat in vielen Wirten. Gene, die das Genprodukt von auxotrophen Markern des Wirts (beispielsweise LEU2, URA3, HIS3) codieren, werden häufig als Selektionsmarker in Hefe verwendet. Die Verwendung von viralen (beispielsweise Baculovirus) oder Phagen-Vektoren und Vektoren, die in der Lage sind, sich in das Genom der Wirtszelle zu integrieren, werden auch in Betracht gezogen. In einer Ausführungsform ist der Vektor pLKTOK38. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Zellen, die diese Expressionsvektoren tragen.
Ein Expressionsvektor umfasst ein fusioniertes Gen, das eine leichte Kette eines humanisierten Immunglobulins codiert, wobei das Gen eine Nukleotidsequenz umfasst, die eine von einer leichten Kette eines nicht-humanen Antikörpers mit Bindungsspezifität für CCR2 abstammende CDR codiert, und eine von einer leichten Kette humanen Ursprungs abgeleitete Gerüstregion.
Daher beinhaltet die Erfindung einen Expressionsvektor, der ein Gen umfasst, das eine leichte Kette eines humanisierten Immunglobulins codiert, wobei das Gen eine Nukleotidsequenz umfasst, die eine von einer leichten Kette eines nicht-humanen Antikörpers mit Bindungsspezifität für CCR2 abstammende CDR codiert, und eine von einer leichten Kette humanen Ursprungs abgeleitete Gerüstregion. Die Erfindung betrifft auch einen Expressionsvektor, der ein Gen umfasst, das eine schwere Kette eines humanisierten Immunglobulins codiert, wobei das Gen eine Nukleotidsequenz umfasst, die eine von einer schweren Kette eines nicht-humanen Antikörpers mit Bindungsspezifität für CCR2 abstammende CDR codiert, und eine von einer schweren Kette humanen Ursprungs abgeleitete Gerüstregion. In einer Ausführungsform ist der nicht-humane Antikörper der Maus Antikörper 1D9. Die Erfindung schließt auch Wirtszellen ein, die die Expressionsvektoren der Erfindung umfassen. Die Erfindung betrifft auch ein isoliertes oder rekombinantes Gen, das eine leichte oder schwere Kette eines humanisierten Immunglobulins codiert, das eine erste Nukleinsäuresequenz umfasst, die eine von dem monoklonalen Maus Antikörper 1D9 abgeleitete Antigen-bindende Region codiert, und eine zweite Nukleinsäuresequenz, die wenigstens einen Teil einer konstanten Region eines Immunglobulins humanen Ursprungs codiert.
Die Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle (beispielsweise eine, die ein humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon exprimiert, das eine Bindungsspezifität für CCR2 aufweist), die ein erstes rekombinantes Nukleinsäuremolekül umfasst, das eine leichte Kette eines humanisierten Immunglobulins oder ein Fragment davon codiert, und ein zweites rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das eine schwere Kette eines humanisierten Immunglobulins oder ein Fragment davon codiert, wobei das erste Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz umfasst, die eine von der leichten Kette des Maus Antikörpers 1D9 abgeleitete CDR codiert und eine von einer leichten Kette humanen Ursprungs abgeleitete Gerüstregion, und wobei das zweite Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz umfasst, die eine von der schweren Kette des Maus Antikörpers 1D9 abgeleitete CDR codiert und eine von einer schweren Kette humanen Ursprungs abgeleitete Gerüstregion. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines humanisierten Immunglobulins oder Antigen-bindenden Fragments davon, umfassend dem Halten einer Wirtszelle der Erfindung unter Bedingungen, die für die Expression eines humanisierten Immunglobulins angemessen sind, wobei humanisierte Immunglobulinketten exprimiert werden und ein Bindungsspezifität für CCR2 aufweisendes humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon hergestellt wird. Das Verfahren kann weiterhin den Schritt des Isolierens des humanisierten Immunglobulins oder des Antigen-bindenden Fragments davon umfassen.
So kann beispielsweise ein Nukleinsäuremolekül (d.h. ein oder mehrere Nukleinsäuremolekül(e)), das die schweren und die leichten Ketten eines humanisierten Immunglobulins mit Bindungsspezifität für CCR2 oder ein Konstrukt (d.h. ein oder mehrere Konstrukt(e)) codiert, das (ein) derartige(s) Nukleinsäuremolekül(e) umfasst, in eine geeignete Wirtszelle durch ein Verfahren eingebracht werden, das für die bestimmte Wirtszelle angemessen ist (beispielsweise Transformation, Transfektion, Elektroporation, Infektion), so dass das/die Nukleinsäuremolekül(e) operativ mit einem oder mehreren Expressionssteuerelement(en) verbunden ist/sind (beispielsweise in einem Vektor in einem Konstrukt, das durch Prozesse in der Zelle erzeugt wurde und das in das Wirtszellen Genom integriert wurde). Wirtszellen können unter Bedingungen gehalten werden, die für die Expression geeignet sind (beispielsweise in der Gegenwart eines Inducers, geeigneten Medien, die mit angemessenen Salzen ergänzt wurden, Wachstumsfaktoren, Antibiotika, Nahrungsergänzungsmittel, usw.), wobei das codierte Polypeptid/die codierten Polypeptide hergestellt wird/werden. Falls erwünscht, kann das codierte Protein (beispielsweise humanisierter Antikörper 1D9) aus beispielsweise den Wirtszellen, dem Medium oder aus Milch isoliert werden. Dieses Verfahren umfasst die Expression in einer Wirtszelle eines transgenen Tieres (siehe beispielsweise WO 92/03918 , GenPharm International, veröffentlicht am 19. März, 1992).
Es können Fusionsproteine hergestellt werden, in denen ein humanisiertes Immunglobulin oder eine Immunglobulinkette in einer N-terminalen Position, einer C-terminalen Position oder in einer intern in dem Fusionsprotein gelegenen Position mit einem nicht-Immunglobulinanteil (d.h. ein Anteil, der nicht in natürlich vorkommenden Immunglobulinen vorkommt) verbunden ist. So können beispielsweise einige Ausführungsformen durch die Insertion einer Immunglobulinsequenzen codierenden Nukleinsäure in einen geeigneten Expressionsvektor, wie in einen pET Vektor (beispielsweise pET-15b, Novagen), einen Phagenvektor (beispielsweise pCANTAB 5 E, Pharmacia) oder in einen anderen Vektor (beispielsweise pRIT2T Protein A Fusionsvektor, Pharmacia), hergestellt werden. Das resultierende Konstrukt kann zur Expression in eine geeignete Wirtszelle eingebracht werden. Nach der Expression können einige Fusionsproteine aus einem Zelllysat mittels einer geeigneten Affinitätsmatrix isoliert oder aufgereinigt werden (siehe beispielsweise Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., Hrsg., Vol. 2, Suppl. 26, Seiten 16.4.1–16.7.8 (1991)).
THERAPEUTISCHE VERFAHREN UND ZUSAMMENSETZUNGEN
Die vorliegende Erfindung stellt humanisierte Immunglobuline bereit, die (1) CCR2 in vitro und/oder in vivo binden können und/oder (2) eine Aktivität oder Funktion von CCR2 verändern können, wie (a) die Bindungsfunktion (beispielsweise die Fähigkeit von CCR2 einen Liganden zu binden) und/oder (b) das Leukozyten-trafficking, einschließlich der Rekrutierung und/oder Akkumulation von Leukozyten in Geweben. Vorzugsweise sind die humanisierten Immunglobuline in der Lage, CCR2 selektiv in vitro und/oder in vivo zu binden und CCR2-vermittelte Interaktionen zu inhibieren. In einer Ausführungsform kann ein humanisiertes Immunglobulin CCR2 binden und die Bindung von CCR2 an einen oder mehrere seiner Liganden (beispielsweise HIV, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4) inhibieren. Die humanisierten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung sind in einer Vielzahl von Verfahren mit Anwendungen in der Forschung, Diagnose und Therapie anwendbar. So können sie zum Nachweisen, Isolieren und/oder Aufreinigen von CCR2 oder Varianten davon (beispielsweise durch Affinitäts-Aufreinigung oder durch andere geeignete Verfahren) und zur Untersuchung der CCR2 Struktur (beispielsweise der Konformation) und Funktion verwendet werden. Die humanisierten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung können auch in Diagnoseanwendungen (beispielsweise in vitro, ex vivo) oder zur Veränderung der CCR2 Funktion in therapeutischen (einschließlich in prophylaktischen) Ansätzen verwendet werden.
So können beispielsweise die humanisierten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung zum Nachweisen und/oder Messen des Niveaus von CCR2 in einer Probe (beispielsweise Gewebe oder Körperfluide, wie entzündliche Exsudate, Blut, Serum, Innereien-Fluide, auf Zellen, die CCR2 tragen) verwendet werden. Beispielsweise kann eine Probe (beispielsweise Gewebe und/oder Körperfluid) von einem Individuum erhalten werden und ein geeignetes immunologisches Verfahren kann zum Nachweis und/oder zur Erfassung der CCR2-Expression angewandt werden, einschließlich Verfahren wie der enzymgekoppelte Immunadsorptionstest (ELISA), einschließlich Chemilumineszenz-Assays, Radioimmuno-Assays und Immunohistologie. In einer Ausführungsform wird ein Verfahren zum Nachweis eines bestimmten CCR2 in einer Probe bereitgestellt, was das in Kontakt bringen einer Probe mit einem humanisierten Immunglobulin der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen umfasst, die für die spezifische Bindung des humanisierten Immunglobulins an CCR2 und für den Nachweis der gebildeten Antikörper-CCR2-Komplexe geeignet sind. In einer Anwendung des Verfahrens können humanisierte Immunglobuline zur Analyse von normalen und entzündeten Gewebe (beispielsweise von einem Menschen) auf CCR2 Reaktivität und/oder Expression (beispielsweise immunohistologisch) verwendet werden, um Verbindungen zwischen bestimmten Bedingungen und der erhöhten CCR2 Expression (beispielsweise in betroffenen Geweben) nachzuweisen. Die humanisierten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung erlauben immunologische Verfahren der Bewertung der Gegenwart von CCR2 in normalem Gewebe, verglichen mit entzündlichem Gewebe, durch die das Vorhandensein einer Erkrankung, ein Fortlaufen einer Erkrankung und/oder die Wirksamkeit einer anti-CCR2 Integrin Therapie in entzündlichen Geweben bewertet werden kann.
Die humanisierten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung können auch zur Veränderung (beispielsweise Inhibition (reduzieren oder verhindern)) der Bindungsfunktion und/oder des durch CCR2 vermittelten Leukozyten- (beispielsweise Lymphozyten, Monozyten) trafficking verwendet werden. So können beispielsweise humanisierte Immunglobuline, die die Bindung von CCR2 an einen Liganden (d.h. an einen oder an mehrere Liganden) inhibieren, bei der Behandlung von Erkrankungen, die mit Leukozyten (beispielsweise Lymphozyten, Monozyten) Infiltration von Geweben assoziiert sind, gemäß dem Verfahren verabreicht werden. Zusätzlich können humanisierte Immunglobuline, die die Bindung von CCR2 an einen Liganden (d.h. an einen oder an mehrere Liganden) inhibieren, gemäß dem Verfahren bei der Behandlung von HIV verabreicht werden. Zur Behandlung einer derartigen Erkrankung wird einem Individuum (beispielsweise einem Säugetier wie einem Menschen oder anderen Primaten) eine wirksame Menge eines humanisierten Immunglobulins der vorliegenden Erfindung (d.h. eins oder mehrere) verabreicht.
Das humanisierte Immunglobulin wird in einer wirksamen Menge verabreicht, die die Bindung von CCR2 an einen seiner Liganden inhibiert. In der Therapie ist eine wirksame Menge ausreichend, um den erwünschten therapeutischen (einschließlich den prophylaktischen) Effekt zu erzielen (wie eine Menge, die ausreicht, um CCR2-vermittelte Bindungen und Signalisierungen zu reduzieren oder zu verhindern). Das humanisierte Immunglobulin kann in Einzeldosen oder in Mehrfachdosen verabreicht werden. Die Dosierung kann durch bekannte Verfahren bestimmt werden und kann von beispielsweise dem Alter, der Empfindlichkeit, der Toleranz und dem allgemeinen Wohlbefinden des Individuums abhängig sein. Geeignete Dosierungen für Antikörper können von ungefähr 0,1 mg/kg Körpergewicht bis zu ungefähr 10,0 mg/kg Körpergewicht und Behandlung reichen.
Gemäß dem Verfahren kann das humanisierte Immunglobulin einem Individuum (beispielsweise einem Menschen) allein oder in Verbindung mit anderen Mitteln verabreicht werden. Ein humanisiertes Immunglobulin kann vor, zusammen mit oder nach der Verabreichung des zusätzlichen Mittels verabreicht werden. Daher schließt die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen mit ein, die ein humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon der Erfindung und einen geeigneten Träger umfassen. In einer Ausführungsform wird mehr als ein humanisiertes Immunglobulin verabreicht, das die Bindung von CCR2 an seine Liganden inhibiert. In einer weiteren Ausführungsform wird ein zusätzlicher monoklonaler Antikörper zu dem humanisierten Immunglobulin der vorliegenden Erfindung verabreicht. In noch einer weiteren Ausführungsform kann ein zusätzlicher pharmakologisch aktiver Inhaltsstoff (beispielsweise eine anti-Entzündungszusammensetzung wie Sulfasalazin, eine weitere nicht-steroide anti-Entzündungszusammensetzung oder eine steroide anti-Entzündungszusammensetzung) in Verbindung mit einem humani sierten Immunglobulin der vorliegenden Erfindung verabreicht werden.
Eine Vielzahl an Verabreichungswegen ist möglich, abhängig von der zu behandelnden Erkrankung oder dem zu behandelnden Zustand, einschließlich, aber nicht zwingend begrenzt auf parenteral (beispielsweise intravenöse, intraarterielle, intramuskuläre, subkutane Injektionen), oral (beispielsweise diätetisch), topisch, inhalativ (beispielsweise intrabronchiale, intranasale oder orale Inhalation, intranasale Tropfen) oder rektal. Die parenterale Verabreichung ist die bevorzugte Art der Verabreichung.
Die Formulierung wird entsprechend des gewählten Verabreichungsweges (beispielsweise Lösung, Emulsion) variieren. Eine angemessene Zusammensetzung, die den zu verabreichenden humanisierten Antikörper umfasst, kann in einem physiologisch akzeptablen Vehikel oder Träger hergestellt werden. Für Lösungen oder Emulsionen schließen geeignete Träger beispielsweise wässrige oder alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich salzige und gepufferte Medien, ein. Parenterale Vehikel können Natriumchloridlösungen, Ringers Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, laktierte Ringerlösungen oder nichtflüchtige Öle einschließen. Intravenöse Vehikel können verschiedene Additive, Präservative oder Fluide, nahrhafte oder elektrolytische Regenerierer (Replenisher) einschließen (siehe allgemein Remington's Pharmaceutical Sciences, 17^th Edition, Mack Publishing Co., PA, 1985). Für Inhalationen kann die Zusammensetzung gelöst und in einem für die Verabreichung geeigneten Spender (beispielsweise ein Zerstäuber, Vernebler oder Druckzerstäuberspender) geladen werden.
Daher schließt die Erfindung ein Verfahren der Inhibition einer HIV-Infektion einer Zelle ein, das das in Kontakt bringen einer Zelle mit einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung umfasst, die ein humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon der Erfindung umfasst. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung von HIV oder zur Inhibition einer HIV-Infektion in einem Patienten, was die Verabreichung einer Zusammensetzung an den Patienten umfasst, die eine wirksame Menge eines humanisierten Immunglobulins oder Antigen-bindendes Fragment davon der Erfindung umfasst.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren der Inhibition einer mit der Bindung eines Chemokins an den Säugetier CCR2 assoziierten Funktion oder einem funktionalen Bereich von CCR2, was das in Kontakt bringen einer CCR2 oder einen Bereich davon umfassenden Zusammensetzung mit einer wirksamen Menge eines humanisierten Immunglobulins oder Antigen-bindenden Fragments davon der Erfindung umfasst, wobei das humanisierte Immunglobulin die Bindung des Chemokins an den Säugetier CCR2 inhibiert und eine oder mehrere mit der Bindung des Chemokins an CCR2 assoziierte Funktionen inhibiert. Das Chemokin kann beispielsweise aus der Gruppe ausgewählt werden bestehend aus MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 und Kombinationen davon.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren der Inhibition des Leukozyten-trafficking in einem Patienten, was die Verabreichung einer Zusammensetzung an den Patienten umfasst, die eine wirksame Menge eines humanisierten Immunglobulins oder Antigen-bindenden Fragments davon der Erfindung umfasst, die an den Säugetier CCR2 bindet und die Bindung eines Liganden an den Rezeptor inhibiert. Beispielsweise kann der Ligand ein Chemokin (beispielsweise MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4) oder HIV sein.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren der Inhibition der Interaktion einer ersten CCR2 exprimierenden Zelle mit einem Liganden (beispielsweise eine zweite Zelle, die einen Liganden von CCR2 exprimiert), was das in Kontakt bringen der ersten Zelle mit einer wirksamen Menge eines humanisierten Immunglobulins oder Antigen-bindenden Fragments davon der Erfindung umfasst, wobei insbesondere das Immunglobulin oder Fragment die Bindung des Liganden an CCR2 inhibiert. So kann die Zelle beispielsweise aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten, T-Zellen, Basophilen und Zellen, die eine rekombinante Nukleinsäure umfassen, die CCR2 oder einen Bereich davon codieren. In einer Ausführungsform ist der Ligand ein Chemokin (beispielsweise MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4). In einer weiteren Ausführungsform ist der Ligand HIV.
Die Erfindung enthält auch ein Verfahren der Behandlung einer CCR2-vermittelten Störung in einem Patienten, was die Verabreichung einer wirksamen Menge eines humanisierten Immunglobulins oder Antigen-bindenden Fragments davon der Erfindung an den Patienten umfasst, das an Säugetier CCR2 bindet. Die Störung kann eine Allergie, Atheromatose, Anaphylaxie, Malignität, chronische und akute entzündliche Störungen, allergische Reaktionen vermittelt durch Histamin und IgE, Schock und rheumatoide Arthritis, Arteriosklerose, multiple Sklerose, Stenose, Restenose, Transplantatsabstoßung, fibröse Erkrankungen, Asthma und entzündliche Glomerulopathien einschließen, ist darauf aber nicht begrenzt.
In einer besonderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren der Inhibition einer Restenose in einem Patienten, was die Verabreichung einer wirksamen Menge eines humanisierten Immunglobulins oder Antigen-bindenden Fragments davon der Erfindung an den Patienten umfasst, das an Säugetier CCR2 bindet. Die Erfindung schließt auch ein humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon der Erfindung für die Verwendung in der Therapie oder der Diagnose oder für die Verwendung in der Behandlung einer CCR2-vermittelten Erkrankung oder Störung ein. Die Erfindung schließt auch die Verwendung eines humanisierten Immunglobulins oder Antigen-bindenden Fragments davon der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer CCR2-vermittelten Erkrankung ein.
Anti-idiotypische Antikörper werden auch bereitgestellt. Anti-idiotypische Antikörper erkennen antigenische Determinanten, die mit den Antigen-Bindestellen eines anderen Antikörpers assoziiert sind. Anti-idiotypische Antikörper können gegen zweite Antikörper durch Immunisieren eines Tieres derselben Art und vorzugsweise desselben Stammes hergestellt werden, wie das Tier, das zur Herstellung des zweiten Antikörpers verwendet wurde. Siehe beispielsweise U.S. Patent Nr. 4,699,880 .
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die unter den ATCC Zugangsnummern HB-12549 und HB-12550 hinterlegten Hybridom-Zelllinien, sowie die von den unter den ATCC Zugangsnummern HB-12549 und HB-12550 hinterlegten Hybridom-Zelllinien produzierten Antikörper. Die Zelllinien der vorliegenden Erfindung haben einen anderen Nutzen, als den für die Herstellung der monoklonalen Antikörper. So können die Zelllinien der vorliegenden Erfindung beispielsweise mit anderen Zellen zur Herstellung zusätzlicher Hybridome fusioniert werden (wie mit einer geeigneten Chemikalie markierte humane Myelom-, Maus Myelom-, humane Maus Heteromyelom- oder humane lymphoblastoide-Zellen), und sind daher für den Transfer von Genen vorgesehen, die die monoklonalen Antikörper codieren. Zusätzlich können die Zelllinien als Quelle für Nukleinsäuren verwendet werden, die die anti-CCR2 Immunglobulinketten codieren, die isoliert und exprimiert werden können (beispielsweise nach dem Transfer in andere Zellen unter Verwendung jeglicher geeigneter Methoden (siehe beispielsweise Cabilly et al., U.S. Patent Nr. 4,816,567 ; Winter, U.S. Patent Nr. 5,225,539 )). So können beispielsweise Klone isoliert werden (beispielsweise durch PCR), die eine reorganisierte anti-CCR2 leichte oder schwere Kette umfassen oder es können cDNA Banken aus mRNA hergestellt werden, die aus den Zelllinien isoliert wurde, und es können cDNA Klone isoliert werden, die eine anti-CCR2 Immunglobulinkette codieren. Daher können Nukleinsäuren erhalten werden, die die schweren und/oder leichten Ketten der Antikörper oder Bereiche davon codieren, und in Einklang mit rekombinanten DNA Methoden zur Herstellung des spezifischen Immunglobulins, der Immunglobulinkette oder von Varianten davon (beispielsweise humanisierte Immunglobuline) in einer Vielzahl an Wirtszellen oder in einem in vitro Translationssystem verwendet werden. Beispielsweise können die Nukleinsäuren, einschließlich cDNAs oder Derivate davon, die Varianten wie ein humanisiertes Immunglobulin oder eine Immunglobulinkette codieren, in geeignete prokaryotische oder eukaryotische Vektoren (beispielsweise Expressionsvektoren) gebracht werden und in eine geeignete Wirtszelle durch ein geeignetes Verfahren (beispielsweise Transformation, Transfektion, Elektroporation, Infektion) eingebracht werden, so dass die Nukleinsäure operativ mit einem oder mehreren Expressionssteuerelementen (beispielsweise in dem Vektor oder im Wirtszellgenom integriert) verbunden wird. Zur Herstellung können Wirtszellen unter Bedingungen gehalten werden, die für die Expression geeignet sind (beispielsweise in Gegenwart eines Inducers, geeignete mit angemessenen Salzen ergänzte Medien, Wachstumsfaktoren, Antibiotika, Nahrungsergänzungen usw.), wobei das codierte Polypeptid hergestellt wird. Falls erwünscht kann das codierte Protein wiedererlangt und/oder isoliert werden (beispielsweise aus den Wirtszellen, dem Medium oder aus Milch). Somit ist klar, dass das Verfahren der Herstellung die Expression in einer Wirtszelle eines transgenen Tieres umfasst (siehe beispielsweise WO 92/03918 , GenPharm International, veröffentlicht am 19. März, 1992).
Wie hier beschrieben können Antikörper und funktionale Fragmente davon der vorliegenden Erfindung die Bindung eines Liganden an CCR2 blockieren (inhibieren) und/oder die mit der Bindung des Liganden an CCR2 assoziierten Funktionen inhibieren. Wie im Folgenden beschrieben wird, können verschiedene Verfahren zur Bewertung der Inhibition des Bindens eines Liganden an CCR2 und/oder der Funktion, die mit dem Binden des Liganden an den Rezeptor assoziiert wird, verwendet werden.
BINDUNGS-ASSAYS
Wie hier verwendet bezeichnet "Säugetier CCR2 Protein" natürlich vorkommende oder endogene Säugetier CCR2 Proteine und Proteine, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die die gleiche ist, wie die des natürlich vorkommenden oder endogenen entsprechenden Säugetier CCR2 Proteins (beispielsweise rekombinante Proteine). Entsprechend enthält der hier definierte Begriff voll entwickelte Rezeptorproteine, polymorphe oder allelische Varianten und andere Isoformen des Säugetier CCR2 (beispielsweise hergestellt durch alternatives Spleißen oder andere zelluläre Prozesse), und modifizierte oder unmodifizierte Formen der vorstehenden (beispielsweise glycosylierte, unglycosylierte). Es können Säugetier CCR2 Proteine und/oder rekombinante Proteine (einschließlich synthetisch hergestellte Proteine) isoliert werden. Natürlich vorkommende oder endogene Säugetier CCR2 Proteine schließen Wildtyp Proteine wie voll entwickelte CCR2s, polymorphe oder allelische Varianten und andere Isoformen ein, die natürlich in Säugern (beispielsweise Menschen, nicht-humane Primaten) vorkommen, wie die CCR2a und CCR2b Formen des Rezeptorproteins, die durch alternatives Spleißen des Carboxy-Terminus des Proteins hergestellt werden. Derartige Proteine können beispielsweise aus einer Quelle wiedererlangt oder isoliert werden, die natürlich Säugetier CCR2 herstellt. Diese Proteine und Säugetier CCR2 Proteine, die die gleiche Aminosäuresequenz wie natürlich vorkommendes oder endogenes entsprechendes Säugetier CCR2 aufweisen, werden durch den Namen des entsprechenden Säugetiers benannt. Beispielsweise wird das Protein als humanes CCR2 Protein bezeichnet, wenn das entsprechende Säugetier ein Mensch ist (beispielsweise wird ein rekombinantes humanes CCR2 in einer geeigneten Wirtszelle hergestellt).
"Funktionale Varianten" von Säugetier CCR2 Proteinen schließen funktionale Fragmente, funktionale Mutantenproteine und/oder funktionale Fusionsproteine ein (beispielsweise hergestellt durch Mutagenese und/oder rekombinante Methoden). Im Allgemeinen schließen Fragmente oder Bereiche von Säugetier CCR2 Proteinen solche ein, die eine Deletion (d.h. eine oder mehrere Deletionen) einer Aminosäure (d.h. einer oder mehrerer Aminosäuren) relativ zu dem voll entwickelten Säugetier CCR2 Protein aufweisen (wie N-terminale, C-terminale oder interne Deletionen). Fragmente oder Bereiche, in denen nur zusammenhängende Aminosäuren entfernt wurden oder in denen nicht-zusammenhängende Aminosäuren relativ zu dem voll entwickelten Säugetier CCR2 Protein entfernt wurden, sind auch vorgesehen.
Im Allgemeinen schließen Mutanten von Säugetier CCR2 Proteinen natürliche oder künstliche Varianten des Säugetier CCR2 Proteins ein, die sich durch die Addition, Deletion und/oder Substitution von einem oder mehreren zusammenhängenden oder nicht-zusammenhängenden Aminosäureresten (beispielsweise Rezeptor-Chimären) unterscheiden. Derartige Mutationen können beispielsweise in konservierten Regionen, nicht-konservierten Regionen (verglichen mit anderen CXC und/oder CC Chemokin Rezeptoren), extrazellulären, cytoplasmatischen oder Transmembranen-Regionen liegen.
Im Allgemeinen umfassen Fusionsproteine Polypeptide, die eine Säugetier CCR2 (beispielsweise humanes CCR2) als einen ersten Anteil umfassen, der über eine Peptidbindung mit einem zweiten Anteil verbunden ist, der nicht in natura in dem Säugetier CCR2 vorkommt. Daher kann der zweite Anteil eine Aminosäure, ein Oligopeptid oder ein Polypeptid sein. Der erste Anteil kann sich am N-Terminus, C-Terminus oder innerhalb des Fusionsproteins befinden. In einer Ausführungsform umfasst das Fusionsprotein einen Affinitätsliganden (beispielsweise ein Enzym, ein Antigen, Epitop-Etiketten bzw. tags) als den ersten Anteil und ein zweiter Anteil umfasst eine Linkersequenz und humanes CCR2 oder einen Bereich davon.
Ein "funktionales Fragment oder Bereich", "funktionale Mutante" und/oder "funktionales Fusionsprotein" eines Säugetier CCR2 Proteins bezieht sich auf ein isoliertes und/oder rekombinantes Protein oder Polypeptid, das mindestens eine Funktionseigenschaft des hier beschriebenen Säugetier CCR2 Proteins aufweist, wie eine Bindungsaktivität, eine Signalaktivität und/oder eine Fähigkeit zur Stimulierung einer zellulären Antwort. Bevorzugte funktionale Varianten können einen Liganden binden (d.h. einen oder mehrere Liganden wie MCP-1, MCP-2, MCP-3 und/oder MCP-4) und werden hier als "Ligand-bindende Varianten" bezeichnet.
In einer Ausführungsform weist eine funktionale Variante des Säugetier CCR2 mindestens ungefähr 85% Sequenzübereinstimmung mit dem Säugetier CCR2 auf, vorzugsweise mindestens ungefähr 90% Sequenzübereinstimmung und mehr bevorzugt mindestens ungefähr 95% Sequenzübereinstimmung mit dem Säugetier CCR2. Die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen des Säugetier CCR2a und CCR2b werden in U.S. Patent Nr. 5,707,815 beschrieben. Die Sequenzübereinstimmung kann mittels eines geeigneten Programms unter angemessenen Parametern, wie den voreingestellten Parametern, bestimmt werden, wie mit dem Blastx Programm (Version 1.4). In einer Ausführungsform sind die Parameter für die Blastx Suche die Ergebnismatrix (scoring matrix) BLOSUM62, W = 3. In einer weiteren Ausführungsform umfasst eine funktionale Variante eine Nukleinsäuresequenz, die sich von dem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül unterscheidet, die aber aufgrund der Degenerierung des genetischen Codes einen Säugetier CCR2 oder einen Bereich davon codiert.
Eine Zusammensetzung, die ein isoliertes und/oder rekombinantes Säugetier CCR2 oder eine funktionale Variante davon umfasst, kann unter Bedingungen gehalten werden, die für die Bindung geeignet sind, und das Säugetier CCR2 oder die Variante wird mit einem Antikörper oder zu testenden Fragment in Kontakt gebracht und die Bindung wird direkt oder indirekt erfasst oder gemessen. In einer Ausführungsform werden Zellen verwendet, die CCR2 natürlich exprimieren oder Zellen, die eine rekombinante Nukleinsäuresequenz umfassen, die ein Säugetier CCR2 oder eine Variante davon codiert. Die Zellen werden unter Bedingungen gehalten, die für die Expression des Rezeptors angemessen sind. Die Zellen werden mit einem Antikörper oder Fragment unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die für die Bindung geeignet sind (beispielsweise in einem geeigneten Bindungspuffer), und die Bindung wird durch standardmäßige Methoden erfasst. Zur Bestimmung der Bindung wird das Ausmaß der Bindung relativ zu einer geeigneten Kontrolle bestimmt (beispielsweise verglichen mit dem in Abwesenheit des Antikörpers bestimmten Hintergrund, verglichen mit der Bindung eines zweiten Antikörpers (d.h. einem Standard), verglichen mit der Bindung eines Antikörpers an nicht-transfizierte Zellen). Eine zelluläre Fraktion, wie eine Membranfraktion, die einen Rezeptor enthält, oder Liposomen, die einen Rezeptor umfassen, kann an Stelle von ganzen Zellen verwendet werden.
In einer Ausführungsform ist der Antikörper mit einem geeigneten Marker markiert (beispielsweise mit einem fluoreszenten Marker, Isotopenmarker, Antigen- oder Epitopmarker) und die Bindung wird durch Erfassen des Markers bestimmt. In einer weiteren Ausführungsform kann der gebundene Antikörper durch einen markierten zweiten Antikörper erfasst werden. Die Spezifität der Bindung kann durch Konkurrenz oder Verdrängung bewertet werden, beispielsweise unter Verwendung von unmarkierten Antikörpern oder Liganden als Konkurrenten.
Bindungs-Inhibitions-Assays können auch dazu verwendet werden, Antikörper oder Fragmente davon zu identifizieren, die an CCR2 binden, und die Bindung einer weiteren Verbindung wie einem Liganden (beispielsweise MCP-1, MCP-2, MCP-3 und/oder MCP-4) an CCR2 oder an eine funktionale Variante zu inhibieren. Beispielsweise kann ein Bindungs-Assay durchgeführt werden, in dem eine Reduktion in der Bindung eines Liganden von CCR2 (in Gegenwart eines Antikörpers) erfasst oder gemessen wird, verglichen mit der Bindung des Liganden in Abwesenheit des Antikörpers. Eine Zusammensetzung, die einen isolierten und/oder rekombinanten Säugetier CCR2 oder ein funktionales Fragment davon umfasst, kann mit dem Liganden und dem Antikörper gleichzeitig oder nacheinander in jeder Reihenfolge in Kontakt gebracht werden. Eine Reduzierung in dem Ausmaß der Bindung des Liganden in Gegenwart des Antikörpers deutet auf eine Inhibition der Bindung durch den Antikörper hin. Beispielsweise kann die Bindung des Liganden reduziert oder beseitigt werden.
In einer Ausführungsform wird die direkte Inhibition der Bindung eines Liganden (beispielsweise eines Chemokins wie MCP-1) an einen Säugetier CCR2 oder an eine Variante davon durch einen Antikörper oder durch ein Fragment überwacht. Beispielsweise kann die Fähigkeit eines Antikörpers überwacht werden, die Bindung von ¹²⁵I-markiertem MCP-1, ¹²⁵I-markiertem MCP-2, ¹²⁵I-markiertem MCP-3 oder ¹²⁵I-markiertem MCP-4 an Säugetier CCR2 zu inhibieren. Ein derartiger Assay kann unter Verwendung von geeigneten Zellen durchgeführt werden, die CCR2 oder eine funktionale Variante davon tragen, wie isolierte Blutzellen (beispielsweise T-Zellen, PBMC) oder geeignete Zelllinien, die natürlich CCR2 exprimieren, oder eine Nukleinsäure enthaltende Zelllinie, die ein Säugetier CCR2 codiert oder beispielsweise eine Membranfraktion dieser Zellen.
Andere Verfahren der Identifizierung der Gegenwart eines CCR2-bindenden Antikörpers sind verfügbar, wie andere geeignete Bindungs-Assays oder Verfahren, die Ereignisse überwachen, die durch Rezeptorbindung ausgelöst werden, einschließlich signalisierende Funktion und/oder Stimulation einer zellulären Antwort (beispielsweise Leukozyten-trafficking).
Es sollte klar sein, dass der inhibitorische Effekt der Antikörper der vorliegenden Erfindung in einem Bindungs-Assay bewertet werden kann. Die Konkurrenz zwischen Antikörpern für die Rezeptorbindung kann in dem Verfahren ebenfalls bewertet werden. So identifizierte Antikörper können weiter bewertet werden, um zu bestimmen, ob sie nach der Bindung andere Funktionen von CCR2 inhibieren und/oder zur Bewertung ihrer therapeutischen Nützlichkeit.
SIGNALISIERUNGS-ASSAYS
Die Bindung eines Liganden oder Promotors, wie ein Agonist, an CCR2 kann zum Signalisieren durch den G Protein-gekoppelten Rezeptor führen, und die Aktivität der G Proteine sowie anderer intrazellulärer Signalmoleküle wird stimuliert. Die Induktion der Signalfunktion durch eine Verbindung (beispielsweise durch einen Antikörper oder Fragment davon) kann durch Verwenden jedes geeigneten Verfahrens überwacht werden. Ein derartiges Verfahren kann zur Identifizierung von Antikörper Agonisten von CCR2 verwendet werden. Die inhibitorische Aktivität eines Antikörpers oder Fragments davon kann durch Verwenden eines Liganden oder Promotors in dem Assay bestimmt werden, und die Fähigkeit des Antikörpers die durch einen Liganden oder Promotor induzierte Aktivität zu inhibieren kann bewertet werden.
Die Aktivität des G Proteins, wie die Hydrolyse von GTP zu GDP, oder spätere Signalereignisse, die durch Rezeptorbindung ausgelöst werden, wie die Induktion einer schnellen und dauerhaften Erhöhung der Konzentration von (cytosolisch) freiem Calcium [Ca²⁺]i, können durch die im Stand der Technik bekannten Verfahren oder andere geeignete Verfahren bewertet werden (siehe beispielsweise Neote, K. et al., Cell, 72: 415–425 1993); Van Riper et al., J. Exp. Med., 177: 851–856 (1993); Dahinden, C.A. et al., J. Exp. Med., 179: 751–756 (1994)).
So kann beispielsweise der funktionale Assay von Sledziewski et al., der an G Protein gekoppelte Hybridrezeptoren verwendet, zur Überwachung der Fähigkeit eines Liganden oder eines Promotors verwendet werden, Rezeptoren zu binden und ein G Protein zu aktivieren (Sledziewski et al., U.S. Patent Nr. 5,284,746 ; dessen Lehre hier durch Referenzen aufgenommen wurde).
Derartige Assays können in Gegenwart des zu bewertenden Antikörpers oder Fragments davon durchgeführt werden, und die Fähigkeit des Antikörpers oder Fragments davon, die durch den Liganden oder Promotor induzierte Aktivität zu inhibieren, wird durch Verwenden von bekannten Verfahren und/oder hier beschriebenen Verfahren bestimmt.
CHEMOTAXIS UND ASSAYS DER ZELLULÄREN STIMULATION
Chemotaxis-Assays können auch verwendet werden, um die Fähigkeit eines Antikörpers oder funktionalen Fragments davon zu bewerten, die Bindung eines Liganden an Säugetier CCR2 oder an eine funktionale Variante davon zu blockieren und/oder Funktionen zu inhibieren, die mit der Bindung des Liganden an den Rezeptor assoziiert sind. Diese Assays basieren auf der funktionalen Migration von Zellen in vitro und in vivo, was durch eine Verbindung induziert wird. Die Chemotaxis kann wie in den Beispielen beschrieben bewertet werden, beispielsweise in einem Assay unter Verwendung einer 96-well Chemotaxis-Platte oder unter Verwendung anderer anerkannter Verfahren zur Bewertung der Chemotaxis. So wurde beispielsweise die Verwendung eines in vitro transendothelialen Chemotaxis-Assays durch Springer et al. beschrieben (Springer et al., WO 94/20142 , veröffentlicht am 15. September, 1994, die Lehre wurde hier durch Referenzen aufgenommen; siehe auch Berman et al., Immunol. Invest. 17: 625–677 (1988)). Eine Migration über das Endothel in Kollagengele wurde auch beschrieben (Kavanaugh et al., J. Immunol., 146: 4149–4156 (1991)). Es können auch beispielsweise stabile Transfektanten von Maus L1-2 pre-B Zellen oder von anderen geeigneten Wirtszellen, die in der Lage sind, Chemotaxis durchzuführen, verwendet werden.
Im Allgemeinen überwachen Chemotaxis Assays die gerichtete Bewegung oder Migration einer geeigneten Zelle (wie eine Leukozyte (beispielsweise Lymohozyte, Eosinophile, Basophile)) in oder durch eine Barriere (beispielsweise Endothel, ein Filter) in Richtung des erhöhten Niveaus einer Verbindung, von einer ersten Oberfläche der Barriere zu einer abgewandten zweiten Oberfläche. Membranen oder Filter stellen praktische Barrieren bereit, so dass die gerichtete Bewegung oder Migration einer geeigneten Zelle in oder durch einen Filter in Richtung des erhöhten Niveaus einer Verbindung, von einer ersten Oberfläche des Filters zu einer abgewandten zweiten Oberfläche des Filters, überwacht wird. In einigen Assays ist die Membran mit einer Substanz beschichtet, wie ICAM-1, Fibronektin oder Kollagen, um die Adhäsion zu unterstützen. Derartige Assays stellen eine in vitro Annäherung an die Leukozyten Zielsuche bzw. "homing" bereit.
Beispielsweise kann man die Inhibition der Migration von Zellen in einem geeigneten Behälter (einem Aufbewahrungsmittel) erfassen oder messen, von einer ersten Kammer in oder durch eine mikroporöse Membran in eine zweite Kammer, die einen zu testenden Antikörper enthält und die von der ersten Kammer durch die Membran abgetrennt ist. Es wird eine geeignete Membran ausgewählt, die eine geeignete Porengröße zur Überwachung der spezifischen Migration als Antwort auf eine Verbindung aufweist, einschließlich beispielsweise Nitrozellulose, Polykarbonat. Beispielsweise können Porengrößen von ungefähr 3–8 μm und vorzugsweise von ungefähr 5–8 μm verwendet werden. Die Porengröße auf einem Filter kann gleich sein oder innerhalb eines Bereichs geeigneter Porengrößen liegen.
Zur Bewertung der Migration und Inhibition der Migration kann die Strecke der Migration in dem Filter, die Anzahl der Zellen, die den Filter überqueren und an der zweiten Oberfläche des Filters haften bleiben und/oder die Anzahl der Zellen, die sich in der zweiten Kammer ansammeln, durch standardmäßige Methoden (beispielsweise Mikroskopie) bestimmt werden. In einer Ausführungsform sind die Zellen mit einem nachweisbaren Marker markiert (beispielsweise mit Radioisotopen, fluoreszenten Markierungen, Antigen- oder Epitopmarkierungen), und die Migration kann in Gegenwart und Abwesenheit des Antikörpers oder des Fragments durch Bestimmung der Gegenwart der Markierung, die auf der Membran haftet und/oder in der zweiten Kammer vorliegt, durch angemessene Verfahren (beispielsweise durch Erfassen der Radioaktivität, Fluoreszenz, Immunoassays) bewertet werden. Das Ausmaß der durch einen Antikörper Agonisten induzierten Migration kann relativ zu einer geeigneten Kontrolle bestimmt werden (beispielsweise verglichen mit der Hintergrundmigration, bestimmt in Abwesenheit des Antikörpers, verglichen mit dem Ausmaß der Migration, die durch eine zweite Verbindung (d.h. einen Standard) induziert wurde, verglichen mit der durch Antikörper induzierten Migration nicht-transfizierter Zellen).
In einer Ausführungsform, insbesondere für T-Zellen, in der Monozyten oder Zellen ein Säugetier-CR2 exprimieren, kann die transendotheliale Migration überwacht werden. In dieser Ausführungsform wird die Migration durch eine Endothelzellschicht bewertet. Zur Herstellung der Zellschicht können Endothelzellen auf einem mikroporösen Filter oder einer Membran kultiviert werden, die wahlweise mit einer Substanz wie Kollagen, Fibronektin oder anderen Proteinen der extrazellulären Matrix beschichtet ist, um das Anheften von Endothelzellen zu unterstützen. Vorzugsweise werden Endothelzellen kultiviert, bis eine konfluente Monoschicht gebildet wurde. Eine Vielzahl an Säugetier Endothelzellen steht für die Monoschichtbildung zur Verfügung, einschließlich beispielsweise Venen-, Arterien- oder mikrovaskuläres Endothel, wie humane Nabelvenen Endothelzellen (Clonetics Corp., San Diego, CA). Zur Bewertung der Chemotaxis als Antwort auf einen besonderen Säugetier rezeptor werden Endothelzellen des gleichen Säugetiers bevorzugt, jedoch können auch Zellen von heterologen Säugetier-Arten oder -Gattungen verwendet werden.
Im Allgemeinen wird der Assay durch Erfassen der gerichteten Migration von Zellen in oder durch eine Membran oder Filter durchgeführt, in Richtung der erhöhten Niveaus einer Verbindung, von einer ersten Oberfläche des Filters zu einer abgewandten zweiten Oberfläche des Filters, wobei der Filter eine Endothelzellschicht auf einer ersten Oberfläche enthält. Die gerichtete Migration findet von dem ersten Gebiet, das an die erste Oberfläche angrenzt, in oder durch die Membran in Richtung einer Zusammensetzung statt, die auf der abgewandten Seite des Filters liegt. Die Konzentration der in dem an die zweite Oberfläche angrenzenden Gebiet vorliegenden Verbindung ist höher, als die in dem an die erste Oberfläche angrenzenden Gebiet.
In einer Ausführungsform, die zum Testen auf einen Antikörperinhibitor verwendet wird, kann eine Zusammensetzung, die Zellen umfasst, die in der Lage sind zu migrieren und einen Säugetier CCR2 zu exprimieren, in der ersten Kammer angeordnet werden. in der zweiten Kammer wird eine Zusammensetzung angeordnet, die einen oder mehrere Liganden oder Promotoren umfasst, die in der Lage sind, die Chemotaxis von den Zellen in der ersten Kammer zu induzieren (die eine Chemoattraktans-Funktion aufweisen). Vorzugsweise wird, kurz bevor die Zellen in der ersten Kammer angeordnet werden oder gleichzeitig mit den Zellen, eine Zusammensetzung vorzugsweise in der ersten Kammer angeordnet, die den zu testenden Antikörper umfasst. Antikörper oder funktionale Fragmente davon, die in diesem Assay Rezeptoren binden können und die Induktion der Chemotaxis der Säugetier CCR2 exprimierenden Zellen durch einen Liganden oder Promotor inhibieren können, sind Inhibitoren der Rezeptorfunktion (beispielsweise Inhibitoren der stimulierenden Funktion). Eine Reduzierung in dem Ausmaß der durch einen Liganden oder Promotor induzierten Migration in Gegenwart des Antikörpers oder des Fragments deutet auf inhibitorische Aktivität hin. Separate Bindungsstudien (siehe oben) konnten zur Bestimmung, ob die Inhibition ein Ergebnis der Bindung des Antikörpers an den Rezeptor ist oder ob sie über einen anderen Mechanismus stattfindet, durchgeführt werden.
In vivo Assays, die die Leukozyteninfiltration in ein Gewebe als Antwort auf die Injektion einer Verbindung (beispielsweise Chemokin oder Antikörper) in das Gewebe überwachen, werden im Folgenden beschrieben (siehe Model der Entzündung). Diese Modelle des in vivo "homings" messen die Fähigkeit von Zellen auf einen Liganden oder Promotor durch Emigration und Chemotaxis zu einem Ort der Entzündung zu antworten und sie bewerten die Fähigkeit eines Antikörpers oder Fragments davon diese Emigration zu blockieren.
Zusätzlich zu den beschriebenen Verfahren können die Effekte eines Antikörpers oder Fragments auf die stimulierende Funktion von CCR2 durch Überwachen der durch einen aktiven Rezeptor induzierten zellulären Antwort unter Verwendung von geeigneten Wirtszellen, die den Rezeptor enthalten, bewertet werden.
IDENTIFIZIERUNG WEITERER LIGANDEN, INHIBITOREN UND/ODER PROMOTOREN DER SÄUGER CCR2-FUNKTION
Die vorstehend beschriebenen Assays, die zur Bewertung der Bindung und Funktion der erfindungsgemässen Antikörper und Fragmente eingesetzt werden können, Lösung angepasst werden, um weitere Liganden oder andere Substanzen, die an Säuger CCR2 oder funktionelle Varianten davon binden können, sowie Inhibitoren und/oder Promotoren der Säuger CCR2-Funktion zu identifizieren. So können beispielsweise Mittel mit der gleichen oder vergleichbaren Bindungsspezifität, wie die eines erfindungsgemässen Antikörpers oder ein funktioneller Bereich davon, durch einen kompetitiven Assay mit dem Antikörper oder Bereich davon identifiziert werden. Die vorliegende Erfindung umfasst daher auch Verfahren zur Identifizierung von Liganden des Rezeptors oder anderer Substanzen, die an ein Säuger-CCR2-Protein binden, sowie Inhibitoren (beispielsweise Antagonisten) oder Promotoren (beispielsweise Agonisten) der Rezeptorfunktion. In einer Ausführungsform werden Zellen, die ein Säuger CCR2-Protein oder eine funktionelle Variante davon tragen (beispielsweise Leukozyten, Zelllinien oder geeignete Wirtszellen, die verändert wurden, um ein Säuger-CCR2-Protein oder eine funktionelle Variante davon, die von einer in die Zellen eingebrachten Nukleinsäure codiert werden, exprimieren) in einem Assay eingesetzt, um die Wirkamkeit von Liganden oder anderen Substanzen, die den Rezeptor binden, einschließlich Inhibitoren oder Promotoren der Rezeptorfunktion, zu identifizieren und zu bewerten. Derartige Zellen sind auch nützlich, die Funktion des exprimierten Rezeptorproteins oder Polypeptids zu bewerten.
Erfindungsgemäss können Liganden und andere Substanzen, die Rezeptoren binden, Inhibitoren oder Promotoren der Rezeptorfunktion in einem geeigneten Assay identifiziert werden und weiter auf einen therapeutischen Effekt bewertet werden. Inhibitoren der Rezeptorfunktion können dazu verwendet werden, um die Rezeptoraktivität zu inhibieren (zu reduzieren oder zu verstärken), und Liganden und/oder Promotoren können dazu verwendet werden, eine normale Rezeptorfunktion bei Bedarf zu induzieren (auszulösen oder zu verstärken). Die vorliegende Erfindung liefert daher ein Verfahren zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen, einschließlich Autoimmunerkrankung und Gewebeabstossung, welche umfasst, Verabreichen eines Inhibitors der Rezeptorfunktion an ein Individuum (beispielsweise einen Säuger). Die vorliegende Erfindung liefert weiter ein Verfahren zur Stimulierung der Rezeptorfunktion durch Verabreichen eines neuen Liganden oder Promotor der Rezeptorfunktion an ein Individuum, wodurch eine neue Vorgehensweise zur selektiven Stimulierung der Leukozytenfunktion bereitgestellt wird, welche beispielsweise bei der Behandlung infektiöser Erkrankungen und Krebs nützlich sind.
Wie hier verwendet bezeichnet der Begriff "Ligand" eines Säuger-CCR2-Proteins eine bestimmte Klasse an Substanzen, die an ein Säuger-CCR2-Protein binden, einschließlich natürlicher Liganden und synthetische und/oder rekombinante Formen natürlicher Liganden. Infektiöse Mittel mit einem Tropismus für CCR2-positive Säugerzellen (beispielsweise Viren, wie HIV) können darüber hinaus an ein Säuger-CCR2-Protein binden. Ein natürlicher Ligand eines bestimmten Säugerrezeptors ist von einem Säuger abgeleitet, der der gleiche ist, wie der des Säuger-CCR2-Proteins (beispielsweise ein Chemokin, wie MCP-1, MCP-2, MCP-3 und/oder MCP-4). In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt eine Ligandenbindung eines Säuger-CCR2-Proteins mit hoher Affinität.
Wie hier verwendet ist "Inhibitor" eine Substanz, die mindestens eine funktionelle Eigenschaft eines Säuger-CCR2-Proteins (beispielsweise ein humanes CCR2) inhibiert (verringert oder verhindert), wie Bindungsaktivität (beispielsweise Ligandenbindung, Promotorbindung, Antikörperbindung), Signalisierungsaktivität (beispielsweise Aktivierung eines Sauger-G-Proteins, Induzierung eines schnellen und transienten Anstiegs der Konzentration an cytosolischem freiem Calcium [Ca²⁺]i), und/oder eine zelluläre Antwortsfunktion (beispielsweise Stimulierung der Chemotaxis, Exozytose oder Freisetzung von Entzündungsmediatoren durch Leukozyten). Ein Inhibitor ist darüber hinaus eine Substanz, die das Eindringen von HIV in eine Zelle inhibiert. Der Ausdruck Inhibitor bezeichnet weiter Substanzen, einschließlich Antagonisten, die Rezeptor binden (beispielsweise ein Antikörper, ein Mutant eines natürlichen Liganden, organische Moleküle mit geringen Molekulargewicht, andere kompetitive Inhibitoren der Ligandenbindung), und Substanzen, die Rezeptorfunktion ohne daran zu binden inhibieren (beispielsweise ein anti-idiotypischer Antikörper).
Wie hier verwendet ist ein "Promotor" eine Substanz, die mindestens eine funktionelle Eigenschaft eines Säuger-CCR2-Proteins (beispielsweise humanes CCR2) fördert (erhöht oder steigert), wie eine Bindungsaktivität (beispielsweise Liganden-, Inhibitor und/oder Promotor-Bindung), eine Signalisierungsaktivität (beispielsweise Aktivierung eines Säuger G-Proteins, Induktion eines schnellen und transienten Anstiegs der Konzentration an cytosolischem freiem Calcium [Ca²⁺]i), und/oder eine zelluläre Antwortsfunktion (beispielsweise Stimulierung der Chemotaxis, Exozytose oder Freisetzung von Entzündungsmediatoren durch Leukozyten). Der Ausdruck Promotor betrifft darüber hinaus Substanzen Substanzen, einschließlich Agonisten, die Rezeptor binden (beispielsweise ein Antikörper, ein Homolog eines natürlichen Liganden von einer anderen Spezies), und Substanzen, die die Rezeptorfunktion, ohne daran zu binden, fördern (beispielsweise durch Aktivierung eines assoziierten Proteins). In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Agonist ein anderer als ein Homolog eines natürlichen Liganden.
Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zum Nachweis oder zur Identifizierung eines Mittels, das an einen Säuger-CC-Chemokin-Rezeptor oder eine Liganden-bindende Variante davon bindet, einschließlich Liganden, Inhibitoren, Promotoren und anderen Substanzen, die an einen Säuger-CCR2-Protein oder funktionelle Variante davon binden. Gemäß dem Verfahren können ein zu testendes Mittel, ein erfindungsgemässer Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment davon (beispielsweise 8G2, 1D9, ein Antikörper mit einer Epitopspezifität, die gleich oder vergleichbar ist zu der von 8G2 oder 1D9, und Antigen-bindende Fragmente davon), und eine Zusammensetzung, welche einen Säuger-CC-Chemokin-Rezeptor 2 oder eine Liganden-bindende Variante davon kombiniert werden. Die vorstehend aufgeführten Komponenten werden unter Bedingungen kombiniert, die geeignet sind, um den Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment davon an einen Säuger-CC-Chemokin-Rezeptor 2 oder eine Liganden bindende Variante davon zu binden, wobei eine Bindung des Antikörpers oder Fragments an den Sauger-CC-Chemokin-Rezeptor 2 oder die Liganden bindende Variante gemäß den hier beschriebenen Verfahren oder anderen geeigneten Methoden entweder direkt oder indirekt erfasst oder gemessen wird. Eine Abnahme der Menge an gebildetem Komplex relativ zu einer geeigneten Kontrolle (beispielsweise in der Abwesenheit eines zu testenden Mittels) zeigt an, dass das Mittel den Rezeptor oder die Variante bindet. Die einen Sauger-CC-Chemokin-Rezeptor 2 oder eine Liganden bindende Variante davon enthaltende Zusammensetzung kann eine Membranfraktion sein oder eine einen rekombinanten Sauger-CC-Chemokin-Rezeptor 2 oder eine Liganden bindende Variante davon tragende Zelle sein. Der Antikörper oder das Fragment davon kann mit einem Marker markiert sein, wie einem Radioisotop, Spin-Marker, Antigen- oder Epitop-Marker, Enzym-Marker, einer fluoreszenten Gruppe und einer chemilumineszenten Gruppe.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis oder zur Identifizierung eines Mittels, das an einen Säuger-CC-Chemokin-Rezeptor 2 oder eine Liganden bindende Variante davon bindet, welches umfasst, Kombinieren eines zu testenden Mittels, eines erfindungsgemässen Antikörpers oder eines Antigen bindenden Fragments davon (beispielsweise 1D9, 8G2, ein Antikörper mit einer Epitopspezifität, die gleich oder vergleichbar ist zu/mit der von 1D9 oder 8G2, oder ein Antigen bindendes Fragment davon), und einer Zelle, die einen Säuger-CC-Chemokin-Rezeptor 2 oder eine Liganden bindende Variante davon trägt. Die vorstehend aufgeführten Komponenten werden unter Bedingungen kombiniert, die geeignet sind, um den Antikörper oder das Antigen bindende Fragment davon an das CCR2-Protein oder eine Liganden bindende Variante davon zu binden, wobei eine Bindung des Antikörpers oder Fragments an den Säuger-CC-Chemokin-Rezeptor 2 oder die Liganden bindende Variante gemäß den hier beschriebenen Verfahren oder anderen geeigneten Methoden entweder direkt oder indirekt erfasst oder gemessen wird. Eine Abnahme der Menge an gebildetem Komplex relativ zu einer geeigneten Kontrolle (beispielsweise in der Abwesenheit eines zu testenden Mittels) zeigt an, dass das Mittel den Rezeptor oder die Variante bindet. Der Antikörper oder das Fragment davon kann mit einem Marker markiert sein, wie einem Radioisotop, Spin-Marker, Antigen- oder Epitop-Marker, Enzym-Marker, einer fluoreszenten Gruppe und einer chemilumineszenten Gruppe. Diese und ähnliche Assays können dazu verwendet werden Mittel zu erfassen, einschließlich Liganden (beispielsweise Chemokine oder HIV-Stämme, die mit CCR2 interagieren) oder andere Substanzen, einschließlich Inhibitoren oder Promotoren der Rezeptorfunktion, die CCR2 binden und mit dem hier beschriebenen Antikörper zur Bindung an den Rezeptor konkurrieren.
Die vorstehend beschriebenen Assays können allein oder in Kombination mit jedem anderen geeigneten Verfahren dazu verwendet werden, Liganden oder Substanz, die an ein Säuger-CCR2-Protein binden, Inhibitoren und Promotoren eines Säuger-CCR2-Proteins oder eine Variante zu identifizieren. Die erfindungsgemässen in vitro Verfahren können für eine Durchmusterung mit hohem Durchsatz angepasst werden, bei dem eine große Anzahl an Proben verarbeitet werden (beispielsweise ein Format mit 96 Vertiefungen). Zellen, die Säuger-CCR2 (beispielsweise humanes CCR2) bei Niveaus exprimieren, die für eine Durchmusterung mit hohem Durchsatz geeignet sind, können verwendet werden, und sind daher bei der Identifizierung und/oder Isolierung von Liganden oder anderen, Rezeptor-bindenden Substanzen, und Inhibitoren oder Promotoren des Säuger-CCR2-Proteins, besonders nützlich. Eine Expression kann auf eine Vielzahl von Wegen überwacht werden. So kann beispielsweise eine Expression unter Verwendung von erfindungsgemässen Antikörpern überwacht werden, die einen Rezeptor oder einen Bereich davon binden. Darüber hinaus können im Handel erhältliche Antikörper verwendet werden, um eine Expression eines Antigen- oder Epitop-tagged Fusionsproteins nachzuweisen, welches umfasset, ein Rezeptorprotein oder Polypeptid (beispielsweise FLAG-tagged Rezeptoren), und ein gewünschtes Niveau exprimierende Zellen nachzuweisen.
Eine Nukleinsäure, die das Säuger-CCR2-Protein oder eine funktionelle Variante davon codiert, können in einen Expressionssystem eingebracht werden, um ein Rezeptorprotein oder Polypeptid herzustellen. Ein isoliertes und/oder rekombinantes CCR2-Protein oder eine Variante, wie einen Rezeptor, der in stabil oder transient mit einem eine rekombinante einen Sauger-CCR2-Protein oder Variante davon kodierende Nukleinsäure umfassenden Konstrukt transfizierten Zellen exprimiert wird, oder eine den Zellrezeptor enthaltende Zellfraktion (beispielsweise eine Membranfraktion aus transfizierten Zelle, Liposomen mit Rezeptor) können in Tests auf Rezeptorfunktion verwendet werden. Der Rezeptor kann nach Bedarf weiter gereinigt werden. Die Untersuchung auf Rezeptorfunktion kann in vitro oder in vivo erfolgen.
Ein isoliertes oder rekombinantes Säuger-CCR2-Protein oder eine funktionelle Variante davon, wie humanes CCR2 kann in dem vorliegenden Verfahren verwendet werden, bei dem der Effekt einer Verbindung durch Überwachung der Rezeptorfunktion, wie hier beschrieben oder unter Verwendung anderer geeigneter Techniken bewertet werden. So können beispiels weise stabile oder transiente Transfektanten (beispielsweise mit Baculovirus infizierte Sf9-Zellen, stabile Transfektanten von Maus L1/2 Pre-B-Zellen) in Bindungs-Assays verwendet werden. Stabile Transfektanten von Jurkat-Zellen oder anderen geeigneten Zellen, die zur Chemotaxis befähigt sind, können in Chemotaxis-Assays verwendet werden (beispielsweise Maus L1/2 Pre-B-Zellen).
Gemäß dem erfindungsgemässen Verfahren können die Verbindungen einzeln durchmustert werden, oder ein oder mehrere Verbindungen können gemäß den hier beschriebenen Verfahren simultan untersucht werden. Wird ein Gemisch von Verbindungen untersucht, dann können die durch diese Verfahren ausgewählten Verbindungen (nach Bedarf) getrennt und durch geeignete Verfahren (beispielsweise PCR, Sequenzieren, Chromatographie, Massenspektrosopie) identifiziert werden. Die Anwesenheit einer oder mehrerer Verbindungen (beispielsweise eines Liganden, Inhibitors, Promotors) in einer Test-Probe kann darüber hinaus mit diesen Verfahren ebenfalls bestimmt werden.
Grosse Kombinationsbanken von Verbindungen (beispielsweise organische Verbindungen, rekombinante oder synthetische Peptide, "Peptidoide", Nukleinsäuren), die durch eine chemische Kombinationssynthese oder anderen Verfahren hergestellt wurden, können getestet werden (siehe beispielsweise Zuckerman, R.N. et al., J. Med. Chem., 37: 2678–2685 (1994) und die hier angeführten Druckschriften; siehe auch, Ohlmeyer, M. H. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1092210926 (1993) und DeWitt, S. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909–6913 (1993), betreffend mit einem Tag versehene Verbindungen; Rutter, W. J. et al. U.S.P. Nr. 5,010,175 ; Huebner, V. D. et al., U.S.P. Nr. 5,182,366 ; und Geysen, H. M., U.S.P. Nr. 4,833,092 ). Wenn Verbindungen, die aus einer Kombinationsbank durch das vorliegende Verfahren gewählt wurden, einzigartige Tags tragen, ist eine Identifizierung einzelner Komponenten mittels chromatgraphischer Verfahren möglich.
Gemäß einer Ausführungsform wird eine Phagen-Display-Methodologie verwendet. So können beispielsweise ein Säuger-CCR2-Protein oder eine funktionelle Variante, ein Antikörper oder ein funktioneller Bereich davon der vorliegenden Erfindung, und ein Phage (beispielsweise ein Phage oder eine Sammlung von Phagen, wie eine Bank), der ein Polypeptid darbietet unter Bedingungen kombiniert werden, die zur Bindung des Antikörpers oder Bereichs davon an das Säuger-CCR2-Protein oder der Variante davon geeignet sind (beispielsweise in einem geeigneten Bindungspuffer). Ein Phage, der mit dem Antikörper oder Bereich davon konkurrieren kann und an das Säuger-CCR2-Protein oder die Variante davon bindet, kann unter Verwendung von Standard-Techniken oder anderen geeigneten Verfahren erfasst oder ausgewählt werden. Ein gebundener Phage kann von dem Rezeptor unter Verwendung eines geeigneten Elutionspuffers getrennt werden. So kann beispielsweise eine Änderung der Ionenstärke oder des pH-Wertes zu einer Freisetzung des Phagen führen. Alternativ kann der Elutionspuffer eine Freisetzungskomponente umfassen, oder Komponenten, die ausgestaltet sind, eine Bindung von Verbindungen zu unterbrechen (beispielsweise ein oder mehrere Verbindungen, die eine Bindung des dem Rezeptor angebotenen Peptids unterbindet, wie ein Ligand, Inhibitor und/oder Promotor, der kompetitiv eine Bindung inhibiert). As Auswahlverfahren kann wahlweise wiederholt werden oder ein anderer Auswahlschritt kann dazu verwendet werden, um einen den Rezeptor bindenden Phagen weiter anzureichern. Das dargebotene Polypeptid kann charakterisiert werden (beispielsweise durch Sequenzieren der Phagen-DNA). Die identifizierten Polypeptide können hergestellt und weiter auf Bindung untersucht werden, und auf Inhibitor- oder Promotor-Funktion. Analoge derartiger Peptide, die eine erhöhte Stabilität oder andere wünschenswerte Eigenschaften aufweisen, können hergestellt werden.
In einer Ausführungsform können von Phagen exprimierte und dargebotene Fusionsproteine hergestellt werden, die ein Hüllprotein mit einem N-terminalen Peptid umfassen, das durch eine Nukleinsäure mit zufälliger Sequenz codiert wird. Geeignete Wirtszellen, die ein Säuger-CCR2-Protein oder eine Variante, und einen anti-CCR2-Antikörper oder funktionellen Bereich davon umfassen, werden mit dem Phagen kombiniert, gebundener Phage wird ausgewählt, gewonnen und charakterisiert (siehe beispielsweise Doorbar, J. und G. Winter, J. Mol. Biol. 244 (1994), 361, die ein Phagendarbiet-Verfahren erläutern, bei dem ein G-Protein gekoppelter Rezeptor zum Einsatz kommt).
Andere Quellen potentieller Liganden oder andere Substanzen, die daran binden, oder Inhibitoren und/oder Promotoren des humanen CCR2-Proteins umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein, Varianten von CCR2-Liganden, einschließlich natürlich vorkommender, synthetischer oder rekombinanter Varianten von MCP-1, MCP-2, MCP-3 und/oder MCP-4, Substanzen, wie andere Chemoattraktoren oder Chemokine, Varianten davon, organische Moleküle mit geringem Molekulargewicht, andere Inhibitoren und/oder Promotoren (beispielsweise anti-CCR2-Antikörper, Antagonisten, Agonisten), andere G-Protein-gekoppelte Rezeptorliganden, Inhibitoren und/oder Promotoren (beispielsweise Antagonisten oder Agonisten), und lösliche Bereich eines Säuger-CCR2-Rezeptors, wie ein geeignetes Rezeptorpeptid oder Analog, das die Rezeptorfunktion inhibieren kann (siehe beispielsweise Murphy, R.B., WO 94/05695 ).
ENTZÜNDUNGSMODELLE
In vivo Modelle der Entzündung sind verfügbar und können dazu verwendet werden, die Auswirkungen von erfindungsgemäßen Antikörpern und Fragmenten in vivo als therapeutische Mittel zu bewerten. So kann beispielsweise eine Leukozyteninfitration nach intradermaler Injektion eines Chemokins und eines Antikörpers oder Fragments, der/das mit Säuger-CCR2 reaktiv ist, in ein geeignetes Tier, wie Kaninchen, Maus, Ratte, Meerschweinchen oder Rhesus-Makaken überwacht werden (siehe beispielsweise Van Damme, J. et al., J: Exp. Med., 176: 59–65 (1992); Zachariae, C. O. C. et al., J. Exp. Med. 171: 2177–2182 (1990); Jose, P. J. et al., J Exp. Med. 179: 881–887 (1994)). IN einer Ausführungsform werden Haut-Biopsien histologisch auf Infiltration von Leukozyten (beispielsweise Eosinophilen, Granulozyten) bewertet. In einer anderen Ausführungsform werden markierte Zellen (beispielsweise stabil transfizierte Zellen, die CCR2 exprimieren, mit beispielsweise ¹¹¹In markiert), welche zur Chemotaxis und Extravasion befähigt sind, einem Tier verabreicht. So kann beispielsweise ein zu bewertender Antikörper oder zu bewertendes Fragment entweder vor, gleichzeitig mit oder nachdem ein Ligand einem Test-Tier verabreicht wurde, verabreicht werden. Eine Abnahme des Ausmaßes der Infiltration in Anwesenheit des Antikörpers im Vergleich zu dem Ausmaß der Infiltration in Abwesenheit von Inhibitor zeigt Inhibition an.
DIAGNOSTISCHE UND THERAPEUTISCHE ANWENDUNGEN
Die erfindungsgemäßen Antikörper und Fragmente sind in einer Vielzahl von Anwendungen nützlich, einschließlich Forschung, Diagnostik und therapeutischen Anwendungen. In einer Ausführungsform werden die Antikörper mit einem geeigneten Marker markiert (beispielsweise einem fluoreszierenden Marker, chemilumineszenten Marker, Isotop-Marker, Antigen- oder Epitop-Marker oder Enzym-Marker). Sie können beispielsweise zur Isolierung und/oder Reinigung des Rezeptors oder Bereich davon verwendet werden und zur Untersuchung der Rezeptor-Struktur (beispielsweise der Konformation) und -Funktion.
Darüber hinaus können die verschiedenen erfindungsgemäßen Antikörper dazu verwen det werden CCR2 nachzuweisen, oder die Expression von Rezeptor, beispielsweise auf T-Zellen 8bwCD8+-Zellen, CD45RO+-Zellen), Monozyten und/oder mit einem Rezeptorgen transfizierte Zellen zu erfassen. Sie sind daher auch in Anwendungen nützlich, wie Zellsortierung (beispielsweise Strömungszytometrie, Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung), für diagnostische oder Forschungs-Zwecke.
Die erfindungsgemäßen anti-CCR2-Antikörper sind bei diagnostischen Anwendungen nützlich. Ein anti-CCR2-Antikörper oder Fragment davon kann dazu verwendet werden, die Expression dieses Rezeptors in mit HIV infizierten Individuen zu überwachen, vergleichbar zu der Art und Weise, in der anti-CD4 als ein diagnostischer Indikator des Erkrankungsstadiums verwendet wurde.
Typischerweise führen diagnostische Assays zu einem Nachweis der Bildung eines Komplexes, der von der Bindung eines Antikörpers oder Fragments davon an CCR2 herrührt. Für diagnostische Zwecke können die Antikörper oder Antigen-bindenden Fragmente markiert oder nicht markiert werden. Die Antikörper oder Fragmente können direkt markiert werden. Eine Vielzahl von Markern können eingesetzt werden, einschließlich, ohne darauf begrenzt zu sein, Radionuklide, Fluoromere, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzymkofaktoren, Enzyminhibitoren und Liganden (beispielsweise Biotin, Haptene). Zahlreiche geeignete Immunassays sind dem Durchschnittsfachmann bekannt, siehe beispielsweise US-P-3,817,827 ; 3,850,752 ; 3,901,654 und 4,098,876 ). Wenn die Antikörper oder Fragment nicht markiert sind, dann können sie unter Verwendung geeigneter Mittel erfaßt werden, wie beispielsweise in Agglutinierungs-Assays. Nicht markierte Antikörper oder Fragmente können darüber hinaus in Kombination mit anderen (d.h. ein oder mehreren) geeigneten Reagenzien verwendet werden, die zur Erfassung von Antikörper eingesetzt werden, wie beispielsweise einem markiertem Antikörper (beispielsweise ein zweiter Antikörper), der mit dem ersten Antikörper reaktiv ist (beispielsweise anti-idiotypische Antikörper oder andere Antikörper, die für das nicht-markierte Immunglobulin spezifisch sind) oder einem anderen geeigneten Reagenz (beispielsweise markiertes Protein A).
In einer Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Antikörper oder Fragmente in Enzym-Immunassays verwendet werden, worin der betreffende Antikörper oder das Fragment, oder zweite Antikörper an ein Enzym konjugiert sind. Wir eine biologische Probe, die Säuger-CCR2-Protein umfaßt, mit den betreffenden Antikörpern kombiniert, dann erfolgt eine Bindung zwischen den Antikörpern und dem CCR2-Protein. In einer Ausführungsform wird eine Probe mit Säuger-CCR2-Protein exprimierenden Zellen, wie humanes Blut, mit den betreffenden Antikörpern kombiniert, wobei zwischen den Antikörpern und den humanes CCR2-Protein mit einem von dem Antikörper erkannten Epitop tragenden Zellen eine Bindung erfolgt. Diese gebundenen Zellen können von nicht-gebundenen Reagenzien getrennt werden und die Anwesenheit des Antikörper-Enzym-Konjugats, das spezifisch an die Zellen gebunden ist, kann bestimmt werden, beispielsweise durch in Kontakt bringen der Probe mit einem Substrat des Enzyms, das eine Farbe oder andere erfaßbare Änderung erzeigt, wenn das Enzym darauf wirkt. In einer anderen Ausführungsform können die betreffenden Antikörper nicht markiert sein, wobei ein zweiter, markierter Antikörper zugesetzt werden kann, von dem der betreffende Antikörper erkannt wird.
Kits zur Verwendung beim Nachweis der Anwesenheit eines Säuger-CCR2-Proteins in einer biologischen Probe kann ebenfalls hergestellt werden. Derartige Kits umfassen einen Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon, das an einen Säuger-CC-Chemokin-Rezeptor 2 oder einen Bereich des Rezeptors bindet, sowie ein oder mehrere Hilfsreagenzien, die zur Erfassung der Anwesenheit eines Komplexes zwischen dem Antikörper oder Fragment und CCR2 oder einem Bereich davon geeignet sind. Die erfindungsgemäßen Antikörperzusammensetzungen können in lyophilisierter Form entweder allein oder in Kombination mit weiteren Antikörpern, die für andere Epitope spezifisch sind, bereitgestellt werden. Die Antikörper, die markiert oder nicht-markiert sein können, können in den Kits zusammen mit weiteren Inhaltsstoffen (beispielsweise Puffern, wie Tris, Phosphat und Carbonat, Stabilisierungsmitteln, Exzipienten, Bioziden und/oder inerten Proteinen, beispielsweise bovinem Serumalbumin) vorgesehen sein. So können beispielsweise Antikörper als ein lyophilisiertes Gemisch mit den zugesetzten Inhaltsstoffen bereitgestellt werden, oder die zugesetzten Inhaltsstoffe können separat zur Kombination durch den Verwender bereitgestellt werden. Im Allgemeinen werden diese zugesetzten Materialien in weniger als etwa 5 Gew.-% vorhanden sein, bezogen auf die Menge an aktivem Antikörper, und werden gewöhnlich in einer gesamtmenge von mindestens etwa 0,001 Gew.-%, bezogen auf die Antikörperkonzentration vorhanden sein. Wird ein zweiter Antikörper verwendet, der den mononklonalen Antikörper binden kann, dann kann ein derartiger Antikörper in dem Kit bereitgestellt werden, beispielsweise in einem separaten Gefäß oder Behälter. Der zweite Antikörper ist, wenn vorhanden, gewöhnlich markiert und kann in analoger Art und Weise mit den vorstehend aufgeführten Antikörperformulierungen formuliert werden.
In vergleichbarer Art und Weise betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zum Erfassen und/oder Quantifizieren der Expression eines Säugers-CCR2 oder eines Bereichs des Rezeptors, durch eine zelle, worin eine Zusammensetzung, die eine Zelle oder Fraktion davon umfaßt (beispielsweise eine Membranfraktion) mit einem Antikörper oder funktionalem Fragment davon in Kontakt gebracht wird (beispielsweise 1D9 und/oder 8G2), der an Säuger CCR2 oder einen Bereich des Rezeptors unter Bedingungen bindet, die für eine Bindung des Antikörpers oder Fragments davon geeignet sind, wobei eine Bindung überwacht wird. Ein Nachweis des Antikörpers, mit dem die Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper und CCR2 oder einem Bereich davon angezeigt wird, zeigt die Anwesenheit des Rezeptors an. Eine Bindung des Antikörpers an die Zellen kann beispielsweise wie vorstehend unter der Überschrift "Bindungsassays" aufgeführt, bestimmt werden. Das Verfahren kann dazu verwendet werden, eine Expression von CCR2 auf Zellen eines Individuums (beispielsweise in einer Probe, wie einer Körperflüssigkeit, wie Blut, Speichel, oder einer anderen geeigneten Probe) zu erfassen. Das Expressionsniveau von CCR2 auf der Oberfläche von T-Zellen oder Monozyten kann darüber hinaus ebenso bestimmt werden, beispielsweise durch Strömungscytometrie, und das Expressionsniveau (beispielsweise die Färbungsintensität) kann mit der Neigung zu einer Erkrankung, dem Fortschreiten oder dem Risiko korrelliert werden.
Chemokin-Rezeptoren fungieren bei der Migration von Leukozyten durch den Körper, insbesondere zu Stellen der Entzündung. Ein herauswandern von Zellen aus den Gefässen zu Stellen der Entzündung wird durch ein 3-Schritt-Verfahren reguliert, welches Interaktionen von Leukozyten- und Endothelial-Zelladhäsionsproteinen und Zell-spezifischen Chemoattraktoren und aktivierenden Faktoren beinhaltet (Springer, T. A., Cell, 76: 301–314 (1994); Butcher, E. C., Cell, 67: 1033–1036 (1991); Butcher, E. C. und Picker, L. J., Science (Wash. DC), 272: 6066 (1996)). Diese sind: (a) Interaktion mit geringer Affinität zwischen Leukozyten-Selektinen und Endothelialzell-Kohlenhydraten; (b) Interaktion mit hoher Affinität zwischen Leukozyten-Chemoattraktant-Rezeptoren und Chemoattraktant/aktivierenden Faktoren; und (c) eine enge Bindung zwiscen Leukozyten-Integrinen und Endothelialzellen-Adäsionsproteinen der iImmunglobulin-Superfamilie. Unterschiedliche Leuko zyten-Untergruppen exprimieren unterschiedliche Repertoires von Selektinen, Chemoattraktant-Rezeptoren und Integrinen. Darüber hinaus ändert eine Entzündung die Expression von Endothelial-Adhäsionsproteinen und die Expression von Chemoattraktoren und Leukozyten aktivierenden Faktoren. Als Folge gibt es eine große Vielfalt bei der Regulierung der Selektivität der Leukozyten-Rekrutierung zu extravaskulären Stellen. Der zweite Schritt ist von Bedeutung, da davon ausgegangen wird, dass die Aktivierung der Leukozyten-Chemoattraktor-Rezeptoren den Übergang von dem Selektin-vermittelten Zell-Rollen zu der Integrin-vermittelten engen Bindung bewirkt. Dieses führt dazu, dass die Leukozyten bereit sind, zu pervaskulären Stellen zu wandern. Der Interaktion Chemoattraktor/Chemoattraktor-Rezeptor ist für eine transendotheliale Wanderung und Lokalisierung innerhalb eines Gewebes ebenfalls von Bedeutung (Campbell, J. J., et al., J. Cell Biol. 134: 255–266 (1996); Carr, M. W., et al., Immunity, 4: 179–187 (1996)). Diese Wanderung wird durch einen Konzentrationsgradienten von Chemoattraktoren geführt, der auf den Kern der Entzündung hinläuft.
CCR2 besitzt beim Leukozyten-Verkehr eine wichtige Rolle. Es ist wahrscheinlich, dass CCR2 ein Schlüssel-Chemokin-Rezeptor für T-Zellen oder T-Zelluntergruppen ist oder für die Wanderung von Monozyten zu bestimmten Stellen der Entzündung, und so können monoklonale anti-CCR2-Antikörper dazu verwendet werden T-zell- oder Monozyten-Migration zu inhibieren (zu reduzieren oder zu verhindern), insbesondere die, die mit T-Zell Dysfunktion assoziiert sind, wie Autoimmunerkrankungen, oder allergischen reaktionen oder mit Monozyten-vermittelten Störungen, wie Atherosklerose. Infolgedessen können die erfindungsgemäßen Antikörper und Fragmente dazu verwendet werden, die Rezeptorfunktion bei der Forschung und therapeutischen Anwendungen zu modulieren. So können beispielsweise die hier beschriebenen Antikörper und funktionellen Fragmente als Inhibitoren fungieren, um (a) Bindung (beispielsweise eines Liganden, eines Inhibitors oder eines Promotors) an den Rezeptor zu inhibieren (zu reduzieren oder zu verhindern), (b) eine Rezeptorsignalfunktion zu inhibieren, und/oder (c) eine stimulierende Funktion zu inhibieren. Antikörper, die als Inhibitoren der Rezeptorfunktion wirken, können Liganden- oder Promotoren-Bindung direkt oder indirekt (beispielsweise duch Bewirken einer Konformationsänderung) blockieren. So können beispielsweise Antikörper die Rezeptorfunktion durch Inhibierung einer Bindung eines Liganden, oder durch Desensitivierung (mit oder ohne Inhibierung der Bindung eines Liganden) inhibieren. Antikörper, die Rezeptor binden, können weiter als Agonisten der Rezeptorfunktion dienen, eine Rezeptorfunktion auslösen oder stimulieren, wie als Signalisierungsfunktion und/oder Stimulierungsfunktion eines Rezeptors (beispielsweise Leukozyten-Wanderung) bei Bindung des Rezeptors.
Die vorliegende Erfindung liefert daher ein Verfahren zur Inhibierung von Leukozytenwanderung in einem Säuger (beispielsweise einem humanen Patienten), welches umfasst, Verabreichen einer wirksamen Menge eines erfindungsgemässen Antikörpers oder eines funktionellen Fragments an einen Säuger. Die Verabreichung eines erfindungsgemässen Antikörpers oder funktionellen Fragments kann zu einer Verbesserung oder Eliminierung des Erkrankungszustandes führen.
Der erfindungsgemässe Antikörper oder ein funktionelles Fragmente davon kann weiter dazu verwendet werden Störungen zu behandeln, bei denen die Aktivierung des CCR2-Rezeptors durch Bindung von Chemokinen impliziert ist. So können beispielsweise die Antikörper oder funktionellen Fragmente davon (beispielsweise 19 und/oder 8G2 oder funktionelle Fragmente davon) zur Behandlung von Allergie, Atherogenese, Anaphylaxe, Maligne Erkrankungen, chronische und akute Entzündung, Histamin und IgE-vermittelte allergische Reaktionen, Schock und rheumaoide Artrithis, Atherosklerose, multiple Sklerose, Stenose, Restenose, Allograftabstossung, fibrotische Erkrankung, Asthma und entzündliche Glomerulopathien.
Erkrankungen oder Zustände von Menschen oder anderen Spezien, die mit Inhibitoren der CCR2-Rezeptor-Funktion behandelt werden können (einschließlich Antikörper oder geeignete Fragmente davon) umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein:

• Entzündliche oder allergische Erkrankungen und zustande, einschließlich allergische Erkrankungen der Atemwege, wie Asthma, allergische Rhinits, hypersensitive Lungenerkrankungen, hypersensitive Pneumonitis, interstitielle Lungenerkrankungen (ILD) (beispielsweise idiopathische pulmonäre Fibrose, oder mit rheumatischer Arthritis assoziierte ILD, systemischer Lups erythematosus, Ankylosis spondylitis, systemische Sklerose, Sjogren's Syndrom, Polymyositis oder Dermatomyositis; chronisch obstruktive Lungenerkrankung; Anaphylaxis oder hypersensitive Antworten, Arzneimittelallergien (beispielsweise gegen Penicillin, Cephalosporine), Insektenstich-Allergien, entzündliche Darmerkrankungen, wie Crohn's-Erkrankung, und ulcerative Colitis; Spndyloarthropathien, Scleroderma, Psoriasis und entzündliche Dermatosen, wie Dermatitits, Ekzem, atopische Dermatitis, allergische Kontaktdermatitis, urticaria, Vaskulitis (beispielsweise nektrotisierende, kutane und hypersensitive Vaskulitis);
• Autoimmunerkrankungen, wie Arthritis (beispielsweise rheumatoide Arthritis, jvenile rheumatoide Arthritis, Psoriatische Arthritis) multiples Sklerose, systemischer Lupus erythematosus, Myasthenia gravis, juvenile anfängliche Diabetes, Nephritides, wie Glomerulonephritis, autoimmun Thyroiditis, Behcet's Erkrankung;
• Gewebeabstossung (beispielsweise bei Transplantation), einschließlich Allograft-Abstossung oder Transplantat gegen Wirt Erkrankung, und Organtransplantat-assoziierte Arteriosklerose;
• Aterosklerose;
• Krebs mit Leukozyteninfiltration der Haut oder Organe;
• Stenose oder Restenose der Gefässe, insbesondere der Arterien, beispielsweise der Koronarartere, wie Stenose oder Restenose, die von einer Gefäßbehandlung herrühren (beispielsweise chirurgische, therapeutische oder mechanische Behandlung), sowie neointimale Hyperplasie. So kann beispielsweise Restenose, die gewöhnlicherweise eine Verengung der Lumenöffnung des Gefässes bewirkt, von einer Gefäß-Verletzung herrühren, einschließlich, ohne darauf begrenzt zu sein, die, die von Gefäßtransplantations-Verfahren, Angioplastie, einschließlich durch einen Baloon durchgeführte Angioplastie, Atherectomie, Laser oder andere geeignete Verfahren (beispielsweise perkutane translumenale Koronarangioplastie (PTCA)), Stent-Anordnung (beispielsweise mechanische oder biologische endovaskuläre Stent-Anordnung), Gefäß-Bypass-Verfahren oder Kombinationen davon, sowie anderen zur Behandlung stenotischer oder verschlossener Blutgefäße herrühren;
• Andere Erkrankungen oder Zustände (einschließlich CCR2-vermittelter Erkrankungen oder Zustände), bei denen unerwünschte entzündliche Antworten inhibiert werden sollen, können behandelt werden, einschließlich, ohne darauf begrenzt zu sein, Reperfusions-Verletzung, bestimmte hematologische bösartige Tumore, Cytokin-induizerte Toxizität (beispielsweise septischer Schock, endotoxischer Schock), Polymyositis, Dermatomyositis und Granulomatöse Erkrankungen, einschließlich Sarcoidosis.

Erkrankungen oder Zustände von Menschen und anderen Spezien, die mit Promotoren der CCR2-Rezeptor-Funktion behandelt werden können (einschließlich Antikörper oder Fragmente davon), umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein:

• Immunsuppression, wie die in Individuen mit Immundefizienzsyndromen, wie AIDS, Individuen, die einer Radiotherapie, Chemotherapie, Therapie für Autoimmunerkrankungen oder anderer Arzneimitteltherapie (beispielsweise Corticosteroid-Therapie) unterworfen wurden, welche eine Immunsuppression hervorruft, und Immunsuppression aufgrund congenitaler Defizienz der Rezeptorfunktion oder aufgrund anderer Ursachen.

Erfindungsgemäße anti-CCR2-Antikörper können die Bindung einer oder mehrerer Chemokine blockieren, wodurch die stromabwärts gelegene Kaskade einer oder mehrerer Vorfälle, die zu den vorstehend aufgeführten Störungen führen, blockiert wird.
Antikörper oder funktionelle Fragment davon, die CCR2-Antagonisten sind, können als Therapeutika für AIDS, sowie für bestimmte entzündliche Erkrankungen verwendet werden. HIV-1 und HIV-2 sind etiologische Mittel des eworbenen Immundefizienz-Syndroms in Menschen. AIDS geht teilweise auf eine Depletion von CD4+ T-Lymphozyten in mit HIV-infizierten Individuen zurück. HIV infiziert hauptsächlich T-Lymphozyten, Monozyten/Makrophagen, dentritische Zellen und im zentralen Nervensystem, Mikroganglien. Alle diese Zellen exprimieren das CD4-Glycoprotein, das für HIV-1 und HIV-2 als Rezeptor dient. Ein effizientes Eindringen von HIV in Zielzellen hängt von der Bindung des viralen äußeren Glycoproteins, gp120, an die aminoterminale CD4-Domäne ab. Nach Virusbindung vermitteln die HIV-Hüllglycoproteine die Fusion viraler und Wirts-Zellmembranen, um den Eintrittsprozess zu vervollständigen. Eine von den HIV-1 Hüllglycoproteinen vermittelte Membranfusion infizierter Zellen fürht zu einer Zell-Zell-Fusion, was zur Syncytia-Bildung führt.
Kürzlich wurden zusätzlich zu CD4 Wirtszellfaktoren vorgeschlagen, die die Effizienz von HIV-Hüllglycoprotein-vermittelter Membranfusion bestimmen. Es wurde gezeigt, dass der 7-Transmembranrezeptor (7TMR) mit der Bezeichnung HUMSTSR, LESTR oder "Fusin" bei einer Reihe von CD-4 exprimierenden Zellen die Infektion und durch im Labor angepaßte HIV-Hüll-Glycoproteine vermittelte Zellfusion unterstützt (Feng, Y., et al. Science (Wash. D.C.) 272 (1986), 872–877). Antikörper gegen HUMSTER bockierte Zellfusion und Infektion durch im Labor angepaßte HIV-1 Isolate blockierte Zellfusion, jedoch nicht Makrophagen tropischer primäre Viren in vitro (Feng, Y., et al. Science (Wash. D.C.) 272 (1986), 872–877).
Die Fähigkeit von Chemokinrezeptoren und verwandet Molekülen, eine Infektion primärer klinischer HIV-Isolate zu erleichtern, wurde kürzlich von mehreren Gruppen berichtet (sie beispielsweise Bates, P., Cell, 86: 1–3 (1996); Choe, H., et al., Cell, 85: 1135–1148 (1996); Doranzet al., Cell 85: 1149–1158 (1996)). Diese Studien zeigen, dass die Involvierung verschiedener Meitglieder der Chemokin Rezeptor-Familie in frühen Stufen der HIV-1 Infektion hilft, viralen Tropismus und β-Chemokin Inhibierung primärer HIV-1 Isolate zu erklären.
Die vorliegende Erfindung liefert weiter ein Verfahren zur inhibierung einer HIV-Infektion einer Zelle (beispielsweise eine Neuinfektion und/oder Syncytia-Bildung), welche einen Säuger-CCR2 oder einen Bereich davon exprimiert, umfassend, Inkontaktbringen der Zelle mit einer Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines Antikörpers oder funktionellen Fragments davon umfasst, der/das an ein Säuger-CCR2-Rezeptor oder einen Bereich davon bindet.
Die Zusammensetzung kann weiter ein oder mehrere Mittel umfassen, die gegen HIV wirksam sind, einschließlich, ohne darauf begrenzt zu sein, anti-CCR3-Antikörper, anti-CCR5-Antikörper und anti-Fusin-Antikörper.
Verschiedene Verfahren können dazu verwendet werden, eine Bindung von HIV an eine Zelle zu bewerten, und/oder eine Infektion einer Zelle durch HIV in der Anwesenheit von erfindungsgemässen Antikörpern. So können beispielsweise Assays, mit denen eine Bindung von gp120 oder eines Teils davon an den Rezeptor bewertet werden, HIV-Infektion und Syncytia-Bildung verwendet werden (siehe beispielsweise Choe, H., et al. Cell, 85: 1135–1148 (1996)). Die Fähigkeit des erfindungsgemässen Antikörpers zur Inhibierung dieser Abläufe kann unter Verwendung dieser oder anderer geeigneter Verfahren bewertet werden.
Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von HIV in einem Patienten, welches umfasst, Verabreichen einer Zusammensetzung an einen Patienten, welches eine wirksame Menge eines Antikörpers oder funktionellen Fragments umfasst, der/das an einen Säuger-CCR2 oder Bereich des Rezeptors bindet. Noch einmal, die Zusammensetzung kann weiter ein oder mehrere zusätzliche Mittel umfassen, die gegen HIV wirksam sind, einschließlich, ohne darauf begrenzt zu sein, anti-CCR3-Antikörper, anti-CCR5-Antikörper und anti-Fusin-Antikörper. Eine therapeutische Verwendung des Anti körpers zur Behandlung von HIV umfasst eine prophylaktische Verwendung (beispielsweise zur Behandlung eines Patienten, der an HIV ausgesetzt war oder nicht). So können beispielsweise Mitglieder des Gesundheitssystems, die an HIV ausgesetzt sein können oder ausgesetzt waren (beispielsweise über einen Nadelstich) gemäß dem Verfahren behandelt werden. Ein weiteres Beispiel ist die Behandlung eines dem Virus nach ungeschütztem sexuellen Kontakt oder Versagen des Schutzes ausgesetztem Patienten.
Bei AIDS scheint eine Behandlung mit mehreren Arzneimitteln meistversprechend. Ein anti-Chemokin-Rezeptor-Antagonist, der HIV-Infektion inhibiert, kann zu der Arzneimittelbehandlung zugegeben werden, insbesondere zum Blockieren der Virusinfektion neuer Zellen. Die Verabreichung eines erfindungsgemässen Antikörpers oder Fragments in Kombination mit einem oder mehreren therapeutischen Mitteln, wie Nucleosidanalogen (beispielsweise AZT, 3TC, ddI) und/oder Proteaseinhibitoren ist vorgesehen und liefert einen wichtigen Zusatz zu einer HIV-Behandlung. In einer Ausführungsform wird ein humanisierter monoklonaler anti-CCR2-Antikörper zusammen mit einem (d.h. einen oder mehreren) therapeutischen Mittel zur Reduzierung der viralen Last von Patienten durch Verhinderung der Fusion und/oder Infektion neuer Zellen eingesetzt. Ein derartiger Antikörper kann darüber hinaus zur Verhinderung perinataler Infektion eingesetzt werden.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verhinderung einer HIV-Infektion in einem Individuum, welche umfasst, Verabreichen einer wirksamen Menge eines Antikörpers oder funktionellen Fragments an das Individuum, der/das an CCR2 bindet. Gemäß dem Verfahren beinhaltet eine Verhinderung einer HIV-Infektion Behandlung, um eine Infektion neuer Zellen in einem infizierten Individuum zu verhindern (zu reduzieren oder zu eliminieren), oder um eine Infektion in einem Individuum, der einer HIV-Infektion ausgesetzt sein kann, konnte oder war, zu verhindern. So können beispielsweise Individuen, wie ein mit HIV infiziertes Individuum, ein Fötus einer mit HIV infizierten Frau, oder ein Mitarbeiter des Gesundheitssystems gemäß den erfindungsgemässen Verfahren behandelt werden.
VERABREICHUNGSARTEN
Ein oder mehrere erfindungsgemässe Antikörper oder Fragmente können einem Individuum über eine geeignete Route verabreicht werden, entweder allein oder in Kombination mit (vor, gleichzeitig mit oder danach) einem anderen Arzneimittel oder Mittel, oder vor, gleichzeitig mit oder nach einem chirurgischen, mechanischen oder therapeutischem Engriff verabreicht werden. So können die erfindungsgemässen Antikörper auch zusammen mit anderen monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern verwendet werden (beispielsweise zusammen mit Antikörpern, die andere Chemokin-Rezeptoren binden, einschließlich, ohne darauf begrenzt zu sein CCR3 und CCR5), oder mit existierenden Blutplasmaprodukten, wie im Handel erhältlichem gamma Globulin und Immunglobulinprodukten, die bei der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung verwendet werden. Die Antikörper oder Fragmente der vorliegenden Erfindung können als separat verabreichte Zusammensetzungen verwendet werden, die zusammen mit Antibiotika und/oder antimikrobiellen Mitteln gegeben werden.
Eine wirksame Menge eines Antikörpers oder Fragments (d.h. ein oder mehrere Antikörper oder Fragmente) wird verabreicht. Eine wirksame Menge ist eine Menge, die ausreichend ist, bei den Bedingungen der Verabreichung den gewünschten therapeutischen (einschließlich prophylaktischen) Effekt zu erzielen, wie ein Menge, die ausreichend ist, eine CCR2-Funktion zu inhibieren, und damit eine entzündliche Antwort zu inhibieren, oder eine Menge, die ausreihend ist, eine CCR2-Funktion zu fördern, wie angezeigt. Der Antikörper oder das Fragment kann in einer Einzeldosis oder mehreren Dosen verabreicht werden. Die Dosierung kann anhand in Stand der Technik bekannter Verfahren bestimmt werden und ist abhängig von beispielsweise dem gewählten Antikörper oder Fragment, dem Alter des Subjekts, der Sensitivitä und Toleranz gegenüber Arzneimitteln, und dem allgemeinen Zustand. Antikörper und Antigen-bindende Fragmente davon, wie humane, humanisierte und chimäre Antikörper und Antigen-bindende Fragmente, können häufig mit geringerer Frequenz verabreicht werden als andere Typen an Therapeutika. So kann beispielsweise eine wirksame Menge eines Antikörpers von etwa 0,01 mg/kg bis etwa 5 oder 10 mg/kg täglich, wöchentlich, zwei-wöchentlich oder monatlich reichen.
Eine Vielzahl von Routen sind möglich, einschließlich, ohne notwendigerweise darauf beschränkt zu sein, oral, dietätisch, topisch, parenteral (beispielsweise über intravenöse, intraarterielle, intramuskuläre, subkutane Injektion oder Infusion), Inhalation (beispielsweise intrabronchiale, intraokulare, intranasale oder orale Inhalation, intranasale Tropfen) je nach der zu behandelnden Erkrankung oder dem zu behandelnden Zustand. Andere geeignete Verfahren der Verabreichung können weiter wiederaufladbare oder biologisch abbaubare Einrichtungen und polymere Einrichtungen mitlangsamer Freisetzung umfassen. Die erfindungsgemässen pharmazeutischen Zusammensetzungen können weiter als ein Teil einer Kombinationstherapie mit anderen Mitteln verabreicht werden.
Die Formulierung eines zu verabreichenden Antikörpers oder Fragments wird in Abhängigkeit von dem Verabreichungsweg und der gewählten Formulierung (beispielsweise Lösung, Emulsion, Kapsel) ab. Eine geeignete pharmazeutische Zusammensetzung, die einen zu verabreichenden Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon umfasst, kann in einem physiologisch annehmbaren Vehikel oder Träger hergestellt werden. Ein Gemisch von Antikörpern und/oder Fragmenten kann ebenfalls verwendet werden. Für Lösungen oder Emulsionen umfassen geeignete Träger beispielsweise wässrige oder alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Kochsalzlösung und gepufferte Medien. Parenterale Vehikel können Natriumchloridlösung, Ringer's Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Lactatsringer oder fixierte Öle. Eine Vielzahl geeigneter wässriger Träger sind dem Fachmann bekannt, einschließlich Wasser, gepuffertes Wasser, gepufferte Kochsalzlösung, Polyole (beispielsweise Glycerin, Propylenglycol, flüssiges Polyethylenglycol), Dextroselösung und Glycin. Intravenöse Träger können verschiedene Additive, Preservative, oder Fluide, Nährstoff oder Elektrolyt-Ergänzungsmittel beinhalten (siehe allgemein, Remington's Pharmaceutical Science, 16th Ausgabe, Mack, Hrsg. 1980). Die Zusammensetzungen können wahlweise nach Bedarf pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen enthalten, um sich physiologischen Bedingungen anzupassen, wie pH einstellende Substanzen und Puffermittel und Toxizität einstellende Mittel, beispielsweise Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid und Natriumlactat. Die erfindungsgemässen Antikörper und Fragmente können zur Lagerung lyophilisiert werden und in einem geeigneten Träger vor Verwendung gemäß im Stand der Technik bekannten Lyophilisierungs- und Wiederherstellungs-Techniken wiederhergestellt werden. Die optimale Konzentration des/der aktiven Inhaltsstoffs(e) in ein gewählten Medium kann gemäß dem Fachmann wohlbekannter Verfahren empirisch bestimmt werden, und wird von der schlussendlich gewünschten pharmazeutischen Formulierung abhängigen. Zur Inhalation kann der Antikörper oder das Fragment solubilisiert und in einen geeigneten Dispenser zur Verabreichung geladen werden (beispielsweise einen Atomizator, Vernebler oder unter Druck gesetzten Aerosol-Dispenser).
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele erläutert, die in keiner Weise beschränkend sein sollen. Die Lehren aller hier angeführten Dokumente, werden hier unter Bezugnahme mit aufgenommen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Materialien
Die folgenden Materialien wurden aus den angegebenen Quellen erhalten:
PE-konjuguerter anti-CD16, PE-konjugiertes Streptavidin, und biotinyliertes anti-Mensch-IgE wurden von Pharmingen (San Diego, CA) erhalten. FITC-konjugiertes Ziegen anti-Maus-IgG wurde von Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, PA) erhalten. FACS-Lysispuffer wurde von Becton Dickenson (Mountain View, CA) erhalten und [125I]-MCP-1 wurde von NEN (Boston, MA) erhalten.
Zellen, Zellinien und Gewebekultur
Die Maus pre-B-Lymphomzellinie L1/2 wurde in RPMI-1640, ergänzt mit 10% fötalem Clone I (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 50 Einheiten/ml Penicillin (Gibco BRL), 50 μg/ml Streptomycin (Gibco, BRL), 2 mM L-Glutamin (Gibco, BRL) und 55 μM β-Mercaptoethanol (Gibco, BRL) gehalten. Andere Zellinien umfassten Transfektanen von L1/2 Zellen, die CCR1 exprimieren (Campbell, J. et al. (1996) J. Cell. Bio., 134: 255–266), oder CCR5 (WU et al., Nature 384: 179–183 (1996)) und in dem vorstehend aufgeführten Kulturmedium, ergänzt mit 800 μg/l aktivem G418, gezüchtet wurden. THP-1 Zellen (ATCC Nr. TIB202) wurden gemäß ATCC-Instruktionen gezüchtet. PBMC wurden aus heparinisiertem Blut, wie in Ponath et al. J. Clin. Invest, 97: 604–612 (1996) beschrieben gereinigt.
Herstellung von CCR2b Expressionskonstrukt und stabilen Transfektanten
Der codierende Bereich des humanen CCR2b (Charo et al. (1994) Proc. Ntl. Acd. Sci. USA, 91: 275) wurde mittels RT-PCR Amplifizierung wie beschrieben (Qin S. et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26: 640–647) erhalten. cDNA wurde unter Verwendung von Oligo (dT) Priming hergestellt und eine Amplifizierung der codierenden CCR2b-Region wurde durch nested PCR mit den folgenden Primer-Sätzen erreicht, die den Positionen der CCR2b-Sequenz wie gezeigt entsprechen (GenBank Hinterlegungsnr. U03905; Charo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2752–2756 (1994)).

1) 5'primer: 5'-TGAGACAAGCCACAAGCTGAAC-3' (Nukleotide 11 bis 32; SEQ. ID. Nr: 1); 3'Primer: 5'-TCTGTATTAGTACACACAGCCC-3' (Nukleotide 1301 bis 1280; SEQ. ID. Nr: 2);
2) 5'Primer: 5'-ATGCTGTCCACATCTCGTTCTCGG-3' (Nukleotide 81 bis 104; SEQ. ID. Nr: 3);
3'Primer: 5'-TTATAAACCAGCCGAGACTTCCTGCTC-3' (Nukleotide 1164 bis 1137; SEQ. ID. Nr: 4).

Der CCR2B cDNA codierende Bereich wurde modifiziert, um die CD5-Signalpeptid-Leadersequenz (aruffo et al., Cell 61: 1303–1313 (1990)). Die bestimmte Aminosäuresequenz dieses Peptid ist: NH2-Met-Pro-Met-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Thr-Leu-Tyr-Leu-Leu-Gly-Met-Leu-Val-Ala-Ser-Val-Leu-Ala... (SEQ ID NO: 5).
Unter Verwendung von PCR mit der CCR2b cDNA als Template und zwei überlappende 5'-Primer, die eine BamHI-Restriktionsschnittstelle enthält, codieren die CD5-Signalpeptidsequenz und die aminoterminae Sequenz von CCR2b und einen 3'-Primer, der intern in der CCR2 codierenden Region angeordnet ist.
5'CD5 Seq 1 Primer
5'-GGGGATCCAGAAACCATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTG-3' (SEQ. ID. Nr: 6)
5'CD5 Seq 2 Primer
5'-GCCACCTTGTACCTGCTGGGGATGCTGGTCGCTTCCGTGCTAGCGATGCTGTCCACATCTCGTTC-3' (SEQ. ID. Nr: 7)
3'CCR2AB2 Primer-5'-GACGACCAGCATGTTGCC-3' (SEQ. ID. Nr: 8; U03905 Nucleotide 272 bis 255)
Das amplifizierte 278 Basenpaar Fragment wurde mit BamHI und Apa1 verdaut und das so erhaltene 209 Basenpaar Fragment wurde in die Apa1 Stelle an Position 206 der CCR2b cDNA (Genbank Hinterlegungsnummer U03905) inseriert, um das endogene 5' Basenpaarfragment von CCR2 zu ersetzen. Die so erhaltene Sequenz, die ein CCR2b mit der CD5 Signalpeptid-Leadersequenz, die unmittelbar vor dem Rezeptorstart Methionin ist, codiert, wurde in die BamHI und XhoI-Stellen von pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Ca) inseriert, um das Säuger-Expressionsplasmid pCD5MCRPB zu bilden. Das CD5-CCR2b- Fragment wurde in die BamHI-NotI-Stelle von pCDEF3 cloniert (Goldman et al., (1996) Biotechniques 21: 1013–1015) und ieses Konstrukt wurde als CCR2bDEF3 bezeichnet. In diesem Expressionsvektor wurde die Expression des inserierten Gens durch den EF-1α-Promotor angebtrieben.
50 ml L1/2-Zellen wurden bei 4 × 10⁵ Zellen/ml am Tag vor der Elektroporation ausgesäät. Am Tag der Elektroporation wurden die Zellen, die zu einer Dichte von 1 × 10⁶/ml gewachsen waren aus ihrem Medium zentrifugiert und in 800 μl Raumtemperatur warmen Elektroporationspuffer resuspendiert. (Zajac et al., DNA 7: 509–513). 120 mM L-Glutaminsäure (Sigma), 7 mM Mg Acetat (EM Science), 4,3 mM Glucose (Sigma), 17 mM K Pipes, pH 6,9 (Sigma), 1 mM EGTA (Sigma), 5 mM ATP, pH 7,0 (Sigma). 25 μg ScaI linearisierte, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahierte und mit Isopropanol ausgefällte CCR2bDEF3 Plasmid DNA wurde in eine Elektroporationsküvette mit einem 0,4 cm Spalt überführt. Die resuspendierten Zellen wurden zu der Küvette zugesetzt und ein einzelner Puls bei 450 V, 960 μFd angelegt. Die Zellen wurden dann aus der Küvette in eine T-75 Flasche überführt, die 15 ml L1/2 Wachstumsmedium enthielten (vorstehend beschrieben und für 3 Tage gezüchtet; zu diesem Zeitpunkt wurden die Zellen aus ihrem Medium zentrifugiert und in L1/2 Wachstumsmedium resuspendiert, das zusätzlich mit 1 mM Natriumpyruvat (Gibco BRL) und 0,8 mg/ml aktivem G418 (Gibco BRL) ergänzt war).
AUSWAHL VON ZELLEN, DIE CCR2 EXPRIMIEREN MITTELS CHEMOTAXIS
Die transfizierten Zellen wurden 11 Tage wachsen gelassen, worauf sie in frischem Wachstumsmedium 1:20 geteilt wurden. Am Tage 16 wurden die Zellen mittels Chemotaxis ausgewählt. 600 μl 1 nM MCP-1 in RPMI 1640, ergänzt mit 0,5% BSA (RPMI/BSA), wurden in eine untere Kammer überführt und 1 × 10⁶ CCR2bDEF3-Zellen in 100 μl RPMI/BSA wurden in die obere Kammer einer 3,0 Mikropore Chemotaxisplatte mit 24 Vertiefungen (Becton Dickenson) überführt. Die Zellen wurden vier Stunden der Chemotaxis überlassen und 20 min in einer 37 °C, 5% CO₂ Inkubator mit hoher Luftfeuchtigkeit, worauf die obere Kammer entfernt wurde. Diese Inkubationszeit wurde zum Zeitpunkt des Experiments gewählt, da sie ausreichend lang war für die auf MCP-1 antwortende Zellen eine Chemotaxis zu durchlaufen, jedoch kurz genug, um den Hintergrund gering zu halten. Sekundäre Auswahl von CCR2b exprimierenden Zellen durch FACS-Sortierung
Die Zellen, die mittels Chemotaxis durch die Membran gelangten und in die untere Kammer, wurden gezüchtet und weiter durch steriles FACS-Sortieren aufgereinigt. 10 Mio CCR2bDEF3 Zelllen wurden aus ihrem Medium zentrifugiert, in 2,5 ml PBS (+Ca, Mg), das mit 1% Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum ("HI FCS") (Gibco BRL) und 2,5 ml steril filtriertem anti-CCR2b aminoterminalem Peptid Antikörper-Überstand 5A11 ergänzt war, resuspendiert. Die Zellen und der Antikörper wurden vermischt und auf Eis 30 min inkubieren gelassen. Die Zellen wurden dann zweimal mit PBS (+) (Gibco BRL) gewaschen, und in 5 ml steril filtriertem, 1:250 verdünntem FITC-konjugiertem, Affinitäts-aufgereinigtem F(ab¹)₂ Ziegen-anti-Maus IgG (Jackson ImmunoResearch Laboraties) in PBS (+), ergänzt mit 1% HI FCS, resuspendiert. Die Zellen wurden für 30 min auf Eis im Dunklen inkubiert, dann zweimal mit PBS (+) (Gibco BRL) gewaschen. Die Zellen wurden auf FACSCAlibur^® sortiert und die hellsten 4% der Zellen wurden gewonnen (FL1 ≥ 3 × 10²).
Die sortierten Zellen wurden wachsen gelassen und sie wurden unter Verwendung des gleichen Protokolls, wie vorstehend erneut sortiert. Die hellsten 1% der Zellen wurden gewonnen (FL1 ≥ 3 × 10³)
HERSTELLUNG MONOKLONALER ANTIKÖRPER
Zur Herstellung mAk gegen CCR2b wurden Transfektanten kontinuierlich überwacht, um sicherzustellen, dass das Niveau der Expression nicht nach unten abdriftete. FACS-Färbung wurde periodisch durchgeführt, um die Expression des Rezeptors auf den Transfektanten sicherzustellen, wobei der anti-CCR2-Antikörper-Überstand 5A11 mit Ziegen-anti-Maus IgG FITC als zweiter Antikörper verwendet wurde.
20 Mio CCR2bDEF3.L1/2 Zellen wurden in RPMI 1640 gewaschen (Gibco BRL) und in RPMI 1640 plus 0,2 mg/ml Mitomycin C für 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden dann zweimal mit PBS(+) gewaschen und 2 × 107 Zellen in 0,5 ml PBS(+) wurden intraperitoneal in weibliche C57 BL/6 Mäuse injiziert. Dies wurde zwei weitere Male in 2 Wochen Intervallen wiederholt. Beim 4. Mal wurden 2 × 10⁷ Zellen in 0,25 ml resuspendiert und intravenös injiziert. 3 Tage nach der intravenösen Injektion wurden die Mäuse geopfert und die Milz wurde entfernt und die Zellen mit der SP2/0-Zellinie wie beschrieben fusioniert (Current protocols in Immunology, John Wiley and Sons, New York, 1992).
Dieser Satz Mäuse wurde zuvor mehrmals mit 2 unterschiedlichen Zellinien, sowie einem synthetischen Peptid immunisiert, wobei jedoch aus mehreren Fusionen keine Antikörper erzeugt wurden, die CCR2 positive Zellen anfärbten. Die vorstehend aufgeführten 4 Immunisierungen mit der CCR2bDEF3.L1/2-Zelllinie, die große Mengen an CCR2 exprimiert, war für den Erhalt des beschriebenen Antikörpers von Bedeutung.
AUSWAHL EINZELNER ZELLKLONE VON CCR2-TRANSFEKTANTEN DURCH LIMITIERENDE VERDÜNNUNG
Nachdem die Maus die letzte Injektion erhalten hat, wurden die zweimal sortierten Zellen erneut wachsen gelassen und sie wurden dann durch limitierende Verdünnung weiter gereinigt. Die Zellen wurden bei 1 und 9,5 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen verdünnt. Subklonierte Zellen aus der 0,5 Zellen pro Vertiefung wurden wachsen gelassen und auf CCR2b-Expression durch indirekte Immunofluoreszenz FACS-Analyse unter Verwendung des anti-CCR2-Antikörper-Übertsandes 5A11 mit Ziegen-anti-Maus-IgG FITC als den zweiten Antikörper untersucht. Das Verfahren war das gleiche, wie vorstehend beschrieben, mit der Maßgabe, dass das Färbevolumen 100 μl betrug. 4 Positive wurden ausgewählt und eingefroren.
IDENTIFIZIERUNG VON POSITIVEN MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN
Eine Immunfluoreszenz-Färbeanlyse unter Verwendung von FACScan^® (Becton Dickinson & Co., Mountain View. CA) wurde ingesetzt, um die monoklonalen Antikörper zu identifizieren, die mit dem CCR2b-Rezeptor reaktiv waren. Hybridomkultur-Überstände wurden in einem Format mit 96 Vertiefungen unter Verwendung eines Ziegen-anti-Maus IgG FITC als den zweiten Antikörper untersucht. CCR2bDEF3.L1/2 Zellen wurden dazu verwendet, monoklonale Antikörper zu identifizieren, die mit CCR2b reaktiv waren, und nicht-transfizierte L1/2-Zellen wurden dazu verwendet, monoklonale Antikörper zu eliminieren, die mit anderen Zelloberflächenproteinen reaktiv waren.
FACS-FÄRBUNG – GEZÜCHTETE ZELLEN
Zum Anfärben gezüchteter Transfektanten-Zellinien wurden 0,5 × 10⁶ Zellen in 50 μl in PBS + 1% FCS in einer Polystyrolplatte mit 96 Vertiefungen mit einem V-förmigen Boden resuspendiert. 50 μl primärer Antikörper-Überstand oder HAT-Meiudm (negative Kontrolle) wurden zugesetzt du die Proben wurden bei 4 °C für 30 min inkubiert. 100 μl PBS wurden zugesetzt und die Zellen wurden mittels Zentrifugation pelletiert und einmal mit PBS gewaschen. Das pellet wurde in 100 μl PBS + 1% FCS, enthaltend FITC konjugierter Ziegen-anti-Maus IgG-Antikörper resuspendiert (eine 1:250 Verdünnung) und für 30 min bei 4 °C im Dunklen inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, in PBS resuspendiert, und mittels Strömungscytometrie mit einem FacScan-Cytometer unter Verwendung der CellQuest-Software (Becton Dickenson) analysiert. Die Zellen wurden mit 1% PBS/1% Formaldehyd fixiert, wenn Sie nicht am gleichen Tag analysiert wurden. Die monoklonalen Antikörper 1D9 und 8G2 färben CCR2-Transfektanten, jedoch nicht CCR1- oder CCR5-Transfektanten (1A–1O).
FACS-FÄRBUNG – GESAMTBLUT
100 μl Gesamtblut wurde mit 100 μl 1D9 Antikörper Hybridomüberständen oder HAT-Medium (negative Kontrolle) vermischt und bei 4 °C für 30 min inkubiert. Nach einer Waschung mit PBS wurden 100 μl Ziegen-anti-Maus IgG-Antikörper (eine 1:250 Verdünnung) zu jeder Probe zugesetzt und für 30 min bei 4 °C im Dunklen inkubiert. Die Proben wurden dann einmal mit PBS gewaschen, wenn eine Färbung mit einer zweiten farbe erfolgen sollte, andernfalls noch zweimal in PBS gewaschen. Für eine Anfärbung mit 2 färben wurden 5 μl Mausserum zu den Zellpellets nach einer einzigen Waschung zugegeben, gemischt und für 5 min bei 4 °C im Dunklen inkubiert. Zweite primäre Antikörper (oder PBS als negative Kontrolle) wurden zugesetzt (10 μl anti CD16, 100 μl 1:200 Verdünnung von anti IgE) und für 30 min bei 4 °C im Dubklen inkubiert. Die Proben wurden dann einmal mit PBS gewaschen und in 100 μl Strepatavidin PE resuspendiert (1:200 + 1% BSA) und für 15 min bei 4 °C im Dunklen inkubiert. Erythrozyten wurden durch Zugabe von 2 ml FACS Lysispuffer zu jeder Probe und inkubieren bei Raumtemperatur im Dunklen für 15 min lysiert, bis die Proben klar waren. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation pellettiert und der gesamte Überstand wurde bis auf 200 μl abgesaugt. Die Proben wurden mittels Strömungscytometrie auf einem FacScan-Cytometer unter Verwendung der CellQuest-Softare (Becton Dickenson) analysiert. CCR2b wird auf den meisten Monozyten exprimiert, einer Subpopulation von Lymphozyten und einer Untergruppe von Granulozyten (2A–2L). CCR2b wird auf einer IgE-positiven Population im peripheren Blut (Basophilen) exprimiert.
MCP-1 BINDUNGSASSAY
Bindung von MCP-1 wurde in einem Endvolumen von 0,1 ml 50 mM Hepes pH 7,4, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl₂, 0,02% Natriumazid, 0,5% BSA (HBB), enthaltend entweder 2,5 μg THP-1 membranprotein oder 500.000 PBMC und 0,1 mM [125I]-MCP-1. Kompetitionsbindungsexperimente wurden durchgeführt, indem unterschiedlichen Konzentrationen an nicht-markiertem MCP-1, 1D9-Antikörper oder einer negativen Kontrolle IgG2a eingeschlossen wurden. Eine nicht-spezifische Bindung wurde nach Zusatz eines 2500-fachen Überschusses von nicht-markiertem MCP-1 bestimmt. Die Proben wurden für 60 min bei Raumtemperatur inkubiert, und gebundener und freier Marker wurde mittels Filtration durch GF/B-Filterplatten mit 96 Vertiefungen, die vorher in 0,3% Polyethylenimin getränkt waren, abgetrennt. Die Filter wurden in HBB gewaschen, das weiter mit 0,5 M NaCl ergänzt war, getrocknet, und die Menge an gebundener Radioaktivität wurde durch Flüssigkeitsscintillationszählung bestimmt. Der mAb 1D9 inhibiert [¹²⁵I] Bindung an THP-1-Zellmembrane mit einem IC₅₀ von etwa 0,004 μg/ml (etwa 0,02 nM; 4) und an frische PBMC mit einem IC50 von 0,04 μg/ml (etwa 0,2 mM; 5).
CHEMOTAXIS VON PBMC
Die Chemotaxis wurde unter Verwendung einer Chemotaxisplatte mit 96 Vertiefungen und einer Porengrösse von 3 μm (Neuroprobe, Cabin John, MD) untersucht. Gemäß Standardverfahren unter Verwendung einer Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation isolierte PBMC wurden mit PBS/0,5% BSA gewaschen und dann in Chemotaxis-Assaymedium (HBSS/10 mM HEPES/0,5% Fettsäure-freies BSA) in einer Endkonzentration von 10 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden in Chemotaxisassaymedium bei Raumtemperatur für 20 min mit unterschiedlichen Konzentrationen des anti-CCR2-Antikörpers, 1D9, oder nicht-spezifischem Maus-IgG2a inkubiert. Die gleichen Verdünnungen des Antikörpers wurden mit Chemokin vermischt und 30 μl des Gemisches wurde auf den Boden einer jeden Vertiefung der Chemotaxisplatte zugesetzt. Die Böden der Vertiefungen waren mit der Membran bedeckt, und 25 μl des Zell-und-Antikörper-Gemisches wurden zu dem oberen Bereich des Filters gegeben. Die platten wurden bei 37 °C in 5% CO₂ Inkubator für etwa 80 min inkubiert. Nach Beendigung der Wanderung wurde die Membran entfernt worauf die Platte mit den Vertiefungen mit Böden für 30 min bei –80 °C inkubiert wurden, um den Inhalt einzufrieren. Die Platten wurden bei 37 °C für 10 min aufgetaut. 6 μl einer 1:400 Verdünnung eines CyQuant-Reagenzes (Molecular Probes, Eugene, OR) in einem vom Hersteller bereitgestellten Lysispuffer wurden zu jeder Vertiefung gegeben und die Zellmigration wurde quantifiziert, wie durch Fluoreszenzidentität angezeigt, die unter Verwendung eines CytoFlour Fluoreszenzplatten-Lesegeräts bei 485ex/535em bestimmt wurde. Der mAk 1D9 inhibiert MCP-1-induziete Chemotaxis, jedoch nicht RANTES induzierte Chemotaxis, frischer PBMC (6A und 6B). Eine Inhibierung von MCP-1 induzierter Chemotaxis frischer PBMC wurde mit 10 μg/ml (~ 40 mM) gezeigt.
BEISPIEL 2
HUMANISIERUNG DES MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS 1D9
Der monoklonale 1D9-Antikörper ist in Menschen höchstewahrscheinlich Immunogen und ruft ggf. eine Mensch-anti-Maus-Antikörper-Reaktion (HAMA) hervor. Diese HAMA Antwort führt gewöhnlich zu einer schnellen Klärung des monoklonalen Maus-Antikörpers aus dem Körper, was jeden therapeutischen Effekt, den der monoklonale Antikörpers 1D9 haben könnte, begrenzt. Aus diesem Grunde wurde in einem Versuch die Immunogenität dieses Antikörpers in Menschen zu reduzieren und dessen therapeutisches Potential zu maximieren die Humanisierung des monoklonalen Maus-Antikörpers 1D9 vorangetrieben. Die folgenden Beispiele liefern eine detaillierte Analyse der Aminosäuresequenzdaten von 1D9, des Aufbaus eines molekularen Modells der Maus 1D9 F_v-Domäne, und der aufbau-Strategie für eine erfolgreiche Humanisierung des Maus-Antikörpers. Dies Aufbau-Strategie führt zu einem Aufbau einer Anzahl an humanisierten Versionen von sowohl dem variablen leichten kappa-Kette (V_K) Bereich und dem variablen Bereich (V_H) der schweren Kette. Insgesamt umfaßte der humanisierte V_H-Bereich bis zu 16 Aminosäureänderungen in den FRs des gewählten humanen V_H-Bereichs. Diese Änderungen wurden zwischen vier Versionen der humanisierten des humanisierten V_H-Bereichs aufgeteilt. Darüber hinaus wurden 12 Aminosäureänderungen in den FRs des gewählten humanen V_K-Bereichs in die vier Versionen des humanisierten V_K-Bereichs, der ebenfalls mitaufgenommen wurde, eingeschlossen.
SEQUENZANALYSE DES VARIABLEN BEREICHS DER MAUS 1D9 KAPPA LEICHTEN KETTE
Die Aminosäuresequenz des 1D9 V_K-Bereich (7) wurde mit anderen variablen Bereichen der Maus leichten kappa-Kette verglichen und weiter wurden die variablen Bereiche in die Kabat-Datenbank unterteilt (Kabat et al., Sequences of Proteins of immunological interest, 5. Ausgabe, U. S. Department of Health and Human Services, U. S. Government Printing Office (1991)). Aus dieser Analyse wurde gefunden, dass der 1D9 V_K-Bereich der Maus-Konsesnus-Sequenz der Maus kappa-Untergruppe II (Identität = 79,46%, Ähnlichkeit = 82,14%) am meisten ähnelt. Werden nur die FRs des variablen Bereichs der 1D9 kappa leichten Kette in der Maus Untergruppe II verlichen, dann steigt die prozentuale Identität auf 87,5%, während die prozentuale Ähnlichkeit auf 88,75 anstieg. Darüber hinaus zeigt der Maus 1D9 V_K-Bereich eine gute homologie zur Translation des Maus 70/3 V_K-Keimbahngens (13). ZUsammengefasst zeigt der vorstehend aufgeführte Beweis deutlich, dass die 1D9-Equenz für den Maus V_K-Bereich typisch ist.
SEQUENZANALYSE DES MAUS 1D9 VARIABLEN BEREICH DER SCHWERE KETTE
Eine vergleichbare Analyse des 1D9 V_H-BereichS (8) zeigt, dass sie am besten zu der Konsensussequenz der Maus schweren Kette Untergruppe III in der Kabat-Datenbank paßte (Kabat et al., Sequences of Proteins of immunological interest, 5. Ausgabe, U. S. Department of Health and Human Services, U. S. Government Printing Office (1991)). Eine Identität zwischen dem variablen Bereich der Maus schweren Kette wurde mit 70,94% bestimmt, während die Ähnlichkeit auf 76,07% berechnet wurde. Werden nur die FRs des 1D9 V_H-Bereichs mit der Maus-Untergruppe IIIc verglichen, dann stieg die prozentuale Identität auf 75,86%, während die Ähnlichkeit auf 80,46% anstieg. Der Maus 1D9 V_H-Bereich zeigte unter anderem weiter eine gute Homologie zu einer Translation des Maus MLR-RF24BG V_H-Keimbahngens (14). Der vorstehend aufgeführte Beweis bestätigte daher, dass die 1D9-Sequenz für einen Maus V_H-Bereich typisch ist.
MOLEKULARES GESTALTEN DER 1D9-DOMÄNE
Zur Unterstützug beim Aufbau der humanisierten variablen Bereiche des 1D9-Antikörpers, wurde einer Reihe molekularer Modelle des Maus 1D9 Fv-Bereichs und acht CDR-Propf-Varianten erstellt. Dies wurde unter Verwendung der AbM Molekularmodell-Packung, die von Oxford Molecular Limited (OML) geliefert und angewendet wurde, erreicht. Antikörper-Röntgenstrahlenkristallstrukturen waren von der Brookhaven Datenbank verfügbar und wurden formattiert, so dass diese zur Modellierung mit AbM verwendet werden konnten.
Die FRs des 1D9 variablen Bereichs wurden auf FRs aus ähnlichen, struktur-gelösten Immunglobulin varablen Bereichen modelliert. Während identische Aminosäure-Seitenketten in deren ursprünglicher Orientierung gehalten wurden, wurden nicht passende Seitenketten wie in dem ursprünglichen 1D9 Fv ersetzt. Die Rückgrat-Atome der FRs des Fab Bv04-01 V_K-Bereichs wurde für das Modell des Fv-Gerüstbereichs von 1D9 für die V_K- und V_H-Ketten (Brookhaven PDB-Code 1nbv, aufgelöst auf 2,0 Å. Die Sequenz von Fab Bv04-01 war eine gute Anpassung für die Sequenzen des variablen Bereichs des Maus 1D9 und deren humanisierten Varianten. Die Identitäten zwischen Fab Bv04-0 und dem Maus 1D9 und humanisierten Sequenzen reichten von 76% bis 78% für V_K-Sequenzen und von 74% bis 84% für V_H-Sequenzen. Eine Untersuchung von AbM mit bekannten Strukturen zeigte, dass die FR-Gerüsthomologie bei der Qualität eines jeden Models ein wichtiger Faktor ist, da die Verwendung von FR-Strukturen, die zu einer zu modellierenden Sequenz nur schlecht paßt, die Position und Orientierung von CDR-Loops erheblich und nachteilig beeinflussen kann.
Für die Rückgrat-Strukturen der CDrs L1, L2, L3 H1 und H2 wurden die Konformationen für all der Modelle aus kanonischen Klassen genommen, die von AbM ohne Modifizerung verwendet werden, wobei die in den 9 und 10 genommenen Klassen verwendet wurden.
Für die Rückgratstruktur des L1-Loops (der L1-Schleife) wurde die Loop-Konformation des Maus 1D9 V_K-Bereichs aus der kanonischen Klasse 4 von AbM genommen. Diese kanonische Klasse basiert auf den von Cothia seinen Kollegen beschriebenen (Chothia and Lesk, J., Mol. Biol. 197: 901 (1987); Chothia et al., Nature 34: 877 (1989); Tramontano et al., J. Mol. Biol. 215: 175 (1990); und Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799 (1992)), wired jedoch dahingehend modifiziert, dass Strukturen berücksichtigt wurden, die seit der Veröffentlichung der ursprünglichen Artikel verfügbar geworden sind. Eine Untersuchung des Verhaltens von AbM-Vorhersagen für bekannte Loop-Strukturen zeigte, dass CDR-Loops, die auf diese Art und Weise erzeugt wurden, gewöhnlich sehr genau modelliert werden, d.h. bis innerhalb 14,5 × 10^–10 m, (1–1,5 Å) Abweichung.
Der H3-Loop in dem 1D9 V_H-Bereich ist bei 6 Aminosäuren Länge vergleichbar kurz. Er wurde unter Verwendung einer Suche nach Rückgrat-Strukturen aus Röntgenstrahlen-Strukturen in der Brookhaven Datenbank modelliert. Für kurze Loops wie diesen gibt es ausreichend Loop-Konformationen aus bekannten Röntgenstrahlen-Strukturen, um den für den Loop verfügbaren Konformationsraum zu saturieren. Eine Untersuchung der von AbM gemachten Vorhersagen mit den Strukturen neuer Antikörper, bei denen die Struktur in den vom Programm verwendeten Datenbanken nicht beinhaltet ist, zeigt, dass für CDR H3-Loops dieser grösse die genauigkeit wahrscheinlich mindestens 2,0 × 10^–10m (2,0 Å) beträgt. Nach Einstellen des gesamten Modells auf sterische Hinderungen wurde es einer Energie-Minimierung unterworfen, wie im MAKROMODEL implementiert, um unerwünschte Atom- Kontakte zu verhindern und van der Waals und elektrostatische Interaktionen zu optimieren.
Aufbau der humanisierten 1D9 V_K-Antikörpervarianten
Der erste Schritt beim Aufbau der humanisierten variablen Bereiche des 1D9-Antikörpers war die Auswahl des humanen variablen Bereichs der kappa leichten Kette, die als Basis für den humanisierten 1D9 V_K-Bereich dient. Als Unterstützung für dieses Verfahren wurde der 1D9 V_K-Bereich ursprünglich mit der Konsensus-Sequenz der vier Untergruppen für den humane variablen Bereich der kappa leichten Kette, wie von Kabat definiert verglichen (Kabat et al., Sequences of Proteins of immunological interest, 5. Ausgabe, U.S. Department of Health and Human Services, U. S. Government Printing Office (1991)). Die Maus 1D9 variable Bereich der leichten Kette war fast vergleichbar zu der Konsensussequenz der humanen kappa leichten Kette Untergruppe II, mit der sie eine 76,2%-ige Identität über den gesamten variablen Bereich, und eine 82,5%-ige Identität mit den FRs alleine aufwies. Bei Bestimmung der Ähnlichkeit stiegen diese Werte auf 79,7 allgemein und auf 85,0% in den FRs alleine an. Somit schien sie gut zu den Sequenzen des variablen Bereichs der humanen kappa leichten Kette aus der kappa Untergruppe II zu passen.
Die Maus 1D9 VK wurde dann mit allen aufgezeichneten Beispielen einzelner Sequenzen der öffentlich zugänglichen, humanen variablen Bereichen verglichen. Die 15 zeigt die besten 17 Passungen zu dem Maus 1D9 V_K-Bereich, die über diese Analyse identifiziert wurden. Allgemein, der Suchalgorithmus wählte den humanen V_K-Bereich Antikörper 036521 (Rheinnecker et al., Journal of Immunology, 157 (7): 2989–97 (1996)) als die beste Passung zu der Maus 1D9 V_K-Bereich aus (16). Eine Übersicht der ursprünglichen Offenbarung für diesen Antikörper zeigte, dass Maus-Oligonukleotid-Primer verwendet wurden, um die Gene von dem Hybridom zu erhalten. D.h., dass dieser Antikörper in der Tat ein Maus-Antikörper und kein humaner Antikörper ist, wie aus der Kabat-Datenbank hervorgeht. Infolgedessen war die nächst beste Passung zu dem Maus 1D9 V_K-Bereich anhand der Datenbanksuche der humane V_K-Bereich des Antikörpers HF-21/28 (Kabat Datenbank ID Nummer 005056; Chastagner et al., Gene. 101(2): 305–6 (1991)). Die humane Sequenz wies eine allgemeine Identität zu dem 1D9 V_K-Bereich von 79,3% auf und 85,0% innerhalb der FRs alleine. Bei Messung im Hinblick auf die Ähnlichkeit stiegen diese Werte auf 83,99% allgemein und 87,5% in den FRs alleine an. Darüber hinaus waren die Schlüssel FR Aminosäuren in dem HF-21/28 Bereich konservativer beibehalten als in den anderen Kandidaten für die variablen Bereich der humanen leichten kappa Ketten. In der Folge wurde der variable Bereich FR der HF-21/28 leichten Kette als die humane Akzeptorsequenz für die Humanisierung des variablen Bereichs der 1D9 leichten kappa Kette.
Unglücklicherweise war der letzte Rest in Fr4 (bei Position 107 gemäß dem Kabat Nummerierungssystem) des humanen HF-21/28 V_K-Bereichs durch die Kabat-Datenbank oder die Autoren, die diese Sequenz eines variablen Bereichs ursprünglich isolierten, nicht definiert. Es wurde daher entschieden, die am häufigsten aufgefundene Aminosäure an dieser Stelle in den von der Kabat humane kappa leichte Kette Untergruppe k-II beschriebenen Sequenzen des variablen Bereichs, zu inserieren (Kabat et al., Sequences of Proteins of immunological interest, 5. Ausgabe, U. S. Department of Health and Human Services, U. S. Government Printing Office (1991)). Infolgedessen wurde Lysin an Position 107 in FR4, basierend auf einer Analyse der Kabat-Datenbank, zugefügt, wobei gefunden wurde, dass 87,5% der Sequenzen in der Kabat humane kappa leichte Kette Untergruppe k-II ein Lysin an dieser Stelle aufwies. Dies wurde dann die Basis der ersten humanisierten Version de 1D9 leichten kappa kette (1D9RK_A), welche im Wesentlichen die CDRs des 1D9 V_K-Bereichs und die FRs des HF-21/28-Bereichs umfaßten.
Der nächste Schritt in diesem Aufbauverfahren bestand darin, die Aminosäuresequenzen der humanen Akzeptor HF-21/28 VK-Bereich-FRs zu studieren, um zu bestimmen, ob diese Aminosäurereste eine Bindung an das Antigen ggf. nachteilig beeinflussen. Dies könnte direkt durch Interaktion mit dem Antigen, oder indirekt durch Ändern der Konformation oder Orientierung der CDR-Loops erfolgen. Dies war ein schwieriger Prozess, der nur dadurch möglich wurde, dass ein Modell der 1D9 variablem Bereiche verfügbar wurden, d.h. beide, die V_K- und V_H-Bereiche. Nichtsdestotrotz wurde dann jede Aminosäure in den Maus 1D9 FRs, die eine Antigenbindung möglicherweise beeinflussen könnte, auf Umwandlung in dem humanisiertem 1D9-Antikörper berücksichtigt. Bei der Entscheidung, welche Maus-Reste beibehalten werden sollten, wurden die folgenden Punkte angesprochen:

• Es war von großer Bedeutung, dass die kanonischen Strukturen der hypervariablem Loops (Chothia und Lesk, J. Mol. Biol. 197: 901 (1987); Chothia et al., Nature 34: 877 (1989); Tramontane et al., J. Mol. Biol. 215: 175 (1990); und Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799 (1992)) konserviert waren. In der Folge war es wichtig, in den humani sierten 1D9 variablen Bereichen alle der Maus FR-Reste, die teil dieser kanonischen Strukturen waren, beizubehalten (9 und 10).
• Die Sequenzen der variablen Bereiche des 1D9-Antikörpers wurden mit ähnlichen Sequenzen von anderen Maus-Antikörpern verglichen, um unübliche oder seltene Reste, die ggf. eine wichtige Rolle bei der Antigenbindung zeigten, zu identifizieren. Dies wurde dann unter Verwendung des Maus-Modells der 1D9 Gene der variablen Bereiche untersucht.
• Eine direkte Analyse des Modells wurde erstellt, um zu versuchen oder vorherzusagen, ob jeder der anderen Maus FR-Reste, der nicht in dem humanisierten FRs vorhanden ist, eine Antigenbindung in eine Art und Weise beeinflussen könnte.
• Vergleiche der einzelnen humanen Akzeptorsequenzen für die variablen Bereiche der leichten kappa Kette und der schweren Kette zu der Konsensussequenz der humanen variablen Bereiche Untergruppe, zu denen die Akzeptorsequenzen gehören, wurden ebenfalls angestellt. Die Identifizierung jeder idiosyncratischen Aminosäure in den humanen Donorsequenzen war wichtig, da diese eine Antigenbindung negativ beeinflussen könnten.
• Da die ausgewählten humanen variablen Bereiche der leichten und schweren Kette von zwei unterschiedlichen humanen Antikörpern abgeleitet wären, sollte eine sorgfältige Analyse der Interdomänen-Packungsreste der variablem Bereiche der Donor und der Akzeptor eichten kappa Kette durchgeführt werden (Chothia et al., J. Mol. Biol. 186: 651 (1985)). Dies, da jede Falschpackung in diesem Bereich einen dramatischen Effekt auf die Antigenbindung ausüben könnte, unabhängig von der Konformation der CDR-Loopstrukturen des humanisierten 1D9-Antikörpers

Obwohl zwischen den FRs dem Donor Maus 1D9-V_K-Bereich und dem Akzeptor humanen HF-21/28 V_K-Bereich Unterschiede in 12 Aminosäuren bestand, wurden lediglich 2 Mausreste als ausreichend wichtig für eine Bindungsaffinität erachtet, um diese in den humanisierten FRs zu bewahren. Die erste der FR-Änderungen, die in 1D9RK_B eingebracht wurde, war an Stelle 36 lokalisiert. Dieser Rest ist ein Vernier-Rest (Foote und Winter, J. Mol. Biol. 224: 487 (1992)) und soll eine Schlüsselstruktur bestimmender Rest für die L1-Loopstruktur sein, wie von Chothia und seinen Mitarbeitern definiert wurde (Chothia und Lesk, J. Mol. Biol. 197: 901 (1987); Chothia et al., Nature 34: 877 (1989),; Tramontano et al., J. Mol. Biol. 215: 175 (1990); und Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799 (1992)). Obwohl beide reste hydrophob sin dist das humane Phe voluminöser an dieser Stelle und die Röntgenstrahlenstrukturen mit Leu und Phe an dieser Stelle zeigen, dass bei Vorhandensein von Phe, eine sterische Behinderung dazu führt, dass die Seitenkette bei 34 Asn in die entgegengesetzte Richtung zeigt. Dies wurde daher für eine erfolgreiche Humanisierung der 1D9 leichten kappa Kette als wichtig erachtet.
Die zweite Änderung, die in der humanisierten Version von 1D9RK_B eingeführt wurde, bestand im Rest 37, d.h. G1n37Leu. Obwohl dies eine konservative Änderung war, erfolgte dies in einer hoch konservierten region an der Basis von CDR1. Es wurde davon ausgegangen, dass durch Bewahren dieses Maus-Leu-Restes in dieser Version die Affinität des humanisierten Antikörpers erhalten bleibt.
Zwei andere Versionen des humanisierten V_K-Bereichs wurden zum Aufbau ebenfalls berücksichtigt, um die Konsequenzen auf die Struktur und die Bindungsaffinität der Manipulation der FRs des humanisierten 1D9-Antikörpers zu erforschen. 1D9RK_C war im Wesentlichen identisch zu 1D9RK_B, mit der Maßgabe der Mutation Gin100Gly. Es gibt einen dramatischen Unterschied bei dem Molekülvolumen zwischen diesen beiden Resten, und diese Version wurde daher hergestellt, um diese Änderung der FRs der umgestalteten leichten kappa Kette auf die Antikörper-Struktur und die allgemeine Affinität des Antikörpers zu erforschen. ID9RK_D enthielt die in 1D9RK_C beschriebene Modifizierung und zusätzlich die FR-Änderung Gln17His. Obwohl Gln und His eine ähnliche Grösse aufweisen und beide schwach polar sind, ist der Mausrest (His) an dieser Stelle bei allen Maus V_K-Sequenzen äußerst selten (0,07% insgesamt, wobei dies nicht in der Maussequenzen der Kabat-Untergruppe II zu verzeichnen ist) und wurde in humanen V_K-Sequenzen nie verzeichnet. Im Gegensatz dazu kommt der Rest Gln an dieser Stelle häufiger vor in sowohl Maussequenzen (16,16% insgesamt, und 6,12% in Maussequenzen der Kabat-Untergruppe II) als auch Menschsequenzen (5,00% insgesamt und 39,7% in der humanen Sequenzen der Kabat Untergruppe II). Die einfache Seltenheit des His an dieser Stelle weist darauf hin, dass es für eine Bindung wichtig sein kann, obwohl kein klarer Beweis vorhanden ist, um dies aus den molekularen Modellierungsdaten zu stützen. Eine Beschreibung der Aminosäuresequenz aller humanisierten 1D9-Antikörper V_K-Bereichsvarianten, die vorstehend aufgeführt sind, sind in 11 gegeben.
AUFBAU HUMANISTERER 1D9 V_H-ANTIKÖRPER-VARIANTEN
Erneut ist der erste Schritt beim Aufbau des humanisierten V_H-Bereichs des Maus 1D9-Antikörpers die Auswahl des Akzeptor varliablen Bereich der humanen schweren Kette, der als die Basis für den humanisierten 1D9-V_H-Bereich dienen würde. Wird der 1D9 V_H-Bereich ursprünglich mit der Konsensussequenz der drei Untergruppen der humanen variablen Bereiche der schweren Kette verglichen wurde gefunden, dass dieser mit der Konsensussequenz für die human schwere kette der Untergruppe III am ähnlichsten war, mit einer allgemeinen Identität von 69,231% und einer 78,161% Identität zwischen den FRs alleine. Ei bewertung im Hinblick auf die Ähnlichkeit stiegen diese Werte auf 74,359% insgesamt und auf 82, 759% innerhalb der FRs allein.
Der Maus 1D9 V_H-Bereich wurde dann mit allen aufgezeichneten Beispielen einzelner Sequenzen öffentlich verfügbarer humaner variablen Bereiche verglichen. Die 17A–B zeigten die besten 24 Passungen zu dem Maus 1D9 V_H-Bereich, die durch diese Analyse identifiziert wurden. Ein allgemeiner Suchalgorithmus waählte den humanen V_H-Bereich des Antikörpers 4B4'CL (Kabat Datenbank ID Nr. 000490; Sanz et al., Journal of Immunology. 142: 883 (1989)) als beste Pssung zu dem 1D9 V_H-Bereich aus. Der V_H-Bereich dieses Klons wies eine allgemeine identität zu dem 1D9 V_H-Bereich von 67,2% auf, einem Wert, der auf 80,95 anstieg, wenn die FRs alleine verglichen wurden (18A–B). D.h. erneut, obwohl dieser humane FR nicht der homologste zu den möglichen humanen Akzeptor V_H-Sequenzen war, wurde er die Basis der humanisierten Version der 1D9 schweren Kette.
Der nächste Schritt in dem Aufbauverfahren bestand darin, die Aminosäuresequenzen des humanen Akzeptor 4B4'CL V_H-Bereichs zustudieren, um festzustellen, ob eine dieser Aminosäuresequenz ggf. eine Bindung an das Antigen nachteilig beeinflußt. Erneut waren die Molekularen Modelle, erstellt durch OML, in diesem Aufbauverfahren von Bedeutung, aus dem eine Anzahl von Aminosäuren in den Maus 1D9 V_H-Bereich FRs zur Umwandlung in die erste (1D9RH_A) und nachfolgende Versionen des humanisierten Antikörpers identifiziert wurden (12 und 20A–C). Es gab 16 Aminosäure-Unterschiede zwischen den FRs des Donor Maus-1D9 und den humanen Akzeptor 4B4'CL V_H-Bereichen, wobei bis zu 5 Mausreste zur Konservierung in den humanisierten FRs berücksichtigt wurden (12).
1D9RH_A bestand aus den CDRs des Maus 1D9-Antikörper V_H-Bereichs, die in die FRs des humanen 4B4'CL-Antikörper V_H-Bereich genetisch inseriert wurden. 1D9RH_B war identisch zu der Version 1D9RH_A außer zwei FR1-Mutationen, Thr28Ser und Asn30Ser. Diese Änderungen wurden erstellt, da Sie Vernier-Aminosäuren darstellten, wie von Foote und Winter definiert (J. Mol. Biol. 224: 487 (1992)), die für die H1-Loopkonformation von Bedeutung sind. Die Reste 27–30 werden als teil des H1-Loops selbst angesehen, so dass Sie für die richtige Konformation und Orientierung dieses Loops sogar noch bedeutungsvoller sind, was deren Konservierung sogar noch mehr rechtfertigt. Diese zwei Reste stellten daher die Summe der Änderungen dar, die an den FRs der humanen 4B4'CL V_H-Sequenz in ID9RH_B vorgenommen wurden. 1D9RH_C war identisch zu der Version 1D9RH_B mit der Maßgabe, dass er zwei weitere Änderungen an den Positionen Gly49Ala und Phe67Tyr aufwies. Der Rest an Position 49 wurde jedoch als ein Vernier-Rest identifiziert (Foote und Winter, J. Mol. Biol. 224: 487 (1992)), was für die hypervariable H2-Loopstruktur wichtig ist, so dass entschieden wurde, den Maus Ala-Rest in dieser Version beizubehalten. Die Position des Restes 67 war ebenfalls eine Vernierrest-Position, die für den Erhalt der CDR-Loopkonformation als wichtig identifiziert wurde. Tyr ist in humanen V_H-Sequenzen äußerst selten aufzufinden (0,08% insgesamt und wurde zuvor an dieser Position nicht in Aminosäure V_H-Bereichen aufgefunden. In der Folge muss diese durch somatische Mutation hervorgerufen sein. Somit wurde aufgrund seiner zu CDR2 gemäß dem molekularen Modell nahen Position und dessen Vernier-Status entschieden, den Maus Tyr-Rest an dieser Position beizubehalten. 1D9RH_D war identisch zu 1D9RH_C mit der Maßgabe einer Thr93Val-Mutation. Dieser Rest wurde als für beide, V_H/V_K, wichtiger Packungsrest identifiziert. Darüber hiaus stützt seine versteckte Position zwischen CDR-Loops H1 und H3 gemäß dem molekularen Modell die Entscheidung, den Maus Val-Rest an dieser Position konserviert zu lassen. Eine Beschreibung der Aminosäuresequenzen aller vorstehend beschriebener humanisierten V_H-Bereichs-Varianten ist in 12 gegeben.
INHIBIERUNG DER MCP-1 BINDUNG DURCH DIE HUMANISIERTE VERSION VON 1D9
25 erläutert die Fähigkeit des Maus mAb 1D9 und einer humanisierten Version von mAb 1D9, die die 1D9RH_AV_H schwere Kette (12) und die die 1D9RH_AV_K leichte Kette (11) umfasst, die Bindung von [¹²⁵I]-MCP-1 an ganze THP-1 Zellen zu inhibieren. 0,5 × 10⁶ THP-1 Zellen wurden in 50 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0,1% BSA, 0,05% Natriumazid (Bindungspuffer) mit unterschiedlichen Verdünnungen der Antikörperproben für 10 Minuten bei 37 °C inkubiert. Ein gleiches Volumen von [¹²⁵I]-MCP-1 in Bindungspuffer wurde zu einer Endkonzentration von 0,1 nM dazugegeben und für weitere 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden verdünnt und mit einem gleichen Volumen Bindungspuffer mit 0,5 M NaCl (Waschpuffer) gevortext und durch Zentrifugation (Labortischzentrifuge, 7000 Upm, 2 Minuten) wurde ein Pellet gebildet. Nach Entfernen des Überstands wurde das Pellet in 200 μl Waschpuffer gevortext und wie zuvor zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. Die Zellen wurden in 100 μl Waschpuffer resuspendiert und auf einem Gamma-Zähler (Cobra, Packard Instruments) gezählt. Die Datenanalyse wurde unter Verwendung der Software Graphpad durchgeführt.
Obwohl diese Erfindung insbesondere mit Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen gezeigt und beschrieben wurde, sollte dem Fachmann klar sein, dass verschiedene Veränderungen in Form und Detail vorgenommen werden können, ohne von dem Geltungsbereich der Erfindung abzuweichen, der durch die anhängigen Ansprüche umfasst wird.
Sequenz Liste

Claims

Humanisierte leichte Immunglobulin-Kette oder Antigen-bindendes Fragment davon, umfassend, mindestens einen Komplementaritäts-bestimmenden Bereich, der von der variablen leichten Kette der SEQ. ID. Nr. 9 abgeleitet ist, und einen Gerüstbereich der humanen leichten Kette, der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr. 11 abgeleitet ist.
Humanisierte leichte Immunglobulin-Kette oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 1, worin der Komplementaritäts-bestimmende Bereich ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 24–39 der SEQ. ID. Nr. 9, den Aminosäuren 55–61 der SEQ. ID. Nr. 9 und den Aminosäuren 94–102 der SEQ. ID. Nr. 9.
Humanisierte leichte Immunglobulin-Kette oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 1, umfassend, drei Komplementaritäts-bestimmende Bereiche, die von der leichten Kette der SEQ. ID. Nr. 9 abgeleitet sind.
Humanisierte leichte Immunglobulin-Kette oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 1, umfassend, einen variablen Bereich mit einer Aminosäuresequenz, bestehend aus der SEQ. ID. Nr. 12, der SEQ. ID. Nr. 13, der SEQ. ID. Nr. 14, der SEQ. ID. Nr. 15 und der SEQ. ID. Nr. 107.
Humanisierte leichte Immunglobulin-Kette oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 1, umfassend einen variablen Bereich der SEQ. ID. Nr. 12.
Humanisierte leichte Immunglobulin-Kette oder Antigen-bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 1–5, weiter umfassend, einen humanen konstanten Bereich oder Teil davon.
Humanisierte leichte Immunglobulin-Kette oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 6, worin der konstante Bereich vom kappa-Typ ist.
Humanisierte schwere Immunglobulin-Kette oder Antigen-bindendes Fragment davon, umfassend, mindestens einen Komplementaritäts-bestimmenden Bereich, der von der variablen schweren Kette der SEQ. ID. Nr. 10 abgeleitet ist, und einen Gerüstbereich der schweren Kette, der von der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr. 16 abgeleitet ist.
Humanisierte schwere Immunglobulin-Kette oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 8, worin der Komplementaritäts-bestimmende Bereich ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den: Aminosäuren 31–35 der SEQ. ID. Nr. 10, den Aminosäuren 50–68 der SEQ. ID. Nr. 10 und den Aminosäure 101–106 der SEQ. ID. Nr. 10.
Humanisierte schwere Immunglobulin-Kette oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 8, umfassend, drei Komplementaritäts-bestimmende Bereiche, die von der schweren Kette der SEQ. ID. Nr. 10 abgeleitet sind.
Humanisierte schwere Immunglobulin-Kette oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 8, umfassend, einen variablen Bereich mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der SEQ. ID. Nr. 17, der SEQ. ID. Nr. 18, der SEQ. ID. Nr. 19 und der SEQ. ID. Nr. 20.
Humanisierte schwere Immunglobulin-Kette oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 8, umfassend, einen variablen Bereich der SEQ. ID. Nr. 17.
Humanisierte schwere Immunglobulin-Kette oder Antigen-bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 8–12, weiter umfassend, einen humanen konstanten Bereich oder einen Teil davon.
Humanisierte schwere Immunglobulin-Kette oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 13, worin der konstante Bereich vom gamma-Typ ist.
Humanisierte schwere Immunglobulin-Kette oder Antigen-bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 13 und 14, worin der humane konstante Bereich oder ein Teil davon mutiert ist, um die Bindung an Fc-Rezeptoren und/oder die Fähigkeit zur Fixierung von Komplement zu minimieren.
Humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon mit einer Bindungsspezifität für den Säuger CC-Chemokin-Rezeptor 2, worin das Immunglobulin oder Antigen bindende Fragment davon mindestens eine humanisierte leichte Kette oder ein Antigen bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfaßt, und mindestens eine humanisierte schwere Kette oder Antigen bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 8 bis 15.
Humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 16, worin das Immunglobulin oder das Antigen bindende Fragment davon mindestens eine humanisierte leichte Kette oder Antigen bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfaßt und worin das Immunglobulin oder Antigen bindendes Fragment davon weiter mindestens einen Komplementaritäts-bestimmenden Bereich umfaßt, der von der variablen schweren Kette der SEQ. ID. Nr. 10 abgeleitet ist.
Humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 17, worin das Immunglobulin der das Antigen bindende Fragment davon weiter einen Gerüstbereich umfaßt, der abgeleitet ist von der variablen schweren Kette der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr. 16.
Humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 16, worin das Immunglobulin oder das Antigen bindende Fragment davon mindestens eine humanisierte schwere Kette oder Antigen bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 8 bis 15 umfaßt, und worin das Immunglobulin oder das Antigen bindende Fragment davon weiter mindestens einen Komplementaritäts-bestimmenden Bereich umfaßt, der abgeleitet ist von der variablen Kette der SEQ. ID. Nr. 9.
Humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 19, worin das Immunglobulin oder das Antigen bindende Fragment davon weiter einen Gerüstbereich umfaßt, der abgeleitet ist von der variablem leichten Kette der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr. 11.
Humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 1–20, worin das Immunglobulin oder das Antigen bindende Fragment davon mit dem monoklonalen Antikörper, der unter der ATCC Hinterlegungsnummer HB-12549 hinterlegt wurde, um die Bindung an den Säuger CC-Chemokin-Rezeptor 2 konkurriert.
Humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 1–21, worin der Säuger CC-Chemokin-Rezeptor-2 der humane CC-Chemokin-Rezeptor 2 ist.
Humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 22, worin das Immunglobulin oder das Antigen bindende Fragment davon eine Bindung des CC-Chemokin-Rezeptors 2 an einen Liganden inhibiert.
Humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 23, worin der Ligand ein Chemokin ist, wie ein Chemokin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 und Kombinationen davon.
Humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 23, worin der Ligand HIV ist oder ein Bereich davon.
Humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 1–25, worin das Immunglobulin oder Fragment davon mit einem Marker markiert ist, wie einem Marker, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Radioisotop, einem Spin-Marker, einem Antigen-Marker, einem Enzym-Marker, einem fluoreszieren den Marker, einem chemolumineszenten Marker und einem Epitop-Marker.
Humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 1–25, worin das Antigen bindende Fragment davon ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Fv-Fragment, einem Fab-Fragment, einem Fab'-Fragment und einem F(ab')₂-Fragment.
Humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 1–27, worin das Immunglobulin oder das Antigen bindende Fragment davon eine oder mehrere Funktionen inhibiert, die assoziiert sind mit der Bindung des Säuger-CC-Chemokin-Rezeptor 2 an einen CC-Chemokin 2 Liganden, wie Leukozyten-Wanderung, Eintritt von HIV in die Zelle, T-Zell-Aktivierung, Entzündungsmediator-Freisetzung und Leukozyten-Degranulierung.
Humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 28, worin die mit der Bindung des Liganden an den Rezeptor assoziierte Funktion Chemotaxis ist.
Humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 28, worin die mit der Bindung des Liganden an den Rezeptor assoziierte Funktion HIV-Infektiösität ist.
Humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 1–30, worin das Immunglobulin oder das Antigen bindende Fragment davon den CC-Chemokin-Rezeptor 2 mit einer Affinität von mindestens 0,1 × 10^–9 M, mindestens etwa 1 × 10^–9 M oder mindestens etwa 3 × 10^–9 M bindet.
Humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 29, worin das Immunglobulin oder das Antigen bindende Fragment davon eine Chemokin induzierte Chemotaxis von Zellen bei mindestens weniger als 150 μg/ml, weniger als 100 μg/ml, weniger als 50 μg/ml oder weniger als 20 μg/ml inhibiert.
Humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 32, worin die Zellen periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) sind.
Humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon nach Anspruch 23, worin das Immunglobulin oder das Antigen bindende Fragment davon eine Bindung des Liganden an den Rezeptor mit einer IC₅₀ von weniger als 1,0 μg/ml, weniger als etwa 0,05 μg/ml oder weniger als etwa 0,005 μg/ml inhibiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das die humanisierte leichte Immunglobulin-Kette oder ein Antigen-bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert und/oder die humanisierte schwere Immunglobulin-Kette oder ein Antigen-bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 8 bis 15.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 35, worin die Nukleinsäure eine humanisierte leichte Immunglobulin-Kette oder ein Antigen-bindendes Fragment davon codiert und worin die Nukleinsäure einen Bereich der Nukleinsäuresequenz der SEQ. ID. Nr. 98 umfaßt.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 35, worin die Nukleinsäure eine humanisierte schwere Immunglobulin-Kette oder ein Antigen-bindendes Fragment davon codiert, und worin die Nukleinsäure einen Bereich der Nukleinsäuresequenz der SEQ. ID. Nr. 97 umfaßt.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 35, worin die Nukleinsäure eine fusionierte Nukleinsäure ist, die eine humanisierte leichte Immunglobulin-Kette nach einem der Ansprüche 1–5 codiert, und mindestens einen Bereich einer konstanten Region eines Immunglobulins humanen Ursprungs codiert.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 38, worin die konstante Region vom kappa Typ ist.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 35, worin die Nukleinsäure eine fusionierte Nukleinsäure ist, die eine humanisierte schwere Immunglobulin-Kette nach einem der Ansprüche 8–12 codiert, und mindestens einen Bereich einer konstanten Region eines Immunglobulins humanen Ursprungs codiert.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 40, worin die konstante Region vom gamma Typ ist.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 40 oder 41, worin die konstante Region oder ein Bereich davon mutiert ist, um eine Bindung an Fc-Rezeptoren und/oder die Fähigkeit Komplement zu fixieren auf ein Minimum zu reduzieren.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 38 und 39, weiter umfassend eine dritte Nukleinsäure, die mindestens einen Komplementaritäts-bestimmenden Bereich codiert, abgeleitet von der schweren Kette der SEQ. ID. Nr. 10, und einen Gerüstbereich, abgeleitet von der schweren Kette der SEQ. ID. Nr. 16.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 43, worin die dritte Nukleinsäure mindestens drei Komplementaritäts-bestimmende Bereiche der schweren Kette der SEQ. ID. Nr. 10 umfaßt.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 40 bis 42, weiter umfassend eine dritte Nukleinsäure, die mindestens einen Komplementaritäts-bestimmenden Bereich codiert, der abgeleitet ist von der leichten Kette der SEQ. ID. Nr. 9, und einen Gerüstbereich, der von der leichten Kette der SEQ. ID. Nr. 11 abgeleitet ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 45, worin die dritte Nukleinsäure mindestens drei Komplementaritäts-bestimmende Bereiche der leichten Kette der SEQ. ID. Nr. 9 umfaßt.
Expressionsvektor, der ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 35 bis 46 umfaßt.
Isolierte Wirtszelle, der einen Expressionsvektor nach Anspruch 47 umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines humanisierten Immunglobulins, umfassend, Halten einer Wirtszelle nach Anspruch 48 unter Bedingungen, die zur Expression eines humanisierten Immunglobulins geeignet sind, wobei die humanisierten Immunglobulin-Ketten exprimiert werden und ein humanisiertes Immunglobulin hergestellt wird, und wahlweise Isolieren des humanisierten Immunglobulins.
In vitro Verfahren zur Inhibierung der Interaktion einer den Säuger CC-Chemokin Rezeptor 2 exprimierenden Zelle mit einem Liganden des Rezeptors, welches umfaßt, Inkontaktbringen der Zelle mit einer wirksamen Menge eines humanisierten Immunglobulins oder eines Antigen bindenden Fragments davon nach einem der Ansprüche 16 bis 34.
Verfahren nach Anspruch 50, wobei der Ligand ein Chemokin ist, wie ein Chemokin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 und Kombinationen davon.
Verfahren nach Anspruch 50, wobei der Ligand HIV oder ein Teil davon ist.
In vitro Verfahren zur Inhibierung einer HIV-Infektion einer Zelle, umfassend, Inkontaktbringen einer Zelle mit einer wirksamen Menge eines humanisierten Immunglobulins oder eines Antigen bindenden Fragments davon nach einem der Ansprüche 16 bis 34.
Verwendung eines humanisierten Immunglobulins oder eines Antigen-bindenden Fragments davon nach einem der Ansprüche 16 bis 34 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von HIV in einem Subjekt oder zur Inhibierung der HIV-Infektion in einem Subjekt.
In vitro Verfahren zur Inhibierung einer Funktion, die mit der Bindung eines Chemokins an einen Säuger CC-Chemokin-Rezeptor 2 oder an einen funktionalen Bereich des Rezeptors assoziiert ist, umfassend, Inkontaktbringen des Rezeptors oder eines Bereichs davon mit einer wirksamen Menge eines humanisierten Immunglobulins oder eines Antigenbindenden Fragments davon nach einem der Ansprüche 16 bis 34.
Verfahren nach Anspruch 55, wobei das Chemokin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 und Kombinationen davon.
Verfahren nach Anspruch 55, wobei die Funktion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) Signalaktivität (b) Stimulation einer zellularen Antwort; und (c) Kombinationen von (a) und (b).
Verfahren nach Anspruch 57, wobei die Funktion Signalaktivität ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) Aktivierung eines Säuger G-Proteins; (b) Induktion eines schnellen und transienten Anstiegs der Konzentration an cytosolischem freiem Calcium [Ca²⁺]; und (c) Kombinationen von (a) und (b).
Verfahren nach Anspruch 57, wobei die Funktion eine Stimulierung einer zellulären Antwort ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) Stimulierung der Chemotaxis; (b) Exocytose; (c) Entzündungsmediator-Freisetzung durch Leukozyten; (d) Integrin-Aktivierung;
T-Zell Aktivierung; (f) Leukozyten-Degranulierung; und (g) Kombinationen von (a), (b), (c), (d), (e) und (f).
Verfahren nach Anspruch 50, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten, T-Zellen, Basophilen, Dentritischen Zellen, Eosinophilen, Mastzellen, und Zellen, die eine rekombinante Nukleinsäure umfassen, die den Säuger CCR2 oder einen Teil davon codieren.
Verfahren nach Anspruch 60, wobei die T-Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus CD8+-Zellen, CD25+-Zellen, CD4+-Zellen und CD45RO+-Zellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 50 und 55, wobei der Säuger-CC-Chemokin Rezeptor 2 ein humaner CC-Chemokin-Rezeptor 2 ist.
Verwendung eines humanisierten Immunglobulin oder Antigen-bindenden Fragments davon nach einem der Ansprüche 16 bis 34 bei der Herstellung eines Medikaments für eine Störung oder einen Zustand, ausgewählt unter: entzündlicher oder allergischer Erkrankung und Zuständen, Autoimmunerkrankung, Atherosklerose, Atherogenese, Stenose oder Restenose des Gefäßsystems, Verengung eines Lumens eines Gefäßes in einem Subjekt, neointimale Hyperplasie eines Gefäßes in einem Subjekt, Reperfusions-Verletzung, Polymyose, Dermatomyose und Granulomatose-Erkrankung einschließlich Sarcoidose.
Verwendung nach Anspruch 63, wobei die Erkrankung eine entzündliche Erkrankung ist und wobei die entzündliche Erkrankung Sklerodermie ist.
Verwendung nach Anspruch 63, wobei die Störung eine Autoimmunstörung ist und wobei die Autoimmunstörung multiple Sklerose oder rheumatoide Arthritis ist.
Verwendung nach Anspruch 63, wobei die Störung eine entzündliche oder allergische Erkrankung oder ein Zustand ist, und wobei die entzündliche oder allergische Erkrankung oder der Zustand Asthma ist.
Verwendung nach Anspruch 63, wobei der Zustand ausgewählt ist unter Stenose oder Restenose des Gefäßsystems, Verengung eines Lumens eines Gefäßes in einem Subjekt und neointimale Hyperplasie eines Gefäßes in einem Subjekt und wobei der Zustand assoziiert ist mit einer Gefäßintervention in dem Subjekt.
Verwendung nach Anspruch 67, wobei die Gefäßintervention ausgewählt ist unter Angioplastie, einer Stent-Anordnung oder beidem.
Verwendung nach Anspruch 63 bis 68, wobei das Subjekt ein Mensch ist.
Verwendung nach Anspruch 63 bis 69, wobei das Medikament für eine parenterale Verabreichung, intravenöse Verabreichung oder subkutane Verabreichung oder Infusion formuliert ist.
Verwendung nach Anspruch 63 bis 68, wobei das Medikament hergestellt ist zur Verabreichung mit einem anderen Arzneimittel oder Mittel, wie einem Antikörper oder einem Antigen-bindenden Fragment davon, der/das einen Chemokin Rezeptor bindet, der nicht ein CC-Chemokin Rezeptor 2 ist, einem Antikörper oder Antigen-bindenden Fragment davon, der/das den CC-Chemokin Rezeptor 3 bindet, einem Antikörper oder Antigenbindenden Fragment davon, der/das den CC-Chemokin Rezeptor 5 bindet, 1-Globulin, Immunglobulin oder Kombinationen davon.
Verfahren zur Erfassung der Expression eines Säuger-CC-Chemokin Rezeptor 2 in einer Probe, umfassend, Inkontaktbringen der Probe mit einem humanisierten Immunglobulin oder Antigenbindenden Fragment davon nach einem der Ansprüche 16 bis 34 unter Bedingungen, die geeignet sind zum Binden des Immunglobulins oder des Antigen-bindenden Fragments davon an den Rezeptor, Bestimmen, ob zwischen dem Immunglobulin oder dem Antigen-bindenden Fragment davon und dem Rezeptor unter Bildung eines Komplexes eine Bindung erfolgte, wobei ein Komplex die Anwesenheit eines Säuger-CC-Chemokin Rezeptors 2 in der Probe anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 72, wobei die Probe eine Körperflüssigkeit ist, wie Entzündungsexsudate, Speichel, Blut, Serum oder Darmflüssigkeit.
Verfahren nach einem der Ansprüche 72 bis 73, wobei der Säuger-CC-Chemokin Rezeptor 2 ein humaner CC-Chemokin Rezeptor 2 ist.
In vitro Verfahren zum Nachweis der Expression eines Säuger-CC-Chemokin Rezeptor 2 durch eine Zelle, umfassend: Inkontaktbringen einer Zelle mit einem humanisierten Immunglobulin oder einem Antigen-bindenden Fragment davon nach einem der Ansprüche 16 bis 34 unter Bedingungen, die geeignet sind für eine Bindung des Immunglobulins oder des Antigen-bindenden Fragments davon an den Rezeptor, Bestimmen, ob zwischen dem Immunglobulin oder dem Antigen-bindenden Fragment davon mit dem Rezeptor unter Bildung eines Komplexes eine Bindung erfolgte, wobei ein Komplex die Expression eines Säuger-CC-Chemokin Rezeptor 2 durch die Zelle zeigt.
Verfahren nach Anspruch 75, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten, T-Zellen, Basophilen, dentritischen Zellen, Eosinophilen und Mastzellen.
Verfahren nach Anspruch 76, wobei die T-Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus CD8+-Zellen, CD25+-Zellen, CD4+-Zellen und CD45RO+-Zellen.
Zusammensetzung, welche ein humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 16 bis 34 umfaßt, und wahlweise einen physiologisch verträglichen Träger.
Zusammensetzung nach Anspruch 78, worin die Zusammensetzung in lyophilisierter Form vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 78 und 79, worin die Zusammensetzung weiter ein oder mehrere umfaßt eines Puffers, eines Stabilisators, eines Exzipienten, eines bioziden Mittels und eines inerten Proteins.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 78, worin das Immunglobulin oder das Antigen-bindende Fragment davon ein lyophilisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindende Fragment davon ist, das in einem pharmazeutisch verträglichen Träger rekonstituiert ist.
Kit, welcher umfaßt: ein humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 16 bis 34.
Kit nach Anspruch 82, worin das humanisierte Immunglobulin oder das Antigen bindende Fragment davon lyophilisiert ist.
Kit nach Anspruch 82 oder 83, welcher weiter einen physiologisch verträglichen Träger umfaßt.
Kit nach Anspruch 82, welcher weiter ein oder mehrere Hilfsmittel umfaßt, die geeignet sind, die Anwesenheit eines Komplexes zwischen dem Immunglobulin oder dem Antigen-bindenden Fragment davon und dem Rezeptor zu erfassen.
Kit nach Anspruch 85, weiter umfassend ein zweites Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon, das für ein Epitop des Rezeptors spezifisch ist, das verschieden ist von dem ersten Immunglobulin oder Antigen-bindenden Fragment davon, oder das das erste Immunglobulin oder das Antigen-bindende Fragment davon bindet.
Kit nach Anspruch 86, worin das zweite Immunglobulin oder Antigen-bindende Fragment davon markiert ist.
Humanisiertes Immunglobulin oder Antigen-bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 16 bis 34 zur Verwendung in der Therapie oder Diagnose.