JPS62129222A - 細胞培養組成物およびその用途 - Google Patents
細胞培養組成物およびその用途Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(技術分野)
この発明は基底膜錯体に係わシ、特に再結合された基底
膜誘導細胞外基層(マドI)?’ル(mitrigel
))であって、加熱により重合し、試験管内および生体
内で細胞成長および分化を促進するものに関する。
膜誘導細胞外基層(マドI)?’ル(mitrigel
))であって、加熱により重合し、試験管内および生体
内で細胞成長および分化を促進するものに関する。
(従来技術)
基底膜は薄い連続的シートからなシ、基質から上皮を分
離し、神経、筋繊維、平滑筋細胞および脂肪細胞を囲ん
でいる。この基底膜はタイプ■コラーゲン、グリコプロ
ティンラミニン(laminin)。
離し、神経、筋繊維、平滑筋細胞および脂肪細胞を囲ん
でいる。この基底膜はタイプ■コラーゲン、グリコプロ
ティンラミニン(laminin)。
エンタフチン(entaetin)、 ニドダン(ni
dogen)およびヘノぐラン硫酸グロテオグリカン(
heparansulfate p10teoglyc
an)からなる。研究によると、これら物質はラミナル
シダ(larninadensa)およびラミナルシダ
(lamlna 1ucida)を横切る延長部内に共
分布を示す。電子顕微鏡によれば、これら成分はS n
m巾の索からなる網状体として現われ、これらの共分布
から基底膜の形成は種々の成分の相互作用を介して生ず
ると考えられる。タイグ■コラーゲン分子は分子間ジス
ルフィド結合を形成し。
dogen)およびヘノぐラン硫酸グロテオグリカン(
heparansulfate p10teoglyc
an)からなる。研究によると、これら物質はラミナル
シダ(larninadensa)およびラミナルシダ
(lamlna 1ucida)を横切る延長部内に共
分布を示す。電子顕微鏡によれば、これら成分はS n
m巾の索からなる網状体として現われ、これらの共分布
から基底膜の形成は種々の成分の相互作用を介して生ず
ると考えられる。タイグ■コラーゲン分子は分子間ジス
ルフィド結合を形成し。
プラスミンで消化した基底膜中に見らiする連続的網状
体と関連する( Inoue et al、、J、Ca
1l Biol。
体と関連する( Inoue et al、、J、Ca
1l Biol。
97.1524−1537.1983)。
基底膜の各成分は相互に作用し合うことが知ら九てbる
。精製された各成分について試験管により研究した結果
、ラミニンはその短い鎖を介して。
。精製された各成分について試験管により研究した結果
、ラミニンはその短い鎖を介して。
変性されたものでなく生のタイプ■コラーデンと結合し
、また、その長い鎖中のドメインを介してヘノ9ランス
ル7エートプロテオグリカンと結合している。これらの
基底膜成分は可溶性である。しかし、これらの巨大分子
を試験管中で相互に混合したとき、ラミニン/タイプ■
コラーダン/ヘパラン硫酸プロテオグリカンを1:1:
0.1モル比の割合で含む凝集状沈でんを生ずる( K
leinmanat al、Biochemiatry
22 、4969−4974*1983)。しかし
、この沈でん物は膜構造から予想されるような弾性およ
び結持性を示さない。
、また、その長い鎖中のドメインを介してヘノ9ランス
ル7エートプロテオグリカンと結合している。これらの
基底膜成分は可溶性である。しかし、これらの巨大分子
を試験管中で相互に混合したとき、ラミニン/タイプ■
コラーダン/ヘパラン硫酸プロテオグリカンを1:1:
0.1モル比の割合で含む凝集状沈でんを生ずる( K
leinmanat al、Biochemiatry
22 、4969−4974*1983)。しかし
、この沈でん物は膜構造から予想されるような弾性およ
び結持性を示さない。
基底膜のnl製成分は従来、培養細胞のコーテング剤と
して使用されている(Terranova et al
、、cel122ニア19:1980)。しかし、この
物質は可溶であって、本発明の組成物で得られるような
3次元マトリックスを形成しない。
して使用されている(Terranova et al
、、cel122ニア19:1980)。しかし、この
物質は可溶であって、本発明の組成物で得られるような
3次元マトリックスを形成しない。
(発明が解決すべき問題点)
本発明は再結合された基底膜誘導細胞外組成物(マトリ
グル)であって、加熱により重合し、3次元マトリック
スを形成し、試験管内および生体内で細胞成長および分
化を促進する組成物を提供することを目的とする。
グル)であって、加熱により重合し、3次元マトリック
スを形成し、試験管内および生体内で細胞成長および分
化を促進する組成物を提供することを目的とする。
さらに本発明はマ)lJfルの製造法および細胞成長な
らびに分化を促進する方法を提供することを目的とする
。
らびに分化を促進する方法を提供することを目的とする
。
さらに本発明はヒト胎盤抽出物からマトリグルを製造す
る方法を提供することを目的とする。
る方法を提供することを目的とする。
さらに本発明は腫細胞の転移性能を判定する方法および
転移性種細胞を分離する方法を提供することを目的とす
る。
転移性種細胞を分離する方法を提供することを目的とす
る。
(問題点を解決するための手段)
上記問題点は60〜85j4量チのラミニン、5〜30
重」チのコラーダン■、1〜10重景%のニドデン、1
〜1offii%のヘノ9ランスル7エートプロテオグ
リカンおよび1〜5重t%エントアクチンを含む生物学
的活性重合性抽出物からなる基底膜誘導組成物を提供す
ることにより解決し得る。ここで、1生物学的活性”と
は上皮細胞を含む種々の細胞の正常な成長、分化を補助
する能力を意味する。
重」チのコラーダン■、1〜10重景%のニドデン、1
〜1offii%のヘノ9ランスル7エートプロテオグ
リカンおよび1〜5重t%エントアクチンを含む生物学
的活性重合性抽出物からなる基底膜誘導組成物を提供す
ることにより解決し得る。ここで、1生物学的活性”と
は上皮細胞を含む種々の細胞の正常な成長、分化を補助
する能力を意味する。
生理学的条件下で、タイプ■コラーrン、ラミニン、へ
/41’ランスルフェートソロチオグリカン、ニドダン
、エンタフチン等の成分がほぼ一定の割合で相互に反応
し、ラメラ構造のゲル、すなわち基底膜の次元と似た構
造のグルを形成することが見出され化6本明細省で記載
した条件下で、これらの成分はマトリックスの再結合の
ために必要となる。これはこのデルの全ての成分が超分
子錯体を形成し、これがマトリックス形成における中間
体となっているものと思われる。本発明でこのグルは叙
述的用語としてマトリグル(matrigel)と呼ぶ
ことにする。
/41’ランスルフェートソロチオグリカン、ニドダン
、エンタフチン等の成分がほぼ一定の割合で相互に反応
し、ラメラ構造のゲル、すなわち基底膜の次元と似た構
造のグルを形成することが見出され化6本明細省で記載
した条件下で、これらの成分はマトリックスの再結合の
ために必要となる。これはこのデルの全ての成分が超分
子錯体を形成し、これがマトリックス形成における中間
体となっているものと思われる。本発明でこのグルは叙
述的用語としてマトリグル(matrigel)と呼ぶ
ことにする。
この再結合マトリックス(マトリデル)は種々の細胞の
成長と分化を促進する。特に本発明の再結合基底膜グル
は培養において上皮細胞のための良好な基板となる。こ
のマド+)’y’ルは細胞接着、ノイロン、肝細胞、セ
ルトリ細胞1毛包、甲状腺細胞等の多くの細胞の成長お
よび分化を促進する。
成長と分化を促進する。特に本発明の再結合基底膜グル
は培養において上皮細胞のための良好な基板となる。こ
のマド+)’y’ルは細胞接着、ノイロン、肝細胞、セ
ルトリ細胞1毛包、甲状腺細胞等の多くの細胞の成長お
よび分化を促進する。
セルトリ細胞をこのゲル中で培養し、のちに動物に戻し
たところ、***細胞の生存および熟成が良好であった。
たところ、***細胞の生存および熟成が良好であった。
本発明の組成物はさらに神経再生(視神経および坐骨神
経)が生体中で促進され、組織再結合が生ずることが見
出された。ヒト胎盤から抽出されたものを用い、マドI
Jfルを製造すると、免疫学的相互作用又は拒否がヒト
に対し使用したとき減少することが認められた。
経)が生体中で促進され、組織再結合が生ずることが見
出された。ヒト胎盤から抽出されたものを用い、マドI
Jfルを製造すると、免疫学的相互作用又は拒否がヒト
に対し使用したとき減少することが認められた。
以下1本発明の好ましい具体例について説明する。
物質
タイゾ■コラーデン、ラミニンおよびヘノ母ランスルフ
ェートグロテオグリカンをEH8(Engelbret
hHolm −Swarm )腫(Tlmpl at
al、J、Biol、Chem 。
ェートグロテオグリカンをEH8(Engelbret
hHolm −Swarm )腫(Tlmpl at
al、J、Biol、Chem 。
254 : 9933−9937 ;Hasaell
et al 。
et al 。
P10c、Natl、 Acad、 5eをUSA
77 : 4494−4 4 9 8 : 1 9
8 0 ; Kleinman、 et a
l+Biochamistry21 :6188−61
93:1982)から製造した。この肺組織をグロテア
ーゼ抑制剤を含有する3、 4 MNaCl 、0.0
5 M トリス−HClt 、 p)17.4中で洗浄
したのち、基底膜マトリックスを0.05 Mトリス−
HCl 、 pH7,4中で0.5 M HaCtで抽
出した。
77 : 4494−4 4 9 8 : 1 9
8 0 ; Kleinman、 et a
l+Biochamistry21 :6188−61
93:1982)から製造した。この肺組織をグロテア
ーゼ抑制剤を含有する3、 4 MNaCl 、0.0
5 M トリス−HClt 、 p)17.4中で洗浄
したのち、基底膜マトリックスを0.05 Mトリス−
HCl 、 pH7,4中で0.5 M HaCtで抽
出した。
次に、上記Timpl et alに記載された方法で
ラミニンを0.5 M NaCL抽出物から分離した。
ラミニンを0.5 M NaCL抽出物から分離した。
ニー)7’)豆中毒症動物からの肺組織の残渣′jkO
,05M ) +7スーHC1、pH7,4中の2.0
Mグアニソンで抽出し、さらに0.005Mソチオスレ
イトールを含む同じ緩衝液で抽出し、タイゾ■コラーr
ンを可溶化した( Klelnman at al )
o低比重ヘパランスルフェートプロテオグリカンは上記
腫の6.0M尿素抽出iからイオン交換クロマトグラフ
ィを用い、塩化セシウム比重遠心分離および分子篩コラ
ムクロマトグラフィにより精製した(Has口11 e
t al)。なお、へ・イランはシグマケミカル社から
入手した。
,05M ) +7スーHC1、pH7,4中の2.0
Mグアニソンで抽出し、さらに0.005Mソチオスレ
イトールを含む同じ緩衝液で抽出し、タイゾ■コラーr
ンを可溶化した( Klelnman at al )
o低比重ヘパランスルフェートプロテオグリカンは上記
腫の6.0M尿素抽出iからイオン交換クロマトグラフ
ィを用い、塩化セシウム比重遠心分離および分子篩コラ
ムクロマトグラフィにより精製した(Has口11 e
t al)。なお、へ・イランはシグマケミカル社から
入手した。
基底膜マトリックスの分画されない抽出物を、塩で洗っ
た組織を等量(l rnL/Irn )の2M尿素、0
、05 M )リス−HCt 、 PH= 7.4で4
℃で一晩処理し、10.000Gで30分間遠心分離す
ることによシ得た。この残渣を等量の緩衝液で一度洗っ
た。ついで、この抽出物および洗液を一緒にし、0、0
5 M トリス−HC2に0.15 M NaC1を溶
かしたもの−=7.4(TBS)で透析し、遠心分離し
て不溶物質の少量を除去した。
た組織を等量(l rnL/Irn )の2M尿素、0
、05 M )リス−HCt 、 PH= 7.4で4
℃で一晩処理し、10.000Gで30分間遠心分離す
ることによシ得た。この残渣を等量の緩衝液で一度洗っ
た。ついで、この抽出物および洗液を一緒にし、0、0
5 M トリス−HC2に0.15 M NaC1を溶
かしたもの−=7.4(TBS)で透析し、遠心分離し
て不溶物質の少量を除去した。
この上澄分を少量づつ一20℃で貯ぞうし、以下の再結
合テストに用いた。公知の定量ELI SA試験を用い
、この抽出物がラミニン(3,S rn97mt )、
タイプ■コラーデン(0,1rni/ml )およびヘ
パランスルフェートプロテオグリカン(0,1ml/m
A )を含むことが見い出された。エンタフチン、ニド
ダン、その他の少量成分も含まれていることが見い出さ
れた。コラムクロマトグラフィにおいては抽出物は0.
5 M NaC6,0,05M トリス−1((A、p
H7,4を用い透析し、ついで遠心分離して不溶物質を
除去した。
合テストに用いた。公知の定量ELI SA試験を用い
、この抽出物がラミニン(3,S rn97mt )、
タイプ■コラーデン(0,1rni/ml )およびヘ
パランスルフェートプロテオグリカン(0,1ml/m
A )を含むことが見い出された。エンタフチン、ニド
ダン、その他の少量成分も含まれていることが見い出さ
れた。コラムクロマトグラフィにおいては抽出物は0.
5 M NaC6,0,05M トリス−1((A、p
H7,4を用い透析し、ついで遠心分離して不溶物質を
除去した。
再結合試験
生理学的緩衝液に2M尿素抽出物を0,05〜0、1
at加えたものを遠心分離管に入れ、これを用いてダル
化をおこなりたo O,l 5 M NaC2−0,0
5Mトリス−HCl 、 pH7,4中に溶かした精製
成分を抽出物に加え、所定の濃度で培養した。0.15
MNaCj。
at加えたものを遠心分離管に入れ、これを用いてダル
化をおこなりたo O,l 5 M NaC2−0,0
5Mトリス−HCl 、 pH7,4中に溶かした精製
成分を抽出物に加え、所定の濃度で培養した。0.15
MNaCj。
0、05 M )リス−HC1,pi−1=7.4を用
いて最終量を0.5又は1.0 mlとし、各サンプル
を35℃で1時間培養した。不溶物質を遠心分離で分離
し、−2レフトはサンダル緩衝版に溶かし、還元条件下
で5%又は7.5係アクリルアミド中で電気泳動させた
( Laernmll、1970 、 Natuve
−ロンドン、227:680−682)。各実験は最低
3回繰り返した。
いて最終量を0.5又は1.0 mlとし、各サンプル
を35℃で1時間培養した。不溶物質を遠心分離で分離
し、−2レフトはサンダル緩衝版に溶かし、還元条件下
で5%又は7.5係アクリルアミド中で電気泳動させた
( Laernmll、1970 、 Natuve
−ロンドン、227:680−682)。各実験は最低
3回繰り返した。
沈でん物中のタンパク質の総量は標準Lowry法によ
シ判定した。ニドダンおよびエンタフチンのグル中の量
はヘレナ濃度計(Quick 5can ljl、 H
alenaLab、 Corp、テキサス州、米国)を
用いダルの写真の走査によりラミニンの4000にバン
ドに存在する物質の総量に関連するものであった。エン
タフチンおよびニドダンはSDSデル中の移行、および
適当な抗体を用いたW@5ternプロット分析におけ
る交叉反応性(c10@a reactivity )
Kより同定された。ゲル中のタイプ■コラーケ9ンは1
4G−ラベル付キタイゾ■コラーrンを用い、又、ヘパ
ランスルフェートプロテオグリカンは2 S−スルフェ
ートラベル付き物質(別の平行実験により比活性が予め
知られたもの)を用いそれぞれ定量した。
シ判定した。ニドダンおよびエンタフチンのグル中の量
はヘレナ濃度計(Quick 5can ljl、 H
alenaLab、 Corp、テキサス州、米国)を
用いダルの写真の走査によりラミニンの4000にバン
ドに存在する物質の総量に関連するものであった。エン
タフチンおよびニドダンはSDSデル中の移行、および
適当な抗体を用いたW@5ternプロット分析におけ
る交叉反応性(c10@a reactivity )
Kより同定された。ゲル中のタイプ■コラーケ9ンは1
4G−ラベル付キタイゾ■コラーrンを用い、又、ヘパ
ランスルフェートプロテオグリカンは2 S−スルフェ
ートラベル付き物質(別の平行実験により比活性が予め
知られたもの)を用いそれぞれ定量した。
回転影付け(shadowing )
0、5 M NaC6y O−05M )リス−HCt
、 pHニア、4で平衡させた2、 0 M尿素抽出物
をセファローズ4Bコラム上に載せた。このコラムから
溶出させたピーク分画(0,1mli/ml )の少量
(30ttt )を0.155M酢酸アンモニウム、p
H=7.4,3QQμlおよびグリセロール600μl
で希釈した。この混合物を回転影付けをおこなうためマ
イカ上にスプレィし、白金−パラジウムで影付けし、カ
ーざン塗布をおこない、J加L100Ct子顕微鏡で検
査した。
、 pHニア、4で平衡させた2、 0 M尿素抽出物
をセファローズ4Bコラム上に載せた。このコラムから
溶出させたピーク分画(0,1mli/ml )の少量
(30ttt )を0.155M酢酸アンモニウム、p
H=7.4,3QQμlおよびグリセロール600μl
で希釈した。この混合物を回転影付けをおこなうためマ
イカ上にスプレィし、白金−パラジウムで影付けし、カ
ーざン塗布をおこない、J加L100Ct子顕微鏡で検
査した。
再結合された成分の超構造(ultrastructu
re)上述の如くケ゛ルをつくった。すなわち、抽出物
0、2 ml を単独で、又はタイゾ■コラーゲンおよ
びヘノ4ランスルフエートグロテオグリカンの存在下で
35℃で培養した。このケ゛ルを遠心分離によ部分離し
、ついで2.54グルタアルデヒドで固定し、1 %
0.04で処理し、2%酢酸ウラニルでブロックスティ
ン(block 5tain )をおこない、脱水した
。
re)上述の如くケ゛ルをつくった。すなわち、抽出物
0、2 ml を単独で、又はタイゾ■コラーゲンおよ
びヘノ4ランスルフエートグロテオグリカンの存在下で
35℃で培養した。このケ゛ルを遠心分離によ部分離し
、ついで2.54グルタアルデヒドで固定し、1 %
0.04で処理し、2%酢酸ウラニルでブロックスティ
ン(block 5tain )をおこない、脱水した
。
このグルはついで電子写真のためgpon (Ladd
Research Industries、Inc、バ
ーリントン、米国。
Research Industries、Inc、バ
ーリントン、米国。
VT:LX−112レシン)で処理した。薄い部分を酢
酸ウラニルおよびくえん酸鉛でスティンし。
酸ウラニルおよびくえん酸鉛でスティンし。
JEOL I OOC電子顕微鏡で検査した。ラット腎
細管基底膜の薄い部分をLaurie et al(A
m、J、Anat。
細管基底膜の薄い部分をLaurie et al(A
m、J、Anat。
169: 463−481 ;1984)の方法で得た
。
。
細胞培養
816C3細胞を組織培養グラスチック上で直接、又は
グルタミン、抗生物質、20mMチロシンおよび5チ胎
児ウシ血清を含むDMEM (Dulbeccoの変形
イーグル培地、細胞の着色可視化のためフェノールレッ
ドを欠いたもの)およびF’12培地の混合物中で11
11I厚の基底膜グル上で培養した。1週間後、細胞の
写真を採りた。
グルタミン、抗生物質、20mMチロシンおよび5チ胎
児ウシ血清を含むDMEM (Dulbeccoの変形
イーグル培地、細胞の着色可視化のためフェノールレッ
ドを欠いたもの)およびF’12培地の混合物中で11
11I厚の基底膜グル上で培養した。1週間後、細胞の
写真を採りた。
精製基底膜成分および基底膜の非分画抽出物を用いて基
底膜の集合体を分析した。精製したタイf■コラーケン
、ラミニンオヨヒヘノ9ランスルフェートグロテオグリ
カンは生理学的条件下、35℃で1時間培養したところ
凝集状沈でんが形成された。これに対し、基底膜の尿素
抽出物を生理食塩水を用い透析し、ついで35℃で1時
間温めたところゲルが形成された。このゲルの成分を遠
心分離により分離し、SDS/!aル電気泳動によシ検
査した。第1A図に示すようにラミニン、エンタフチン
、ニドダンのゲル中の量はタイプ■コラーケ9ンを抽出
物中50〜60%になるまで添加するにつれ、それに比
例して増大した。ヘパランスルフェートプロテオグリカ
ンも基底膜成分の沈でん量の増加に寄与した(第18図
)。
底膜の集合体を分析した。精製したタイf■コラーケン
、ラミニンオヨヒヘノ9ランスルフェートグロテオグリ
カンは生理学的条件下、35℃で1時間培養したところ
凝集状沈でんが形成された。これに対し、基底膜の尿素
抽出物を生理食塩水を用い透析し、ついで35℃で1時
間温めたところゲルが形成された。このゲルの成分を遠
心分離により分離し、SDS/!aル電気泳動によシ検
査した。第1A図に示すようにラミニン、エンタフチン
、ニドダンのゲル中の量はタイプ■コラーケ9ンを抽出
物中50〜60%になるまで添加するにつれ、それに比
例して増大した。ヘパランスルフェートプロテオグリカ
ンも基底膜成分の沈でん量の増加に寄与した(第18図
)。
グル中の主成分のグル電気泳動による分離および定量の
結果、添加されたタイゾ■コラーrン(第1A図)又は
ヘノ9ランスルフエートグロテオグリカン(第18図)
の存在下ではラミニン、エンタクチン、ニドデノの割合
は一定であった。タイゾ■コラーデン(150μg)お
よびヘパランスルフェートプロテオグリカン(103g
)の双方を抽出物に添加したとき、培養物中80%まで
のタン・ぐりaをゲル中に導入した。ラミニンのより小
さい鎖がタイグ■コラーrンの鎖とともに共電気泳動し
、5DSrル中の可視化を妨げた。
結果、添加されたタイゾ■コラーrン(第1A図)又は
ヘノ9ランスルフエートグロテオグリカン(第18図)
の存在下ではラミニン、エンタクチン、ニドデノの割合
は一定であった。タイゾ■コラーデン(150μg)お
よびヘパランスルフェートプロテオグリカン(103g
)の双方を抽出物に添加したとき、培養物中80%まで
のタン・ぐりaをゲル中に導入した。ラミニンのより小
さい鎖がタイグ■コラーrンの鎖とともに共電気泳動し
、5DSrル中の可視化を妨げた。
デル中のタイプ■コラーデンの量を予測するため、3H
ラベル付きタイグ■コラーゲン(比活性が予め知られた
もの)を用い、その量に基づいてタイプ■コラーデンの
flを測定した。同様に、ヘラランスルフェートプロテ
オグリカンも可視化できないため、 S−ラベル付き
へ79ランスルフエートグロテオグリカンを用いた。こ
れらの実験の結果ラミニンはrル中約60%(264±
56μy)を占め、タイグ■コラーrンは30チ(12
7±7μg)’を占メ、ヘバランスルフェートグロテオ
グリカンは2%以下(8±0.7μ、p)、ニドダンは
5チ、エンタフチンは1%以下であることが判明した。
ラベル付きタイグ■コラーゲン(比活性が予め知られた
もの)を用い、その量に基づいてタイプ■コラーデンの
flを測定した。同様に、ヘラランスルフェートプロテ
オグリカンも可視化できないため、 S−ラベル付き
へ79ランスルフエートグロテオグリカンを用いた。こ
れらの実験の結果ラミニンはrル中約60%(264±
56μy)を占め、タイグ■コラーrンは30チ(12
7±7μg)’を占メ、ヘバランスルフェートグロテオ
グリカンは2%以下(8±0.7μ、p)、ニドダンは
5チ、エンタフチンは1%以下であることが判明した。
これに対し、抽出物をタイプ■コラーケ9ン、フィブロ
ネクチン又はへ・9ランで補りても沈でんの増加はなく
、特定の相互作用が生じていることを示した(第1b図
)。0.5 M NaC6を用いてプロテオグリカンの
タンパク質核の培養による除去(1晩)をおこなったと
ころ、重合能が失われた。このことはプロテオグリカン
のタン/?り部分が他の成分との結合に係わることを示
すものである。
ネクチン又はへ・9ランで補りても沈でんの増加はなく
、特定の相互作用が生じていることを示した(第1b図
)。0.5 M NaC6を用いてプロテオグリカンの
タンパク質核の培養による除去(1晩)をおこなったと
ころ、重合能が失われた。このことはプロテオグリカン
のタン/?り部分が他の成分との結合に係わることを示
すものである。
生理学的条件下ではグル化は20分以内で完了する(第
2図)。このデル化は温度に依存し、35℃で最大の重
合が生じる(第3図)。50℃で相互作用がなくなるこ
とから熱的変性により重要な成分の不活性化がなされる
ことを示した。
2図)。このデル化は温度に依存し、35℃で最大の重
合が生じる(第3図)。50℃で相互作用がなくなるこ
とから熱的変性により重要な成分の不活性化がなされる
ことを示した。
グルの安定性について徨々の溶媒を用いてテストした。
グルは冷い水性塩では溶解せず、酸性溶液で若干溶け、
グアニジノ又は尿素溶液で完全に溶けることが認められ
た(表1)。これは各成分が比較的強い非共有結合によ
り連結テれていることを意味する。グアニジン溶解ゲル
を生理学的緩衝液を用いて透析し、タイプ■コラーrン
の存在下で温めたところ、ゲル状構造が再形成された。
グアニジノ又は尿素溶液で完全に溶けることが認められ
た(表1)。これは各成分が比較的強い非共有結合によ
り連結テれていることを意味する。グアニジン溶解ゲル
を生理学的緩衝液を用いて透析し、タイプ■コラーrン
の存在下で温めたところ、ゲル状構造が再形成された。
この方法は数回繰り返しても同様の割合でラミニン、ニ
ドデンおよびエンタフチンが沈でんする(各回毎にSD
Sポリアクリルアミドゲルを判定した。第4図)。タイ
グ■コラーゲンの存在下においては、ゲルの再形成がよ
シ急速となシ、各成分の沈でん量も増大した。
ドデンおよびエンタフチンが沈でんする(各回毎にSD
Sポリアクリルアミドゲルを判定した。第4図)。タイ
グ■コラーゲンの存在下においては、ゲルの再形成がよ
シ急速となシ、各成分の沈でん量も増大した。
表1
溶媒 溶解度@)015M
NmCl 0015M
NaCA 00.5M HA
e 431.0M尿素+ソチオ
スレイトール 402.0M尿素 7
3 2.0Mグアニノン 97(注) 0.
5MHAcを除き、全ての溶液は0.05Mトリス−H
ClでpI(7,4に緩衝された。
NmCl 0015M
NaCA 00.5M HA
e 431.0M尿素+ソチオ
スレイトール 402.0M尿素 7
3 2.0Mグアニノン 97(注) 0.
5MHAcを除き、全ての溶液は0.05Mトリス−H
ClでpI(7,4に緩衝された。
可溶性は24℃で20分間おこない判断した。
撹拌20分後、溶液を遠心分離し、ベレットは再溶され
、還元剤を用いSDSデル中で電気泳動させた。ベレッ
ト中の各成分の比はSDSグルを走査することによって
おこなわれた。
、還元剤を用いSDSデル中で電気泳動させた。ベレッ
ト中の各成分の比はSDSグルを走査することによって
おこなわれた。
さらに基底成分の可溶性錯体の存在についての判定をお
こなった。尿素抽出液を透析して尿素を除去し、セファ
ロース4Bコラム(0,5MNaCt。
こなった。尿素抽出液を透析して尿素を除去し、セファ
ロース4Bコラム(0,5MNaCt。
結合性条件)t″通過せたところ、主ピーク中にラミニ
ン、ニドゲン、エンタフチンが溶出した(第5A、58
図)。この主ピークの物質をブールし、同様の分子篩コ
ラム(4Mグアニソン、解離条件)に移したところ、こ
れらの成分はそれらの分子量から予想し得る態様で分離
された(第5A図、第5C図〕。この結果から、錯体中
にラミニン、ニドrン、エンタクチンの結合する非共有
結合の強い結合が作用していることが判明した。この物
質の回転影付は電子顕微鏡写真から可溶錯体の存在が認
められた(第5A図)。この錯体は大きいプロテオグリ
カンの存在を示した。このプロテオグリカンはいくつか
のラミ=ン分子で囲まれているためへパランスルフェー
ト側鎖がつぶれたため大きい球形をなしている。ニドダ
ンおよびエンタフチン分子ははっきシしていないが、S
DSポリアクリルアミドrルグル錯体中での存在が知ら
れている(第5B図)。
ン、ニドゲン、エンタフチンが溶出した(第5A、58
図)。この主ピークの物質をブールし、同様の分子篩コ
ラム(4Mグアニソン、解離条件)に移したところ、こ
れらの成分はそれらの分子量から予想し得る態様で分離
された(第5A図、第5C図〕。この結果から、錯体中
にラミニン、ニドrン、エンタクチンの結合する非共有
結合の強い結合が作用していることが判明した。この物
質の回転影付は電子顕微鏡写真から可溶錯体の存在が認
められた(第5A図)。この錯体は大きいプロテオグリ
カンの存在を示した。このプロテオグリカンはいくつか
のラミ=ン分子で囲まれているためへパランスルフェー
ト側鎖がつぶれたため大きい球形をなしている。ニドダ
ンおよびエンタフチン分子ははっきシしていないが、S
DSポリアクリルアミドrルグル錯体中での存在が知ら
れている(第5B図)。
タイグ■コラーデンおよびへAランスルフェートプロテ
オグリカンをともない、あるいともなわない再結合基底
膜の超構造についても検査をおこなった。これらをとも
なわない場合、ゲルは多くの広く分離した薄いフィラメ
ント状の集合体からなるものであった(第6A図)。タ
イプ■コラーゲン、又ハへ74ランスルフエートソロチ
オクリカン/タイプ■コラーデンを添加したものは相互
に連結した。あるいは合流した薄いシート状のものとな
る(第68)。この網状物の各部分は腎細管基底膜のラ
ミナデンサのものと似た平均幅のものである(第6C図
)。しかし、生の基底膜(ラミナデンサ様層が平行に配
列してhる。たとえばPYS @基底膜(Martns
z −Hernandez 9t al、Lab。
オグリカンをともない、あるいともなわない再結合基底
膜の超構造についても検査をおこなった。これらをとも
なわない場合、ゲルは多くの広く分離した薄いフィラメ
ント状の集合体からなるものであった(第6A図)。タ
イプ■コラーゲン、又ハへ74ランスルフエートソロチ
オクリカン/タイプ■コラーデンを添加したものは相互
に連結した。あるいは合流した薄いシート状のものとな
る(第68)。この網状物の各部分は腎細管基底膜のラ
ミナデンサのものと似た平均幅のものである(第6C図
)。しかし、生の基底膜(ラミナデンサ様層が平行に配
列してhる。たとえばPYS @基底膜(Martns
z −Hernandez 9t al、Lab。
Invest、 47 : 247−257 、198
)又はR*ieh@rt O膜(Inoy* at
al、I Ca11.Blol、 97:1524−1
537.1983))と異なり、そのラミナデンサ様構
造のものは相互に結合しているが、平行な多導層状構造
のものではない。各部分は前述の他の基底膜と同様に5
nm中の索のものでありた。
)又はR*ieh@rt O膜(Inoy* at
al、I Ca11.Blol、 97:1524−1
537.1983))と異なり、そのラミナデンサ様構
造のものは相互に結合しているが、平行な多導層状構造
のものではない。各部分は前述の他の基底膜と同様に5
nm中の索のものでありた。
マトリデル(再結合基底@)は細菌学的ペトリ皿の表面
をコートするのに用いられ、a!々の細胞の成長1分化
の基板としてテストされ念。黒色](B16C3)はこ
の基底膜ゲル上で成長させたとき、組織培養表面と比較
して形態学的に川成り異なった状態水した(第7図)。
をコートするのに用いられ、a!々の細胞の成長1分化
の基板としてテストされ念。黒色](B16C3)はこ
の基底膜ゲル上で成長させたとき、組織培養表面と比較
して形態学的に川成り異なった状態水した(第7図)。
この基板上において。
細胞の早期およびより広い着色化が見られた。内皮細胞
はとのゲル上で管状構造が形成し、肝細胞はこのデル基
板上で組織培養板又はタイflコラーゲン上での場合よ
シ長く生存した。生体中において、基底膜デルは末梢神
経再生を促進することが見出された( Madlson
et al 、1985 、 Exptl。
はとのゲル上で管状構造が形成し、肝細胞はこのデル基
板上で組織培養板又はタイflコラーゲン上での場合よ
シ長く生存した。生体中において、基底膜デルは末梢神
経再生を促進することが見出された( Madlson
et al 、1985 、 Exptl。
Neu10l、、88 : 767−772 )。
これらの研究から再結合基底膜は生物学的に活性であっ
て広範な細胞応答を誘発する。又、これは細胞接着、成
長および分化を各成分について知られているものを超え
る程度に補助、促進し得るから、このグルはこれらの分
子を特異、かつ活性的配置で含んでいる本のと思われる
。
て広範な細胞応答を誘発する。又、これは細胞接着、成
長および分化を各成分について知られているものを超え
る程度に補助、促進し得るから、このグルはこれらの分
子を特異、かつ活性的配置で含んでいる本のと思われる
。
実施例1
操作は約1001の種に基づいておこなわれ、4℃でお
こなわれた。
こなわれた。
1、)3.4MNaCL (397N) 、0.05
4νi ト リ ス(12,1,9)、0.004M
EDTA (3,0g)、0.002MNEM (0,
511)に水を加え2Lとし、pH=7.4に調整され
た3、 4 NaCL緩衝液200 ml中に腫を均質
化する。
4νi ト リ ス(12,1,9)、0.004M
EDTA (3,0g)、0.002MNEM (0,
511)に水を加え2Lとし、pH=7.4に調整され
た3、 4 NaCL緩衝液200 ml中に腫を均質
化する。
2、)10.00 ORPMで15分遠心分離し、上澄
液を棄てる。
液を棄てる。
3、)橿残渣(−a、 4 M NaCL緩衝液中)を
均質化する。
均質化する。
4、)10.00 ORPMで15分遠心分離し、上澄
液を棄てる。
液を棄てる。
5、)3.4 M NaCt緩衝液中の腫残渣を均質化
する。
する。
6、)10. OOORPMで15分遠心分離し、上澄
液を棄てる。
液を棄てる。
7、)2 M尿素(240!り、0.05 M )リス
(12,1、i? )、0.15MNaCt(18,!
i’)に水を加え2tにし、−7,4に調整した2M尿
素緩衝液100 rnL中に;厘を均質化する。
(12,1、i? )、0.15MNaCt(18,!
i’)に水を加え2tにし、−7,4に調整した2M尿
素緩衝液100 rnL中に;厘を均質化する。
8、)4℃で1晩、撹拌する。
9、)14.00 ORPMで20分間遠心分離する。
上澄液を貯える。
10、)2M尿素緩衝液を腫残渣に加え、均質化する。
11、)14. OOORPMで20分間遠心分離し、
上澄液を貯える・ 12、)l起上澄液を一緒にし、トリス−食塩水(0,
05Mトリス12.1 、p、 0.15MNaC21
8,0,9に水を加えて2Lとし、pH=7.4とした
もの)を用いて透析する。
上澄液を貯える・ 12、)l起上澄液を一緒にし、トリス−食塩水(0,
05Mトリス12.1 、p、 0.15MNaC21
8,0,9に水を加えて2Lとし、pH=7.4とした
もの)を用いて透析する。
lt用目盛付きシリンダを用い、トリス−食塩水900
mlとクロロホルム 5 rnL (これは滅菌処理
)を加える。
mlとクロロホルム 5 rnL (これは滅菌処理
)を加える。
13、)12時間透析する一端部のバッグを回転させる
。
。
14島析をトリス−食塩水のみに変える。
15、)トIJスー食塩水をさらに1度変えて透析する
。
。
16、殿後の透析は培地塩、たとえばDMEM又はDu
lbecco −Vogtを用いておこなう。
lbecco −Vogtを用いておこなう。
17ン寸ツクの内側を滅菌する。バッグの外側はアルコ
ールで滅菌し、止血かん子およびはさみをアルコール中
で洗い、パック中のものを滅菌容器に移す。子分けをお
こなう。コラーゲン■をこの段階で、0.1〜1 ml
/rnlの範囲で(重合したグルマトリックスの結持性
、強度をどのようにするかに準じて決定する)、液相に
加えてもよい。高い濃度のゲルはど耐久性が良好である
。
ールで滅菌し、止血かん子およびはさみをアルコール中
で洗い、パック中のものを滅菌容器に移す。子分けをお
こなう。コラーゲン■をこの段階で、0.1〜1 ml
/rnlの範囲で(重合したグルマトリックスの結持性
、強度をどのようにするかに準じて決定する)、液相に
加えてもよい。高い濃度のゲルはど耐久性が良好である
。
18)直ちに冷却する。貯そうが必要なときは一20℃
で低温保存する。グル化について:抽出物を所望の容器
に入れ、30〜120分間重合のために約24〜35℃
で温める。35瓢ペトリ皿については抽出物1 ml以
下を使用する。それを薄く広げる。
で低温保存する。グル化について:抽出物を所望の容器
に入れ、30〜120分間重合のために約24〜35℃
で温める。35瓢ペトリ皿については抽出物1 ml以
下を使用する。それを薄く広げる。
19?ルを細胞培養基層として使用するため、適当な成
長媒体a 10Lを工程(財)で得た重合グルの上に加
え、所望細胞を分散させて培地を培養する。細胞の型に
準じて成長培地を選ぶ。標準成長培地および条件は各細
胞の種類【準じてそれぞれ公知のものである。
長媒体a 10Lを工程(財)で得た重合グルの上に加
え、所望細胞を分散させて培地を培養する。細胞の型に
準じて成長培地を選ぶ。標準成長培地および条件は各細
胞の種類【準じてそれぞれ公知のものである。
ある細胞の種類についての他の成長促進方法は工程(1
枠の重合直前に冷い抽出液中に細胞を接腫し、分散させ
、ついで重合をおこない、工程(至)へ進む方法である
。たとえば毛包、セルトリ細胞等は重合前に分散させた
方が培養を良好におこなうことができる。これに対し、
上皮細胞、外分細葉細胞。
枠の重合直前に冷い抽出液中に細胞を接腫し、分散させ
、ついで重合をおこない、工程(至)へ進む方法である
。たとえば毛包、セルトリ細胞等は重合前に分散させた
方が培養を良好におこなうことができる。これに対し、
上皮細胞、外分細葉細胞。
坐骨神経細胞、を髄ノイロン、甲状腺培養等は重合され
たグル上に培養した方が良い。
たグル上に培養した方が良い。
実施例2
組成、生物学的活性において同等のものがEHSマウス
について用いたと同様の方法によりヒト胎盤から得るこ
とができる。しかし、胎盤はEIISマウス腫のような
純粋な基底膜からなるものでないので、以下に述べる如
く別の工程を必要とする。
について用いたと同様の方法によりヒト胎盤から得るこ
とができる。しかし、胎盤はEIISマウス腫のような
純粋な基底膜からなるものでないので、以下に述べる如
く別の工程を必要とする。
(a)、胎盤から索および羊膜を除去する。
(b) 、ついで胎盤を洗い、7ツ化フェニルメチルス
ルホニル;n−エチルマレイミドEiDTA 、 ヘf
スタチン等の標準グロテアーゼ抑制剤を含む3.4MN
aCt、、0.05 M トリス−HCt、pH;’7
.4からなる溶液中で均質化する。
ルホニル;n−エチルマレイミドEiDTA 、 ヘf
スタチン等の標準グロテアーゼ抑制剤を含む3.4MN
aCt、、0.05 M トリス−HCt、pH;’7
.4からなる溶液中で均質化する。
(c)、組織残渣を0.5 MNaC!、0.05 M
トリス−He/=、 pH: 7.4からなる液の等
t (1/rrL )で4℃で1晩抽出する。
トリス−He/=、 pH: 7.4からなる液の等
t (1/rrL )で4℃で1晩抽出する。
(d)、緩衝液で抽出したのちの組織を同一の緩衝液の
等量で洗い、これを抽出物と一緒にする。
等量で洗い、これを抽出物と一緒にする。
(a)、組織残渣t″2.0 M尿素、0.05 M
)リス−HC1,pk17.4からなる液の等量(g/
rnL )と4℃で1晩抽出する。
)リス−HC1,pk17.4からなる液の等量(g/
rnL )と4℃で1晩抽出する。
(f) 、 0.5 M NaCt抽出物と、2.0
M尿素抽出物を0.02.Mりん酸ナトリウム、pH7
,4で4℃で1晩透析し、透析したサンプルを0.15
M NaCLを含む0、02 M 、i5ん酸す)
IJウム緩衝液で平衡させたヘノ9リンセフアロースコ
ラムを用い別々にクロマトグラフィをおこなった。この
結合された物質を1、0 M NaC1で溶出し、透析
し、イーグルの最少必須培地とした。
M尿素抽出物を0.02.Mりん酸ナトリウム、pH7
,4で4℃で1晩透析し、透析したサンプルを0.15
M NaCLを含む0、02 M 、i5ん酸す)
IJウム緩衝液で平衡させたヘノ9リンセフアロースコ
ラムを用い別々にクロマトグラフィをおこなった。この
結合された物質を1、0 M NaC1で溶出し、透析
し、イーグルの最少必須培地とした。
ヘパリンセファロースクロマトグラフィの前後の胎盤抽
出物をその純度について比較し友。そのために、0.5
M NaCtおよび2.0M尿素抽出物、およびヘパ
リンコラムからの結合物質を水を用いて透析し、親油化
し、SOSポリアクリルアミドrルグル電気泳動させた
。これらサンプルをタン・ぐり含量についてのグロフイ
ールを測定スるためCoomasgiaブルーで着色し
、ニトロセルロースに移したのち、抗−ラミニン抗体と
免疫反応させた。 ゛その結果、基底膜の主成分である
ラミニンが、マウス基底膜製剤と同様に、ヘパリンアフ
イニティクロマトグラフイの後、そのままの状態で胎盤
抽出物中に存在することが確認された(第8図)。
出物をその純度について比較し友。そのために、0.5
M NaCtおよび2.0M尿素抽出物、およびヘパ
リンコラムからの結合物質を水を用いて透析し、親油化
し、SOSポリアクリルアミドrルグル電気泳動させた
。これらサンプルをタン・ぐり含量についてのグロフイ
ールを測定スるためCoomasgiaブルーで着色し
、ニトロセルロースに移したのち、抗−ラミニン抗体と
免疫反応させた。 ゛その結果、基底膜の主成分である
ラミニンが、マウス基底膜製剤と同様に、ヘパリンアフ
イニティクロマトグラフイの後、そのままの状態で胎盤
抽出物中に存在することが確認された(第8図)。
胎盤ラミニンはMr=400,000およびMr =2
00,000成分の連鎖を含有していた。
00,000成分の連鎖を含有していた。
この物質の生物学的活性を神経軸索突起について、NG
108−15神経芽細胞ト神経膠腫混成細胞を用いてテ
ストした。これらの細胞は抽出物およびへ・母リン結合
物質に対して急速(2時間以内)に応答した。すなわち
、長い神経軸索突起の成長をおこないながら応答した(
第9図)。テストすべき物質をイーグルの最少必須培地
(血清。
108−15神経芽細胞ト神経膠腫混成細胞を用いてテ
ストした。これらの細胞は抽出物およびへ・母リン結合
物質に対して急速(2時間以内)に応答した。すなわち
、長い神経軸索突起の成長をおこないながら応答した(
第9図)。テストすべき物質をイーグルの最少必須培地
(血清。
その他の培地を欠くもの)に新しく解離した細胞ととも
に加えた。組織培養プラスチック上で2時間培養したの
ち、胎盤物質に露出した細胞中に拡張した形成プロセス
が認められた。すなわち、胎盤物質は神経軸索突起発達
を刺激する点において、マウス;1物質とほぼ同等の活
性を示した。
に加えた。組織培養プラスチック上で2時間培養したの
ち、胎盤物質に露出した細胞中に拡張した形成プロセス
が認められた。すなわち、胎盤物質は神経軸索突起発達
を刺激する点において、マウス;1物質とほぼ同等の活
性を示した。
全て腫細胞を転移させるため、血液流に導入し。
ついで離れた部位で流出させ成長させる。したがって腫
細胞は内皮基底膜に対し、付着し、分解し、通過して転
移する必要がある。これらは腫細胞転移に重要なことで
ある。これらのM要な工程を測測定るための特異な試験
管内テスト法を考案した。
細胞は内皮基底膜に対し、付着し、分解し、通過して転
移する必要がある。これらは腫細胞転移に重要なことで
ある。これらのM要な工程を測測定るための特異な試験
管内テスト法を考案した。
この方法は迅速で、定量的で、再現性で、非転移性と転
移性の細胞とを区別し得る。この方法はマウス再結合基
底膜を用いる。
移性の細胞とを区別し得る。この方法はマウス再結合基
底膜を用いる。
抜孔フィルタをプライドウエルポイデン(Boyden
)チャンバー内に配置した。下方室には誘引剤としてフ
ィブロブラスト培地又はラミニンを設けた。
)チャンバー内に配置した。下方室には誘引剤としてフ
ィブロブラスト培地又はラミニンを設けた。
マウス(ネズミ)基底膜抽出物50μlをこのフィルタ
(上部室に設けたもの)の上に置き、37℃で重合させ
た。イーグルの最少必須培地又は他の適当な培地中の細
胞を上方ウェルに加え、チャンバー全体を37℃で、9
5%空気、5%CO2中で5時間培養した。この間に転
移性細胞をマ) IJフックス付着させ、マトリックス
を分解させ、その中およびフィルタ孔内を通過させた。
(上部室に設けたもの)の上に置き、37℃で重合させ
た。イーグルの最少必須培地又は他の適当な培地中の細
胞を上方ウェルに加え、チャンバー全体を37℃で、9
5%空気、5%CO2中で5時間培養した。この間に転
移性細胞をマ) IJフックス付着させ、マトリックス
を分解させ、その中およびフィルタ孔内を通過させた。
この方法を第10図に示す。マ) IJフックス侵入し
た細胞数はフィルタ孔の下面で定量することができた。
た細胞数はフィルタ孔の下面で定量することができた。
たとえば細胞をDifquick (Havelco)
で着色したのち、顕微鏡で算定する。その他、細胞を放
射能ラベル化した場合はシンチレーションカウンターで
直接測定することができる。
で着色したのち、顕微鏡で算定する。その他、細胞を放
射能ラベル化した場合はシンチレーションカウンターで
直接測定することができる。
生体中で非転移性の細胞はマトリックスを侵入しない。
すなわち、1フィールド当り5個以下の細胞がフィルタ
、の下面に見られたにすぎない。これに対し、生体中で
転移性の細胞は高いフィールド当Dlo個以上の細胞が
フィルタの下面に見られる。公知の転移性の細胞株(1
0以上のネズミおよびヒトaa胞)をテストし、その結
果、#l胞の接着能1分解能および移行能(再結合基底
膜)と、転移性との間に直接的関係が存在することが見
出された(表11)。 11“表■ NIH3T3フィブロプラスト 不町 不可
NIH3T3 (RASで感染) 可
可NIH3T3 (MOSで感染) 可
可NIH3T3 (ssvで感染)回訓Nl
ll3T3 (M〜fSV テ感染)回訓B16Fl
黒色1匝 可 可B16
F10 # 町
町B16BL6 u
可 可B16Br2 1
町 町に−1
7357Cll0 不可 不可に−17351
1Cll0 可 町MC−18
0類表皮ガン 可 可A−204
横絞筋肉腫 可 可PA−1奇形種
可 可PC−3前立線ガン
可 町MALMg 3m 黒
色種 可 可5W620 結腸
腺腫 可 町MCF −7胸部ガ
ン 不町 不可MCF −7胸部ガン
および oj’ i:iJエストラ
ゾオール 細胞はBoydsnチャンバー試験において5時間おこ
なった。フィルタの下面に5細胞/フイールド以下現わ
れたものは非転移性(不可)とし、同じく10細胞、/
フィールド以上の細胞株は転移性(可)とした。腫瘍を
生体中で形成し得る細胞株の機能については公知である
。
、の下面に見られたにすぎない。これに対し、生体中で
転移性の細胞は高いフィールド当Dlo個以上の細胞が
フィルタの下面に見られる。公知の転移性の細胞株(1
0以上のネズミおよびヒトaa胞)をテストし、その結
果、#l胞の接着能1分解能および移行能(再結合基底
膜)と、転移性との間に直接的関係が存在することが見
出された(表11)。 11“表■ NIH3T3フィブロプラスト 不町 不可
NIH3T3 (RASで感染) 可
可NIH3T3 (MOSで感染) 可
可NIH3T3 (ssvで感染)回訓Nl
ll3T3 (M〜fSV テ感染)回訓B16Fl
黒色1匝 可 可B16
F10 # 町
町B16BL6 u
可 可B16Br2 1
町 町に−1
7357Cll0 不可 不可に−17351
1Cll0 可 町MC−18
0類表皮ガン 可 可A−204
横絞筋肉腫 可 可PA−1奇形種
可 可PC−3前立線ガン
可 町MALMg 3m 黒
色種 可 可5W620 結腸
腺腫 可 町MCF −7胸部ガ
ン 不町 不可MCF −7胸部ガン
および oj’ i:iJエストラ
ゾオール 細胞はBoydsnチャンバー試験において5時間おこ
なった。フィルタの下面に5細胞/フイールド以下現わ
れたものは非転移性(不可)とし、同じく10細胞、/
フィールド以上の細胞株は転移性(可)とした。腫瘍を
生体中で形成し得る細胞株の機能については公知である
。
転移性細胞の選択
大きい転移性細胞はその接着能、分解能および移行能(
再結合基底膜に対して)に基づいて純粋な形で選択し、
得ることができる。ネズミ基底膜抽出物を組織培養皿(
0,5rnk−径)上に置き、37℃で30分間重合し
た。これら細胞は滅菌状態で完全培地に成長できるよう
にして載せた。2日後、転移性細胞が付着し、分解を経
て、マ) IJフックス中移行しプラスチック皿の表面
に現われた。これを第11図に示す。この表面の転移性
細胞を再結合基底膜ゲルを除去したのち回収した。
再結合基底膜に対して)に基づいて純粋な形で選択し、
得ることができる。ネズミ基底膜抽出物を組織培養皿(
0,5rnk−径)上に置き、37℃で30分間重合し
た。これら細胞は滅菌状態で完全培地に成長できるよう
にして載せた。2日後、転移性細胞が付着し、分解を経
て、マ) IJフックス中移行しプラスチック皿の表面
に現われた。これを第11図に示す。この表面の転移性
細胞を再結合基底膜ゲルを除去したのち回収した。
非転移性細胞はこの方法が適応されず、極めて稀れにマ
トリダル中又はグラスチック皿上に2日後に細胞fc認
めることができた(表m)。転移性細胞はこのマトリッ
クスに対し、付着し、分解作用を示し、さらにその中を
移行し多量に培養皿表面に発現する。この選ばれた細胞
、すなわちこのマ) IJフックス通過移行した細胞1
腫瘍細胞移行試験(Tumor Ce1l Invas
ion As5ay )で再テストしたところ、よ)均
質で移行密度の大きい細胞が認められた。
トリダル中又はグラスチック皿上に2日後に細胞fc認
めることができた(表m)。転移性細胞はこのマトリッ
クスに対し、付着し、分解作用を示し、さらにその中を
移行し多量に培養皿表面に発現する。この選ばれた細胞
、すなわちこのマ) IJフックス通過移行した細胞1
腫瘍細胞移行試験(Tumor Ce1l Invas
ion As5ay )で再テストしたところ、よ)均
質で移行密度の大きい細胞が認められた。
表■
選択されなかった細胞
Cll0(非転移性) 2±1C13(低転移
性) 6±1M2 (高転移性)
16±1選択された細胞 Cll0 19士1 M2 19±3なお、全ての細
胞はM、D、 Anderson病院(Ho、usto
nsテキサス州、米国)から入手した。選ばれた細胞は
親株でマドI))fkを化学的侵蝕し、分離し、成長し
た。その移行能金再テストしたところ、よシ強い移行能
を示した。上記データはマド+)l’ル士S、D、を移
行した細胞凝集体の集を表わしている。
性) 6±1M2 (高転移性)
16±1選択された細胞 Cll0 19士1 M2 19±3なお、全ての細
胞はM、D、 Anderson病院(Ho、usto
nsテキサス州、米国)から入手した。選ばれた細胞は
親株でマドI))fkを化学的侵蝕し、分離し、成長し
た。その移行能金再テストしたところ、よシ強い移行能
を示した。上記データはマド+)l’ル士S、D、を移
行した細胞凝集体の集を表わしている。
第1図は基底膜抽出物からの基底膜成分のグル化に対す
るタイプ■コラーrン、ヘパランスルフェートプロテオ
グリカンおよびヘノ千ランの影響を示す図であって、抽
出物100μlに対し、各成分を加え、O,15MNa
CL、0.05 M )リス−HCL tp)17.4
中、35℃で1時間培養したものである。 各サンプルはついで遠心分離され、不溶物質はサンプル
緩衝液中に溶かし次。又、各サンプルの等11℃5%ア
クリルアミド中で電気泳動させ念。グルの濃度測定走査
によシイレット化され友タンパク質の定量をおこなった
。仏)はグル中の化タンパク量に対するタイプ■コラー
ゲンの影響を示し、Φ)はグル中の化タンパク量に対す
るタイプ■コラーゲン、ヘパランスルフェートプロテオ
グリカン、ヘノ々ランの量的影響を示している。 第2図は基底膜抽出物のグル化に対するタイプ■コラー
ゲンの添加および時間的影響を示している。条件は第1
図と同様である。タイプ■コラーrン(50Mg)の存
在下(・)、非存在下(○)での比較がなされている。 第3図は基底膜抽出物のグル化と温度との関係金示す図
である。これは第2図の凡例通りタイグ■コラーrン(
50μμ)の存在下でおこなわれた。 第4図はグルの溶解後の基底膜の再ゲル化能を示す図で
ある。1全抽出”と記載された最初の線は出発物質の組
成を示している。“第1のグル”はタイプ■コラーrン
の存在下で形成されたグル中の成分金示している。タイ
プ■コラーゲンの非存在下で形成されたグル中の物質i
2.0Mグラニシン中に20分で溶解し、O] 5 M
NaCL、0.05 Mトリス−HCt、 d(= 7
.4を用い透析し、タイプ■コラーゲンの存在下又は非
存在下で再グル化した(2回目のグル)。このサイクル
をさらに2回縁シ返した(第3回、第4回目のケ゛ル)
。又、グルの等量を5%アクリルアミドダル中で電気泳
動させた。 第5図は2.0M尿累抽出液のセファロース4Bコラム
クロマトグラフイを示している。全抽出物の2mt(2
M尿素、 0.15 M NaC4,0,05M )リ
スHC1,pH=7.4<解離性) 、 又1d O,
5M NaC1゜0.05M)リス−HC2,pH=
7.4 (結合性)に平衡させた)を相応する緩衝液で
平衡させたセファロース4Bコラム(2X60cIn)
に導入した(A)。 03)は結合性のものについて、(Qは解離性のものに
ついてSDSポリアクリルアミドゲルで分析した結果を
示す。さらに結合性条件でコラムから溶出された物質を
回転影付けにより電子顕微鏡で検査した体)。ピーク分
画の最も共通する錯体は中央のへパランスルフェートプ
ロテオグリカンと周辺のラミニン分子である。゛エンタ
フチンおよびニドダンは小分子であって見えないが存在
することが知られている。 第6図は再結合グルと真正の基底膜の電子顕微鏡写真図
である。(4)はタイプ■コラーゲン又はヘパランスル
フェートプロテオグリカンの非存在下で形成されたグル
を示す。@)はタイプ■コラーrン、ヘノ臂うンスルフ
ェートフロテオクリカンノ存在下で形成されたグルを示
す。グルの端部が上部にある。このグルは鋼状tなし、
その構造は巾が生の基底膜のラミナデンサと似ている。 厚さは多少変化している。(c)は腎細管(100#m
ラットからのもの)基底膜で、ラミナルシダとラミナデ
ンサとからなっている。ラミナデンサの延長部は細胞膜
に接している(矢線先端)。Bar=200μmX 4
7.500 。 第7図は基底膜のB16C3メラニン形成の形態学およ
び分化に対する影響を示し1いる。0.15MNaCL
、 0.05 M )リス−HCL 、 p)i=
7.4中のEH8−腫の滅菌2M尿素抽出物をベトリ皿
表面に37℃、30分でグル化させ、同数の細胞をyル
(左)上、又は対照組織培養プラスチック皿に載せた。 20m1iチロシン、グンタミシン、グルタミンおよび
5%胎児ウシ血清を含むDMEM中で1週間培養させた
のち、細胞の写真を取りたものであゃ、(A)は細胞に
よるメラニン形成の評価および形態を示し、小)は皿を
直接見た図である。端のグルは偏向させて、細胞がそれ
に接していることを示している。 第8図はヘパリンアフィニティクロマトグラフィののち
の胎盤の2.0M尿素抽出物のCoomasaieブル
ースナインであってラミニンの純度を示している。 第9図はノイロンプロセス形成に対するヒト胎盤マトリ
グルの影響、丁なわち神経軸索突起を強く促進すること
を示している。 第10図はマトリグルを用いた腫細胞転移性テストを示
す図。 第11図はマトリグルを用いた転移性細胞選択を示す図
である。 出願人代理人 弁理士 鈴・江 武 彦図面の浄書(内
容に変更なし) ケ゛ルイしに対するタイア■フラープ°ンの11−0
1 5 102550100μ9 タイア■フラーデ゛シ糸カ。 FIG、鎮 添mt、μ9 FIG、Ib Lf′ル化量(’/、) す゛°ル化装 (’10”) W 呻 −−− 1綜天シ理屹王由品物の4ド子曹子 醋公A件 介I!!ut #離条許 ・ ″、 ツ ・2 、A、 ヘノVリンアフィニティク0マトグ)フイかリアクリル
アミドデル FIG、8 手 続 7市 、L−E 書(方式) 71
.・11件の表示 特願昭61−203534号 2、発明の名称 細胞培養組成物およびその用途 3、補正をする者 π件との関係 特許出願人 名称 アメリカ合衆国 4、代理人 住所 東京都千代田区霞が関3丁目7番2号 UBEビ
ルリt・、・ : 適正な願書(代表者の氏名)、委任状およびその訳文。 明細書1図面、代表者資格証明書 、補正の内容 (1)委任状およびその訳文並びに適正な願書は別紙の
通り(2)明細書の浄8(内容に変更なし)(3)明細
書第53頁第2行目に於て「第1U5!Jは・・・」と
あるを「第1a図および第1b図はともに・・・」と訂
正する。 (4)明細書第頁第4行目ないし第15行目に於て[(
A)はゲル中の総タンパク量に対するタイプ■コラーゲ
ンの影響を示し、(B)は・・・」とあるを「このうち
第1a図はゲル中の総タンパク量に対するタイプ■コラ
ーゲンの影響を示した生物の形態の写真、第1b図は・
・・」と訂正する。 (5)明細書第54頁第15行目に於て「・・・を示す
図である。」とあるを 「・・・を示す生物の形態の写
真である。」と訂正する。 (6)明細書第55頁第15行目ないし第56頁第8行
目に於て「第5図は・・・を示している。・・・に導入
した(A)、(B)は結合性のものについて、(c)は
・・・を示す、ざらに・・・した(A)。」とあるを「
第5A図、第5B図および第5C図は・m−を示してい
る。 このうち、第5A図は・拳・に導入した場合を示し、第
5A図の下部の図は吸光度を示す線図、上部の図はその
ピーク部分における生物の形態の写真である。第5B図
は結合性のものについての生物の形態の写真、第5C図
は・や・を示す生物の形態の写真である。なお、ここに
おいて、・・・した、」と訂正する。 (7)明細書第57頁第4行目ないし第5行目に於て「
第6図は再結合ゲルと真正の基底膜の電子顕微鏡写真図
である。 (A)は・・・」とあるを「第6図は再結合ゲルと真正
の基底膜を電子顕微鏡で拡大した生物の形態を示す写真
である。このうち、(A)は・・・」と訂正する。 (8)明細書第58頁第5行目に於て「第7図は・・・
」とあるを「第7A図および第7B図は・・・」と訂正
する。 (3)明細書第59頁第1行目ないし第4行目に於て「
(A)は細胞によるメラニン形成の評価および形態を示
し。 (B)は皿を直接見た図である。」とあるを「このうち
第7A図は細胞によるメラニン形成の評価および形態を
示した生物の形態を示す写真、第7B図は血中のものを
直接見た生物の形態を示す写真である。」と訂正する。 (10)明細書同頁第9行目に於て 「拳・・の純度を
示している。」とあるを「・・・の純度を示す生物の形
態を示す写真である。」と訂正する。 (11)明細書第頁第2行目に於て「・・・を示してい
る。」とあるを「・・・示す生物の形態を示す写真であ
る。」と訂正する。 (12)図面の浄書 (内容に変更なし)(13)代表
者資格証明書の原木については、特願昭80−4097
5号にて、昭和80年8月3日提出のものを援用する。
るタイプ■コラーrン、ヘパランスルフェートプロテオ
グリカンおよびヘノ千ランの影響を示す図であって、抽
出物100μlに対し、各成分を加え、O,15MNa
CL、0.05 M )リス−HCL tp)17.4
中、35℃で1時間培養したものである。 各サンプルはついで遠心分離され、不溶物質はサンプル
緩衝液中に溶かし次。又、各サンプルの等11℃5%ア
クリルアミド中で電気泳動させ念。グルの濃度測定走査
によシイレット化され友タンパク質の定量をおこなった
。仏)はグル中の化タンパク量に対するタイプ■コラー
ゲンの影響を示し、Φ)はグル中の化タンパク量に対す
るタイプ■コラーゲン、ヘパランスルフェートプロテオ
グリカン、ヘノ々ランの量的影響を示している。 第2図は基底膜抽出物のグル化に対するタイプ■コラー
ゲンの添加および時間的影響を示している。条件は第1
図と同様である。タイプ■コラーrン(50Mg)の存
在下(・)、非存在下(○)での比較がなされている。 第3図は基底膜抽出物のグル化と温度との関係金示す図
である。これは第2図の凡例通りタイグ■コラーrン(
50μμ)の存在下でおこなわれた。 第4図はグルの溶解後の基底膜の再ゲル化能を示す図で
ある。1全抽出”と記載された最初の線は出発物質の組
成を示している。“第1のグル”はタイプ■コラーrン
の存在下で形成されたグル中の成分金示している。タイ
プ■コラーゲンの非存在下で形成されたグル中の物質i
2.0Mグラニシン中に20分で溶解し、O] 5 M
NaCL、0.05 Mトリス−HCt、 d(= 7
.4を用い透析し、タイプ■コラーゲンの存在下又は非
存在下で再グル化した(2回目のグル)。このサイクル
をさらに2回縁シ返した(第3回、第4回目のケ゛ル)
。又、グルの等量を5%アクリルアミドダル中で電気泳
動させた。 第5図は2.0M尿累抽出液のセファロース4Bコラム
クロマトグラフイを示している。全抽出物の2mt(2
M尿素、 0.15 M NaC4,0,05M )リ
スHC1,pH=7.4<解離性) 、 又1d O,
5M NaC1゜0.05M)リス−HC2,pH=
7.4 (結合性)に平衡させた)を相応する緩衝液で
平衡させたセファロース4Bコラム(2X60cIn)
に導入した(A)。 03)は結合性のものについて、(Qは解離性のものに
ついてSDSポリアクリルアミドゲルで分析した結果を
示す。さらに結合性条件でコラムから溶出された物質を
回転影付けにより電子顕微鏡で検査した体)。ピーク分
画の最も共通する錯体は中央のへパランスルフェートプ
ロテオグリカンと周辺のラミニン分子である。゛エンタ
フチンおよびニドダンは小分子であって見えないが存在
することが知られている。 第6図は再結合グルと真正の基底膜の電子顕微鏡写真図
である。(4)はタイプ■コラーゲン又はヘパランスル
フェートプロテオグリカンの非存在下で形成されたグル
を示す。@)はタイプ■コラーrン、ヘノ臂うンスルフ
ェートフロテオクリカンノ存在下で形成されたグルを示
す。グルの端部が上部にある。このグルは鋼状tなし、
その構造は巾が生の基底膜のラミナデンサと似ている。 厚さは多少変化している。(c)は腎細管(100#m
ラットからのもの)基底膜で、ラミナルシダとラミナデ
ンサとからなっている。ラミナデンサの延長部は細胞膜
に接している(矢線先端)。Bar=200μmX 4
7.500 。 第7図は基底膜のB16C3メラニン形成の形態学およ
び分化に対する影響を示し1いる。0.15MNaCL
、 0.05 M )リス−HCL 、 p)i=
7.4中のEH8−腫の滅菌2M尿素抽出物をベトリ皿
表面に37℃、30分でグル化させ、同数の細胞をyル
(左)上、又は対照組織培養プラスチック皿に載せた。 20m1iチロシン、グンタミシン、グルタミンおよび
5%胎児ウシ血清を含むDMEM中で1週間培養させた
のち、細胞の写真を取りたものであゃ、(A)は細胞に
よるメラニン形成の評価および形態を示し、小)は皿を
直接見た図である。端のグルは偏向させて、細胞がそれ
に接していることを示している。 第8図はヘパリンアフィニティクロマトグラフィののち
の胎盤の2.0M尿素抽出物のCoomasaieブル
ースナインであってラミニンの純度を示している。 第9図はノイロンプロセス形成に対するヒト胎盤マトリ
グルの影響、丁なわち神経軸索突起を強く促進すること
を示している。 第10図はマトリグルを用いた腫細胞転移性テストを示
す図。 第11図はマトリグルを用いた転移性細胞選択を示す図
である。 出願人代理人 弁理士 鈴・江 武 彦図面の浄書(内
容に変更なし) ケ゛ルイしに対するタイア■フラープ°ンの11−0
1 5 102550100μ9 タイア■フラーデ゛シ糸カ。 FIG、鎮 添mt、μ9 FIG、Ib Lf′ル化量(’/、) す゛°ル化装 (’10”) W 呻 −−− 1綜天シ理屹王由品物の4ド子曹子 醋公A件 介I!!ut #離条許 ・ ″、 ツ ・2 、A、 ヘノVリンアフィニティク0マトグ)フイかリアクリル
アミドデル FIG、8 手 続 7市 、L−E 書(方式) 71
.・11件の表示 特願昭61−203534号 2、発明の名称 細胞培養組成物およびその用途 3、補正をする者 π件との関係 特許出願人 名称 アメリカ合衆国 4、代理人 住所 東京都千代田区霞が関3丁目7番2号 UBEビ
ルリt・、・ : 適正な願書(代表者の氏名)、委任状およびその訳文。 明細書1図面、代表者資格証明書 、補正の内容 (1)委任状およびその訳文並びに適正な願書は別紙の
通り(2)明細書の浄8(内容に変更なし)(3)明細
書第53頁第2行目に於て「第1U5!Jは・・・」と
あるを「第1a図および第1b図はともに・・・」と訂
正する。 (4)明細書第頁第4行目ないし第15行目に於て[(
A)はゲル中の総タンパク量に対するタイプ■コラーゲ
ンの影響を示し、(B)は・・・」とあるを「このうち
第1a図はゲル中の総タンパク量に対するタイプ■コラ
ーゲンの影響を示した生物の形態の写真、第1b図は・
・・」と訂正する。 (5)明細書第54頁第15行目に於て「・・・を示す
図である。」とあるを 「・・・を示す生物の形態の写
真である。」と訂正する。 (6)明細書第55頁第15行目ないし第56頁第8行
目に於て「第5図は・・・を示している。・・・に導入
した(A)、(B)は結合性のものについて、(c)は
・・・を示す、ざらに・・・した(A)。」とあるを「
第5A図、第5B図および第5C図は・m−を示してい
る。 このうち、第5A図は・拳・に導入した場合を示し、第
5A図の下部の図は吸光度を示す線図、上部の図はその
ピーク部分における生物の形態の写真である。第5B図
は結合性のものについての生物の形態の写真、第5C図
は・や・を示す生物の形態の写真である。なお、ここに
おいて、・・・した、」と訂正する。 (7)明細書第57頁第4行目ないし第5行目に於て「
第6図は再結合ゲルと真正の基底膜の電子顕微鏡写真図
である。 (A)は・・・」とあるを「第6図は再結合ゲルと真正
の基底膜を電子顕微鏡で拡大した生物の形態を示す写真
である。このうち、(A)は・・・」と訂正する。 (8)明細書第58頁第5行目に於て「第7図は・・・
」とあるを「第7A図および第7B図は・・・」と訂正
する。 (3)明細書第59頁第1行目ないし第4行目に於て「
(A)は細胞によるメラニン形成の評価および形態を示
し。 (B)は皿を直接見た図である。」とあるを「このうち
第7A図は細胞によるメラニン形成の評価および形態を
示した生物の形態を示す写真、第7B図は血中のものを
直接見た生物の形態を示す写真である。」と訂正する。 (10)明細書同頁第9行目に於て 「拳・・の純度を
示している。」とあるを「・・・の純度を示す生物の形
態を示す写真である。」と訂正する。 (11)明細書第頁第2行目に於て「・・・を示してい
る。」とあるを「・・・示す生物の形態を示す写真であ
る。」と訂正する。 (12)図面の浄書 (内容に変更なし)(13)代表
者資格証明書の原木については、特願昭80−4097
5号にて、昭和80年8月3日提出のものを援用する。
Claims (17)
- (1)60〜85重量%のラミニン、5〜30重量%の
コラーゲンIV、1〜10重量%のニドゲン、1〜10重
量%のヘパランスルフェートプロテオグリカンおよび1
〜5重量%のエントアクチンを含む抽出物からなる細胞
培養組成物であって、加熱により重合し、細胞成長およ
び分化を促進し得るものであることを特徴とする組成物
。 - (2)該抽出物はエンゲルブレス−ホルム−スワルム腫
(Engelbreth−Holm−Swarm)から
得られるものである特許請求の範囲第1項記載の組成物
。 - (3)該抽出物がヒト胎盤から得られるものである特許
請求の範囲第1項記載の組成物。 - (4)該組成物が重合の結果、三次元マトリックスを形
成するものである特許請求の範囲第3項記載の組成物。 - (5)細胞成長促進は試験管内および生体内でおこなう
ことができるものである特許請求の範囲第4項記載の組
成物。 - (6)該組成物が上皮細胞の成長および分化を補助し得
るものである特許請求の範囲第5項記載の組成物。 - (7)該組成物が神経軸索突起の成長および分化を補助
し得るものである特許請求の範囲第5項記載の組成物。 - (8)エンゲルブレス−ホルム−スワルム腫から下記方
法で得られ、細胞の成長および分化を促進し得る生物学
的活性抽出物; すなわち、4℃の温度下で、 (a)上記腫を適当な第1の緩衝液中で多数回均質化し
、各均質工程ののち可溶分画を廃棄して不要成分を除去
する工程と; (b)適当な尿素緩衝液中で残留する腫を抽出し、これ
を16〜18時間撹拌する工程と; (c)工程(b)からの抽出物を分離し、貯え、これを
工程(b)を繰り返す毎におこなう工程と;(d)工程
(c)からの抽出物を総て一緒にして適当な滅菌緩衝液
を用いて、かつ、この緩衝液を何回も変えながら透析す
る工程と; (e)得られた透析液を培養されるべき細胞に接腫する
前又は後に、該透析液を重合して、細胞培養のための基
層として利用する工程とを具備してなる方法からなるも
の。 - (9)第1の緩衝液がpH=7.4の3.4MNaCl
緩衝液である特許請求の範囲第8項記載の抽出物。 - (10)尿素緩衝液がpH=7.4の2M尿素緩衝液で
ある特許請求の範囲第8項記載の抽出物。 - (11)滅菌緩衝液がクロロホルムを滅菌量含むイーグ
ルの最少必須培地である特許請求の範囲第8項記載の抽
出物。 - (12)透析液を24〜35℃で重合する特許請求の範
囲第8項記載の抽出物。 - (13)上皮細胞の成長と分化を補助し得る特許請求の
範囲第8項記載の抽出物。 - (14)神経軸索細胞の成長および分化を補助し得る特
許請求の範囲第8項記載の抽出物。 - (15)ヒト胎盤から下記方法で得られ、細胞の成長お
よび分化を促進し得る生物学的活性抽出物;すなわち、
4℃の温度下で、 (a)上記腫を適当な第1の緩衝液中で多数回均質化し
、各均質工程ののち可溶分画を廃棄して不要成分を除去
する工程と; (b)適当な尿素緩衝液中で残留する腫を抽出し、これ
を16〜18時間撹拌する工程と; (c)工程(b)からの抽出物を分離し、貯え、これを
工程(b)を繰り返す毎におこなう工程と;(d)工程
(c)からの抽出物を総て一緒にして、これをヘパラン
アフィニティーコラムへ移し、吸着、ついで生理学的濃
度より大きい濃度の塩溶液で結合物質を溶出する工程と
; (e)適当な滅菌緩衝液を用いて、かつ、この緩衝液を
何回も変えながら透析する工程と; (f)得られた透析液を培養されるべき細胞に接腫する
前又は後に、該透析液を重合して、細胞培養のための基
層として利用する工程とを具備してなる方法からなるも
の。 - (16)腫細胞の転移性能を判定する方法であって、(
a)特許請求の範囲第1項記載の腫抽出物50μlない
し100μlを懸濁させた核孔フィルタ上に載置させて
、該抽出物を重合させる工程と; (b)緩衝された媒体中で、検査されるべき腫細胞の懸
濁された単一細胞層を上記重合層上に置き、該細胞を3
7℃、5時間、上記の重合された抽出物に付着させ、か
つその中を移行させる工程と;(c)核孔フィルタの反
対側表面上に移行した細胞の存在を判定する工程とから
なるもの。 - (17)移行性腫細胞を単離する方法であって、(a)
特許請求の範囲第1項記載の腫抽出物1〜2mlを組織
培養皿上に載せ、該抽出物を重合化させる工程と; (b)緩衝媒体中で、この重合された層上に懸濁腫細胞
の単一細胞層を載せる工程と; (c)この培養皿を37℃で48時間、培養に供する工
程と; (d)この培養皿から重合されたマトリックスを除去す
る工程と: (e)この培養皿に付着した細胞を成長媒体中で成長さ
せる工程とを具備してなるもの。
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