ITCZ20090001A1 - Isolamento e messa in coltura di cellule epiteliali tumorali dal sangue e dai suoi derivati in pazienti affetti da cancro epiteliale solido - Google Patents
Isolamento e messa in coltura di cellule epiteliali tumorali dal sangue e dai suoi derivati in pazienti affetti da cancro epiteliale solido Download PDFInfo
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Description
DESCRIZIONE
DELL<'>INVENZIONE INDUSTRIALE AVENTE PER TITOLO:
ISOLAMENTO E MESSA IN COLTURA DI CELLULE EPITELIALI TUMORALI DAL SANGUE e dai suoi derivati IN PAZIENTI AFFETTI DA CANCRO EPITELIALE SOLIDO.
TESTO DELLA DESCRIZIONE L’isolamento e la messa in coltura di cellule epiteliali tumorali circolanti in opportuno mezzo di differenziazione, derivate dal sangue periferico nei soggetti affetti da carcinoma epiteliale costituisce una metodica nuova, che rivela tramite un passaggio in vitro, la presenza di una popolazione di cellule circolanti con proprietà pluri differenziati ve altrimenti definite dalla letteratura scientifica corrente come popolazione transitoria tumorale multidifferenziante: tumoral transit amplifying population. Lo studio della popolazione tumorale circolante (CTC) permette di monitorare il decorso della patologia neoplastica. Il metodo qui presentato ha permesso di isolare e caratterizzare la popolazione epiteliale circolante nei campioni di sangue in pazienti affetti da carcinoma della mammella, del polmone o della prostata, del colon, del sistema nervoso centrale. STATO DELL<'>ARTE: Molti approcci sperimentali sono riportati in letteratura per isolare e selezionare le CTC con sorter e/0 macchinari di citofluorimetria ( Terstappen et al 1998), con Fuso di beads immunomagnetiche (Zieglschmid et al 2005) o di sistemi di imaging sofisticati (Kraeft et al 2004 e Krivacic et al 2004). Recentemente Nagrath et al (Nature 2007) ha presentato un microchip che catalizza Pintereazione tra le CTC target e Panticorpo EPCAM. scelto dalPautore, diretto contro uno specifico antigene epiteliale.
PROBLEMA TECNICO; nonostante i numerosi studi il reperimento della popolazione CTC, che corrisponde a 1 cellula per IO<9>cellule nel sangue di pazienti affetti da patologia tumorale, rimane un procedimento diffìcile e complicato. SOLUZIONE DEL PROBLEMA TECNICO: La procedura qui riportata, prevede che seminando, la popolazione cellulare isolata da campioni di sangue, in un mezzo di coltura pro-differenziativo, la piccola percentuale di CTC diventa visibile attraverso la loro crescita ed aderenza in vitro che si manifesta attraverso la presenza di piccole popolazione di cellule aderenti alla piastra di semina. Pertanto, il mezzo utilizzato promuovendo il processo di differenziazione permette di evidenziare quella popolazione circolante che possiede intrinseche potenzialità prodifferenziative. La popolazione delle CTC. con questo metodo può essere seminata, coltivata per essere selezionata, studiata in termini genetico, proteomico molecolari, e fenotipicamente caratterizzata, attraverso l<'>analisi citofluorimetrica, per una serie dì specifici antigeni di superficie rappresentativi di vari gradi di differenziazione cellulare epiteliale per ulteriori selezioni. La scelta degli specifici antigeni di superficie è dipendente dalla localizzazione primitiva e dall<'>istologia del tumore di origine (definito in letteratura scientifica: tumore in situ). Questa metodologia è semplice e altamente riproducibile e può essere utilizzata da qualsiasi laboratorio. In particolare: isolate dal sangue tutte le cellule circolanti, con una procedura classica, una parte di esse, selezionata con un singolo passaggio sperimentale, viene messa in piastra per la loro coltivazione, amplificazione e conservazione. DESCRIZIONE DI UNA O PIU' FORME DI ATTUAZIONE: La medesima procedura è stata testata su liquidi biologici definiti anche sangue-derivati. La differente "resa in vitro" della popolazione di CTC isolate dai campioni di sangue e dai suoi derivati, dei pazienti con cancro epiteliale solido può essere considerato patognomonico di malattia neoplastica e metastatica e può essere utilizzato come mezzo per monitorare il decorso post-chirurgico per findividuazione precoce di lesioni recidivanti. Infine la disponibilità in vitro di cellule tumorali circolanti permette di testare la sensibilità cellulare individuale per una specifica batteria di terapie antitumorali. FUNZIONAMENTO: II mezzo utilizzato grazie alla sua composizione, promuovendo la differenziazione cellulare, permette di evidenziare quella popolazione circolante che possiede intrinseche potenzialità prodifferenziative. La popolazione di CTC isolate dai campioni di sangue e dai suoi derivati, dei pazienti con cancro epiteliale solido, seminata nel mezzo differenziante, aderisce alla piastra di semina. La conseguente "resa in vitro" è il risultato di questa semplice operazione che mette in evidenza in maniera diretta e semplice la presenza di una particolare sotto popolazione che si trova in circolo nei pazienti affetti da cancro. Cambiando mezzo e utilizzando un mezzo che favorisce la coltivazione in sospensione delle cellule, questa operazione non si attua e le CTC se pur presenti non risultano evidenti. Inoltre è risultato evidente che se otteniamo una coltura primaria di cellule tumorali, direttamente dalla massa neoplastica asportata chirurgicamente, utilizzando lo stesso metodo, la coltura cellulare che si ottiene presenta analogie fenotipiche e di espressione molecolare alla popolazione cellulare della coltura cellulare ottenuta dalle CTC dello stesso paziente. La corrispondenza tra le due colture cellulari, appartenenti allo stesso paziente ma derivate da due fonti biologiche differenti ( massa tumorale e sangue periferico) può essere verificata con l'analisi di espressione di molecole espresse sulla superfìcie cellulare e selezionando la popolazione tumorale con gli appositi presidi sperimentali. La resa in vitro degli elementi cellulari tumorali circolanti diminuisce dopo l<'>intervento chirurgico in maniera direttamente correiabile con la radicalità dell<'>intervento stesso.
VANTAGGI: L’obiettivo finale è quello di avere un sistema di procedimento rapido e veloce che ci permette di verificare la biologica persistenza di malattia tumorale, di verificare la radicalità di intervento chirurgico a scopo terapeutico e di monitoraggio in termini di diagnosi precoce della ripresa di malattia. Inoltre, la messa in coltura degli elementi cellulari tumorali e la loro conservazione apre prospettive sia nell’ambito della ricerca che della valutazione farmacologia in termini di sensibilità farmacologia individuale immediata e in differita.
VARIANTI: la procedura è applicabile anche ad altri liquidi biologici derivati dal sangue e caratteristici di distretti tissutali specifici, pertanto questa ulteriore applicazione garantisce il reperimento di cellule epiteliali e la loro identificazione e messa in coltura con risvolti diagnostici e terapeutici declinabili da caso a caso.
MODO IN CUI LTNVEZIONE POSSA ESSERE UTILIZZATA IN AMBITO INDUSTRIALE : La procedura qui descritta utilizza un mezzo di coltura in vitro di cellule umane primarie che è industrializzabile e utilizzabile come mezzo idoneo alla coltivazione e amplificazione di cellule umane differenziate. L’applicazione di questo tipo di mezzo nel contesto di questa procedura è del tutto innovativa e la sua specifica funzione in questa procedura è stata scoperta dall’inventore.
Descrizione della procedura
1 ) Provete in EDTA, 5 mi di sangue intero e/o di derivati dello stesso, agitare bene la proveta capovolgendola da 5 a 10 volte
2) Diluire con PBS IX (t.a.) 1:2 fino a 1 :4 (in base alla densità del liquido biologico di partenza)
3) Centrifuga 1500 rpm 15 minuti temperatura 20 gradi
4) Asportato il liquido di lavaggio il pellet viene risospeso in PBS IX per la successiva deposizione della sospensione cellulare sul ficoll.
5) In una falcon da 15 mi, metere 3ml di ficoll e sopra stratificare 4 mi di sospensione cellulare risospesa in PBS IX.
6) Centrifuga 1500 rpm 40 min temperatura 20 gradi.
7) Viene aspirata la frazione ( la seconda) che contiene la maggiore percentuale in cellule 8) La sospensione cellulare così ottenuta viene addizionata con PBS IX ( 1 :3) e centrifuga a 1000 rpm 10 min temp 20 gradi.
9) Questo step viene ripetuto due volte.
10) Aspirato il sumatante il pellet viene risospeso in Primary Culture medium (PCM).
1 1 ) Un terzo della sospensione otenuta viene posta in FACS tube per la colorazione con CD133 e CK organo specifica o per Epcam.
12) La rimanente parte della sospensione viene piastrata in apposite piastre di Peti (Culture dish TC-Treated)
Timing: poco più di 20 minuti
Raccomandazioni: attenzione :il procedimento va iniziato entro e non oltre 20 min dal prelievo; importante è la procedura di asportazione della seconda frazione del ficoll . Conviene effettuarla con mano ferma e movimento circolare per evitare la contaminazione da parte di materiale cellulare e di altro tipo, presente nelle frazioni superiori e inferiori.
A)Dal momento in cui la sospensione cellulare viene piastrata decorre un periodo variabile per l’evidenza della popolazione cellulare aderente che dipende sia dalla quantità di materiale cellulare isolato che dalla variabilità individuale che dallo stato di malattia neoplastica ( si fa riferimento alla stadiazione dei tumori internazionale. International Union Agaist cancer 2002) . Di solito il tempo varia da un minimo di 4h ad un massimodi 48h.
B) quando la sospensione cellulare epiteliale è derivata da liquidi biologici derivati del sangue, come saliva, liquidi pleurici, peritoneale ecc. è bene sempre diluire non più di 1 :2 con PBS . Centrifugare come sopra anche 30 minuti. Ripetere anche due volte lo stesso step. La decisione di eseguire gli step successivi dipende dall<'>entità del pellet ottenuto ed è operatore dipendente. Criteri di inclusione: 1) l'assenza di trattamento neoadiuvante nei pazienti neoplastici.
2) analisi istologica che confermi l<'>assenza di caratteristiche antigeniche e/o fenotipiche per carcinomi a piccole cellule.
Reagentario da Preparare
PCM IX: Preparazione di una soluzione concentrata (10X) di Terreno nutritivo F-12 di HAM (Nutrient Mixture F-12 HAM. Kaighn<'>s). sciogliere in un litro di acqua autoclavata. Sterilizzare mediante filtrazione con una membrana avente porosità 0,22 micron. A partire dal terreno 10X si prepara la soluzione IX aggiungendo alla soluzione l<'>acqua necessaria per ottenere il volume finale richiesto. Alla soluzione IX ottenuta, aggiungere bicarbonato di sodio 7,5% (33.3ml di soluzione per ogni litro finale di terreno da preparare). Mescolare e correggere il pH del terreno a 7,4. Sterilizzare la soluzione con filtro da 0,22 micron. Penicellin-Streptomycin solution 1% e Fetal bovine serum 10%. Conservare il mezzo a 4°C. Prima dell’utilizzo lasciare 15 minuti a temperatura ambiente.
- Penicellin-Streptomycin solution 1%.
Se si utilizzano additivi non sterili, sterilizzare il terreno filtrandolo mediante una membrana con porosità 0,22 micron. Conservare il mezzo a 4°C. Prima dell’utilizzo lasciare 15 minuti a temperatura ambiente.
MATERIALI da consumo utilizzati
REAGENTS
• Foetal Bovine Serum Heat Inact. S.American (CE) (Invitrogen, cat. no.10500-064) • Trypsin 0,5% EDTA (Invitrogen, cat. no.25300-054)
• Penicellin-Streptomycin solution (Invitrogen, cat. no.15140-122)
• Sodium Pyruvate MEM lOOmM Invitrogen, cat. no.l 1360-09)
• Albumin from Bovine Serum, further purified Fraction V (Sigma, cat. no.A3294-l 00G) • Phosphate-Buffered Saline (PBS) IX, liquid (Invitrogen, cat. no.10010-015)
• Hepes 1M (Gibco, cat. no. 15630)
• RPMI-1640 Medium (Sigma, cat. no. R8758)
D-MEM:F-12 (1:1) Glutamax (Gibco Invitrogen, cat. no. 31331-028)
Nutrient mixture F-12 HAM, KAIGHN<'>S) (Sigma, cat. no. N3520) • D-(+)-GLUCOSE Solution (10%) (Sigma , cat. no. G8644)
• Celi Freezing Medium-Serum-Free (IX) sterile-filtered (Sigma, cat. no.C2639-50ml) • Ficoil-Paque Plus (GE Healthcare, cat. no. 17-1440-03)
• Fungizone Ampotericin B 250UG/ML (Invitrogen, cat. no. 15290-026)
• Epsoclar (Heparin Sodium)25000U.I./5ml (Mayne Pharma, cat. no. ATC BOI AB01 ) • Sodium bicarbonate. SigmaUltra, Minimum 99.5% (Sigma, cat. no. S6297)
EQU1PMENT
• Ultra Low Cluster 6Well Fiat Bottom (Corning cat.no. 3471 )
• Suspension Culture Dish 60mmxl5mm style (Corning cat.no. 430589)
• Culture dish 100mmx20mm, TC-Treated (Corning cat.no. cc430167)
• Culture dish 60mmxl5mm, TC-Treated (Corning cat.no. cc430166)
• TC flash 25 cm2 (Corning cat.no. cc430639)
• Centrifuge tube 50ml (Corning cat.no. cc430291)
• Centrifuge tube 15ml (Corning cat.no. cc430766)
• Round bottom tube 5ml polystyrene (BD Falcon ref 352052)
• Celi strainer ΙΟΟμιη nylon (BD Falcon ref 352360)
• Filter System 0.2μιη (Corning cat.no. cc430515)
• Stripettes 1 mi (Corning cat.no. cc4485)
• Stripettes 2 mi (Corning cat.no. cc4486)
• Stripettes 5 mi (Corning cat.no. cc4487)
• Stripettes 10 mi (Corning cat.no. cc4488)
• Stripetes 25 mi (Corning cat.no. cc4489)
• Forceps (Microglass Heim, cat. no. XX6200006, 180351052) • Sterile scalpels (Microglass Heim, cat. no. BA210, BA21 1)
Claims (1)
- RIVENDICAZIONI La rivendicazione riguarda l<'>uso della procedura per l’isolamento della popolazione tumorale circolante, pertanto l'inventore del procedimento ivi descritto si riserva di vietare a terzi , salvo il consenso del titolare , 1) di applicare il procedimento e il mezzo di coltura per le cellule umane utilizzato nel procedimento 2) di usare il procedimento e il mezzo di coltura per le cellule umane utilizzato nel procedimento 3) mettere in commercio procedimento e il mezzo di coltura per le cellule umane utilizzato nel procedimento 4) vendere o importare il mezzo di coltura cellulare descritto ed utilizzato in questo procedimento; 5) vendere o importare il procedimento descritto; La possibilità di poter isolare e coltivare cellule epiteliali tumorali circolanti permette di monitorare lo stato biologico di malattia neoplastica. In particolare, in tutti i pazienti sottoposti ad intervento chirurgico, il campione di sangue prelevato e processato secondo la procedura di seguito riportato, dopo un periodo variabile da paziente a paziente, mostra una popolazione cellulare aderente alla piastra di semina, con caratteristiche antigeniche specifiche della popolazione tumorale derivante dal tessuto neoplastico primitivo, di entità correiabile con lo stato di malattia.
Priority Applications (1)
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| IT000001A ITCZ20090001A1 (it) | 2009-01-13 | 2009-01-13 | Isolamento e messa in coltura di cellule epiteliali tumorali dal sangue e dai suoi derivati in pazienti affetti da cancro epiteliale solido |
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| WO2008008515A2 (en) * | 2006-07-14 | 2008-01-17 | Aviva Biosciences Corporation | Methods and compositions for detecting rare cells from a biological sample |
-
2009
- 2009-01-13 IT IT000001A patent/ITCZ20090001A1/it unknown
Patent Citations (2)
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