JP2008539693A - 抗dsc2抗体のエフェクター機能を用いて細胞を障害する方法 - Google Patents
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- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
Abstract
Description
DSC2は、肺癌、大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、および肝臓癌の細胞を含む様々な癌細胞において特異的に発現することが見出されている。本発明は、エフェクター機能を有するデスモコリン2(DSC2)に対する抗体に関し、かつ、抗DSC2抗体のエフェクター機能を介してDSC2発現細胞を障害するための方法および組成物における抗体の使用に関する。なお本出願は、2005年5月12日に提出された米国特許仮出願第60/680,609号の恩典を主張し、その内容はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
肺癌は、最も一般的な致死的ヒト腫瘍の一つである。非小細胞肺癌(NSCLC)は最も一般的な病型であり、肺腫瘍の80%近くを占める(American Cancer Society, Cancer Facts and Figures 2001, Am. Chem. Soc. Atlanta, 2001(非特許文献1))。大半のNSCLCは進行期前には診断されないため、近年の多様式治療法の進歩にも関わらず、全体的な10年生存率は10%程度の低さのままである(Fry et al., Cancer 86:1867-76, 1999(非特許文献2))。現在、白金を用いた化学療法はNSCLCの基礎的療法であると考えられている。しかしながら薬剤による治療効果は、進行したNSCLC患者の生存をある程度延ばすことができる程度に留まっている(Non-small Cell Lung Cancer Collaborative Group, Bmj 311:899-909, 1995(非特許文献3))。チロシンキナーゼ阻害剤の使用を含む多数の標的療法が研究されている。しかしながらこれまでに、望ましい結果が達成された患者の数は限られており、一部の患者においては、治療効果には重篤な副作用を伴った(Kris et al., Proc Am Soc Clin Oncol 21: 292a (A1166), 2002(非特許文献4))。
本アプローチにおいて、癌細胞に特異的に結合する抗体に薬剤を結合させ、次に薬剤を癌細胞に特異的に作用させる。本方法によって、薬剤は癌細胞に集中的に作用し、したがって、強い副作用を有する薬剤であっても、少ない副作用で使用することができる。薬剤に加えて、薬剤の前駆体、該前駆体を活性型に代謝する酵素などを抗体に結合させるアプローチも報告されている。
本アプローチは、例えば増殖因子受容体または増殖因子に結合する抗体を用いて、増殖因子と癌細胞との結合を阻害する。癌細胞の一部は、増殖因子の活性に応じて増殖する。例えば、上皮細胞増殖因子(EGF)または血管内皮増殖因子(VEGF)依存性の癌が知られている。このような癌においては、増殖因子と癌細胞の結合を阻害することで治療効果が期待できる。
癌細胞のある種の抗原に結合する抗体は、癌細胞に対して細胞障害性を発揮する可能性がある。これらの種類の抗体は、それ自身が直接抗腫瘍効果を有する。癌細胞に対して細胞障害性を示す抗体は、腫瘍に対して高い効果が期待される抗体薬剤として注目されている。
定義
本明細書で用いる「1つの」、「ある」および「その」という用語は、特に明示する場合を除き、「少なくとも1つの」を意味する。
抗体依存性細胞媒介性細胞障害性(ADCC)とは、エフェクター細胞および抗体、特に、IgGクラス抗体の作用を介して標的細胞において引き起こされる細胞障害性反応を指す。従って、この効果を引き起こすために必要とされる抗体の量は極めて少なく、この細胞障害性機能は、腫瘍、自己免疫疾患等のように、弱い抗体産生反応しか引き起こされない場合に重要であると考えられる。ADCCは、抗体を使用した癌治療における重要な機序であることが公知である(Clynes RA, et al., Nature Med 6: 443-6, 2000)。例えば、ADCCは、抗CD20キメラ抗体を使用した癌の処置のための重要なエフェクター機序であることが報告されている(Cartron G, et al., Blood 99: 754-8, 2002)。従って、癌治療のために本発明を適用する場合、ADCCのエフェクター機能は、特に重要になる。
抗体-抗原複合体の抗体のFc領域は、補体系を活性化することが公知である。この系に関与している補体は、酵素反応、または他の活性化された補体との結合を通して連続的に活性化され、ヒスタミン放出の誘導、好中球およびマクロファージのための走化性因子としての作用、オプソニン作用等のような生物学的活性を示す分子を形成する。これらの活性化された分子のうち、C5b-9膜侵襲複合体(MAC)は、エフェクター細胞と無関係のウイルス粒子および細胞膜を障害する。MACは、細胞膜に対する強い結合親和性を発揮し、細胞膜に結合した分子は、孔を空け、細胞への水の流入および流出を容易にする。その結果、細胞膜が不安定になるか、または浸透圧の変化を通して細胞が破壊される。活性化された補体または補体の複合体によって引き起こされた生物学的活性は、補体系を活性化した抗原-抗体複合体の近傍の領域にのみ及ぶ。特に、抗体可変領域が結合している細胞を溶解する機能が、CDCとして定義される。
いくつかの抗体は、病原体の感染性および/または毒素の活性を奪う機能を有することが公知である。そのような病原体および毒素の中和は、抗体の抗原性可変領域と、病原体または毒素に含まれる抗原との結合を通して達成され得る。時に、ウイルスから感染性を奪うために、中和は、抗体媒介のみならず補体媒介も必要とすることが公知である。従って、治療等において補体媒介を必要とする中和活性を有する抗体を使用する場合には、補体系の活性化にとって不可欠なFc領域が、抗原性可変領域に加えて必要である。
抗体のエフェクター機能を使用して癌細胞を破壊するために必要とされる条件は、例えば、以下の通りである:
(a)標的癌細胞の膜表面における多数の抗原性分子の発現;
(b)標的癌性組織内の均一な抗原の分布;および
(c)抗体に結合した抗原の細胞表面における長時間の滞留。
本発明の一局面によると、以下のアミノ酸配列のうちのいずれかを有するポリペプチドが提供される:
FSSFGMH (SEQ ID NO: 26)、
YISSGSSTIYYADTVK (SEQ ID NO: 27)、
VHYYYFDY (SEQ ID NO: 28)、
KASQDINKYIA (SEQ ID NO: 29)、
YTSTLQP (SEQ ID NO: 30)、
LQYDNLW (SEQ ID NO: 31)、
DYSMH (SEQ ID NO: 32)、
WINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 33)、
WLLFDY (SEQ ID NO: 34)、
KSSQSLLNSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 35)、
FASTRES (SEQ ID NO: 36)、
QQHYSTPL (SEQ ID NO: 37)、
GNYWS (SEQ ID NO: 39)、
EINHSGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 40)、
VPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDV (SEQ ID NO: 41)、
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 44)、
GNSNRPS (SEQ ID NO: 45)、
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO: 46)、
GYFWS (SEQ ID NO: 49)、
EINHSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 50), GQGYYSSLDP (SEQ ID NO: 51)、SGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO: 53)、
SNNQRPS (SEQ ID NO: 54)、および
AAWDDSLNGVV (SEQ ID NO: 55)。
群1-1: VH CDR1としてFSSFGMH (SEQ ID NO: 26)、VH CDR2としてYISSGSSTIYYADTVK (SEQ ID NO: 27)、およびVH CDR3としてVHYYYFDY (SEQ ID NO: 28);
群1-2: VL CDR1としてKASQDINKYIA (SEQ ID NO: 29)、VL CDR2としてYTSTLQP (SEQ ID NO: 30)、およびVL CDR3としてLQYDNLW (SEQ ID NO: 31);
群2-1: VH CDR1としてDYSMH (SEQ ID NO: 32)、VH CDR2としてWINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 33)、およびVH CDR3としてWLLFDY (SEQ ID NO: 34);
群2-2: VL CDR1としてKSSQSLLNSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 35)、VL CDR2としてFASTRES (SEQ ID NO: 36)、およびVL CDR3としてQQHYSTPL (SEQ ID NO: 37);
群3-1: VH CDR1としてGNYWS (SEQ ID NO: 39)、VH CDR2としてEINHSGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 40)、およびVH CDR3としてVPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDV (SEQ ID NO: 41);
群3-2: VL CDR1としてTGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 44)、VL CDR2としてGNSNRPS (SEQ ID NO: 45)、およびVL CDR3としてQSYDSSLSGWV (SEQ ID NO: 46);
群4-1: VH CDR1としてGYFWS (SEQ ID NO: 49)、VH CDR2としてEINHSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 50)、およびVH CDR3としてGQGYYSSLDP (SEQ ID NO: 51); ならびに
群4-2: VL CDR1としてSGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO: 53)、VL CDR2としてSNNQRPS (SEQ ID NO: 54)、およびVL CDR3としてAAWDDSLNGVV (SEQ ID NO: 55)。
MDSRLNLVFLVLILKGVQCDVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARVHYYYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 20)、
MRPSIQFLGLLLFWLHGAQCDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLWTFGGGTKL (SEQ ID NO: 21)、
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARWLLFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 22)、
MESQTQVLMFLLLWVSGACADIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPLTFGAGTKL (SEQ ID NO: 23)、
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGNYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGNTKYNPSLKSRVAISADTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 16)、
HVILTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVPG (SEQ ID NO: 17)、
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYFWSWIRQAPGKGLEWIGEINHSGSTSYNPSLKSRVTMTIDTSRKQFSLKLSSVTAADAAVYYCARGQGYYSSLDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 18)、および
SYELTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTKLTVLG (SEQ ID NO: 19)。
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(d)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リジン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、トレオニン(T);および
8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins, 1984参照)。
(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;
(iii) ペプチド合成、丸善、1975;
(iv) ペプチド合成の基礎と実験、丸善、1985;
(v) 続医薬品の開発、第14巻 (ペプチド合成), 広川書店, 1991;
(vi) 国際公開公報第99/67288号; および
(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, “Solid Phase Peptide Synthesis”, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
本発明の一局面として、本発明のポリペプチドは、抗体であり得る。本発明の抗体は、免疫グロブリンの任意のクラスまたはサブクラスに属し得る。IgG1クラス抗体は、ADCCおよびCDCの両方を誘発し、このクラスの抗体の非特異的結合は、免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスの中でも最も低いと考えられているため、IgG1クラス抗体が、本発明のために特に好ましい。
群1: VH CDR1としてFSSFGMH (SEQ ID NO: 26)、VH CDR2としてYISSGSSTIYYADTVK (SEQ ID NO: 27)、およびVH CDR3としてVHYYYFDY (SEQ ID NO: 28)、VL CDR1としてKASQDINKYIA (SEQ ID NO: 29)、VL CDR2としてYTSTLQP (SEQ ID NO: 30)、およびVL CDR3としてLQYDNLW (SEQ ID NO: 31);
群2: VH CDR1としてDYSMH (SEQ ID NO: 32)、VH CDR2としてWINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 33)、VH CDR3としてWLLFDY (SEQ ID NO: 34); VL CDR1としてKSSQSLLNSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 35)、VL CDR2としてFASTRES (SEQ ID NO: 36)、およびVL CDR3としてQQHYSTPL (SEQ ID NO: 37);
群3: VH CDR1としてGNYWS (SEQ ID NO: 39)、VH CDR2としてEINHSGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 40)、VH CDR3としてVPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDV (SEQ ID NO: 41)、VL CDR1としてTGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 44)、VL CDR2としてGNSNRPS (SEQ ID NO: 45)、およびVL CDR3としてQSYDSSLSGWV (SEQ ID NO: 46); または
群4: VH CDR1としてGYFWS (SEQ ID NO: 49)、VH CDR2としてEINHSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 50)、VH CDR3としてGQGYYSSLDP (SEQ ID NO: 51)、VL CDR1としてSGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO: 53)、VL CDR2としてSNNQRPS (SEQ ID NO: 54)、およびVL CDR3としてAAWDDSLNGVV (SEQ ID NO: 55)。
MDSRLNLVFLVLILKGVQCDVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARVHYYYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 20) および
MRPSIQFLGLLLFWLHGAQCDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLWTFGGGTKL (SEQ ID NO: 21);
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARWLLFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 22) および
MESQTQVLMFLLLWVSGACADIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPLTFGAGTKL (SEQ ID NO: 23);
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGNYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGNTKYNPSLKSRVAISADTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 16) および
HVILTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVPG (SEQ ID NO: 17); または
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYFWSWIRQAPGKGLEWIGEINHSGSTSYNPSLKSRVTMTIDTSRKQFSLKLSSVTAADAAVYYCARGQGYYSSLDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 18) および
SYELTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTKLTVLG (SEQ ID NO: 19)。
さらに、本発明は、抗体を含む、上記の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリペプチドをコードする限り、mRNA、RNA、cDNA、ゲノムDNA、化学合成されたポリヌクレオチドなどを含む如何なる形態の本発明のポリヌクレオチドを用いてもよい。得られる物質が目的の本発明のポリペプチドまたはその同等物をコードする限り、本発明のポリヌクレオチドには、所与のヌクレオチド配列およびその縮重配列を含むものが含まれる。
FSSFGMH (SEQ ID NO: 26)、
YISSGSSTIYYADTVK (SEQ ID NO: 27)、
VHYYYFDY (SEQ ID NO: 28)、
KASQDINKYIA (SEQ ID NO: 29)、
YTSTLQP (SEQ ID NO: 30)、
LQYDNLW (SEQ ID NO: 31)、
DYSMH (SEQ ID NO: 32)、
WINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 33)、
WLLFDY (SEQ ID NO: 34)、
KSSQSLLNSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 35)、
FASTRES (SEQ ID NO: 36)、
QQHYSTPL (SEQ ID NO: 37)、
GNYWS (SEQ ID NO: 39)、
EINHSGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 40)、
VPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDV (SEQ ID NO: 41)、
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 44)、
GNSNRPS (SEQ ID NO: 45)、
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO: 46)、
GYFWS (SEQ ID NO: 49)、
EINHSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 50)、
GQGYYSSLDP (SEQ ID NO: 51)、
SGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO: 53)、
SNNQRPS (SEQ ID NO: 54)、および
AAWDDSLNGVV (SEQ ID NO: 55)。
群1-1: VH CDR1としてFSSFGMH (SEQ ID NO: 26)、VH CDR2としてYISSGSSTIYYADTVK (SEQ ID NO: 27)、およびVH CDR3としてVHYYYFDY (SEQ ID NO: 28);
群1-2: VL CDR1としてKASQDINKYIA (SEQ ID NO: 29)、VL CDR2としてYTSTLQP (SEQ ID NO: 30)、およびVL CDR3としてLQYDNLW (SEQ ID NO: 31);
群2-1: VH CDR1としてDYSMH (SEQ ID NO: 32)、VH CDR2としてWINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 33)、およびVH CDR3としてWLLFDY (SEQ ID NO: 34);
群2-2: VL CDR1としてKSSQSLLNSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 35)、VL CDR2としてFASTRES (SEQ ID NO: 36)、およびVL CDR3としてQQHYSTPL (SEQ ID NO: 37);
群3-1: VH CDR1としてGNYWS (SEQ ID NO: 39)、VH CDR2としてEINHSGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 40)、およびVH CDR3としてVPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDV (SEQ ID NO: 41);
群3-2: VL CDR1としてTGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 44)、VL CDR2としてGNSNRPS (SEQ ID NO: 45)、およびVL CDR3としてQSYDSSLSGWV (SEQ ID NO: 46);
群4-1: VH CDR1としてGYFWS (SEQ ID NO: 49)、VH CDR2としてEINHSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 50)、およびVH CDR3としてGQGYYSSLDP (SEQ ID NO: 51); ならびに
群4-2: VL CDR1としてSGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO: 53)、VL CDR2としてSNNQRPS (SEQ ID NO: 54)、およびVL CDR3としてAAWDDSLNGVV (SEQ ID NO: 55)。
本発明はまた、本発明の上記のポリヌクレオチドが内部に挿入されたベクターも提供する。本発明のベクターは、本発明のポリヌクレオチド、特にDNAを宿主細胞中で維持するため、本発明のポリペプチドを発現させるため、または遺伝子治療用に本発明のポリヌクレオチドを投与するために有用である。
本発明は、抗DSC2抗体が、抗体エフェクター機能を通してDSC2発現細胞を障害する(即ち、細胞を死滅させるか、細胞に対して毒性であるか、またはさもなくば細胞の増殖もしくは***を阻害する)、抗DSC2抗体を活性成分として含む薬学的組成物を提供する。
本発明はまた、DSC2発現細胞を障害するための方法を提供する。具体的には、本方法は、DSC2発現細胞と抗DSC2抗体とを接触させる段階を含む。抗体の接触を通して、細胞は、抗体のエフェクター機能によって障害されることが予想される。
1) DSC2に結合する抗体を癌患者に投与する段階;および
2) 患者の癌細胞に結合した抗体のエフェクター機能によってこれらの細胞を障害する段階。
本発明により、抗DSC2抗体の投与が、抗体のエフェクター機能を通して、癌細胞を障害することが発見された。従って、本発明者らは、エフェクター機能を有するDSC2抗体を誘導する組成物は、エフェクター機能を有する抗体を含む本発明の薬学的組成物と等しい治療効果を有すると考えた。そのような予防接種効果は、DSC2ポリペプチドまたは該ポリペプチドを発現する核酸分子を投与することによって達成され得ると予想される。従って、本発明は、DSC2発現細胞に対する少なくとも一つのエフェクター機能を有する抗体をインビボで誘導するための免疫原性組成物を提供する。本組成物は、典型的には、DSC2ポリペプチドまたは該ポリペプチドを発現する核酸分子を、活性成分として含む。ポリペプチドまたは核酸分子は、単離または精製された物質であることが好ましい。
更に本発明は、インビボにおいてDSC2発現細胞に対する少なくとも一つのエフェクター機能を有する抗体を誘導する方法を提供する。詳細には、本方法は、上述した本発明の免疫原性組成物を対象に投与する段階を含む。例えば、本発明の免疫原性組成物を、一日あたり0.1 mg〜250 mg/kgで、経口または非経口的に投与することができる。非経口投与には、皮下注射および静脈注射が含まれる。成人1人あたりの投与量は、通常、5 mg〜17.5 g/日、好ましくは5 mg〜10 g/日、およびより好ましくは100 mg〜3 g/日である。
以下、実施例に基づいて本発明をさらに説明する。しかし、本明細書記載の材料、方法などは、単に本発明の局面を説明するものであり、決して本発明の範囲を制限することを意図するものではない。よって、本明細書記載の方法および材料などと類似したまたは同等である材料および方法などを、本発明の実施または試行において使用してもよい。
ヒトの肺癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、および肝臓癌の細胞系を、10%ウシ胎仔血清を添加した適切な培地中で、単層として増殖させた。実験に用いた細胞系を表1に示す。
*2 ダルベッコ改変イーグル培地
*3 イーグル最低必須培地
*4 ライボビッツL-15培地
*5 マッコイ改変5A培地
*6 東北大学 加齢医学研究所 医用細胞資源センター
非小細胞肺癌(NSCLC): NCI-H358;
結腸腺癌: HT-29;
膵臓癌: KLM-1;
前立腺癌: LNCap FGC;
乳管癌: T47D;
胃管腺癌: MKN-7;および
肝細胞癌(HCC): HepG2。
(2-1) ポリクローナル抗体
標準のプロトコールに従い、細菌内で発現させたHisタグ付加融合タンパク質を免疫原として用いて、個々のタンパク質特異的ポリクローナル抗体を産生させた。これらの融合タンパク質は、該タンパク質の特異的部分(144〜540残基)に相当するタンパク質部分を含んだ。
まず、モノクローナル抗体を入手するため、それぞれDSC2のドメイン(アミノ酸1〜901に相当する)および細胞外ドメイン(即ち、アミノ酸1〜688に相当する分泌型抗原DSC2-s)をコードする抗原コーディング遺伝子を、正常な肺cDNAから増幅した。プライマーは、以下のように設計された:
DSC2に対して
5'-AATATTAATTAACTCCATGGAGGCAGCCC-3' (SEQ ID NO: 5) および
5'-ATCGGGATCCTCTCTTCATGCATGCTTCTGCTA-3' (SEQ ID NO: 6);
DSC2-sに対して
5'-AATATTAATTAACTCCATGGAGGCAGCCC-3' (SEQ ID NO: 5) および
5'-AATAGGATCCTCCACCGCCAATCC-3' (SEQ ID NO: 7)。
それぞれ、マウスモノクローナル抗体48-5およびs10-4に基づくヒト化キメラ抗体ch48-5およびchs10-4を、以前に報告された方法(Alvin Y Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA 84: 3439-43, 1987;Mitchel E Reff et al., Blood 83(2): 435-45, 1994)に従って調製した。具体的には、RNeasy Mini Kit(QIAGEN, 74104)によって、マウス48-5またはs10-4ハイブリドーマ細胞から全RNAを抽出し、次いで、GenenRacer(商標)キット(Invitrogen, L1502-02)を使用して、一本鎖cDNAへと逆転写した。鋳型としてのこのcDNAおよび以下のプライマーセットを使用したPCRによって、抗体の可変領域(Fab)をコードする遺伝子を決定した:
5'プライマー: GeneRacer(商標)キットの5'プライマー ; ならびに
3'プライマー: CH1(IgG2a)に対する5'-AATTTTCTTGTCCACCTTGGTG-3' (SEQ ID NO: 24) および
CL1(κ)に対する5'-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCT-3' (SEQ ID NO: 25)。
入手された産物を、クローニングし、配列分析に供した。
48-5のH鎖可変領域: MDSRLNLVFLVLILKGVQCDVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARVHYYYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 20)、および
L鎖可変領域: MRPSIQFLGLLLFWLHGAQCDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLWTFGGGTKL (SEQ ID NO: 21); ならびに
s10-4のH鎖可変領域: MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARWLLFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 22)、および
L鎖可変領域: MESQTQVLMFLLLWVSGACADIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPLTFGAGTKL (SEQ ID NO: 23)。
(i)培養細胞を使用したファージ発現ライブラリのスクリーニング
DSC2に対するヒトscFV抗体のスクリーニングを、抗体研究所(IFA;名古屋、日本)において作製されたヒトscFV抗体をコードするファージライブラリを使用して達成した。具体的には、DSC2に対するヒトscFV抗体のスクリーニングが、JP-A 2005-185281に記載された方法に従い、ヒトscFV抗体をコードするファージライブラリAIMS4(WO 01/062907)を使用して実施された。
スクリーニングされた大腸菌を希釈し、100μg/mlのアンピシリンが補足された寒天培地上で培養した。入手されたコロニーを選出し、2×YTGA培地中で30℃で一晩インキュベートした。
フローサイトメトリー分析により、ヒトscFV抗体の二つのクローンである、クローン332および545が、抗原に陽性に反応することが確認された。これらの二つのクローンは、以下のアミノ酸配列からなっていた:
クローン332の重鎖: QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGNYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGNTKYNPSLKSRVAISADTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:16)、および軽鎖: HVILTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVPG (SEQ ID NO:17); ならびに
クローン545の重鎖: QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYFWSWIRQAPGKGLEWIGEINHSGSTSYNPSLKSRVTMTIDTSRKQFSLKLSSVTAADAAVYYCARGQGYYSSLDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:18)、および軽鎖: SYELTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTKLTVLG (SEQ ID NO:19)。
これらのヒトscFV抗体は、IFAにおいて完全なIgG型に変換された。
全RNAはRNeasy(登録商標)キット(QIAGEN)を用いて細胞系から抽出した。さらに、、オリゴ(dT)-セルロースカラム(Amersham Biosciences)によって全RNAからmRNAを精製し、SuperScript First-Strand Synthesis System (Invitrogen)を用いて、逆転写(RT)によってファーストストランドcDNAへと変換した。GAPDHを定量対照としてモニタリングすることにより、その後のPCR増幅のために各ファーストストランドcDNAの適切な希釈物を調製した。用いたプライマー配列は以下の通りである:
DSC2に対して
5'-GTGCCTGTCTTCAATTCACAA-3' (SEQ ID NO:8) および
5'-TCTGATTCAGGGAGTGCGAA-3' (SEQ ID NO:9)、
c-erbB2に対して
5'-GTATTTGATGGTGACCTGGGAAT-3' (SEQ ID NO:10) および
5'-CCCCTGGGTCTTTATTTCATCT-3' (SEQ ID NO:11)、
GAPDHに対して
5'-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3' (SEQ ID NO:12) および
5'-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3' (SEQ ID NO:13)、ならびに
β-アクチンに対して
5'-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3' (SEQ ID NO:14) および
5'-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3' (SEQ ID NO:15)。
癌細胞(5×106個)を、精製されたポリクローナル抗体(pAb:BB049)、モノクローナル抗体(mAb)、ウサギIgG(pAbの対照)、またはマウスIgG(mAbの対照)と共に4℃で30分間インキュベートした。細胞を、リン酸緩衝液(PBS)により洗浄し、次いでFITC標識Alexa Fluor 488の中で4℃で30分間インキュベートした。細胞をPBSで再び洗浄し、フローサイトメーター(FACSCalibur(登録商標), Becton Dickinson)で分析し、次いで、BD CellQuest(商標)Proソフトウェア(Becton Dickinson)によって分析した。平均蛍光強度(MFI)を、フローサイトメトリー強度の比率(各タンパク質特異的抗体による強度/ウサギIgGによる強度)として定義した。
標的細胞を、37℃で30分間、0.8μMのカルセインアセトキシメチルエステル(カルセイン-AM、DOJINDO)に曝露した。カルセイン-AMは、蛍光性誘導体カルセインを産生する細胞性エステラーゼによるカルセイン-AMの開裂後に、蛍光性となる。アッセイ法に加える前に標的癌細胞を2回洗浄し、その後、96ウェルU底プレートに播種した(4×103細胞/ウェル)。ヒト末梢血単核細胞(PMBC)を健常人から採取し、Ficoll-Paque(Amersham Biosciences)密度勾配遠心分離により分離し、その後、エフェクター細胞として使用した。BB049抗DSC2ポリクローナル抗体(2μg/ウェル)または対照抗体Herceptin(2μg/ウェル;Roche)と共に、標的癌細胞(T)およびエフェクター細胞(E)を、様々なE:T比(200:1、100:1、50:1、25:1、12.5:1、および6.25:1)で、96ウェルプレート内、AIM-V培地250μl中で同時インキュベーションした。このインキュベーションは、250μLのAIM-V培地(Life Technologies, Inc)中で、37℃で6時間、3通り行った。対照アッセイ法には、抗DSC2ポリクローナル抗体BB049またはエフェクター細胞のみと標的細胞とのインキュベーションを含んだ。Herceptinは、いくつかの実験における対照として用いた。
本発明は、抗体の細胞障害性を利用することにより、DSC2発現細胞を障害することができるとの発見に、少なくとも一部基づくものである。DSC2遺伝子の強い発現は、肺癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、および肝臓癌において、本発明者らによって同定された。本明細書において、肺癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、および肝臓癌の細胞系に対する抗DSC2抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞障害性(ADCC)の効果を証明する結果が提示されている。従って、本発明の抗体、組成物、および方法は、DSC2発現に関連する疾患、例えば、肺癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、および肝臓癌を処置するための新規のアプローチを提供する。
Claims (25)
- エフェクター機能を示す、デスモコリン2(DSC2)に対する抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項1記載の抗体。
- IgG1である、請求項1記載の抗体。
- エフェクター機能が、抗体依存性細胞障害性もしくは補体依存性細胞障害性のいずれかまたは両方である、請求項1記載の抗体。
- 相補性決定領域(CDR)が、
群1: VH CDR1としてFSSFGMH (SEQ ID NO: 26)、VH CDR2としてYISSGSSTIYYADTVK (SEQ ID NO: 27)、およびVH CDR3としてVHYYYFDY (SEQ ID NO: 28)、VL CDR1としてKASQDINKYIA (SEQ ID NO: 29)、VL CDR2としてYTSTLQP (SEQ ID NO: 30)、およびVL CDR3としてLQYDNLW (SEQ ID NO: 31) ;
群2: VH CDR1としてDYSMH (SEQ ID NO: 32)、VH CDR2としてWINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 33)、VH CDR3としてWLLFDY (SEQ ID NO: 34)、VL CDR1としてKSSQSLLNSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 35)、VL CDR2としてFASTRES (SEQ ID NO: 36)、およびVL CDR3としてQQHYSTPL (SEQ ID NO: 37) ;
群3: VH CDR1としてGNYWS (SEQ ID NO: 39)、VH CDR2としてEINHSGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 40)、VH CDR3としてVPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDV (SEQ ID NO: 41)、VL CDR1としてTGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 44)、VL CDR2としてGNSNRPS (SEQ ID NO: 45)、およびVL CDR3としてQSYDSSLSGWV (SEQ ID NO: 46) ; ならびに
群4: VH CDR1としてGYFWS (SEQ ID NO: 49)、VH CDR2としてEINHSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 50)、VH CDR3としてGQGYYSSLDP (SEQ ID NO: 51)、VL CDR1としてSGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO: 53)、VL CDR2としてSNNQRPS (SEQ ID NO: 54)、およびVL CDR3としてAAWDDSLNGVV (SEQ ID NO: 55)
からなる群より選択され、CDR1、CDR2、およびCDR3が、フレームワークアミノ酸配列によって分離される、請求項1記載の抗体。 - 請求項1記載の抗体または該抗体をコードするポリヌクレオチドを活性成分として含む、DSC2発現細胞を障害するための薬学的組成物。
- DSC2発現細胞が、肺癌、大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、または肝臓癌の細胞からなる群より選択される、請求項6記載の薬学的組成物。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項6記載の薬学的組成物。
- 抗体がIgG1である、請求項6記載の薬学的組成物。
- 抗体のエフェクター機能が、抗体依存性細胞障害性もしくは補体依存性細胞障害性のいずれかまたは両方である、請求項6記載の薬学的組成物。
- 抗体のCDRが、
群1: VH CDR1としてFSSFGMH (SEQ ID NO: 26)、VH CDR2としてYISSGSSTIYYADTVK (SEQ ID NO: 27)、およびVH CDR3としてVHYYYFDY (SEQ ID NO: 28)、VL CDR1としてKASQDINKYIA (SEQ ID NO: 29)、VL CDR2としてYTSTLQP (SEQ ID NO: 30)、およびVL CDR3としてLQYDNLW (SEQ ID NO: 31);
群2: VH CDR1としてDYSMH (SEQ ID NO: 32)、VH CDR2としてWINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 33)、VH CDR3としてWLLFDY (SEQ ID NO: 34); VL CDR1としてKSSQSLLNSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 35)、VL CDR2としてFASTRES (SEQ ID NO: 36)、およびVL CDR3としてQQHYSTPL (SEQ ID NO: 37);
群3: VH CDR1としてGNYWS (SEQ ID NO: 39)、VH CDR2としてEINHSGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 40)、VH CDR3としてVPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDV (SEQ ID NO: 41)、VL CDR1としてTGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 44)、VL CDR2としてGNSNRPS (SEQ ID NO: 45)、およびVL CDR3としてQSYDSSLSGWV (SEQ ID NO: 46); ならびに
群4: VH CDR1としてGYFWS (SEQ ID NO: 49)、VH CDR2としてEINHSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 50)、VH CDR3としてGQGYYSSLDP (SEQ ID NO: 51)、VL CDR1としてSGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO: 53)、VL CDR2としてSNNQRPS (SEQ ID NO: 54)、およびVL CDR3としてAAWDDSLNGVV (SEQ ID NO: 55)
からなる群より選択され、CDR1、CDR2、およびCDR3が、フレームワークアミノ酸配列によって分離される、請求項6記載の薬学的組成物。 - ポリヌクレオチドがベクターに含まれる、請求項6記載の薬学的組成物。
- 以下の段階を含む、DSC2発現細胞を障害するための方法:
a)DSC2発現細胞を請求項1記載の抗体と接触させる段階;および
b)DSC2発現細胞に結合した抗体のエフェクター機能によって該細胞を障害する段階。 - DSC2、その免疫学的活性断片、またはDSC2もしくはその免疫学的活性断片を発現するポリヌクレオチドを有効成分として含む、対象におけるDSC2発現細胞に対するエフェクター機能を有する抗体を誘導するための免疫原性組成物。
- DSC2、その免疫学的活性断片、またはDSC2もしくはその免疫学的活性断片を発現する細胞もしくはポリヌクレオチドを対象に投与する段階を含む、対象におけるDSC2発現細胞に対するエフェクター機能を有する抗体の産生を誘導するための方法。
- 以下の群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むポリペプチド:
FSSFGMH (SEQ ID NO: 26)、
YISSGSSTIYYADTVK (SEQ ID NO: 27)、
VHYYYFDY (SEQ ID NO: 28)、
KASQDINKYIA (SEQ ID NO: 29)、
YTSTLQP (SEQ ID NO: 30)、
LQYDNLW (SEQ ID NO: 31)、
DYSMH (SEQ ID NO: 32)、
WINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 33)、
WLLFDY (SEQ ID NO: 34)、
KSSQSLLNSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 35)、
FASTRES (SEQ ID NO: 36)、
QQHYSTPL (SEQ ID NO: 37)、
GNYWS (SEQ ID NO: 39)、
EINHSGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 40)、
VPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDV (SEQ ID NO: 41)、
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 44)、
GNSNRPS (SEQ ID NO: 45)、
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO: 46)、
GYFWS (SEQ ID NO: 49)、
EINHSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 50)、
GQGYYSSLDP (SEQ ID NO: 51)、
SGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO: 53)、
SNNQRPS (SEQ ID NO: 54)、および
AAWDDSLNGVV (SEQ ID NO: 55)。 - 抗体である、請求項16記載のポリペプチド。
- 以下の群
群1-1: VH CDR1としてFSSFGMH (SEQ ID NO: 26)、VH CDR2としてYISSGSSTIYYADTVK (SEQ ID NO: 27)、およびVH CDR3としてVHYYYFDY (SEQ ID NO: 28);
群1-2: VL CDR1としてKASQDINKYIA (SEQ ID NO: 29)、VL CDR2としてYTSTLQP (SEQ ID NO: 30)、およびVL CDR3としてLQYDNLW (SEQ ID NO: 31);
群2-1: VH CDR1としてDYSMH (SEQ ID NO: 32)、VH CDR2としてWINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 33)、およびVH CDR3としてWLLFDY (SEQ ID NO: 34);
群2-2: VL CDR1としてKSSQSLLNSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 35)、VL CDR2としてFASTRES (SEQ ID NO: 36)、およびVL CDR3としてQQHYSTPL (SEQ ID NO: 37);
群3-1: VH CDR1としてGNYWS (SEQ ID NO: 39)、VH CDR2としてEINHSGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 40)、およびVH CDR3としてVPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDV (SEQ ID NO: 41);
群3-2: VL CDR1としてTGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 44)、VL CDR2としてGNSNRPS (SEQ ID NO: 45)、およびVL CDR3としてQSYDSSLSGWV (SEQ ID NO: 46);
群4-1: VH CDR1としてGYFWS (SEQ ID NO: 49)、VH CDR2としてEINHSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 50)、およびVH CDR3としてGQGYYSSLDP (SEQ ID NO: 51); ならびに
群4-2: VL CDR1としてSGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO: 53)、VL CDR2としてSNNQRPS (SEQ ID NO: 54)、およびVL CDR3として AAWDDSLNGVV (SEQ ID NO: 55)
におけるVH鎖およびVL鎖のいずれかの相補性決定領域(CDR)として上記アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、CDR1、CDR2、およびCDR3が、フレームワークアミノ酸配列によって分離される、請求項17記載のポリペプチド。 - 抗体が、SEQ ID NO: 20または22のマウスVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 21または23のマウスVLアミノ酸配列を含む、請求項17記載のポリペプチド。
- 抗体が、SEQ ID NO: 16または18のヒトVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 17または19のヒトVLアミノ酸配列を含む、請求項17記載のポリペプチド。
- 抗体がヒトIgG1のFc領域を更に含む、請求項17記載のポリペプチド。
- 請求項16記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
- 請求項22記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項22記載のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含むベクターを含む、宿主細胞。
- ポリペプチドを発現する細胞を培養する段階、および、細胞培養物からポリペプチドを収集する段階を含む、請求項16記載のポリペプチドを産生する方法。
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