JP2007526761A - Blood test prototypes and methods for the detection of circulating tumor cells and endothelial cells - Google Patents

Blood test prototypes and methods for the detection of circulating tumor cells and endothelial cells Download PDF

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Abstract

転移性心血管環境または転移性胎盤環境を模倣する細胞接着マトリックスシステムを使用して、疾患を単離し、そして診断するための方法およびデバイスが開示される。この細胞接着マトリックスは、疾患（例えば、癌、心血管疾患、および胎児性疾患）に罹患した患者の処置における診断用途および治療用途のため、ならびに、転移性疾患、心血管疾患、および胎児性疾患の分子分析における研究用途のための、血液のような流体サンプル由来の標的細胞（例えば、転移性腫瘍細胞、胎児細胞、および内皮前駆細胞）の濃縮を促進する。多重分子分析を用いた、循環性の腫瘍細胞および内皮細胞の濃縮と検出とのための血液試験のプロトタイプおよび方法が、本明細書において記載される。Disclosed are methods and devices for isolating and diagnosing disease using a cell adhesion matrix system that mimics a metastatic cardiovascular or metastatic placental environment. This cell adhesion matrix is for diagnostic and therapeutic uses in the treatment of patients suffering from diseases such as cancer, cardiovascular disease, and fetal diseases, as well as metastatic, cardiovascular, and fetal diseases. Facilitates enrichment of target cells (eg, metastatic tumor cells, fetal cells, and endothelial progenitor cells) from fluid samples such as blood for research use in molecular analysis. Described herein are blood test prototypes and methods for enrichment and detection of circulating tumor cells and endothelial cells using multiplex molecular analysis.

Description

（関連出願）
本出願は、２００３年１０月３１日出願の米国仮特許出願番号６０／５１６，５７１（これより、優先権が求められる）の利益を主張する。この仮特許出願は、本明細書において参考として援用される。 (Related application)
This application claims the benefit of US Provisional Patent Application No. 60 / 516,571, filed Oct. 31, 2003, from which priority is sought. This provisional patent application is incorporated herein by reference.

（発明の背景）
（１．発明の分野）
本発明は、血液または他の組織流体サンプル（例えば、腹水、擦過標本および塗抹標本）由来の標的細胞（例えば、腫瘍細胞、胎児細胞、および血管由来の細胞）を分離するための改善された細胞接着マトリックス（「ＣＡＭ」）および改善された細胞単離デバイスに関する。より詳細には、本発明は、選択的に細胞（例えば、転移の可能性を有する標的癌細胞および／または浸潤突起（ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ）を示す内皮前駆細胞）を単離するために使用され得るＣＡＭシステムに関する。 (Background of the Invention)
(1. Field of the Invention)
The present invention provides improved cells for isolating target cells (eg, tumor cells, fetal cells, and blood vessel-derived cells) from blood or other tissue fluid samples (eg, ascites, scrapes and smears). Adhesion matrix (“CAM”) and improved cell isolation devices. More particularly, the present invention provides a CAM system that can be used to selectively isolate cells (eg, target cancer cells with the potential for metastasis and / or endothelial progenitor cells that exhibit invapopoda). About.

（２．関連技術の説明）
（循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）および癌の検出）
内皮組織の悪性腫瘍は、癌の最も一般的な形態であり、そして癌に関連する死の主な原因である。これらの腫瘍の外科的処置における進歩に起因して、死亡率は、多くの場合初期診断時には隠れている初期転移および再発に関連するようになってきている（非特許文献１；非特許文献２）。例えば、膵臓および他の胃腸（ＧＩ）器官の離れた解剖的位置は、隣接する構造を浸潤して１ｃｍより大きな腫瘍へと成長する前に膵臓癌および他のＧＩ癌が検出される可能性を低くしている（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献２；非特許文献９；非特許文献１０）。乳癌に関してでさえ、マンモグラフィーによって検出される乳癌の小腫瘍（＜１ｃｍ）の１２〜３７％が診断時に転移していた（非特許文献１１；非特許文献１２）。 (2. Explanation of related technology)
(Detection of circulating tumor cells (CTC) and cancer)
Endothelial malignancy is the most common form of cancer and is the leading cause of cancer-related death. Due to advances in surgical treatment of these tumors, mortality has become associated with early metastasis and recurrence that are often hidden at the time of initial diagnosis (Non-Patent Document 1; Non-Patent Document 2). ). For example, the distant anatomical location of the pancreas and other gastrointestinal (GI) organs may allow pancreatic and other GI cancers to be detected before they invade adjacent structures and grow into tumors larger than 1 cm. (Non-patent document 3; Non-patent document 4; Non-patent document 5; Non-patent document 6; Non-patent document 7; Non-patent document 8; Non-patent document 2; Non-patent document 9; Non-patent document 10) . Even for breast cancer, 12-37% of small breast tumors (<1 cm) detected by mammography had metastasized at diagnosis (Non-patent document 11; Non-patent document 12).

文献において、循環中に見出される内皮性腫瘍細胞が転移形成の最も初期の徴候を表すこと、および循環性腫瘍細胞（「ＣＴＣ」）が癌腫の癌進行のための独立した診断法と見なされ得ることを示す証拠が蓄積している（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献２０；非特許文献７；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献１；非特許文献２）。同様に、血流から癌細胞を単離するための信頼できる手順は、癌の臨床診断用途と治療用途との両方において顕著な影響力を有する（非特許文献１；非特許文献２）。癌を有する患者の循環中における腫瘍細胞の存在を示すための、新規な腫瘍の段階付け（Ｍｉ期と称される）が提唱されている。この段階付けは、循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出し得る血液試験の開発を保証する。癌研究分野において、既存の方法よりも検出感度を（有利には、少なくとも一桁の大きさ）上昇させ得る新規の腫瘍細胞濃縮法が待たれている（非特許文献２）。   In the literature, endothelial tumor cells found in the circulation represent the earliest signs of metastasis formation, and circulating tumor cells ("CTC") can be considered as an independent diagnostic method for cancer progression of carcinoma (Non-patent document 13; Non-patent document 14; Non-patent document 15; Non-patent document 16; Non-patent document 17; Non-patent document 18; Non-patent document 19; Non-patent document 5; Non-patent document 6; Non-patent document 20; Non-patent document 7; Non-patent document 21; Non-patent document 22; Non-patent document 23; Non-patent document 24; Similarly, reliable procedures for isolating cancer cells from the bloodstream have significant impact in both clinical diagnostic and therapeutic applications of cancer (Non-Patent Document 1; Non-Patent Document 2). A novel tumor staging (referred to as Mi stage) has been proposed to show the presence of tumor cells in the circulation of patients with cancer. This staging ensures the development of a blood test that can detect circulating tumor cells (CTC). In the field of cancer research, there is a need for a novel method for concentrating tumor cells that can increase the detection sensitivity (advantageously at least an order of magnitude) over existing methods (Non-patent Document 2).

（循環性内皮前駆細胞、血管新生および心血管の危険）
内皮細胞障害は、アテローム斑発生についての重要な刺激である（非特許文献２５）。末梢血、骨髄、および臍帯血の単核細胞画分から単離され得る循環性内皮前駆細胞（「ＣＥＣ」）は、内皮細胞障害の指標として同定されている（非特許文献２６；非特許文献２７）。研究室での証拠は、これらの細胞が多くの内皮特異的細胞表面マーカーを発現し、そして多くの内皮の特性を示すことを示唆する。これらの細胞が虚血を有する動物モデルに注入される場合、これらが迅速に新脈管形成部位に取り込まれることが記載されている。 (Circulating endothelial progenitor cells, angiogenesis and cardiovascular risk)
Endothelial cell injury is an important stimulus for the development of atherosclerotic plaque (Non-patent Document 25). Circulating endothelial progenitor cells (“CEC”) that can be isolated from the mononuclear cell fraction of peripheral blood, bone marrow, and umbilical cord blood have been identified as indicators of endothelial cell damage (Non-Patent Document 26; Non-Patent Document 27). ). Laboratory evidence suggests that these cells express many endothelium-specific cell surface markers and exhibit many endothelial properties. It has been described that when these cells are injected into an animal model with ischemia, they are rapidly taken up by the angiogenic site.

パイロット研究において、非特許文献２７は、低いＣＥＣレベルが心血管の危険因子およびに上腕の反応性と関連することを見出した。十分なＣＥＣのない内皮障害が心血管疾患の進行に影響し得ることが示唆されている。この初期研究は、心血管疾患の診断および処置におけるＣＥＣの可能性を指摘した。ＣＥＣは、細胞の循環性プールを提供して脈管形成を促進することによって、内皮修復に寄与し得る（非特許文献２８）。したがって、ＣＥＣは、心血管疾患の危険性の負の予測因子であり得る。したがって、ＣＥＣのための有効な濃縮方法は、心血管疾患の前診断および管理に非常に有用である。   In a pilot study, NPL 27 found that low CEC levels were associated with cardiovascular risk factors and upper arm responsiveness. It has been suggested that endothelial damage without sufficient CEC can affect the progression of cardiovascular disease. This initial study pointed to the potential of CEC in the diagnosis and treatment of cardiovascular disease. CEC may contribute to endothelial repair by providing a circulating pool of cells and promoting angiogenesis (28). Thus, CEC may be a negative predictor of cardiovascular disease risk. Therefore, an effective enrichment method for CEC is very useful for pre-diagnosis and management of cardiovascular disease.

（細胞の異種性および現在の細胞の分離技術）
血中に循環する腫瘍細胞および内皮前駆細胞（細胞の異種性供給源）は、まれである。これらの細胞は、分析のために分離することが困難である可能性がある。癌患者において、血中のＣＴＣまたは剥脱した異常細胞（新生物細胞）の数は、一般的に、非新生物細胞の数と比較して非常に少ない。したがって、慣習的な細胞病理学による剥脱した異常細胞の検出は、多くの場合限りがある。さらに、剥脱した細胞は、しばしば、高度に異種性であり、多くの異なる細胞型から構成されている（興味深いことに、剥脱した細胞において示差的に発現されることが最初に報告されていた多くの遺伝子は、実際は、代わりに非腫瘍細胞によって発現されていたことがわかった）。この異種性の問題と合わせて、各臨床標本中に存在する新生物細胞の頻度は様々であり、ランダムに混合された集団中の示差的な遺伝子発現の定量を偏らせ、そして複雑にする。アポトーシス細胞および新生物細胞は、一般により大きな腫瘍、末梢血および腹水の中にある。これらの細胞は、質の高いＲＮＡを含まず、したがって、分子分析のためには技術的な問題が存在する（非特許文献１９）。 (Cell heterogeneity and current cell isolation technology)
Tumor cells and endothelial progenitor cells (a heterogeneous source of cells) that circulate in the blood are rare. These cells can be difficult to separate for analysis. In cancer patients, the number of CTCs or exfoliated abnormal cells (neoplastic cells) in the blood is generally very small compared to the number of non-neoplastic cells. Therefore, the detection of detached abnormal cells by conventional cytopathology is often limited. Furthermore, exfoliated cells are often highly heterogeneous and are composed of many different cell types (interestingly, many of the first reported to be differentially expressed in exfoliated cells Was actually found to be expressed by non-tumor cells instead). Combined with this heterogeneous problem, the frequency of neoplastic cells present in each clinical specimen varies, biasing and complicating the quantification of differential gene expression in a randomly mixed population. Apoptotic and neoplastic cells are generally in larger tumors, peripheral blood and ascites. These cells do not contain high quality RNA, and therefore there are technical problems for molecular analysis (Non-patent Document 19).

循環性の腫瘍細胞および内皮細胞のための多くの細胞濃縮法が記載されている。   A number of cell enrichment methods for circulating tumor cells and endothelial cells have been described.

ａ）顕微解剖は、まれな腫瘍細胞を１つ１つ単離するために使用され得る（非特許文献２９）。この方法は、代表的に、いくつかの限界を有する：（１）その後のサンプル処理が複雑であること、（２）細胞生存度が容易に確立できないこと、そして（３）切除されるべき細胞の選択が、主に形態学的基準に基づいており、このことが高頻度に擬陽性結果を生じさせること。   a) Microdissection can be used to isolate rare tumor cells one by one (29). This method typically has several limitations: (1) subsequent sample processing is complex, (2) cell viability cannot be easily established, and (3) cells to be excised. The choice of is mainly based on morphological criteria, which frequently produces false positive results.

ｂ）腫瘍細胞の物理的特徴（例えば、形状、密度および電荷）もまた利用され得る（非特許文献３０）。有核血液細胞（成熟赤血球を欠く）において腫瘍細胞を濃縮するための数種の密度勾配遠心分離法が開発されている。密度勾配遠心分離法は、５００倍〜１０００倍の細胞濃縮を達成し得る。次いで、濃縮された腫瘍細胞は、高感度アッセイ（例えば、免疫細胞化学、および推定腫瘍マーカーもしくは推定内皮マーカー（例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）ｍＲＮＡもしくはサイトカイン１９ｍＲＮＡ）を増幅するために使用され得る逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ））を用いた分子分析に供され得る（非特許文献３１）。しかし、これらの方法は、正常細胞から生存腫瘍細胞を効率的に濃縮しない可能性がある。つまり、５００倍〜１０００倍の細胞濃縮は、多くの場合、さらなる分子分析に有害な影響を与える大きなバックグラウンドノイズを発生する比較的緩やかな濃縮であることが見出されている。さらに、物理的分離技術に基づく濃縮法は、多くの場合、面倒であり、時間がかかり、そして細胞損傷を引き起こし得る多くの工程（例えば、２〜３回より多くのの遠心）を含む。   b) The physical characteristics (eg, shape, density and charge) of tumor cells can also be utilized (Non-patent Document 30). Several density gradient centrifugation methods have been developed to concentrate tumor cells in nucleated blood cells (devoid of mature red blood cells). Density gradient centrifugation can achieve 500- to 1000-fold cell enrichment. The enriched tumor cells can then be used to amplify sensitive assays such as immunocytochemistry and putative tumor markers or putative endothelial markers such as prostate specific antigen (PSA) mRNA or cytokine 19 mRNA It can be used for molecular analysis using reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) (Non-patent Document 31). However, these methods may not efficiently enrich viable tumor cells from normal cells. That is, 500-1000 fold cell enrichment has often been found to be a relatively gradual enrichment that generates significant background noise that has a detrimental effect on further molecular analysis. Furthermore, concentration methods based on physical separation techniques are often cumbersome, time consuming and involve many steps (eg, more than a few centrifugations) that can cause cell damage.

ｃ）抗体ベースの技術は、より最近に開発されている。免疫親和法は、抗体を物理的担体または蛍光標識に付着させる工程を包含する。次いで、目的の細胞の表面に存在する標的に抗体を結合させた後、所望の細胞型について正もしくは負に濃縮するための分別工程が使用され得る。このような方法は、アフィニティークロマトグラフィー、磁気粒子分離、遠心分離または濾過、およびフローサイトメトリー（蛍光活性化細胞分別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）；ＦＡＣＳが挙げられる）を含む。   c) Antibody-based technology has been developed more recently. Immunoaffinity methods involve attaching an antibody to a physical carrier or fluorescent label. A fractionation step may then be used to bind the antibody to a target present on the surface of the cell of interest and then concentrate positively or negatively for the desired cell type. Such methods include affinity chromatography, magnetic particle separation, centrifugation or filtration, and flow cytometry (fluorescence activated cell sorting; includes FACS).

（１）フローサイトメトリーまたは蛍光活性化細胞分別法（「ＦＡＣＳ」）は、バックグラウンドの細胞から個々の細胞を１つ１つ検出および分離する。モデル実験においては、この方法は、密度勾配遠心分離によって末梢血から濃縮された単核細胞画分から乳癌細胞（非特許文献３２）および内皮前駆細胞（非特許文献２７）を検出し得る。さらに、ＦＡＣＳは、抗体被覆磁気マイクロビーズを用いた濃縮工程の後、天然に存在する血中の***の腫瘍細胞および前立腺腫瘍細胞を検出し得る（非特許文献１；非特許文献１３）。しかし、クラスターおよび集団中に存在する細胞はＦＡＣＳプロセスの間に廃棄され、そしていくつか（例えば、卵巣癌）の場合、ほとんどの細胞は、凝集体として存在し、このことは、ＦＡＣＳのＣＴＣまたはＣＥＣ検出を非常に非効率的にしている。     (1) Flow cytometry or fluorescence activated cell sorting ("FACS") detects and separates individual cells from background cells one by one. In model experiments, this method can detect breast cancer cells (Non-patent Document 32) and endothelial progenitor cells (Non-patent Document 27) from a mononuclear cell fraction concentrated from peripheral blood by density gradient centrifugation. Furthermore, FACS can detect naturally occurring breast tumor cells and prostate tumor cells in blood after an enrichment step using antibody-coated magnetic microbeads (Non-patent Document 1; Non-patent Document 13). However, cells present in clusters and populations are discarded during the FACS process, and in some cases (eg, ovarian cancer), most cells are present as aggregates, which means that the FACS CTC or CEC detection is very inefficient.

（２）抗体被覆マイクロビーズに基づくアプローチは、磁場（非特許文献１）、カラムクロマトグラフィー、遠心分離、濾過もしくはＦＡＣＳを使用して分離を達成し得る。その大きな濃縮力にもかかわらず、抗体ベースの細胞分離法に関連する内在的な限界がやはり存在する。最も重大な限界は、癌細胞が、通常、種々の程度で推定腫瘍特異的抗原を発現し（非特許文献３３）、したがって、収集の間に、多くの、ランダムでない可能性のあるサブセットの腫瘍細胞を失いやすいことである。抗体はまた、損傷細胞に対して強い非特異的親和性で結合する傾向があり、これらの細胞の、目的の細胞との同時精製を引き起こす。全体として、このような抗体ベースの細胞分離法は、望ましい偽陰性率よりも高い偽陰性率を有する。現行の抗体で開始される（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ）磁気分離法は、乳癌および前立腺癌を有する患者から、より低レベル（すなわち、１〜１００ ＣＴＣ／血液１ｍＬ）でＣＴＣを検出し（非特許文献１）、または心血管疾患の危険性を有する個体の５０ ＣＥＣ／血液１ｍＬ未満を検出した（非特許文献２７；非特許文献１３）。血液１ミリリットル（ｍＬ）または１ｇには、およそ５×１０９個の赤血球および５×１０６個の有核白血球が存在する。したがって、１ｍＬの血液から数千の癌細胞および内皮細胞の存在を検出することは、なおやりがいのある課題である（非特許文献３４）。 (2) Antibody-coated microbead based approaches can achieve separation using magnetic fields (Non-Patent Document 1), column chromatography, centrifugation, filtration or FACS. Despite its great concentrating power, there are still inherent limitations associated with antibody-based cell separation methods. The most significant limitation is that cancer cells usually express putative tumor-specific antigens to varying degrees (33), and thus many non-random subsets of tumors during collection. It is easy to lose cells. Antibodies also tend to bind with strong non-specific affinity to damaged cells, causing co-purification of these cells with the cells of interest. Overall, such antibody-based cell separation methods have a higher false negative rate than the desired false negative rate. Current antibody-initiated magnetic separation methods detect CTC at lower levels (ie, 1-100 CTC / 1 mL of blood) from patients with breast and prostate cancer (1). ), Or less than 1 mL of CEC / blood in individuals at risk for cardiovascular disease was detected (Non-patent document 27; Non-patent document 13). There are approximately 5 × 10 9 red blood cells and 5 × 10 6 nucleated white blood cells in 1 milliliter (mL) or 1 g of blood. Therefore, detecting the presence of thousands of cancer cells and endothelial cells from 1 mL of blood is still a challenging task (Non-Patent Document 34).

過去２０年にわたって、腫瘍細胞の原発性腫瘍から転移部位への移動を促進する、浸潤性腫瘍細胞の表面上に見出される特異化された複合体が特徴付けられている（非特許文献３５；非特許文献３６；非特許文献３７；非特許文献３８；非特許文献３９；非特許文献４０；非特許文献４１；非特許文献４２；非特許文献４３；非特許文献４４；非特許文献４５；非特許文献４６；非特許文献４７；非特許文献４８；非特許文献４９；非特許文献５０；非特許文献５１；非特許文献５２；非特許文献５３；非特許文献５４；非特許文献５５；非特許文献５６；非特許文献５７；非特許文献５８；非特許文献５９）。これらの複合体は、「浸潤突起（ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ）」と称されているが、内皮細胞マトリックス（ＥＣＭ）成分の複数の型に結合し、そして分解する。浸潤突起は、分化した正常血液細胞上または原発性腫瘍細胞上には見出されず、そしてこれらは、死細胞または死にゆく細胞上では有効に機能しない。浸潤突起は、循環性の内皮前駆細胞中（しかし、血液細胞の９９．９９９％より多くはそうではない）、および妊娠雌の母性血液に見出される胎児細胞中に存在する。本発明は、浸潤突起機能に基づく濃縮工程が、腹水、血液および多くの他の体液中に見出される大部分の細胞型から生存転移性腫瘍細胞および内皮細胞を分離するために強力に働くこと、ならびに上記の他の技術の限界を解決することを認めた。
Ｒａｃｉｌａ，Ｅ．，Ｅｕｈｕｓ，Ｄ．，Ｗｅｉｓｓ，Ａ．Ｊ．，Ｒａｏ，Ｃ．，ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｊ．，Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ，Ｌ．Ｗ．，およびＵｈｒ，Ｊ．Ｗ．「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ」、１９９８年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９５，４５８９４５９４ Ｐａｎｔｅｌ，Ｋ．，Ｃｏｔｅ，ＲＪ．，およびＦｏｄｓｔａｄ，Ｏ．「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ」、１９９９年、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９１，１１１３−１１２４ Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｃ．Ｃ．「Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ：Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ，ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｆｅａｔｕｒｅｓ」、２００３年、Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ １６，３７６ Ｆｌａｔｍｎａｒｋ，Ｋ．，Ｂｊｏｒｎｌａｎｄ，Ｋ．，Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ，Ｈ．Ｏ．，Ｈｅｇｓｔａｄ，Ｅ．，Ｒｏｓａｌｅｓ，Ｒ，Ｈａｒｋｌａｕ，Ｌ．，Ｓｏｌｈａｕｇ，Ｊ．Ｈ．，Ｆａｙｅ，Ｒ Ｓ．，Ｓｏｒｅｉｄｅ，Ｏ．，およびＦｏｄｓｔａｄ，Ｏ．「Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ」、２００２年、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８，４４４−４４９ Ｋｏｃｈ，Ｍ．，Ｗｅｉｔｚ，Ｊ．，Ｋｉｅｎｌｅ，Ｐ．，Ｂｅｎｎｅｒ，Ｘ，Ｗｉｌｌｅｋｅ，Ｆ．，Ｌｅｂｎｅｒｔ，Ｔ．，Ｈｅｒｆａｒｔｈ，Ｃ．，およびＫｎｅｂｅｌ Ｄｏｅｂｅｒｉｔｚ，Ｍ．「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ，Ｃｅｎｔｒａｌ，ａｎｄ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｖｅｎｏｕｓ Ｂｌｏｏｄ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ」、２００１年、Ａｒｃｈ Ｓｕｉｎｇ １３６，８５ Ｌｉｅｆｅｒｓ，Ｇ．Ｊ．，Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎ，Ａ．Ｍ．，ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｌｄｅ，Ｃ．Ｊ．，Ｈｅｒｍａｎｓ，Ｊ．，ｖａｎ Ｋｒｉｅｋｅｎ，Ｊ．Ｈ．，Ｃｏｍｅｉｓｓｅ，Ｃ．Ｊ．，およびＴｏｌｌｅｎａａｒ，ＲＡ．「Ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｓｔａｇｅ ＩＩ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ」、１９９８年、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ．３３９，２２３−２２８ Ｍａｔｓｕｎａｍｉ，Ｋ，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｏｇｕｍａ，Ｈ．，Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｙ．，およびＴａｋａｓａｋｉ，Ｋ．「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｎ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙＩｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ」、２００３年、Ａｎｎ Ｓｕｉｎｇ Ｏｎｃｏｌ １０，１７１ Ｎｏｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｎａｋａｏ，Ａ．，Ａｎｄｏ，Ｎ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．，Ｋａｓａｉ，Ｙ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｓ．，Ｋａｎｅｋｏ，Ｔ．，およびＴａｋａｇｉ，Ｈ．「Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋ−ｒａｓ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓａｓｅｓ」、１９９８年、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １５，４０−４６ Ｗａｌｓｈ，Ｊ．Ｍ．Ｅ．およびＴｅｒｄｉｍａｎ，Ｊ．Ｐ．「Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、２００３年、ＪＡＭＡ：Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ２８９，１２９７ Ｗｅｉｈｒａｕｃｈ，Ｍ．Ｒ「Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ：Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ」［報告］、２００２年、Ｊ．Ｃｈｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０，４３３８−４３４３ Ｃｈａｄｈａ Ｍ，Ｃｈａｂｏｎ ＡＢ，Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ Ｐ，およびＶｉｋｒａｍ Ｂ「Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ ｏｆ ａｘｉｌｌａｒｙ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＴＩ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ａｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ」、１９９４年、Ｃａｎｃｅｒ ７３，３５０−３５３ Ｗｉｌｈｅｌｍ ＭＣ，Ｅｄｇｅ ＳＢ，Ｃｏｌｅ ＤＤ，ｄｅＰａｒｅｄｅｓ Ｅ，およびＦｒｉｅｒｓｏｎ ＨＦ Ｊｒ．「Ｎｏｎｐａｌｐａｂｌｅ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ」、１９９１年、Ａｍ Ｓｕｒｇ．２１３，６００−６０３ Ｂｅｉｔｓｃｈ，Ｐ．Ｄ．およびＣｌｉｆｆｏｒｄ，Ｅ．「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃｅｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ」、２０００年、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ １８０，４４６−４４８ Ｂｒａｎｄｔ，Ｂ．Ｈ．Ｓｃｂｍｉｄｔ，Ｈ，ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ，Ｇ．およびＺａｎｋｅｒ，Ｋ．Ｓ．「Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｂｌｏｏｄ−ｂｏｒｎｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ−−ｃｕｒｒｅｎｔ ｂｅｓｔ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｕｎｍｅｔ ｎｅｅｄｓ」、２００１年、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ １６２ Ｓｕｐｐ，Ｓ１１−１６ Ｆｅｅｚｏｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｏｐｅｌａｎｄ，Ｅ．Ｍ．，ＩＩＩ，およびＨｏｃｈｗａｌｄ，Ｓ．Ｎ．「Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ」、２００２年、Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ ９，９４４−９５３ Ｆｅｈｍ，Ｔ．，Ｓａｇａｌｏｗｓｋｙ，Ａ．，Ｃｌｉｆｆｏｒｄ，Ｅ．，Ｂｅｉｔｓｃｈ，Ｐ．，Ｓａｂｏｏｒｉａｎ，Ｈ．，Ｅｕｈｕｓ，Ｄ．，Ｍｅｎｇ，Ｓ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｌ．，Ｔｕｃｋｅｒ，Ｔ．，Ｌａｎｅ，Ｎ．，Ｇｈａｄｉｍｉ，Ｂ．Ｍ．，Ｈｅｓｅｈｎｅｙｅｒ−Ｈａｄｄａｄ，Ｋ．，Ｒｉｅｄ，Ｔ．，Ｒａｏ，Ｃ．，およびＵｂｒ，Ｊ．「Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ Ｔｈａｔ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ａｒｅ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ」、２００２年、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８，２０７３ Ｇｈｏｓｓｅｉｎ，ＲＡ．，Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Ｓ．，およびＲｏｓａｉ，Ｊ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ａｎｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ」、１９９９年、Ｃｈｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５，１９５０−１９６０ Ｇｌａｖｅｓ，Ｄ．「Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ」、１９８３年、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ４８，６６５−６７３ Ｋａｒｃｚｅｗｓｋｉ，Ｄ．Ｍ．，Ｌｅｍａ，Ｍ．Ｊ．，およびＧｉａｖｅｓ，Ｄ．「Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ａｎ ａｕｔｏｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｒｅｍｏｖａｌ ｆｒｏｍ ｂｌｏｏｄ ｓａｌｖａｇｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｓｕｒｇｅｒｙ」、１９９４年、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ ＆ Ａｎａｌｇｅｓｉａ ７８，１１３１−１１３５ Ｌｕｚｚｉ，Ｋ．Ｊ．，ＭａｃＤｏｎａｉｄ，Ｉ．Ｃ．，Ｓｃｈｉｎｉｄｔ，Ｅ．Ｅ．，Ｋｅｒｋｖｌｉｅｔ，Ｎ．，Ｍｏｒｒｉｓ，ＶＬ，Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ａ．Ｆ．，およびＧｒｏｏｍ，Ａ．Ｃ．「Ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｉｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ：ｄｏｒｍａｎｃｙ ｏｆ ｓｏｌｉｔａｒｙ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｅｓ」、１９９８年、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５３，８６５−８７３ Ｍｏｌｎａｒ，Ｂ．，Ｌａｄａｎｙｉ，Ａ．，Ｔａｎｋｏ，Ｌ．，Ｓｒｅｔｅｒ，Ｌ．，およびＴｕｌａｓｓａｙ，Ｚ．「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ」、２００１年、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７，４０８０ Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｐ．，Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ，ＭＡ，Ｃａｒｄｕｃｃｉ，ＭＡ，Ｐａｒｔｉｎ，Ａ．Ｗ．，Ｓｃｈｅｒ，Ｈｉ，およびＴｓ’ｏ，Ｐ．Ｏ．「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ」、２０００年、Ｃａｎｃｅｒ ８８，２７８７−２７９５ Ｗｅｉｔｚ，Ｊ．，Ｋｉｅｎｌｅ，Ｐ．，Ｍａｇｅｎｅｒ，Ａ．，Ｋｏｃｈ，Ｍ．，Ｓｃｈｒｏｄｅｌ，Ａ．，Ｗｉｌｌｅｋｅ，Ｆ．，Ａｕｔｓｃｈｂａｃｈ，Ｆ．，Ｌａｃｒｏｉｘ，Ｊ．，Ｌｅｈｎｅｒｔ，Ｔ．，Ｈｅｒｆａｒｔｈ，Ｃ．，およびＤｏｅｂｅｒｉｔｚ，Ｍ．ｖ．Ｋ．「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅｓ，Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ」、１９９９年、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５，１８３０ Ｗｈａｒｔｏｎ，Ｒ．Ｑ．，Ｊｏｎａｓ，Ｓ．Ｋ．，Ｇｌｏｖｅｒ，Ｃ．，Ｋｈａｎ，Ｚ．Ａ．Ｊ．，Ｋｌｏｋｏｕｚａｓ，Ａ．，Ｑｕｉｎｎ，Ｈ．，Ｈｅｎｒｙ，Ｍ．，およびＡｌｌｅｎＭｅｒｓｈ，Ｔ．Ｇ．「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｔｗｏ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ Ａｓｓａｙｓ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｓａｍｐｌｅｓ」、１９９９年、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５，４１５８ Ｒｏｓｓ，Ｒ．「Ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ａ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ ｔｈｅ １９９０ｓ」、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ ３６２，８０ １−８０９ Ａｓａｈａｒａ，Ｔ．，Ｍｕｒｏｈａｒａ，Ｔ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ａ．，Ｓｉｌｖｅｒ，Ｍ．，Ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅ，Ｒ，Ｌｉ，Ｔ．，Ｗｉｔｚｅｎｂｉｃｈｌｅｒ，Ｂ．，Ｓｃｈａｔｔｅｍａｎ， Ｇ．，およびＩｓｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ」、１９９７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５， ９６４−９６７ Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ｍ．，Ｚａｌｏｓ，Ｇ．，Ｈａｌｃｏｘ，Ｊ．Ｐ．Ｊ．，Ｓｃｈｅｎｋｅ，Ｗ．Ｈ．，Ｗａｃｌａｗｉｗ，Ｍ．Ａ．，Ｑｕｙｙｕｍｉ，Ａ．Ａ．，およびＦｉｎｋｅｌ，Ｔ．「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｎｄｏｔｈｅｈｉａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ，Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｉｓｋ」、２００３年、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８，５９３−６００ Ｓｚｍｉｔｋｏ，Ｐ．Ｅ．，Ｆｅｄａｋ，Ｐ．Ｗ．Ｍ．，Ｗｅｉｓｅｌ，ＲＤ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｄ．Ｊ．，Ｋｕｔｒｙｋ，Ｍ．Ｊ．Ｂ．，およびＶｅｒｍａ，Ｓ．「Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ： Ｎｅｗ Ｈｏｐｅ ｆｏｒ ａ Ｂｒｏｋｅｎ Ｈｅａｒｔ」、２００３年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０７，３０９３−３１００． Ｓｕａｒｅｚ−Ｑｕｉａｎ，Ｃ．Ａ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｒ．，Ｐｏｈｉｄａ，Ｔ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｄ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．ｌ．，Ｗｅｌｌｕｅｒ，Ｅ，Ｇｈａｎｙ，Ｍ．，およびＢｏｎｎｅｒ，ＲＦ．「Ｌａｓｅｒ ｃａｐｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｉｓｓｕｅｓ」、１９９９年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２６，３２８−３３５ Ｖｏｎａ，Ｇ．，Ｓａｂｉｌｅ，Ｘ，Ｌｏｕｈａ，Ｍ．，Ｓｉｔｒｕｋ，Ｖ．，Ｒｏｍａｎａ，Ｓ．，Ｓｃｈｕｔｚｅ，Ｋ．，Ｃａｐｒｏｎ，Ｆ．，Ｆｒａｎｃｏ，Ｄ．，Ｐａｚｚａｇｌｉ，Ｍ．，Ｖｅｋｅｍａｎｓ，Ｍ．，Ｌａｃｏｕｒ，Ｂ．，Ｂｒｅｃｈｏｔ，Ｃ．，およびＰａｔｅｒｌｉｎｉ−Ｂｒｅｃｈｏｔ，Ｐ．「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｉｚｅ ｏｆ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ」、２０００年、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５６，５７−６３ Ｐｅｃｋ，Ｋ．，Ｓｈｅｒ，Ｙ．Ｐ．，Ｓｈｉｈ，Ｊ．Ｙ．，Ｒｏｆｆｉｅｒ，Ｓ．Ｒ，Ｗｕ，Ｃ．Ｗ．，およびＹａｎｇ，Ｐ．Ｃ．「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ」、１９９８年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８，２７６１−２７６５ Ｇｒｏｓｓ，Ｈ．，Ｖｅｒｗｅｒ，Ｂ．，Ｈｏｕｃｋ，Ｄ．，Ｈｏｆｆｉｎａｎ，ＲＡ．，およびＲｅｃｋｔｅｎｗａｌｄ，Ｄ．「Ｍｏｄｅｌ Ｓｔｕｄｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌｓ ａｔ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ａｓ Ｌｏｗ ａｓ １０−７」、１９９５年、ＰＮＡＳ ９２，５３７−５４１ Ｓａｂｉｌｅ，Ａ．，Ｌｏｕｈａ，Ｍ．，Ｂｏｎｔｅ，Ｅ．，Ｐｏｕｓｓｉｎ，Ｋ．，Ｖｏｎａ，Ｇ．，Ｍｅｊｅａｎ，Ａ．，Ｃｈｒｅｔｉｅｎ，Ｙ．，Ｂｏｕｇａｓ，Ｌ．，Ｌａｃｏｕｒ，Ｂ．，Ｃａｐｒｏｎ，Ｆ．，Ｒｏｓｅｔｏ，Ａ．，Ｂｒｅｃｈｏｔ，Ｃ．，およびＰａｔｅｒｌｉｎｉ−Ｂｉｎｅｃｈｏｔ，Ｐ．「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ｂｅｒ−ＥＰ４ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｂｅｆｏｒｅ ＲＴ−ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」、１９９９年、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １１２，１７１−１７８ Ｇｕｌａｔｉ，Ｓ．Ｃ．およびＡｃａｂａ，Ｌ．「Ｒａｔｉｏｎａｌｅ ｆｏｒ ｐｕｒｇｉｎｇ ｉｎａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」［概説］［参考１７］、１９９３年、Ｊｏｕｍａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ ２，４６７−４７１ Ａｏｙａｍａ，Ａ．およびＣｈｅｎ，Ｗ．−Ｔ．「Ａ １７０−ｋＤａ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ」、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，８２９６−８３００ Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｍ．およびＣｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．「Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ」、１９８７年、Ｃｅｌｌ．４８，１９３−２０３ Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．，Ｙｅｈ，Ｙ．，およびＮａｋａｈａｒａ，Ｈ．「Ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙ：ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｈａｔ ｄｅｇｒａｄｅｓ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ」、１９９４年、Ｊ．Ｔｉｓｓ．Ｃｕｌｔ．Ｍｅｔｈ．１６，１７７−１８１ Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．，Ｏｌｄｅｎ，Ｋ−，Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｂ．Ａ．，およびＣｈｕ，Ｆ．Ｆ．「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ（ｓ）ｔｈａｔ ｄｅｇｒａｄｅ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ａｔ ｃｅｌｌ ｃｏｎｔａｃｔ ｓｉｔｅｓ」、１９８４年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９８，１５４６−１５５５ Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．，Ｌｅｅ，Ｃ．Ｃ．，（ｉｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｌ．，Ｂｅｍｉｅｒ，Ｓ．，Ｌｉｕ，Ｃ．Ｈ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｙ．，Ｙｅｈ，Ｙ．，Ｍｏｎｓｋｙ，Ｗ．Ｌ．，Ｋｅｌｌｙ，Ｔ．，Ｄａｉ，Ｍ．，およびＭｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｃ．「Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ」、１９９４年、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．３１，２１７−２２６ Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．「Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ，ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅ ｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ」、１９９６年、Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ４９，５９−７１ Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．「Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎｓ ｆｏｒｍｅｄ ａｔ ｒｏｓｅｔｔｅ ｃｏｎｔａｃｔ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ」、１９８９年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．２５１，１６７−１８５ Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．およびＷａｎｇ，Ｊ．Ｙ．（１９９９）．「Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃｅｌｌｓ，ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ ａｎｄ ｌａｍｅｌｈｉｐｏｄｉａ，ｈａｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ＭＴＩ−ＭＭＰ，ＭＭＰ−２，ａｎｄ ＴＩＭＰ−２ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ」［概説］［参考５２］、１９９９年、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ８７８，３６１−３７１ Ｇｈｅｒｓｉ，Ｇ．，Ｄｏｎｇ，Ｈ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｙｅｈ，Ｙ．，Ｈａｋｋｉｎｅｎ，Ｌ．，Ｌａｒｊａｖａ，Ｈ．Ｓ．，およびＣｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ ｍａｔｒｉｘ ｂｙ ａ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ」、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，２９２３１−２９２４１ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｌ．Ａ．およびＣｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ ｓｐｌｉｃｅｄ ｓｅｐｒａｓｅ ｍＲＮＡ ｔｈａｔ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｓｏｆｏｒｍ」、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，２５５４−２５５９ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｌ．Ａ．．．およびＣｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｓｅｐｒａｓｅ：Ａ ｓｅｉｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ」、１９９７年、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １３６１，１１−１９ Ｋｅｌｌｙ，Ｔ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｃ．，Ｙｅｈ，Ｙ．，および Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．「Ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ ｐｒｏｍｏｔｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｗｉｄｅ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、１９９４年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５８，２９９−３０８ Ｍｏｎｓｋｙ，Ｗ．Ｌ．，Ｌｉｎ，Ｃ．−Ｙ．，Ａｏｙａｍａ，Ｎ，Ｋｅｌｌｙ，Ｔ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｃ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｓ．Ｋ，およびＣｈｅｎ，Ｗ．−Ｔ．「Ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍａｒｋｅｒ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ，ｓｅｐｒａｓｅ，ｉｓ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｏｎ ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ」、１９９４年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４，５７０２−５７１０ Ｍｏｎｓｋｙ，Ｗ．Ｌ．，Ｋｅｌｌｙ，Ｔ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｙ．，Ｙｅｈ，Ｙ．，Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｗ．Ｇ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｃ．，およびＣｈｅｎ，Ｗ．−Ｔ．「Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍ（ｒ）７２，０００ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ａｔ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ」、１９９３年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３，３ １５９−３１６４ Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｃ，Ｇｈｅｒｓｉ，Ｇ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｓ．Ｋ．，Ｓａｎｇ，Ｑ．Ｘ．，Ｈｏｗａｒｄ，Ｌ．，Ｐｉｎｅｉｒｏ−Ｓａｎｃｈｅｚ．Ｍ．，Ｎａｌｃａｈａｒａ，Ｈ．，およびＣｈｅｎ，Ｗ．−Ｔ．「Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｄｏｃｋｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｔ ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ」、１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２４９４７−２４９５２ Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｃ．およびＣｈｅｎ，Ｗ．−Ｔ．「Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｉｎｔｏ ｍａｔｒｉｘ ｂｅａｄｓ：ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ １ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ」、１９９１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ ９９，２１３−２２５ Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｃ．，Ｙｅｈ，Ｙ．，およびＣｈｅｎ，Ｗ．−Ｔ．「Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ」、１９９２年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ１１９，１３０９−１３２５ Ｎａｋａｈａｒａ，Ｈ．，Ｎｏｍｉｚｕ，Ｍ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｓ．Ｋ，Ｙａｍａｄａ，Ｙ．，Ｙｅｈ，Ｙ．，およびＣｈｅｎ，Ｗ．−Ｔ．「Ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ６ｂｅｔａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｙ ｌａｍｉｎｉｎ Ｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２７２２１−２７２２４ Ｎａｋａｈａｒａ，Ｈ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｃ．，Ｎｏｍｉｚｕ，Ｍ．，Ｙａｍａｄａ，Ｙ．，Ｙｅｈ，Ｙ．，およびＣｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．「Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆｂｅｔａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆｐｌ９０ＲｈｏＧＡＰ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｐｒｏｔｒｕｓｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｔ ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ」、１９９８年、Ｊｏｕｍａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７３，９−１２ Ｎａｋａｈａｒａ，Ｈ．，Ｈｏｗａｒｄ，Ｌ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｅ．Ｗ．，Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．，Ｙｅｈ，Ｙ．，およびＣｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．「Ｔｒａｎｓｎｉｅｍｂｒａｎｅ／ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｏｍａｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｙｐｅ １−ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｃｋｉｎｇ ｔｏ ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ」、１９９７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４，７９５９−７９６４． Ｐａｖｌａｋｉ，Ｍ．，Ｃａｏ，Ｊ．，Ｈｙｍｏｗｉｔｚ，Ｍ．，Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．，Ｂａｈｏｕ，Ｗ．，およびＺｕｃｋｅｒ，Ｓ．「Ａ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｙｐｅ １ Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｓ Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｓ ａｎ Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ」、２００２年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７７，２７４０−２７４９ Ｐｉｎｅｉｒｏ−Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｍ．Ｌ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｄｏｄｔ，Ｊ．，Ｈｏｗａｒｄ，Ｌ．，Ｙｅｈ，Ｙ．，Ｔｒａｎ，Ｈ．，Ａｒｇｒａｖｅｓ，Ｗ．Ｓ．，およびＣｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．（１９９７）．「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ １７０−ｋＤａ ｍｅｌａｎｏｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ（ｓｅｐｒａｓｅ）ａｓ ａ ｓｅｉｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ」、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，７５９５−７６０１；修正１９９８年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１３３６６ Ｓａｇａ，Ｓ．，Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．，およびＹａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．「Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｕｍｏｒｓ」、１９８８年、Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．４８，５５１０−５５１３ Ｚｕｃｋｅｒ，Ｓ．，Ｃａｏ，Ｊ．，およびＣｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．「Ｃｒｉｔｉｃａｌ ａｐｐｒａｉｓａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」、２０００年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９，６６４２−６６５０ Ｚｕｋｏｗｓｋａ−Ｇｒｏｊｅｃ，Ｚ．，Ｋａｒｗａｔｏｗｓｋａ，Ｐ．，Ｒｏｓｅ，Ｗ．，Ｒｏｎｅ，Ｊ．，Ｍｏｖａｆａｇｈ，Ｓ．，Ｊｉ，Ｈ．，Ｙｅｈ，Ｙ．，Ｃｈｅｎ，Ｗ．−Ｔ．，Ｋｌｅｉｎｍａｎ，Ｈ．Ｋ．，Ｇｒｏｕｚｒｎａｎｎ，Ｅ．，およびＧｒａｎｔ，Ｄ．Ｓ．「Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ：ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ｎｅｒｖｅｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ」、１９９８年、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８３，１８７−１９５ Over the past 20 years, a specialized complex found on the surface of invasive tumor cells that promotes the migration of tumor cells from the primary tumor to the metastatic site has been characterized (35). Non-patent document 37; Non-patent document 38; Non-patent document 39; Non-patent document 40; Non-patent document 42; Non-patent document 43; Non-patent document 44; Non-patent document 47; Non-patent document 48; Non-patent document 49; Non-patent document 50; Non-patent document 51; Non-patent document 52; Non-patent document 53; Non-patent document 54; Non-patent document 57; Non-patent document 57; Non-patent document 58; Non-patent document 59). These complexes, referred to as “invapopodia”, bind to and degrade multiple types of endothelial cell matrix (ECM) components. Invading processes are not found on differentiated normal blood cells or primary tumor cells, and they do not function effectively on dead or dying cells. Infiltrating processes are present in circulating endothelial progenitor cells (but not more than 99.999% of blood cells) and in fetal cells found in maternal blood of pregnant females. The present invention demonstrates that the enrichment process based on infiltrating process functions strongly to separate viable metastatic tumor cells and endothelial cells from most cell types found in ascites, blood and many other body fluids, As well as solving the limitations of the other technologies mentioned above.
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（発明の要旨）
一実施形態において、疾患のスクリーニング、診断、評価、予後判定および管理に使用するために、血液サンプルまたは他の流体サンプル中の特定の生存標的細胞を単離するためのＣＡＭが提供される。 (Summary of the Invention)
In one embodiment, a CAM is provided for isolating specific viable target cells in a blood sample or other fluid sample for use in disease screening, diagnosis, evaluation, prognosis and management.

本発明のＣＡＭは、ＣＴＣおよびＣＥＣを含む標的細胞の接着を効果的に促進するために、コア材料の周りに細胞接着材料を利用する。有用な細胞接着材料としては、血液由来接着化合物が挙げられ、そしてフィブロネクチン、フィブリン、ヘパリン、ラミニン、テネイシンもしくはビトロネクチン、および合成化合物（例えば、合成フィブロネクチンおよびラミニンペプチド）、細胞外化合物またはそれらのフラグメント、それらの組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない。ＣＡＭにおける有用な細胞接着材料は、単独で、または他の材料と組み合わせて、マトリックスのコア材料を効果的に被覆する能力を有するべきである。このコアは、好ましくは、化学的に非反応性の材料（例えば、ゼラチン粒子、骨フラグメント、コラーゲン、ガラスビーズ、不活性ポリマー材料（例えば、磁性コロイド、ポリスチレン、ナイロンのようなポリアミド材料、ポリエステル材料、セルロースエーテルおよびエーテル様セルロースアセテート）、ウレタンＤＥＡＥ−デキストラン、ならびに他の天然および合成材料（例えば、発泡粒子、綿、羊毛、ダクロン、レーヨン、アクリレートなど）が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。ＣＡＭは、例えば、約１．０〜１．５ｍｍ厚の被覆を形成するように適用され得る。   The CAM of the present invention utilizes cell adhesion material around the core material to effectively promote adhesion of target cells including CTC and CEC. Useful cell adhesion materials include blood derived adhesion compounds, and fibronectin, fibrin, heparin, laminin, tenascin or vitronectin, and synthetic compounds (eg, synthetic fibronectin and laminin peptides), extracellular compounds or fragments thereof, Examples thereof include, but are not limited to, combinations thereof. Useful cell adhesion materials in CAM should have the ability to effectively coat the matrix core material, alone or in combination with other materials. This core is preferably a chemically non-reactive material (eg gelatin particles, bone fragments, collagen, glass beads, inert polymer materials (eg magnetic colloids, polyamide materials such as polystyrene, nylon, polyester materials) , Cellulose ethers and ether-like cellulose acetates), urethane DEAE-dextran, and other natural and synthetic materials such as, but not limited to, expanded particles, cotton, wool, dacron, rayon, acrylates, etc.) Including. The CAM can be applied, for example, to form a coating about 1.0-1.5 mm thick.

例えば、ＣＡＭは、ゼラチン粒子、またはＩ型コラーゲン溶液で被覆され、次にフィルムを形成するように重合されるガラスビースコア材料を含み得る。このような多孔性のコラーゲン被覆されたビーズを含むフィルムは、次いで、サンプル（ＣＴＣおよびＣＥＣのような標的細胞の接着を促進する１種以上の接着成分を含有する血清または全血）に暴露され得る。ＣＴＣおよびＣＥＣのような細胞の接着を促進する血液由来接着材料は、例えば、基底膜成分（例えば、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、ヘパリン、およびビトロネクチン、これらのフラグメント、これらの組み合わせ、またはこれらの成分の生物学的模倣物、ならびに溢出もしくは内皮障害において見られるようなこれらの修飾バージョン）を含み得、そして天然の供給源からの精製によって調製され得るか、または人工的手段によって合成され得る。ＣＡＭは、高度な感度および特異性でやはり標的細胞を認識して結合する、特異的リガンドをさらに含み得る。   For example, the CAM may include a glass beescore material that is coated with gelatin particles or type I collagen solution and then polymerized to form a film. A film containing such porous collagen-coated beads is then exposed to a sample (serum or whole blood containing one or more adhesion components that promote adhesion of target cells such as CTC and CEC). obtain. Blood-derived adhesive materials that promote cell adhesion, such as CTCs and CECs, include, for example, basement membrane components (eg, fibronectin, fibrin, laminin, heparin, and vitronectin, fragments thereof, combinations of these, or components of these Biological mimetics, as well as these modified versions as found in extravasation or endothelial disorders) and can be prepared by purification from natural sources or synthesized by artificial means. The CAM may further include specific ligands that also recognize and bind to target cells with a high degree of sensitivity and specificity.

ＣＡＭフィルムは、血液または体液中に存在するような血液由来細胞接着分子、および結合物質で覆われたマイクロビーズ（例えば、Ｉ型コラーゲンで被覆されたゼラチンマイクロビーズもしくはガラスマイクロビーズ）を備え得る。例えば、マイクロビーズは、００ミクロン〜２，０００ミクロンの範囲の直径を有する脱水ゼラチン粒子またはガラスビーズを包含する（しかし、これらに限定されない）。一実施形態において、このマイクロビーズは、フィルム中での血流を可能にするような吻合チャネルを作製するように構成されるか、またはそうするような形状および大きさである。   The CAM film may comprise blood-derived cell adhesion molecules, such as those present in blood or body fluids, and microbeads coated with a binding substance (eg, gelatin microbeads or glass microbeads coated with type I collagen). For example, microbeads include (but are not limited to) dehydrated gelatin particles or glass beads having a diameter ranging from 00 microns to 2,000 microns. In one embodiment, the microbead is configured or shaped and sized to create an anastomotic channel that allows blood flow in the film.

標的細胞がＣＴＣおよびＣＥＣである実施形態において、本発明のＣＡＭフィルムは、好ましくは、この標的細胞（ＣＴＣおよびＣＥＣ）に対する親和性および特異性を有し、他の細胞（例えば、造血細胞の小分画）に対する親和性は最低限である。ＣＡＭフィルムは、動静脈吻合の血管壁、または転移もしくは心血管プラーク位置においてその部位を模倣するように設計され得る。ここで、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分（コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、フィブリン、ヘパリン、テナシンおよびビトロネクチンなどが挙げられる）は、溢出または内皮障害のプロセスの間に修飾される。本質的に、ＣＡＭ組成物およびＣＡＭアッセイ表面構造は、本明細書において提示された情報を用いて設計されて、細胞の微小環境の模倣を向上させ得、それによってより大きな最大数の生存標的細胞（例えば、ＣＴＣおよびＣＥＣ）が全血から回収されることを可能にする。本発明の方法によって単離された標的細胞（例えば、ＣＴＣおよびＣＥＣが挙げられる）は、代表的に生存可能であり、エキソビボで増殖を示し得、そして細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）に対する接着活性を示し得る。血液から単離されたＣＴＣおよびＣＥＣは、ＣＴＣおよびＣＥＣの発現プロフィールを確立するために使用され得る。   In embodiments where the target cells are CTC and CEC, the CAM film of the invention preferably has affinity and specificity for this target cell (CTC and CEC) and other cells (eg, small hematopoietic cells). The affinity for (fraction) is minimal. The CAM film can be designed to mimic the site of an arteriovenous anastomosis vessel wall or at a metastatic or cardiovascular plaque location. Here, extracellular matrix (ECM) components, including collagen, proteoglycans, fibronectin, laminin, fibrin, heparin, tenascin and vitronectin, are modified during the process of extravasation or endothelial damage. In essence, CAM compositions and CAM assay surface structures can be designed with the information presented herein to improve mimicking of the cellular microenvironment, thereby increasing the maximum number of surviving target cells. (Eg CTC and CEC) can be recovered from whole blood. Target cells isolated by the methods of the present invention, including CTCs and CECs, are typically viable, can exhibit ex vivo growth, and exhibit adhesion activity against extracellular matrix components (ECM). Can show. CTCs and CECs isolated from blood can be used to establish CTC and CEC expression profiles.

本開示のＣＡＭは、例えば、癌の検出、診断、および管理において使用され得る。ＣＡＭは、高い親和性および特異性で生存癌細胞を認識し、それに結合するために使用され得る。そしてそれゆえに、このマトリックスは、流体サンプル（例えば、癌に罹患する患者から得られた血液サンプルおよび／もしくは腹水流体）から癌細胞を単離するために使用され得る。ＣＡＭは、診断のために患者のサンプルから転移性癌細胞を捕獲し、そして癌に苦しむような患者において疾患をモニタリングするために使用され得る。ＣＡＭは、あらゆる型の癌（例えば、卵巣癌、肺癌（例えば、非小細胞性肺癌および小細胞性肺癌）、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、黒色腫、肝臓癌、胃癌、頸部の癌、副腎の癌、直腸癌、甲状腺癌、および結腸直腸癌のような腺癌）由来の生存する循環性転移性腫瘍細胞を検出および単離するために使用され得る。   The CAMs of the present disclosure can be used, for example, in cancer detection, diagnosis, and management. CAM can be used to recognize and bind to live cancer cells with high affinity and specificity. And therefore, this matrix can be used to isolate cancer cells from a fluid sample (eg, a blood sample and / or ascites fluid obtained from a patient suffering from cancer). CAM can be used to capture metastatic cancer cells from patient samples for diagnosis and to monitor disease in patients suffering from cancer. CAM can be any type of cancer (eg, ovarian cancer, lung cancer (eg, non-small cell lung cancer and small cell lung cancer), prostate cancer, pancreatic cancer, breast cancer, melanoma, liver cancer, stomach cancer, cervical cancer, Can be used to detect and isolate living circulating metastatic tumor cells from adrenal cancers, adenocarcinomas such as rectal cancer, thyroid cancer, and colorectal cancer.

あるいは、このマトリックスは、患者における心血管疾患の検出、診断、および管理のために血液サンプル中における内皮細胞を捕獲するために使用され得る。ＣＡＭは、心身血管疾患を有する患者から採られた血液がマトリックスと接触する場合に、血液サンプル中に存在する生存内皮細胞と高い親和性および選択性で結合する能力を有する。種々の発生段階にある内皮細胞（前駆内皮細胞を含む）が、心血管疾患（例えば、この疾患に苦しむ患者における脈管形成）の診断に使用され得る。   Alternatively, this matrix can be used to capture endothelial cells in a blood sample for detection, diagnosis, and management of cardiovascular disease in a patient. CAMs have the ability to bind with high affinity and selectivity to viable endothelial cells present in a blood sample when blood taken from a patient with cardiovascular disease contacts the matrix. Endothelial cells at various stages of development (including progenitor endothelial cells) can be used for the diagnosis of cardiovascular disease (eg, angiogenesis in patients suffering from this disease).

本発明はまた、本発明のＣＡＭを利用して血液のような流体サンプルから標的細胞を単離する、細胞単離デバイスを提供する。このようなデバイスは、例えば、標的細胞の効率的な濃縮および同定を可能にする「内皮細胞トラップ」を提供し得る。ここで、この標的細胞は、例えば、癌および／または心血管疾患の危険性を有する被験体の末梢血中の生存内皮前駆細胞である。ＣＡＭ開始（ＣＡＭ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ）細胞単離デバイスが設計されて、血液から、生存する循環性腫瘍細胞と循環性内皮細胞との１００万倍の濃縮を提供し得る。   The present invention also provides a cell isolation device that utilizes the CAM of the present invention to isolate target cells from a fluid sample such as blood. Such devices can provide, for example, “endothelial cell traps” that allow efficient enrichment and identification of target cells. Here, the target cells are, for example, viable endothelial progenitor cells in the peripheral blood of a subject at risk for cancer and / or cardiovascular disease. A CAM-initiated cell isolation device can be designed to provide 1 million-fold enrichment of viable circulating tumor cells and circulating endothelial cells from the blood.

別の実施形態において、ＣＡＭは、妊娠雌の母体循環に存在する胎児細胞のような標的細胞を捕獲および単離するために使用され得る。次いで、ＣＡＭに接着している単離された細胞は、標準的手順を用いた、ダウン症候群、マルファン症候群、テイサックス病および他の疾患のような疾患の出生前診断における分析のために使用され得る。胎児細胞は血液サンプルから直接単離され得、妊婦を侵襲する手順が不要であるので、本発明のマトリックスを用いた胎児細胞の単離は、疾患の出生前診断のためのより安全な方法を可能にする。本発明のこの実施形態および他の実施形態において、ＣＡＭは、細胞単離の標準的技術を用いた血液サンプル中での分析のために通常利用可能な細胞数を、豊富にし、そして増加させる。   In another embodiment, the CAM can be used to capture and isolate target cells such as fetal cells present in the maternal circulation of pregnant females. The isolated cells that adhere to the CAM are then used for analysis in prenatal diagnosis of diseases such as Down's syndrome, Marfan syndrome, Tesak's disease and other diseases using standard procedures. Can be done. Since fetal cells can be isolated directly from a blood sample and no steps are required to invade the pregnant woman, fetal cell isolation using the matrix of the present invention provides a safer method for prenatal diagnosis of disease. enable. In this and other embodiments of the invention, CAM enriches and increases the number of cells normally available for analysis in blood samples using standard techniques of cell isolation.

本開示を用いて、ＣＡＭによる細胞濃縮は、以下の特徴の１つ以上を有するように設計され得る：（ａ）疾患の診断のために必要な標的細胞に対する、高度な感度および特異性での、全血からの生存標的細胞（ＣＴＣおよびＣＥＣを含む）の１００万倍濃縮；（ｂ）例えば、ＣＴＣおよびＣＥＣを含む標的細胞の、細胞の大きさおよび濃度の、他の正常血液および正常組織細胞からの機能および形態による同時判別；（ｃ）全血は、出発サンプルとして、または一般的濃度勾配遠心分離によって調製された細胞分画として使用され得る。ＣＡＭ細胞濃縮は、単一工程プロセスであっても複数工程プロセスであってもよい。   Using this disclosure, cell enrichment by CAM can be designed to have one or more of the following characteristics: (a) with high sensitivity and specificity for target cells required for disease diagnosis 1 million-fold enrichment of viable target cells (including CTC and CEC) from whole blood; (b) other normal blood and normal tissues, eg, cell size and concentration of target cells including CTC and CEC Simultaneous discrimination by function and morphology from cells; (c) Whole blood can be used as a starting sample or as a cell fraction prepared by general concentration gradient centrifugation. CAM cell enrichment may be a single step process or a multi-step process.

単核細胞集団からの生存標的細胞（ＣＴＣおよびＣＥＣを含む）の効率的な捕獲を可能にする、ＣＡＭ開始細胞単離デバイスが、さらに開示される。同時係属中のＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／２６７３５（これは、米国仮特許出願番号６０／２３１，５１７の優先権を主張しており、その開示は、その全体が、本明細書において参考として援用される）において考察されるように、標的細胞は、心血管疾患または癌のような疾患に苦しむ被験体に由来する血液または組織流体サンプルから分画される。このようなデバイスは、例えば、好ましくは容器表面（例えば、チューブの内部底面、スライドの表面もしくはペトリ皿の内部底面、しかしこれらに限定されない）に固定されたＣＡＭ被覆を備え得る。ＣＡＭ開始細胞単離容器のマトリックス被覆された表面は、好ましくは、サンプルが容器中におかれる場合、サンプルに関して接触を最大にするように設計される。ＣＡＭ開始細胞単離デバイスは、種々の既存の利用可能な実験室診断用容器（例えば、細胞培養チャンバースライド、培養用マイクロタイタープレート、培養フラスコなど）を利用し得る。   Further disclosed is a CAM-initiating cell isolation device that allows for efficient capture of viable target cells (including CTC and CEC) from a mononuclear cell population. Co-pending PCT patent application PCT / US01 / 26735 (which claims priority to US Provisional Patent Application No. 60 / 231,517, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety) The target cells are fractionated from a blood or tissue fluid sample derived from a subject afflicted with a disease such as cardiovascular disease or cancer. Such a device may for example comprise a CAM coating, preferably fixed to the container surface (eg, but not limited to the inner bottom surface of the tube, the surface of the slide or the inner bottom surface of the Petri dish). The matrix-coated surface of the CAM-initiating cell isolation container is preferably designed to maximize contact with the sample when the sample is placed in the container. CAM-initiated cell isolation devices may utilize a variety of existing available laboratory diagnostic containers (eg, cell culture chamber slides, culture microtiter plates, culture flasks, etc.).

ＣＡＭ開始細胞単離デバイスは、細胞とＣＡＭとの間の接触を高め、それによって（例えば、生存ＣＴＣおよびＣＥＣの）より効率的な濃縮を促進するために、血流をより最適に模倣するために回転され得る。   CAM-initiated cell isolation devices to more optimally mimic blood flow to enhance contact between cells and CAM, thereby facilitating more efficient enrichment (eg, of viable CTC and CEC) Can be rotated.

同時係属中のＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／２６７３５（これは、米国仮特許出願番号６０／２３１，５１７の優先権を主張する）に記載されるよりも効率的にＣＴＣを含む生存標的細胞を、例えばＣＴＣ関連疾患に罹患する被験体の末梢血から取り除く、ＣＡＭ開始細胞単離デバイスが、本開示に基づいて構築され得る。   Viable target cells containing CTC more efficiently than described in co-pending PCT patent application PCT / US01 / 26735 (which claims priority to US Provisional Patent Application No. 60 / 231,517), For example, a CAM-initiating cell isolation device that removes from the peripheral blood of a subject suffering from a CTC-related disease can be constructed based on the present disclosure.

腫瘍細胞を濃縮するための上記方法およびＣＡＭフィルムはまた、採取された自己血および自己骨髄に対する負の濾過（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）工程として、癌細胞を取除くために容易に使用され得る。本開示のＣＡＭ開始血液濾過デバイスは、例えば、自己輸血が行われる、癌手術の間に回収された血液の自動輸血、骨髄移植、末梢血幹細胞移植およびアフェレーシス（ａｐｈａｅｒｅｓｉｓ）に関して、混入している癌細胞を除去するために利用され得る。さらに、記載されたＣＡＭ開始血液濾過ユニットは、循環から転移し得る細胞を除去することによって完全な癌の発生を防ぐために使用され得る。   The above methods for enriching tumor cells and CAM films can also be readily used to remove cancer cells as a negative filtration step on harvested autologous blood and autologous bone marrow. The CAM-initiated hemofiltration device of the present disclosure can be used for example for autotransfusion of blood collected during cancer surgery, autologous blood transfusion, bone marrow transplantation, peripheral blood stem cell transplantation, and apheresis. Can be used to remove cells. Furthermore, the described CAM-initiated hemofiltration unit can be used to prevent the development of complete cancer by removing cells that can metastasize from circulation.

ＣＡＭ開始血液濾過は、同様に、癌患者における積極的骨髄化学療法（照射）後の置換のために意図された、癌を含まない自己骨髄細胞の調製に利用され得る。癌性細胞の検出は、分子増幅技術によって改善され得、そしてＣＡＭで濃縮された細胞は、（例えば、被験体からのＣＴＣおよびＣＥＣに対して特異的であるような）多重分子分析（例えば、ＤＮＡ、タンパク質に関する試験および免疫学的試験）において使用され得る。   CAM-initiated hemofiltration can also be utilized for the preparation of cancer-free autologous bone marrow cells intended for replacement after aggressive bone marrow chemotherapy (irradiation) in cancer patients. Detection of cancerous cells can be improved by molecular amplification techniques, and cells enriched with CAM can be multiplexed (eg, specific for CTCs and CECs from subjects) (eg, DNA, protein testing and immunological testing).

ＣＡＭで濃縮された細胞およびそれらのＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または抗原は、癌診断目的の多重検出アッセイに適用され得る。多重ＣＴＣ検出アッセイに使用される細胞マーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＴＣ侵襲性表現型［細胞によるコラーゲン摂取およびアセチルＬＤＬ取り込み］、内皮抗原［サイトカイン、内皮特異性抗原（ＥｐＣＡＭ、ＨＥＡ、Ｍｕｃ−１、ＥＭＡ、ＧＡ７３３−１、ＧＡ７３３−２、Ｅ−カドへリン、ＥＧＦＲ、ＴＡＧｌ２、リポカリン（ｌｉｐｏｃａｌｉｎ）２（癌遺伝子２４ｐ３）］、内皮抗原［ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ１、フォン・ヴィレブランド（ｖａｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子（ｖＷＦ）、Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦのレセプター）、ＶＥ−カドへリン］、および他の腫瘍関連抗原［癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）、ヒトカリクレイン−２（ＨＫ２）、ムチン（ＭＵＣ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＡ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピンの１３サブユニット（１３−ｈＣＧ）などが挙げられるが、これらに限定されない］。マーカーは、個別に、または組み合わせて適用されて、被験体由来の所与の体積の血液もしくは体液中の生存腫瘍細胞の有効な同定および算出を達成し得る。データ読み出しの方法としては、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）、および定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲなどが挙げられるが、これらに限定されない。   Cells enriched with CAM and their DNA, RNA, proteins or antigens can be applied in multiplex detection assays for cancer diagnostic purposes. Cell markers used in multiplex CTC detection assays include, but are not limited to: CTC invasive phenotype [collagen uptake and acetyl LDL uptake by cells], endothelial antigens [cytokines, endothelial specific antigens ( EpCAM, HEA, Muc-1, EMA, GA733-1, GA733-2, E-cadherin, EGFR, TAG12, lipocalin 2 (oncogene 24p3)], endothelial antigen [CD31 / PECAM1, von Wille Brand (van Willebrand factor) (vWF), Flt-1 (receptor for VEGF), VE-cadherin], and other tumor-associated antigens [carcinoembryonic antigen (CEA), epidermal growth factor receptor (EGFR), human Kallikrein-2 (HK2), mucin ( UC), prostate specific antigen (PSA), prostate specific membrane antigen (PMA), 13 subunits of human chorionic gonadotropin (13-hCG) and the like. Or applied in combination to achieve effective identification and calculation of viable tumor cells in a given volume of blood or body fluid from a subject, including flow cytometry, fluorescence microscopy, Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), quantitative real-time RT-PCR, and the like are included, but are not limited thereto.

ＣＡＭで濃縮されたＣＴＣ細胞は、癌についての遺伝的試験のための供給源を提供する。ＣＴＣ細胞において一般的に試験される遺伝子の構造および機能の変化としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。癌遺伝子（例えば、ＥＲＢＢ２、ＲＡＳ、ＭＹＣ、ＢＣＬ２など）、腫瘍抑制遺伝子（例えば、ｐ５３、ＡＰＣ、ＢＲ ＣＡ］、ＢＲＣＡ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＣ２ＳＡ、ＣＤＣ２５Ｂ、ＫＩＰ］、ＲＢ］など）、腫瘍の進行に関連する遺伝子［例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮増殖因子（ＥＧＦＲ）、ヒトカリクレイン−２（ＨＫ２）、ムチン（ＭＵＧ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＡ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピンの１３サブユニット（１３−ｈＣＧ）など］、および転移カスケードに関連する遺伝子［例えば、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（細胞移動）のｎｍ２３ファミリー（ＨＪ−６）、ＰＴＥＮ／ＭＭＡＣ］（細胞移動および局所性接着）、ＣＡＤＪ／Ｅ−カドへリン（細胞−細胞接着）、ＭＫＫ４／ＳＥＫｉ（ストレスに対する細胞応答）、ＫｉＳＳ−ｉ（ＭＩＩＭＬＰ９発現の調節）、ＢＲ／ＶＩＳｉ（細胞運動性）など］。例えば、異数性およびＣＫｉ９、ＥＲＢ２、ＣＥＡ、ＭＵＧ］、ＥＧＦレセプター、Ｊ３−ｈＣＧの変化は、乳癌の診断に有用である；肺癌についてのｐＳ３、Ｋｉ−ｒａｓ変異体 ＣＤＫＮ２Ａ、ＬＯＨ ３ｐ、ＦＨＩＰ；結腸直腸癌、胃癌、および膵臓癌についてのｐ５３、ＡＰＣ、ＣＥＡ、ＣＫｉ９、ＣＫ２０、ＥＲＢＢ２、Ｋｉ−ｒａｓ；前立腺癌についてのＰＳＡ、ＰＳＭ、ＨＫ２；頭部および頸部の癌についてのｐ５３変異体およびマイクロサテライト変化。遺伝子マーカーは、個別にかまたは組み合わせて適用されて、被験体における遺伝的変化の有用な検出を達成し得る。データ読み出しのための方法としては、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、傾向もしくは色素ベースのポリメラーゼ連鎖反応リーダーなどが挙げられるが、これらに限定されない。   CAM-enriched CTC cells provide a source for genetic testing for cancer. Changes in the structure and function of genes commonly tested in CTC cells include, but are not limited to: Oncogene (eg, ERBB2, RAS, MYC, BCL2, etc.), tumor suppressor gene (eg, p53, APC, BR CA], BRCA2, CDKN2A, CCND1, CDC2SA, CDC25B, KIP], RB], etc., tumor progression Genes such as carcinoembryonic antigen (CEA), epidermal growth factor (EGFR), human kallikrein-2 (HK2), mucin (MUG), prostate specific antigen (PSA), prostate specific membrane antigen (PMA) ), 13 subunits of human chorionic gonadotropin (13-hCG), etc.], and genes related to the translocation cascade [e.g., nm23 family of nucleoside diphosphate kinases (cell migration) (HJ-6), PTEN / MMAC] (Cell migration and local adhesion), CADJ / E-cadherin (cell Cell adhesion), MKK4 / Seki (cellular response to stress), regulation of KiSS-i (MIIMLP9 expression), BR / VISI (cell motility), etc.]. For example, aneuploidy and changes in CKI9, ERB2, CEA, MUG], EGF receptor, J3-hCG are useful in the diagnosis of breast cancer; pS3 for lung cancer, Ki-ras mutants CDKN2A, LOH 3p, FHIP; P53, APC, CEA, CKi9, CK20, ERBB2, Ki-ras for colorectal cancer, gastric cancer, and pancreatic cancer; PSA, PSM, HK2 for prostate cancer; p53 variants for head and neck cancer and Microsatellite change. Genetic markers can be applied individually or in combination to achieve useful detection of genetic changes in a subject. Methods for data readout include, but are not limited to, flow cytometry, fluorescence microscopy, trending or dye-based polymerase chain reaction readers.

ＣＡＭで濃縮された、特定の腫瘍について現在公知であるＣＥＣ細胞およびそれらのＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または抗原はまた、心血管疾患の危険性を有する被験体を検出するための多重ＣＥＣ検出アッセイに適用され得る。多重ＣＥＣアッセイに使用される細胞マーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＥＣ機能表現型［細胞によるアセチルＬＤＬ取り込み］および内皮抗原［ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１、フォン・ヴィレブランド（ｖａｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子（ｖＷＦ）、Ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦについてのレセプター）、ＶＥ−カドへリン］。これらのマーカーは、個別にかまたは組み合わせて適用されて、被験体由来の所与の体積の血液もしくは体液中の生存内皮細胞の有効な同定および算出を達成し得る。データ読み出しの方法としては、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）、および定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲなどが挙げられるが、これらに限定されない。ＣＡＭで濃縮されたＣＥＣ細胞は、被験体の遺伝的な試験のための供給源をさらに提供し得る。つまり、被験体の遺伝子の構造および機能の変化は、ＣＡＭにより濃縮されたＣＴＣ細胞を用いて遺伝的に試験され得る。遺伝的マーカーは、個別にかまたは組み合わせて適用されて、被験体の遺伝的変化の有効な検出を達成し得る。   CAM-enriched CEC cells currently known for specific tumors and their DNA, RNA, proteins or antigens also apply to multiplex CEC detection assays to detect subjects at risk for cardiovascular disease Can be done. Cell markers used in the multiplex CEC assay include, but are not limited to: CEC functional phenotype [acetyl LDL uptake by cells] and endothelial antigen [CD31 / PECAM-1, von Willebrand (van) Willebrand factor (vWF), Flk-1 (receptor for VEGF), VE-cadherin]. These markers can be applied individually or in combination to achieve effective identification and calculation of viable endothelial cells in a given volume of blood or body fluid from a subject. Data readout methods include, but are not limited to, flow cytometry, fluorescence microscopy, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and quantitative real-time RT-PCR. CAM-enriched CEC cells can further provide a source for genetic testing of a subject. That is, changes in the structure and function of a subject's genes can be genetically tested using CAM-enriched CTC cells. Genetic markers can be applied individually or in combination to achieve effective detection of a subject's genetic changes.

一実施形態において、ＣＡＭ上に捕獲された生存細胞は、適切なコア材料および細胞接着被覆を選択することによって、消化酵素（コラゲナーゼ、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ＧＩＢＣＯから購入される）、およびヒアルロナーゼが挙げられるが、これらに限定されない）の使用によってデバイス表面から容易に放出され得る。例えば、細胞接着分子とＣＡＭフィルムのコラーゲンもしくはゼラチンが、消化に感受性であり得る。細胞とマトリックスとの間の結合を切断する酵素は、生存細胞をＣＡＭから懸濁液中に放出させる。例えば、Ｉ型コラーゲンが細胞接着分子を支持する骨格である場合、ＣＡＭで捕獲された細胞は、コラゲナーゼを用いて懸濁液中に効率的に放出され得る。   In one embodiment, viable cells captured on the CAM are treated with digestive enzymes (collagenase, trypsin / EDTA solution (purchased from GIBCO), and hyaluronase by selecting the appropriate core material and cell adhesion coating. Can be easily released from the device surface by use of (but not limited to). For example, cell adhesion molecules and CAM film collagen or gelatin may be sensitive to digestion. An enzyme that cleaves the bond between the cell and the matrix releases viable cells from the CAM into suspension. For example, when type I collagen is a scaffold that supports cell adhesion molecules, cells captured by CAM can be efficiently released into suspension using collagenase.

本発明の検出方法は、癌診断目的（例えば、初期検出）、治療反応および外科的反応のモニタリング、ならびに癌進行の予後判定のために使用され得る。ＣＡＭで濃縮されたＣＴＣは、例えば、腫瘍細胞を単離する現行の外科的方法を使用するよりも早く癌を検出し、治療反応および外科的反応をモニタリングし、癌の病期決定を改善し、そして患者の腫瘍の転移の可能性を決定するために使用され得る。これらの用途は、被験体の遺伝的変化を決定する工程、循環性腫瘍細胞の組織起源を検証する工程、癌の型の分子マーカーを測定する工程、そして腫瘍の細胞障害性白血球の数もしくは補体の結合における減少の程度を決定する工程のような、当業者に公知のさらなる多重分子アッセイを用いてさらに増強され得る。   The detection methods of the present invention can be used for cancer diagnostic purposes (eg, initial detection), monitoring of therapeutic and surgical responses, and prognosis of cancer progression. CAM-enriched CTCs, for example, detect cancer faster than using current surgical methods to isolate tumor cells, monitor treatment and surgical response, and improve cancer staging And can be used to determine the likelihood of metastasis of a patient's tumor. These uses include determining a subject's genetic changes, verifying the tissue origin of circulating tumor cells, measuring molecular markers of cancer types, and the number or complement of tumor cytotoxic leukocytes. It can be further enhanced using additional multiplex molecular assays known to those skilled in the art, such as determining the degree of reduction in body binding.

予後判定および治療有効性がまた、本発明の検出アッセイによって判定され得る。例えば、治療的介入の間およびその後の生存ＣＴＣの数が、治療有効性を確認するために使用され得る。ＣＡＭで濃縮されたＣＴＣ、および関連する抗腫瘍宿主免疫は、顕微鏡画像およびフローサイトメトリーと併せて検出され、定量化され得る。化学治療レジメンの選択は、最も効率よく、過度の副作用なしに、血液サンプル中の生存ＣＴＣの数を減少させるこれらのレジメンを決定することによって最適化され得る。化学治療レジメンの最適化はまた、ＣＡＭで濃縮されたＣＴＣを一連のエキソビボの化学治療レジメンに供することによって行われ得る。次いで、有効な用量または薬物の組み合わせが同じ患者に投与され得る。生存ＣＴＣの数は、この化合物もしくは薬剤の投与前および投与後に決定され得る。投与後に生存ＣＴＣの数を顕著に減少させる化合物もしくは薬剤が、見込みある抗癌剤として選択され得る。効力を示す薬剤は、ＣＴＣの数を減少させ得るもの、細胞障害性白血球および補体系（宿主免疫）の数を増加させ得るもの、ならびに腫瘍細胞増殖を抑制し得るものである。   Prognosis and therapeutic efficacy can also be determined by the detection assay of the present invention. For example, the number of surviving CTCs during and after therapeutic intervention can be used to confirm therapeutic efficacy. CAM enriched CTC, and associated anti-tumor host immunity, can be detected and quantified in conjunction with microscopic images and flow cytometry. The choice of chemotherapeutic regimens can be optimized by determining those regimens that most efficiently reduce the number of viable CTCs in the blood sample without undue side effects. Chemotherapy regimen optimization can also be performed by subjecting the CAM-enriched CTCs to a series of ex vivo chemotherapy regimens. An effective dose or drug combination can then be administered to the same patient. The number of viable CTCs can be determined before and after administration of the compound or agent. Compounds or agents that significantly reduce the number of viable CTCs after administration can be selected as potential anticancer agents. Agents that show efficacy are those that can reduce the number of CTCs, those that can increase the number of cytotoxic leukocytes and the complement system (host immunity), and those that can inhibit tumor cell growth.

本発明の検出方法はまた、新規化合物または新規薬剤が抗心血管疾患活性または他の活性を有するか否かを検出するために使用され得る。   The detection methods of the invention can also be used to detect whether a new compound or a new agent has anti-cardiovascular disease activity or other activity.

同時係属中のＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／２６７３５に記載されるように、腫瘍に対する宿主免疫の存在に起因して、ほとんどのＣＴＣが循環中で死んでいるかアポトーシス状態であることに注意すべきである。ＣＴＣおよび腫瘍関連細胞障害性白血球の生存率、ならびに個々のドナーに由来する自己補体系に関する測定は、腫瘍に対する宿主免疫を決定する有効な手段を組み立てる。被験体は、ＣＡＭによって濃縮された生存ＣＴＣの数が、自己血漿の非存在下では高いが自己血漿の存在下では低い場合、抗腫瘍免疫を有するとみなされ得る。一方、抗腫瘍免疫を失った被験体は、免疫による殺傷に抵抗する免疫自己血漿の存在下および非存在下で、高レベルの生存ＣＴＣを有する。   It should be noted that most CTCs are dead in the circulation or in an apoptotic state due to the presence of host immunity against the tumor, as described in co-pending PCT patent application PCT / US01 / 26735. is there. Measurements of CTC and tumor-associated cytotoxic leukocyte viability, as well as the self-complement system from individual donors, assemble an effective means of determining host immunity to tumors. A subject can be considered to have anti-tumor immunity if the number of viable CTCs enriched by CAM is high in the absence of autologous plasma but low in the presence of autologous plasma. On the other hand, subjects who have lost anti-tumor immunity have a high level of surviving CTC in the presence and absence of immune autologous plasma that resists killing by immunity.

癌患者の血液からＣＡＭによって濃縮された生存ＣＴＣはまた、抗腫瘍ワクチン開発のため、樹状細胞との融合に使用され得る。例えば、異なる癌を有する個々の患者からのＣＴＣは、エキソビボの培養および増殖に供され得、そしてこれらの細胞は、全体で、または特異的膜構造および特異的抗原に対して精製されて、有効な抗腫瘍ワクチン開発のために樹状細胞と相互作用させるために使用され得る。   Viable CTCs enriched by CAM from the blood of cancer patients can also be used for fusion with dendritic cells for anti-tumor vaccine development. For example, CTCs from individual patients with different cancers can be subjected to ex vivo culture and expansion, and these cells can be purified in whole or purified against specific membrane structures and specific antigens Can be used to interact with dendritic cells for the development of new anti-tumor vaccines.

癌患者の血液からＣＡＭ法によって濃縮された細胞障害性リンパ球は、それ自身価値がある可能性がある：非腫瘍関連リンパ球と比較したそれらの遺伝子発現プロフィールの慎重な比較は、転移性腫瘍細胞に対して起こされている進行中の免疫応答および炎症の型に関する価値ある情報をもたらし得る。さらに、別の価値ある治療アプローチは、インビトロで、例えばＩＬ−２を用いて、これらの細胞を増殖させ、これらを患者に再導入して、患者の抗腫瘍免疫応答を増強するためのものであり得る。このアプローチは、黒色腫および他の腫瘍の管理において劇的な有用性を有し得る。   Cytotoxic lymphocytes enriched by the CAM method from the blood of cancer patients may be valuable per se: a careful comparison of their gene expression profiles compared to non-tumor-associated lymphocytes is a metastatic tumor It can provide valuable information regarding the type of ongoing immune response and inflammation that is being raised against the cells. In addition, another valuable therapeutic approach is to expand these cells in vitro, for example using IL-2, and reintroduce them into the patient to enhance the patient's anti-tumor immune response. possible. This approach can have dramatic utility in the management of melanoma and other tumors.

本発明の実施形態は、診断目的および治療目的の両方に関して、例えば転移性ＣＴＣの小分画を、患者の体内の多数の他の循環性細胞から分離する能力を提供することに有用である。   Embodiments of the present invention are useful for providing the ability to separate, for example, a small fraction of metastatic CTC from a number of other circulating cells in a patient's body, for both diagnostic and therapeutic purposes.

本発明の実施形態は：（１）生存標的細胞（例えば、腫瘍細胞および内皮細胞）を特異的に単離し、しかし無関係な細胞もしくは損傷した細胞をそのまま残すことができ；（２）全血中の５００万個を超える細胞から１００個を超える標的細胞（例えば、腫瘍細胞および内皮細胞）の濃縮を達成することができ；（３）正常血液細胞から、標的細胞を同じアッセイ形式で容易に同定（「癌細胞」または「内皮前駆細胞」のように）することができ；（４）バックグラウンドの正常血液細胞から、転移性の癌および心血管疾患に罹患する患者の診断および治療に有用な細胞を濃縮することができる。   Embodiments of the invention include: (1) specifically isolated viable target cells (eg, tumor cells and endothelial cells), but can leave unrelated or damaged cells intact; (2) in whole blood Enrichment of over 100 target cells (eg, tumor cells and endothelial cells) from over 5 million cells; (3) Easily identify target cells from normal blood cells in the same assay format (Such as “cancer cells” or “endothelial progenitor cells”); (4) useful for diagnosis and treatment of patients suffering from metastatic cancer and cardiovascular disease from background normal blood cells Cells can be concentrated.

（発明の実施形態の詳細な説明）
本発明は、疾患（例えば、癌および心血管疾患）の、および出生前診断における、スクリーニング、診断および管理のための、患者から採られた流体サンプル中の標的細胞の単離および検出に関する
患者から採られた流体サンプルからの標的細胞の単離は、本方法によって促進される。このような細胞の単離は、このような細胞に関連する疾患状態を管理することに有用であり得る。例えば、患者から採られた血液サンプルにおける腫瘍細胞および内皮細胞の同定は、転移性の癌および心血管疾患をそれぞれ示す。したがって同様に、妊娠雌の血液中に存在する胎児細胞は、単離され得、そして胎児に関する疾患の出生前診断に使用され得る。 (Detailed Description of Embodiments of the Invention)
The present invention relates to isolation and detection of target cells in a fluid sample taken from a patient for screening, diagnosis and management of diseases (eg, cancer and cardiovascular disease) and in prenatal diagnosis. Isolation of target cells from the collected fluid sample is facilitated by the present method. Isolation of such cells can be useful in managing disease states associated with such cells. For example, the identification of tumor cells and endothelial cells in blood samples taken from patients indicates metastatic cancer and cardiovascular disease, respectively. Thus, similarly, fetal cells present in the blood of pregnant females can be isolated and used for prenatal diagnosis of diseases related to the fetus.

本発明の実施形態は、標的細胞の分離に関し、これは、浸潤突起の接着性の表現型の挙動に基づいて標的細胞を捕獲する機能的濃縮手順を用いた、腫瘍細胞、内皮細胞および胎児細胞の分離戦略を包含する。この細胞接着特性は、強い親和性および特異性で血管の微小環境を模倣するＥＣＭマトリックスに結合する性向として現れ、１つの特異的なタンパク質によってではなく、むしろ、「浸潤突起」と称される細胞の突起における細胞表面上にクラスター形成している、特異的細胞接着レセプターのインテグリンを含むタンパク質の複合体によって媒介されるように見える。   Embodiments of the invention relate to target cell separation, which involves tumor cells, endothelial cells and fetal cells using a functional enrichment procedure that captures target cells based on the adherent phenotypic behavior of the infiltrate Includes separation strategies. This cell adhesion property manifests itself as a propensity to bind to an ECM matrix that mimics the vascular microenvironment with strong affinity and specificity, rather than by one specific protein, rather called a cell called an “invasive process” It appears to be mediated by a complex of proteins, including the specific cell adhesion receptor integrin, clustered on the cell surface in the process.

（ＣＡＭ細胞濃縮）
ＣＡＭ細胞濃縮の腫瘍細胞および内皮細胞の分離戦略は、過去１０年間（ＡｏｙａｍａおよびＣｈｅｎ，１９９０；ＣｈｅｎおよびＣｈｅｎ，１９８７；Ｃｈｅｎら，１９９４ａ；Ｃｈｅｎら，１９８４；Ｃｈｅｎら，１９９４ｂ；Ｃｈｅｎ，１９９６；Ｃｈｅｎ，１９８９；ＣｈｅｎおよびＷａｎｇ，１９９９；Ｇｈｅｒｓｉら，２００２；ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＣｈｅｎ，２０００；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，１９９７；Ｋｅｌｌｙら，１９９４；Ｍｏｎｓｋｙら，１９９４；Ｍｏｎｓｋｙら，１９９３；Ｍｕｅｌｌｅｒら，１９９９；ＭｕｅｌｌｅｒおよびＣｈｅｎ，１９９１；Ｍｕｅｌｌｅｒら，１９９２；Ｎａｋａｈａｒａら，１９９６；Ｎａｋａｈａｒａら，１９９８；Ｎａｋａｈａｒａら，１９９７；Ｐａｖｌａｋｉら，２００２；Ｐｉｎｅｉｒｏ−Ｓａｎｃｈｅｚら，１９９７；Ｓａｇａら，１９８８；Ｚｕｃｋｅｒら，２０００；Ｚｕｋｏｗｓｋａ−Ｇｒｏｊｅｃら，１９９８）に詳細に特徴付けられたような、材料に対する接着性の表現型の挙動に基づいて標的細胞を捕獲する、機能的濃縮手順を使用する工程を包含する。浸潤突起を有する細胞（「浸潤突起性細胞（ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉｃ ｃｅｌｌ）」）が、血管の微小環境を模倣するマトリックスに、特に摂動状態で、強い親和性で結合することが見出されている。浸潤突起の挙動に基づいて、生存転移性腫瘍細胞および脈管形成性内皮細胞について高度に選択的であり、かつ白血球／単球および赤血球のうちのいくつかを捕獲し、そして他の細胞型を溶液中に残す、機能的細胞濃縮工程が、設計され得る。ＣＡＭ細胞濃縮アッセイは、白血球共通抗原ＣＤ４５に対して指向する抗体を用いた負の同定／選択手順をさらに包含し得る。 (CAM cell concentration)
CAM cell-enriched tumor and endothelial cell separation strategies have been described in the past decade (Aoyama and Chen, 1990; Chen and Chen, 1987; Chen et al., 1994a; Chen et al., 1984; Chen et al., 1994b; Chen, 1996; Chen and Wang, 1999; Ghersi et al., 2002; Goldstein and Chen, 2000; Goldstein et al., 1997; Kelly et al., 1994; Monsky et al., 1994; Monsky et al., 1993; Mueller et al., 1999; Mueller and Chen, 1991 Mueller et al., 1992; Nakahara et al., 1996; Nakahara et al., 1998; Nakahara et al., 1997; Pavlaki et al., 2 02; Pineiro-Sanchez et al., 1997; Saga et al., 1988; Zucker et al., 2000; Zukowski-Grojec et al., 1998) target cells based on the phenotypic behavior of adhesion to materials. Using a functional enrichment procedure that captures It has been found that cells with infiltrating processes (“invadoid cells”) bind with strong affinity to a matrix that mimics the vascular microenvironment, particularly in perturbed states. Based on the behavior of infiltrates, it is highly selective for viable metastatic tumor cells and angiogenic endothelial cells, and captures some of leukocytes / monocytes and erythrocytes, and other cell types A functional cell enrichment process can be designed that remains in solution. The CAM cell enrichment assay may further include a negative identification / selection procedure using an antibody directed against the leukocyte common antigen CD45.

本方法は、生化学的に非反応性のコア（例えば、細胞接着分子、特に天然および合成の血液由来接着分子、と物理的に結合するコラーゲンポリマー）を備えるＣＡＭを利用する。ＣＡＭは、好ましくは、生存腫瘍細胞がマトリックスに接着することを可能にし、一方で血中の正常なバックグラウンド細胞への接着を回避するように設計される、すなわち、生存腫瘍細胞が高いアビディティで結合することを可能にし、しかし正常細胞（好ましくは、例えば、９９．９％を超える白血球細胞および９９．９９９９％を超える赤血球細胞を含む）、および死んだ腫瘍細胞および死につつある腫瘍細胞への結合は回避する。ＣＡＭ被覆はまた、１つ以上のＣＡＭ侵襲性細胞と反応し得るリガンド（例えば、抗体、蛍光マーカーおよび／もしくは色素マーカーなど）を含む。このリガンドは、ＣＡＭに可視性の変化もしくは非可視性の（しかし検出可能な）変化を引き起こし得、１つ以上の検出されるべき細胞の存在を示す。このようなリガンドは、あるいは、ＣＡＭと関連する別々の検出層に並行して配置され得る。薄いＣＡＭ被覆は、好ましくは、細胞分離ユニットの内部底面に固定される。   The method utilizes a CAM with a biochemically non-reactive core (eg, a collagen polymer that physically binds to cell adhesion molecules, particularly natural and synthetic blood-derived adhesion molecules). The CAM is preferably designed to allow viable tumor cells to adhere to the matrix while avoiding adherence to normal background cells in the blood, i.e., viable tumor cells with high avidity To normal cells (preferably including more than 99.9% white blood cells and more than 99.9999% red blood cells), and to dead and dying tumor cells Avoid binding. The CAM coating also includes a ligand (eg, antibody, fluorescent marker and / or dye marker, etc.) that can react with one or more CAM invasive cells. This ligand can cause a visible or invisible (but detectable) change in the CAM, indicating the presence of one or more cells to be detected. Such ligands can alternatively be placed in parallel on separate detection layers associated with the CAM. A thin CAM coating is preferably secured to the inner bottom surface of the cell separation unit.

したがって、ＣＡＭは、例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の病期ＩおよびＩＶである患者に由来する血液サンプルの単核細胞分画から、生存腫瘍細胞を首尾よく回収するために使用され得る。   Thus, CAM can be used to successfully recover viable tumor cells, for example, from a mononuclear cell fraction of a blood sample derived from a patient with stage I and IV non-small cell lung cancer (NSCLC).

このＣＡＭアプローチはまた、同定の目的で腫瘍細胞を標識するために使用され得る。例えば、蛍光標識コラーゲンを用いてＣＡＭが調製される場合、侵襲性腫瘍細胞は、コラーゲンを消化および摂取する性向を示すので、標識される。対照的に正常細胞は、ＣＡＭを障害しないまま残す。   This CAM approach can also be used to label tumor cells for identification purposes. For example, when a CAM is prepared using fluorescently labeled collagen, invasive tumor cells are labeled because they exhibit a propensity to digest and ingest collagen. In contrast, normal cells leave the CAM intact.

濃縮が所望される浸潤突起細胞に関して、ＣＡＭ組成物およびＣＡＭアッセイ表面構造は、血管内微小環境をよりよく模倣し、それによってサンプル（例えば、全血）から最大数の所望される生存細胞を回収するように設計される。浸潤突起細胞のより効率的な濃縮はまた、血流を最適に模倣して、腫瘍細胞とＣＡＭとの間の接触を増加させるユニット回転手順の使用によって達成され得る。好ましい実施形態において、サンプルは、代表的に、このサンプル中における浸潤突起細胞の生存率を保持させる様式で処理されるべきである。   For infiltrating cells that are desired to be enriched, the CAM composition and CAM assay surface structure better mimics the intravascular microenvironment, thereby recovering the maximum number of desired viable cells from a sample (eg, whole blood). Designed to do. More efficient enrichment of infiltrating process cells can also be achieved by use of a unit rotation procedure that optimally mimics blood flow and increases contact between tumor cells and CAM. In a preferred embodiment, the sample should typically be processed in a manner that preserves the viability of infiltrating cells in the sample.

（ＣＡＭ開始単離デバイス）
ＣＡＭ開始細胞単離デバイスは、多数の設計（例えば、細胞培養チャンバースライド、培養用マイクロタイタープレート、または培養フラスコなど）を備え得る。 (CAM start isolation device)
A CAM-initiating cell isolation device can comprise a number of designs, such as a cell culture chamber slide, a culture microtiter plate, or a culture flask.

例えば、ＣＡＭ開始細胞単離デバイスは、図１に示されるように、１つ以上のウェル（１２）の底部にＣＡＭ（１０）を有する、ユニットアレイ（１４）中の複数のウェル（１２）を備える。図１Ａは、１３ウェルのマイクロアレイを図示し、一方図１Ｂは、９６ウェルのマイクロアレイを図示する。ＣＡＭ開始細胞単離デバイスは、種々の形状の採血管（１６、１８、２２）（これらの採血管は、蓋（２０）がはまっていてもいなくてもよい）を備え得るか、または図２に示されるような容器（この容器では、内壁は、ＣＡＭフィルム（１０）で被覆されており、底面（２６）は被覆されておらず、そして蓋（２０）は、はまっているかもしくははまっていない）を備え得る。好ましくは、このような容器は、使用前に滅菌される。ＣＡＭ開始血液デバイスは、例えば、容器内に置かれたサンプル（２８）からＣＡＭ（３０）中のＣＴＣおよび／またはＣＥＣを単離するために使用され得る。ＣＡＭ（１０）は、例えば、細胞接着材料を含む層（３０）内に組み込まれたガラスビーズ（３４）から構成され得る。   For example, a CAM-initiating cell isolation device comprises a plurality of wells (12) in a unit array (14) having a CAM (10) at the bottom of one or more wells (12), as shown in FIG. Prepare. FIG. 1A illustrates a 13-well microarray, while FIG. 1B illustrates a 96-well microarray. The CAM-initiating cell isolation device may comprise various shapes of blood collection tubes (16, 18, 22), which may or may not be covered with a lid (20) or FIG. (In this container, the inner wall is covered with a CAM film (10), the bottom (26) is not covered, and the lid (20) is fitted or not fitted) ). Preferably, such containers are sterilized before use. The CAM-initiating blood device can be used, for example, to isolate CTC and / or CEC in CAM (30) from sample (28) placed in a container. The CAM (10) can be composed, for example, of glass beads (34) incorporated within a layer (30) comprising a cell adhesion material.

ＣＡＭ開始細胞単離デバイスは、透視図および図３Ｂの断面図におけるような測定用カード（３８）を備えるディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）（３６）を利用し得る。測定用カード（３８）は、ＣＡＭフィルムに被覆されている。このディップスティックまたは測定カードは、細胞分離容器（１６）に挿入される。ＣＡＭフィルムは、ディップスティック（３８）の表面上、ならびに／またはチューブ（１６）および／もしくは蓋（２０）に広げられ得る。   The CAM-initiating cell isolation device may utilize a dipstick (36) with a measurement card (38) as in the perspective view and cross-sectional view of FIG. 3B. The measurement card (38) is covered with a CAM film. This dipstick or measurement card is inserted into the cell separation container (16). The CAM film can be spread on the surface of the dipstick (38) and / or on the tube (16) and / or the lid (20).

一実施形態において、ＣＡＭ開始細胞単離デバイスは、細胞集団がＣＡＭフィルムに接触する前にこの集団を分離するのを助ける、分離前および／または分離後の特徴（例えば、フィルター（例えばＡｍｉｃｏｎフィルター、中空フィルター）、膜、もしくは勾配（例えば、フィコール（ｆｉｃｏｌｌ）、スクロースなど））をさらに備える。   In one embodiment, the CAM-initiating cell isolation device is a pre-separation and / or post-separation feature (eg, filter (eg, Amicon filter, Hollow filters), membranes, or gradients (eg, ficoll, sucrose, etc.).

図４を見ると、血液濾過カセット（４３）の３次元図が示されている。このカセットは、濾過されるべきサンプルの導入のため、ハウジング中にメッシュ（もしくはＣＡＭ被覆メッシュ）のような前フィルター（４１）を含み、ハウジング中にＣＡＭ（１０）で充填された主フィルター（４０）、および後フィルター（４２）出口を含む。図４Ｂは、ＣＡＭで充填された主フィルター区画（４０）の拡大された断面図である。   Turning to FIG. 4, a three-dimensional view of the blood filtration cassette (43) is shown. This cassette includes a pre-filter (41) such as a mesh (or CAM coated mesh) in the housing for introduction of the sample to be filtered, and a main filter (40) filled with CAM (10) in the housing. ), And a post filter (42) outlet. FIG. 4B is an enlarged cross-sectional view of the main filter compartment (40) filled with CAM.

一実施形態において、ＣＡＭ開始細胞単離デバイスのＣＡＭフィルムは、コラーゲン被覆された、フィルム中における血流を可能にする吻合チャンネルを作製するように構成された、都合良くは２００ミクロンから２０００ミクロンの範囲の直径を有するマイクロビーズを含む。この血液濾過ユニット中の全血は、約３７℃でインキュベートされ得、かつ細胞とＣＡＭとの間の接触を増加させる血流を模倣するように回転され得、そして血液からの生存細胞の効率よい濃縮を支持する。腫瘍細胞および内皮前駆細胞のような標的細胞を含む血液は、ＣＡＭ開始濃縮デバイス中に４〜４８時間の範囲に及ぶ長期間保存されて、濃縮の効率を増し得る。   In one embodiment, the CAM film of the CAM-initiating cell isolation device is configured to create a collagen-coated, anastomotic channel that allows blood flow in the film, conveniently from 200 microns to 2000 microns. Includes microbeads having a range of diameters. Whole blood in this hemofiltration unit can be incubated at about 37 ° C. and can be rotated to mimic the blood flow that increases contact between the cells and the CAM, and the efficiency of viable cells from the blood Supports concentration. Blood containing target cells such as tumor cells and endothelial progenitor cells can be stored in CAM-initiated concentration devices for extended periods ranging from 4 to 48 hours to increase the efficiency of concentration.

ＣＡＭ開始細胞単離デバイスおよびシステムを設計することにおいて、３つのパラメーターが解決される必要があり得る：（ｉ）腫瘍の血管内微小環境の模倣性を高め、それによって最大数の生存腫瘍細胞を全血から回収するための、ＣＡＭ組成物およびＣＡＭアッセイ表面構造；（ｉｉ）血流を最適に模倣し、腫瘍細胞とＣＡＭとの間の接触を増加させ、そしてより効率よい生存腫瘍細胞の濃縮を促進するためのユニット回転手順；ならびに（ｉｉｉ）血液サンプル中における腫瘍細胞の生存率をよりよく保持する血液処理様式。   In designing CAM-initiating cell isolation devices and systems, three parameters may need to be resolved: (i) increase the mimicry of the tumor's intravascular microenvironment, thereby increasing the maximum number of viable tumor cells CAM composition and CAM assay surface structure for recovery from whole blood; (ii) Optimum mimicking blood flow, increasing contact between tumor cells and CAM, and more efficient enrichment of viable tumor cells A unit rotation procedure to facilitate the treatment; and (iii) a blood processing modality that better preserves the viability of tumor cells in the blood sample.

腫瘍細胞を濃縮するための上記の正のＣＴＣ選択法はまた、癌細胞を取除くための、採取された自己血または自己骨髄に対する負の濾過工程として使用され得る。したがって、本発明のＣＡＭ開始血液濾過工程は、癌手術の間に改修された血液の自己輸血、治療的骨髄移植および末梢血幹細胞移植、ならびにアフェレーシスに関して利用され得る。記載されたＣＡＭ開始血液濾過工程はまた、循環から転移し得る細胞を除去することによって完全な癌の発生を防ぐために使用され得る。   The positive CTC selection method described above for enriching tumor cells can also be used as a negative filtration step on collected autologous blood or autologous bone marrow to remove cancer cells. Thus, the CAM-initiated hemofiltration process of the present invention can be utilized for blood autotransfusion, therapeutic bone marrow and peripheral blood stem cell transplantation, and apheresis modified during cancer surgery. The described CAM-initiated hemofiltration process can also be used to prevent the development of complete cancer by removing cells that can metastasize from the circulation.

アッセイの腫瘍細胞濃縮効率を最適化するために、特異的かつ感受性のあるコントロール実験が行われ得る。有意な変数としては、以下が挙げられる：（ａ）ＣＡＭによって捕獲された後の、外因性に添加された腫瘍細胞株の生存率、（ｂ）最も効率よく腫瘍細胞を濃縮および単離する条件、ならびに（ｃ）ＣＡＭフィルムからの細胞の完全な溶出を生じる細胞処理様式。   Specific and sensitive control experiments can be performed to optimize the tumor cell enrichment efficiency of the assay. Significant variables include: (a) Viability of exogenously added tumor cell lines after being captured by CAM, (b) Conditions for the most efficient enrichment and isolation of tumor cells As well as (c) a cell treatment mode that results in complete elution of cells from the CAM film.

（実施例１）
（血液由来のＣＴＣおよびＣＥＣ）
全血は、ＣＡＭ血液収集ユニット（例えば、採血管（図２および図３））中に置かれ得る。このチューブは約３７℃でインキュベートされ得、血流を模倣して、細胞とＣＡＭとの間の接触を増加させるように回転され得る。血液は、ＣＡＭ血液試験ユニット中での凝固を防ぐために、抗凝固剤（すなわちＡｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ Ｃｉｔｒａｔｅ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ溶液ＵＳＰ（ＡＣＤ，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）＋５０単位のヘパリンリチウム／ｍＥ）の存在下で回収され得る。密封したＣＡＭ血液チューブはローラー上に配置され得、約３７℃で５〜３０サイクル／分で回転され得、次いで細胞の接着が起こるように１〜３時間インキュベートされ得る。 Example 1
(CTC and CEC derived from blood)
Whole blood can be placed in a CAM blood collection unit, such as a blood collection tube (FIGS. 2 and 3). The tube can be incubated at about 37 ° C. and can be rotated to mimic blood flow and increase contact between cells and CAM. Blood is collected in the presence of an anticoagulant (ie Anticoagulant Citrate Dextrose Solution USP (ACD, Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL) + 50 units of lithium heparin / mE) to prevent clotting in the CAM blood test unit. obtain. The sealed CAM blood tube can be placed on a roller and spun at 5-30 cycles / min at about 37 ° C. and then incubated for 1-3 hours for cell attachment to occur.

（実施例２）
（特異性および感受性のコントロール）
種々の腫瘍起源のヒト腫瘍細胞株が、特異性および感受性のコントロール実験の実施において使用するために選択され得る。例えば、ヒト結腸腫瘍細胞株ＳＷ−４８０、ヒト胃腫瘍細胞株ＲＦ−４８、数種の***腫瘍細胞株、ヒト悪性黒色腫株ＬＯＸ、および数種の卵巣腫瘍細胞株が使用され得る。腫瘍細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から譲渡され得る。全ての細胞株は、マイコプラズマ感染に関して陰性であることが確認されるべきである。腫瘍細胞株は、以下について検査されるべきである：（ａ）プレートから１時間以内でのＣＡＭへの高親和性の結合；（ｂ）高い増殖率；および（ｃ）腫瘍細胞株は、濃縮手順の最後に腫瘍細胞を直接的に可視化させることができるように、使用前に、容易にかつ安定して（１００％）赤色もしくは緑色蛍光染料で蛍光標識されるべきであるか、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に関する発現プラスミドで形質転換されるべきである。コントロールの正常血液は、その比較効率を評価するため、既知の数の、蛍光標識されているかまたはＧＦＰを発現する蛍光ヒト腫瘍細胞とともに播種され、そしてＣＡＭ細胞濃縮法に供される。 (Example 2)
(Specificity and sensitivity control)
Human tumor cell lines of various tumor origins can be selected for use in performing specificity and sensitivity control experiments. For example, human colon tumor cell line SW-480, human gastric tumor cell line RF-48, several breast tumor cell lines, human malignant melanoma line LOX, and several ovarian tumor cell lines can be used. Tumor cell lines can be assigned from the American Type Culture Collection (Manassas, VA). All cell lines should be confirmed negative for mycoplasma infection. Tumor cell lines should be examined for: (a) high affinity binding to CAM within 1 hour of the plate; (b) high growth rate; and (c) tumor cell lines enriched Should be easily and stably (100%) fluorescently labeled with a red or green fluorescent dye or green fluorescent before use so that tumor cells can be directly visualized at the end of the procedure Should be transformed with an expression plasmid for the protein (GFP). Control normal blood is seeded with a known number of fluorescently labeled or fluorescent human tumor cells expressing GFP and subjected to the CAM cell enrichment method to assess its comparative efficiency.

健康なドナーからの全血または臍帯由来の臍帯血は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）を通じて得ることができる。受け取った後直ちに、血液は、多くの場合にさらなる実験操作の間に生じる凝固を防ぐため、Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ Ｃｉｔｒａｔｅ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ溶液ＵＳＰ（ＡＣＤ，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）＋ヘパリンリチウムを補充されるべきである。正常血は、癌特性を有する細胞を含まない。したがって、これらの血液サンプル中にスパイク（ｓｐｉｋｅ）される腫瘍細胞は、この特異性および感受性についての試験で回収されたもののみであるはずである。   Whole blood from healthy donors or umbilical cord blood from umbilical cords can be obtained through the National Disease Research Interchange (Philadelphia). Immediately after receipt, blood should be supplemented with Anticoagulant Citrate Dextrose Solution USP (ACD, Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL) + lithium heparin to prevent clotting that often occurs during further experimental manipulations. . Normal blood does not contain cells with cancer characteristics. Thus, the only tumor cells spiked into these blood samples should be those recovered in this test for specificity and sensitivity.

臍帯血または健康な個体からの血液のサンプルは、既知の数の蛍光標識されている（すなわち、蛍光染料で予め標識されている）かまたはＧＦＰタグ化された腫瘍細胞とともに播種され得る。混合された血液サンプルの３ｍＬアリコートは、腫瘍細胞濃縮のためのＣＡＭアッセイユニットに移送され得る。浮遊血液細胞は、除去され得る。例えば、Ｉ型コラーゲンがＣＡＭフィルムを支持する骨格である場合、ＣＡＭに捕獲された細胞は、コラゲナーゼを用いて懸濁液中に放出され得る。臍帯血由来のコントロール生存腫瘍細胞の数を決定するため、例えば、約３，０００個のＧＦＰ−腫瘍細胞が、３ｍＬの臍帯血（約１５，０００，０００，０００個の血液細胞または細胞培養完全培地（１５％ヒト血清を含む））中にスパイクされ得、そしてＣＡＭ濃縮に供され得る。培地から回収された細胞は、実際の生存腫瘍細胞の数を示す。その比、（臍帯血から回収された細胞数）／（培地から回収された細胞数）は、アッセイの効率を示す。培地と比較した臍帯血からの生存腫瘍細胞の回収％は、ＣＡＭ濃縮アッセイのための最適な条件を決定するために使用され得る。これらの条件としては、ＣＡＭ血液チューブのインキュベーション時間（例えば、１〜３時間）、回転の速さ（例えば、５〜３０サイクル／分）、および細胞生存率を保持するための血液保存時間の長さ（例えば、４〜４８時間）が挙げられる。極端に多数のバックグラウンド細胞の数の存在は、癌細胞のＣＡＭ表面との直接的な接触を妨げ、そしてＣＡＭ法の感度の検出を下げる。採血管のＣＡＭフィルムは、都合良くは、腫瘍細胞に対するＣＡＭの表面接触面積を最大化するように設計される。ＣＡＭは、造血細胞からの腫瘍細胞の示差的な接触に依存するので、細胞インキュベーション時間の長さもまた重要である。   A sample of umbilical cord blood or blood from a healthy individual can be seeded with a known number of fluorescently labeled (ie, pre-labeled with fluorescent dyes) or GFP-tagged tumor cells. A 3 mL aliquot of the mixed blood sample can be transferred to a CAM assay unit for tumor cell enrichment. Suspended blood cells can be removed. For example, if type I collagen is a scaffold that supports a CAM film, cells captured by the CAM can be released into suspension using collagenase. To determine the number of control viable tumor cells derived from umbilical cord blood, for example, about 3,000 GFP-tumor cells are treated with 3 mL of umbilical cord blood (about 15,000,000,000 blood cells or cell culture complete Medium (with 15% human serum)) and can be subjected to CAM enrichment. Cells recovered from the medium indicate the actual number of viable tumor cells. The ratio, (number of cells recovered from cord blood) / (number of cells recovered from medium) indicates the efficiency of the assay. % Recovery of viable tumor cells from cord blood compared to media can be used to determine the optimal conditions for the CAM enrichment assay. These conditions include CAM blood tube incubation time (eg, 1-3 hours), rotational speed (eg, 5-30 cycles / min), and long blood storage time to preserve cell viability. (For example, 4 to 48 hours). The presence of an extremely large number of background cells prevents direct contact of cancer cells with the CAM surface and reduces the sensitivity of the CAM method. The CAM film of the blood collection tube is conveniently designed to maximize the surface contact area of the CAM to the tumor cells. Since CAM relies on differential contact of tumor cells from hematopoietic cells, the length of cell incubation time is also important.

（実施例３）
（ＣＡＭ血液濾過ユニットにおける細胞生存度の決定）
（ｖ．採血管）
別の問題は、血液サンプルの細胞生存度である。この生存度は、研究の実験室への移送の間に変動し得る。保存期間の延長がその血液中の細胞を損傷することが予測され得る。ＣＡＭ血液ユニット中の腫瘍細胞が輸送の間に生存状態いることができるか否かを決定するため、３，０００個のＧＦＰ−腫瘍細胞を３ｍＬの臍帯血中および１５％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）を含むコントロール培地中にスパイクした。各アリコートを４℃で一連の時間（４、６、８、１２、１６、２４、３６および４８時間）保存した。次いで、各アリコートをＣＡＭによって捕獲し、ＣＡＭによるＧＦＰ−腫瘍細胞の回収％を決定した。各時点について、４種の重複した実験を行い、会衆％を決定した。この結果は、ＣＡＭで捕獲された腫瘍細胞が血中の浮遊細胞よりも良好に生存することを示した。 (Example 3)
(Determination of cell viability in CAM hemofiltration unit)
(V. Blood collection tube)
Another issue is the cell viability of the blood sample. This viability can vary during transfer to the laboratory of the study. It can be expected that an extended shelf life will damage the cells in the blood. To determine if the tumor cells in the CAM blood unit can survive during transport, 3,000 GFP-tumor cells in 3 mL umbilical cord blood and 15% human serum (Sigma). Spike into control medium containing. Each aliquot was stored at 4 ° C for a series of times (4, 6, 8, 12, 16, 24, 36 and 48 hours). Each aliquot was then captured by CAM and the% recovery of GFP-tumor cells by CAM was determined. For each time point, four duplicate experiments were performed to determine the congregation%. This result indicated that tumor cells captured by CAM survived better than floating cells in the blood.

ＣＡＭで濃縮された細胞は、顕微鏡的方法およびフローサイトメトリー法を含む、当業者に公知の任意の手段によって計数され得る（詳しい方法については以下を参照のこと）。細胞濃縮実験について、顕微鏡による計数によって得られた予備的データは、回収率がスパイクの量に従って（おおまかにはロジスティック曲線に従って）増加することを示唆する。   Cells enriched with CAM can be counted by any means known to those skilled in the art, including microscopic and flow cytometric methods (see below for detailed methods). For cell enrichment experiments, preliminary data obtained by microscopic counting suggests that recovery increases with the amount of spike (roughly according to a logistic curve).

本開示のＣＡＭ開始細胞単離デバイスを用いて、約１０％の生存率で、最初のサンプル中に血液１ｍＬあたり１，０００個を超えるＧＦＰ−ＬＯＸ細胞が存在する場合、臍帯血中にスパイクされたＧＦＰ−ＬＯＸヒト悪性黒色腫細胞のおよそ４０％を回収することができる。   Using the CAM-initiating cell isolation device of the present disclosure, if there are more than 1,000 GFP-LOX cells per mL of blood in the first sample with a survival rate of about 10%, they are spiked into cord blood. Approximately 40% of GFP-LOX human malignant melanoma cells can be recovered.

（フローサイトメトリーによる被験体の血液中の生存腫瘍細胞の算出および検証のための戦略）
臨床研究において、標識された腫瘍細胞は、侵襲性腫瘍細胞を検出するためにＦＩＴＣ標識コラーゲン（緑）を用い、白血球を検出および除外するためにＰＥ標識された抗ＣＤ４５白血球共通抗原抗体（赤）を用い、そして死細胞を除外するために７−ＡＡＤを用いた、マルチパラメーターフローサイトメトリー細胞分析機で測定され得る。この自動細胞分析は、例えば、上皮、内皮および造血性抗原に対して指向する抗体を含む細胞系統マーカーを用いる顕微鏡を使った顕微鏡的評価によって、並行して、かつ独立に検証され得る。 (Strategy for calculation and validation of viable tumor cells in the blood of a subject by flow cytometry)
In clinical studies, labeled tumor cells use FITC-labeled collagen (green) to detect invasive tumor cells and PE-labeled anti-CD45 leukocyte common antigen antibody (red) to detect and exclude leukocytes And can be measured with a multi-parameter flow cytometric cell analyzer using 7-AAD to exclude dead cells. This automated cell analysis can be verified in parallel and independently, for example, by microscopic evaluation with a microscope using cell lineage markers including antibodies directed against epithelial, endothelial and hematopoietic antigens.

フローサイトメトリーによる血中の侵襲性腫瘍細胞の算出は、マルチパラメーターフローサイトメトリー細胞分析機によって達成され得る。この分析機は、例えば、以下を用いる：（ａ）侵襲性腫瘍細胞を検出するための、腫瘍細胞によって摂取されるＦＩＴＣ標識コラーゲン（緑）、ならびに（ｂ）細胞集団中に混入した白血球を検出および除外するための、ＰＥ標識抗ＣＤ４５白血球共通抗原抗体（赤）。例えば、ＣＡＭによって捕獲された腫瘍細胞および一緒に単離された正常血液細胞は、フィコエリトリン（ＰＥ）結合ＣＤ４５抗体および死細胞核酸染料７−ＡＡＤで後染色され得る。標識された細胞サンプルは、吸引され得、そして例えば、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析され得る。データ分析のための基準としては、他の要因の中でもとりわけ、以下が挙げられ得る：（ａ）前方光散乱によって規定されるサイズ、（ｂ）直交光散乱によって規定される粒度、（ｃ）死んだ７−ＡＡＤ細胞（負の事象）、（ｄ）ＰＥ標識ＣＤ４５ ｍＡｂ正常細胞（負の事象）、および（ｅ）ＦＩＴＣ−腫瘍細胞（正の事象）。   Calculation of invasive tumor cells in the blood by flow cytometry can be accomplished by a multi-parameter flow cytometry cell analyzer. This analyzer uses, for example, the following: (a) FITC-labeled collagen (green) taken up by tumor cells to detect invasive tumor cells, and (b) leukocytes contaminated in the cell population And PE labeled anti-CD45 leukocyte common antigen antibody (red) to exclude. For example, tumor cells captured by CAM and normal blood cells isolated together can be post-stained with phycoerythrin (PE) -conjugated CD45 antibody and dead cell nucleic acid dye 7-AAD. Labeled cell samples can be aspirated and analyzed, for example, on a FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson). Criteria for data analysis may include, among other factors, the following: (a) size defined by forward light scatter, (b) particle size defined by orthogonal light scatter, (c) dead 7-AAD cells (negative event), (d) PE-labeled CD45 mAb normal cells (negative event), and (e) FITC-tumor cells (positive event).

当業者によって理解されるように、異種臨床標本において（例えば、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムを用いて）、生細胞からアポトーシス細胞および死細胞を区別する、数種のサイトメトリー法が存在する。例えば、ＣＡＭで精製された細胞のマルチパラメーターフローサイトメトリーに細胞生存度試験を組み入れるため、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、固定されたＣＡＭ細胞集団において死細胞を標識し得る。７−ＡＡＤは、４８８ｎｍのアルゴンレーザー線によって励起され、そして遠赤外範囲のスペクトルを放射する。７−ＡＡＤスペクトル放射は、ＦＩＴＣおよびＰＥの放射から分離され得る（ＯＬＩＶＥＲら，１９９９）。蛍光パラメーターは、ＣＡＭで精製された血液細胞のサブセットにおいて、死細胞（７−ＡＡＤ）、生存しかつ侵襲性の腫瘍細胞（ＦＩＴＣ−コラーゲン）、および白血球（ＰＥ−ＣＤ４５）の特徴づけを可能にする。新たに標識された細胞は、直ちに計数するためにフローの実験室に送達され得るか、または４℃で１〜３日間懸濁液中で保存され得る。ＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターは、２〜４細胞サンプル／時で計数するように構築され得る。   As will be appreciated by those skilled in the art, there are several cytometric methods that distinguish apoptotic and dead cells from live cells in heterogeneous clinical specimens (eg, using FITC-labeled annexin V and propidium iodide). . For example, to incorporate cell viability testing into multiparameter flow cytometry of CAM-purified cells, 7-amino-actinomycin D (7-AAD, Molecular Probes) was used in a fixed CAM cell population. Dead cells can be labeled. 7-AAD is excited by a 488 nm argon laser line and emits a spectrum in the far infrared range. The 7-AAD spectral radiation can be separated from the radiation of FITC and PE (OLIVER et al., 1999). Fluorescence parameters allow characterization of dead cells (7-AAD), live and invasive tumor cells (FITC-collagen), and leukocytes (PE-CD45) in a subset of blood cells purified with CAM To do. Freshly labeled cells can be delivered to a flow laboratory for immediate counting or stored in suspension at 4 ° C. for 1-3 days. The ACSCalibur flow cytometer can be constructed to count at 2-4 cell samples / hour.

癌または心血管疾患を有する固体から得られた代表的血液サンプルにおいて、循環性の腫瘍細胞および内皮細胞は、通常の造血細胞よりも（１００万倍の範囲で）非常に数が少ない。   In a typical blood sample obtained from a solid with cancer or cardiovascular disease, circulating tumor cells and endothelial cells are very few (in the million times range) than normal hematopoietic cells.

記載される実施形態は、任意の特定の仮説に限定されないが、本発明者らは、以下を推定する：
（ａ）癌進行の最も初期段階の間、転移性細胞は原発性腫瘍から出現し始め；これらの細胞は、侵襲性挙動を示す、
（ｂ）癌の存在を示す血液由来の腫瘍細胞集団は、早期診断およびさらなる分子分析を可能にする、そして
（ｃ）循環性腫瘍細胞と原発性腫瘍細胞との両方に存在する診断用の遺伝子のセットが存在し、これは、循環性腫瘍細胞の組織部位起源を解決するため、特定の癌のサブタイプを決定するため、そして高度に確信のある患者の転移の可能性を予測するために、使用され得る。 The described embodiments are not limited to any particular hypothesis, but we estimate the following:
(A) During the earliest stages of cancer progression, metastatic cells begin to emerge from the primary tumor; these cells exhibit invasive behavior;
(B) a blood-derived tumor cell population that indicates the presence of cancer allows for early diagnosis and further molecular analysis, and (c) a diagnostic gene present in both circulating and primary tumor cells To solve the tissue site origin of circulating tumor cells, to determine specific cancer subtypes, and to predict the likelihood of metastasis in highly confident patients Can be used.

（ＣＡＭ培養法によって濃縮された細胞の顕微鏡的特徴づけ）
高収量のＣＡＭ培養が、独立したＣＡＭ法として並行して行われて、ＣＡＭによる腫瘍細胞濃縮を検証し得、そしてフローサイトメトリーによって計数され得る。ＣＡＭ培養法は、細胞系統マーカーもしくは推定腫瘍マーカーを用いて、顕微鏡および免疫細胞化学によって容易に補強され得る。顕微鏡は、血液からＣＡＭによって濃縮されたＣＴＣを以下に示される特徴：Ｃｏ＋／Ｅｐｉ＋／Ｅｎｄｏ＋／Ｌｅｕ−を有するものとして；ＣＥＣを以下：Ｃｏ−／Ｅｐｉ−／Ｅｎｄｏ＋／Ｌｅｕ−として；腫瘍関連リンパ球を以下：Ｃｏ−／Ｅｐｉ−／Ｅｎｄｏ−／Ｌｅｕ＋として、同定するために使用され得る。特に、ＣＴＣは、以下である：
１）摂取および濃縮されたＴＲＩＴＣ標識コラーゲンフラグメントからの陽性の蛍光（Ｃｏ＋；ＥＣＭを分解および摂取する傾向は、侵襲性および転移性の細胞の特徴の１つである）
２）サイトケラチンおよび上皮膜抗原（ＢｅｒＥＰ４，ＥｐＣＡＭ，ＧＡ７３３ ａｎｄＭｕｃ−ｌ）を含む上皮特異的マーカーに対する、陽性の免疫細胞化学検出（Ｅｐｉ＋）
３）ＣＤ３１、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）およびＶＥＧＦレセプターを含む内皮特異的マーカーに対する、陽性の免疫細胞化学検出（Ｅｎｄｏ＋）
４）ＣＤ４５、ＣＤ１４およびＣＤ６８を含む白血球／単球系統のマーカーに対する、陰性の免疫細胞化学検出；白血球様細胞診断法に対して陰性（Ｌｅｕ−）。 (Microscopic characterization of cells enriched by CAM culture)
High-yield CAM cultures can be performed in parallel as independent CAM methods to verify tumor cell enrichment by CAM and can be counted by flow cytometry. CAM culture methods can be easily augmented by microscopy and immunocytochemistry using cell lineage markers or putative tumor markers. The microscope shows CTCs enriched by CAM from blood with the following characteristics: Co + / Epi + / Endo + / Leu−; CEC below: Co− / Epi− / Endo + / Leu−; The sphere can be used to identify the following: Co− / Epi− / Endo− / Leu +. In particular, the CTC is:
1) Positive fluorescence from ingested and concentrated TRITC-labeled collagen fragments (Co +; the tendency to degrade and ingest ECM is one of the characteristics of invasive and metastatic cells)
2) Positive immunocytochemical detection (Epi +) against epithelial specific markers including cytokeratin and epithelial membrane antigen (BerEP4, EpCAM, GA733 and Muc-1)
3) Positive immunocytochemical detection for endothelium-specific markers including CD31, von Willebrand factor (vWF) and VEGF receptor (Endo +)
4) Negative immunocytochemical detection for leukocyte / monocyte lineage markers including CD45, CD14 and CD68; negative for leukocyte-like cytodiagnosis (Leu-).

ＣＡＭ細胞チャンバー法の抗体標識設計は、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）明視野および三重の蛍光フィルターの使用（例えば、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ３００倒立蛍光顕微鏡上で使用可能である）と組み合わせて、各顕微鏡視野において、強力な腫瘍細胞特徴づけの多重手段を提供する。同じ蛍光顕微鏡視野において、侵襲性細胞のＴＲＩＴＣ−コラーゲン標識は赤色蛍光として見られ、ＦＩＴＣ−細胞型マーカーは緑色蛍光として見られ、そしてＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８核染料は青色蛍光として見られ、一方、ＡＰＡＡＰ染色細胞型マーカーは、ＤＩＣ明光において赤色として示される。画像は、コンピューターハードドライブに保存され得、そしてサンプル中の色素染色もしくは蛍光染色された細胞の数は、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ画像分析ソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のようなソフトウェアに支援されて計数され得る。   The antibody labeling design of the CAM cell chamber method is combined with the use of differential interference contrast (DIC) bright field and triple fluorescence filters (eg, available on Nikon Eclipse E300 inverted fluorescence microscope) Provides multiple means of powerful tumor cell characterization. In the same fluorescence microscope field, TRITC-collagen labeling of invasive cells is seen as red fluorescence, FITC-cell type markers are seen as green fluorescence, and Hoechst 33258 nuclear dye is seen as blue fluorescence, while APAAP-stained cell type The marker is shown as red in DIC bright light. The images can be stored on a computer hard drive, and the number of dye-stained or fluorescently stained cells in the sample can be counted with the aid of software such as Metamorph image analysis software (Universal Imaging Corporation).

ＣＡＭで濃縮され、そして標識された細胞を有するスライドは、陽性腫瘍細胞に関して蛍光顕微鏡下でスキャンされ得る。   Slides with cells enriched with CAM and labeled can be scanned under a fluorescence microscope for positive tumor cells.

（ＣＡＭで濃縮された細胞の多重分子分析：マイクロアレイおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）
循環性腫瘍細胞に特異的に存在することが予測されるｍＲＮＡの発現レベル 対 白血球に存在することが予測されるそのレベルが、濃縮の成功度の基準として使用され得る。所与の細胞集団中の腫瘍細胞のパーセンテージは、腫瘍細胞株およびコントロールとして白血球細胞サンプルを使用して、上皮マーカー（ＧＡ７３３−１）および白血球マーカー（ＣＤ４５）の発現を用いて検証され得る。 (Multiple molecular analysis of cells enriched with CAM: microarray and real-time RT-PCR)
The expression level of mRNA that is predicted to be specifically present in circulating tumor cells versus that level that is predicted to be present in leukocytes can be used as a measure of the success of enrichment. The percentage of tumor cells in a given cell population can be verified using expression of epithelial markers (GA733-1) and leukocyte markers (CD45) using tumor cell lines and white blood cell samples as controls.

リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、血液サンプルから精製された細胞サンプルで、例えばＲｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒを用いて行われ得る。β−アクチンに対する上皮マーカーＧＡ７３３−１および白血球マーカーＣＤ４５のリアルタイムＰＣＲ定量が行われ得る。上皮マーカーＧＡ７３３−１は、純粋な腫瘍細胞サブセットおよび腫瘍細胞株に高レベルで発現されるが、白血球では高レベルでは発現されないと予測される。代わって、白血球マーカーＣＤ４５は、白血球サンプルおよび純粋でない腫瘍細胞集団で検出されるが、腫瘍細胞株でも腫瘍細胞サンプルでも検出されないはずである。回収された腫瘍細胞サンプルにおける実質的なＧＡ７３３−１シグナルの観察は、ＣＡＭ濃縮手順が、腫瘍特徴的マーカーが容易にかつ再現可能に測定され得る細胞プールに戻ることを実証するものと解釈され得る。白血球の混入の程度を示すため、各ＣＡＭ腫瘍細胞セットにおけるＣＤ４５シグナルのレベルを決定することもまた重要である。実質的な混入が観察される場合、例えば、ＣＤ４５の負の選択工程が試されるかまたは最終プロトコールに組み込まれることが必要であり得ることが結論付けられる。   Real-time RT-PCR can be performed on cell samples purified from blood samples using, for example, a Roche Light Cycler. Real-time PCR quantification of the epithelial marker GA733-1 and leukocyte marker CD45 for β-actin can be performed. The epithelial marker GA733-1 is predicted to be expressed at high levels in pure tumor cell subsets and tumor cell lines, but not at high levels in leukocytes. Instead, leukocyte marker CD45 should be detected in leukocyte samples and impure tumor cell populations, but not in tumor cell lines or tumor cell samples. The observation of a substantial GA733-1 signal in the collected tumor cell sample can be interpreted as demonstrating that the CAM enrichment procedure returns to a cell pool where tumor characteristic markers can be easily and reproducibly measured. . It is also important to determine the level of CD45 signal in each CAM tumor cell set to indicate the extent of leukocyte contamination. If substantial contamination is observed, it is concluded that, for example, a negative selection step for CD45 may need to be tried or incorporated into the final protocol.

ほとんどの癌の分子的基盤が理解されていない。各臨床標本において、癌腫細胞は、数および病理学的な型において多様である；癌腫細胞はまた、種々の型および数の正常細胞に囲まれている。さらに、腫瘍細胞は、進行および転移の間にその遺伝子発現プロフィールを変化させる。ＣＡＭ細胞濃縮法は、ＤＮＡマイクロアレイ分析およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を用いたエキソビボでの腫瘍細胞の分子分析に利用可能な、生存腫瘍細胞集団を提供する。これらの生存腫瘍細胞集団は、原発性腫瘍および血液由来の腫瘍細胞において共通に発現される遺伝子、ならびに特殊な上皮性の癌の腫瘍細胞において特異的に発現される遺伝子を発見する広範な調査を可能にする。表１および表２に見られるように、本発明の細胞分離法は、マイクロアレイおよびＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて血液サンプルから単離された腫瘍細胞の特徴づけを可能にした。データは、特殊な腫瘍細胞型に関して特徴的な遺伝子発現を示す。   The molecular basis of most cancers is not understood. In each clinical specimen, the carcinoma cells are diverse in number and pathological type; the carcinoma cells are also surrounded by various types and numbers of normal cells. In addition, tumor cells change their gene expression profiles during progression and metastasis. The CAM cell enrichment method provides a viable tumor cell population that can be used for molecular analysis of tumor cells ex vivo using DNA microarray analysis and real-time RT-PCR analysis. These surviving tumor cell populations are subject to extensive research to discover genes that are commonly expressed in primary tumors and blood-derived tumor cells, as well as genes that are specifically expressed in tumor cells of special epithelial cancers. enable. As seen in Tables 1 and 2, the cell separation method of the present invention allowed the characterization of tumor cells isolated from blood samples using microarray and RT-PCR techniques. The data shows characteristic gene expression for specific tumor cell types.

（表１．細胞サンプルおよびそれらの元の臨床標本の組織病理学的情報）   (Table 1. Histopathological information of cell samples and their original clinical specimens)

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＊全部で７７の細胞サンプル中、４１の細胞サンプルをＤＮＡマイクロアレイにより検査し、６３の細胞サンプルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより検査し、２７の細胞サンプルをＤＮＡマイクロアレイとリアルタイムＲＴ−ＰＣＲとの両方により検査した。
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 * Out of a total of 77 cell samples, 41 cell samples are examined by DNA microarray, 63 cell samples are examined by real-time RT-PCR, and 27 cell samples are examined by both DNA microarray and real-time RT-PCR did.

（表２Ａ．卵巣腫瘍標本および子宮腫瘍標本から濃縮された種々の型の腫瘍細胞においてアップレギュレートされた１２６個の遺伝子）   Table 2A. 126 genes up-regulated in various types of tumor cells enriched from ovarian and uterine tumor specimens

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（表２Ｂ．卵巣腫瘍標本および子宮腫瘍標本から濃縮された種々の型の白血球においてアップレギュレートされた４８遺伝子）
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 (Table 2B. 48 genes up-regulated in various types of leukocytes enriched from ovarian and uterine tumor specimens)

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（表２Ｃ．卵巣腫瘍標本および子宮腫瘍標本から濃縮された種々の型の線維芽細胞においてアップレギュレートされた４５遺伝子）
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 (Table 2C. 45 genes upregulated in various types of fibroblasts enriched from ovarian and uterine tumor specimens)

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（腫瘍に対する宿主免疫の決定のための方法および組成物）
同時係属中のＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／２６７３５に記載されるように、腫瘍に対する宿主免疫の存在に起因してほとんどのＣＴＣは、循環中で死んでいるか、アポトーシス性である。ＣＡＭ開始血液デバイス、ＣＴＣの生存度、および個々のドナーに由来する血漿は、腫瘍に対する宿主免疫を決定する有効な手段を組み立てる。ＣＡＭで濃縮されたＣＴＣは、多くの場合、細胞障害性白血球とともにクラスターを形成する。細胞接着マトリックスは、有望な予後を示し得る患者由来のこのような免疫細胞と癌細胞との複合体のクラスターを容易に単離する。さらに、腫瘍細胞溶解に関与する補体系の可溶性成分が、同じ被験体の血液に由来する自己血漿の存在下でのＣＴＣ生存度によって決定され得る。したがって、腫瘍細胞障害性白血球および可溶性補体系の存在は、宿主免疫についての重要な指標である。
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 (Methods and compositions for determination of host immunity against tumors)
As described in co-pending PCT patent application PCT / US01 / 26735, most CTCs are either dead in the circulation or apoptotic due to the presence of host immunity against the tumor. CAM-initiated blood devices, CTC viability, and plasma from individual donors assemble an effective means of determining host immunity against tumors. CAM-enriched CTCs often form clusters with cytotoxic leukocytes. The cell adhesion matrix readily isolates clusters of such immune cell and cancer cell complexes from patients that may show promising prognosis. Further, the soluble component of the complement system involved in tumor cell lysis can be determined by CTC viability in the presence of autologous plasma derived from the same subject's blood. Thus, the presence of tumor cytotoxic leukocytes and soluble complement system is an important indicator for host immunity.

抗腫瘍細胞障害性白血球および補体系の存在下における生存ＣＴＣ数を決定するため、全血もしくは単核細胞は、１０〜２０％の自己血漿の存在下で、ＣＡＭ開始細胞単離デバイスを介してスクリーニングされ得る。ＣＡＭによって濃縮されたＣＴＣの数が、自己血漿の非存在下で高いが自己血漿の存在下で低い場合、この被験体は、抗腫瘍免疫が高い。一方、自己血漿の存在下および非存在下で検出される、免疫による殺傷に抵抗する高レベルの生存ＣＴＣは、高い悪性度を有する患者に関する最も強力な指標である。   To determine the number of surviving CTCs in the presence of anti-tumor cytotoxic leukocytes and complement system, whole blood or mononuclear cells are passed through a CAM-initiating cell isolation device in the presence of 10-20% autologous plasma. Can be screened. If the number of CTCs enriched by CAM is high in the absence of autologous plasma but low in the presence of autologous plasma, the subject has high anti-tumor immunity. On the other hand, a high level of survival CTC that resists immune killing, detected in the presence and absence of autologous plasma, is the most powerful indicator for patients with high malignancy.

（実施例４）
（全血からの腫瘍細胞のＣＡＭの正の（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）単離）
全血からの腫瘍細胞の単離のために実施され得る例示的なプロトコールは、以下に示される：
１．臍帯血の調製：既知の数のＧＦＰ腫瘍細胞でスパイクされた３ｍＬの抗凝固処理臍帯血（＋３００μのＡＣＤおよびヘパリンリチウム）を、ＣＡＭ血液試験ユニットの各チューブに添加する。密封したＣＡＭ血液チューブをローラー上に配置し、３７℃で５〜３０サイクル／分で回転させる。１〜３時間インキュベートして腫瘍細胞の接着を起こさせる。
２．コントロール培地の調製：既知の数のＧＦＰ腫瘍細胞でスパイクされた３ｍＬのコントロール培地（＋３００μｌのＡＣＤおよびヘパリンリチウム）を、ＣＡＭ血液試験ユニットの各チューブに添加する。密封したＣＡＭ腫瘍チューブをローラー上に配置し、３７℃で５〜３０サイクル／分で回転させる。１〜３時間インキュベートして腫瘍細胞の接着を起こさせる。
３．血液または培地上清をピペッティングによって慎重に除去する。内壁上のＣＡＭフィルムを害することなくチューブを洗浄溶液（ＰＢＳ／０．１％、ＢＳＡ／１０％、ＡＣＤおよびヘパリンリチウム）３ｍＬ中で５回洗浄する。
４．１ｍＬのコラゲナーゼ溶液を、徹底的に洗浄されて赤血球を除去されたＣＡＭ血液濾過ユニットの各チューブに添加する。ＣＡＭ血液試験ユニットの各チューブに添加する。密封したＣＡＭ血液チューブをローラー上に配置し、３７℃で５サイクル／分で回転させる。１０分間インキュベートしてＣＡＭを溶解し、腫瘍細胞を懸濁液中に放出させる。コラゲナーゼ溶液（ＰＢＳ、０．３ ｍＭ ＣａＣｌ２、０．２μｇ／ｍＬ Ｉ型コラゲナーゼ ［Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ］、２５μｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ［Ｒｏｃｈｅ］）。
５．懸濁液を新しいＢｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移送する。ＴＲＩＴＣ−抗ＣＤ４５（顕微鏡観察用）もしくはＰＥ−抗ＣＤ４５（フローサイトメトリー用）を用いて直ちに免疫蛍光標識するため、氷上に保持する。標識された腫瘍細胞を、顕微鏡およびフローサイトメトリーの両方によって計数する。 Example 4
(Positive isolation of CAM of tumor cells from whole blood)
An exemplary protocol that can be implemented for the isolation of tumor cells from whole blood is shown below:
1. Umbilical cord blood preparation: 3 mL of anticoagulated umbilical cord blood spiked with a known number of GFP tumor cells (+ 300μ ACD and lithium heparin) is added to each tube of the CAM blood test unit. The sealed CAM blood tube is placed on a roller and rotated at 37 ° C. for 5-30 cycles / min. Incubate for 1-3 hours to allow tumor cell adhesion.
2. Control medium preparation: 3 mL of control medium (+300 μl of ACD and lithium heparin) spiked with a known number of GFP tumor cells is added to each tube of the CAM blood test unit. The sealed CAM tumor tube is placed on a roller and rotated at 37 ° C. with 5-30 cycles / min. Incubate for 1-3 hours to allow tumor cell adhesion.
3. Carefully remove blood or medium supernatant by pipetting. Wash the tube 5 times in 3 mL of wash solution (PBS / 0.1%, BSA / 10%, ACD and lithium heparin) without harming the CAM film on the inner wall.
4. Add 1 mL of collagenase solution to each tube of the CAM hemofiltration unit that has been thoroughly washed to remove red blood cells. Add to each tube of CAM blood test unit. The sealed CAM blood tube is placed on a roller and rotated at 37 ° C at 5 cycles / min. Incubate for 10 minutes to lyse the CAM and release the tumor cells in suspension. Collagenase solution (PBS, 0.3 mM CaCl 2 , 0.2 μg / mL type I collagenase [Worthington Biochemical], 25 μg / mL DNase [Roche]).
5). Transfer the suspension to a new Bppendorf tube. Keep on ice for immediate immunofluorescence labeling with TRITC-anti-CD45 (for microscopy) or PE-anti-CD45 (for flow cytometry). Labeled tumor cells are counted by both microscopy and flow cytometry.

（実施例５）
（蛍光材料を含むＣＡＭフィルム）
浸潤突起細胞がＥＣＭマトリクスを消化して内部移行する場合、ＣＡＭマトリックスが蛍光性であれば、腫瘍細胞葉、濃縮プロセスの間に蛍光性になるはずである。これを達成するため、ＣＡＭ基質が捕獲容器に被覆される前に、蛍光ＴＲＩＴＣ−もしくはＦＩＴＣ−Ｉ型コラーゲンポリマーがこれに組み込まれる。癌細胞を白血球から区別するために、白血球共通抗原ＣＤ４５に対して指向するフィコエリトリン（ＰＥ）結合抗体またはＦＩＴＣ結合抗体もしくはＴＲＩＴＣ結合抗体を用いた負の同定手順が使用され得る。 (Example 5)
(CAM film containing fluorescent material)
When infiltrating process cells digest and internalize the ECM matrix, if the CAM matrix is fluorescent, it should become fluorescent during the tumor cell leaf, enrichment process. To achieve this, a fluorescent TRITC- or FITC-I collagen polymer is incorporated into the CAM substrate before it is coated on the capture container. To distinguish cancer cells from leukocytes, a negative identification procedure using phycoerythrin (PE) -conjugated antibodies or FITC-conjugated or TRITC-conjugated antibodies directed against the leukocyte common antigen CD45 can be used.

現在、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫細胞化学（上皮分子（例えばＣＫ１８およびＣＫ２０サイトカイン、ＧＡ７３３上皮膜抗原、Ｍｕｃ−１、および汎上皮抗原ＢｅｒＥＰ４）に対して標的化されている）を使用し、循環性腫瘍細胞の上皮起源を確認した（Ｇｈｏｓｓｅｉｎら，１９９９；Ｍｏｌｎａｒら，２００１；Ｒａｃｉｌａら，１９９８；Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｔ，１９９７；Ｓｏｅｔｈら，１９９７；Ｖｌｅｍｓら，２００２；Ｗｈａｒｔｏｎら，１９９９）。両方法とも、高い検出感度を有し、全血由来の単核細胞分画の分画遠心法濃縮後の血中の循環性腫瘍細胞（約５００）を成功裏に分離したが、循環性腫瘍細胞は血中の正常細胞１０億個あたり１００個未満で現れるので、検出速度は低いままである。さらに、このアプローチが最も重要な細胞を捕獲するか否かは分からない。なぜなら、循環への転移進行に関与する遺伝子は、未知であるからである。抗上皮抗体ベースのアフィニティー精製の使用は、血中の腫瘍細胞の著しい損失をもたらす。   Currently using RT-PCR and immunocytochemistry (targeted against epithelial molecules such as CK18 and CK20 cytokines, GA733 epithelial antigen, Muc-1 and panepithelial antigen BerEP4), circulating tumors The epithelial origin of the cells was confirmed (Ghossein et al., 1999; Molnar et al., 2001; Racila et al., 1998; Schoenfeld et at, 1997; Soeth et al., 1997; Vlems et al., 2002; Wharton et al., 1999). Both methods have high detection sensitivity and successfully separated circulating tumor cells (about 500) in blood after concentration of the fraction of mononuclear cells derived from whole blood after differential centrifugation. Since cells appear at less than 100 per billion normal cells in blood, the detection rate remains low. Furthermore, it is not known whether this approach captures the most important cells. This is because the genes involved in the progression of circulation to the circulation are unknown. The use of anti-epithelial antibody-based affinity purification results in a significant loss of tumor cells in the blood.

対照的に、ＣＡＭの１００万倍の細胞濃縮は、１工程で行われ得、１５×１０９血液細胞から３０００個の生存腫瘍細胞の４０％より多くを回収することを達成し得る。 In contrast, a cell enrichment of 1 million times that of CAM can be performed in one step and can achieve recovery of more than 40% of 3000 viable tumor cells from 15 × 10 9 blood cells.

標的細胞の濃縮をさらに向上させるため、複数工程の細胞濃縮手順が採用されて、血液から８５％より多くの腫瘍細胞を回収し得る。この方法は、最初に、単核細胞を濃縮するために全血液細胞を密度勾配遠心分離し、続いてこれらの細胞を蛍光ＣＡＭフィルム上で適切な期間（例えば１２〜１８時間）培養する工程を包含する。これは、以下を目的とする：（ａ）腫瘍細胞を標識すること、（ｂ）ＣＡＭフィルム上で、腫瘍細胞、および白血球の０．１％未満を培養すること、そして（ｃ）ＣＡＭで捕獲された細胞集団を抗体または核酸染料で染色すること。個々の腫瘍細胞および凝集体の両方は、顕微鏡により容易に観察され得る（一方で、細胞凝集体は、多くの場合、フローサイトメトリーにおいて問題を生じる）。   To further enhance target cell enrichment, a multi-step cell enrichment procedure can be employed to recover more than 85% of tumor cells from blood. This method involves first density-centrifugating whole blood cells to concentrate mononuclear cells, followed by culturing these cells on a fluorescent CAM film for an appropriate period of time (eg, 12-18 hours). Includes. This is aimed at: (a) labeling tumor cells, (b) culturing less than 0.1% of tumor cells and leukocytes on CAM film, and (c) capturing with CAM Staining the cell population with an antibody or nucleic acid dye. Both individual tumor cells and aggregates can be easily observed with a microscope (while cell aggregates often cause problems in flow cytometry).

ＣＡＭ血液濾過アッセイは、癌を有する患者の血中の生存腫瘍細胞、内皮前駆細胞および免疫リンパ球を単離するために使用され得る。ＣＡＭで捕獲された細胞は、ＦＩＴＣ（もしくはＴＲＩＴＣ）−コラーゲンベースのＣＡＭで被覆された１６ウェルチャンバースライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に並行して播種され、そして１２〜１８時間培養される。侵襲性腫瘍細胞は、蛍光性ＣＡＭを摂取し、そしてＦＩＴＣ（もしくはＴＲＩＴＣ）で標識されるようになるが、一方同時に精製された内皮細胞および白血球は、未標識のままである。循環性腫瘍細胞の正の同定に加えて、単離された細胞は、蛍光顕微鏡観察のためにＴＲＩＴＣ（もしくはＦＩＴＣ）−ＣＤ４５またはＴＲＩＴＣ（もしくはＦＩＴＣ）−ＣＤ３１で標識することによってか、あるいはフローサイトメトリーのためにＰＥ−ＣＤ４５またはＰＥ−ＣＤ３１で標識することによって、負の同定のため試験される。   The CAM hemofiltration assay can be used to isolate viable tumor cells, endothelial progenitor cells and immune lymphocytes in the blood of patients with cancer. CAM-captured cells are seeded in parallel on a 16-well chamber slide (Lab-Tek, Rochester, NY) coated with FITC (or TRITC) -collagen-based CAM and cultured for 12-18 hours . Invasive tumor cells take up fluorescent CAM and become labeled with FITC (or TRITC), while simultaneously purified endothelial cells and leukocytes remain unlabeled. In addition to positive identification of circulating tumor cells, the isolated cells are labeled with TRITC (or FITC) -CD45 or TRITC (or FITC) -CD31 for flow microscopy or by flow sites Tested for negative identification by labeling with PE-CD45 or PE-CD31 for measurement.

（実施例６）
（フローサイトメトリーによる単離細胞の算出）
患者あたり約１０〜２０ｍＬの血液がＶａｃｕｔａｉｎｅｒチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、緑色の蓋、ヘパリンリチウム抗凝固剤、各チューブには７ｍＬ入る）に採取される。新鮮な採取血液のアリコートは、ＣＡＭ血液試験管に移してもよく、または単核細胞を得るために密度勾配遠心分離にかけて、そしてさらなるＣＡＭ上での細胞濃縮および同定に供してもよい。フローサイトメトリーによる血中生存腫瘍細胞の算出は、以下の基準に基づいて達成され得る：（ａ）そのＦＩＴＣ標識コラーゲンの摂取を介して可視化された腫瘍細胞；（ｂ）正常血液細胞のＰＥ標識は、混入白血球を同定するための補足的なシグナルとして使用され得る；（ｃ）死んだ７−ＡＡＤ細胞（負の事象）。 (Example 6)
(Calculation of isolated cells by flow cytometry)
Approximately 10-20 mL of blood per patient is collected in a Vacutainer tube (Becton Dickinson, green lid, heparin lithium anticoagulant, 7 mL in each tube). An aliquot of freshly collected blood may be transferred to a CAM blood tube or subjected to density gradient centrifugation to obtain mononuclear cells and subjected to cell enrichment and identification on additional CAMs. Calculation of blood surviving tumor cells by flow cytometry can be accomplished based on the following criteria: (a) tumor cells visualized through ingestion of their FITC-labeled collagen; (b) PE labeling of normal blood cells Can be used as a supplemental signal to identify contaminating leukocytes; (c) dead 7-AAD cells (negative events).

ＦＩＴＣ−コラーゲンタグ化、またはＧＦＰタグ化された腫瘍細胞は、ＣＡＭによって捕獲され得、そして単離された正常血液細胞は、フィコエリトリン（ＰＥ）結合ＣＤ４５抗体によって後で免疫染色され得る。５００μｌ程度の少ないサンプルが吸引され得、そしてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析され得る。データは、核酸染料７−ＡＡＤの蛍光に関する閾値を使用して、リストモードで取得され得る。マルチパラメーターでのデータ分析のための基準としては、以下が挙げられる：（ａ）前方光散乱によって規定されるサイズ、（ｂ）直交光散乱によって規定される粒度、（ｃ）死んだ７−ＡＡＤ細胞（負の事象）、（ｄ）ＦＩＴＣ−コラーゲン−腫瘍細胞もしくはＧＦＰ−腫瘍細胞（正の事象）、そして（ｅ）ＰＥ−標識ＣＤ４５ ｍＡｂ正常細胞（負の事象）。   FITC-collagen tagged or GFP tagged tumor cells can be captured by CAM and isolated normal blood cells can be later immunostained with phycoerythrin (PE) -conjugated CD45 antibody. Samples as little as 500 μl can be aspirated and analyzed on a FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson). Data can be acquired in list mode using a threshold for the fluorescence of the nucleic acid dye 7-AAD. Criteria for multi-parameter data analysis include: (a) size defined by forward light scatter, (b) particle size defined by orthogonal light scatter, (c) dead 7-AAD Cells (negative events), (d) FITC-collagen-tumor cells or GFP-tumor cells (positive events), and (e) PE-labeled CD45 mAb normal cells (negative events).

フローサイトメトリーによって、公開された速度、血液１ｍＬあたり１０，０００，０００，０００個の血液細胞中１００，０００個の腫瘍細胞より短い頻度で血中に存在する腫瘍細胞の算出を可能にするため（Ｇｌａｖｅｓら，１９８８；Ｋａｒｃｚｅｗｓｋｉら，１９９４）、有利なことには、以下が注目され得る：
（ｉ）適切な時間（サンプル流動速度＝６０μｌ／ｍｍ）においてフローサイトメーターを通過する腫瘍細胞が著しく減少することなく、サンプル容量は３〜２０ｍＬから５００μｌまで、そして全細胞数は１５，０００，０００，０００個〜１，０００，０００個まで減少され得る。 To enable calculation of tumor cells present in blood by flow cytometry at a published rate, less than 100,000 tumor cells in 10,000,000,000 blood cells per mL of blood (Glaves et al., 1988; Karczewski et al., 1994), advantageously, the following may be noted:
(I) Sample volume from 3-20 mL to 500 μl and total cell count of 15,000,000 without significant decrease in tumor cells passing through the flow cytometer at the appropriate time (sample flow rate = 60 μl / mm) It can be reduced from 000,000 to 1,000,000.

（ｉｉ）濃縮された腫瘍細胞は、それと同時に単離された正常細胞から区別される必要がある。腫瘍細胞は、ＦＩＴＣ−コラーゲン標識またはＧＦＰ標識され得、一方上記同時単離された細胞の９９％超は、白血球であるはずであり、フィコエリトリン（ＰＥ）結合抗ＣＤ４５抗体で標識され得る。   (Ii) Enriched tumor cells need to be distinguished from normal cells isolated at the same time. Tumor cells can be FITC-collagen labeled or GFP labeled while more than 99% of the co-isolated cells should be leukocytes and labeled with phycoerythrin (PE) -conjugated anti-CD45 antibodies.

（ｉｉｉ）腫瘍細胞は、多くの場合、直径５０μｍ〜５００μｍの凝集体として存在し得る。ＣＡＭ血液濾過および抗体ベースの磁気ビーズ法から得られる細胞サンプルは、５０μｍメッシュを通して濾過されて、フローサイトメーターにロードする前に大きな凝集体が除去され得る。あるいは、凝集体がＣＡＭ上で培養される場合、循環性腫瘍細胞は、１２〜１８時間以内に凝集体から発生し、ＣＡＭフィルムを侵襲し始める。蛍光ＣＡＭフィルムが使用される場合、ＣＡＭ法によって濃縮された腫瘍細胞は蛍光コラーゲンによって標識され得、そしてそれらは、コラゲナーゼによって個々の細胞として懸濁され得る。   (Iii) Tumor cells can often exist as aggregates with a diameter of 50 μm to 500 μm. Cell samples obtained from CAM hemofiltration and antibody-based magnetic bead methods can be filtered through a 50 μm mesh to remove large aggregates before loading into the flow cytometer. Alternatively, when the aggregates are cultured on CAM, circulating tumor cells will develop from the aggregates within 12-18 hours and begin to invade the CAM film. When fluorescent CAM films are used, tumor cells enriched by the CAM method can be labeled with fluorescent collagen and they can be suspended as individual cells by collagenase.

（実施例７）
（フローサイトメーターにおいて使用するための、被験体由来の腫瘍細胞のＣＡＭ濃縮）
（１）．３ｍＬの抗凝固処理された血液（０．３ｍＬのヘパリンリチウム＋抗凝固剤クエン酸デキストロース溶液 ＵＳＰ−ＡＣＤ，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，Ｊｉｂ）を、ＦＩＴＣ標識コラーゲンで被覆されたＣＡＭ血液濾過ユニットの各チューブに添加する。密封したＣＡＭ血液チューブをローラー上に配置し、３７℃で５〜３０サイクル／分で回転させる。１〜３時間インキュベートして腫瘍細胞の接着を起こさせる。 (Example 7)
(CAM enrichment of subject-derived tumor cells for use in a flow cytometer)
(1). 3 mL of anticoagulated blood (0.3 mL lithium heparin + anticoagulant dextrose citrate solution USP-ACD, Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, Jib) was added to each FITC-labeled collagen-coated CAM blood filtration unit. Add to tube. The sealed CAM blood tube is placed on a roller and rotated at 37 ° C. for 5-30 cycles / min. Incubate for 1-3 hours to allow tumor cell adhesion.

（２）．非付着細胞および上清をピペッティングによって慎重に除去する。内壁上のＣＡＭフィルムを害することを避けるように、３ｍＬの溶液で５回、チューブを慎重に洗浄する。洗浄溶液（ＰＢＳ／Ｏ １％ ＢＳＡ １ ％ ＡＣＤおよびヘパリンリチウム）。   (2). Carefully remove non-adherent cells and supernatant by pipetting. Carefully wash the tube 5 times with 3 mL of solution to avoid harming the CAM film on the inner wall. Wash solution (PBS / O 1% BSA 1% ACD and lithium heparin).

（３）．ＨＥＰＥ緩衝液（ｐＨ７．４）中に１５％のヒト血清を含有する、１ｍＬの完全細胞培養培地をＣＡＭ血液濾過ユニットの各チューブに添加する。密封したＣＡＭ血液チューブをローラー上に配置し、３７℃で５サイクル／分で回転させる。９〜１５時間インキュベートして摂取されたＦＩＴＣ−Ｉ型コラーゲンで腫瘍細胞を標識させる。   (3). 1 mL of complete cell culture medium containing 15% human serum in HEPE buffer (pH 7.4) is added to each tube of the CAM hemofiltration unit. The sealed CAM blood tube is placed on a roller and rotated at 37 ° C at 5 cycles / min. Tumor cells are labeled with FITC-I collagen ingested after incubating for 9-15 hours.

（４）．ピペッティングによって培地上清を慎重に除去する。内壁上のＣＡＭフィルムを害することなく、３ｍＬ ＰＢＳで３回、チューブを洗浄する。   (4). Carefully remove media supernatant by pipetting. Wash the tube three times with 3 mL PBS without harming the CAM film on the inner wall.

（５）．１ｍＬのコラゲナーゼ溶液を、徹底的に洗浄されたＣＡＭ血液濾過ユニットの各チューブに添加する。密封したＣＡＭ血液チューブをローラー上に配置し、３７℃で５サイクル／分で回転させる。１０分間インキュベートし、ＣＡＭを溶解して腫瘍細胞を懸濁液中に放出させる。コラゲナーゼ溶液（ＰＢＳ、０．３ｍＭ ＣａＣｌ２、０．２μ／ｍＬ Ｉ型コラゲナーゼ［Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ］、２５μｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ［Ｒｏｃｈｅ］）。 (5). Add 1 mL of collagenase solution to each tube of a thoroughly washed CAM hemofiltration unit. The sealed CAM blood tube is placed on a roller and rotated at 37 ° C at 5 cycles / min. Incubate for 10 minutes to lyse the CAM and release the tumor cells into suspension. Collagenase solution (PBS, 0.3 mM CaCl 2 , 0.2 μ / mL type I collagenase [Worthington Biochemical], 25 μg / mL DNase [Roche]).

（６）．２つのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブのうちの１つに、各５００μｌ、懸濁液を移す。   (6). Transfer 500 μl of each suspension to one of two Eppendorf tubes.

（７）．マルチパラメーターフローサイトメトリーのための染色／調製：１００μｌの固定用溶液（ＰＢＳ、６％パラホルムアルデヒド、ｐＨ７．２）を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中の５００μｌの細胞懸濁液に添加し（最終固定濃度 １％パラホルムアルデヒド）、そして２０〜２５℃で１０分間固定する。   (7). Staining / preparation for multiparameter flow cytometry: 100 μl of fixing solution (PBS, 6% paraformaldehyde, pH 7.2) is added to 500 μl of cell suspension in an Eppendorf tube (final fixed concentration 1% Paraformaldehyde), and fix at 20-25 ° C. for 10 minutes.

（８）．１，０００ｒｐｍで１分間細胞ペレットをスピンダウンする。固定液を除去し、５００μｌのＰＢＳ溶液で３回、チューブを洗浄する。氷上に保持し、１０μｇ／ｍＬのＰＥ−抗ＣＤ４５（白血球を標識するため）および１μｇ／ｍＬの７−ＡＡＤ（死細胞を染色するため）を添加し、続いて暗中、４℃で１０ｍｍインキュベーションする。   (8). Spin down the cell pellet at 1,000 rpm for 1 minute. Remove fixative and wash tube 3 times with 500 μl PBS solution. Keep on ice, add 10 μg / mL PE-anti-CD45 (to label leukocytes) and 1 μg / mL 7-AAD (to stain dead cells), followed by 10 mm incubation at 4 ° C. in the dark .

上記のプロトコールは、ＣＴＣ検出に関して特殊化されている。ＣＥＣおよび腫瘍関連リンパ球の検出に関して、ＰＥ−抗ＣＤ３１およびＰＥ−抗ＣＤ４５は、それぞれ、ＣＥＣおよび腫瘍関連リンパ球を標識するために使用され得る。   The above protocol is specialized for CTC detection. For detection of CEC and tumor-associated lymphocytes, PE-anti-CD31 and PE-anti-CD45 can be used to label CEC and tumor-associated lymphocytes, respectively.

（実施例８）
（フローサイトメトリーにおける使用のための、ＣＡＭ ９６ウェル細胞チャンバー法によって濃縮された腫瘍細胞）
（１）．密度遠心分離によるＭＮＣ分画の調製：Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ採血管（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，緑色の蓋，抗凝固剤としてヘパリンリチウム、各チューブには７ｍＬ入る）中の、残りの３〜１５ｍＬの抗凝固処理された血液を使用する。細胞ペレットは、１，０００ｒｐｍでスピンダウンされ、そして細胞は、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５ｍＬ ＰＢＳ中に再懸濁される。単核細胞（ＭＮＣ）分画は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度遠心分離（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって、製造者の指示に従って得られ、１５％のウシ血清を含有する完全培養培地中で洗浄され、そして３〜１５ｍＬの完全培地に懸濁される。 (Example 8)
(Tumor cells enriched by CAM 96 well cell chamber method for use in flow cytometry)
(1). Preparation of MNC fraction by density centrifugation: remaining 3-15 mL of anticoagulated blood in Vacutainer blood collection tube (Becton Dickinson, green lid, heparin lithium as anticoagulant, 7 mL in each tube) Is used. The cell pellet is spun down at 1,000 rpm and the cells are resuspended in 5 mL PBS containing 0.5 mM EDTA. Mononuclear cell (MNC) fractions were obtained by Ficoll-Paque density centrifugation (Pharmacia) according to manufacturer's instructions, washed in complete culture medium containing 15% bovine serum, and 3-15 mL Suspended in complete medium.

（２）．ＣＡＭ ９６ウェルチャンバースライド上でのＭＮＣ分画の培養：１００μｌ／ウェルの細胞懸濁液（ＣＡＭおよびＤｙｎａｌ ＡＡＭＢのような他の方法によって捕獲される細胞にも適用可能である）は、所望のウェル（例えば、１５％のウシ血清を含有する１００μｌの完全培養培地で満たされた、ＦＩＴＣ−コラーゲンベースのＣＡＭで被覆された９６ウェルマイクロタイタープレートの８ウェル）上に播かれ、そしてＣＯ２インキュベ−ター中で、３７℃で１２〜１８時間培養される。この工程は、腫瘍細胞の蛍光コラーゲンフラグメントを消化して内部に移行する能力をアッセイすることによって、腫瘍細胞を標識する。 (2). Culture of MNC fractions on CAM 96 well chamber slides: 100 μl / well of cell suspension (also applicable to cells captured by other methods such as CAM and Dynal AAMB) in the desired well (e.g., filled with complete culture medium 100μl containing 15% bovine serum, FITC-collagen-based CAM coated with 96-well microtiter plate 8 well) seeded onto, and CO 2 incubation - Incubate at 37 ° C. for 12-18 hours. This step labels the tumor cells by assaying their ability to digest and translocate the fluorescent collagen fragments of the tumor cells.

（３）．非付着細胞および上清をピペッティングによって慎重に除去し、内壁上のＣＡＭフィルムに害がないように、２００μｌのＰＢＳで２回、このウェルを洗浄する。非付着細胞は、ＭＮＣ分画中の死んだ腫瘍細胞および非腫瘍性血液細胞から構成される。浮遊細胞は、集められ得、そしてＣＤ１９白血球もしくは幹細胞に関する細胞単離に供され得る。   (3). Non-adherent cells and supernatant are carefully removed by pipetting and the wells are washed twice with 200 μl PBS so that the CAM film on the inner wall is not harmed. Non-adherent cells are composed of dead tumor cells and non-neoplastic blood cells in the MNC fraction. Suspension cells can be collected and subjected to cell isolation for CD19 leukocytes or stem cells.

（４）．１００μｌのコラゲナーゼ溶液（ＰＢＳ、０．３ｍＭ ＣａＣｌ２、０．２μｇ／ｍＬ Ｉ型コラゲナーゼ［Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ］、２５μｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ［Ｒｏｃｈｅ］）を、徹底的に洗浄された８ウェル行の９６ウェルＣＡＭ血液ユニットの各ウェルに添加する。付着細胞を１０分間インキュベートし、ＣＡＭを溶解させて、結合した腫瘍細胞を懸濁液中に放出させた。 (4). 100 μl of collagenase solution (PBS, 0.3 mM CaCl 2 , 0.2 μg / mL type I collagenase [Worthington Biochemical], 25 μg / mL DNase [Roche]) was washed in 96 well CAM blood in an 8 well row. Add to each well of the unit. Adherent cells were incubated for 10 minutes to lyse the CAM and release the bound tumor cells into suspension.

（５）．８ウェルから８００μｌ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに懸濁液を移す。   (5). Transfer the suspension from 8 wells to 800 μl to an Eppendorf tube.

（６）．２００μｌの固定用溶液（ＰＢＳ、１０％パラホルムアルデヒド、ｐＨ７．２）を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中の８００μｌの細胞懸濁液に添加し（最終固定濃度 ２％パラホルムアルデヒド）、そして２０〜２５℃で１０分間固定する。   (6). 200 μl of fixative solution (PBS, 10% paraformaldehyde, pH 7.2) is added to 800 μl of cell suspension in an Eppendorf tube (final fix concentration 2% paraformaldehyde) and at 20-25 ° C. for 10 minutes Fix it.

（７）．細胞ペレットを１０００ｒｐｍで１分間スピンダウンし、固定液を除去し、そしてチューブを５００μｌのＰＢＳ溶液で３回洗浄する。細胞ペレットを氷上に保持し、そして１０μｇ／ｍＬのＰＥ−抗ＣＤ４５、ＰＥ−抗ＣＤ１４およびＰＥ−抗ＣＤ６８（白血球、単球、マクロファージを標識するため）、ならびに１μｇ／ｍＬの７−ＡＡＤ（死細胞を染色するため）を添加し、続いて、暗中、４℃で１０分間インキュベートする。   (7). The cell pellet is spun down at 1000 rpm for 1 minute, the fixative is removed, and the tube is washed 3 times with 500 μl of PBS solution. Cell pellets are kept on ice and 10 μg / mL PE-anti-CD45, PE-anti-CD14 and PE-anti-CD68 (to label leukocytes, monocytes, macrophages), and 1 μg / mL 7-AAD (death) To stain cells), followed by incubation at 4 ° C. for 10 minutes in the dark.

上記のプロトコールは、ＣＴＣ検出のために特殊化されている。ＣＥＣおよび腫瘍関連リンパ球の検出のためには、ＰＥ−抗ＣＤ３１およびＰＥ−抗ＣＤ４５が、それぞれＣＥＣおよび腫瘍関連リンパ球を標識するために使用され得る。   The above protocol is specialized for CTC detection. For detection of CEC and tumor associated lymphocytes, PE-anti-CD31 and PE-anti-CD45 can be used to label CEC and tumor-associated lymphocytes, respectively.

（実施例９）
（ＣＡＭ １６ウェル細胞チャンバー法によって濃縮された腫瘍細胞の顕微鏡的特徴付け）
（１）低速による細胞分画および血漿分画の調製。７５０ｒｐｍで５分間の遠心分離：Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ採血管（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、緑色の蓋、抗凝固剤としてヘパリンリチウム、各管には７ｍｌ入る）中の３〜７ｍＬの抗凝固処理された血液中の細胞ペレットを、７５０ｒｐｍで５分間、または１，０００ｒｐｍで３分間スピンダウンする。遠心された血液の上清から全部で１２０μｌを、１５％のウシ血清を含有する６８０μｌの抗凝固処理された完全培養培地で満たされたＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに、血漿を移す。［血漿培地と称される：１０％の抗凝固剤（ＡＣＤおよびヘパリンリチウム）ならびに７５％の完全培養培地中の、特定のドナー由来の１５％血漿］。血漿の残りは、０．５μＬアリコートに保存される。 Example 9
(Microscopic characterization of tumor cells enriched by CAM 16 well cell chamber method)
(1) Preparation of cell fraction and plasma fraction at low speed. Centrifugation at 750 rpm for 5 minutes: 3-7 mL of cell pellet in anticoagulated blood in a Vacutainer blood collection tube (Becton Dickinson, green lid, lithium heparin as anticoagulant, 7 ml in each tube) Spin down for 5 minutes at 750 rpm or 3 minutes at 1,000 rpm. Transfer a total of 120 μl from the centrifuged blood supernatant to an Eppendorf tube filled with 680 μl of anticoagulated complete culture medium containing 15% bovine serum. [Referred to as plasma medium: 15% plasma from a particular donor in 10% anticoagulant (ACD and lithium heparin) and 75% complete culture medium]. The rest of the plasma is stored in 0.5 μL aliquots.

（２）密度遠心分離によるＭ７ＮＣ分画の調製：細胞は、５ｍＬ ＥＤＴＡを含有する５ｍＬ ＰＢＳ中に再懸濁される。単核細胞（ＭＩＮＣ）分画は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度遠心分離（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって、製造者の指示に従って得られ、１５％ウシ血清を含有する完全培養培地中で洗浄され、そして分画前の血液と同体積の完全培地中に懸濁される。   (2) Preparation of M7NC fraction by density centrifugation: Cells are resuspended in 5 mL PBS containing 5 mL EDTA. Mononuclear cell (MINC) fractions were obtained by Ficoll-Paque density centrifugation (Pharmacia) according to the manufacturer's instructions, washed in complete culture medium containing 15% bovine serum, and pre-fractionated blood And suspended in the same volume of complete medium.

（３）各特定のドナー由来の１５％血漿を含むかもしくは含まない完全培養培地とともに予めインキュベートされた、ＣＡＭ １６ウェルチャンバースライドの調製：ＴＲＩＴＣコラーゲンベースのＣＡＭで被覆された１６ウェルチャンバースライド（９６ウェルマイクロタイタープレート形式（Ｌａｂ−Ｔｅｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）中）の上部８ウェルの各ウェルに、１００μｌの完全培養培地および１０％抗凝固剤を播く。ＴＲＩＴＣコラーゲンベースのＣＡＭで被覆された１６ウェルチャンバースライド（９６ウェルマイクロタイタープレート形式（Ｌａｂ−Ｔｅｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）中）の下部８ウェルの各ウェルに、１００μｌの完全培養培地および１０％抗凝固剤、ならびに１５％の個体の血漿を播く［手順１において調製された血漿培地 １０％抗凝固剤（ＣＤＡ＋ヘパリン）中の特定のドナー由来の１５％血漿］。   (3) Preparation of CAM 16 well chamber slide pre-incubated with complete culture medium with or without 15% plasma from each specific donor: TRITC collagen based CAM coated 16 well chamber slide (96 Each well of the top 8 wells in a well microtiter plate format (Lab-Tek, Rochester, NY) is seeded with 100 μl complete culture medium and 10% anticoagulant. 100 μl of complete culture medium and 10% anticoagulation in each well of the bottom 8 wells of a 16 well chamber slide (in 96 well microtiter plate format (Lab-Tek, Rochester, NY)) coated with TRITC collagen based CAM Agents, as well as 15% of individual plasma are seeded [plasma medium prepared in Procedure 1 15% plasma from a specific donor in 10% anticoagulant (CDA + heparin)].

（４）ＣＡＭ １６ウェルチャンバースライド上でのＭＮＣ分画の培養：１００μｌ／ウェルの細胞懸濁液（ＣＡＭおよびＤｙｎａｌ ＡＡＭＢのような他の方法によって捕獲される細胞にも適用可能である）は、１５％のウシ血清を含有する１００μｌの完全培養培地で満たされた、ＴＲＩＴＣコラーゲンベースのＣＡＭで被覆された１６ウェルチャンバースライド（９６ウェルマイクロタイタープレート形式（Ｌａｂ−Ｔｅｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）中）の各ウェル（例えば、、ＦＩＴＣ−コラーゲンベースのＣＡＭで被覆された９６ウェルマイクロタイタープレートの８ウェル）上に播かれ、そしてＣＯ２インキュベ−ター中で、３７℃で１２〜１８時間培養される。この工程は、蛍光コラーゲンフラグメントを消化して内部に移行する能力をアッセイすることによって、腫瘍細胞を標識する。 (4) Cultivation of MNC fraction on CAM 16 well chamber slides: 100 μl / well cell suspension (also applicable to cells captured by other methods such as CAM and Dynal AAMB) Of a TRITC collagen-based CAM-coated 16-well chamber slide (in 96-well microtiter plate format (Lab-Tek, Rochester, NY)) filled with 100 μl complete culture medium containing 15% bovine serum Each well (eg, 8 wells of a 96 well microtiter plate coated with FITC-collagen-based CAM) is plated and incubated at 37 ° C. for 12-18 hours in a CO 2 incubator. This step labels tumor cells by assaying their ability to digest and translocate fluorescent collagen fragments.

（５）非付着細胞および上清をピペッティングによって慎重に除去する。非付着細胞は、ＭＮＣ分画中の死んだ腫瘍細胞および非腫瘍性血液細胞から構成される。   (5) Carefully remove non-adherent cells and supernatant by pipetting. Non-adherent cells are composed of dead tumor cells and non-neoplastic blood cells in the MNC fraction.

（６）抗体および核酸染色：２００μｌの固定用溶液（ＰＢＳ、３．７％パラホルムアルデヒド、ｐＨ７．２）をＣＡＭ標識チャンバーユニットの各ウェルに添加し、そして２０〜２５℃で１０分間固定する。固定液を除去し、ウェルを２００μｌのＰＢＳ溶液で３回洗浄し、そして、蛍光顕微鏡観察のために青色蛍光Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２核染料および緑色蛍光ＦＩＴＣ−抗フォン・ヴィレブランド因子（内皮表現型を標識する）を用いて、ならびにＤＩＣ明視野顕微鏡のために赤色ＡＰＡＡＰ−抗ＥＳＡ（サイトケラチン、ＥＭＡなど上皮マーカー、造血細胞マーカーＣＤ４５／ＣＤ１４／ＣＤ６８／ＣＤ１９／ＣＤ８、もしくは他の内皮細胞マーカーＣＤ３１、ｆｉｔ−１など）を用いて、直ちに免疫標識するために、細胞ペレットを氷上に保持する。   (6) Antibody and nucleic acid staining: 200 μl of fixing solution (PBS, 3.7% paraformaldehyde, pH 7.2) is added to each well of the CAM labeling chamber unit and fixed at 20-25 ° C. for 10 minutes. The fixative is removed, the wells are washed 3 times with 200 μl of PBS solution, and blue fluorescent Hoechst 33342 nuclear dye and green fluorescent FITC-anti-von Willebrand factor (labeling the endothelial phenotype) for fluorescence microscopy Red APAAP-anti-ESA (cytokeratin, EMA and other epithelial markers, hematopoietic cell markers CD45 / CD14 / CD68 / CD19 / CD8, or other endothelial cell markers CD31, fit-1 Etc.), keep the cell pellet on ice for immediate immunolabeling.

上記のプロトコールはＣＴＣ検出のために特殊化されている。ＣＥＣおよび腫瘍関連リンパ球の検出のため、抗ＣＤ３１および抗ＣＤ４５が、それぞれＣＥＣおよび腫瘍関連リンパ球の標識のために使用され得、次いでｃＲＮＡプローブを生成するために使用され得る。   The above protocol is specialized for CTC detection. For detection of CEC and tumor associated lymphocytes, anti-CD31 and anti-CD45 can be used for labeling CEC and tumor associated lymphocytes, respectively, and then used to generate cRNA probes.

（実施例１０）
（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびＤＮＡマイクロアレイ分析において使用するための、ＣＡＭ９６ウェル細胞チャンバー法によって濃縮された腫瘍細胞）
（１）密度遠心分離によるＭＮＣ分画の調製［上記実施例７のプロトコールに類似する］：Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ 採血管（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，緑色の蓋，抗凝固剤としてヘパリンリチウム、各チューブには７ｍＬ入る）中の残りの３〜１５ｍＬの抗凝固処理された血液を使用する。細胞ペレットは、１，０００ｒｐｍでスピンダウンされる。細胞は、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５ｍＬ ＰＢＳ中に再懸濁され、そして単核細胞（ＭＮＣ）分画は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度遠心分離（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって、製造者の指示に従って得られ、１５％のウシ血清を含有する完全培養培地中で洗浄され、そして３〜１５ｍＬの完全培地に懸濁される。 (Example 10)
(Tumor cells enriched by the CAM 96-well cell chamber method for use in real-time RT-PCR and DNA microarray analysis)
(1) Preparation of MNC fraction by density centrifugation [similar to the protocol of Example 7 above]: During Vacutainer blood collection tube (Becton Dickinson, green lid, heparin lithium as anticoagulant, 7 mL in each tube) Use the remaining 3-15 mL of anticoagulated blood. The cell pellet is spun down at 1,000 rpm. Cells are resuspended in 5 mL PBS containing 0.5 mM EDTA and mononuclear cell (MNC) fractions are obtained by Ficoll-Paque density centrifugation (Pharmacia) according to the manufacturer's instructions, 15 Washed in complete culture medium containing 1% bovine serum and suspended in 3-15 mL complete medium.

（２）ＣＡＭ ９６ウェルチャンバースライド上でのＭＮＣ分画の培養：１００μｌ／ウェルの細胞懸濁液（ＣＡＭおよびＤｙｎａｌ ＡＡＭＢのような他の方法によって捕獲される細胞にも適用可能である）は、１５％のウシ血清を含有する１００μｌの完全培養培地で満たされた、Ｉ型コラーゲンベースのＣＡＭで被覆された９６ウェルマイクロタイタープレートの残りの８８ウェル）上に播かれ、そしてＣＯ２インキュベ−ター中で、３７℃で１２〜１８時間培養される。 (2) Incubation of MNC fraction on CAM 96 well chamber slide: 100 μl / well cell suspension (also applicable to cells captured by other methods such as CAM and Dynal AAMB) The remaining 88 wells of a 96-well microtiter plate coated with type I collagen-based CAM, filled with 100 μl complete culture medium containing 15% bovine serum, and a CO 2 incubator Incubate at 37 ° C. for 12-18 hours.

（３）非付着細胞および上清をピペッティングによって慎重に除去する。内壁上のＣＡＭフィルムに害がないように、２００μｌのＰＢＳで３回、このウェルを洗浄する。非付着細胞は、ＭＮＣ分画中の死んだ腫瘍細胞および非腫瘍性血液細胞から構成される。浮遊細胞は、集められ得、そしてＣＤ１９白血球もしくは幹細胞に関する細胞単離に供され得る。   (3) Carefully remove non-adherent cells and supernatant by pipetting. The wells are washed 3 times with 200 μl PBS so that the CAM film on the inner wall is not harmed. Non-adherent cells are composed of dead tumor cells and non-neoplastic blood cells in the MNC fraction. Suspension cells can be collected and subjected to cell isolation for CD19 leukocytes or stem cells.

（４）ＣＡＭで捕獲された細胞についてのＲＮＡの単離：１０μＬ／ウェルのＴｒｉｚｏｌ試薬を、徹底的に洗浄された９６ウェルＣＡＭ血液ユニットの８８ウェルの列の各ウェルに各ウェルに添加する。Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて全ＲＮＡが抽出され、続いてＲＮｅａｓｙスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で洗浄される。   (4) Isolation of RNA for CAM-captured cells: 10 μL / well of Trizol reagent is added to each well in each well of an 88 well row of 96 well CAM blood units that have been thoroughly washed. Total RNA is extracted using Trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA), followed by washing with an RNeasy spin column (Qiagen, Inc., Valencia, CA).

（実施例１１）
（細胞分画の純度を検証するための細胞型抗体マーカーを用いた免疫細胞化学）
細胞型抗体マーカーを用いた免疫細胞化学を使用して細胞分画の純度を検証した。図５の上２つのパネルは、卵巣の漿液腺癌の腹水由来のＣＡＭによって濃縮された白血球（Ｌｅｕ）および腫瘍細胞（Ｅｐｉ）の、ＣＤ４５汎白血球抗原（左パネル、Ｌｅｕ、赤）に対して指向する抗体、および汎サイトケラチン、上皮抗原（右パネル、Ｅｐｉ、赤）に対して指向する抗体を用いた、免疫組織化学的同定を示す。下の２つのパネルは、ＣＡＭによって濃縮された純粋な腫瘍細胞の免疫組織化学的同定、およびそれに続く抗体ＥｐＣＡＭでの正の選択を示す。汎サイトケラチンに対する抗体で標識される腫瘍細胞が、ここでは優性である（左パネル、Ｅｐｉ、赤）。腫瘍細胞上にいくつかのＥｐＣＡＭ抗体−Ｄｙｎａｌビーズが見えることに注意。純粋な腫瘍細胞の一部（２％）が、ＣＤ３１（右パネル、Ｅｎｄｏ、赤）、内皮表面抗原に対して指向する抗体で標識された。核は、非イオン性界面活性剤で細胞質幕を透過性にした後、ユニバーサルな細胞マーカーとしてＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２核染色を用いて青く染色された（写真サイズ３３１μｍ×２３９μｍ）。 (Example 11)
(Immunocytochemistry using cell-type antibody markers to verify the purity of cell fractions)
The purity of the cell fraction was verified using immunocytochemistry using cell type antibody markers. The top two panels in FIG. 5 show leukocytes (Leu) and tumor cells (Epi) enriched by CAM from ascites of ovarian serous adenocarcinoma against CD45 panleukocyte antigen (left panel, Leu, red). Immunohistochemical identification is shown using antibodies directed against, and antibodies directed against pancytokeratin, epithelial antigen (right panel, Epi, red). The bottom two panels show the immunohistochemical identification of pure tumor cells enriched by CAM and subsequent positive selection with the antibody EpCAM. Tumor cells labeled with antibodies against pancytokeratin are dominant here (left panel, Epi, red). Note that several EpCAM antibody-Dynal beads are visible on the tumor cells. A portion (2%) of pure tumor cells were labeled with CD31 (right panel, Endo, red), an antibody directed against endothelial surface antigen. The nuclei were stained blue using Hoechst 33342 nuclear stain as a universal cell marker (photo size 331 μm × 239 μm) after permeabilizing the cytoplasmic curtain with a nonionic surfactant.

（実施例１２）
（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析）
１種以上の癌の遺伝的基盤をさらに解明するために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析が使用され得る。ＲＴ−ＰＣＲ分析はまた、マイクロアレイデータを検証するために使用され得る。 (Example 12)
(Real-time RT-PCR analysis)
Real-time RT-PCR analysis can be used to further elucidate the genetic basis of one or more cancers. RT-PCR analysis can also be used to validate microarray data.

定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して、精製された６３個の細胞サンプルの代表的な７つの細胞集団について特異的なＤＮＡマイクロアレイクラスターから選択された、１０個の遺伝子の発現を測定した（図５Ａ）。（Ａ）６３個の細胞サンプルにおける、異なる腫瘍細胞型（ＭＭＰ７，ムチン１，ＧＡ７３３−１、リポカリン２およびサイトケラチン１８）間でアップレギュレートされた５つの遺伝子；白血球（ＣＤ４５、オートタキシン、ＣＸＣＲ４およびＳＤＦ−１）間でアップレギュレートされた４つの遺伝子；線維芽細胞でアップレギュレートされた１つの遺伝子（Ｉ型コラーゲン）、の定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。（Ｂ）７つの細胞群の間で示差的に調節された１０個の遺伝子の定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。棒グラフのプロットは、異なる細胞群の代表的な遺伝子発現パターン、ならびに細胞群内および細胞群間の発現レベルの変動を示すために使用される。各遺伝子について、相対的発現は、各群の細胞サンプルの数の平均倍数発現（ｍｅａｎ ｆｏｌｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（β−アクチンに対して正規化されたもの）と比較される。エラーバー、平均値のＳＥ。   Quantitative real-time RT-PCR was used to measure the expression of 10 genes selected from specific DNA microarray clusters for 7 representative cell populations of 63 purified cell samples (FIG. 5A). ). (A) Five genes up-regulated among different tumor cell types (MMP7, mucin 1, GA733-1, lipocalin 2 and cytokeratin 18) in 63 cell samples; leukocytes (CD45, autotaxin, CXCR4) Quantitative real-time RT-PCR analysis of 4 genes up-regulated between SDF-1) and 1 gene up-regulated in fibroblasts (type I collagen). (B) Quantitative real-time RT-PCR analysis of 10 genes differentially regulated among 7 cell groups. Bar graph plots are used to show representative gene expression patterns of different cell groups, as well as variations in expression levels within and between cell groups. For each gene, relative expression is compared to the mean fold expression (normalized to β-actin) of the number of cell samples in each group. Error bar, mean SE.

ＣＡＭ開始細胞分離デバイスによって単離される腫瘍細胞の４つの異なる型のうち、５つのアップレギュレートされた遺伝子が、ほとんどの卵巣腫瘍標本および子宮腫瘍標本から濃縮された腺癌細胞サンプルにおいて高発現されていることが見出された（図６Ａ〜６Ｃ）。腫瘍細胞関連遺伝子、白血球関連遺伝子、および線維芽細胞関連遺伝子についての異なる細胞群型間での発現の違いはまた、ＤＮＡマイクロアレイデータとリアルタイムＲＴ−ＰＣＲデータとの間で類似することが見られた。これらの結果は、ほとんどのアレイプローブセットは、転写物の複雑な混合物内の意図された転写物のレベルを正確に測定する可能性が高いことを示唆する。   Of the four different types of tumor cells isolated by the CAM-initiating cell separation device, five up-regulated genes are highly expressed in adenocarcinoma cell samples enriched from most ovarian and uterine tumor specimens (FIGS. 6A-6C). Differences in expression among different cell population types for tumor cell-related genes, leukocyte-related genes, and fibroblast-related genes were also seen to be similar between DNA microarray data and real-time RT-PCR data . These results suggest that most array probe sets are likely to accurately measure the level of the intended transcript within a complex mixture of transcripts.

種々の上記に開示された特徴および他の特徴、またはそれらの代替物は、望ましくは、多くの異なる系および適用と組み合わせられ得ることが理解される。また、その種々の現在予見できないまたは予測できない変更、改変、変化、または改善が、当業者によって実質的になされ得、また以下の特許請求の範囲によって包含されるべきであることが意図されることが理解される。   It is understood that the various above-disclosed features and other features, or alternatives thereof, can desirably be combined with many different systems and applications. Also, it is intended that various presently unforeseeable or unforeseeable changes, modifications, changes or improvements can be made substantially by those skilled in the art and are to be encompassed by the following claims. Is understood.

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Ｆｅｈｍ，Ｔ．，Ｓａｇａｌｏｗｓｋｙ，Ａ．，Ｃｌｉｆｆｏｒｄ，Ｅ．，Ｂｅｉｔｓｃｈ，Ｐ．，Ｓａｂｏｏｒｉａｎ，Ｈ．，Ｅｕｈｕｓ，Ｄ．，Ｍｅｎｇ，Ｓ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｌ．，Ｔｕｃｋｅｒ，Ｔ．，Ｌａｎｅ，Ｎ．，Ｇｈａｄｉｍｉ，Ｂ．Ｍ．，Ｈｅｓｅｈｎｅｙｅｒ−Ｈａｄｄａｄ，Ｋ．，Ｒｉｅｄ，Ｔ．，Ｒａｏ，Ｃ．，およびＵｂｒ，Ｊ．（２００２）．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ Ｔｈａｔ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ａｒｅ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８，２０７３．

Ｆｌａｔｍｎａｒｋ，Ｋ．，Ｂｊｏｒｎｌａｎｄ，Ｋ．，Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ，Ｈ．Ｏ．，Ｈｅｇｓｔａｄ，Ｅ．，Ｒｏｓａｌｅｓ，Ｒ，Ｈａｒｋｌａｕ，Ｌ．，Ｓｏｌｈａｕｇ，Ｊ．Ｈ．，Ｆａｙｅ，Ｒ Ｓ．，Ｓｏｒｅｉｄｅ，Ｏ．，およびＦｏｄｓｔａｄ，Ｏ．（２００２）．Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８，４４４−４４９．

Ｇｈｅｒｓｉ，Ｇ．，Ｄｏｎｇ，Ｈ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｙｅｈ，Ｙ．，Ｈａｋｋｉｎｅｎ，Ｌ．，Ｌａｒｊａｖａ，Ｈ．Ｓ．，およびＣｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．（２００２）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ ｍａｔｒｉｘ ｂｙ ａ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，２９２３１−２９２４１．

Ｇｈｏｓｓｅｉｎ，ＲＡ．，Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Ｓ．，およびＲｏｓａｉ，Ｊ．（１９９９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ａｎｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｃｈｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５，１９５０−１９６０．

Ｇｌａｖｅｓ，Ｄ．（１９８３）．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ４８，６６５−６７３．

Ｇｌａｖｅｓ，Ｄ．，Ｈｕｂｅｎ，ＲＰ．，およびＷｅｉｓｓ，Ｌ．（１９８８）．Ｈａｅｍａｔｏｇｅｎｏｕｓ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ５７，３２−３５．

Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｌ．Ａ．およびＣｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．（２０００）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ ｓｐｌｉｃｅｄ ｓｅｐｒａｓｅ ｍＲＮＡ ｔｈａｔ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｓｏｆｏｒｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，２５５４−２５５９．

Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｌ．Ａ．．．およびＣｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．（１９９７）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｓｅｐｒａｓｅ：Ａ ｓｅｉｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １３６１，１１−１９．

Ｇｒｏｓｓ，Ｈ．，Ｖｅｒｗｅｒ，Ｂ．，Ｈｏｕｃｋ，Ｄ．，Ｈｏｆｆｉｎａｎ，ＲＡ．，およびＲｅｃｋｔｅｎｗａｌｄ，Ｄ．（１９９５）．Ｍｏｄｅｌ Ｓｔｕｄｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌｓ ａｔ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ａｓ Ｌｏｗ ａｓ １０−７．ＰＮＡＳ ９２，５３７−５４１．

Ｇｕｌａｔｉ，Ｓ．Ｃ．（１９９３）．Ｑｕｅｓｔｉｏｎｉｎｇ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｕｒｇｉｎｇ ｉｎ ＢＭＴ．［概説］［参考１１］．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １１，２４９−２５１．

Ｇｕｌａｔｉ，Ｓ．Ｃ．およびＡｃａｂａ，Ｌ．（１９９３）．Ｒａｔｉｏｎａｌｅ ｆｏｒ ｐｕｒｇｉｎｇ ｉｎａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．［概説］［参考１７］．Ｊｏｕｍａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ ２，４６７−４７１．

Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ｍ．，Ｚａｌｏｓ，Ｇ．，Ｈａｌｃｏｘ，Ｊ．Ｐ．Ｊ．，Ｓｃｈｅｎｋｅ，Ｗ．Ｈ．，Ｗａｃｌａｗｉｗ，Ｍ．Ａ．，Ｑｕｙｙｕｍｉ，Ａ．Ａ．，およびＦｉｎｋｅｌ，Ｔ．（２００３）．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｎｄｏｔｈｅｈｉａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ，Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｉｓｋ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８，５９３−６００．

Ｋａｒｃｚｅｗｓｋｉ，Ｄ．Ｍ．，Ｌｅｍａ，Ｍ．Ｊ．，およびＧｉａｖｅｓ，Ｄ．（１９９４）．Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ａｎ ａｕｔｏｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｒｅｍｏｖａｌ ｆｒｏｍ ｂｌｏｏｄ ｓａｌｖａｇｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｓｕｒｇｅｒｙ．Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ ＆ Ａｎａｌｇｅｓｉａ ７８，１１３１−１１３５．

Ｋｅｌｌｙ，Ｔ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｃ．，Ｙｅｈ，Ｙ．，および Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．（１９９４）．Ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ ｐｒｏｍｏｔｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｗｉｄｅ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５８，２９９−３０８．

Ｋｏｃｈ，Ｍ．，Ｗｅｉｔｚ，Ｊ．，Ｋｉｅｎｌｅ，Ｐ．，Ｂｅｎｎｅｒ，Ｘ，Ｗｉｌｌｅｋｅ，Ｆ．，Ｌｅｂｎｅｒｔ，Ｔ．，Ｈｅｒｆａｒｔｈ，Ｃ．，およびＫｎｅｂｅｌ Ｄｏｅｂｅｒｉｔｚ，Ｍ．（２００１）．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ，Ｃｅｎｔｒａｌ，ａｎｄ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｖｅｎｏｕｓ Ｂｌｏｏｄ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ．Ａｒｃｈ Ｓｕｉｎｇ １３６，８５．

Ｌｉｅｆｅｒｓ，Ｇ．Ｊ．，Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎ，Ａ．Ｍ．，ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｌｄｅ，Ｃ．Ｊ．，Ｈｅｒｍａｎｓ，Ｊ．，ｖａｎ Ｋｒｉｅｋｅｎ，Ｊ．Ｈ．，Ｃｏｍｅｉｓｓｅ，Ｃ．Ｊ．，およびＴｏｌｌｅｎａａｒ，ＲＡ．（１９９８）．Ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｓｔａｇｅ ＩＩ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ．３３９，２２３−２２８．

Ｌｕｚｚｉ，Ｋ．Ｊ．，ＭａｃＤｏｎａｉｄ，Ｉ．Ｃ．，Ｓｃｈｉｎｉｄｔ，Ｅ．Ｅ．，Ｋｅｒｋｖｌｉｅｔ，Ｎ．，Ｍｏｒｒｉｓ，ＶＬ，Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ａ．Ｆ．，およびＧｒｏｏｍ，Ａ．Ｃ．（１９９８）．Ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｉｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ：ｄｏｒｍａｎｃｙ ｏｆ ｓｏｌｉｔａｒｙ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５３，８６５−８７３．

Ｍａｔｓｕｎａｍｉ，Ｋ，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｏｇｕｍａ，Ｈ．，Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｙ．，およびＴａｋａｓａｋｉ，Ｋ．（２００３）．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｎ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙＩｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ａｎｎ Ｓｕｉｎｇ Ｏｎｃｏｌ １０，１７１．

Ｍｏｌｎａｒ，Ｂ．，Ｌａｄａｎｙｉ，Ａ．，Ｔａｎｋｏ，Ｌ．，Ｓｒｅｔｅｒ，Ｌ．，およびＴｕｌａｓｓａｙ，Ｚ．（２００１）．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７，４０８０．

Ｍｏｎｓｋｙ，Ｗ．Ｌ．，Ｋｅｌｌｙ，Ｔ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｙ．，Ｙｅｈ，Ｙ．，Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｗ．Ｇ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｃ．，およびＣｈｅｎ，Ｗ．−Ｔ．（１９９３）．Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍ（ｒ）７２，０００ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ａｔ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３，３ １５９−３１６４．

Ｍｏｎｓｋｙ，Ｗ．Ｌ．，Ｌｉｎ，Ｃ．−Ｙ．，Ａｏｙａｍａ，Ｎ，Ｋｅｌｌｙ，Ｔ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｃ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｓ．Ｋ，およびＣｈｅｎ，Ｗ．−Ｔ．（１９９４）．Ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍａｒｋｅｒ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ，ｓｅｐｒａｓｅ，ｉｓ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｏｎ ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４，５７０２−５７１０．

Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｃ．およびＣｈｅｎ，Ｗ．−Ｔ．（１９９１）．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｉｎｔｏ ｍａｔｒｉｘ ｂｅａｄｓ：ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ １ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ ９９，２１３−２２５．

Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｃ，Ｇｈｅｒｓｉ，Ｇ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｓ．Ｋ．，Ｓａｎｇ，Ｑ．Ｘ．，Ｈｏｗａｒｄ，Ｌ．，Ｐｉｎｅｉｒｏ−Ｓａｎｃｈｅｚ．Ｍ．，Ｎａｌｃａｈａｒａ，Ｈ．，およびＣｈｅｎ，Ｗ．−Ｔ．（１９９９）．Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｄｏｃｋｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｔ ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２４９４７−２４９５２．

Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｃ．，Ｙｅｈ，Ｙ．，およびＣｈｅｎ，Ｗ．−Ｔ．（１９９２）．Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ１１９，１３０９−１３２５．

Ｎａｋａｈａｒａ，Ｈ．，Ｈｏｗａｒｄ，Ｌ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｅ．Ｗ．，Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．，Ｙｅｈ，Ｙ．，およびＣｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．（１９９７）．Ｔｒａｎｓｎｉｅｍｂｒａｎｅ／ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｏｍａｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｙｐｅ １−ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｃｋｉｎｇ ｔｏ ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４，７９５９−７９６４．

Ｎａｋａｈａｒａ，Ｈ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｃ．，Ｎｏｍｉｚｕ，Ｍ．，Ｙａｍａｄａ，Ｙ．，Ｙｅｈ，Ｙ．，およびＣｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．（１９９８）．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆｂｅｔａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆｐｌ９０ＲｈｏＧＡＰ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｐｒｏｔｒｕｓｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｔ ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ．Ｊｏｕｍａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７３，９−１２．

Ｎａｋａｈａｒａ，Ｈ．，Ｎｏｍｉｚｕ，Ｍ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｓ．Ｋ，Ｙａｍａｄａ，Ｙ．，Ｙｅｈ，Ｙ．，およびＣｈｅｎ，Ｗ．−Ｔ．（１９９６）．Ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ６ｂｅｔａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｙ ｌａｍｉｎｉｎ Ｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２７２２１−２７２２４．

Ｎｏｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｎａｋａｏ，Ａ．，Ａｎｄｏ，Ｎ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．，Ｋａｓａｉ，Ｙ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｓ．，Ｋａｎｅｋｏ，Ｔ．，およびＴａｋａｇｉ，Ｈ．（１９９８）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋ−ｒａｓ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓａｓｅｓ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １５，４０−４６．

Ｏｌｉｖｉｅｒら（１９９９）．Ａ ｒａｐｉｄ ｓｉｎｇｌｅ−ｌａｓｅｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｌｙ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １０４，５３０− ５３７．

Ｐａｎｔｅｌ，Ｋ．，Ｃｏｔｅ，ＲＪ．，およびＦｏｄｓｔａｄ，Ｏ．（１９９９）．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９１，１１１３−１１２４．

Ｐａｖｌａｋｉ，Ｍ．，Ｃａｏ，Ｊ．，Ｈｙｍｏｗｉｔｚ，Ｍ．，Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．，Ｂａｈｏｕ，Ｗ．，およびＺｕｃｋｅｒ，Ｓ．（２００２）．Ａ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｙｐｅ １ Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｓ Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｓ ａｎ Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７７，２７４０−２７４９．

Ｐｅｃｋ，Ｋ．，Ｓｈｅｒ，Ｙ．Ｐ．，Ｓｈｉｈ，Ｊ．Ｙ．，Ｒｏｆｆｉｅｒ，Ｓ．Ｒ，Ｗｕ，Ｃ．Ｗ．，およびＹａｎｇ，Ｐ．Ｃ．（１９９８）．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８，２７６１−２７６５．

Ｐｉｎｅｉｒｏ−Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｍ．Ｌ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｄｏｄｔ，Ｊ．，Ｈｏｗａｒｄ，Ｌ．，Ｙｅｈ，Ｙ．，Ｔｒａｎ，Ｈ．，Ａｒｇｒａｖｅｓ，Ｗ．Ｓ．，およびＣｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．（１９９７）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ １７０−ｋＤａ ｍｅｌａｎｏｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ（ｓｅｐｒａｓｅ）ａｓ ａ ｓｅｉｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，７５９５−７６０１；Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１３３６６．

Ｒａｃｉｌａ，Ｅ．，Ｅｕｈｕｓ，Ｄ．，Ｗｅｉｓｓ，Ａ．Ｊ．，Ｒａｏ，Ｃ．，ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｊ．，Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ，Ｌ．Ｗ．，およびＵｈｒ，Ｊ．Ｗ．（１９９８）．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
９５，４５８９４５９４．

Ｒｉｌｌ，Ｄ．Ｒ．，Ｓａｎｔａｎａ，Ｖ．Ｍ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｗ．Ｍ．，Ｎｉｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｂｏｗｍａｎ，Ｌ．Ｃ．，Ｋｒａｎｃｅ，Ｒ．Ａ．，
Ｈｅｓｌｏｐ，Ｈ．Ｅ．，Ｍｏｅｎ，ＲＣ．，Ｊｉｈｌｅ，Ｊ．Ｎ．，およびＢｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｋ．（１９９４）．Ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ
ｔｈａｔ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ ｃａｎ ｒｅｔｕｒｎ ａ
ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ ８４，３８０−３８３．

Ｒｏｓｓ，Ｒ．（１９９３）．Ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ａ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ ｔｈｅ １９９０ｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３６２，８０ １−８０９．

Ｓａｂｉｌｅ，Ａ．，Ｌｏｕｈａ，Ｍ．，Ｂｏｎｔｅ，Ｅ．，Ｐｏｕｓｓｉｎ，Ｋ．，Ｖｏｎａ，Ｇ．，Ｍｅｊｅａｎ，Ａ．，Ｃｈｒｅｔｉｅｎ，Ｙ．，Ｂｏｕｇａｓ，Ｌ．，Ｌａｃｏｕｒ，Ｂ．，Ｃａｐｒｏｎ，Ｆ．，Ｒｏｓｅｔｏ，Ａ．，Ｂｒｅｃｈｏｔ，Ｃ．，およびＰａｔｅｒｌｉｎｉ−Ｂｉｎｅｃｈｏｔ，Ｐ．（１９９９）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ｂｅｒ−ＥＰ４ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｂｅｆｏｒｅ ＲＴ−ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １１２，１７１−１７８．

Ｓａｇａ，Ｓ．，Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｔ．，およびＹａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（１９８８）．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．４８，５５１０−５５１３．

Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ，Ａ．，Ｋｒｕｇｅｒ，ＩＣＨ．，Ｇｏｍｍ，Ｊ．，Ｓｉｎｎｅｔｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｇａｚｅｔ，Ｊ．Ｃ．，Ｓａｃｋｓ，Ｎ．，Ｂｅｎｄｅｒ，ＨＧ，Ｌｕｑｍａｎｉ，Ｙ．，およびＣｏｏｍｂｅｓ，ＲＣ．（１９９７）．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｂｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｋｅｒａｔｉｎ １９．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ３３，８５４−８６１．

Ｓｏｅｔｈ，Ｅ．，Ｖｏｇｅｌ，ｌ．，Ｒｏｄｅｒ，Ｃ．，Ｊｕｌｉｌ，Ｈ．，Ｍａｒｘｓｅｎ，Ｊ．，Ｋｒｕｇｅｒ，Ｕ．，Ｈｅｎｎｅ−Ｂｒｕｎｓ，Ｄ．，Ｋｒｅｍｅｒ，Ｂ．，およびＫａｌｔｈｏｆｆ，Ｈ．（１９９７）．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｎｄ ｖｅｎｏｕｓ ｂｌｏｏｄ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７，３１０６．

Ｓｕａｒｅｚ−Ｑｕｉａｎ，Ｃ．Ａ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｒ．，Ｐｏｈｉｄａ，Ｔ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｄ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．ｌ．，Ｗｅｌｌｕｅｒ，Ｅ，Ｇｈａｎｙ，Ｍ．，およびＢｏｎｎｅｒ，ＲＦ．（１９９９）．Ｌａｓｅｒ ｃａｐｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ
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Ｓｚｍｉｔｋｏ，Ｐ．Ｅ．，Ｆｅｄａｋ，Ｐ．Ｗ．Ｍ．，Ｗｅｉｓｅｌ，ＲＤ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｄ．Ｊ．，Ｋｕｔｒｙｋ，Ｍ．Ｊ．Ｂ．，およびＶｅｒｍａ，Ｓ．（２００３）．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ： Ｎｅｗ Ｈｏｐｅ ｆｏｒ ａ Ｂｒｏｋｅｎ Ｈｅａｒｔ．
Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０７，３０９３−３１００．

Ｖｌｅｍｓ，Ｆ．Ａ．，Ｄｉｅｐｓｔｒａ，Ｊ．Ｈ．Ｓ．，Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ，Ｉ．Ｍ．Ｈ．Ａ．，Ｒｕｅｒｓ，Ｔ．Ｊ．Ｍ．，Ｌｉｇｔｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｊ．Ｌ．，Ｐｕｎｔ，Ｃ．Ｊ．Ａ．，Ｖａｎ Ｋｒｉｅｋｅｎ，Ｊ．Ｈ．Ｊ．Ｍ．，Ｗｏｂｂｅｓ，Ｔ．，およびＶａｎ Ｍｕｉｊｅｎ，Ｇ．Ｎ．Ｐ．（２００２）．Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ ２０ ＲＴ−ＰＣＲ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ａｎｄ ｄｏｗｕｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｕｒ ｔｉｓｓｕｅ．Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ ５５，１５６．

Ｖｏｎａ，Ｇ．，Ｓａｂｉｌｅ，Ｘ，Ｌｏｕｈａ，Ｍ．，Ｓｉｔｒｕｋ，Ｖ．，Ｒｏｍａｎａ，Ｓ．，Ｓｃｈｕｔｚｅ，Ｋ．，Ｃａｐｒｏｎ，Ｆ．，Ｆｒａｎｃｏ，Ｄ．，Ｐａｚｚａｇｌｉ，Ｍ．，Ｖｅｋｅｍａｎｓ，Ｍ．，Ｌａｃｏｕｒ，Ｂ．，Ｂｒｅｃｈｏｔ，Ｃ．，およびＰａｔｅｒｌｉｎｉ−Ｂｒｅｃｈｏｔ，Ｐ．（２０００）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｉｚｅ ｏｆ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５６，５７−６３．

Ｗａｌｓｈ，Ｊ．Ｍ．Ｅ．およびＴｅｒｄｉｍａｎ，Ｊ．Ｐ．（２００３）．Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＪＡＭＡ：Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ２８９，１２９７．

Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｐ．，Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ，ＭＡ，Ｃａｒｄｕｃｃｉ，ＭＡ，Ｐａｒｔｉｎ，Ａ．Ｗ．，Ｓｃｈｅｒ，Ｈｉ，およびＴｓ’ｏ，Ｐ．Ｏ．（２０００）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ ８８，２７８７−２７９５．

Ｗｅｉｈｒａｕｃｈ，Ｍ．Ｒ（２００２）．Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ：Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ．［報告］．Ｊ．Ｃｈｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０，４３３８−４３４３．

Ｗｅｉｔｚ，Ｊ．，Ｋｉｅｎｌｅ，Ｐ．，Ｍａｇｅｎｅｒ，Ａ．，Ｋｏｃｈ，Ｍ．，Ｓｃｈｒｏｄｅｌ，Ａ．，Ｗｉｌｌｅｋｅ，Ｆ．，Ａｕｔｓｃｈｂａｃｈ，Ｆ．，Ｌａｃｒｏｉｘ，Ｊ．，Ｌｅｈｎｅｒｔ，Ｔ．，Ｈｅｒｆａｒｔｈ，Ｃ．，およびＤｏｅｂｅｒｉｔｚ，Ｍ．ｖ．Ｋ．（１９９９）．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅｓ，Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５，１８３０．

Ｗｈａｒｔｏｎ，Ｒ．Ｑ．，Ｊｏｎａｓ，Ｓ．Ｋ．，Ｇｌｏｖｅｒ，Ｃ．，Ｋｈａｎ，Ｚ．Ａ．Ｊ．，Ｋｌｏｋｏｕｚａｓ，Ａ．，Ｑｕｉｎｎ，Ｈ．，Ｈｅｎｒｙ，Ｍ．，およびＡｌｌｅｎＭｅｒｓｈ，Ｔ．Ｇ．（１９９９）．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｔｗｏ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ Ａｓｓａｙｓ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｓａｍｐｌｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５，４１５８．

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図１Ａは、ＣＡＭ １６ウェルチャンバースライドの前面図を示す。このチャンバースライドの底面は、ＣＡＭフィルム（例えば、蛍光標識されたコラーゲンフィルム）で被覆されており、癌および心血管疾患の診断に使用され得る循環性の腫瘍細胞および内皮前駆細胞を濃縮し得る。図１Ｂは、ＣＡＭ ９６ウェルチャンバースライドの前面図を示す。このチャンバースライドの底面は、ＣＡＭフィルム（例えば、蛍光標識されたＣＡＭフィルム）で被覆されており、循環性腫瘍細胞および内皮前駆細胞を濃縮し得、癌および心血管疾患の診断に使用され得るコラーゲンを含む。FIG. 1A shows a front view of a CAM 16 well chamber slide. The bottom surface of the chamber slide is coated with a CAM film (eg, a fluorescently labeled collagen film), which can concentrate circulating tumor cells and endothelial progenitor cells that can be used to diagnose cancer and cardiovascular disease. FIG. 1B shows a front view of a CAM 96 well chamber slide. The bottom surface of this chamber slide is coated with a CAM film (eg, fluorescently labeled CAM film), which can concentrate circulating tumor cells and endothelial progenitor cells and can be used for diagnosis of cancer and cardiovascular disease including. 図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、疾患診断に使用され得る正立した７ｍｌ、１５ｍｌおよび３０ｍｌの真空採血管の前面図を示す。これらは、その内部表面に沿ってＣＡＭフィルムで被覆されている。図２Ｄは、内部表面に沿ってＣＡＭフィルムで被覆された、正立した組織培養容器の前面図を示す。これらは、癌および心血管疾患の診断および処置に使用され得る。図２Ｅは、例えば図２Ａ〜２Ｄにおける容器中のＣＡＭフィルムの拡大した全面図を示す。2A, 2B and 2C show front views of upright 7 ml, 15 ml and 30 ml vacuum blood collection tubes that can be used for disease diagnosis. They are coated with a CAM film along their inner surface. FIG. 2D shows a front view of an upright tissue culture vessel coated with a CAM film along the interior surface. They can be used for diagnosis and treatment of cancer and cardiovascular diseases. FIG. 2E shows an enlarged full view of the CAM film in the container, for example in FIGS. 図３Ａは、ＣＡＭフィルムで被覆されたディップスティック挿入物を有する、正立した採血管の前面図を示す。図３Ｂは、図３Ａのディップスティックの前面図を示す。FIG. 3A shows a front view of an upright blood collection tube with a dipstick insert coated with CAM film. FIG. 3B shows a front view of the dipstick of FIG. 3A. 図４Ａは、血液濾過カセットの３次元図を示す。このカセットは、以下を含む：濾過されるべきサンプルの導入のための、ハウジング中の、前フィルターメッシュ入口；薄いＣＡＭフィルムで被覆された細胞分離ビーズで充填された主フィルター区画；濾過された血液を除去するための、ハウジング中の、後フィルターメッシュ出口。これは、本発明の診断、治療または処置のための血液濾過システムと併せて使用され得る。図４Ｂは、ＣＡＭフィルムで被覆された細胞分離ビーズで充填された、図４Ａの主フィルター区画の拡大された断面図であり、内部の限られた範囲内に細胞分離ビーズによって形成された吻合チャンネルを示す。FIG. 4A shows a three-dimensional view of the hemofiltration cassette. This cassette includes: a pre-filter mesh inlet in the housing for introduction of the sample to be filtered; a main filter compartment filled with cell separation beads coated with a thin CAM film; filtered blood After filter mesh outlet in the housing to remove. This can be used in conjunction with the hemofiltration system for diagnosis, therapy or treatment of the present invention. FIG. 4B is an enlarged cross-sectional view of the main filter compartment of FIG. 4A filled with cell separation beads coated with a CAM film, and an anastomotic channel formed by the cell separation beads within a limited interior. Indicates. 図５は、抗体ＥｐＣＡ（正の選択）を含まない（Ａ）／（Ｂ）および含まない（Ｃ）／（Ｄ）、ＣＤ４５汎白血球抗原、および汎サイトケラチン（Ｂ）／（Ｃ）またはＣＤ−３１（Ｄ）に対する抗体を用いた細胞接着マトリックスによって濃縮された、卵巣腺癌の腹水に由来する白血球（Ａ）および腫瘍細胞（Ｂ）／（Ｃ）／（Ｄ）の免疫細胞化学顕微鏡写真である。FIG. 5 shows (A) / (B) and without (C) / (D), CD45 panleukocyte antigen, and pancytokeratin (B) / (C) or CD without antibody EpCA (positive selection) Immunocytochemical micrographs of leukocytes (A) and tumor cells (B) / (C) / (D) derived from ascites of ovarian adenocarcinoma, enriched by a cell adhesion matrix using an antibody against -31 (D) It is. 図６Ａ〜Ｃは、腹水由来の腫瘍細胞（図６Ａおよび６Ｂ）および固形原発性腫瘍由来の腫瘍細胞（図６Ａおよび６Ｃ）に関するＤＮＡマイクロアレイクラスターから選択された１０個の遺伝子のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ相対発現分析である。FIGS. 6A-C show real-time RT-PCR relative of 10 genes selected from DNA microarray clusters for ascites-derived tumor cells (FIGS. 6A and 6B) and solid primary tumor-derived tumor cells (FIGS. 6A and 6C). Expression analysis.

Claims (38)

標的細胞を流体サンプルから単離するための装置であって、該装置は、以下：
内部表面および外部表面を有する容器；
１種以上の細胞接着分子に結合する非反応性のコア材料を含む細胞接着マトリックス
を備え；
ここで、該細胞接着マトリックスが、該容器の該内部表面を覆っている、装置。 An apparatus for isolating target cells from a fluid sample, the apparatus comprising:
A container having an inner surface and an outer surface;
Comprising a cell adhesion matrix comprising a non-reactive core material that binds to one or more cell adhesion molecules;
Wherein the cell adhesion matrix covers the internal surface of the container. 請求項１に記載の装置であって、ここで、前記細胞接着マトリックスの非反応性のコア材料が、以下：
ゼラチン、架橋ゼラチン、骨、ガラス、不活性ポリマー、およびデキストランからなる群より選択される、少なくとも一つの材料である、装置。 The device of claim 1, wherein the non-reactive core material of the cell adhesion matrix is:
A device that is at least one material selected from the group consisting of gelatin, cross-linked gelatin, bone, glass, inert polymer, and dextran. 請求項１に記載の装置であって、前記細胞接着マトリックスの細胞接着分子が、プロテオグリカン、フィブロネクチン、フィブリン、ヘパリン、ラミニン、テネイシン、ビトロネクチン、および／またはこれらのフラグメントからなる群より選択される、少なくとも一つの分子である、装置。   2. The device of claim 1, wherein the cell adhesion molecule of the cell adhesion matrix is selected from the group consisting of proteoglycan, fibronectin, fibrin, heparin, laminin, tenascin, vitronectin, and / or fragments thereof. A device that is a molecule. 請求項１に記載の装置であって、前記容器の内部表面が、前記細胞接着マトリックスで、少なくとも５％覆われている、装置。   The device according to claim 1, wherein the inner surface of the container is covered with the cell adhesion matrix by at least 5%. 請求項１に記載の装置であって、前記標的細胞に結合する場合に該標的細胞に対して、検出可能な親和性を有する、少なくとも一つのリガンドを含む、装置。   The device of claim 1, comprising at least one ligand having a detectable affinity for the target cell when bound to the target cell. 請求項５に記載の装置であって、前記リガンドが蛍光標識されている、装置。   6. The device according to claim 5, wherein the ligand is fluorescently labeled. 請求項５に記載の装置であって、前記リガンドが前記細胞接着マトリックスへと組み込まれている、装置。   6. The device of claim 5, wherein the ligand is incorporated into the cell adhesion matrix. 請求項５に記載の装置であって、前記リガンドが、前記細胞接着マトリックスに結合する層中に見出される、装置。   6. The device of claim 5, wherein the ligand is found in a layer that binds to the cell adhesion matrix. 請求項１に記載の装置であって、前記細胞接着マトリックスに近接する細胞分離機構をさらに含み、該細胞分離機構は、前記標的細胞と該細胞接着マトリックスとの相互作用の前に該標的細胞を含有するサンプルから細胞を取り除くように、作動可能に構成される、装置。   The apparatus of claim 1, further comprising a cell separation mechanism proximate to the cell adhesion matrix, wherein the cell separation mechanism removes the target cell prior to interaction between the target cell and the cell adhesion matrix. A device operatively configured to remove cells from a containing sample. 請求項９に記載の装置であって、該細胞分離メカニズムが、フィルター、膜、メッシュ、物質勾配からなる群より選択される、少なくとも一つの機構である、装置。   The apparatus according to claim 9, wherein the cell separation mechanism is at least one mechanism selected from the group consisting of a filter, a membrane, a mesh, and a substance gradient. 請求項５に記載の装置であって、少なくとも１種のリガンドが、該リガンドと単離された標的細胞との相互作用の際に視覚的検出を可能にするように、作動可能に構成される、装置。   6. The apparatus of claim 5, wherein at least one ligand is operatively configured to allow visual detection upon interaction of the ligand with an isolated target cell. ,apparatus. 請求項１に記載の装置を使用する方法であって、該方法は、以下：
該装置において、前記流体サンプル中の細胞の混合物を該細胞接着マトリックスに接触させる工程；
標的細胞を該細胞接着マトリックスから単離する工程；
を包含する、方法。 A method of using the apparatus of claim 1, the method comprising:
Contacting the cell adhesion matrix with a mixture of cells in the fluid sample in the device;
Isolating target cells from the cell adhesion matrix;
Including the method. 請求項１２に記載の方法であって、該方法は、未結合の細胞を前記細胞接着マトリックスから取り除く工程をさらに包含する、方法。   13. The method according to claim 12, further comprising removing unbound cells from the cell adhesion matrix. 請求項１２に記載の方法であって、前記流体サンプルが、血液サンプルもしくは腹水サンプル、または生検サンプルもしくは擦過サンプルもしくは塗抹サンプルである、方法。   13. The method of claim 12, wherein the fluid sample is a blood sample or ascites sample, or a biopsy sample or a scraped sample or smear sample. 請求項１２に記載の方法であって、前記細胞混合物が、密度勾配遠心分離または赤血球溶解の後、血液サンプル由来の単核細胞を含む、方法。   13. The method of claim 12, wherein the cell mixture comprises mononuclear cells from a blood sample after density gradient centrifugation or erythrocyte lysis. 請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記標的細胞が、腫瘍細胞、内皮細胞または胎児細胞である、方法。   13. The method according to claim 12, wherein the target cell is a tumor cell, endothelial cell or fetal cell. 請求項１６に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が、肺癌、膀胱癌、***組織の癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胸部の癌、皮膚癌、肝臓癌、胃癌、食道癌、頭部および頚部の癌、頚部癌、子宮癌、脳の癌、腎臓癌、甲状腺癌、結腸癌または直腸癌のうちの少なくとも一つの癌に由来する、方法。   17. The method of claim 16, wherein the tumor cells are lung cancer, bladder cancer, breast tissue cancer, ovarian cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, breast cancer, skin cancer, liver cancer, stomach cancer, esophageal cancer, A method derived from at least one cancer of head and neck cancer, cervical cancer, uterine cancer, brain cancer, kidney cancer, thyroid cancer, colon cancer or rectal cancer. 請求項１２に記載の方法であって、前記標的細胞が内皮細胞または内皮前駆体細胞である、方法。   13. The method according to claim 12, wherein the target cell is an endothelial cell or endothelial precursor cell. 請求項１２の方法であって、前記標的細胞が妊娠雌から取得した胎児の細胞である、方法。   13. The method of claim 12, wherein the target cell is a fetal cell obtained from a pregnant female. 請求項１２の方法であって、前記細胞接着マトリックスがビーズを含む、方法。   13. The method of claim 12, wherein the cell adhesion matrix comprises beads. 請求項１２の方法であって、前記細胞マトリックスが蛍光標識された細胞接着マトリックス成分を含有する、方法。   13. The method of claim 12, wherein the cell matrix contains a fluorescently labeled cell adhesion matrix component. 請求項１２の方法であって、前記標的細胞が浸潤突起を含む、方法。   13. The method of claim 12, wherein the target cell comprises an infiltrating process. 請求項１２の方法であって、前記標的細胞が細胞接着レセプターのインテグリンを含む、方法。   13. The method of claim 12, wherein the target cell comprises a cell adhesion receptor integrin. 開口部、底部、および周囲の側壁を有する容器であって、該容器は、該容器の内部表面上に細胞接着マトリックスの少なくとも一つの被覆層を含み、該容器は、流体が該容器の開口部の中に置かれた場合に流体サンプルによって接触されるように、作動可能に構成されている、容器。   A container having an opening, a bottom, and a peripheral side wall, the container including at least one coating layer of a cell adhesion matrix on an inner surface of the container, the container containing a fluid in the opening of the container A container operatively configured to be contacted by a fluid sample when placed in the container. 請求項２４に記載の容器であって、該容器は、マイクロタイタープレート、顕微鏡スライドチャンバ、組織培養デバイス、細胞チャンバユニット、血液濾過ユニット、チューブ、瓶、またはこれらの組み合わせ、からなる群より選択される、容器。   25. The container of claim 24, wherein the container is selected from the group consisting of a microtiter plate, a microscope slide chamber, a tissue culture device, a cell chamber unit, a blood filtration unit, a tube, a bottle, or a combination thereof. A container. 請求項２１に記載の蛍光標識された細胞接着マトリックスであって、ここで、該マトリックスは、血液中の癌細胞を標識するために使用される、細胞接着マトリックス。   24. The fluorescently labeled cell adhesion matrix of claim 21, wherein the matrix is used to label cancer cells in blood. 疾患の出生前診断のための方法であって、該方法は、以下：
妊娠雌からの血液サンプルを、細胞接着マトリックスと接触させる工程、
該細胞接着マトリックスから胎児細胞を単離する工程、
該胎児細胞を培地中で培養する工程、および
遺伝的異常および染色体異常の存在に関して、該胎児細胞を試験する工程
を包含する、方法。 A method for prenatal diagnosis of disease comprising the following:
Contacting a blood sample from a pregnant female with a cell adhesion matrix;
Isolating fetal cells from the cell adhesion matrix;
Culturing the fetal cells in a medium, and testing the fetal cells for the presence of genetic and chromosomal abnormalities. 請求項２７に記載の方法であって、前記遺伝的異常および染色体異常が、ダウン症候群、マルファン症候群、テイサックス病、およびサラセミア、からなる群より選択される、方法。   28. The method of claim 27, wherein the genetic and chromosomal abnormalities are selected from the group consisting of Down's syndrome, Marfan syndrome, Tesax disease, and thalassemia. 請求項２７に記載の方法であって、前記細胞接着マトリックスが、多数の被覆されたビーズを含み、このビーズが、非反応性のコア材料を含有し、かつ該コア材料の周囲に細胞接着分子を含有する、方法。   28. The method of claim 27, wherein the cell adhesion matrix comprises a number of coated beads, the beads contain a non-reactive core material and cell adhesion molecules around the core material. Containing a method. 請求項２９に記載の細胞接着マトリックスであって、前記非反応性のコアが、コラーゲンマイクロビーズ、ゼラチンマイクロビーズおよびガラスマイクロビーズまたはこれらの組み合わせ、からなる群より選択される、少なくとも１種の材料である、細胞接着マトリックス。   30. The cell adhesion matrix of claim 29, wherein the non-reactive core is selected from the group consisting of collagen microbeads, gelatin microbeads and glass microbeads or combinations thereof. A cell adhesion matrix. 請求項３０に記載の容器であって、前記コラーゲンが、蛍光染料で標識されている、容器。   31. A container according to claim 30, wherein the collagen is labeled with a fluorescent dye. 癌をインビトロで診断するための方法であって、該方法は、以下：
患者から得られたサンプル流体を、血液由来の成分を含有する細胞接着マトリックスと接触させる工程、
該マトリックスに付着した転移性の腫瘍細胞を、該サンプルの流体中の細胞から単離する工程；
該マトリックスに付着した該転移性の腫瘍細胞を、所定の期間培養する工程；ならびに
該培養物における該転移性腫瘍細胞の顕微鏡分析およびフローサイトメトリー分析を行う工程
を包含する、方法。 A method for diagnosing cancer in vitro, the method comprising:
Contacting a sample fluid obtained from a patient with a cell adhesion matrix containing blood-derived components;
Isolating metastatic tumor cells attached to the matrix from cells in the fluid of the sample;
A method comprising culturing the metastatic tumor cells attached to the matrix for a predetermined period; and performing microscopic analysis and flow cytometry analysis of the metastatic tumor cells in the culture. 請求項３２に記載の方法であって、該方法は、前記転移性の癌細胞の免疫組織化学を行い、前記サンプル流体中に存在する癌細胞の型を同定する工程、および／または該癌細胞を標識細胞接着マトリックスおよび核酸染料で染色して、該サンプル流体中に存在する癌細胞の型を同定する工程、をさらに包含する、方法。   33. The method of claim 32, wherein the method comprises performing immunohistochemistry of the metastatic cancer cell to identify the type of cancer cell present in the sample fluid, and / or the cancer cell. Staining with a labeled cell adhesion matrix and a nucleic acid dye to identify the type of cancer cells present in the sample fluid. 請求項３２に記載の方法であって、該方法は、上皮腫瘍遺伝子マーカーのＤＮＡマイクロアレイ分析および／またはリアルタイムＰＣＲ定量を用いて、前記転移性腫瘍細胞を特徴付ける工程をさらに包含する、方法。   33. The method of claim 32, further comprising characterizing the metastatic tumor cells using DNA microarray analysis and / or real-time PCR quantification of epithelial tumor gene markers. 請求項３４に記載の方法であって、ここで、前記腫瘍遺伝子マーカーが、ＧＡ７３３−２、ＧＡ７３３−１、ＭＭＰ７、ムチン１、リポカリン２、サイトケラチン１８、Ｅ−カドへリン−１、セプラーゼ、自家毒素、およびＣＸＣＲ４である、方法。   35. The method of claim 34, wherein the oncogene marker is GA733-2, GA733-1, MMP7, mucin 1, lipocalin 2, cytokeratin 18, E-cadherin-1, seprase, A method that is autologous toxin and CXCR4. 流体入口および流体出口を収納する濾過カセットであって、該収納は、
該流体入口に近接する前フィルター；
該流体出口に近接する後フィルター；および
細胞接着マトリックスを備えるフィルター区画であって、該フィルター区画は、該前フィルターと後フィルターとの間に配置されている、フィルター区画
を含む、濾過カセット。 A filtration cassette containing a fluid inlet and a fluid outlet, the storage comprising:
A prefilter proximate to the fluid inlet;
A filtration cassette comprising a back filter proximate to the fluid outlet; and a filter compartment comprising a cell adhesion matrix, wherein the filter compartment is disposed between the front filter and the back filter. 請求項３６に記載の方法であって、前記前フィルターまたは前記後フィルターのうちの１つが、細胞接着マトリックスに結合している、方法。 40. The method of claim 36, wherein one of the pre-filter or the post-filter is bound to a cell adhesion matrix. 流体サンプルから標的細胞を単離するための装置であって、該装置は、以下：
該流体サンプルを保持するように設計された内側表面と外側表面とを有する、管
細胞接着マトリックスを有するカードに連結された蓋を備える、ディップスティック
を備える、装置。 An apparatus for isolating target cells from a fluid sample, the apparatus comprising:
An apparatus comprising a dipstick comprising a lid coupled to a card having a tube cell adhesion matrix having an inner surface and an outer surface designed to hold the fluid sample.
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