JP2007526761A - 循環性の腫瘍細胞および内皮細胞の検出のための血液試験のプロトタイプおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2003年10月31日出願の米国仮特許出願番号60/516,571(これより、優先権が求められる)の利益を主張する。この仮特許出願は、本明細書において参考として援用される。
(1.発明の分野)
本発明は、血液または他の組織流体サンプル(例えば、腹水、擦過標本および塗抹標本)由来の標的細胞(例えば、腫瘍細胞、胎児細胞、および血管由来の細胞)を分離するための改善された細胞接着マトリックス(「CAM」)および改善された細胞単離デバイスに関する。より詳細には、本発明は、選択的に細胞(例えば、転移の可能性を有する標的癌細胞および/または浸潤突起(invadopodia)を示す内皮前駆細胞)を単離するために使用され得るCAMシステムに関する。
(循環性腫瘍細胞(CTC)および癌の検出)
内皮組織の悪性腫瘍は、癌の最も一般的な形態であり、そして癌に関連する死の主な原因である。これらの腫瘍の外科的処置における進歩に起因して、死亡率は、多くの場合初期診断時には隠れている初期転移および再発に関連するようになってきている(非特許文献1;非特許文献2)。例えば、膵臓および他の胃腸(GI)器官の離れた解剖的位置は、隣接する構造を浸潤して1cmより大きな腫瘍へと成長する前に膵臓癌および他のGI癌が検出される可能性を低くしている(非特許文献3;非特許文献4;非特許文献5;非特許文献6;非特許文献7;非特許文献8;非特許文献2;非特許文献9;非特許文献10)。乳癌に関してでさえ、マンモグラフィーによって検出される乳癌の小腫瘍(<1cm)の12〜37%が診断時に転移していた(非特許文献11;非特許文献12)。
内皮細胞障害は、アテローム斑発生についての重要な刺激である(非特許文献25)。末梢血、骨髄、および臍帯血の単核細胞画分から単離され得る循環性内皮前駆細胞(「CEC」)は、内皮細胞障害の指標として同定されている(非特許文献26;非特許文献27)。研究室での証拠は、これらの細胞が多くの内皮特異的細胞表面マーカーを発現し、そして多くの内皮の特性を示すことを示唆する。これらの細胞が虚血を有する動物モデルに注入される場合、これらが迅速に新脈管形成部位に取り込まれることが記載されている。
血中に循環する腫瘍細胞および内皮前駆細胞(細胞の異種性供給源)は、まれである。これらの細胞は、分析のために分離することが困難である可能性がある。癌患者において、血中のCTCまたは剥脱した異常細胞(新生物細胞)の数は、一般的に、非新生物細胞の数と比較して非常に少ない。したがって、慣習的な細胞病理学による剥脱した異常細胞の検出は、多くの場合限りがある。さらに、剥脱した細胞は、しばしば、高度に異種性であり、多くの異なる細胞型から構成されている(興味深いことに、剥脱した細胞において示差的に発現されることが最初に報告されていた多くの遺伝子は、実際は、代わりに非腫瘍細胞によって発現されていたことがわかった)。この異種性の問題と合わせて、各臨床標本中に存在する新生物細胞の頻度は様々であり、ランダムに混合された集団中の示差的な遺伝子発現の定量を偏らせ、そして複雑にする。アポトーシス細胞および新生物細胞は、一般により大きな腫瘍、末梢血および腹水の中にある。これらの細胞は、質の高いRNAを含まず、したがって、分子分析のためには技術的な問題が存在する(非特許文献19)。
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一実施形態において、疾患のスクリーニング、診断、評価、予後判定および管理に使用するために、血液サンプルまたは他の流体サンプル中の特定の生存標的細胞を単離するためのCAMが提供される。
本発明は、疾患(例えば、癌および心血管疾患)の、および出生前診断における、スクリーニング、診断および管理のための、患者から採られた流体サンプル中の標的細胞の単離および検出に関する
患者から採られた流体サンプルからの標的細胞の単離は、本方法によって促進される。このような細胞の単離は、このような細胞に関連する疾患状態を管理することに有用であり得る。例えば、患者から採られた血液サンプルにおける腫瘍細胞および内皮細胞の同定は、転移性の癌および心血管疾患をそれぞれ示す。したがって同様に、妊娠雌の血液中に存在する胎児細胞は、単離され得、そして胎児に関する疾患の出生前診断に使用され得る。
CAM細胞濃縮の腫瘍細胞および内皮細胞の分離戦略は、過去10年間(AoyamaおよびChen,1990;ChenおよびChen,1987;Chenら,1994a;Chenら,1984;Chenら,1994b;Chen,1996;Chen,1989;ChenおよびWang,1999;Ghersiら,2002;GoldsteinおよびChen,2000;Goldsteinら,1997;Kellyら,1994;Monskyら,1994;Monskyら,1993;Muellerら,1999;MuellerおよびChen,1991;Muellerら,1992;Nakaharaら,1996;Nakaharaら,1998;Nakaharaら,1997;Pavlakiら,2002;Pineiro−Sanchezら,1997;Sagaら,1988;Zuckerら,2000;Zukowska−Grojecら,1998)に詳細に特徴付けられたような、材料に対する接着性の表現型の挙動に基づいて標的細胞を捕獲する、機能的濃縮手順を使用する工程を包含する。浸潤突起を有する細胞(「浸潤突起性細胞(invadopodic cell)」)が、血管の微小環境を模倣するマトリックスに、特に摂動状態で、強い親和性で結合することが見出されている。浸潤突起の挙動に基づいて、生存転移性腫瘍細胞および脈管形成性内皮細胞について高度に選択的であり、かつ白血球/単球および赤血球のうちのいくつかを捕獲し、そして他の細胞型を溶液中に残す、機能的細胞濃縮工程が、設計され得る。CAM細胞濃縮アッセイは、白血球共通抗原CD45に対して指向する抗体を用いた負の同定/選択手順をさらに包含し得る。
CAM開始細胞単離デバイスは、多数の設計(例えば、細胞培養チャンバースライド、培養用マイクロタイタープレート、または培養フラスコなど)を備え得る。
(血液由来のCTCおよびCEC)
全血は、CAM血液収集ユニット(例えば、採血管(図2および図3))中に置かれ得る。このチューブは約37℃でインキュベートされ得、血流を模倣して、細胞とCAMとの間の接触を増加させるように回転され得る。血液は、CAM血液試験ユニット中での凝固を防ぐために、抗凝固剤(すなわちAnticoagulant Citrate Dextrose溶液USP(ACD,Baxter Healthcare Corporation,Deerfield,IL)+50単位のヘパリンリチウム/mE)の存在下で回収され得る。密封したCAM血液チューブはローラー上に配置され得、約37℃で5〜30サイクル/分で回転され得、次いで細胞の接着が起こるように1〜3時間インキュベートされ得る。
(特異性および感受性のコントロール)
種々の腫瘍起源のヒト腫瘍細胞株が、特異性および感受性のコントロール実験の実施において使用するために選択され得る。例えば、ヒト結腸腫瘍細胞株SW−480、ヒト胃腫瘍細胞株RF−48、数種の***腫瘍細胞株、ヒト悪性黒色腫株LOX、および数種の卵巣腫瘍細胞株が使用され得る。腫瘍細胞株は、American Type Culture Collection(Manassas,VA)から譲渡され得る。全ての細胞株は、マイコプラズマ感染に関して陰性であることが確認されるべきである。腫瘍細胞株は、以下について検査されるべきである:(a)プレートから1時間以内でのCAMへの高親和性の結合;(b)高い増殖率;および(c)腫瘍細胞株は、濃縮手順の最後に腫瘍細胞を直接的に可視化させることができるように、使用前に、容易にかつ安定して(100%)赤色もしくは緑色蛍光染料で蛍光標識されるべきであるか、または緑色蛍光タンパク質(GFP)に関する発現プラスミドで形質転換されるべきである。コントロールの正常血液は、その比較効率を評価するため、既知の数の、蛍光標識されているかまたはGFPを発現する蛍光ヒト腫瘍細胞とともに播種され、そしてCAM細胞濃縮法に供される。
(CAM血液濾過ユニットにおける細胞生存度の決定)
(v.採血管)
別の問題は、血液サンプルの細胞生存度である。この生存度は、研究の実験室への移送の間に変動し得る。保存期間の延長がその血液中の細胞を損傷することが予測され得る。CAM血液ユニット中の腫瘍細胞が輸送の間に生存状態いることができるか否かを決定するため、3,000個のGFP−腫瘍細胞を3mLの臍帯血中および15%ヒト血清(Sigma)を含むコントロール培地中にスパイクした。各アリコートを4℃で一連の時間(4、6、8、12、16、24、36および48時間)保存した。次いで、各アリコートをCAMによって捕獲し、CAMによるGFP−腫瘍細胞の回収%を決定した。各時点について、4種の重複した実験を行い、会衆%を決定した。この結果は、CAMで捕獲された腫瘍細胞が血中の浮遊細胞よりも良好に生存することを示した。
臨床研究において、標識された腫瘍細胞は、侵襲性腫瘍細胞を検出するためにFITC標識コラーゲン(緑)を用い、白血球を検出および除外するためにPE標識された抗CD45白血球共通抗原抗体(赤)を用い、そして死細胞を除外するために7−AADを用いた、マルチパラメーターフローサイトメトリー細胞分析機で測定され得る。この自動細胞分析は、例えば、上皮、内皮および造血性抗原に対して指向する抗体を含む細胞系統マーカーを用いる顕微鏡を使った顕微鏡的評価によって、並行して、かつ独立に検証され得る。
(a)癌進行の最も初期段階の間、転移性細胞は原発性腫瘍から出現し始め;これらの細胞は、侵襲性挙動を示す、
(b)癌の存在を示す血液由来の腫瘍細胞集団は、早期診断およびさらなる分子分析を可能にする、そして
(c)循環性腫瘍細胞と原発性腫瘍細胞との両方に存在する診断用の遺伝子のセットが存在し、これは、循環性腫瘍細胞の組織部位起源を解決するため、特定の癌のサブタイプを決定するため、そして高度に確信のある患者の転移の可能性を予測するために、使用され得る。
高収量のCAM培養が、独立したCAM法として並行して行われて、CAMによる腫瘍細胞濃縮を検証し得、そしてフローサイトメトリーによって計数され得る。CAM培養法は、細胞系統マーカーもしくは推定腫瘍マーカーを用いて、顕微鏡および免疫細胞化学によって容易に補強され得る。顕微鏡は、血液からCAMによって濃縮されたCTCを以下に示される特徴:Co+/Epi+/Endo+/Leu−を有するものとして;CECを以下:Co−/Epi−/Endo+/Leu−として;腫瘍関連リンパ球を以下:Co−/Epi−/Endo−/Leu+として、同定するために使用され得る。特に、CTCは、以下である:
1)摂取および濃縮されたTRITC標識コラーゲンフラグメントからの陽性の蛍光(Co+;ECMを分解および摂取する傾向は、侵襲性および転移性の細胞の特徴の1つである)
2)サイトケラチンおよび上皮膜抗原(BerEP4,EpCAM,GA733 andMuc−l)を含む上皮特異的マーカーに対する、陽性の免疫細胞化学検出(Epi+)
3)CD31、フォン・ヴィレブランド因子(vWF)およびVEGFレセプターを含む内皮特異的マーカーに対する、陽性の免疫細胞化学検出(Endo+)
4)CD45、CD14およびCD68を含む白血球/単球系統のマーカーに対する、陰性の免疫細胞化学検出;白血球様細胞診断法に対して陰性(Leu−)。
循環性腫瘍細胞に特異的に存在することが予測されるmRNAの発現レベル 対 白血球に存在することが予測されるそのレベルが、濃縮の成功度の基準として使用され得る。所与の細胞集団中の腫瘍細胞のパーセンテージは、腫瘍細胞株およびコントロールとして白血球細胞サンプルを使用して、上皮マーカー(GA733−1)および白血球マーカー(CD45)の発現を用いて検証され得る。
同時係属中のPCT特許出願PCT/US01/26735に記載されるように、腫瘍に対する宿主免疫の存在に起因してほとんどのCTCは、循環中で死んでいるか、アポトーシス性である。CAM開始血液デバイス、CTCの生存度、および個々のドナーに由来する血漿は、腫瘍に対する宿主免疫を決定する有効な手段を組み立てる。CAMで濃縮されたCTCは、多くの場合、細胞障害性白血球とともにクラスターを形成する。細胞接着マトリックスは、有望な予後を示し得る患者由来のこのような免疫細胞と癌細胞との複合体のクラスターを容易に単離する。さらに、腫瘍細胞溶解に関与する補体系の可溶性成分が、同じ被験体の血液に由来する自己血漿の存在下でのCTC生存度によって決定され得る。したがって、腫瘍細胞障害性白血球および可溶性補体系の存在は、宿主免疫についての重要な指標である。
(全血からの腫瘍細胞のCAMの正の(positive)単離)
全血からの腫瘍細胞の単離のために実施され得る例示的なプロトコールは、以下に示される:
1.臍帯血の調製:既知の数のGFP腫瘍細胞でスパイクされた3mLの抗凝固処理臍帯血(+300μのACDおよびヘパリンリチウム)を、CAM血液試験ユニットの各チューブに添加する。密封したCAM血液チューブをローラー上に配置し、37℃で5〜30サイクル/分で回転させる。1〜3時間インキュベートして腫瘍細胞の接着を起こさせる。
2.コントロール培地の調製:既知の数のGFP腫瘍細胞でスパイクされた3mLのコントロール培地(+300μlのACDおよびヘパリンリチウム)を、CAM血液試験ユニットの各チューブに添加する。密封したCAM腫瘍チューブをローラー上に配置し、37℃で5〜30サイクル/分で回転させる。1〜3時間インキュベートして腫瘍細胞の接着を起こさせる。
3.血液または培地上清をピペッティングによって慎重に除去する。内壁上のCAMフィルムを害することなくチューブを洗浄溶液(PBS/0.1%、BSA/10%、ACDおよびヘパリンリチウム)3mL中で5回洗浄する。
4.1mLのコラゲナーゼ溶液を、徹底的に洗浄されて赤血球を除去されたCAM血液濾過ユニットの各チューブに添加する。CAM血液試験ユニットの各チューブに添加する。密封したCAM血液チューブをローラー上に配置し、37℃で5サイクル/分で回転させる。10分間インキュベートしてCAMを溶解し、腫瘍細胞を懸濁液中に放出させる。コラゲナーゼ溶液(PBS、0.3 mM CaCl2、0.2μg/mL I型コラゲナーゼ [Worthington Biochemical]、25μg/mL DNase[Roche])。
5.懸濁液を新しいBppendorfチューブに移送する。TRITC−抗CD45(顕微鏡観察用)もしくはPE−抗CD45(フローサイトメトリー用)を用いて直ちに免疫蛍光標識するため、氷上に保持する。標識された腫瘍細胞を、顕微鏡およびフローサイトメトリーの両方によって計数する。
(蛍光材料を含むCAMフィルム)
浸潤突起細胞がECMマトリクスを消化して内部移行する場合、CAMマトリックスが蛍光性であれば、腫瘍細胞葉、濃縮プロセスの間に蛍光性になるはずである。これを達成するため、CAM基質が捕獲容器に被覆される前に、蛍光TRITC−もしくはFITC−I型コラーゲンポリマーがこれに組み込まれる。癌細胞を白血球から区別するために、白血球共通抗原CD45に対して指向するフィコエリトリン(PE)結合抗体またはFITC結合抗体もしくはTRITC結合抗体を用いた負の同定手順が使用され得る。
(フローサイトメトリーによる単離細胞の算出)
患者あたり約10〜20mLの血液がVacutainerチューブ(Becton Dickinson、緑色の蓋、ヘパリンリチウム抗凝固剤、各チューブには7mL入る)に採取される。新鮮な採取血液のアリコートは、CAM血液試験管に移してもよく、または単核細胞を得るために密度勾配遠心分離にかけて、そしてさらなるCAM上での細胞濃縮および同定に供してもよい。フローサイトメトリーによる血中生存腫瘍細胞の算出は、以下の基準に基づいて達成され得る:(a)そのFITC標識コラーゲンの摂取を介して可視化された腫瘍細胞;(b)正常血液細胞のPE標識は、混入白血球を同定するための補足的なシグナルとして使用され得る;(c)死んだ7−AAD細胞(負の事象)。
(i)適切な時間(サンプル流動速度=60μl/mm)においてフローサイトメーターを通過する腫瘍細胞が著しく減少することなく、サンプル容量は3〜20mLから500μlまで、そして全細胞数は15,000,000,000個〜1,000,000個まで減少され得る。
(フローサイトメーターにおいて使用するための、被験体由来の腫瘍細胞のCAM濃縮)
(1).3mLの抗凝固処理された血液(0.3mLのヘパリンリチウム+抗凝固剤クエン酸デキストロース溶液 USP−ACD,Baxter Healthcare Corporation,Deerfield,Jib)を、FITC標識コラーゲンで被覆されたCAM血液濾過ユニットの各チューブに添加する。密封したCAM血液チューブをローラー上に配置し、37℃で5〜30サイクル/分で回転させる。1〜3時間インキュベートして腫瘍細胞の接着を起こさせる。
(フローサイトメトリーにおける使用のための、CAM 96ウェル細胞チャンバー法によって濃縮された腫瘍細胞)
(1).密度遠心分離によるMNC分画の調製:Vacutainer採血管(Becton Dickinson,緑色の蓋,抗凝固剤としてヘパリンリチウム、各チューブには7mL入る)中の、残りの3〜15mLの抗凝固処理された血液を使用する。細胞ペレットは、1,000rpmでスピンダウンされ、そして細胞は、0.5mM EDTAを含有する5mL PBS中に再懸濁される。単核細胞(MNC)分画は、Ficoll−Paque密度遠心分離(Pharmacia)によって、製造者の指示に従って得られ、15%のウシ血清を含有する完全培養培地中で洗浄され、そして3〜15mLの完全培地に懸濁される。
(CAM 16ウェル細胞チャンバー法によって濃縮された腫瘍細胞の顕微鏡的特徴付け)
(1)低速による細胞分画および血漿分画の調製。750rpmで5分間の遠心分離:Vacutainer採血管(Becton Dickinson、緑色の蓋、抗凝固剤としてヘパリンリチウム、各管には7ml入る)中の3〜7mLの抗凝固処理された血液中の細胞ペレットを、750rpmで5分間、または1,000rpmで3分間スピンダウンする。遠心された血液の上清から全部で120μlを、15%のウシ血清を含有する680μlの抗凝固処理された完全培養培地で満たされたEppendorfチューブに、血漿を移す。[血漿培地と称される:10%の抗凝固剤(ACDおよびヘパリンリチウム)ならびに75%の完全培養培地中の、特定のドナー由来の15%血漿]。血漿の残りは、0.5μLアリコートに保存される。
(リアルタイムRT−PCRおよびDNAマイクロアレイ分析において使用するための、CAM96ウェル細胞チャンバー法によって濃縮された腫瘍細胞)
(1)密度遠心分離によるMNC分画の調製[上記実施例7のプロトコールに類似する]:Vacutainer 採血管(Becton Dickinson,緑色の蓋,抗凝固剤としてヘパリンリチウム、各チューブには7mL入る)中の残りの3〜15mLの抗凝固処理された血液を使用する。細胞ペレットは、1,000rpmでスピンダウンされる。細胞は、0.5mM EDTAを含有する5mL PBS中に再懸濁され、そして単核細胞(MNC)分画は、Ficoll−Paque密度遠心分離(Pharmacia)によって、製造者の指示に従って得られ、15%のウシ血清を含有する完全培養培地中で洗浄され、そして3〜15mLの完全培地に懸濁される。
(細胞分画の純度を検証するための細胞型抗体マーカーを用いた免疫細胞化学)
細胞型抗体マーカーを用いた免疫細胞化学を使用して細胞分画の純度を検証した。図5の上2つのパネルは、卵巣の漿液腺癌の腹水由来のCAMによって濃縮された白血球(Leu)および腫瘍細胞(Epi)の、CD45汎白血球抗原(左パネル、Leu、赤)に対して指向する抗体、および汎サイトケラチン、上皮抗原(右パネル、Epi、赤)に対して指向する抗体を用いた、免疫組織化学的同定を示す。下の2つのパネルは、CAMによって濃縮された純粋な腫瘍細胞の免疫組織化学的同定、およびそれに続く抗体EpCAMでの正の選択を示す。汎サイトケラチンに対する抗体で標識される腫瘍細胞が、ここでは優性である(左パネル、Epi、赤)。腫瘍細胞上にいくつかのEpCAM抗体−Dynalビーズが見えることに注意。純粋な腫瘍細胞の一部(2%)が、CD31(右パネル、Endo、赤)、内皮表面抗原に対して指向する抗体で標識された。核は、非イオン性界面活性剤で細胞質幕を透過性にした後、ユニバーサルな細胞マーカーとしてHoechst33342核染色を用いて青く染色された(写真サイズ331μm×239μm)。
(リアルタイムRT−PCR分析)
1種以上の癌の遺伝的基盤をさらに解明するために、リアルタイムRT−PCR分析が使用され得る。RT−PCR分析はまた、マイクロアレイデータを検証するために使用され得る。
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Claims (38)
- 標的細胞を流体サンプルから単離するための装置であって、該装置は、以下:
内部表面および外部表面を有する容器;
1種以上の細胞接着分子に結合する非反応性のコア材料を含む細胞接着マトリックス
を備え;
ここで、該細胞接着マトリックスが、該容器の該内部表面を覆っている、装置。 - 請求項1に記載の装置であって、ここで、前記細胞接着マトリックスの非反応性のコア材料が、以下:
ゼラチン、架橋ゼラチン、骨、ガラス、不活性ポリマー、およびデキストランからなる群より選択される、少なくとも一つの材料である、装置。 - 請求項1に記載の装置であって、前記細胞接着マトリックスの細胞接着分子が、プロテオグリカン、フィブロネクチン、フィブリン、ヘパリン、ラミニン、テネイシン、ビトロネクチン、および/またはこれらのフラグメントからなる群より選択される、少なくとも一つの分子である、装置。
- 請求項1に記載の装置であって、前記容器の内部表面が、前記細胞接着マトリックスで、少なくとも5%覆われている、装置。
- 請求項1に記載の装置であって、前記標的細胞に結合する場合に該標的細胞に対して、検出可能な親和性を有する、少なくとも一つのリガンドを含む、装置。
- 請求項5に記載の装置であって、前記リガンドが蛍光標識されている、装置。
- 請求項5に記載の装置であって、前記リガンドが前記細胞接着マトリックスへと組み込まれている、装置。
- 請求項5に記載の装置であって、前記リガンドが、前記細胞接着マトリックスに結合する層中に見出される、装置。
- 請求項1に記載の装置であって、前記細胞接着マトリックスに近接する細胞分離機構をさらに含み、該細胞分離機構は、前記標的細胞と該細胞接着マトリックスとの相互作用の前に該標的細胞を含有するサンプルから細胞を取り除くように、作動可能に構成される、装置。
- 請求項9に記載の装置であって、該細胞分離メカニズムが、フィルター、膜、メッシュ、物質勾配からなる群より選択される、少なくとも一つの機構である、装置。
- 請求項5に記載の装置であって、少なくとも1種のリガンドが、該リガンドと単離された標的細胞との相互作用の際に視覚的検出を可能にするように、作動可能に構成される、装置。
- 請求項1に記載の装置を使用する方法であって、該方法は、以下:
該装置において、前記流体サンプル中の細胞の混合物を該細胞接着マトリックスに接触させる工程;
標的細胞を該細胞接着マトリックスから単離する工程;
を包含する、方法。 - 請求項12に記載の方法であって、該方法は、未結合の細胞を前記細胞接着マトリックスから取り除く工程をさらに包含する、方法。
- 請求項12に記載の方法であって、前記流体サンプルが、血液サンプルもしくは腹水サンプル、または生検サンプルもしくは擦過サンプルもしくは塗抹サンプルである、方法。
- 請求項12に記載の方法であって、前記細胞混合物が、密度勾配遠心分離または赤血球溶解の後、血液サンプル由来の単核細胞を含む、方法。
- 請求項12に記載の方法であって、ここで、前記標的細胞が、腫瘍細胞、内皮細胞または胎児細胞である、方法。
- 請求項16に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が、肺癌、膀胱癌、***組織の癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胸部の癌、皮膚癌、肝臓癌、胃癌、食道癌、頭部および頚部の癌、頚部癌、子宮癌、脳の癌、腎臓癌、甲状腺癌、結腸癌または直腸癌のうちの少なくとも一つの癌に由来する、方法。
- 請求項12に記載の方法であって、前記標的細胞が内皮細胞または内皮前駆体細胞である、方法。
- 請求項12の方法であって、前記標的細胞が妊娠雌から取得した胎児の細胞である、方法。
- 請求項12の方法であって、前記細胞接着マトリックスがビーズを含む、方法。
- 請求項12の方法であって、前記細胞マトリックスが蛍光標識された細胞接着マトリックス成分を含有する、方法。
- 請求項12の方法であって、前記標的細胞が浸潤突起を含む、方法。
- 請求項12の方法であって、前記標的細胞が細胞接着レセプターのインテグリンを含む、方法。
- 開口部、底部、および周囲の側壁を有する容器であって、該容器は、該容器の内部表面上に細胞接着マトリックスの少なくとも一つの被覆層を含み、該容器は、流体が該容器の開口部の中に置かれた場合に流体サンプルによって接触されるように、作動可能に構成されている、容器。
- 請求項24に記載の容器であって、該容器は、マイクロタイタープレート、顕微鏡スライドチャンバ、組織培養デバイス、細胞チャンバユニット、血液濾過ユニット、チューブ、瓶、またはこれらの組み合わせ、からなる群より選択される、容器。
- 請求項21に記載の蛍光標識された細胞接着マトリックスであって、ここで、該マトリックスは、血液中の癌細胞を標識するために使用される、細胞接着マトリックス。
- 疾患の出生前診断のための方法であって、該方法は、以下:
妊娠雌からの血液サンプルを、細胞接着マトリックスと接触させる工程、
該細胞接着マトリックスから胎児細胞を単離する工程、
該胎児細胞を培地中で培養する工程、および
遺伝的異常および染色体異常の存在に関して、該胎児細胞を試験する工程
を包含する、方法。 - 請求項27に記載の方法であって、前記遺伝的異常および染色体異常が、ダウン症候群、マルファン症候群、テイサックス病、およびサラセミア、からなる群より選択される、方法。
- 請求項27に記載の方法であって、前記細胞接着マトリックスが、多数の被覆されたビーズを含み、このビーズが、非反応性のコア材料を含有し、かつ該コア材料の周囲に細胞接着分子を含有する、方法。
- 請求項29に記載の細胞接着マトリックスであって、前記非反応性のコアが、コラーゲンマイクロビーズ、ゼラチンマイクロビーズおよびガラスマイクロビーズまたはこれらの組み合わせ、からなる群より選択される、少なくとも1種の材料である、細胞接着マトリックス。
- 請求項30に記載の容器であって、前記コラーゲンが、蛍光染料で標識されている、容器。
- 癌をインビトロで診断するための方法であって、該方法は、以下:
患者から得られたサンプル流体を、血液由来の成分を含有する細胞接着マトリックスと接触させる工程、
該マトリックスに付着した転移性の腫瘍細胞を、該サンプルの流体中の細胞から単離する工程;
該マトリックスに付着した該転移性の腫瘍細胞を、所定の期間培養する工程;ならびに
該培養物における該転移性腫瘍細胞の顕微鏡分析およびフローサイトメトリー分析を行う工程
を包含する、方法。 - 請求項32に記載の方法であって、該方法は、前記転移性の癌細胞の免疫組織化学を行い、前記サンプル流体中に存在する癌細胞の型を同定する工程、および/または該癌細胞を標識細胞接着マトリックスおよび核酸染料で染色して、該サンプル流体中に存在する癌細胞の型を同定する工程、をさらに包含する、方法。
- 請求項32に記載の方法であって、該方法は、上皮腫瘍遺伝子マーカーのDNAマイクロアレイ分析および/またはリアルタイムPCR定量を用いて、前記転移性腫瘍細胞を特徴付ける工程をさらに包含する、方法。
- 請求項34に記載の方法であって、ここで、前記腫瘍遺伝子マーカーが、GA733−2、GA733−1、MMP7、ムチン1、リポカリン2、サイトケラチン18、E−カドへリン−1、セプラーゼ、自家毒素、およびCXCR4である、方法。
- 流体入口および流体出口を収納する濾過カセットであって、該収納は、
該流体入口に近接する前フィルター;
該流体出口に近接する後フィルター;および
細胞接着マトリックスを備えるフィルター区画であって、該フィルター区画は、該前フィルターと後フィルターとの間に配置されている、フィルター区画
を含む、濾過カセット。 - 請求項36に記載の方法であって、前記前フィルターまたは前記後フィルターのうちの1つが、細胞接着マトリックスに結合している、方法。
- 流体サンプルから標的細胞を単離するための装置であって、該装置は、以下:
該流体サンプルを保持するように設計された内側表面と外側表面とを有する、管
細胞接着マトリックスを有するカードに連結された蓋を備える、ディップスティック
を備える、装置。
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