JP2006006258A - 核酸の核酸抽出方法および核酸抽出装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 核酸を含む試料溶液中の核酸を核酸吸着性の多孔膜に吸着させた後、洗浄等を経て脱着させて核酸を分離精製する方法において効率良く、簡便で、迅速で、自動化適正に優れ、良好な再現性で核酸を含む試料溶液を得る。
【解決手段】 核酸抽出カートリッジに核酸を含む試料溶液を注入し圧力差により該試料溶液中の核酸をフィルター部材に吸着させた後、核酸抽出カートリッジに洗浄液を分注し圧力差により不純物を除去し、その後、核酸抽出カートリッジに回収液を分注し圧力差によりフィルター部材に吸着した核酸を分離して回収液とともに回収する際に、洗浄液を分注して放置させる時間と回収液を分注して放置させる時間との少なくとも一方を所定の時間に制御する。
【選択図】 図１０

Description

本発明は、フィルター部材を備えた核酸抽出カートリッジを用いて試料溶液の核酸を自動抽出する核酸抽出方法および核酸抽出装置に関する。

従来の核酸抽出法としては、遠心法によるもの、磁気ビーズを用いるもの、フィルターを用いるもの等がある。
例えば、核酸を二酸化珪素、シリカポリマー、珪酸マグネシウム等の固相に吸着させ、引き続く洗浄，脱着等の操作によって精製する方法がある（例えば、特許文献１参照）。

特公平７−５１０６５号公報

しかし、前記のような従来の核酸抽出法は、分離性能としては優れているが、簡便性、迅速性、自動化適正においては十分ではなかった。また、同一性能の吸着媒体の工業的大量生産が困難であり、かつ、取扱いが不便で、種々の形状に加工しがたい等の問題点がある。

本発明は、前記事情に鑑みてなされたもので、その目的は、核酸を含む試料溶液中の核酸を核酸吸着性固相担体に吸着させた後、洗浄等を経て脱着させて核酸を分離精製する方法において効率良く、簡便で、迅速で、自動化適正に優れ、良好な再現性で核酸を含む試料溶液を得ることができる核酸抽出方法及び核酸抽出装置を提供することにある。

本発明の前記目的は、下記構成によって達成される。
（１） 核酸を含む試料溶液を核酸吸着性固相担体に接触させて、該核酸吸着性固相担体に核酸を吸着させる工程と、
洗浄液を該核酸吸着性固相担体に接触させて、核酸が吸着した状態で前記核酸吸着性固相担体を洗浄する工程と、
回収液を該核酸吸着性固相担体に接触させて、該核酸吸着性固相担体から核酸を脱着させる工程を含む核酸抽出方法であって、
前記洗浄液を分注して放置させる時間及び前記回収液を分注して放置させる時間のうち少なくとも一方を所定の時間に制御することを特徴とする核酸抽出方法。
（２） 洗浄液を放置させる時間を５０秒から１０００秒の範囲に制御することを特徴とする上記（１）に記載の核酸抽出方法。
（３） 洗浄液を放置させる時間を１００秒から３００秒の範囲に制御することを特徴とする上記（１）に記載の核酸抽出方法。
（４） 回収液を放置させる時間を２０秒から３００秒の範囲に制御することを特徴とする上記（１）に記載の核酸抽出方法。
（５） 回収液を放置させる時間を２５秒から６０秒の範囲に制御することを特徴とする上記（１）に記載の核酸抽出方法。
（６） 前記核酸吸着性固相担体が、イオン結合の関与しない相互作用で核酸を吸着する該核酸吸着性固相担体であることを特徴とする上記（１）から（５）のいずれか１つに記載の核酸抽出方法。
（７） 前記核酸を含む試料溶液が、
カオトロピック塩、界面活性剤、消泡剤、タンパク質分解酵素および核酸安定化剤の中から選ばれる化合物を含む前処理液と試験検体を混合し、混合液を得る工程と、
前記混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程とを含むことを特徴とする上記（１）から（６）のいずれか１つに記載の核酸抽出方法。
（８） 前記核酸安定化剤がメルカプト化合物であることを特徴とする上記（７）に記載の核酸抽出方法。
（９） 前記カオトロピック塩がグアニジウム塩であることを特徴とする上記（７）に記載の核酸抽出方法。
（１０） 前記水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノールのいずれかを含むことを特徴とする上記（７）に記載の核酸抽出方法。
（１１） 前記核酸吸着性固相担体を少なくとも２個の開口を有する容器の内部に収容した核酸抽出カートリッジに、核酸を含む試料溶液を注入し圧力差により該試料溶液中の核酸を該核酸吸着性固相担体に吸着させた後、前記核酸抽出カートリッジに洗浄液を分注し圧力差により不純物を除去し、その後、前記核酸抽出カートリッジに回収液を分注し圧力差により核酸吸着性固相担体に吸着した核酸を分離して回収液とともに回収することを特徴とする上記（１）から（１０）のいずれか１つに記載の核酸抽出方法。
（１２） 核酸吸着性固相担体からなるフィルター部材を備えた核酸抽出カートリッジを用い、該核酸抽出カートリッジに核酸を含む試料溶液を注入し圧力差により該試料溶液中の核酸を該フィルター部材に吸着させた後、該核酸抽出カートリッジに洗浄液を分注し圧力差により不純物を除去し、その後、該核酸抽出カートリッジに回収液を分注し圧力差によりフィルター部材に吸着した核酸を分離して回収液とともに回収する抽出動作を自動的に行う核酸抽出装置であって、
該核酸抽出カートリッジに加圧ノズルから加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、
該核酸抽出カートリッジに洗浄液及び回収液をそれぞれ分注する分注ノズルを有する分注機構と、
洗浄液を分注して放置させる時間と回収液を分注して放置させる時間との少なくとも一方を所定の時間に制御する放置時間制御手段が設けられたことを特徴とする核酸抽出装置。
（１３） 洗浄液を放置させる時間を５０秒から１０００秒の範囲に制御することを特徴とする上記（１２）に記載の核酸抽出装置。
（１４） 洗浄液を放置させる時間を１００秒から３００秒の範囲に制御することを特徴とする上記（１２）に記載の核酸抽出装置。
（１５） 回収液を放置させる時間を２０秒から３００秒の範囲に制御することを特徴とする上記（１２）に記載の核酸抽出装置。
（１６） 回収液を放置させる時間を２５秒から６０秒の範囲に制御することを特徴とする上記（１２）に記載の核酸抽出装置。
（１７） 前記核酸抽出カートリッジに核酸を含む試料溶液を注入して該試料溶液中の核酸を前記フィルター部材に吸着させる工程、前記核酸抽出カートリッジに洗浄液を分注して不純物を除去する工程、前記核酸抽出カートリッジに回収液を分注してフィルター部材に吸着した核酸を分離して回収液とともに回収する工程の抽出動作を加圧によって自動的に行う上記（１２）から（１６）のいずれか１つに記載の核酸抽出装置。
（１８） 前記核酸抽出カートリッジに加圧ノズルから加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、前記核酸抽出カートリッジに洗浄液及び回収液をそれぞれ分注する分注ノズルを有する分注機構が設けられたことを特徴とする上記（１２）から（１７）のいずれか１つに記載の核酸抽出装置。

本発明によれば、核酸を含む試料溶液中の核酸を核酸吸着性の多孔膜に吸着させた後、洗浄等を経て脱着させて核酸を分離精製する方法において効率良く、簡便で、迅速で、自動化適正に優れ、再現性が良好な核酸を含む試料溶液を得ることができる核酸抽出方法及び核酸抽出装置を提供できる。

以下に本発明に係る核酸抽出方法を実施するのに好適な核酸抽出装置の実施の形態について詳細に説明する。
図１は核酸抽出装置の一実施形態であってカバーを除去した状態を示す斜視図、図２は核酸抽出装置の移動ヘッドの概略構成図、図３は核酸抽出装置の概略ブロック構成図である。
本核酸抽出装置１００は、容器内にフィルター部材を収容した核酸抽出カートリッジ（以降は単にカートリッジと称する）１１及び核酸を含む回収液を収容する回収容器１３をそれぞれ複数配列させて保持する保持機構３と、カートリッジ１１に単一の加圧ノズル４１から加圧エアを導入する加圧エア供給機構４と、カートリッジ１１に洗浄液及び回収液をそれぞれ分注する分注ノズル５１を有する分注機構５と、加圧エア供給機構２０の加圧ノズル４１と保持機構１０とを相対移動させる移動機構７とを備えて構成される。フィルター部材としては、核酸吸着性多孔質体（ここでは核酸吸着性多孔性膜）などの核酸吸着性固相担体を用いることができる。

そして、本発明に係る核酸抽出方法を行う核酸抽出装置１００では、(1)核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(2)該核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で洗浄する工程、及び(3)回収液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を分離させる工程を順次実施するものである。

本実施形態の核酸抽出装置１００の機構を説明する前に、この核酸抽出装置による核酸の抽出工程を説明する。
図４はカートリッジの（ａ）斜視図と（ｂ）Ｐ−Ｐ断面図、図５は抽出動作の工程図（ａ）〜（ｇ）である。
この核酸抽出装置１００は、図４（ａ）に示すようなカートリッジ１１を用いて試料溶液中の核酸を抽出するものである。このカートリッジ１１は、上端が開口した筒状本体１１ａの底部に核酸吸着性多孔膜１１ｂが保持され、筒状本体１１ａの核酸吸着性多孔膜１１ｂより下方部位はロート状に形成され、下端中心部に細管ノズル状の排出部１１ｃが所定長さに突出形成され、筒状本体１１ａの側部両側に縦方向の突起１１ｄが形成されてなる。カートリッジ１１の上部開口１１ｅより後述の試料溶液、洗浄液、回収液が分注された後、上部開口１１ｅより加圧エアが導入され、各液を核酸吸着性多孔膜１１ｂに通して排出部１１ｃより後述の廃液容器１２又は回収容器１３に流下排出する。なお、図示の場合、筒状本体１１ａは上部と下部に分割され嵌着する構造となっている。また、上部開口１１ｅは、図４（ｂ）にＰ−Ｐ断面を示すように、内周面をテーパ状にカットした傾斜面１１ｆを有し、この傾斜面１１ｆは、後述する加圧ノズル４１先端の傾斜外周面に略一致するように形成されている。

核酸抽出装置１００は、基本的に図５(ａ)〜(ｇ)に示すような抽出工程によって核酸の抽出を行う。まず図５の(ａ)工程で、廃液容器１２上に位置するカートリッジ１１に溶解処理された核酸を含む試料溶液Ｓを注入する。次に(ｂ)工程で、カートリッジ１１に加圧エアを導入して加圧し、核酸吸着性多孔膜１１ｂに通して試料溶液Ｓを通過させ、この核酸吸着性多孔膜１１ｂに核酸を吸着させ、通過した液状成分は廃液容器１２に排出する。

次に(ｃ)工程でカートリッジ１１に洗浄液Ｗを自動分注し、(ｄ)工程でカートリッジ１１に加圧エアを導入して加圧し、核酸吸着性多孔膜１１ｂに核酸を保持したままその他の不純物の洗浄除去を行い、通過した洗浄液Ｗを廃液容器１２に排出する。この(ｃ)工程及び(ｄ)工程は複数回繰り返してもよい。

その後、(ｅ)工程でカートリッジ１１の下方の廃液容器１２を回収容器１３に交換してから、(ｆ)工程でカートリッジ１１に回収液Ｒを自動分注し、(ｇ)工程でカートリッジ１１に加圧エアを導入して加圧し、核酸吸着性多孔膜１１ｂと核酸の結合力を弱め、吸着されている核酸を離脱させて、核酸を含む回収液Ｒを回収容器１３に排出し回収する。

前記カートリッジ１１における核酸吸着性多孔膜１１ｂは、基本的には液体が通過可能な多孔質体であり、その表面は試料溶液中の核酸を化学的結合力で吸着する特性を有し、洗浄液による洗浄時にはその吸着を保持し、回収液による回収時に核酸の吸着力を弱めて離すように構成されてなる。その詳細は後述することにする。

核酸抽出装置１００は、図１〜図３に示すように、装置本体２に、複数のカートリッジ１１を保持するカートリッジホルダ２１と、廃液容器１２及び回収容器１３を保持する容器保持台２２と、カートリッジ１１に加圧エアを導入する加圧エア供給機構４と、カートリッジ１１に洗浄液Ｗ及び回収液Ｒを分注する分注機構５等を備えてなる。カートリッジホルダ２１と容器保持台２２は保持機構３を構成する。次に各機構３〜５を具体的に説明する。

＜保持機構＞
保持機構３は、カートリッジホルダ２１と容器保持台２２からなる。容器保持台２２には、装置本体２の前方下部に廃液容器１２及び回収容器１３を保持したラック６が載置される。ラック６の容器交換移動（前後動）は、容器保持台２２の基部に設置された作動部材３１（図３参照）が、容器交換モータ３２（ＤＣモータ）の駆動に応じて移動することで行われる。この前後動により、カートリッジホルダ２１の下方に回収容器１３が位置したり、廃液容器１２がカートリッジホルダ２１の下方に位置するようになる。前記容器交換モータ３２の作動は位置センサ３３ａ，３３ｂの検出に応じて制御される。

カートリッジホルダ２１は、前後のプレート材の接合による２分割構造に構成され、横方向に延びる保持部材２１ａ，２１ｂを備える。保持部材２１ａ，２１ｂには複数の保持孔２１ｃが並設され、上方よりカートリッジ１１が挿入され、カートリッジ１１の筒状本体１１ａの側部両側に形成された突起１１ｄ（図４参照）の下端がカートリッジホルダ２１内の係合部材（不図示）に係合保持される。係合部材は移動可能で、移動時には突起１１ｄとの係合を解除してカートリッジ１１を全部同時に下方に落下廃棄するようになっている。

このカートリッジホルダ２１は、図１のようにラック６が下降した位置では、カートリッジホルダ２１に保持されたカートリッジ１１の排出部１１ｃの下端はラック６にセットされた廃液容器１２及び回収容器１３より上方に位置している。容器保持台２２がパルスモータ等の昇降モータ４７（図３参照））の駆動により昇降動作されて、ラック６がフォトセンサ４８ａ〜４８ｃの検出に伴う制御により昇降移動されると、これにより、ラック６が上昇した際にカートリッジ１１の排出部１１ｃが廃液容器１２又は回収容器１３の内部に所定量挿入されるようになる。

ラック６は、その天面で横方向に延びる廃液容器保持孔と回収容器保持孔とを平行２列に備え、後側の廃液容器保持孔に複数の廃液容器１２が、前側の回収容器保持孔に複数の回収容器１３がそれぞれ列状に保持される。廃液容器保持孔及び回収容器保持孔はカートリッジホルダ２１の保持孔２１ｃと等ピッチで等位置に配設され、保持された各カートリッジ１１の下方にそれぞれ廃液容器１２及び回収容器１３が位置するように設定されている。この廃液容器１２と回収容器１３とは混同防止のためにサイズ、形状等が異なったものを使用するのが好ましい。

＜加圧エア供給機構＞
加圧エア供給機構４は、図１〜図３に示すように、前記保持機構３のラック６に対して昇降移動する可動体としての移動ヘッド４０と、この移動ヘッド４０に設置された単一の加圧ノズル４１と、加圧エアを発生するエアポンプ４３と、リリーフバルブ４４と、加圧ノズル４１側に設置され給気経路を開閉する開閉バルブ４５と、加圧ノズル４１側に設置された圧力センサ４６と、加圧ノズル４１を昇降動作させるノズル昇降手段を備えている。ノズル昇降手段は、パルスモータ等のノズル昇降モータ８１とこれに接続されるネジ−ナット機構により昇降動作を実現している。この構成により、順次カートリッジ１１に加圧エアを送給する。そして、エアポンプ４３と、リリーフバルブ４４と、加圧ノズル４１はそれぞれ制御部７０からの制御指令に基づいて動作する。

前記移動ヘッド４０は、装置本体２の中間フレーム２３と上フレーム２４との間に設置された移動手段としてのパルスモータ等のヘッド移動モータ２６（図３参照）、ヘッド移動モータ２６により回転駆動される駆動側プーリ２７、回転自在でテンション調整を行う従動側プーリ２８、駆動側プーリ２７と従動側プーリ２８との間を懸架されるタイミングベルト２９とを備えている。なお、ヘッド移動モータ２６は、フォトセンサ２５ａ〜２５ｃの検出に伴う制御により駆動され、カートリッジ１１の配列方向に沿って移動ヘッド４０を移動させる。

加圧ノズル４１は移動ヘッド４０に上下移動可能にかつ下方に付勢されて設置され、加圧ノズル４１の下方先端の外周面は、円錐形状とされている。これにより、加圧ノズル４１が下降移動した際に、カートリッジホルダ２１にセットされたカートリッジ１１の上端開口に、加圧ノズル４１先端で当接させることで、カートリッジ１１のテーパ状にカットされた傾斜面１１ｆが、加圧ノズル４１の先端の円錐面と密着してカートリッジ１１内を密閉する。この密封状態の下で、漏れのないカートリッジ１１内への加圧エア送給が可能となる。

リリーフバルブ４４はエアポンプ４３と開閉バルブ４５との間の通路のエアを排出する際に大気開放作動される。開閉バルブ４５は選択的に開作動されて、エアポンプ４３からの加圧エアを加圧ノズル４１を経てカートリッジ１１内に導入するようにエア回路が構成されている。以上の構成により、エアポンプ４３からカートリッジ１１までの間に給気流路が形成される。

＜分注機構＞
分注機構５は、カートリッジホルダ２１上を横方向に移動可能な前述の移動ヘッド４０に一体に搭載された洗浄液分注ノズル５１ｗ及び回収液分注ノズル５１ｒと、洗浄液ボトル５６ｗに収容された洗浄液Ｗを洗浄液分注ノズル５１ｗに給送する洗浄液供給ポンプ５２ｗ（図３参照）と、回収液ボトル５６ｒに収容された回収液Ｒを回収液分注ノズル５１ｒに給送する回収液供給ポンプ５２ｒ（図３参照）と、中間フレーム２３に載置された廃液容器５７等を備える。

移動ヘッド４０は、ヘッド移動モータ２６（図３参照）によって各カートリッジ１１上で順次停止し、復帰状態では廃液容器５７上に停止して、各カートリッジ１１上の空間を空けるように駆動制御される。各カートリッジ１１上の空間が空くことによって、作業性が大きく向上される。

洗浄液分注ノズル５１ｗ及び回収液分注ノズル５１ｒは先端が下方に向けて屈曲され、洗浄液分注ノズル５１ｗはバルブ５５ｗを介して洗浄液供給ポンプ５２ｗに接続され、洗浄液供給ポンプ５２ｗは洗浄液ボトル５６ｗに接続され、回収液分注ノズル５１ｒはバルブ５５ｒを介して回収液供給ポンプ５２ｒに接続され、回収液供給ポンプ５２ｒは回収液ボトル５６ｒに接続されている。洗浄液ボトル５６ｗ及び回収液ボトル５６ｒはそれぞれ装置本体２の前面側に装着されて操作性を高めている。洗浄液供給ポンプ５２ｗ及び回収液供給ポンプ５２ｒはチューブポンプで構成され、それぞれポンプモータ５３ｗ，５３ｒ（パルスモータ）によってセンサ５４ｗ，５４ｒの位置検出に基づいて所定量の洗浄液Ｗ及び回収液Ｒを分注するように駆動制御される。これら、ポンプモータ５３ｗ，５３ｒ、及びバルブ５５ｗ，５５ｒは、制御部７０からの指令に基づいて動作する。

洗浄液Ｗ又は回収液Ｒを分注する場合には、バルブ５５ｗ又は５５ｒを開き、ポンプモータ５３ｗ又は５３ｒを駆動して洗浄液供給ポンプ５２ｗ又は回収液供給ポンプ５２ｒのロータ部材を回転作動させる。これにより、洗浄液Ｗ又は回収液Ｒを洗浄液供給ポンプ５２ｗ又は回収液供給ポンプ５２ｒにより吸引してバルブ５５ｗ又は５５ｒを通じて洗浄液分注ノズル５１ｗ又は回収液分注ノズル５１ｒより吐出させる。この吐出時には、洗浄液分注ノズル５１ｗ又は回収液分注ノズル５１ｒをカートリッジ１１上に移動させておく。これにより、所定量の洗浄液Ｗ又は回収液Ｒがカートリッジ１１に分注される。

洗浄液ボトル５６ｗ及び回収液ボトル５６ｒは、容器本体５６ｗｂ，５６ｒｂとキャップ５６ｗｕ，５６ｒｕよりなり、両キャップ５６ｗｕ，５６ｒｕにはそれぞれ細パイプ状の吸引チューブ５８ｗ，５８ｒが設置され、該吸引チューブ５８ｗ，５８ｒの下端が容器本体５６ｗｂ，５６ｒｂの底部近傍に開口して、洗浄液供給ポンプ５２ｗ又は回収液供給ポンプ５２ｒの作動に応じて洗浄液Ｗ、回収液Ｒを吸い上げるようになっている。

前記のような各機構３〜５は、装置本体２の上部に設置された図示しない操作パネルの入力操作に対応して、連係された制御部７０によって制御される。つまり、制御部７０に接続された記憶部７２に予め記憶されているプログラムに基づいて駆動制御される。

次に、前記核酸抽出装置１００による抽出動作を具体的に説明する。まず保持機構３のラック６におけるカートリッジホルダ２１にカートリッジ１１をセットし、ラック６に廃液容器１２及び回収容器１３をそれぞれセットし、このラック６を装置本体２の容器保持台２２に載置して準備を行う。次に、溶解処理された試料溶液Ｓをピペット等によって各カートリッジ１１に順次注入する。このとき、移動ヘッド４０は廃液容器５７の直上に位置して、カートリッジ１１上の空間を空けている。なお、核酸抽出装置１００に搭載する前のラック６にセットした後又はセットする前のカートリッジ１１に試料溶液Ｓを先に注入するようにしてもよい。

その後、操作パネルの操作によって装置を作動させると、図６（ａ）に示すように、移動ヘッド４０がカートリッジ１１の直上位置まで移動する。そして、一例として示す図中左端のカートリッジＣ１の直上に加圧ノズル４１を配置させ、加圧エア供給機構４のノズル昇降モータ８１の駆動によって移動ヘッド４０の加圧ノズル４１を下降移動させる（図６（ｂ））。すると、加圧ノズル４１の先端外周面が、カートリッジ１１の傾斜面１１ｆと密着する。一方、容器保持台２２が昇降モータ４７の駆動により上昇動作され、カートリッジ１１の下端排出部１１ｃを廃液容器１２内に所定量挿入させて、排出液が飛散等によって外部に漏れてコンタミネーションの原因とならないようにする。

その後、加圧エアの供給が行われる。制御部７０の指令により、開閉バルブ４５が閉状態でエアポンプ４３が駆動され、開閉バルブ４５が開作動される。そして、加圧ノズル４１を通して１番目（Ｃ１）のカートリッジ１１にエアポンプ４３からの加圧エアが所定量供給される。

次いで、開閉バルブ４５を閉作動するのに続いて、加圧ノズル４１をノズル昇降モータ８１により上昇させてヘッド移動モータ２６を駆動して移動ヘッド４０をカートリッジ１１の配列ピッチ分移動させる。そして、次の２番目のカートリッジ１１（Ｃ２）に対して同様に加圧エアを所定量供給する（図６（ｃ））。
圧力が作用した試料溶液Ｓは、核酸吸着性多孔膜１１ｂを通って核酸が吸着保持され、その他の液状成分は下端部の排出部１１ｃより廃液容器１２に排出される。試料溶液Ｓが全て核酸吸着性多孔膜１１ｂを通過すると圧力が液排出完了圧力以下に低下し、圧力センサ４６によってカートリッジ１１の抽出終了が検出される。この工程をカートリッジ１１の数だけ繰り返し行う。

次に、洗浄処理に移行する。前記加圧エア供給後に移動ヘッド４０を上昇させて、最初のカートリッジ（Ｃ１）上へ戻す。そして、移動ヘッド４０の洗浄液分注ノズル５１ｗを１番目のカートリッジ（Ｃ１）上で停止させて洗浄液Ｗを所定量分注し、移動ヘッド４０を次のカートリッジ（Ｃ２）上に移動させて順次洗浄液Ｗを分注する。全部のカートリッジ１１への洗浄液Ｗの分注が終了すると、移動ヘッド４０を最初のカートリッジ（Ｃ１）上へ戻す。
次に、図６に示したように、移動ヘッド４０の加圧ノズル４１が下降して、加圧ノズル４１の下端部がカートリッジ１１の上端開口に圧接して密閉してから、前述と同様に開閉バルブ４５を開作動してカートリッジ１１に加圧エアを供給する。圧力が作用した洗浄液Ｗは、核酸吸着性多孔膜１１ｂを通って核酸以外の不純物の洗浄除去を行い、洗浄液Ｗは下端部の排出部１１ｃより廃液容器１２に排出される。全部のカートリッジ１１における洗浄液Ｗが全て核酸吸着性多孔膜１１ｂを通過して排出されると、移動ヘッド４０が初期の位置まで作動される。なお、洗浄処理を複数回行う場合には前記動作を繰り返す。

次に、回収処理に移行する。まず洗浄処理後の前記移動ヘッド４０の戻り動作に同期して、ラック６が昇降モータ４７により下降動作して、カートリッジ１１の下端排出部１１ｃが廃液容器１２から外れた後、保持機構３の作動部材３１を容器交換モータ３２の駆動により移動させてラック６を後退移動させる。このようにして、カートリッジ１１の下方に回収容器１３を位置させる容器交換を行う。

続いて、ラック６を昇降モータ４７により上昇させて、カートリッジ１１の下端が回収容器１３内に挿入されている状態に保持する。そして、図８（ａ）に示すように、移動ヘッド４０を移動させて回収液分注ノズル５１ｒを１番目のカートリッジ（Ｃ１）上に停止させて回収液Ｒを所定量分注し、移動ヘッド４０を次のカートリッジ（Ｃ２）に移動させて順次回収液Ｒの分注を行う（図８（ｂ））。全部のカートリッジ１１への回収液Ｒの分注が終了すると、図６に示すように、前述と同様の加圧エアの供給を各カートリッジ１１に対して実施する。
加圧エアが前述同様に供給され、圧力が作用した回収液Ｒは、核酸吸着性多孔膜１１ｂを通ってそれに吸着されている核酸を離脱させて、回収液Ｒとともに核酸が下端部の排出部１１ｃより回収容器１３に排出される。全部のカートリッジ１１における回収液Ｒが全て回収容器１３に排出されると、移動ヘッド４０が最初の廃液容器５７直上の待避位置に移動して、一連の動作が終了する。

抽出動作が終了したラック６は昇降モータ４７の駆動により下降され、カートリッジ１１及び廃液容器１２はカートリッジホルダ２１及びラック６より取り出されて廃棄され、一方、回収容器１３はラック６より取り出され、必要に応じて蓋がされて、次の核酸分析処理等が施される。

なお、本実施形態では、複数のカートリッジ１１が固定側に支持され、加圧エア供給機構４の加圧ノズル４１がカートリッジ１１の配列方向に沿って移動自在に支持されている構成を示したが、本発明は、これに限定されるものではなく、図９に核酸抽出装置の概略構成を示すように、加圧エア供給機構４の加圧ノズル４１が固定側に支持され、複数のカートリッジ１１、廃液容器１２、及び回収容器１３が、それらの配列方向に沿って移動自在に支持された構成としてもよい。図９に示す構成によれば、固定された加圧ノズル４１，洗浄液分注ノズル５１ｗ、回収液分注ノズル５１ｒに対して、カートリッジ１１、廃液容器１２、及び回収容器１３をそれぞれ連続的に供給し、核酸の抽出を完了したものを回収することで、大量の核酸抽出処理を連続して実施することができる。

また、エアポンプ４３からカートリッジ１１に供給するエアは、試料溶液、洗浄液、回収液液体等の性状に影響を及ぼさなければ、他のいかなる気体であってもよい。

核酸抽出装置１００は、複数のカートリッジ１１をまとめて吸引する構成と比較して、個々のカートリッジ１１に対して最適なエア供給時間、エア供給量等を制御することが可能であり、また、試料溶液の液量や粘度等にばらつきがあっても、それによる影響を受けにくくなり、核酸の抽出処理のタクトを速めることができ、核酸抽出の対象を広げることができ、装置の汎用性を高めることができる。例えば、複数のカートリッジを同時にエア供給を行う構成にあっては、一部のカートリッジの加圧エア供給が終了した場合でも、他のカートリッジに加圧エア供給が完了しない場合には、加圧エア供給を完了させることができない。即ち、複数のカートリッジ１１が全て完了するまでは次の工程に移行できなくなる。これに対して本実施形態の核酸抽出装置１００によれば、各カートリッジを個々に順次処理を行うので、他のカートリッジによる影響を受けることがなく、最適な処理を最短の時間で実施することが可能となる。

また、１つのカートリッジ１１だけにエアを供給するだけなので、複数のカートリッジ１１に同時に供給する場合と比較してエアポンプ４３の能力を下げることができる。もって、小型のエアポンプ４３が使用可能となり設置スペースが少なく、コンパクトな構成にできる。
さらに、カートリッジ１１を均等な配列ピッチで設け、加圧ノズル４１に対する分注ノズル５１ｒ、５１ｗの配列ピッチをカートリッジ１１の配列ピッチの整数倍とすることで、複数の異なるカートリッジ１１に対して分注処理と加圧処理を同時に実施することもでき、処理時間の短縮が図られる。なお、カートリッジ１１、廃液容器１２、回収容器１３は、直線状に配列する他にも円弧状等の曲線状に配列させてもよい。例えば円弧状に配列した場合には、支軸を中心とするアームを用いることで円弧状の各位置に加圧エア供給や分注を行うことができる。

本発明に係る核酸抽出方法は、洗浄液を分注して放置させる時間と回収液を分注して放置させる時間のうち少なくとも一方を所定の時間に制御するものである。
図１０は、本発明に係る核酸抽出工程の手順を示すフローチャートである。以下に説明する核酸抽出工程では、既に述べた核酸抽出装置１００を用いることとする。

図１０に示すように、先ずカートリッジ１１に核酸を含む試料溶液Ｓを注入する（ステップＳ１０１）。この試料溶液Ｓを収容したカートリッジ１１に加圧エアを導入し（ステップＳ１０２）、洗浄液Ｗを分注する（ステップＳ１０３）。洗浄液Ｗを分注した後、カートリッジ１１に加圧エアを導入する前にそのまま放置することで所定の時間だけ核酸を分注した洗浄液Ｗに放置させる（ステップＳ１０４）。そして、この所定の時間が経過した後、清浄液Ｗを廃液容器１２に排出する（ステップＳ１０５）。

洗浄液Ｗを放置させる時間としては、５０秒から１０００秒の範囲に制御することが好ましく、１００秒から３００秒の範囲に制御することがより好ましい。

洗浄液Ｗを分注した後、カートリッジ１１に加圧エアを導入する前に所定の時間だけ核酸を分注した洗浄液Ｗに放置させることで、回収処理の後で抽出される核酸の量を増加させることができる。

次に、回収液Ｒを分注（ステップＳ１０６）する。回収液Ｒを分注した後、カートリッジ１１に加圧エアを導入する前にそのまま放置することで所定の時間だけ核酸を分注した回収液Ｒに放置させる（ステップＳ１０７）。そして、この所定の時間が経過した後、回収液Ｒを回収容器１３に排出する（ステップＳ１０８）。

回収液Ｒを放置させる時間としては、２０秒から３００秒の範囲に制御することが好ましく、２５秒から６０秒の範囲に制御することがより好ましい。

回収液Ｒを分注した後、カートリッジ１１に加圧エアを導入する前に所定の時間だけ核酸を分注した回収液Ｒに放置させることで、抽出される核酸の量を増加させることができる。

洗浄液Ｗを分注して放置させる時間又は回収液Ｒを分注して放置させる時間を、所定の時間に制御すれば、抽出できる核酸の量を増加させるという効果を得ることができる。また、洗浄液Ｗを分注して放置させる時間と回収液Ｒを分注して放置させる時間との両方をそれぞれ所定の時間に制御すれば、抽出できる核酸の量をより一層増加させることができる。

例えば、洗浄液Ｗのみを所定の時間だけ放置させる場合には、図１０においてステップＳ１０７で示す回収液Ｒを放置する手順を省略する。一方、回収液Ｒのみを所定の時間だけ放置させる場合には、図１０においてステップＳ１０４で示す洗浄液Ｗを放置する手順を省略する。

図３を参照して、洗浄液を分注して放置させる時間及び回収液を分注して放置させる時間をそれぞれ所定の時間に制御する機構を説明する。
図３に示すように、制御部７０は、洗浄処理時において、洗浄液Ｗの分注後、カートリッジ１１に加圧エアの送給しないように、エアポンプ４３，リリーフバルブ４４及び加圧ノズル４１を制御する。そして、カートリッジ１１内で核酸を洗浄液Ｗに所定の時間だけ浸し、再び、制御部７０によってエアポンプ４３，リリーフバルブ４４及び加圧ノズル４１を制御して加圧エアを送給し、カートリッジ１１から洗浄液Ｗを排出する。また、制御部７０は、回収処理時において、回収液Ｒの分注後、カートリッジ１１に加圧エアの送給しないように、エアポンプ４３，リリーフバルブ４４及び加圧ノズル４１を制御する。そして、カートリッジ１１内で核酸を回収液Ｒに所定の時間だけ浸し、再び、制御部７０によってエアポンプ４３，リリーフバルブ４４及び加圧ノズル４１を制御して加圧エアを送給し、カートリッジ１１から回収液Ｒを排出する。本実施形態において制御部７０が放置時間制御手段として機能する。

本実施形態において、洗浄液Ｗを分注して放置させる時間及び回収液Ｒを分注して放置させる時間をそれぞれ所定の時間に制御を制御部７０によって行う機構としたがこれに限定されない。例えば、洗浄液Ｗ及び回収液Ｒを分注した後に、それぞれ所定の時間だけカートリッジ１１内で放置させるため、加圧エアの送給を停止するようにエアポンプ４３，リリーフバルブ４４及び加圧ノズル４１と協働するエア供給停止部を設けてもよい。

次に、前記のカートリッジ１１が備える核酸吸着性多孔膜（核酸吸着性多孔質体）１１ｂについて詳細に説明する。
前記カートリッジ１１に内有する核酸吸着性多孔膜１１ｂは、基本的には核酸が通過可能な多孔性であり、その表面は試料溶液中の核酸を化学的結合力で吸着する特性を有し、洗浄液による洗浄時にはその吸着を保持し、回収液による回収時に核酸の吸着力を弱めて離すように構成されてなる。

前記核酸抽出カートリッジ１１に内有する核酸吸着性多孔膜１１ｂは、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であることを特徴とする。これは、多孔性膜側の使用条件で「イオン化」していないことを意味し、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜が引き合うようになると推定される。これにより分離性能に優れ、しかも洗浄効率よく、核酸を単離精製することができる。好ましくは、核酸吸着性多孔性膜は、親水基を有する多孔性膜であり、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜の親水基同士が引きあるようになると推定される。

親水基を有する多孔性膜とは、多孔性膜を形成する材料自体が、親水性基を有する多孔性膜、または多孔性膜を形成する材料を処理またはコーティングすることによって親水基を導入した多孔性膜を意味する。多孔性膜を形成する材料は有機物、無機物のいずれでも良い。例えば、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する有機材料である多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する無機材料である多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜などを使用することができるが、加工の容易性から、多孔性膜を形成する材料は有機高分子などの有機材料を用いることが好ましい。

親水基とは、水との相互作用を持つことができる有極性の基（原子団）を指し、核酸の吸着に関与する全ての基（原子団）が当てはまる。親水基としては、水との相互作用の強さが中程度のもの（化学大事典、共立出版株式会社発行、「親水基」の項の「あまり親水性の強くない基」参照）が良く、例えば、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、オキシエチレン基、アミノ基、アミド基などを挙げることができる。好ましくは水酸基である。

本発明で実施可能な親水基を有する多孔性膜としては、アミド基を有する有機材料の多孔性膜を挙げることができる。アミド基を有する有機材料としては、ポリアミドを好ましく用いることができる。ポリアミドとしては、フィブロイン、ポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリアクリルアミド、ナイロン４６、ナイロン６６、ナイロン６１０、ナイロン６１２、ナイロン６、ナイロン７、ナイロン１１、ナイロン１２が挙げられるが特にこれらに限定されることはない。また、N-メチル変性ナイロン、N-アルコキシメチル変性ナイロン、N-アルキルチオメチル変性ナイロン等の変性ナイロンも用いることができる。ポリアミドの多孔性膜については、米国特許第２,７８３,８９４号、同第３，４０８，３１５号、同第４，３４０，４７９号、同第４，３４０，４８０号、同第４，４５０，１２６号、ドイツ特許ＤＥ３,１３８,５２５号、特開昭５８−３７８４２号等に記載の原料、方法で得られるものを使用することができるが、これらに限定されるものではない。

本発明で実施可能な水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロース混合物等の多糖類で、形成された多孔性膜を挙げることができるが、特に多糖構造を有する有機材料の多孔性膜を好ましく使用することができる。

さらに、有する多孔性膜の有機材料としては、ビニルアシレートの重合体の鹸化物、または少なくともビニルアシレートのモノマーユニットを含む２種類以上のモノマー共重合体の鹸化物についても好ましく用いることができる。また、前記ビニルアシレートの重合体の鹸化物、または少なくとも１ｍｏｌ％以上のビニルアシレートのモノマーユニットを含む２種類以上のモノマー共重合体の鹸化物の鹸化率が１％以上であることが好ましく、さらに前記ビニルアシレートのアシル基がアセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、バレル基、ペプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基の少なくとも一つ以上から選ばれることが好ましい。

前記の多糖構造としては、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、アガロース、デキストリン、アミロース、アミロペクチン、デンプン、グリコーゲン、プルラン、マンナン、グルコマンナン、リケナン、イソリケナン、ラミナラン、カラギーナン、キシラン、フルクタン、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、キチン、キトサン等を挙げることができ、さらに前記いずれかの多糖構造の誘導体についても挙げることができ、特にエステル誘導体が好ましく用いることができる。多糖構造およびその誘導体であれば前記に挙げた材料に限定されることはない。
また、前記いずれかの多糖構造のエステル誘導体の鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記多糖構造のエステル誘導体のエステルとしては、カルボン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、ホスホン酸エステル、ピロリン酸エステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記いずれかの多糖構造の、カルボン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、ホスホン酸エステル、ピロリン酸エステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造のカルボン酸エステルとしては、アルキルカルボニルエステル、アルケニルカルボニルエステル、芳香族カルボニルエステル、芳香族アルキルカルボニルエステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記いずれかの多糖構造のアルキルカルボニルエステル、アルケニルカルボニルエステル、芳香族カルボニルエステル、芳香族アルキルカルボニルエステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造のアルキルカルボニルエステルのエステル基としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、バレル基、ペプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基のいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、バレル基、ペプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基のいずれか一つ以上から選ばれるエステル基を持つ前記いずれかの多糖構造の鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造のアルケニルカルボニルエステルのエステル基がアクリル基、メタクリル基のいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記アクリル基、メタクリル基のいずれか一つ以上から選ばれるエステル基を持つ前記いずれかの多糖構造の鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造の芳香族カルボニルエステルのエステル基がベンゾイル基、ナフタロイル基の少なくとも一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記ベンゾイル基、ナフタロイル基の少なくとも一つ以上から選ばれるエステル基を持つ前記いずれかの多糖構造の鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造の硝酸エステルとしては、ニトロセルロース、ニトロヘミセルロース、ニトロデキストラン、ニトロアガロース、ニトロデキストリン、ニトロアミロース、ニトロアミロペクチン、ニトログリコーゲン、ニトロプルラン、ニトロマンナン、ニトログルコマンナン、ニトロリケナン、ニトロイソリケナン、ニトロラミナラン、ニトロカラギーナン、ニトロキシラン、ニトロフルクタン、ニトロアルギン酸、ニトロヒアルロン酸、ニトロコンドロイチン、ニトロキチン、ニトロキトサンなどを好ましく用いることができる。
また、前記、ニトロセルロース、ニトロヘミセルロース、ニトロデキストラン、ニトロアガロース、ニトロデキストリン、ニトロアミロース、ニトロアミロペクチン、ニトログリコーゲン、ニトロプルラン、ニトロマンナン、ニトログルコマンナン、ニトロリケナン、ニトロイソリケナン、ニトロラミナラン、ニトロカラギーナン、ニトロキシラン、ニトロフルクタン、ニトロアルギン酸、ニトロヒアルロン酸、ニトロコンドロイチン、ニトロキチン、ニトロキトサンなどの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造の硫酸エステルとしては、セルロース硫酸、ヘミセルロース硫酸、デキストラン硫酸、アガロース硫酸、デキストリン硫酸、アミロース硫酸、アミロペクチン硫酸、グリコーゲン硫酸、プルラン硫酸、マンナン硫酸、グルコマンナン硫酸、リケナン硫酸、イソリケナン硫酸、ラミナラン硫酸、カラギーナン硫酸、キシラン硫酸、フルクタン硫酸、アルギン酸硫酸、ヒアルロン酸硫酸、コンドロイチン硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロース硫酸、ヘミセルロース硫酸、デキストラン硫酸、アガロース硫酸、デキストリン硫酸、アミロース硫酸、アミロペクチン硫酸、グリコーゲン硫酸、プルラン硫酸、マンナン硫酸、グルコマンナン硫酸、リケナン硫酸、イソリケナン硫酸、ラミナラン硫酸、カラギーナン硫酸、キシラン硫酸、フルクタン硫酸、アルギン酸硫酸、ヒアルロン酸硫酸、コンドロイチン硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造のスルホン酸エステルとしては、アルキルスルホン酸エステル、アルケニルスルホン酸エステル、芳香族スルホン酸エステル、芳香族アルキルスルホン酸エステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記いずれかの多糖構造のアルキルスルホン酸エステル、アルケニルスルホン酸エステル、芳香族スルホン酸エステル、芳香族アルキルスルホン酸エステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造のリン酸エステルとしては、セルロースリン酸、ヘミセルロースリン酸、デキストランリン酸、アガロースリン酸、デキストリンリン酸、アミロースリン酸、アミロペクチンリン酸、グリコーゲンリン酸、プルランリン酸、マンナンリン酸、グルコマンナンリン酸、リケナンリン酸、イソリケナンリン酸、ラミナランリン酸、カラギーナンリン酸、キシランリン酸、フルクタンリン酸、アルギン酸リン酸、ヒアルロン酸リン酸、コンドロイチンリン酸、キチンリン酸、キトサンリン酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロースリン酸、ヘミセルロースリン酸、デキストランリン酸、アガロースリン酸、デキストリンリン酸、アミロースリン酸、アミロペクチンリン酸、グリコーゲンリン酸、プルランリン酸、マンナンリン酸、グルコマンナンリン酸、リケナンリン酸、イソリケナンリン酸、ラミナランリン酸、カラギーナンリン酸、キシランリン酸、フルクタンリン酸、アルギン酸リン酸、ヒアルロン酸リン酸、コンドロイチンリン酸、キチンリン酸、キトサンリン酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造のホスホン酸エステルとしては、セルロースホスホン酸、ヘミセルロースホスホン酸、デキストランホスホン酸、アガロースホスホン酸、デキストリンホスホン酸、アミロースホスホン酸、アミロペクチンホスホン酸、グリコーゲンホスホン酸、プルランホスホン酸、マンナンホスホン酸、グルコマンナンホスホン酸、リケナンホスホン酸、イソリケナンホスホン酸、ラミナランホスホン酸、カラギーナンホスホン酸、キシランホスホン酸、フルクタンホスホン酸、アルギン酸ホスホン酸、ヒアルロン酸ホスホン酸、コンドロイチンホスホン酸、キチンホスホン酸、キトサンホスホン酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロースホスホン酸、ヘミセルロースホスホン酸、デキストランホスホン酸、アガロースホスホン酸、デキストリンホスホン酸、アミロースホスホン酸、アミロペクチンホスホン酸、グリコーゲンホスホン酸、プルランホスホン酸、マンナンホスホン酸、グルコマンナンホスホン酸、リケナンホスホン酸、イソリケナンホスホン酸、ラミナランホスホン酸、カラギーナンホスホン酸、キシランホスホン酸、フルクタンホスホン酸、アルギン酸ホスホン酸、ヒアルロン酸ホスホン酸、コンドロイチンホスホン酸、キチンホスホン酸、キトサンホスホン酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造のリン酸エステルとしては、セルロースピロリン酸、ヘミセルロースピロリン酸、デキストランピロリン酸、アガロースピロリン酸、デキストリンピロリン酸、アミロースピロリン酸、アミロペクチンピロリン酸、グリコーゲンピロリン酸、プルランピロリン酸、マンナンピロリン酸、グルコマンナンピロリン酸、リケナンピロリン酸、イソリケナンピロリン酸、ラミナランピロリン酸、カラギーナンピロリン酸、キシランピロリン酸、フルクタンピロリン酸、アルギン酸ピロリン酸、ヒアルロン酸ピロリン酸、コンドロイチンピロリン酸、キチンピロリン酸、キトサンピロリン酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロースピロリン酸、ヘミセルロースピロリン酸、デキストランピロリン酸、アガロースピロリン酸、デキストリンピロリン酸、アミロースピロリン酸、アミロペクチンピロリン酸、グリコーゲンピロリン酸、プルランピロリン酸、マンナンピロリン酸、グルコマンナンピロリン酸、リケナンピロリン酸、イソリケナンピロリン酸、ラミナランピロリン酸、カラギーナンピロリン酸、キシランピロリン酸、フルクタンピロリン酸、アルギン酸ピロリン酸、ヒアルロン酸ピロリン酸、コンドロイチンピロリン酸、キチンピロリン酸、キトサンピロリン酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造のエーテル誘導体としては、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチル−カルバモイルエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、シアノエチルセルロース、カルバモイルエチルセルロース等を用いることができるが、これらに限定されることはない。好ましくは、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースを用いることができる。

前記いずれかの多糖構造の水酸基が、任意の置換度でハロゲン化したものについても好ましく用いることができる。

前記セルロースエステル誘導体について、以下に記す。前記セルロースエステル誘導体原料のセルロースとしては、綿花リンタや木材パルプ（広葉樹パルプ，針葉樹パルプ）、麻、酢酸菌培養過程で生成するセルロース等の天然セルロース、それらを酸加水分解、機械的に粉砕、爆砕処理、高温下に押出機処理によって重合度を調整したものなどがあり、何れの原料セルロースから得られるセルロースエステル誘導体でも使用でき、場合により混合して使用してもよい。これらの原料セルロースについての詳細な記載は、例えばプラスチック材料講座（１７）繊維素系樹脂（丸澤、宇田著、日刊工業新聞社、１９７０年発行）に見られる。

それによると、セルロースの分子量は広範囲であり例えば天然セルロースは６０万〜１５０万（重合度概算３５００〜１万）であり、精製リンタは８万〜５０万（重合度概算５００〜３０００）であり、木材パルプは８万〜１３４万（重合度概算５００〜２１００）である。ここで分子量は、セルロースあるいはその誘導体の強度的性質は大きく影響し、分子量が小さくなるとある重合度から急にその力学的強度が低下するが、本発明の核酸吸着性多孔性膜の原料としては問題なく使用できる。

前記核酸吸着性多孔性膜の一例として、セルロースからエステル化して得られるセルロースエステル誘導体の多孔性膜が使用できるが、特に好ましい前述のセルロースがそのまま利用できる訳ではなく、リンタやパルプを精製して精製リンタと精製高級木材パルプとして用いられる。リンタは綿実に綿繊維の中で繊維長が短い短繊維でありα−セルロース含量（例えば８８〜９２質量％）が多く純度が高く、不純物も少ない。この粗リンタはゴミ取り、アルカリ蒸煮、漂白、酸処理、脱水および乾燥によって精製リンタを得ることができる。これらの詳細はプラスチック材料講座（１７）繊維素系樹脂（丸澤、宇田著、日刊工業新聞社、１９７０年発行）の２５〜２８頁に記述され、表２・３にその特性が記載されており、本発明でより好ましい精製リンタが得られる。

さらに、精製パルプについても同著の２８〜３２頁に記述されており、表２・４に特性も記載されており、該手法などで精製されたパルプもセルロースエステル誘導体原料として好ましい。ここで、精製された綿花リンタと木材パルプを混合して用いることも好ましく、その割合は特に限定されないが好ましくは５／９５〜９５／５であり、より好ましくは１０／９０〜９０／１０である。混合することによって溶解性を向上させて、セルロースエステル誘導体多孔性膜の面状、力学特性を改良することができる。

この中で、パルプの純度の指標となるα−セルロース含有量は、例えば８０〜１００質量％程度の範囲から選択でき、木材パルプでは、通常８５〜９８％程度である。本発明では低純度パルプ、例えばα−セルロース含有量８０〜９６％（特に９２〜９６％）程度のパルプも使用できる。これらのパルプのうち、通常木材パルプが使用される。

さらに本発明の核酸吸着性多孔性膜においては、特開平１１−１３０３０１号公報に記載のように、パルプあるいは綿花中の中性構成糖成分には、グルコースが主成分であるがマンノースとキシロースとを含んでいてもよい。その比率は特に限定されないが、マンノース／キシロース（モル比）＝０．３５／１〜３．０／１、好ましくは０．３５／１〜２．５／１、さらに好ましくは０．３５／１〜２／１である。その場合に作製されたセルローストリアセテートにおいて、マンノースおよびキシロースの総含有量は、０．０１〜５モル％、好ましくは０．１〜４モル％である。なお、「マンノース」「キシロース」は、パルプ中に含まれるヘミセルロース（キシラン，グルコマンナンなど）の主たる構成糖である。これらの原料パルプおよび得られたセルロースエステル誘導体（セルローストリアセテートについて）の構成糖成分は、具体的には特開平１１−１３０３０１号に記載の方法で分析できる。

また、セルロースの多孔性膜としては、再生セルロースの多孔性膜を好ましく使用する事ができる。再生セルロースとは、アセチルセルロースの固体の表面または全体を、鹸化処理によりセルロース化したもの、セルロースの銅アンモニア溶液から作製したもの、セルロースのビスコース溶液から作製したもの、セルロースのアルカリ溶液から作製したものを挙げることができ、本来のセルロースとは、結晶状態等の点で異なっている。セルロースにはI、II、III、IVの結晶型が存在するが、本発明においては、どの結晶型でも好ましく使用でき、またI、II、III、IVの結晶型それぞれが任意の割合で含まれていてよい。アセチルセルロース多孔性膜から作製する再生セルロース多孔性膜については、特公昭４５−４６３３号公報、特開昭５６−１００６０４号公報、等に記載の原料、方法で得られるものを使用することができるが、これらに限定するものではない。また、セルロースの銅アンモニア溶液から作製する再生セルロース多孔性膜については、特開昭５８−８９６２５号公報、特開昭５８−８９６２６号公報、特開昭５８−８９６２７号公報、特開昭５８−８９６２８号公報、特開昭５９−４５３３３号公報、特開昭５９−４５３３４号公報、特開昭５９−１９９７２８号公報、特開昭６１−２７４７０７号公報、特開昭６２−１４０３号公報、特開昭６３−１６１９７２号公報、特開平７−３３０９４５号公報、等に記載の原料、方法で得られるものを使用することができるが、これらに限定するものではない。また、セルロースにアルカリと二硫化炭素を作用させて得られるビスコース溶液からも同様に原液組成や凝固方法を工夫することによって、再生セルロース多孔膜が得られ、本発明に使用することができる。また、セルロースのアルカリ溶液から作製する再生セルロース多孔性膜は、特開昭６２−２４０３２８号公報、特開昭６２−２４０３２９号公報、特開平１−１８８５３９号公報、等に記載の原料、方法で得られるものを使用することができるが、これらに限定されるものではない。

本発明の核酸吸着性多孔性膜においては、前記セルロースエステル誘導体の粘度平均重合度が２００〜３０００であることが好ましい。また、前記セルロースエステル誘導体の重量平均分子量と数平均分子量の比が０．８〜２であることが好ましい。さらに、前記セルロースエステル誘導体が酸解離指数１．９３〜４．５の酸またはその塩を含有することが好ましい。

前記セルロースエステル誘導体が、残存酢酸量あるいは炭素数３〜２２の脂肪酸が０．５質量％以下であることが好ましい。また、セルロースエステル誘導体が、アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属の少なくとも一種を１ｐｐｂ〜１００００ｐｐｍ含有していることが好ましい。さらに、前記セルロースアシレートが、アルミニウム、ビスマス、ケイ素、重金属（クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、砒素、銀、カドミウム、スズ、アンチモン、金、白金、水銀、鉛など）の少なくとも一種を、１ｐｐｂ〜１０００ｐｐｍ含有したことが好ましい。

特に好ましいセルロースエステル誘導体の多孔性膜としては、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物から成る有機高分子の多孔性膜を挙げることができる。アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物として、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物を好ましく使用する事ができる。特にトリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物を好ましく使用することができる。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９である事が好ましく、９０：１０〜５０：５０である事がより好ましい。

以上記述したセルロースエステル誘導体については、特開平１０−４５８０３、特開平１１−２６９３０４、特開平８−２３１７６１、特開平８−２３１７６１、特開平１０−６０１７０、特開平９−４０７９２、特開平１１−５８５１、特開平１１−２６９３０４、特開平９−９０１０１、特開昭５７−１８２７３７、特開平４−２７７５３０、特開平１１−２９２９８９、特開平１２−１３１５２４、特開平１２−１３７１１５号などに記載のセルロースエステル誘導体を利用することも好ましい。これらの素材も、本発明の核酸吸着性多孔性膜に対しては特に限定されるものではない。

セルロースの構造を評価する手段として、Ｘ線解析もまた用いられる。それによるとセルロース分子は繊維軸方向に平行に配列し水素結合によって引き合い、５個のセルロース分子のセルビオース単位によって１個の単位胞を形成していることが記載されている。また、Ｘ線法によればその結晶化度は天然セルロースで約７０％であることが示されており、これらのセルロースも本発明のセルロースエステル誘導体作製に対して使用できる。

ここで、本発明でも利用されるセルロースはその分析については種々行われており、ＡＳＴＭ ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐａｒｔ １５、 ＴＡＰＰＩ Ｓｔａｎｄａｒｄ （Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｕｌｐ ａｎｄ Ｐａｐｅｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）やＪＩＳ Ｐ ８１０１などに詳細に掲げられている。測定項目としては、灰分、酸化カルシウムと酸化マグネシウムの含量、α−セルロース、β−セルロース、銅価などである。

鹸化とは、エステル誘導体を鹸化処理液(例えば水酸化ナトリウム水溶液)に接触させることを言う。これにより、鹸化処理液に接触したエステル誘導体のエステル部位が加水分解され、水酸基が導入される。鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度、処理温度、処理時間を変えて鹸化処理を行えば良い。鹸化率は、ＮＭＲ、ＩＲ又はＸＰＳにより、容易に測定することができる（例えば、カルボニル基のピーク減少の程度で定めることができる）。

多糖構造を有する有機材料の多孔性膜の具体例としては、特開２００３−１２８６９１号公報に記載の、アセチルセルロースの表面鹸化物が挙げられる。アセチルセルロースの表面鹸化物とは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理したものであり、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物も好ましく使用することができる。より好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物を使用することである。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９であることが好ましい。更に好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の混合比は、９０：１０〜５０：５０であることである。この場合、鹸化処理の程度（鹸化率）で固相表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。核酸の分離効率をあげるためには、水酸基の量（密度）が多い方が好ましい。例えば、トリアセチルセルロース等のアセチルセルロースの場合には、鹸化率（表面鹸化率）が約５％以上であることが好ましく、１０％以上であることが更に好ましい。また、水酸基を有する有機高分子の表面積を大きくするために、アセチルセルロースの多孔性膜を鹸化処理することが好ましい。この場合、多孔性膜は、表裏対称性の多孔性膜を使うと膜の表裏を区別することなく製造できるメリットがあり好ましく、また、表裏非対称性の多孔性膜を使用することで目詰まりのリスクを低減できるメリットがあり、好ましく使用することができる。

親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法として、ポリマー鎖内または側鎖に親水基を有すグラフトポリマー鎖を多孔性膜に結合することができる。
有機材料の多孔性膜にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする２つの方法がある。

まず、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる方法においては、ポリマーの末端または側鎖に多孔性膜と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と、多孔性膜の官能基とを化学反応させることでグラフトさせることができる。多孔性膜と反応する官能基としては、多孔性膜の官能基と反応し得るものであれば特に限定はないが、例えば、アルコキシシランのようなシランカップリング基、イソシアネート基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、カルボニル基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、アリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基、アミド基、ヒドラジド基、アルデヒド基、チオール基、スクシイミド基等を挙げることができる。

ポリマーの末端、または側鎖に反応性官能基を有するポリマーとして特に有用な化合物は、トリアルコキシシリル基をポリマー末端に有するポリマー、アミノ基をポリマー末端に有するポリマー、カルボキシル基をポリマー末端に有するポリマー、エポキシ基をポリマー末端に有するポリマー、イソシアネート基をポリマー末端に有するポリマーが挙げられる。この時に使用されるポリマーとしては、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、具体的には、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、ポリ乳酸、ポリケトン、ポリエーテルイミド、ポリアミドイミド、ポリフェニレンスルホン、ポリフェニレンスルフィドスルホン、ナイロン、N-メチル変性ナイロン、N-アルコキシメチル変性ナイロン、N-アルキルチオメチル変性ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリアリルアミン、ポリウレタンなどを挙げることができる。

多孔性膜を基点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させ、グラフトポリマー鎖を形成させる方法は、一般的には表面グラフト重合と呼ばれる。表面グラフト重合法とは、プラズマ照射、光照射、加熱などの方法で基材表面上に活性種を与え、多孔性膜と接するように配置された重合可能な二重結合を有する化合物を重合によって多孔性膜と結合させる方法を指す。
基材に結合しているグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば、親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。

特に有用な親水基を有するモノマーの具体例としては、次のモノマーを挙げることができる。例えば、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノメタクリレート等の水酸性基含有モノマーを特に好ましく用いることができる。また、アクリル酸、メタアクリル酸等のカルボキシル基含有モノマー、もしくはそのアルカリ金属塩及びアミン塩、アクリルアミド等も好ましく用いることができる。

親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができるが、多糖構造を有するポリマーが好ましい。

また、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。

親水基を有する無機材料である多孔性膜としては、シリカ化合物を含有する多孔性膜を挙げることができる。シリカ化合物を含有する多孔性膜としては、ガラスフィルターを挙げることができる。また、特許公報第３０５８３４２号に記載されているような、多孔質のシリカ薄膜を挙げることができる。この多孔質のシリカ薄膜とは、二分子膜形成能を有するカチオン型の両親媒性物質の展開液を基板上に展開した後、基板上の液膜から溶媒を除去することによって両親媒性物質の多層二分子膜薄膜を調整し、シリカ化合物を含有する溶液に多層二分子膜薄膜を接触させ、次いで前記多層二分子膜薄膜を抽出除去することで作製することができる。

親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する２つの方法がある。
多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる場合は、グラフトポリマー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。
親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、前記、親水基を持たない有機材料の多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法において、記載した親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。

親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができる。

親水基を持たない無機材料の多孔性膜としては、アルミニウム等の金属、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス、もしくはニューセラミックス、シリコン、活性炭、アルミノケイ酸塩等を加工して作製した多孔性膜を挙げることができる。

また、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。

前記核酸吸着性固相担体調製工程において用途に応じた種々の添加剤（例えば、可塑剤、静電防止剤、劣化防止剤、紫外線防止剤、界面活性剤、剥離剤、着色剤、補強剤、架橋剤など）を加えることができる。またその添加する時期はドープ作製工程において何れでも添加しても良いが、ドープ調製工程の最後の調製工程に添加剤を添加し調製する工程を加えて行ってもよい。

前記核酸吸着性固相担体には、必要に応じて可塑剤を含有することができ、特開２００２−２６５６３６に記載のリン酸エステル、カルボン酸エステル、また、特開平２−６８２６に記載の多価アルコール、また、特開平５−１９４７８８号、特開昭６０−２５００５３号、特開平４−２２７９４１号、特開平６−１６８６９号、特開平５−２７１４７１号、特開平７−２８６０６８号、特開平５−５０４７号、特開平１１−８０３８１号、特開平７−２０３１７号、特開平８−５７８７９号、特開平１０−１５２５６８号、特開平１０−１２０８２４号、特開平１１−１２４４４５号記載の（ジ）ペンタエリスリトールエステル類、特開平１１−２４６７０４号記載のグリセロールエステル類、特開２０００−６３５６０号記載のジグリセロールエステル類、特開平１１−９２５７４号記載のクエン酸エステル類、特開平１１−９０９４６号記載の置換フェニルリン酸エステル類、特開昭５６−１００６０４号の各公報などに記載されている可塑剤が好ましく用いることができる。これらの記載によると可塑剤だけでなくその利用方法あるいはその特性についての好ましい記載が多数あり、本発明の核酸吸着性固相担体においても好ましく用いられるものである。

前記核酸吸着性固相担体には、取扱の際に膜が帯電するのを防ぐ目的で、静電防止剤を添加することができる。この静電防止剤については、イオン導電性物質や導電性微粒子が好ましく用いられる。ここでイオン導電性物質とは電気伝導性を示し、電気を運ぶ担体であるイオンを含有する物質のことであるが、例としてはイオン性高分子化合物を挙げることができる。イオン性高分子化合物としては、特公昭４９−２３８２８号、特公昭４９−２３８２７号、特公昭４７−２８９３７号の各公報に見られるようなアニオン性高分子化合物；特公昭５５−７３４号、特開昭５０−５４６７２号、特公昭５９−１４７３５号、特公昭５７−１８１７５号、特公昭５７−１８１７６号、特公昭５７−５６０５９号の各公報などに見られるような、主鎖中に解離基を持つアイオネン型ポリマー；特公昭５３−１３２２３号、特公昭５７−１５３７６号、特公昭５３−４５２３１号、特公昭５５−１４５７８３号、特公昭５５−６５９５０号、特公昭５５−６７７４６号、特公昭５７−１１３４２号、特公昭５７−１９７３５号、特公昭５８−５６８５８号、特開昭６１−２７８５３号、特公昭６２−９３４６号の各公報に見られるような、側鎖中にカチオン性解離基を持つカチオン性ペンダント型ポリマー；等を挙げることができる。これらのうち、好ましいのは導電性物質が微粒子状をしており、前記核酸吸着性固相担体中にこれらを微分散し添加したものであって、これらに用いられる好ましい導電性物質として、金属酸化物やこれらの複合酸化物からなる導電性微粒子及び特開平９−２０３８１０号公報に記載されているようなアイオネン導電性ポリマー或いは分子間架橋を有する第４級アンモニウムカチオン導電性ポリマー粒子などを含有することが望ましい。好ましい粒径としては５ｎｍ〜１０μｍの範囲であり、更に好ましい範囲は用いられる微粒子の種類に依存する。導電性微粒子である金属酸化物の例としては、ＺｎＯ、ＴｉＯ₂ 、ＳｎＯ₂ 、Ａｌ₂ Ｏ₃ 、Ｉｎ₂ Ｏ₃ 、ＳｉＯ₂ 、ＭｇＯ、ＢａＯ、ＭｏＯ₂ 、Ｖ₂ Ｏ₅ 等、或いはこれらの複合酸化物が好ましく、特にＺｎＯ、ＴｉＯ₂ 及びＳｎＯ₂ が好ましい。異種原子を含む例としては、例えばＺｎＯに対してはＡｌ、Ｉｎ等の添加、ＴｉＯ₂ に対してはＮｂ、Ｔａ等の添加、又ＳｎＯ₂ に対しては、Ｓｂ、Ｎｂ、ハロゲン元素等の添加が効果的である。これら異種原子の添加量は０．０１〜２５ｍｏｌ％の範囲が好ましいが、０．１〜１５ｍｏｌ％の範囲が特に好ましい。また、これらの導電性を有するこれら金属酸化物粉体の体積抵抗率は１０７Ωｃｍ以下、特に１０５Ωｃｍ以下であって、１次粒子径が１００Å以上０．２μｍ以下で、高次構造の長径が３０ｎｍ以上６μｍ以下である特定の構造を有する粉体を核酸吸着性固相担体に体積分率で０．０１％以上２０％以下含んでいることが好ましい。また、分散性粒状ポリマーとしての架橋型カチオン性導電性ポリマーの特徴は、粒子内のカチオン成分を高濃度、高密度に持たせることができるため、優れた導電性を有しているばかりでなく、低相対湿度下においても導電性の劣化は見られず、粒子同志も分散状態ではよく分散されているにもかかわらず、膜形状の場合、流延後造膜過程において粒子同志の接着性もよいため膜強度も強く、耐薬品性に優れている。また、架橋型のカチオン性導電性ポリマーである分散性粒状ポリマーは一般に約１０ｎｍ〜１０００ｎｍの粒子サイズ範囲にあり、好ましくは２０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の粒子サイズが用いられる。ここで用いる分散性粒状性ポリマーとは、視覚的観察によって透明又はわずかに濁った溶液に見えるが、電子顕微鏡の下では粒状分散物として見えるポリマーである。更にまた、有機電子導電性有機化合物も利用できる。例えば、ポリチオフェン、ポリピロール、ポリアニリン、ポリアセチレン、ポリフォスファゼンなどである。これらは、酸供与材としてポリスチレンスルフォン酸、過塩素酸などとのコンプレックスで好ましく用いられる。

前記核酸吸着性固相担体には、劣化防止剤（例、酸化防止剤、過酸化物分解剤、ラジカル禁止剤、金属不活性化剤、酸捕獲剤、アミン）や紫外線防止剤を添加することができる。これらの劣化防止剤や紫外線防止剤については、特開昭６０−２３５８５２号、特開平３−１９９２０１号、特開平５−１９０７０７号、特開平５−１９４７８９号、特開平５−２７１４７１号、特開平６−１０７８５４号、特開平６−１１８２３３号、特開平６−１４８４３０号、特開平７−１１０５６号、特開平７−１１０５５号、特開平７−１１０５６号、特開平８−２９６１９号、特開平８−２３９５０９号、特開平７−１１０５６号、特開２０００−２０４１７３号、特開平５−１９７０７３号、特開平５−１９４７８９号、特開平６−１０７８５４号、特開昭６０−２３５８５２号、特開平１２−１９３８２１号、特開平８−２９６１９号、特開平６−１１８２３３号、特開平６−１４８４３０号、特開２００２−２６５６３６号、特開平５−１９７０７３号の各公報などに記載されているものが好ましく用いることができる。特に好ましい劣化防止剤の例としては、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を挙げることができる。

これらの添加量は、調製する溶液（ドープ）の０．０１〜１質量％であることが好ましく、０．０１〜０．０８質量％であることがさらに好ましい。添加量が０．０１質量％未満であると、劣化防止剤の効果がほとんど認められない。添加量が１質量％を越えると、固相担体表面への劣化防止剤のブリードアウト（滲み出し）が認められる場合がある。本発明で好ましい劣化防止剤は、沸点が２００℃以上、２５℃で液体であるか、または融点が２５〜２５０℃である固体であることが好ましい。更に好ましくは沸点が２５０℃以上、２５℃で液体であるか、融点が２５〜２００℃の固体である劣化防止剤が挙げられる。劣化防止剤が液体の場合は、その精製は通常減圧蒸留によって実施されるが高真空ほど好ましく、例えば１００Ｐａ以下が好ましい。また分子蒸留装置などを用いて精製することも特に好ましい。また可塑剤が固体の場合は、溶媒を用いて再結晶させてろ過、洗浄し乾燥することで実施されることが一般的である。

前記核酸吸着性固相担体には、界面活性剤を添加することができる。界面活性剤については、特開２００２−２６５６３６号公報、特公昭５５−３１４１８号公報、界面活性剤等一覧表２００１年度版（日本界面活性剤工業会）、界面活性剤の応用（幸書房、刈米孝夫著、昭和５５年９月１日発行）等に記載されているものが好ましく用いられるが、これらに限定されるものではない。本発明においては、好ましい界面活性剤はその種類、使用量において特に限定されず、目的とする界面活性特性が得られる量であればよい。

前記核酸吸着性固相担体には、必要であれば製造時の剥離の荷重を小さくするために剥離剤を含有することもできる。前記剥離剤については、界面活性剤が有効であり、リン酸系、スルフォン酸系、カルボン酸系、ノニオン系、カチオン系など特に限定されない。これらは、例えば特開昭６１−２４３８３７号、特開２０００−９９８４７号公報などに記載されている。また、特開平１０−３１６７０１号公報に記載の、酸解離指数ｐＫａ１．９３〜４．５０［好ましくは２．０〜４．４、さらに好ましくは２．２〜４．３（例えば、２．５〜４．０）、特に２．６〜４．３（例えば、２．６〜４．０）程度］の酸またはその塩が剥離剤として好ましい。これらは、無機酸または有機酸のいずれでもよい。酸のｐＫａについては「改訂３版 化学便覧，基礎編II」（（財）日本化学会編，丸善（株）発行）を参照できる。また、特開２００２−２６５６３６号公報に記載の剥離剤についても好ましく用いることができる。これらの記載によると剥離剤だけでなくその利用方法あるいはその特性についての好ましい記載が多数あり、本発明の核酸吸着性固相担体においても好ましく用いられるものである。

前記核酸吸着性固相担体には、着色剤を添加することができる。着色剤については、これまでに公知の色素、染料、顔料、酸化発色色素、還元発色色素、pH指示薬、蛍光色素、カップリング色素、紫外線吸色素、赤外線吸色素、近赤外線吸収色素、感圧色素、フォトクロミック色素、サーモクロミック色素、エレクトロクロミック色素、有機発光色素、光電変換色素、増感色素、２色性色素、エレクトロルミネッセンス色素、食品用色素、有機非線形光学色素、化学発光用色素、医薬品用色素、医療診断用色素、化粧品用色素、半導体レーザー用色素、昇華転写用色素、溶融転写用色素、感熱色素、ロイコ色素、電磁波吸収色素、光導電性色素、帯電性色素等の有機、または無機、または有機無機複合の着色剤を単独または複数種類を所望の濃度で、また界面活性剤や保護ポリマー等の分散剤と併用して所望の濃度で使用することができるが、これらに限定されるものではない。

前記核酸吸着性固相担体には、膜強度を向上させる目的で補強剤を添加することができる。補強剤としては、ガラス繊維、炭素繊維、ケイ素繊維、セルロース繊維、パルプ繊維、チタン酸カリウム繊維、炭化ケイ素ウィスカー、窒化ケイ素ウィスカー、酸化亜鉛ウィスカー、ホウ酸アルミニウムウィスカー、塩基性硫酸マグネシウムおよび繊維状ゾノトライト、チタン酸カリウムウィスカー、シリコンカーバイト(SiC)ウィスカー、ウィスカー状炭酸カルシウムなどが好ましく用いられるが、これらに限定されるものではなく、繊維状または針状結晶状のものであれば使用することができる。また、耐折性を向上させるために合成ポリマーを添加することもでき、特開昭５４−１１０８１に記載されているポリウレタン等を好ましく使用することができるが、これらに限定されるものではない。

前記核酸吸着性固相担体には、架橋剤を添加することができる。架橋剤については、これまでに公知のものが使用できるが、固相担体素材の持つ官能基により適切な種類を選ぶことが好ましい。官能基が水酸基の場合、特開平７−２５６０６６号公報、特開平３−６８４３１号公報などに記載された架橋剤が好ましく使用できるが、これらに限定されるものではない。

前記核酸吸着性固相担体には、湿潤剤を添加することができる。湿潤剤については、特開昭６３−２６２５５０号公報、特開昭６３−２６２５４９号公報、特公昭５５−３１４１８号公報に記載のものが好ましく使用できるが、これらに限定されるものではない。

前記の核酸吸着性多孔性膜は、溶液が内部を通過可能であり、厚さが１０μｍ〜５００μｍである。さらに好ましくは、厚さが５０μｍ〜２５０μｍである。洗浄がし易い点で、厚さが薄いほど好ましい。

前記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、最小孔径が０．２２μｍ以上である。さらに好ましくは、最小孔径が０．５μｍ以上である。また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、最大孔径と最小孔径の比が２以上である多孔性膜を用いる事が好ましい。これにより、核酸が吸着するのに十分な表面積が得られるとともに、目詰まりし難い。さらに好ましくは、最大孔径と最小孔径の比が５以上である多孔性膜を用いる。

前記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、空隙率が５０〜９５％である。さらに好ましくは、空隙率が６５〜８０％である。また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、バブルポイントが、０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ²である。さらに好ましくは、バブルポイントが、０．２〜４ｋｇｆ／ｃｍ²である。

前記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、圧力損失が、０．１〜１００ｋＰａである多孔性膜を用いる事が好ましい。これにより、過圧時に均一な圧力が得られる。さらに好ましくは、圧力損失が、０．５〜５０ｋＰａである多孔性膜を用いる事ができる。ここで、圧力損失とは、膜の厚さ１００μｍあたり、水を通過させるのに必要な最低圧力である。

前記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、また、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ²の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ²あたり１分間で１〜５０００ｍＬである多孔性膜を用いることができる。さらに好ましくは、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ²の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ²あたり１分間で５〜１０００ｍＬである多孔性膜を用いることができる。

前記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、多孔性膜1ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．１μｇ以上である多孔性膜を好ましく使用する事ができる。さらに好ましくは、多孔性膜1ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．９μｇ以上である多孔性膜を用いることができる。

前記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、一辺が５ｍｍの正方形の多孔性膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに、１時間以内では溶解しないが４８時間以内に溶解するセルロース誘導体からなる多孔性膜を好ましく使用する事ができる。また、一辺が５ｍｍの正方形の多孔質膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに１時間以内に溶解するが、ジクロロメタン５ｍＬに浸漬したときには２４時間以内に溶解しないセルロース誘導体からなる多孔性膜を好ましく使用する事ができる。

核酸吸着性多孔性膜中を、核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を一方の面から他方の面へと通過させることが、液を多孔性膜へ均一に接触させることができる点で、好ましい。核酸吸着性多孔性膜中を、核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を核酸吸着性多孔性膜の孔径が大きい側から小さい側に通過させることが、目詰まりし難い点で、好ましい。

核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させる場合の流速は、液の多孔性膜への適切な接触時間を得るために、膜の面積ｃｍ²あたり、２〜１５００μＬ/secである事が好ましい。液の多孔性膜への接触時間が短すぎると十分な分離精製効果が得られず、長すぎると操作性の点から好ましくない。さらに、前記流速は、膜の面積ｃｍ²あたり、５〜７００μＬ/secである事が好ましい。

また、使用する溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、１枚であってもよいが、複数枚を使用することもできる。複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。

少なくとも二個の開口を有する容器内に、前記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。また、少なくとも二個の開口を有する容器内に、前記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を複数枚収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。この場合、少なくとも二個の開口を有する容器内に収容される複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。

複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸吸着性多孔性膜との組合せであっても良い。例えば、ガラスフィルターと再生セルロースの多孔性膜との組合せを挙げることができる。また、複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸非吸着性多孔性膜との組合せであってもよい、例えば、ガラスフィルターと、ナイロンまたはポリスルホンの多孔性膜との組合せを挙げることができる。
そして、以上に説明した核酸吸着性多孔性膜は、カートリッジの形状に応じて、膜状以外の形態にすることができる。例えば、チップ状やブロック状等とすることができる。

核酸分離精製カートリッジは、少なくとも二個の開口を有する容器内に、前記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容する以外、その他の部材を収容していないことが好ましい。前記の容器の材料としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルなどのプラスチックを使用することができる。また、生分解性の材料も好ましく使用することができる。また、前記の容器は透明であっても、着色してあっても良い。

核酸分離精製カートリッジとして、個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段を備えている核酸分離精製カートリッジを使用する事ができる。個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段としては、バーコード、磁気テープなどが挙げられる。

また、少なくとも二個の開口を有する容器内から核酸吸着性多孔性膜を容易に取り出す事が可能になっている構造を有した核酸分離精製カートリッジを使用することもできる。

前記に記載した、各々の溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容する核酸分離精製カートリッジを用いて、以下の工程で核酸を分離精製することができる。すなわち、(a)核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、(b)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジト内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(c)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に洗浄液を注入する工程、(d)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、(e)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に回収液を注入する工程、(f)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程が挙げることができる。

前記(ｂ)、(ｄ)及び(ｆ)の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させるものであり、より好ましくは、前記(ｂ)、(ｄ)及び(ｆ)の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させるものである。核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を加圧状態で前記多孔性膜に通過させることにより、装置をコンパクトに自動化することができ、好ましい。加圧は、好ましくは１０〜２００ｋｐａ、より好ましくは４０〜１００ｋｐａの程度で行われる。

前記の核酸分離精製の工程では、最初の核酸を含む試料溶液を注入から核酸分離精製カートリッジ外に核酸を得るまでの工程を１０分以内、好適な状況では２分以内で終了することが可能である。また、前記の核酸分精製の工程では核酸を検体中に含まれる全量に対して５０質量％以上、好適な状況では９０質量％以上の収率で得る事が可能である。

前記の核酸分精製の工程では、１ｋｂｐから２００ｋｂｐ、特に２０ｋｂｐから１４０ｋｂｐと広範囲に及ぶ分子量の核酸を回収することができる。すなわち、従来行なわれているガラスフィルターを用いたスピンカラム法に比べて、長鎖の核酸を回収できる。

前記の核酸分精製の工程では、紫外可視分光光度計での測定値(２６０nm/２８０nm)が、ＤＮＡの場合は１．６〜２．０、ＲＮＡの場合は１．８〜２．２となる純度を持つ核酸を回収することができ、不純物混入量の少ない高純度の核酸を定常的に得ることができる。さらには、紫外可視分光光度計での測定値(２６０nm/２８０nm)がＤＮＡの場合は１．８付近、ＲＮＡの場合は２．０付近となる純度を持つ核酸を回収することができる。

本発明において使用できる検体に制限はないが、例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、***、唾液等の体液、あるいは植物（又はその一部）、動物（またはその一部）、細菌、ウイルスなど、あるいはそれらの溶解物およびホモジネートなどの生物材料から調製された溶液が対象となる。

次にこれらの検体について細胞膜および核膜等を溶解して核酸を可溶化する試薬を含む水溶液（核酸可溶化試薬）で処理する。これにより細胞膜および核膜が溶解されて、核酸が水溶液内に分散し、核酸を含む試料溶液を得る。

細胞膜および核膜を溶解して、核酸を可溶化するためには、例えば、対象となる試料が全血の場合、赤血球の除去、（2）各種タンパク質の除去、及び（3）白血球の溶解及び核膜の溶解が必要となる。赤血球の除去および（2）各種タンパク質の除去は、膜への非特異吸着および多孔性膜の目詰まりを防ぐために、（3）白血球の溶解及び核膜の溶解は、抽出の対象である核酸を可溶化させるためにそれぞれ必要となる。特に、（3）白血球の溶解及び核膜の溶解は重要な工程であり、本発明の方法では、この工程により核酸を可溶化することが必要である。

核酸を含む検体は、単一の核酸を含む検体でもよいし、異なる複数種類の核酸を含む検体でもよい。回収する核酸の種類は、ＤＮＡやＲＮＡ等、特に制限されない。検体の数は一つでも複数（複数の容器を用いて、複数検体の並列処理）であってもよい。回収する核酸の長さも特に限定されず、例えば、数ｂｐ〜数Ｍｂｐの任意の長さの核酸を使用することができる。取扱い上の観点からは、回収する核酸の長さは一般的には、数ｂｐ〜数百ｋｂｐ程度である。本発明の核酸分離精製方法は、従来の簡易的な核酸分離精製方法より比較的長い核酸を迅速に取り出すことができ、好ましくは５０ｋｂｐ以上、より好ましくは７０ｋｂｐ、更に好ましくは１００ｋｂｐ以上の核酸を回収することに用いることができる。撹拌及びピペッティングを穏やかにすることが、より長いＤＮＡを回収する点で好ましい。

以下に、細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程について説明する。本発明で、細胞膜および核膜を溶解して核酸を可溶化するには、核酸可溶化試薬を用いる。核酸可溶化試薬としては、カオトロピック塩、界面活性剤、消泡剤、タンパク質分解酵素および核酸安定化剤の中から選ばれる化合物を含む溶液が挙げられる。

細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る方法としては、(Ｉ)細胞又はウイルスを含む検体を容器に注入する工程、(ＩＩ)前記容器に、核酸可溶化試薬溶液を添加し、検体と核酸可溶化試薬溶液を混合する工程、(ＩＩＩ)前記で得られた混合液をインキュベートする工程、(ＩＶ)インキュベートされた混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程を含む方法を挙げることができる。

前記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、検体をホモジナイズ処理することで、自動化処理適正が向上する。ホモジナイズ処理は、例えば、超音波処理、鋭利な突起物を用いる、高速攪拌処理を用いる、微細空隙から押し出す処理、ガラスビーズを用いる処理等で行うことができる。

また、前記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、タンパク質分解酵素を含む核酸可溶化試薬を使用することにより、核酸の回収量及び回収効率が向上し、必要な核酸を含む検体の微量化及び迅速化が可能となる。

タンパク質分解酵素は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼなどから、少なくとも１つのタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、タンパク質分解酵素は、複数種以上のタンパク質分解酵素の混合物も好ましく用いることができる。セリンプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばプロテアーゼＫなどを好ましく用いることができる。システインプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばパパイン、カテプシン類などを好ましく用いることができる。金属プロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばカルボキシペプチターゼ等を好ましく用いることができる。タンパク質分解酵素は、添加時の反応系全容積１ｍｌあたり好ましくは０．００１ＩＵ〜１０ＩＵ、より好ましくは０．０１ＩＵ〜１ＩＵの濃度で用いることができる。

タンパク質分解酵素は、核酸分解酵素を含まないタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、安定化剤を含んだタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。安定化剤としては、金属イオンを好ましく用いることができる。具体的には、マグネシウムイオンが好ましく、例えば塩化マグネシウムなどの形で添加することができる。タンパク質分解酵素の安定化剤を含ませることにより、核酸の回収に必要なタンパク質分解酵素の微量化が可能となり、核酸の回収に必要なコストを低減することができる。タンパク質分解酵素の安定化剤は、反応系全量に対して好ましくは１〜１０００ｍＭ、より好ましくは１０〜１００ｍＭの濃度で含有することが好ましい。

タンパク質分解酵素は、予めカオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とともに混合されて１つの試薬として核酸の回収に供されても良い。また、タンパク質分解酵素は、カオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とは個別の２つ以上の試薬として供されても良い。後者の場合、タンパク質分解酵素を含む試薬を先に検体と混合した後に、カオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬と混合される。また、カオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬を先に混合した後に、タンパク分解酵素を混合してもよい。また、タンパク質分解酵素を検体または、検体とカオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬との混合液に、タンパク質分解酵素保存容器から直接目薬状に滴下させることもできる。この場合、操作を簡便にすることができる。

カオトロピック塩の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、０．５Ｍ以上であることが好ましく、より好ましくは０．５Ｍ〜４Ｍ、さらに好ましくは、１Ｍ〜３Ｍである。前記カオトロピック塩としては、塩酸グアニジンが好ましいが、他のカオトロピック塩（イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、尿素、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム）を使用することもできる。また、これらの塩は単独または複数組み合わせて用いてもよい。

界面活性剤は、例えば、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤を挙げることが出来る。本発明においてはノニオン界面活性剤をこのましく用いることができる。ノニオン界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドを用いることができるが、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤を用いることができる、さらに好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤は、ＰＯＥデシルエーテル、ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥトリデシルエーテル、ＰＯＥアルキレンデシルエーテル、ＰＯＥソルビタンモノラウレート、ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソルビタンモノステアレート、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングリコールから選択されるポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。

また、カチオン界面活性剤も好ましく用いることができる。さらに好ましくは、カチオン界面活性剤は、セチルトリメチルアンモニウムプロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリドから選択されるカチオン界面活性剤である。
これらの界面活性剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。これら界面活性剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましい。

ＤＮＡなどＲＮＡ以外の核酸を回収する場合、前記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、核酸可溶化試薬溶液にＲＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＲＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＤＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。一方、ＲＮＡなどＤＮＡ以外の核酸を回収する場合、核酸可溶化試薬溶液にＤＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＤＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。ＲＮＡ分解酵素阻害剤としては、ＲＮＡ分解酵素を特異的に阻害するものが好ましい。ＲＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、リボヌクレアーゼ Ｈ（ＲＮａｓｅ Ｈ）等のＲＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。ＤＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、ＤＮａｓｅ Ｉ等のＤＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。核酸分解酵素および核酸分解酵素阻害剤は、通常用いられる濃度で用いることが出来る。また、通常どおり加温処理することができる。加温処理は、タンパク質分解酵素による処理と同時におこなうことが好ましい。

核酸安定化剤としては、ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有するものが挙げられる。検体によっては、核酸を分解するヌクレアーゼ等が含まれていることがあり、核酸をホモジナイズするとこのヌクレアーゼが核酸に作用し、収量が激減することがある。前記核酸安定化剤は、検体中の核酸を安定に存在させることができ、これにより、核酸の回収量及び回収効率が向上し、検体の微量化及び迅速化が可能となり、好ましい。

ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有する核酸安定化剤としては、一般的に還元剤として使用される化合物を用いることができる。還元剤としては、水素、ヨウ化水素、硫化水素、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウム等の水素化化合物、アルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、亜鉛等の電気的陽性の大きい金属、またはそれのアマルガム、アルデヒド類、糖類、ギ酸、シュウ酸などの有機酸化物、メルカプト化合物等が挙げられる。中でもメルカプト化合物が好ましい。メルカプト化合物としては、Ｎ−アセチルシステイン、メルカプトエタノールや、アルキルメルカプタン等が挙げられる。特に、β−メルカプトエタノールが好ましい。メルカプト化合物は単独または複数組み合わせて用いてもよい。
核酸安定化剤は、前処理液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．３〜１５質量％で、用いることができる。メルカプト化合物は、前処理液における濃度は０．１〜１０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．５〜５質量％で、用いることができる。

前記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、核酸を含む試料溶液には、消泡剤を含有させることも好ましい。前記消泡剤としては、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分が好ましく挙げられ、また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤が好ましい。

消泡剤の具体例としては、シリコン系消泡剤（例えば、シリコーンオイル、ジメチルポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、変性ポリシロキサン、シリコーンコンパウンドなど）、アルコール系消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルエキサノール、高級アルコール、ポリオキシアルキレングリコールなど）、エーテル系消泡剤（例えば、ヘプチルセロソルブ、ノニルセロソルブ−３−ヘプチルコルビトールなど）、油脂系消泡剤（例えば、動植物油など）、脂肪酸系消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属セッケン系消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミ、ステアリン酸カルシウムなど）、脂肪酸エステル系消泡剤（例えば、天然ワックス、トリブチルホスフェートなど）、リン燐酸エステル系消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウムなど）、アミン系消泡剤（例えば、ジアミルアミンなど）、アミド系消泡剤（例えば、ステアリン酸アミドなど）、その他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄、ボーキサイトなど）などが挙げられる。特に好ましくは、消泡剤として、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分を組み合わせて使用することができる。また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤を使用することも好ましい。

核酸可溶化試薬は、乾燥された状態で供給されることも好ましい。また、凍結乾燥のように乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器を用いることができる。前記の、乾燥された状態で供給される核酸可溶化試薬、および乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器の両方を用いて、核酸を含む試料溶液を得ることもできる。前記の方法で核酸を含む試料溶液を得る場合、核酸可溶化試薬およびタンパク質分解酵素の保存安定性が良く、核酸収量を変えずに操作を簡便にすることができる。

検体と核酸可溶化試薬溶液とを混合する方法は、特に限定されない。混合する際、攪拌装置により３０から３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、分離精製される核酸収量を増加させることができる。または、転倒混和を５から３０回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、１０から５０回行うことによっても混合することができる、この場合、簡便な操作で分離精製される核酸収量を増加させることができる。

タンパク質分解酵素を含む核酸可溶化試薬溶液を用いる場合、検体と核酸可溶化試薬溶液との混合液を、タンパク質分解酵素の至適温度および反応時間でインキュベートすることにより、分離精製される核酸の収量を増加させることがきる。インキュベーション温度は、通常２０℃〜７０℃、好ましくはタンパク分解酵素の至適温度であり、インキュベーション時間は通常１分〜１８時間、好ましくはタンパク分解酵素の至適反応時間である。インキュベーション方法は特に限定されず、湯浴や加温器に入れることで行うことができる。

前記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、インキュベートされた混合液に添加する水溶性有機溶媒は、アルコール類、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等挙げられる。特にアルコールを好ましく用いることができる。
アルコールは、1級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。アルコールがメチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール及びその異性体、ブチルアルコール及びその異性体を好ましく用いることができる。より好ましくはエタノールを用いることができる。これらの水溶性有機溶媒は単独または複数組み合わせて用いてもよい。これら水溶性有機溶媒の核酸可溶化試薬溶液における濃度は１〜２０質量％であることが好ましい。これら水溶性有機溶媒の核酸を含む試料溶液における最終濃度は、５〜９０質量％であることが好ましい。

前記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、試料溶液は、好ましくはｐＨ５〜１０、より好ましくはｐＨ６〜９、さらに好ましくはｐＨ７〜８のものが用いられる。

また、前記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、得られた核酸を含む試料溶液は、表面張力は５０ｄｙｎｅ／ｃｍ以下であることが好ましく、また、粘度は、１〜１００００ｍＰａであることが好ましく、比重は、０．８〜１．２であることが好ましい。

以下、洗浄工程について説明する。洗浄を行うことにより、核酸の回収量及び純度が向上し、必要な核酸を含む検体の量を微量とすることができる。洗浄工程は、迅速化のためには１回の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰返すことが好ましい。

洗浄工程において、洗浄液は、自動注入装置もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジへ供給される。供給された洗浄液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、洗浄液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より洗浄液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法は洗浄効率が優れてより好ましい。洗浄工程における洗浄液の液量は、２μｌ/ｍｍ²以上が好ましい。洗浄液量が多量であれば洗浄効果は向上するが、操作性を保ち、試料の流出を抑止するためには、２００μｌ/ｍｍ²以下が好ましい。

洗浄工程において、洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させる場合の流速は、膜の単位面積（ｃｍ²）あたり、２〜１５００μＬ/secであることが好ましく、５〜７００μＬ/secであることがより好ましい。通過速度を下げて時間を掛ければ洗浄がそれだけ十分に行なわれることになるが、核酸の分離精製操作の迅速化も重要であるので前記した範囲が選択される。

洗浄工程において、洗浄液の液温は４〜７０℃であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。また洗浄工程において、その核酸分離精製カートリッジを器械的な振動や超音波による攪拌を与えながら、または遠心分離により洗浄することもできる。

洗浄工程において、洗浄液には、一般的には核酸分解酵素のような酵素を含ませないが、タンパク質等の夾雑物質を分解する酵素を含ませることができる。また、場合によってはＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素などを含ませることもできる。ＤＮＡ分解酵素を含む洗浄液を使用することにより、検体中のＲＮＡのみを選択的に回収することができる。逆に、ＲＮＡ分解酵素を含む洗浄液を使用することにより、検体中のＤＮＡのみを選択的に回収することができる。

洗浄工程において、洗浄液は、水溶性有機溶媒及び/または水溶性塩を含んでいる溶液であることが好ましい。洗浄液は、核酸吸着性多孔性膜に核酸と共に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、核酸吸着性多孔性膜から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成であることが必要である。この目的には、核酸がアルコール等の水溶性有機溶媒に難溶性であるので、核酸を保持したまま核酸以外の成分を脱着させるのに適している。また、水溶性塩を添加することにより、核酸の吸着効果が高まるので、不要成分の選択的除去作用が向上する。

洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブタノール、アセトンなどを用いることができ、中でもエタノ―ルを用いることが好ましい。洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、２０〜１００重量％であることが好ましく、４０〜８０重量％であることがより好ましい。

一方、洗浄液に含まれる水溶性塩は、ハロゲン化物の塩であることが好ましく、中でも塩化物が好ましい。また、水溶性塩は、一価または二価のカチオンであることが好ましく、特にアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が好ましく、中でもナトリウム塩及びカリウム塩が好ましくナトリウム塩が最も好ましい。水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍＭ／Ｌ以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１Ｍ／Ｌ以下であることが好ましく、０．１Ｍ／Ｌ以下であることがより好ましい。とりわけ、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、さらには、塩化ナトリウムが２０ｍＭ／Ｌ以上含まれていることが特に好ましい。

洗浄液は、カオトロッピク物質を含んでいないことが好ましい。それによって、洗浄工程に引き続く回収工程にカオトロピック物質が混入する可能性を減らすことができる。回収工程時に、カオトロピック物質が混入すると、しばしばＰＣＲ反応等の酵素反応を阻害するので、後の酵素反応等を考慮すると洗浄液にカオトロッピク物質を含まないことが理想的である。また、カオトロピック物質は、腐食性で有害であるので、この点でもカオトロピック物質を用いないで済むことは、実験者にとっても試験操作の安全上極めて有利である。ここで、カオトロピック物質とは、前記したように尿素、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどである。

従来、核酸分離精製工程における洗浄工程の際、洗浄液がカートリリッジなどの容器に対する濡れ性が高いため、しばしば洗浄液が容器中に残留することになり、洗浄工程に続く回収工程への洗浄液の混入して核酸の純度の低下や次工程における反応性の低下などの原因となっている。したがって、カートリッジなどの容器を用いて核酸の吸着及び脱着を行う場合、吸着、洗浄時に用いる液、特に洗浄液が、次の工程に影響を及ぼさないように、カートリッジ内に洗浄残液が残留しないことは重要である。

したがって、洗浄工程における洗浄液が次工程の回収液に混入することを防止して、洗浄液のカートリッジ内への残留を最小限に留めるため、洗浄液の表面張力を３５ｄｙｎｅ/ｃｍ未満にすることが好ましい。表面張力を低くすれば洗浄液とカートリッジの濡れ性が向上し、残留する液量を抑えることができる。

逆に、洗浄工程における洗浄液のカートリッジへの残留を減少させる目的で、洗浄液の表面張力を３５ｄｙｎｅ/ｃｍ以上にして、カートリッジとの撥水性を高めて液滴を形成させ、その液滴が流れ落ちることによって残留する液量を抑えることもできる。核酸を吸着した多孔性膜、回収液、洗浄液の組合せなどによっていずれかの表面張力が選択される。

本発明に係る核酸吸着性多孔性膜を利用して洗浄工程を簡素化することができる。(1)洗浄液が核酸吸着性多孔性膜を通過する回数を1回でよい、(2)洗浄工程を室温でできる。(3)洗浄後、直ちに回収液をカートリッジに注入することができる。（４）前記（１）、（２）、（３）のいずれか1つもしくは２つ以上のも可能である。従来法においては、洗浄液中に含まれる有機溶媒を迅速に取り除くため、しばしば乾燥工程を必要としたが、本発明に係る核酸吸着性多孔性膜は薄膜であるためにこれを省略できるからである。

従来、核酸分離精製工程において、洗浄工程の際、しばしば洗浄液が飛散し他に付着することによって、試料のコンタミネーション（汚染）が起きることが問題となっている。洗浄工程におけるこの種のコンタミネーションは、二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多性孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジと廃液容器の形状とを工夫することによって抑止することができる。

以下に核酸吸着性多性孔膜から核酸を脱着させて回収する工程について示す。回収工程において、回収液は、自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を装着した核酸分離精製カートリッジへ供給される。回収液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法は回収効率が優れてより好ましい。

検体から調整した核酸を含む試料溶液の体積に対して、回収液の体積を調整して核酸の脱着を行うことができる。分離精製された核酸を含む回収液量は、そのとき使用する検体量による。一般的によく使われる回収液量は数１０から数１００μｌであるが、検体量が極微量である時や、逆に大量の核酸を分離精製したい場合には回収液量は１μｌから数１０ｍｌの範囲で変える事ができる。

回収液としては好ましくは精製蒸留水、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファ等が使用できる。また、回収した核酸をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に供する場合、ＰＣＲ反応において用いる緩衝溶液 (例えば、ＫＣｌ ５０ｍｍｏｌ／ｌ、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ １０ｍｍｏｌ／ｌ、ＭｇＣｌ₂ １．５ｍｍｏｌ／ｌを最終濃度とする水溶液)を用いることもできる。

回収液のｐＨは、ｐＨ２〜１１であることが好ましい。さらには、ｐＨ５〜９であることが好ましい。また特にイオン強度と塩濃度は吸着核酸の溶出に効果を及ぼす。回収液は、２９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のイオン強度であることが好ましく、さらには、９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩濃度であることが好ましい。こうすることで、核酸の回収率が向上し、より多くの核酸を回収できることができる。回収される核酸は１本鎖でもよく、２本鎖でも良い。

回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液の体積と比較して少なくすることによって、濃縮された核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１００〜９９：１００、更に好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１０〜９：１０にすることができる。これにより核酸分離精製後工程において濃縮のための操作をすることなく、簡単に核酸を濃縮できる。これらの方法により検体よりも核酸が濃縮されている核酸溶液を得る方法を提供できる。

また別の方法としては、回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液よりも多い条件で核酸の脱着を行うことにより、希望の濃度の核酸を含む回収液を得ることができ、次工程（ＰＣＲなど）に適した濃度の核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１〜５０：１、更に好ましくは、 (回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１〜５：１にすることができる。これにより核酸分離精製後に濃度調整をする煩雑さがなくなるというメリットを得られる。更に、十分量の回収液を使用することにより、多孔性膜からの核酸回収率の増加を図ることができる。

回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便に核酸を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量の核酸を回収する場合等複数回にわたり回収液を注入する事がある。

回収工程においては、核酸の回収液をその後の後工程に使用できる組成にしておくことが可能である。分離精製された核酸は、しばしばＰＣＲ(ポリメラーゼチェインリアクション)法により増幅される。この場合、分離精製された核酸溶液はＰＣＲ法に適したバッファー液で希釈する必要がある。本方法による回収工程において、回収液にＰＣＲ法に適したバッファー液を用いることで、その後のＰＣＲ工程へ簡便、迅速に移行することができる。

また、回収工程において、核酸の回収液に回収した核酸の分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。安定化剤としては、抗菌剤、抗カビ剤や核酸分解抑制剤などを添加することができる。核酸分解酵素の阻害剤としてはＥＤＴＡなどが上げられる。また別の実施態様として、回収容器にあらかじめ安定化剤を添加しておくこともできる。

回収工程で用いられる回収容器には特に限定はないが、２６０ｎｍの吸収が無い素材で作製された回収容器を用いることができる。この場合、回収した核酸溶液の濃度を、他の容器に移し替えずに測定できる。２６０ｎｍに吸収のない素材は、例えば石英ガラス等が挙げられるがそれに限定されるものではない。

以下、本発明に係る核酸抽出方法を用いて核酸抽出工程を行い収集される核酸の収量の測定試験を行った。また、本試験では前記実施形態で説明した核酸抽出装置を用いた。
（１）核酸分離精製容器の作成
本実施例において、カートリッジとして使用する核酸分離精製容器は、内径７ｍｍ、核酸吸着用の固相が収容され、２つの開口を有する核酸精製用容器をハイインパクトポリスチレンで作成した。下部の開口の径を２．５ｍｍとした。

（２）核酸分離精製ユニット
核酸吸着性多孔膜として、トリアセチルセルロ−スの多孔膜を鹸化処理した多孔膜（膜厚 ８０μｍ）を使用し、前記（１）で作成した核酸精製カートリッジの核酸吸着性多孔膜収納部に収容した。

（３）ＲＮＡ可溶化試薬及び洗浄液の調製
以下に示す処方でＲＮＡ可溶化試薬及び洗浄液を調製する。
（ＲＮＡ可溶化試薬の処方）
塩酸グアニジン（ライフテクノロジー社製） ３８２ｇ
Ｔｒｉｓ（ライフテクノロジー社製） １２．１ｇ
Triton-X100（ＩＣＮ製） １０ｇ
蒸留水 １０００ｍｌ
（洗浄液の処方）
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ３０％エタノール

（４）核酸精製操作
ガン化人骨髄細胞（ＨＬ６０）培養液を用意する。この培養液を細胞数が1×10⁶ヶになるよう採取し300×ｇ5分遠心にて細胞を沈殿させ上澄みを除き細胞を得る。前記HL60細胞（1×10⁶ヶ）に前記のＲＮＡ可溶化試薬溶液２００μｌを添加して攪拌、続いてエタノール２００μｌを加え、攪拌することでＲＮＡを含む試料溶液を作成する。該ＲＮＡを含む試料溶液を、前記（１）及び（２）で作成したアセチル価の異なるアセチルセルロ−スの混合物から成る有機高分子の多孔膜を有する核酸精製ユニットの一の開口に注入し、続いて前記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製ユニット内を加圧状態にし、注入したＲＮＡを含む試料溶液を、前記多孔膜に通過させることで、前記性多孔膜に接触させ、核酸分離精製ユニットの他の開口より排出する。続いて、前記核酸分離精製ユニットの前記一の開口に洗浄液を注入し、前記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製ユニット内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、前記多孔膜に通過させ、他の開口より排出する。続いて、前記核酸分離精製ユニットの前記一の開口に回収液を注入し、核酸分離精製ユニットの前記一の開口に圧力差発生装置を結合して核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、前記多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収する。

（５）ＲＮＡの分離精製の確認
回収液の２６０ｎｍ吸収スペクトルを測定し、ＲＮＡの収量を求めた。そして、本実施例の核酸抽出工程における洗浄液及び回収液の放置時間に対するＲＮＡの収量を評価した。本実施例の結果として、洗浄液を注入した後に放置して放置させる時間と核酸の収量との関係を図１１に示した。また、回収液を注入した後に放置して放置させる時間とＲＮＡの収量との関係を図１２に示した。

図１１及び図１２に示すように、洗浄液を注入した後に放置して放置させる時間と回収液を注入した後に放置して放置させる時間を所定の時間になるよう制御することによってＲＮＡの収量が著しく向上することがわかった。具体的には、図１１に示すように、注入した洗浄液を５０秒以上放置してＲＮＡに放置させることでＲＮＡ収量が増加することがわかった。また、図１２に示す用に、注入した回収液を２０秒以上放置してＲＮＡに放置させることでＲＮＡ収量が増加することがわかった。

核酸抽出装置の一実施形態であってカバーを除去した状態を示す斜視図である。 核酸抽出装置の移動ヘッドの概略構成図である。 核酸抽出装置の概略ブロック構成図である。 カートリッジの（ａ）斜視図と（ｂ）Ｐ−Ｐ断面図である。 抽出動作の工程図（ａ）〜（ｇ）である。 移動ヘッドからカートリッジへの加圧エアの供給の様子を示す説明図（ａ），（ｂ），（ｃ）である。 移動ヘッドからカートリッジへの洗浄液の分注の様子を示す説明図（ａ），（ｂ）である。 移動ヘッドからカートリッジへの回収液の分注の様子を示す説明図（ａ），（ｂ）である。 核酸抽出装置の他の形態を示す概略構成図である。 本発明に係る核酸抽出工程の手順を示すフローチャートである。 洗浄液を注入した後に放置して放置させる時間と核酸の収量との関係を示すグラフである。 回収液を注入した後に放置して放置させる時間と核酸の収量との関係を示すグラフである。

符号の説明

２ 装置本体
３ 保持機構
４ 加圧エア供給機構
５ 分注機構
６ ラック
７ 移動手段
１１ カートリッジ（核酸抽出カートリッジ）
１１ｂ 核酸吸着性多孔膜
１２ 廃液容器
１３ 回収容器
２１ カートリッジホルダ
２２ 容器保持台
４０ 移動ヘッド（可動体）
４１ 加圧ノズル
４３ エアポンプ
４５ 開閉バルブ
４６ 圧力センサ
５１ｗ，５１ｒ 分注ノズル
５２ｗ，５２ｒ 供給ポンプ
５６ｗ，５６ｒ ボトル
７０ 制御部
７２ 記憶部
１００ 核酸抽出装置
Ｓ 試料溶液
Ｗ 洗浄液
Ｒ 回収液

Claims (18)

1. 核酸を含む試料溶液を核酸吸着性固相担体に接触させて、該核酸吸着性固相担体に核酸を吸着させる工程と、
   洗浄液を該核酸吸着性固相担体に接触させて、核酸が吸着した状態で前記核酸吸着性固相担体を洗浄する工程と、
   回収液を該核酸吸着性固相担体に接触させて、該核酸吸着性固相担体から核酸を脱着させる工程を含む核酸抽出方法であって、
   前記洗浄液を分注して放置させる時間及び前記回収液を分注して放置させる時間のうち少なくとも一方を所定の時間に制御することを特徴とする核酸抽出方法。
2. 洗浄液を放置させる時間を５０秒から１０００秒の範囲に制御することを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
3. 洗浄液を放置させる時間を１００秒から３００秒の範囲に制御することを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
4. 回収液を放置させる時間を２０秒から３００秒の範囲に制御することを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
5. 回収液を放置させる時間を２５秒から６０秒の範囲に制御することを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
6. 前記核酸吸着性固相担体が、イオン結合の関与しない相互作用で核酸を吸着する該核酸吸着性固相担体であることを特徴とする請求項１から５のいずれか１つに記載の核酸抽出方法。
7. 前記核酸を含む試料溶液が、
   カオトロピック塩、界面活性剤、消泡剤、タンパク質分解酵素および核酸安定化剤の中から選ばれる化合物を含む前処理液と試験検体を混合し、混合液を得る工程と、
   前記混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程とを含むことを特徴とする請求項１から６のいずれか１つに記載の核酸抽出方法。
8. 前記核酸安定化剤がメルカプト化合物であることを特徴とする請求項７に記載の核酸抽出方法。
9. 前記カオトロピック塩がグアニジウム塩であることを特徴とする請求項７に記載の核酸抽出方法。
10. 前記水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノールのいずれかを含むことを特徴とする請求項７に記載の核酸抽出方法。
11. 前記核酸吸着性固相担体を少なくとも２個の開口を有する容器の内部に収容した核酸抽出カートリッジに、核酸を含む試料溶液を注入し圧力差により該試料溶液中の核酸を前記核酸吸着性固相担体に吸着させた後、前記核酸抽出カートリッジに洗浄液を分注し圧力差により不純物を除去し、その後、前記核酸抽出カートリッジに回収液を分注し圧力差により核酸吸着性固相担体に吸着した核酸を分離して回収液とともに回収することを特徴とする請求項１から１０のいずれか１つに記載の核酸抽出方法。
12. 核酸吸着性固相担体がフィルター部材であり、該フィルター部材を備えた核酸抽出カートリッジを用い、該核酸抽出カートリッジに核酸を含む試料溶液を注入し圧力差により該試料溶液中の核酸を前記フィルター部材に吸着させた後、前記核酸抽出カートリッジに洗浄液を分注し圧力差により不純物を除去し、その後、前記核酸抽出カートリッジに回収液を分注し圧力差によりフィルター部材に吸着した核酸を分離して回収液とともに回収する抽出動作を自動的に行う核酸抽出装置であって、
    洗浄液を分注して放置させる時間と回収液を分注して放置させる時間との少なくとも一方を所定の時間に制御する放置時間制御手段が設けられたことを特徴とする核酸抽出装置。
13. 洗浄液を放置させる時間を５０秒から１０００秒の範囲に制御することを特徴とする請求項１２に記載の核酸抽出装置。
14. 洗浄液を放置させる時間を１００秒から３００秒の範囲に制御することを特徴とする請求項１２に記載の核酸抽出装置。
15. 回収液を放置させる時間を２０秒から３００秒の範囲に制御することを特徴とする請求項１２に記載の核酸抽出装置。
16. 回収液を放置させる時間を２５秒から６０秒の範囲に制御することを特徴とする請求項１２に記載の核酸抽出装置。
17. 前記核酸抽出カートリッジに核酸を含む試料溶液を注入して該試料溶液中の核酸を前記フィルター部材に吸着させる工程、前記核酸抽出カートリッジに洗浄液を分注して不純物を除去する工程、前記核酸抽出カートリッジに回収液を分注してフィルター部材に吸着した核酸を分離して回収液とともに回収する工程の抽出動作を加圧によって自動的に行う請求項１２から１６のいずれか１つに記載の核酸抽出装置。
18. 前記核酸抽出カートリッジに加圧ノズルから加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、
    前記核酸抽出カートリッジに洗浄液及び回収液をそれぞれ分注する分注ノズルを有する分注機構が設けられたことを特徴とする請求項１２から１７のいずれか１つに記載の核酸抽出装置。

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