JP2006081410A - 核酸の分離精製方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】
核酸吸着性多孔性膜を使用して核酸を含む試料溶液から核酸を分離精製する方法において、高い収率を維持し、核酸吸着性多孔性膜の諸特性を改良し、加工適性が良好でより高い生産性が得られる核酸吸着性多孔性膜およびそれを使用した核酸分離精製方法を提供する。
【解決手段】
核酸吸着性多孔性膜を使用して核酸を含む試料溶液から核酸を分離精製する方法において、核酸吸着性多孔性膜として添加剤を含んで形成された核酸吸着性多孔性膜を用いる。
【選択図】 なし
核酸吸着性多孔性膜を使用して核酸を含む試料溶液から核酸を分離精製する方法において、高い収率を維持し、核酸吸着性多孔性膜の諸特性を改良し、加工適性が良好でより高い生産性が得られる核酸吸着性多孔性膜およびそれを使用した核酸分離精製方法を提供する。
【解決手段】
核酸吸着性多孔性膜を使用して核酸を含む試料溶液から核酸を分離精製する方法において、核酸吸着性多孔性膜として添加剤を含んで形成された核酸吸着性多孔性膜を用いる。
【選択図】 なし
Description
本発明は、核酸を分離精製する方法に関する。より詳細には、本発明は、核酸吸着性多孔性膜を使用して核酸を含む試料溶液から核酸を分離精製する方法において、加工適性を改良した核酸吸着性多孔性膜およびそれを使用した核酸分離精製方法に関する。
核酸は様々な分野で種々の形態で使用されている。例えば、組換え核酸技術の領域においては、核酸をプローブ、ゲノム核酸、およびプラスミド核酸の形態で用いることが要求される。
核酸は、診断分野においても、種々の形態で種々の目的に用いられている。例えば、核酸プローブは、ヒトの病原体の検出および診断に日常的に用いられている。また、核酸は遺伝障害の検出や食品汚染物質の検出にも用いられている。さらに、核酸は、遺伝地図の作製やクローニング、遺伝子組換えによる形質発現におよぶ種々の目的のために、所定の核酸に関する位置確認や同定、単離において日常的に用いられている。
しかし、多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手できず、そしてその単離と精製との操作が、煩雑であり多くの時間を要する。この時間を要する煩雑な工程は、核酸の損失に結びつきやすいという問題がある。また、例えば、血清、尿およびバクテリアのカルチャーから得られた試料から核酸を精製する場合には、コンタミネーションが発生したり、疑陽性の結果を招くという問題も加わる。
上記問題を解決し、簡便かつ効率よく核酸を分離精製する方法の一つとして、セルロースのような表面に水酸基を有する有機高分子により構成される多孔性膜に核酸を吸着ならびに脱着させる方法が、特許文献１に開示されている。
特開２００３−１２８６９１号公報
しかしながら、前記の多孔性膜を用いる核酸分離精製方法は、分離性能や効率としては優れているが、使用する多孔性膜の強度・帯電防止性・柔軟性が低く、また強い紫外線による滅菌工程での劣化が起こるなどで、加工適性の改良された膜が求められていた。
従って、本発明の目的は、核酸吸着性多孔性膜を使用して核酸を含む試料溶液から核酸を分離精製する方法において、高い収率を維持し、核酸吸着性多孔性膜の諸特性を改良し、加工適性が良好でより高い生産性が得られる核酸吸着性多孔性膜およびそれを使用した核酸分離精製方法を提供することである。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、核酸吸着性多孔性膜に可塑剤、静電防止剤、劣化防止剤、紫外線防止剤、界面活性剤、剥離剤、着色剤、補強剤、架橋剤および湿潤剤から選ばれる少なくとも１種を多孔性膜に添加することで、膜の所望の特性が改善され、加工適性を改善でき、高い生産性が得られることを見出した。さらには、このような添加剤を添加したにもかかわらず、驚くべき事に核酸分離性能には影響を与えないことを見出し、本発明を完成したものである。即ち、本発明は、下記の構成よりなるものである。
１．（１）核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
（２）洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程、及び
（３）回収液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させる工程
を含む核酸の分離精製方法であって、該核酸吸着性多孔性膜として添加剤を含んで形成された核酸吸着性多孔性膜を用いることを特徴とする核酸分離精製方法。
（２）洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程、及び
（３）回収液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させる工程
を含む核酸の分離精製方法であって、該核酸吸着性多孔性膜として添加剤を含んで形成された核酸吸着性多孔性膜を用いることを特徴とする核酸分離精製方法。
２．上記添加剤が、可塑剤、静電防止剤、劣化防止剤、紫外線防止剤、界面活性剤、剥離剤、着色剤、補強剤、架橋剤および湿潤剤から選ばれる少なくとも１種である上記第１項に記載の核酸分離精製方法。
３．上記添加剤が、上記核酸吸着性多孔性膜に対して１０％以下の質量分率で含まれている上記第１又は第２項に記載の核酸分離精製方法。
４．上記核酸吸着性多孔性膜が、厚さが１０μｍ〜５００μｍである、上記第１〜３項のいずれかに記載の核酸分離精製方法。
５．上記核酸吸着性多孔性膜が、孔の最小孔径が０．２２μｍ以上である、上記第１〜４項のいずれかに記載の核酸分離精製方法。
６．上記核酸吸着性多孔性膜が、表裏対称性の多孔性膜である、上記第１〜５項のいずれかに記載の核酸分離精製方法。
７．上記核酸吸着性多孔性膜が、表裏非対称性の多孔性膜である、上記第１〜５項のいずれかに記載の核酸分離精製方法。
８．上記核酸吸着性多孔性膜が、孔の最小孔径に対する最大孔径の比が１：２以上である、上記第７項に記載の核酸分離精製方法。
９．上記核酸吸着性多孔性膜が、空隙率が５０〜９５％である、上記第１〜８項のいずれかに記載の核酸分離精製方法。
１０．上記核酸吸着性多孔性膜が、バブルポイントが０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ2である、上記第１〜９項のいずれかに記載の核酸分離精製方法。
１１．上記核酸吸着性多孔性膜が、圧力損失が０．１〜１００ｋＰａである、上記第１〜１０項のいずれかに記載の核酸分離精製方法。
１２．上記核酸吸着性多孔性膜が、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2あたり１分間で１〜５０００ｍＬである、上記第１〜１１項のいずれかに記載の核酸分離精製方法。
１３．上記核酸吸着性多孔性膜が、1ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．１μｇ以上である、上記第１〜１２項のいずれかに記載の核酸分離精製方法。
１４．上記第１〜１３項のいずれかに記載の核酸分離精製方法に用いられる核酸吸着性多孔性膜。
１４．上記第１〜１３項のいずれかに記載の核酸分離精製方法に用いられる核酸吸着性多孔性膜。
本発明によれば、核酸吸着性多孔性膜を使用して核酸を含む試料溶液から核酸を分離精製する方法において、核酸分離性能には影響を与えずに、核酸吸着性多孔性膜の諸特性（強度・帯電防止性・柔軟性・紫外線耐性など）が改善され、加工適性が良好でより高い生産性が得られる核酸吸着性多孔性膜およびそれを使用した核酸分離精製方法を提供できる。
本発明の核酸分離精製方法は、
（１）核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、（以下「吸着工程」とも称する）
（２）洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程、（以下「洗浄工程」とも称する）
（３）回収液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させる工程、（以下「回収工程」とも称する）
を少なくとも含むものである。
（１）核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、（以下「吸着工程」とも称する）
（２）洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程、（以下「洗浄工程」とも称する）
（３）回収液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させる工程、（以下「回収工程」とも称する）
を少なくとも含むものである。
まず、本発明の核酸分離精製方法において使用される核酸吸着性多孔性膜および吸着工程について説明する。
［核酸吸着性多孔性膜および吸着工程］
本発明における核酸吸着性多孔性膜は、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であることが好ましい。これは、多孔性膜側の使用条件で「イオン化」していないことを意味し、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜が引き合うようになると推定される。これにより分離性能に優れ、しかも洗浄効率よく、核酸を単離精製することができる。好ましくは、核酸吸着性多孔性膜は、親水基を有する多孔性膜であり、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜の親水基同士が引きあうようになると推定される。
［核酸吸着性多孔性膜および吸着工程］
本発明における核酸吸着性多孔性膜は、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であることが好ましい。これは、多孔性膜側の使用条件で「イオン化」していないことを意味し、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜が引き合うようになると推定される。これにより分離性能に優れ、しかも洗浄効率よく、核酸を単離精製することができる。好ましくは、核酸吸着性多孔性膜は、親水基を有する多孔性膜であり、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜の親水基同士が引きあうようになると推定される。
親水基とは、水との相互作用を持つことができる有極性の基（原子団）を指し、核酸の吸着に関与する全ての基（原子団）が当てはまる。親水基としては、水との相互作用の強さが中程度のもの（化学大事典、共立出版株式会社発行、「親水基」の項の「あまり親水性の強くない基」参照）が良く、例えば、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、オキシエチレン基、アミノ基、アミド基などを挙げることができる。好ましくは水酸基である。
親水基を有する多孔性膜とは、多孔性膜を形成する材料自体が、親水基を有する多孔性膜、または多孔性膜を形成する材料を処理またはコーティングすることによって親水基を導入した多孔性膜を意味する。多孔性膜を形成する材料は有機物、無機物のいずれでも良い。例えば、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する有機材料である多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する無機材料である多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜などを使用することができる。中でも加工の容易性から、多孔性膜を形成する材料として有機高分子などの有機材料を用いることが好ましい。
｛親水基を有する有機材料｝
親水基を有する有機材料としては、多糖構造を有する有機材料が挙げられる。多糖構造を有する有機材料としては、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、アガロース、デキストリン、アミロース、アミロペクチン、デンプン、グリコーゲン、プルラン、マンナン、グルコマンナン、リケナン、イソリケナン、ラミナラン、カラギーナン、キシラン、フルクタン、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、キチン、キトサン等を挙げることができる。これらの多糖構造の誘導体を用いてもよい。例えば、多糖構造の水酸基が任意の置換度で、エステル化したもの、エーテル化したもの、ハロゲン化したものが挙げられる。多糖構造およびその誘導体の少なくともいずれかであれば前記に挙げた材料に限定されることなく用いることができる。
特にエステル誘導体を好ましく用いることができる。また、エステル誘導体の鹸化物も好適なものとして挙げられる。
親水基を有する有機材料としては、多糖構造を有する有機材料が挙げられる。多糖構造を有する有機材料としては、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、アガロース、デキストリン、アミロース、アミロペクチン、デンプン、グリコーゲン、プルラン、マンナン、グルコマンナン、リケナン、イソリケナン、ラミナラン、カラギーナン、キシラン、フルクタン、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、キチン、キトサン等を挙げることができる。これらの多糖構造の誘導体を用いてもよい。例えば、多糖構造の水酸基が任意の置換度で、エステル化したもの、エーテル化したもの、ハロゲン化したものが挙げられる。多糖構造およびその誘導体の少なくともいずれかであれば前記に挙げた材料に限定されることなく用いることができる。
特にエステル誘導体を好ましく用いることができる。また、エステル誘導体の鹸化物も好適なものとして挙げられる。
前記多糖構造のエステル誘導体におけるエステルとしては、カルボン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、ホスホン酸エステル、ピロリン酸エステルが挙げられ、エステル誘導体がこれらのエステルから選ばれる少なくともいずれかを有することが好ましい。また、これらエステル誘導体の鹸化物も好適なものとして挙げられる。
前記カルボン酸エステルとしては、アルキルカルボニルエステル、アルケニルカルボニルエステル、芳香族カルボニルエステル、芳香族アルキルカルボニルエステルが挙げられ、エステルとしてカルボン酸エステルを用いる場合には、これらのカルボン酸エステルから選ばれる少なくともいずれかを有することが好ましい。また、これらカルボン酸エステルの鹸化物も好適なものとして挙げられる。
前記アルキルカルボニルエステルのアルキルカルボニル基としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、バレル基、ペプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基が挙げられ、カルボン酸エステルとしてアルキルカルボニルエステルを用いる場合には、これらのアルキルカルボニル基から選ばれる少なくともいずれかを有することが好ましい。また、これらアルキルカルボニルエステルの鹸化物も好適なものとして挙げられる。
前記アルケニルカルボニルエステルのアルケニルカルボニル基としては、アクリル基、メタクリル基が挙げられ、カルボン酸エステルとしてアルケニルカルボニルエステルを用いる場合には、これらのアルケニルカルボニル基から選ばれる少なくともいずれかを有することが好ましい。また、これらアルケニルカルボニルエステルの鹸化物も好適なものとして挙げられる。
前記芳香族カルボニルエステルの芳香族カルボニル基としては、ベンゾイル基、ナフタロイル基が挙げられ、カルボン酸エステルとして芳香族カルボニルエステルを用いる場合には、これらの芳香族カルボニル基から選ばれる少なくともいずれかを有することが好ましい。また、これら芳香族カルボニルエステルの鹸化物も好適なものとして挙げられる。
前記硝酸エステルとしては、ニトロセルロース、ニトロヘミセルロース、ニトロデキストラン、ニトロアガロース、ニトロデキストリン、ニトロアミロース、ニトロアミロペクチン、ニトログリコーゲン、ニトロプルラン、ニトロマンナン、ニトログルコマンナン、ニトロリケナン、ニトロイソリケナン、ニトロラミナラン、ニトロカラギーナン、ニトロキシラン、ニトロフルクタン、ニトロアルギン酸、ニトロヒアルロン酸、ニトロコンドロイチン、ニトロキチン、ニトロキトサンなどが挙げられる。また、これら硝酸エステルの鹸化物も好適なものとして挙げられる。
前記硫酸エステルとしては、セルロース硫酸、ヘミセルロース硫酸、デキストラン硫酸、アガロース硫酸、デキストリン硫酸、アミロース硫酸、アミロペクチン硫酸、グリコーゲン硫酸、プルラン硫酸、マンナン硫酸、グルコマンナン硫酸、リケナン硫酸、イソリケナン硫酸、ラミナラン硫酸、カラギーナン硫酸、キシラン硫酸、フルクタン硫酸、アルギン酸硫酸、ヒアルロン酸硫酸、コンドロイチン硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸などが挙げられる。また、これら硫酸エステルの鹸化物も好適なものとして挙げられる。
前記スルホン酸エステルとしては、アルキルスルホン酸エステル、アルケニルスルホン酸エステル、芳香族スルホン酸エステル、芳香族アルキルスルホン酸エステルが挙げられ、エステルとしてスルホン酸エステルを用いる場合には、これらのスルホン酸エステルから選ばれる少なくともいずれかを有することが好ましい。また、これらスルホン酸エステルの鹸化物も好適なものとして挙げられる。
前記リン酸エステルとしては、セルロースリン酸、ヘミセルロースリン酸、デキストランリン酸、アガロースリン酸、デキストリンリン酸、アミロースリン酸、アミロペクチンリン酸、グリコーゲンリン酸、プルランリン酸、マンナンリン酸、グルコマンナンリン酸、リケナンリン酸、イソリケナンリン酸、ラミナランリン酸、カラギーナンリン酸、キシランリン酸、フルクタンリン酸、アルギン酸リン酸、ヒアルロン酸リン酸、コンドロイチンリン酸、キチンリン酸、キトサンリン酸などが挙げられる。また、これらリン酸エステルの鹸化物も好適なものとして挙げられる。
前記ホスホン酸エステルとしては、セルロースホスホン酸、ヘミセルロースホスホン酸、デキストランホスホン酸、アガロースホスホン酸、デキストリンホスホン酸、アミロースホスホン酸、アミロペクチンホスホン酸、グリコーゲンホスホン酸、プルランホスホン酸、マンナンホスホン酸、グルコマンナンホスホン酸、リケナンホスホン酸、イソリケナンホスホン酸、ラミナランホスホン酸、カラギーナンホスホン酸、キシランホスホン酸、フルクタンホスホン酸、アルギン酸ホスホン酸、ヒアルロン酸ホスホン酸、コンドロイチンホスホン酸、キチンホスホン酸、キトサンホスホン酸などが挙げられる。また、これらホスホン酸エステルの鹸化物も好適なものとして挙げられる。
前記ピロリン酸エステルとしては、セルロースピロリン酸、ヘミセルロースピロリン酸、デキストランピロリン酸、アガロースピロリン酸、デキストリンピロリン酸、アミロースピロリン酸、アミロペクチンピロリン酸、グリコーゲンピロリン酸、プルランピロリン酸、マンナンピロリン酸、グルコマンナンピロリン酸、リケナンピロリン酸、イソリケナンピロリン酸、ラミナランピロリン酸、カラギーナンピロリン酸、キシランピロリン酸、フルクタンピロリン酸、アルギン酸ピロリン酸、ヒアルロン酸ピロリン酸、コンドロイチンピロリン酸、キチンピロリン酸、キトサンピロリン酸などが挙げられる。また、これらピロリン酸エステルの鹸化物も好適なものとして挙げられる。
前記多糖構造のエーテル誘導体におけるエーテルとして、多糖構造を有する有機材料としてセルロースを用いた場合のエーテルの例を以下に挙げるが、多糖の種類、エーテルの種類を含めてこれらに限定されない。
例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチル−カルバモイルエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、シアノエチルセルロース、カルバモイルエチルセルロース等が挙げられる。好ましくは、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースである。
例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチル−カルバモイルエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、シアノエチルセルロース、カルバモイルエチルセルロース等が挙げられる。好ましくは、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースである。
多糖構造を有する有機材料として、セルロースエステル誘導体を用いる場合について、以下に記す。セルロースエステル誘導体原料のセルロースとしては、綿花リンタや木材パルプ（広葉樹パルプ，針葉樹パルプ）、麻、酢酸菌培養過程で生成するセルロース等の天然セルロース、それらを酸加水分解、機械的に粉砕、爆砕処理、高温下に押出機処理によって重合度を調整したものなどがあり、何れの原料セルロースから得られるセルロースエステル誘導体でも使用でき、場合により混合して使用してもよい。これらの原料セルロースについての詳細な記載は、例えばプラスチック材料講座（１７）繊維素系樹脂（丸澤、宇田著、日刊工業新聞社、１９７０年発行）に記載されており、セルロースの分子量は広範囲で、例えば天然セルロースは６０万〜１５０万（重合度概算３５００〜１万）であり、精製リンタは８万〜５０万（重合度概算５００〜３０００）であり、木材パルプは８万〜１３４万（重合度概算５００〜２１００）である。分子量は、セルロースあるいはその誘導体の強度的性質に大きく影響し、分子量が小さくなるとある重合度から急にその力学的強度が低下するが、本発明に用いる核酸吸着性多孔性膜の原料としては問題なく使用できる。
前述の原料セルロースがそのままセルロースエステル誘導体原料として利用できる訳ではなく、リンタやパルプを精製して精製リンタと精製高級木材パルプとして用いられる。
リンタは綿実に綿繊維の中で繊維長が短い短繊維でありα−セルロース含量（例えば８８〜９２質量％）が多く純度が高く、不純物も少ない。この粗リンタはゴミ取り、アルカリ蒸煮、漂白、酸処理、脱水および乾燥によって精製リンタを得ることができる。これらの詳細はプラスチック材料講座（１７）繊維素系樹脂（丸澤、宇田著、日刊工業新聞社、１９７０年発行）の２５〜２８頁に記述され、表２・３にその特性が記載されている。本発明においては、この方法により、精製したリンタを用いることが好ましい。
リンタは綿実に綿繊維の中で繊維長が短い短繊維でありα−セルロース含量（例えば８８〜９２質量％）が多く純度が高く、不純物も少ない。この粗リンタはゴミ取り、アルカリ蒸煮、漂白、酸処理、脱水および乾燥によって精製リンタを得ることができる。これらの詳細はプラスチック材料講座（１７）繊維素系樹脂（丸澤、宇田著、日刊工業新聞社、１９７０年発行）の２５〜２８頁に記述され、表２・３にその特性が記載されている。本発明においては、この方法により、精製したリンタを用いることが好ましい。
精製パルプについても同著の２８〜３２頁に記述されており、表２・４にその特性が記載されている。本発明においては、該手法などで精製されたパルプもセルロースエステル誘導体原料として好ましい。精製された、綿花リンタや木材パルプ等は、単独でも混合して用いてもよい。混合して用いる場合、その割合は特に限定されないが好ましくは５／９５〜９５／５であり、より好ましくは１０／９０〜９０／１０である。多孔性膜を作製する際、混合することによって溶解性を向上させることができ、作製されるセルロースエステル誘導体多孔性膜の面状、力学特性を改良することができ、好ましい。
パルプの純度の指標となるα−セルロース含有量の点では、８０〜１００質量％の範囲から選択できる。木材パルプは、通常８５〜９８質量％程度である。本発明では低純度パルプ、例えばα−セルロース含有量８０〜９６質量％程度のパルプも使用できる。特にα−セルロース含有量９２〜９６質量％のパルプが好ましい。通常木材パルプを使用することができる。
さらに本発明の核酸吸着性多孔性膜には、パルプあるいは綿花中の中性構成糖成分はグルコースが主成分であるがさらにマンノースとキシロースとを含んでいてもよい。綿花中の中性構成糖成分については特開平１１−１３０３０１号公報に記載がある。マンノースとキシロースとを含む場合の比率は特に限定されないが、マンノース／キシロースのモル比は好ましくは、０．３５／１〜３．０／１であり、より好ましくは０．３５／１〜２．５／１、さらに好ましくは０．３５／１〜２／１である。マンノースとキシロースとを含む場合の作製されるセルローストリエステル誘導体における、マンノースおよびキシロースの総含有量は、好ましくは０．０１〜５モル％、より好ましくは０．１〜４モル％である。なお、「マンノース」「キシロース」は、パルプ中に含まれるヘミセルロース（キシラン、グルコマンナンなど）の主たる構成糖である。これらの原料パルプおよび得られたセルロースエステル誘導体の構成糖成分は、具体的には特開平１１−１３０３０１号に記載の方法で分析できる。
本発明の核酸吸着性多孔性膜においては、前記セルロースエステル誘導体の粘度平均重合度が２００〜３０００であることが好ましい。また、前記セルロースエステル誘導体の質量平均分子量と数平均分子量の比が０．８〜２であることが好ましい。さらに、前記セルロースエステル誘導体が酸解離指数１．９３〜４．５の酸またはその塩を含有することが好ましい。
また、前記セルロースエステル誘導体が、残存酢酸量あるいは炭素数３〜２２の脂肪酸が０．５質量％以下であることが好ましい。さらには、セルロースエステル誘導体が、アルカリ金属及びアルカリ土類金属から選ばれる少なくとも一種を１ｐｐｂ〜１００００ｐｐｍ含有していることが好ましい。さらに、前記セルロースエステル誘導体が、アルミニウム、ビスマス、ケイ素、重金属（クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、砒素、銀、カドミウム、スズ、アンチモン、金、白金、水銀、鉛など）の少なくとも一種を、１ｐｐｂ〜１０００ｐｐｍ含有することが好ましい。
以下に、再生セルロース多孔性膜およびその作製について記載するが、本発明に使用することのできる、再生セルロース多孔性膜はこれらに限定されるものではない。
アセチルセルロース多孔性膜から作製する再生セルロース多孔性膜については、特公昭４５−４６３３号公報、特開昭５６−１００６０４号公報、等に記載の原料、方法で得られるものを使用することができる。
セルロースの銅アンモニア溶液から作製する再生セルロース多孔性膜については、特開昭５８−８９６２５号公報、特開昭５８−８９６２６号公報、特開昭５８−８９６２７号公報、特開昭５８−８９６２８号公報、特開昭５９−４５３３３号公報、特開昭５９−４５３３４号公報、特開昭５９−１９９７２８号公報、特開昭６１−２７４７０７号公報、特開昭６２−１４０３号公報、特開昭６３−１６１９７２号公報、特開平７−３３０９４５号公報、等に記載の原料、方法で得られるものを使用することができる。
セルロースにアルカリと二硫化炭素を作用させて得られるビスコース溶液からも同様に原液組成や凝固方法を工夫することによって、再生セルロース多孔性膜が得られ、本発明に使用することができる。
セルロースのアルカリ溶液から作製する再生セルロース多孔性膜は、特開昭６２−２４０３２８号公報、特開昭６２−２４０３２９号公報、特開平１−１８８５３９号公報、等に記載の原料、方法で得られるものを使用することができる。
アセチルセルロース多孔性膜から作製する再生セルロース多孔性膜については、特公昭４５−４６３３号公報、特開昭５６−１００６０４号公報、等に記載の原料、方法で得られるものを使用することができる。
セルロースの銅アンモニア溶液から作製する再生セルロース多孔性膜については、特開昭５８−８９６２５号公報、特開昭５８−８９６２６号公報、特開昭５８−８９６２７号公報、特開昭５８−８９６２８号公報、特開昭５９−４５３３３号公報、特開昭５９−４５３３４号公報、特開昭５９−１９９７２８号公報、特開昭６１−２７４７０７号公報、特開昭６２−１４０３号公報、特開昭６３−１６１９７２号公報、特開平７−３３０９４５号公報、等に記載の原料、方法で得られるものを使用することができる。
セルロースにアルカリと二硫化炭素を作用させて得られるビスコース溶液からも同様に原液組成や凝固方法を工夫することによって、再生セルロース多孔性膜が得られ、本発明に使用することができる。
セルロースのアルカリ溶液から作製する再生セルロース多孔性膜は、特開昭６２−２４０３２８号公報、特開昭６２−２４０３２９号公報、特開平１−１８８５３９号公報、等に記載の原料、方法で得られるものを使用することができる。
特に好ましい、セルロースエステル誘導体の多孔性膜としては、エステル価の異なるセルロースエステル誘導体の混合物から成る有機高分子の多孔性膜を挙げることができる。エステル価の異なるセルロースエステル誘導体の混合物として、セルローストリエステル誘導体とセルロースジエステル誘導体の混合物、セルローストリエステル誘導体とセルロースモノエステル誘導体の混合物、セルローストリエステル誘導体とセルロースジエステル誘導体とセルロースモノエステル誘導体の混合物、セルロースジエステル誘導体とセルロースモノエステル誘導体の混合物を好ましく使用する事ができる。特にセルローストリエステル誘導体とセルロースジエステル誘導体の混合物が好ましい。セルローストリエステル誘導体とセルロースジエステル誘導体の混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９である事が好ましく、９０：１０〜５０：５０である事がより好ましい。
さらには、特開平１０−４５８０３号、特開平１１−２６９３０４号、特開平８−２３１７６１号、特開平８−２３１７６１号、特開平１０−６０１７０号、特開平９−４０７９２号、特開平１１−５８５１号、特開平１１−２６９３０４号、特開平９−９０１０１号、特開昭５７−１８２７３７号、特開平４−２７７５３０号、特開平１１−２９２９８９号、特開平１２−１３１５２４号、特開平１２−１３７１１５号公報などに記載のセルロースエステル誘導体、方法により得られる膜を利用することも好ましい。
前記した鹸化物を得るには、鹸化を行う。鹸化とは、エステル誘導体を鹸化処理液(例えば水酸化ナトリウム水溶液)に接触させることを言う。これにより、鹸化処理液に接触したエステル誘導体のエステル部位が加水分解され、水酸基が導入される。鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度、処理温度、処理時間を変えて鹸化処理を行えば良い。鹸化率は、ＮＭＲ、ＩＲ又はＸＰＳにより、容易に測定することができる（例えば、カルボニル基のピーク減少の程度で定めることができる）。
前記した、エステル誘導体を含んで作製された多孔性膜を表面鹸化することが好ましい。この場合、鹸化処理の程度（鹸化率）で固相表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。核酸の分離効率をあげるためには、水酸基の量（密度）が多い方が好ましい。例えば、エステル誘導体を含んで作製された多孔性膜の鹸化率（表面鹸化率）は、５％以上１００％以下であることが好ましく、１０％以上１００％以下であることが更に好ましい。また、水酸基を有する有機高分子の表面積を大きくするために、セルローストリエステル誘導体の多孔性膜を鹸化することが好ましい。
多孔性膜は、表裏対称性の多孔性膜を使うと膜の表裏を区別することなく製造できるため好ましく、また、表裏非対称性の多孔性膜を使用することで目詰まりのリスクを低減できるため好ましく使用することができる。
多孔性膜は、表裏対称性の多孔性膜を使うと膜の表裏を区別することなく製造できるため好ましく、また、表裏非対称性の多孔性膜を使用することで目詰まりのリスクを低減できるため好ましく使用することができる。
｛親水基を持たない有機材料｝
親水基を持たない有機材料の多孔性膜に多糖構造を導入する方法として、ポリマー鎖内または側鎖に親水基を有すグラフトポリマー鎖を多孔性膜に結合することができる。有機材料の多孔性膜にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする２つの方法がある。
親水基を持たない有機材料の多孔性膜に多糖構造を導入する方法として、ポリマー鎖内または側鎖に親水基を有すグラフトポリマー鎖を多孔性膜に結合することができる。有機材料の多孔性膜にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする２つの方法がある。
まず、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法においては、ポリマーの末端または側鎖に多孔性膜と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と、多孔性膜の官能基とを化学反応させることでグラフトさせることができる。多孔性膜と反応する官能基としては、多孔性膜の官能基と反応し得るものであれば特に限定はないが、例えば、アルコキシシランのようなシランカップリング基、イソシアネート基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、カルボニル基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、アリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基、アミド基、ヒドラジド基、アルデヒド基、チオール基、スクシイミド基等を挙げることができる。
ポリマーの末端、または側鎖に反応性官能基を有するポリマーとして特に有用な化合物は、トリアルコキシシリル基をポリマー末端に有するポリマー、アミノ基をポリマー末端に有するポリマー、カルボキシル基をポリマー末端に有するポリマー、エポキシ基をポリマー末端に有するポリマー、イソシアネート基をポリマー末端に有するポリマーが挙げられる。この時に使用されるポリマーとしては、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、具体的には、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、ポリ乳酸、ポリケトン、ポリエーテルイミド、ポリアミドイミド、ポリフェニレンスルホン、ポリフェニレンスルフィドスルホン、ナイロン、Ｎ−メチル変性ナイロン、Ｎ−アルコキシメチル変性ナイロン、Ｎ−アルキルチオメチル変性ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリアリルアミン、ポリウレタン、フィブロイン、ポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ナイロン４６、ナイロン６６、ナイロン６１０、ナイロン６１２、ナイロン６、ナイロン７、ナイロン１１、ナイロン１２、Ｎ−メチル変性ナイロン、Ｎ−アルコキシメチル変性ナイロン、Ｎ−アルキルチオメチル変性ナイロン等の変性ナイロン、多糖類エステル誘導体及びそれらの鹸化物、エステル価の異なる多糖類エステル誘導体混合物及びそれらの鹸化物などを挙げることができる。
多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させ、グラフトポリマー鎖とする方法は、一般的には表面グラフト重合と呼ばれる。表面グラフト重合法とは、プラズマ照射、光照射、加熱などの方法で基材表面上に活性種を与え、多孔性膜と接するように配置された重合可能な二重結合を有する化合物を重合によって多孔性膜と結合させる方法を指す。
基材に結合しているグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば、親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。
基材に結合しているグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば、親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。
特に有用な親水基を有するモノマーの具体例としては、次のモノマーを挙げることができる。例えば、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノメタクリレート等の水酸性基含有モノマーを特に好ましく用いることができる。また、アクリル酸、メタアクリル酸等のカルボキシル基含有モノマー、もしくはそのアルカリ金属塩及びアミン塩、アクリルアミド等も好ましく用いることができる。
親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。該ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、ポリ乳酸、ポリケトン、ポリエーテルイミド、ポリアミドイミド、ポリフェニレンスルホン、ポリフェニレンスルフィドスルホン、ナイロン、Ｎ−メチル変性ナイロン、Ｎ−アルコキシメチル変性ナイロン、Ｎ−アルキルチオメチル変性ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリアリルアミン、ポリウレタン、フィブロイン、ポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ナイロン４６、ナイロン６６、ナイロン６１０、ナイロン６１２、ナイロン６、ナイロン７、ナイロン１１、ナイロン１２、Ｎ−メチル変性ナイロン、Ｎ−アルコキシメチル変性ナイロン、Ｎ−アルキルチオメチル変性ナイロン等の変性ナイロン、多糖類エステル誘導体及びそれらの鹸化物、エステル価の異なる多糖類エステル誘導体混合物及びそれらの鹸化物などを挙げることができ、多糖構造を有するポリマーが好ましい。
また、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングした、アセチルセルロースまたはアセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が５％以上１００％以下であることが好ましい。さらには、鹸化率が１０％以上１００％以下であることが好ましい。
｛親水基を持たない無機材料｝
親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法としては、多孔性膜と親水基をもつグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する２つの方法がある。
多孔性膜と親水基をもつグラフトポリマー鎖とを化学結合させる場合は、グラフトポリマー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。
親水基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、前記、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法において記載した親水基を有するグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。
親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法としては、多孔性膜と親水基をもつグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する２つの方法がある。
多孔性膜と親水基をもつグラフトポリマー鎖とを化学結合させる場合は、グラフトポリマー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。
親水基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、前記、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法において記載した親水基を有するグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。
親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。該ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、ポリ乳酸、ポリケトン、ポリエーテルイミド、ポリアミドイミド、ポリフェニレンスルホン、ポリフェニレンスルフィドスルホン、ナイロン、Ｎ−メチル変性ナイロン、Ｎ−アルコキシメチル変性ナイロン、Ｎ−アルキルチオメチル変性ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリアリルアミン、ポリウレタン、フィブロイン、ポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ナイロン４６、ナイロン６６、ナイロン６１０、ナイロン６１２、ナイロン６、ナイロン７、ナイロン１１、ナイロン１２、Ｎ−メチル変性ナイロン、Ｎ−アルコキシメチル変性ナイロン、Ｎ−アルキルチオメチル変性ナイロン等の変性ナイロン、多糖類エステル誘導体及びそれらの鹸化物、エステル価の異なる多糖類エステル誘導体混合物及びそれらの鹸化物などを挙げることができる。
親水基を持たない無機材料の多孔性膜としては、アルミニウム等の金属、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス、もしくはニューセラミックス、シリコン、活性炭、アルミノケイ酸塩等を加工して作製した多孔性膜を挙げることができる。
また、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に、セルロースエステル誘導体または、エステル価の異なるセルロースエステル誘導体の混合物をコーティングした後に、コーティングしたセルロースエステル誘導体または、エステル価の異なるセルロースエステル誘導体の混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が５％以上１００％以下であることが好ましい。さらには、鹸化率が１０％以上１００％以下であることが好ましい。
｛添加剤｝
本発明の核酸分離精製方法において用いられる核酸吸着性多孔性膜は、添加剤を含んでなる多孔性膜を用いることを特徴とする。添加剤は、可塑剤、静電防止剤、劣化防止剤、紫外線防止剤、界面活性剤、剥離剤、着色剤、補強剤、架橋剤が挙げられ、核酸吸着性多孔性膜はこの中から選ばれる少なくとも１種を含んでなることが好ましい。これらの添加剤は、用途に応じて選ぶことができ、１種でも、また複数種でもよい。添加剤を添加する時期は、核酸吸着性多孔性膜を溶液流延製膜によって作製する場合には、膜作製に使用するドープ溶液の調製の何れの時期に添加しても良い。予めドープ溶液の組成物の一つとして添加してもよいが、ドープ溶液調製の最後に、すなわちドープ溶液を流延する直前に添加混合する、いわゆる直前添加方法を採用してもよい。製膜後に含浸することにより膜に添加することもできる。
本発明の核酸分離精製方法において用いられる核酸吸着性多孔性膜は、添加剤を含んでなる多孔性膜を用いることを特徴とする。添加剤は、可塑剤、静電防止剤、劣化防止剤、紫外線防止剤、界面活性剤、剥離剤、着色剤、補強剤、架橋剤が挙げられ、核酸吸着性多孔性膜はこの中から選ばれる少なくとも１種を含んでなることが好ましい。これらの添加剤は、用途に応じて選ぶことができ、１種でも、また複数種でもよい。添加剤を添加する時期は、核酸吸着性多孔性膜を溶液流延製膜によって作製する場合には、膜作製に使用するドープ溶液の調製の何れの時期に添加しても良い。予めドープ溶液の組成物の一つとして添加してもよいが、ドープ溶液調製の最後に、すなわちドープ溶液を流延する直前に添加混合する、いわゆる直前添加方法を採用してもよい。製膜後に含浸することにより膜に添加することもできる。
（可塑剤）
可塑剤としては、特開２００２−２６５６３６に記載のリン酸エステル、カルボン酸エステル、また、特開平２−６８２６に記載の多価アルコール、また、特開平５−１９４７８８号、特開昭６０−２５００５３号、特開平４−２２７９４１号、特開平６−１６８６９号、特開平５−２７１４７１号、特開平７−２８６０６８号、特開平５−５０４７号、特開平１１−８０３８１号、特開平７−２０３１７号、特開平８−５７８７９号、特開平１０−１５２５６８号、特開平１０−１２０８２４号、特開平１１−１２４４４５号記載の（ジ）ペンタエリスリトールエステル類、特開平１１−２４６７０４号記載のグリセロールエステル類、特開２０００−６３５６０号記載のジグリセロールエステル類、特開平１１−９２５７４号記載のクエン酸エステル類、特開平１１−９０９４６号記載の置換フェニルリン酸エステル類、特開昭５６−１００６０４号の各公報などに記載されている可塑剤が挙げられる。可塑剤の利用方法および特性は、これらの各公報に記載されており、本発明に適用することができる。
可塑剤としては、特開２００２−２６５６３６に記載のリン酸エステル、カルボン酸エステル、また、特開平２−６８２６に記載の多価アルコール、また、特開平５−１９４７８８号、特開昭６０−２５００５３号、特開平４−２２７９４１号、特開平６−１６８６９号、特開平５−２７１４７１号、特開平７−２８６０６８号、特開平５−５０４７号、特開平１１−８０３８１号、特開平７−２０３１７号、特開平８−５７８７９号、特開平１０−１５２５６８号、特開平１０−１２０８２４号、特開平１１−１２４４４５号記載の（ジ）ペンタエリスリトールエステル類、特開平１１−２４６７０４号記載のグリセロールエステル類、特開２０００−６３５６０号記載のジグリセロールエステル類、特開平１１−９２５７４号記載のクエン酸エステル類、特開平１１−９０９４６号記載の置換フェニルリン酸エステル類、特開昭５６−１００６０４号の各公報などに記載されている可塑剤が挙げられる。可塑剤の利用方法および特性は、これらの各公報に記載されており、本発明に適用することができる。
（静電防止剤）
静電防止剤は、膜を取扱う際に膜が帯電するのを防ぐ目的で添加することができる。静電防止剤としては、イオン導電性物質、導電性微粒子、有機電子導電性有機化合物が挙げられる。
ここでイオン導電性物質とは電気伝導性を示し、電気を運ぶ担体であるイオンを含有する物質のことである。イオン導電性物質の例としてはイオン性高分子化合物を挙げることができる。イオン性高分子化合物としては、特公昭４９−２３８２８号、特公昭４９−２３８２７号、特公昭４７−２８９３７号の各公報に見られるようなアニオン性高分子化合物；特公昭５５−７３４号、特開昭５０−５４６７２号、特公昭５９−１４７３５号、特公昭５７−１８１７５号、特公昭５７−１８１７６号、特公昭５７−５６０５９号の各公報などに見られるような、主鎖中に解離基を持つアイオネン型ポリマー；特公昭５３−１３２２３号、特公昭５７−１５３７６号、特公昭５３−４５２３１号、特公昭５５−１４５７８３号、特公昭５５−６５９５０号、特公昭５５−６７７４６号、特公昭５７−１１３４２号、特公昭５７−１９７３５号、特公昭５８−５６８５８号、特開昭６１−２７８５３号、特公昭６２−９３４６号の各公報に見られるような、側鎖中にカチオン性解離基を持つカチオン性ペンダント型ポリマー；等を挙げることができる。
静電防止剤は、膜を取扱う際に膜が帯電するのを防ぐ目的で添加することができる。静電防止剤としては、イオン導電性物質、導電性微粒子、有機電子導電性有機化合物が挙げられる。
ここでイオン導電性物質とは電気伝導性を示し、電気を運ぶ担体であるイオンを含有する物質のことである。イオン導電性物質の例としてはイオン性高分子化合物を挙げることができる。イオン性高分子化合物としては、特公昭４９−２３８２８号、特公昭４９−２３８２７号、特公昭４７−２８９３７号の各公報に見られるようなアニオン性高分子化合物；特公昭５５−７３４号、特開昭５０−５４６７２号、特公昭５９−１４７３５号、特公昭５７−１８１７５号、特公昭５７−１８１７６号、特公昭５７−５６０５９号の各公報などに見られるような、主鎖中に解離基を持つアイオネン型ポリマー；特公昭５３−１３２２３号、特公昭５７−１５３７６号、特公昭５３−４５２３１号、特公昭５５−１４５７８３号、特公昭５５−６５９５０号、特公昭５５−６７７４６号、特公昭５７−１１３４２号、特公昭５７−１９７３５号、特公昭５８−５６８５８号、特開昭６１−２７８５３号、特公昭６２−９３４６号の各公報に見られるような、側鎖中にカチオン性解離基を持つカチオン性ペンダント型ポリマー；等を挙げることができる。
導電性微粒子は、粒子状の導電性物質のことであり、微分散して添加することにより、核酸吸着性多孔性膜中に粒子状の導電性物質が分散されていることが好ましい。導電性微粒子は、金属酸化物やこれらの複合酸化物からなる導電性微粒子及び分散性粒状ポリマー｛アイオネン導電性ポリマー粒子或いは分子間架橋を有するカチオン導電性ポリマー粒子（例えば、特開平９−２０３８１０号公報に記載されているアイオネン導電性ポリマー粒子、分子間架橋を有する第４級アンモニウムカチオン導電性ポリマー粒子）｝から選ばれることが好ましい。好ましい粒径は、５ｎｍ〜１０μｍの範囲である。粒径の更に好ましい範囲は用いられる導電性物質の種類に依存する。
金属酸化物の例としては、ＺｎＯ、ＴｉＯ2 、ＳｎＯ2 、Ａｌ2 Ｏ3 、Ｉｎ2 Ｏ3 、ＳｉＯ2 、ＭｇＯ、ＢａＯ、ＭｏＯ2 、Ｖ2 Ｏ5 等、或いはこれらの複合酸化物が好ましく、特にＺｎＯ、ＴｉＯ2 及びＳｎＯ2 が好ましい。異種原子を含む例としては、例えばＺｎＯに対してはＡｌ、Ｉｎ等の添加、ＴｉＯ2 に対してはＮｂ、Ｔａ等の添加、又ＳｎＯ2 に対しては、Ｓｂ、Ｎｂ、ハロゲン元素等の添加が効果的である。これら異種原子の添加量は導電性微粒子中０．０１〜２５ｍｏｌ％の範囲が好ましいが、０．１〜１５ｍｏｌ％の範囲が特に好ましい。また、これらの金属酸化物やこれらの複合酸化物からなる導電性微粒子の体積抵抗率は１０7Ωｃｍ以下、特に１０5Ωｃｍ以下であることが好ましい。
金属酸化物やこれらの複合酸化物からなる導電性微粒子の１次粒子径は１００Å以上０．２μｍ以下であることが好ましく、高次構造の長径が３０ｎｍ以上６μｍ以下であることが好ましい。
金属酸化物やこれらの複合酸化物からなる導電性微粒子は核酸吸着性多孔性膜に体積分率で０．０１％以上２０％以下含まれていることが好ましい。
金属酸化物の例としては、ＺｎＯ、ＴｉＯ2 、ＳｎＯ2 、Ａｌ2 Ｏ3 、Ｉｎ2 Ｏ3 、ＳｉＯ2 、ＭｇＯ、ＢａＯ、ＭｏＯ2 、Ｖ2 Ｏ5 等、或いはこれらの複合酸化物が好ましく、特にＺｎＯ、ＴｉＯ2 及びＳｎＯ2 が好ましい。異種原子を含む例としては、例えばＺｎＯに対してはＡｌ、Ｉｎ等の添加、ＴｉＯ2 に対してはＮｂ、Ｔａ等の添加、又ＳｎＯ2 に対しては、Ｓｂ、Ｎｂ、ハロゲン元素等の添加が効果的である。これら異種原子の添加量は導電性微粒子中０．０１〜２５ｍｏｌ％の範囲が好ましいが、０．１〜１５ｍｏｌ％の範囲が特に好ましい。また、これらの金属酸化物やこれらの複合酸化物からなる導電性微粒子の体積抵抗率は１０7Ωｃｍ以下、特に１０5Ωｃｍ以下であることが好ましい。
金属酸化物やこれらの複合酸化物からなる導電性微粒子の１次粒子径は１００Å以上０．２μｍ以下であることが好ましく、高次構造の長径が３０ｎｍ以上６μｍ以下であることが好ましい。
金属酸化物やこれらの複合酸化物からなる導電性微粒子は核酸吸着性多孔性膜に体積分率で０．０１％以上２０％以下含まれていることが好ましい。
分散性粒状ポリマーとしては、分子間架橋を有するカチオン導電性ポリマー粒子が好ましい。分子間架橋を有するカチオン導電性ポリマー粒子の特徴は、粒子内のカチオン成分を高濃度、高密度に持たせることができるため優れた導電性を有していること、低相対湿度下においても導電性の劣化は見られないこと、粒子同志が分散状態において分散性がよく、しかも流延して膜を形成した場合に粒子同志の接着性がよいため膜強度も強く、耐薬品性に優れていることである。また、分子間架橋を有するカチオン導電性ポリマー粒子は一般に粒子サイズが１０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲にあり、好ましくは２０ｎｍ〜３００ｎｍの粒子が用いられる。「分散性粒状ポリマー」とは、視覚的観察によって透明又はわずかに濁った溶液に見えるが、電子顕微鏡の下では粒状分散物として見えるポリマーである。
分散性粒状ポリマーの体積抵抗率は１０7Ωｃｍ以下、特に１０5Ωｃｍ以下であることが好ましい。分散性粒状ポリマーは核酸吸着性多孔性膜に体積分率で０．０１％以上２０％以下含まれていることが好ましい。
分散性粒状ポリマーの体積抵抗率は１０7Ωｃｍ以下、特に１０5Ωｃｍ以下であることが好ましい。分散性粒状ポリマーは核酸吸着性多孔性膜に体積分率で０．０１％以上２０％以下含まれていることが好ましい。
有機電子導電性有機化合物としては、ポリチオフェン、ポリピロール、ポリアニリン、ポリアセチレン、ポリフォスファゼンなどが挙げられる。これらは、酸供与材としてポリスチレンスルフォン酸、過塩素酸などとの錯体で好ましく用いられる。
有機電子導電性有機化合物の体積抵抗率は１０7Ωｃｍ以下、特に１０5Ωｃｍ以下であることが好ましい。有機電子導電性有機化合物は核酸吸着性多孔性膜に体積分率で０．０１％以上２０％以下含まれていることが好ましい。
有機電子導電性有機化合物の体積抵抗率は１０7Ωｃｍ以下、特に１０5Ωｃｍ以下であることが好ましい。有機電子導電性有機化合物は核酸吸着性多孔性膜に体積分率で０．０１％以上２０％以下含まれていることが好ましい。
（劣化防止剤、紫外線防止剤）
劣化防止剤としては、酸化防止剤、過酸化物分解剤、ラジカル禁止剤、金属不活性化剤、酸捕獲剤、アミンが挙げられる。劣化防止剤や紫外線防止剤は、特開昭６０−２３５８５２号、特開平３−１９９２０１号、特開平５−１９０７０７号、特開平５−１９４７８９号、特開平５−２７１４７１号、特開平６−１０７８５４号、特開平６−１１８２３３号、特開平６−１４８４３０号、特開平７−１１０５６号、特開平７−１１０５５号、特開平７−１１０５６号、特開平８−２９６１９号、特開平８−２３９５０９号、特開平７−１１０５６号、特開２０００−２０４１７３号、特開平５−１９７０７３号、特開平５−１９４７８９号、特開平６−１０７８５４号、特開昭６０−２３５８５２号、特開平１２−１９３８２１号、特開平８−２９６１９号、特開平６−１１８２３３号、特開平６−１４８４３０号、特開２００２−２６５６３６号、特開平５−１９７０７３号の各公報などに記載されているものを好ましく用いることができる。特に好ましい劣化防止剤の例としては、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を挙げることができる。特に好ましい紫外線防止剤の例としては、トリアジン系化合物を挙げることができる。
劣化防止剤としては、酸化防止剤、過酸化物分解剤、ラジカル禁止剤、金属不活性化剤、酸捕獲剤、アミンが挙げられる。劣化防止剤や紫外線防止剤は、特開昭６０−２３５８５２号、特開平３−１９９２０１号、特開平５−１９０７０７号、特開平５−１９４７８９号、特開平５−２７１４７１号、特開平６−１０７８５４号、特開平６−１１８２３３号、特開平６−１４８４３０号、特開平７−１１０５６号、特開平７−１１０５５号、特開平７−１１０５６号、特開平８−２９６１９号、特開平８−２３９５０９号、特開平７−１１０５６号、特開２０００−２０４１７３号、特開平５−１９７０７３号、特開平５−１９４７８９号、特開平６−１０７８５４号、特開昭６０−２３５８５２号、特開平１２−１９３８２１号、特開平８−２９６１９号、特開平６−１１８２３３号、特開平６−１４８４３０号、特開２００２−２６５６３６号、特開平５−１９７０７３号の各公報などに記載されているものを好ましく用いることができる。特に好ましい劣化防止剤の例としては、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を挙げることができる。特に好ましい紫外線防止剤の例としては、トリアジン系化合物を挙げることができる。
劣化防止剤および紫外線防止剤は、併用してもよい。劣化防止剤又は紫外線防止剤の添加量は、ドープ溶液中０．０１〜１質量％であることが好ましく、０．０１〜０．０８質量％であることがさらに好ましい。劣化防止剤および紫外線防止剤を併用した場合には、添加の合計量が上記の範囲内にあることが好ましい。添加量が上記の範囲内であれば、多孔性膜表面に劣化防止剤および／または紫外線防止剤のブリードアウト（滲み出し）が起こらずに、劣化防止剤および／または紫外線防止剤の効果が認められ、好ましい。本発明では、沸点が２００℃以上であり２５℃で液体であるか、または融点が２５〜２５０℃であり標準温度２０℃で固体である劣化防止剤および／または紫外線防止剤が好ましく用いられる。更に好ましくは、沸点が２５０℃以上であり２５℃で液体であるか、または融点が２５〜２００℃であり標準温度２０℃で固体である劣化防止剤および／または紫外線防止剤である。劣化防止剤や紫外線防止剤が液体の場合は、その精製は通常減圧蒸留によって実施されるが高真空であるほど好ましく、例えば１００Ｐａ以下であることが好ましい。また分子蒸留装置などを用いて精製することも好ましい。また劣化防止剤や紫外線防止剤が固体の場合は、溶媒を用いて再結晶させてろ過し、洗浄し乾燥することで実施することが一般的である。
（界面活性剤）
界面活性剤については、特開２００２−２６５６３６号公報、特公昭５５−３１４１８号公報、界面活性剤等一覧表２００１年度版（日本界面活性剤工業会）、界面活性剤の応用（幸書房、刈米孝夫著、昭和５５年９月１日発行）等に記載されているものが好ましく用いられるが、これらに限定されるものではない。本発明においては、好ましい界面活性剤はその種類、使用量において特に限定されず、目的とする界面活性特性が得られる量であればよい。
界面活性剤については、特開２００２−２６５６３６号公報、特公昭５５−３１４１８号公報、界面活性剤等一覧表２００１年度版（日本界面活性剤工業会）、界面活性剤の応用（幸書房、刈米孝夫著、昭和５５年９月１日発行）等に記載されているものが好ましく用いられるが、これらに限定されるものではない。本発明においては、好ましい界面活性剤はその種類、使用量において特に限定されず、目的とする界面活性特性が得られる量であればよい。
（剥離剤）
剥離剤は、核酸吸着性多孔性膜製造時に支持体から多孔性膜を剥離するときの荷重を小さくするために用いることができる。剥離剤としては、界面活性剤が有効に用いられ、剥離剤として用いることのできる界面活性剤としてはリン酸系、スルフォン酸系、カルボン酸系、ノニオン系、カチオン系など特に限定されない。これらは、例えば特開昭６１−２４３８３７号、特開２０００−９９８４７号公報などに記載されている。
また、剥離剤として、特開平１０−３１６７０１号公報に記載の、酸解離指数ｐＫａ１．９３〜４．５０の酸またはその塩も挙げることができる。上記の範囲内であれば、無機酸または有機酸のいずれであってもよい。酸のｐＫａについては「改訂３版 化学便覧，基礎編II」（（財）日本化学会編，丸善（株）発行）を参照できる。酸解離指数は、好ましくは２．０〜４．４、より好ましくは２．２〜４．３、さらに好ましくは２．６〜４．３、特に好ましくは２．６〜４．０である。
さらにまた、特開２００２−２６５６３６号公報に記載の剥離剤を好ましく用いることができる。
上記の各公報、化学便覧等に記載されている剥離剤は、これらの各公報、化学便覧等に記載の該剥離剤の利用方法あるいはその特性を、本発明の核酸吸着性多孔性膜において同様に適用することができる。
剥離剤は、核酸吸着性多孔性膜製造時に支持体から多孔性膜を剥離するときの荷重を小さくするために用いることができる。剥離剤としては、界面活性剤が有効に用いられ、剥離剤として用いることのできる界面活性剤としてはリン酸系、スルフォン酸系、カルボン酸系、ノニオン系、カチオン系など特に限定されない。これらは、例えば特開昭６１−２４３８３７号、特開２０００−９９８４７号公報などに記載されている。
また、剥離剤として、特開平１０−３１６７０１号公報に記載の、酸解離指数ｐＫａ１．９３〜４．５０の酸またはその塩も挙げることができる。上記の範囲内であれば、無機酸または有機酸のいずれであってもよい。酸のｐＫａについては「改訂３版 化学便覧，基礎編II」（（財）日本化学会編，丸善（株）発行）を参照できる。酸解離指数は、好ましくは２．０〜４．４、より好ましくは２．２〜４．３、さらに好ましくは２．６〜４．３、特に好ましくは２．６〜４．０である。
さらにまた、特開２００２−２６５６３６号公報に記載の剥離剤を好ましく用いることができる。
上記の各公報、化学便覧等に記載されている剥離剤は、これらの各公報、化学便覧等に記載の該剥離剤の利用方法あるいはその特性を、本発明の核酸吸着性多孔性膜において同様に適用することができる。
（着色剤）
着色剤としては、公知の色素、染料、顔料、酸化発色色素、還元発色色素、ｐＨ指示薬、蛍光色素、カップリング色素、紫外線吸色素、赤外線吸色素、近赤外線吸収色素、感圧色素、フォトクロミック色素、サーモクロミック色素、エレクトロクロミック色素、有機発光色素、光電変換色素、増感色素、２色性色素、エレクトロルミネッセンス色素、食品用色素、有機非線形光学色素、化学発光用色素、医薬品用色素、医療診断用色素、化粧品用色素、半導体レーザー用色素、昇華転写用色素、溶融転写用色素、感熱色素、ロイコ色素、電磁波吸収色素、光導電性色素、帯電性色素等の、有機もしくは無機または有機無機複合の着色剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
これらの着色剤は、単独でも複数の種類を用いることもできる。添加量・濃度は、使用する着色剤により、所望の量・濃度で使用することができる。また併用する界面活性剤や保護ポリマー等の分散剤により、所望の量・濃度で使用することができる。
着色剤としては、公知の色素、染料、顔料、酸化発色色素、還元発色色素、ｐＨ指示薬、蛍光色素、カップリング色素、紫外線吸色素、赤外線吸色素、近赤外線吸収色素、感圧色素、フォトクロミック色素、サーモクロミック色素、エレクトロクロミック色素、有機発光色素、光電変換色素、増感色素、２色性色素、エレクトロルミネッセンス色素、食品用色素、有機非線形光学色素、化学発光用色素、医薬品用色素、医療診断用色素、化粧品用色素、半導体レーザー用色素、昇華転写用色素、溶融転写用色素、感熱色素、ロイコ色素、電磁波吸収色素、光導電性色素、帯電性色素等の、有機もしくは無機または有機無機複合の着色剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
これらの着色剤は、単独でも複数の種類を用いることもできる。添加量・濃度は、使用する着色剤により、所望の量・濃度で使用することができる。また併用する界面活性剤や保護ポリマー等の分散剤により、所望の量・濃度で使用することができる。
（補強剤）
補強剤は、核酸吸着性多孔性膜の膜強度を向上させる目的で添加することができる。補強剤としては、繊維状または針状結晶状のものであれば使用することができる。例えば、ガラス繊維、炭素繊維、ケイ素繊維、セルロース繊維、パルプ繊維、チタン酸カリウム繊維、炭化ケイ素ウィスカー、窒化ケイ素ウィスカー、酸化亜鉛ウィスカー、ホウ酸アルミニウムウィスカー、塩基性硫酸マグネシウムおよび繊維状ゾノトライト、チタン酸カリウムウィスカー、シリコンカーバイト（ＳｉＣ）ウィスカー、ウィスカー状炭酸カルシウムなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、耐折性を向上させるために合成ポリマーを添加することもでき、特開昭５４−１１０８１号公報に記載されているポリウレタン等を好ましく使用することができるが、これらに限定されるものではない。
補強剤は、核酸吸着性多孔性膜の膜強度を向上させる目的で添加することができる。補強剤としては、繊維状または針状結晶状のものであれば使用することができる。例えば、ガラス繊維、炭素繊維、ケイ素繊維、セルロース繊維、パルプ繊維、チタン酸カリウム繊維、炭化ケイ素ウィスカー、窒化ケイ素ウィスカー、酸化亜鉛ウィスカー、ホウ酸アルミニウムウィスカー、塩基性硫酸マグネシウムおよび繊維状ゾノトライト、チタン酸カリウムウィスカー、シリコンカーバイト（ＳｉＣ）ウィスカー、ウィスカー状炭酸カルシウムなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、耐折性を向上させるために合成ポリマーを添加することもでき、特開昭５４−１１０８１号公報に記載されているポリウレタン等を好ましく使用することができるが、これらに限定されるものではない。
（架橋剤）
架橋剤としては、公知のものが使用できるが、核酸吸着性多孔性膜の持つ官能基にあわせてより適切な種類を選ぶことが好ましい。官能基が水酸基の場合には、特開平７−２５６０６６号公報、特開平３−６８４３１号公報などに記載された架橋剤が好ましく使用できるが、これらに限定されるものではない。
架橋剤としては、公知のものが使用できるが、核酸吸着性多孔性膜の持つ官能基にあわせてより適切な種類を選ぶことが好ましい。官能基が水酸基の場合には、特開平７−２５６０６６号公報、特開平３−６８４３１号公報などに記載された架橋剤が好ましく使用できるが、これらに限定されるものではない。
（湿潤剤）
湿潤剤としては、特開昭６３−２６２５５０号公報、特開昭６３−２６２５４９号公報、特公昭５５−３１４１８号公報に記載のものが好ましく使用できるが、これらに限定されるものではない。
上記の各公報に記載されている湿潤剤は、これらの各公報に記載の湿潤剤の利用方法あるいはその特性を、本発明の核酸吸着性多孔性膜において同様に適用することができる。
湿潤剤としては、特開昭６３−２６２５５０号公報、特開昭６３−２６２５４９号公報、特公昭５５−３１４１８号公報に記載のものが好ましく使用できるが、これらに限定されるものではない。
上記の各公報に記載されている湿潤剤は、これらの各公報に記載の湿潤剤の利用方法あるいはその特性を、本発明の核酸吸着性多孔性膜において同様に適用することができる。
｛性状｝
前記の核酸吸着性多孔性膜は、溶液が内部を通過可能であり、厚さが１０μｍ〜５００μｍであることが好ましい。さらに好ましくは、厚さが５０μｍ〜２５０μｍである。この範囲内にあることが、洗浄の観点から好ましい。
前記の核酸吸着性多孔性膜は、溶液が内部を通過可能であり、厚さが１０μｍ〜５００μｍであることが好ましい。さらに好ましくは、厚さが５０μｍ〜２５０μｍである。この範囲内にあることが、洗浄の観点から好ましい。
前記の核酸吸着性多孔性膜は、孔の最小孔径が０．２２μｍ以上であることが好ましい。さらに好ましくは、最小孔径が０．５μｍ以上である。また、核酸吸着性多孔性膜は、孔の最小孔径に対する最大孔径の比が１：２以上である事が好ましい。この範囲内にあれば、核酸が吸着するのに十分な表面積が得られるとともに、目詰まりし難く、好ましい。さらに好ましくは、孔の最小孔径に対する最大孔径の比が１：５以上である。
前記の核酸吸着性多孔性膜は、空隙率が５０〜９５％であることが好ましい。さらに好ましくは、空隙率が６５〜８０％である。
また、核酸吸着性多孔性膜は、バブルポイントが、０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ2であることが好ましい。さらに好ましくは、バブルポイントが、０．２〜４ｋｇｆ／ｃｍ2である。
また、核酸吸着性多孔性膜は、バブルポイントが、０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ2であることが好ましい。さらに好ましくは、バブルポイントが、０．２〜４ｋｇｆ／ｃｍ2である。
前記の核酸吸着性多孔性膜は、圧力損失が０．１〜１００ｋＰａである事が好ましい。この範囲内にあることで、過圧時に均一な圧力が得られ、好ましい。さらに好ましくは、圧力損失が、０．５〜５０ｋＰａである。ここで、圧力損失とは、膜の厚さ１００μｍあたり、水を通過させるのに必要な最低圧力である。
前記の核酸吸着性多孔性膜は、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2あたり１分間で１〜５０００ｍＬであることが好ましい。さらに好ましくは、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2あたり１分間で５〜１０００ｍＬである。
前記の核酸吸着性多孔性膜は、多孔性膜1ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．１μｇ以上である事が好ましい。さらに好ましくは、多孔性膜1ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．９μｇ以上である。
前記の核酸吸着性多孔性膜としては、一辺が５ｍｍの正方形の多孔性膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに、１時間以内では溶解しないが４８時間以内に溶解するセルロース誘導体からなる多孔性膜を好ましく使用する事ができる。また、一辺が５ｍｍの正方形の多孔性膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに１時間以内に溶解するが、ジクロロメタン５ｍＬに浸漬したときには２４時間以内に溶解しないセルロース誘導体からなる多孔性膜を好ましく使用する事ができる。
｛吸着工程｝
本発明の核酸分離精製方法は、前述の通り、吸着工程において、核酸吸着性多孔性膜に、核酸を含む試料溶液を通過させる。
核酸吸着性多孔性膜に核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を一方の面から他方の面へと通過させることが、液を多孔性膜へ均一に接触させることができる点で好ましい。核酸吸着性多孔性膜に核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を核酸吸着性多孔性膜の孔径が大きい側から小さい側に通過させることが、目詰まりし難い点で好ましい。
本発明の核酸分離精製方法は、前述の通り、吸着工程において、核酸吸着性多孔性膜に、核酸を含む試料溶液を通過させる。
核酸吸着性多孔性膜に核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を一方の面から他方の面へと通過させることが、液を多孔性膜へ均一に接触させることができる点で好ましい。核酸吸着性多孔性膜に核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を核酸吸着性多孔性膜の孔径が大きい側から小さい側に通過させることが、目詰まりし難い点で好ましい。
核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させる場合の流速は、液の多孔性膜への適切な接触時間を得るために、膜の面積ｃｍ2あたり、２〜１５００μＬ／secである事が好ましい。液の多孔性膜への接触時間が短すぎると十分な分離精製効果が得られず、長すぎると操作性の点から好ましくない。さらに、前記流速は、膜の面積ｃｍ2あたり、５〜７００μＬ／secである事が好ましい。
核酸吸着性多孔性膜は１枚でも、複数枚を使用することもできる。複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。
核酸吸着性多孔性膜を複数枚使用する場合、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸吸着性多孔性膜との組合せであっても良い。例えば、ガラスフィルターと再生セルロースの多孔性膜との組合せを挙げることができる。また、複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸非吸着性多孔性膜との組合せであってもよい、例えば、ガラスフィルターと、ナイロンまたはポリスルホンの多孔性膜との組合せを挙げることができる。
核酸吸着性多孔性膜を複数枚使用する場合、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸吸着性多孔性膜との組合せであっても良い。例えば、ガラスフィルターと再生セルロースの多孔性膜との組合せを挙げることができる。また、複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸非吸着性多孔性膜との組合せであってもよい、例えば、ガラスフィルターと、ナイロンまたはポリスルホンの多孔性膜との組合せを挙げることができる。
［核酸分離精製カートリッジ］
本発明の核酸分離精製方法において、前記の核酸吸着性多孔性膜を、少なくとも二個の開口を有する容器内に収容して使用することが好ましい（以下、核酸分離精製カートリッジという。）。核酸分離精製カートリッジは、少なくとも二個の開口を有する容器内に、前記の核酸吸着性多孔性膜を１枚収容しても、複数枚収容してもよい。この場合、複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、前記のとおり同一のものであっても、異なるものであって良い。
そして、前述の核酸吸着性多孔性膜は、収容される容器の形状に応じて、膜状以外の形態にすることも可能である。例えば、チップ状やブロック状等とすることができる。
本発明の核酸分離精製方法において、前記の核酸吸着性多孔性膜を、少なくとも二個の開口を有する容器内に収容して使用することが好ましい（以下、核酸分離精製カートリッジという。）。核酸分離精製カートリッジは、少なくとも二個の開口を有する容器内に、前記の核酸吸着性多孔性膜を１枚収容しても、複数枚収容してもよい。この場合、複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、前記のとおり同一のものであっても、異なるものであって良い。
そして、前述の核酸吸着性多孔性膜は、収容される容器の形状に応じて、膜状以外の形態にすることも可能である。例えば、チップ状やブロック状等とすることができる。
核酸分離精製カートリッジは、少なくとも二個の開口を有する容器内に、前記の核酸吸着性多孔性膜を収容する以外、その他の部材を収容していないことが好ましい。前記の容器の材料としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルなどのプラスチックを使用することができる。また、生分解性の材料も好ましく使用することができる。また、前記の容器は透明であっても、着色してあっても良い。
核酸分離精製カートリッジとして、個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段を備えている核酸分離精製カートリッジを使用する事ができる。個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段としては、バーコード、磁気テープなどが挙げられる。
また、少なくとも二個の開口を有する容器内から核酸吸着性多孔性膜を容易に取り出す事が可能になっている構造を有した核酸分離精製カートリッジを使用することもできる。
本発明の核酸分離精製方法は、前述の通り、（１）吸着工程、（２）洗浄工程、（３）回収工程を少なくとも含むものである。
好ましくは、前記(１)、(２)及び(３)の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させるものであり、より好ましくは、前記(１)、(２)及び(３)の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させるものである。核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を加圧状態で前記多孔性膜に通過させることにより、装置をコンパクトに自動化することができ、好ましい。加圧は、好ましくは１０〜２００ｋｐａ、より好ましくは４０〜１００ｋｐａの程度で行われる。
好ましくは、前記(１)、(２)及び(３)の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させるものであり、より好ましくは、前記(１)、(２)及び(３)の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させるものである。核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を加圧状態で前記多孔性膜に通過させることにより、装置をコンパクトに自動化することができ、好ましい。加圧は、好ましくは１０〜２００ｋｐａ、より好ましくは４０〜１００ｋｐａの程度で行われる。
前記工程において、圧力差発生装置としては、注射器、ピペッタ、あるいはペリスタポンプのような加圧が可能なポンプ等、或いは、エバポレーター等の減圧可能なものが挙げられる。これらの内、手動操作には注射器が、自動操作にはポンプが適している。また、ピペッタは片手操作が容易にできるという利点を有する。好ましくは、圧力差発生装置は、核酸分離精製カートリッジの一の開口に着脱可能に結合されている。
さらに好ましくは、前記の核酸吸着性多孔性膜を収容する核酸分離精製カートリッジを用いて、以下の工程で核酸を分離精製することができる。すなわち、
(a)核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、
(b)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジト内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
(c)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に洗浄液を注入する工程、
(d)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、
(e)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に回収液を注入する工程、
(f)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程
を挙げることができる。
(a)核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、
(b)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジト内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
(c)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に洗浄液を注入する工程、
(d)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、
(e)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に回収液を注入する工程、
(f)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程
を挙げることができる。
本発明の核酸分離精製方法は、最初の核酸を含む試料溶液を注入してから核酸分離精製カートリッジ外に核酸を得るまでの工程を１０分以内、好適な状況では２分以内で迅速に終了することが可能である。また、前記の核酸分精製の工程では核酸を検体中に含まれる全量に対して５０質量％以上、好適な状況では９０質量％以上の収率で得る事が可能である。
本発明の核酸分離精製方法は、１ｋｂｐ〜３００ｋｂｐ、特に２０ｋｂｐ〜３００ｋｂｐと広範囲に及ぶ分子量の核酸を回収することができる。すなわち、従来行なわれているガラスフィルターを用いたスピンカラム法に比べて、長鎖の核酸を回収できる。
本発明の核酸分離精製方法は、紫外可視分光光度計での測定値(２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）が、ＤＮＡの場合は１．６〜２．０、ＲＮＡの場合は１．８〜２．２となる純度を持つ核酸を回収することができ、不純物混入量の少ない高純度の核酸を定常的に得ることができる。さらには、紫外可視分光光度計での測定値(２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）がＤＮＡの場合は１．８付近、ＲＮＡの場合は２．０付近となる純度を持つ核酸を回収することができる。
［核酸を含む試料溶液］
本発明において使用できる検体は、核酸を含むものであれば特に制限はなく、例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、***、唾液等の体液、あるいは植物（又はその一部）、動物（またはその一部）、細菌、ウイルスなど、あるいはそれらの溶解物およびホモジネートなどの生物材料が対象となる。
本発明において使用できる検体は、核酸を含むものであれば特に制限はなく、例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、***、唾液等の体液、あるいは植物（又はその一部）、動物（またはその一部）、細菌、ウイルスなど、あるいはそれらの溶解物およびホモジネートなどの生物材料が対象となる。
核酸を含む検体は、単一の核酸を含む検体でもよいし、異なる複数種類の核酸を含む検体でもよい。また、検体の数は一つでも複数であってもよい。すなわち、複数の容器を用いて複数の検体を並列処理してもよい。前記核酸分離精製方法に供される回収する核酸の長さは特に限定されず、例えば、数ｂｐ〜数Ｍｂｐの任意の長さの核酸であってもよい。取扱い上の観点からは、回収に供される核酸の長さは一般的には、数ｂｐ〜数百ｋｂｐ程度であることが好ましい。前記核酸分離精製方法は、従来の核酸分離精製方法、すなわち簡易的な核酸分離精製方法に対し、比較的長い核酸を迅速に取り出すことができる。好ましくは２０〜３００ｋｂｐ、より好ましくは５０〜２００ｋｂｐ、更に好ましくは７０〜１４０ｋｂｐの核酸を回収することに用いることができる。後述する検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、撹拌及びピペッティングを穏やかにすることが、より長いＤＮＡやＲＮＡを回収する点で好ましい。回収する核酸の種類は、ＤＮＡやＲＮＡ等、特に制限されない。
検体は、細胞膜および核膜等を溶解して核酸を水溶液内に分散し、核酸を含む試料溶液を得ることが好ましい。
本発明で、細胞膜および核膜を溶解して核酸を可溶化するには、核酸可溶化試薬を用いることが好ましい。更に好ましくは、細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る方法として、
(Ｉ)検体を容器に注入する工程、
(ＩＩ)前記容器に、核酸可溶化試薬溶液を添加し、検体と核酸可溶化試薬溶液を混合し、混合液を得る工程、
(ＩＩＩ)前記で得られた混合液をインキュベートする工程、
(ＩＶ)インキュベート後の混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程
を含む方法を挙げることができる。
(Ｉ)検体を容器に注入する工程、
(ＩＩ)前記容器に、核酸可溶化試薬溶液を添加し、検体と核酸可溶化試薬溶液を混合し、混合液を得る工程、
(ＩＩＩ)前記で得られた混合液をインキュベートする工程、
(ＩＶ)インキュベート後の混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程
を含む方法を挙げることができる。
検体は、上記（Ｉ）の工程前または（Ｉ）の工程後（ＩＩ）の工程前にホモジナイズ処理することが好ましい。これにより、自動化処理適正を向上することができる。ホモジナイズ処理としては、例えば、超音波処理、鋭利な突起物を用いる、高速攪拌処理を用いる、微細空隙から押し出す処理、ガラスビーズを用いる処理等で行うことができる。
前記（ＩＩ）の工程において、核酸可溶化試薬としては、タンパク質分解酵素、カオトロピック塩、界面活性剤、消泡剤および核酸安定化剤の中から選ばれる化合物を含む溶液が挙げられる。
また、特にタンパク質分解酵素を含む核酸可溶化試薬を使用することにより、核酸の回収量及び回収効率が向上し、必要な核酸を含む検体の微量化及び迅速化が可能となり好ましい。
（タンパク質分解酵素）
タンパク質分解酵素としては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼが挙げられ、少なくとも１つのタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、タンパク質分解酵素は、複数種以上のタンパク質分解酵素の混合物も好ましく用いることができる。
セリンプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばプロテアーゼＫなどを好ましく用いることができる。システインプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばパパイン、カテプシン類などを好ましく用いることができる。金属プロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばカルボキシペプチターゼ等を好ましく用いることができる。
タンパク質分解酵素の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、添加時の全容積１ｍｌあたり好ましくは０．００１ＩＵ〜１０ＩＵ、より好ましくは０．０１ＩＵ〜１ＩＵで用いることができる。
タンパク質分解酵素としては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼが挙げられ、少なくとも１つのタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、タンパク質分解酵素は、複数種以上のタンパク質分解酵素の混合物も好ましく用いることができる。
セリンプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばプロテアーゼＫなどを好ましく用いることができる。システインプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばパパイン、カテプシン類などを好ましく用いることができる。金属プロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばカルボキシペプチターゼ等を好ましく用いることができる。
タンパク質分解酵素の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、添加時の全容積１ｍｌあたり好ましくは０．００１ＩＵ〜１０ＩＵ、より好ましくは０．０１ＩＵ〜１ＩＵで用いることができる。
また、タンパク質分解酵素は、核酸分解酵素を含まないタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、安定化剤を含んだタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。安定化剤としては、金属イオンを好ましく用いることができる。具体的には、マグネシウムイオンが好ましく、例えば塩化マグネシウムなどの形で添加することができる。タンパク質分解酵素の安定化剤を含ませることにより、核酸の回収に必要なタンパク質分解酵素の微量化が可能となり、核酸の回収に必要なコストを低減することができる。
タンパク質分解酵素の安定化剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、好ましくは１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌで含有することが好ましい。
タンパク質分解酵素の安定化剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、好ましくは１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌで含有することが好ましい。
タンパク質分解酵素は、予めカオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とともに混合されて１つの核酸可溶化試薬溶液として核酸の回収に供されても良い。
また、タンパク質分解酵素は、カオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とは個別の２つ以上の核酸可溶化試薬溶液として供されても良い。タンパク質分解酵素を別にする場合、タンパク質分解酵素を含む核酸可溶化試薬溶液を先に検体と混合した後に、カオトロピック塩、界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液と混合される。また、カオトロピック塩、界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液を先に混合した後に、タンパク分解酵素を含む核酸可溶化試薬溶液を混合してもよい。
また、タンパク質分解酵素を、検体または、検体とカオトロピック塩、界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液との混合液に、タンパク質分解酵素保存容器から直接目薬状に滴下させることもできる。この場合、操作を簡便にすることができる。
また、タンパク質分解酵素は、カオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とは個別の２つ以上の核酸可溶化試薬溶液として供されても良い。タンパク質分解酵素を別にする場合、タンパク質分解酵素を含む核酸可溶化試薬溶液を先に検体と混合した後に、カオトロピック塩、界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液と混合される。また、カオトロピック塩、界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液を先に混合した後に、タンパク分解酵素を含む核酸可溶化試薬溶液を混合してもよい。
また、タンパク質分解酵素を、検体または、検体とカオトロピック塩、界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液との混合液に、タンパク質分解酵素保存容器から直接目薬状に滴下させることもできる。この場合、操作を簡便にすることができる。
（カオトロピック塩）
カオトロピック塩としては、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム等を使用することができる。中でもグアニジン塩が好ましい。グアニジン塩としては、イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジンが挙げられ、中でも塩酸グアニジンが好ましい。また、これらの塩は単独または複数組み合わせて用いてもよい。
カオトロピック塩の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、より好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ〜４ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは、１ｍｏｌ／Ｌ〜３ｍｏｌ／Ｌである。
また、カオトロピック塩の代わりに、カオトロピック物質として尿素を用いることもできる。
カオトロピック塩としては、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム等を使用することができる。中でもグアニジン塩が好ましい。グアニジン塩としては、イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジンが挙げられ、中でも塩酸グアニジンが好ましい。また、これらの塩は単独または複数組み合わせて用いてもよい。
カオトロピック塩の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、より好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ〜４ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは、１ｍｏｌ／Ｌ〜３ｍｏｌ／Ｌである。
また、カオトロピック塩の代わりに、カオトロピック物質として尿素を用いることもできる。
（界面活性剤）
界面活性剤としては、例えば、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤が挙げられる。
本発明においてはノニオン界面活性剤およびカチオン界面活性剤をこのましく用いることができる。
ノニオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドを用いることができる。好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤を用いることができる。ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）アルキルエーテル系界面活性剤の中でも、ＰＯＥデシルエーテル、ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥトリデシルエーテル、ＰＯＥアルキレンデシルエーテル、ＰＯＥソルビタンモノラウレート、ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソルビタンモノステアレート、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングリコールがより好ましい。
界面活性剤としては、例えば、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤が挙げられる。
本発明においてはノニオン界面活性剤およびカチオン界面活性剤をこのましく用いることができる。
ノニオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドを用いることができる。好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤を用いることができる。ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）アルキルエーテル系界面活性剤の中でも、ＰＯＥデシルエーテル、ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥトリデシルエーテル、ＰＯＥアルキレンデシルエーテル、ＰＯＥソルビタンモノラウレート、ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソルビタンモノステアレート、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングリコールがより好ましい。
カチオン界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムプロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリドが挙げられる。
これらの界面活性剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。界面活性剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましい。
これらの界面活性剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。界面活性剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましい。
（消泡剤）
消泡剤としては、シリコン系消泡剤（例えば、シリコーンオイル、ジメチルポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、変性ポリシロキサン、シリコーンコンパウンドなど）、アルコール系消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルへキサノール、高級アルコール、ポリオキシアルキレングリコールなど）、エーテル系消泡剤（例えば、ヘプチルセロソルブ、ノニルセロソルブ−３−ヘプチルコルビトールなど）、油脂系消泡剤（例えば、動植物油など）、脂肪酸系消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属セッケン系消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミ、ステアリン酸カルシウムなど）、脂肪酸エステル系消泡剤（例えば、天然ワックス、トリブチルホスフェートなど）、燐酸エステル系消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウムなど）、アミン系消泡剤（例えば、ジアミルアミンなど）、アミド系消泡剤（例えば、ステアリン酸アミドなど）、その他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄、ボーキサイトなど）などが挙げられる。この中でもシリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤が好ましく挙げられる。アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤が好ましい。これらの消泡剤は、単独または組み合わせて用いてもよい。特に好ましくは、消泡剤として、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分を組み合わせて使用することである。
消泡剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は０．１〜１０質量％であることが好ましい。
消泡剤としては、シリコン系消泡剤（例えば、シリコーンオイル、ジメチルポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、変性ポリシロキサン、シリコーンコンパウンドなど）、アルコール系消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルへキサノール、高級アルコール、ポリオキシアルキレングリコールなど）、エーテル系消泡剤（例えば、ヘプチルセロソルブ、ノニルセロソルブ−３−ヘプチルコルビトールなど）、油脂系消泡剤（例えば、動植物油など）、脂肪酸系消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属セッケン系消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミ、ステアリン酸カルシウムなど）、脂肪酸エステル系消泡剤（例えば、天然ワックス、トリブチルホスフェートなど）、燐酸エステル系消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウムなど）、アミン系消泡剤（例えば、ジアミルアミンなど）、アミド系消泡剤（例えば、ステアリン酸アミドなど）、その他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄、ボーキサイトなど）などが挙げられる。この中でもシリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤が好ましく挙げられる。アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤が好ましい。これらの消泡剤は、単独または組み合わせて用いてもよい。特に好ましくは、消泡剤として、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分を組み合わせて使用することである。
消泡剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は０．１〜１０質量％であることが好ましい。
（核酸安定化剤）
核酸安定化剤としては、ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有するものが挙げられる。検体によっては、核酸を分解するヌクレアーゼ等が含まれていることがあり、核酸をホモジナイズするとこのヌクレアーゼが核酸に作用し、収量が激減することがある。前記核酸安定化剤は、検体中の核酸を安定に存在させることができ、これにより、核酸の回収量及び回収効率が向上し、検体の微量化及び迅速化が可能となり、好ましい。
核酸安定化剤としては、ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有するものが挙げられる。検体によっては、核酸を分解するヌクレアーゼ等が含まれていることがあり、核酸をホモジナイズするとこのヌクレアーゼが核酸に作用し、収量が激減することがある。前記核酸安定化剤は、検体中の核酸を安定に存在させることができ、これにより、核酸の回収量及び回収効率が向上し、検体の微量化及び迅速化が可能となり、好ましい。
ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有する核酸安定化剤としては、一般的に還元剤として使用される化合物を用いることができる。還元剤としては、水素、ヨウ化水素、硫化水素、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウム等の水素化化合物、アルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、亜鉛等の電気的陽性の大きい金属、またはそれのアマルガム、アルデヒド類、糖類、ギ酸、シュウ酸などの有機酸化物、メルカプト化合物等が挙げられる。中でもメルカプト化合物が好ましい。メルカプト化合物としては、Ｎ−アセチルシステイン、メルカプトエタノールや、アルキルメルカプタン等が挙げられる。特に、β−メルカプトエタノールが好ましい。メルカプト化合物は単独または複数組み合わせて用いてもよい。
核酸安定化剤は、核酸可溶化試薬溶液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．３〜１５質量％で、用いることができる。メルカプト化合物は、前処理液における濃度は０．１〜１０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．５〜５質量％で、用いることができる。
核酸安定化剤は、核酸可溶化試薬溶液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．３〜１５質量％で、用いることができる。メルカプト化合物は、前処理液における濃度は０．１〜１０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．５〜５質量％で、用いることができる。
（ＲＮＡ分解酵素）
ＤＮＡなどのＲＮＡ以外の核酸を回収する場合、核酸可溶化試薬溶液にＲＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＲＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＤＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。
一方、ＲＮＡなどＤＮＡ以外の核酸を回収する場合、核酸可溶化試薬溶液にＤＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＤＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。ＲＮＡ分解酵素阻害剤としては、ＲＮＡ分解酵素を特異的に阻害するものが好ましい。
ＲＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、リボヌクレアーゼ Ｈ（ＲＮａｓｅ Ｈ）等のＲＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。
ＤＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、ＤＮａｓｅ Ｉ等のＤＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。
核酸分解酵素および核酸分解酵素阻害剤は、本発明においても通常用いられる濃度で用いることが出来る。また、通常どおり加温処理することができる。加温処理は、タンパク質分解酵素による処理と同時におこなうことが好ましい。加温処理については｛インキュベート｝の項において後記する。
ＤＮＡなどのＲＮＡ以外の核酸を回収する場合、核酸可溶化試薬溶液にＲＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＲＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＤＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。
一方、ＲＮＡなどＤＮＡ以外の核酸を回収する場合、核酸可溶化試薬溶液にＤＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＤＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。ＲＮＡ分解酵素阻害剤としては、ＲＮＡ分解酵素を特異的に阻害するものが好ましい。
ＲＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、リボヌクレアーゼ Ｈ（ＲＮａｓｅ Ｈ）等のＲＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。
ＤＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、ＤＮａｓｅ Ｉ等のＤＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。
核酸分解酵素および核酸分解酵素阻害剤は、本発明においても通常用いられる濃度で用いることが出来る。また、通常どおり加温処理することができる。加温処理は、タンパク質分解酵素による処理と同時におこなうことが好ましい。加温処理については｛インキュベート｝の項において後記する。
前記（ＩＩ）の工程において、核酸可溶化試薬は、乾燥された状態で供給されることも好ましい。また、凍結乾燥のように乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器を用いることができる。前記の、乾燥された状態で供給される核酸可溶化試薬、および乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器の両方を用いて、核酸を含む試料溶液を得ることもできる。この方法で核酸を含む試料溶液を得る場合、核酸可溶化試薬およびタンパク質分解酵素の保存安定性が良く、核酸収量を変えずに操作を簡便にすることができる。
（混合）
前記（ＩＩ）の工程において、検体と核酸可溶化試薬溶液とを混合する方法は、特に限定されない。混合する際、攪拌装置により３０から３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、分離精製される核酸収量を増加させることができる。または、転倒混和を５から３０回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、１０から５０回行うことによっても混合することができる、この場合、簡便な操作で分離精製される核酸収量を増加させることができ、好ましい。
前記（ＩＩ）の工程において、検体と核酸可溶化試薬溶液とを混合する方法は、特に限定されない。混合する際、攪拌装置により３０から３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、分離精製される核酸収量を増加させることができる。または、転倒混和を５から３０回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、１０から５０回行うことによっても混合することができる、この場合、簡便な操作で分離精製される核酸収量を増加させることができ、好ましい。
｛インキュベート｝
前記（ＩＩＩ）の工程においてタンパク質分解酵素を含む核酸可溶化試薬溶液を用いる場合、検体と核酸可溶化試薬溶液との混合液を、タンパク質分解酵素の至適温度および反応時間でインキュベートすることにより、分離精製される核酸の収量を増加させることがきる。インキュベーション温度は、通常２０℃〜７０℃、好ましくはタンパク分解酵素の至適温度であり、インキュベーション時間は通常１分〜１８時間、好ましくはタンパク分解酵素の至適反応時間である。インキュベーション方法は特に限定されず、湯浴や加温器に入れることで行うことができる。
前記（ＩＩＩ）の工程においてタンパク質分解酵素を含む核酸可溶化試薬溶液を用いる場合、検体と核酸可溶化試薬溶液との混合液を、タンパク質分解酵素の至適温度および反応時間でインキュベートすることにより、分離精製される核酸の収量を増加させることがきる。インキュベーション温度は、通常２０℃〜７０℃、好ましくはタンパク分解酵素の至適温度であり、インキュベーション時間は通常１分〜１８時間、好ましくはタンパク分解酵素の至適反応時間である。インキュベーション方法は特に限定されず、湯浴や加温器に入れることで行うことができる。
｛水溶性有機溶媒｝
前記（ＩＶ）の工程において、インキュベート後の混合液に添加する水溶性有機溶媒としては、アルコール類、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等が挙げられる。特にアルコールを好ましく用いることができる。
アルコールは、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。中でもメタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ブタノール及びその異性体を好ましく用いることができる。より好ましくはエタノールを用いることができる。これらの水溶性有機溶媒は単独でも複数組み合わせて用いてもよい。これら水溶性有機溶媒の核酸を含む試料溶液における最終濃度は、５〜９０質量％であることが好ましい。
前記（ＩＶ）の工程において、インキュベート後の混合液に添加する水溶性有機溶媒としては、アルコール類、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等が挙げられる。特にアルコールを好ましく用いることができる。
アルコールは、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。中でもメタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ブタノール及びその異性体を好ましく用いることができる。より好ましくはエタノールを用いることができる。これらの水溶性有機溶媒は単独でも複数組み合わせて用いてもよい。これら水溶性有機溶媒の核酸を含む試料溶液における最終濃度は、５〜９０質量％であることが好ましい。
得られる試料溶液のｐＨは、好ましくはｐＨ５〜１０、より好ましくはｐＨ６〜９、さらに好ましくはｐＨ７〜８である。
また、得られる核酸を含む試料溶液は、表面張力は０．０５Ｊ／ｍ2以下であることが好ましく、粘度は、１〜１００００ｍＰａであることが好ましく、比重は、０．８〜１．２であることが好ましい。
［洗浄工程］
以下、洗浄工程について説明する。洗浄を行うことにより、核酸の回収量及び純度が向上し、必要な核酸を含む検体の量を微量とすることができる。洗浄工程は、迅速化のためには1回の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰返すことが好ましい。
以下、洗浄工程について説明する。洗浄を行うことにより、核酸の回収量及び純度が向上し、必要な核酸を含む検体の量を微量とすることができる。洗浄工程は、迅速化のためには1回の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰返すことが好ましい。
洗浄工程において、洗浄液は、自動注入装置もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジへ供給される。供給された洗浄液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、洗浄液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より洗浄液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法は洗浄効率が優れてより好ましい。
洗浄工程における洗浄液の液量は、２μｌ／ｍｍ2以上が好ましい。洗浄液量が多量であれば洗浄効果は向上する。しかし、２００μｌ／ｍｍ2以下とすることで、操作性を保ち、試料の流出を抑止することができ、好ましい。
洗浄工程における洗浄液の液量は、２μｌ／ｍｍ2以上が好ましい。洗浄液量が多量であれば洗浄効果は向上する。しかし、２００μｌ／ｍｍ2以下とすることで、操作性を保ち、試料の流出を抑止することができ、好ましい。
洗浄工程において、洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させる場合の流速は、膜の単位面積（ｃｍ2）あたり、２〜１５００μＬ／ｓｅｃであることが好ましく、５〜７００μＬ／ｓｅｃであることがより好ましい。通過速度を下げて時間を掛ければ洗浄がそれだけ十分に行なわれることになる。しかし、前記の範囲とすることで、核酸の分離精製操作を迅速化でき、好ましい。
洗浄工程において、洗浄液の液温は４〜７０℃であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。また洗浄工程において、洗浄工程と同時に核酸分離精製カートリッジに器械的な振動や超音波による攪拌を与えることもできる。または遠心分離を行うことにより洗浄することもできる。
洗浄工程において、洗浄液には、通常核酸分解酵素のような酵素を含ませないが、タンパク質等の夾雑物質を分解する酵素を含ませることができる。また、目的によりＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素などを含ませることもできる。ＤＮＡ分解酵素を含む洗浄液を使用することにより、検体中のＲＮＡのみを選択的に回収することができる。逆に、ＲＮＡ分解酵素を含む洗浄液を使用することにより、検体中のＤＮＡのみを選択的に回収することができる。
洗浄工程において、洗浄液は、水溶性有機溶媒及び／または水溶性塩を含んでいる溶液であることが好ましい。洗浄液は、核酸吸着性多孔性膜に核酸と共に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、核酸吸着性多孔性膜から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成であることが必要である。この目的には、核酸がアルコール等の水溶性有機溶媒に難溶性であるので、核酸を保持したまま核酸以外の成分を脱着させるのに適している。また、水溶性塩を添加することにより、核酸の吸着効果が高まるので、不純物および不要成分の選択的除去作用が向上する。
洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、アルコール、アセトンなどを用いることができ、アルコールが好ましい。アルコールとしてはメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノールおよびブタノールが挙げられる。中でもエタノ―ルを用いることが好ましい。洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、２０〜１００質量％であることが好ましく、４０〜８０質量％であることがより好ましい。
一方、洗浄液に含まれる水溶性塩は、ハロゲン化物の塩であることが好ましく、中でも塩化物が好ましい。また、水溶性塩は、一価または二価のカチオンであることが好ましく、特にアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が好ましく、中でもナトリウム塩及びカリウム塩が好ましく、ナトリウム塩が最も好ましい。
水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましい。さらに好ましくは、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、とりわけ、塩化ナトリウムが２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上含まれていることが好ましい。
水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましい。さらに好ましくは、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、とりわけ、塩化ナトリウムが２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上含まれていることが好ましい。
洗浄液は、カオトロッピク物質を含んでいないことが好ましい。それによって、洗浄工程に引き続く回収工程にカオトロピック物質が混入する可能性を減らすことができる。回収工程時に、カオトロピック物質が混入すると、しばしばＰＣＲ反応等の酵素反応を阻害するので、後の酵素反応等を考慮すると洗浄液にカオトロッピク物質を含まないことが理想的である。また、カオトロピック物質は、腐食性で有害であるので、この点でもカオトロピック物質を用いないで済むことは、実験者にとっても試験操作の安全上極めて有利である。ここで、カオトロピック物質とは、前記した尿素、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどである。
従来、核酸分離精製工程における洗浄工程の際、洗浄液がカートリッジなどの容器に対する濡れ性が高いため、しばしば洗浄液が容器中に残留することになり、洗浄工程に続く回収工程への洗浄液の混入して核酸の純度の低下や次工程における反応性の低下などの原因となっている。したがって、カートリッジなどの容器を用いて核酸の吸着及び脱着を行う場合、吸着、洗浄時に用いる液、特に洗浄液が、次の工程に影響を及ぼさないように、カートリッジ内に洗浄残液が残留しないことは重要である。
したがって、洗浄工程における洗浄液が次工程の回収液に混入することを防止して、洗浄液のカートリッジ内への残留を最小限に留めるため、洗浄液の表面張力を０．０３５Ｊ／ｍ2未満にすることが好ましい。表面張力を低くすれば洗浄液とカートリッジの濡れ性が向上し、残留する液量を抑えることができる。
逆に、洗浄工程における洗浄液のカートリッジへの残留を減少させる目的で、洗浄液の表面張力を０．０３５Ｊ／ｍ2以上にして、カートリッジに対する撥水性を高めて液滴を形成させ、その液滴が流れ落ちることによって残留する液量を抑えることもできる。核酸を吸着した多孔性膜、回収液、洗浄液の組合せなどによっていずれかの表面張力が選択される。
本発明に係る核酸吸着性多孔性膜を利用して洗浄工程を簡素化することができる。(1)洗浄液が核酸吸着性多孔性膜を通過する回数を1回としてもよい、(2)洗浄工程を室温でもできる。(3)洗浄後、直ちに回収液をカートリッジに注入することもできる。(4)前記(1)、(2)、(3)のいずれか1つもしくは２つ以上組み合わせることも可能である。従来法においては、洗浄液中に含まれる有機溶媒を迅速に取り除くためには、しばしば乾燥工程を必要としたが、本発明に用いる核酸吸着性多孔性膜は薄膜であるために乾燥工程を省略できる。
従来、核酸分離精製方法において、洗浄工程の際、しばしば洗浄液が飛散し他に付着することによって、試料のコンタミネーション（汚染）が起きることが問題となっている。洗浄工程におけるこの種のコンタミネーションは、二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多性孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジと廃液容器の形状とを工夫することによって抑止することができる。
［脱着工程（回収工程）］
以下に核酸吸着性多性孔膜から核酸を脱着させて回収する工程について示す。回収工程において、回収液は、自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を装着した核酸分離精製カートリッジへ供給される。回収液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が、回収効率が優れてより好ましい。
以下に核酸吸着性多性孔膜から核酸を脱着させて回収する工程について示す。回収工程において、回収液は、自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を装着した核酸分離精製カートリッジへ供給される。回収液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が、回収効率が優れてより好ましい。
検体から調整した核酸を含む試料溶液の体積に対して、回収液の体積を調整して核酸の脱着を行うことができる。分離精製された核酸を含む回収液量は、そのとき使用する検体量による。一般的によく使われる回収液量は数１０から数１００μｌであるが、検体量が極微量である時や、逆に大量の核酸を分離精製したい場合には回収液量は１μｌから数１０ｍｌの範囲で変える事ができる。
回収液としては好ましくは精製蒸留水、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファ等が使用できる。
回収工程においては、核酸の回収液をその後の後工程に使用できる組成にしておくことが可能である。分離精製された核酸は、しばしばＰＣＲ(ポリメラーゼチェインリアクション)法により増幅される。この場合、分離精製された核酸溶液はＰＣＲ法に適したバッファー液で希釈する必要がある。本方法による回収工程において、回収液にＰＣＲ法に適したバッファー液を用いることで、その後のＰＣＲ工程へ簡便、迅速に移行することができる。この場合、回収液としてＰＣＲ反応において用いる緩衝溶液 (例えば、ＫＣｌ ５０ｍｍｏｌ／ｌ、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ １０ｍｍｏｌ／ｌ、ＭｇＣｌ2 １．５ｍｍｏｌ／ｌを最終濃度とする水溶液)を用いることもできる。
回収液のｐＨは、ｐＨ２〜１１であることが好ましい。さらには、ｐＨ５〜９であることが好ましい。また特にイオン強度と塩濃度は吸着核酸の溶出に効果を及ぼす。回収液は、２９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のイオン強度であることが好ましく、さらには、９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩濃度であることが好ましい。こうすることで、核酸の回収率が向上し、より多くの核酸を回収できることができる。回収される核酸は１本鎖でもよく、２本鎖でも良い。
回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液の体積と比較して少なくすることによって、濃縮された核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１００〜９９：１００、更に好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１０〜９：１０にすることができる。これにより核酸分離精製後工程において濃縮のための操作をすることなく、簡単に核酸を濃縮できる。これらの方法により検体よりも核酸が濃縮されている核酸溶液を得る方法を提供できる。
また別の方法としては、回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液よりも多い条件で核酸の脱着を行うことにより、希望の濃度の核酸を含む回収液を得ることができ、次工程（ＰＣＲなど）に適した濃度の核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１〜５０：１、更に好ましくは、 (回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１〜５：１にすることができる。これにより核酸分離精製後に濃度調整をする煩雑さがなくなるというメリットを得られる。更に、十分量の回収液を使用することにより、多孔性膜からの核酸回収率の増加を図ることができる。
回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便に核酸を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量の核酸を回収する場合等複数回にわたり回収液を注入してもよい。
また、回収工程において、核酸の回収液に回収した核酸の分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。安定化剤としては、抗菌剤、抗カビ剤や核酸分解抑制剤などを添加することができる。核酸分解抑制剤としては、核酸分解酵素の阻害剤が挙げられ、具体的にはＥＤＴＡなどが挙げられる。また別の実施態様として、回収容器にあらかじめ安定化剤を添加しておくこともできる。
回収工程で用いられる回収容器には特に限定はないが、２６０ｎｍの吸収が無い素材で作製された回収容器を用いることができる。この場合、回収した核酸溶液の濃度を、他の容器に移し替えずに測定できる。２６０ｎｍに吸収のない素材は、例えば石英ガラス等が挙げられるがこれに限定されるものではない。
前記の、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力差発生装置を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する工程は、工程を自動で行う自動装置を用いて行うことができる。自動装置を用いることにより、操作が簡便化および迅速化するだけでなく、作業者の技能によらず一定の水準の、核酸を得ることが可能になる。
以下に、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力差発生装置を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する工程を自動で行う自動で行う自動装置の例を示すが、自動装置はこれに限定されるものではない。
自動装置は、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを用い、該核酸分離精製カートリッジに核酸を含む試料溶液を注入し加圧して該試料溶液中の核酸を前記核酸吸着性多孔性膜に吸着させた後、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄液を分注し加圧して不純物を除去した後、前記核酸分離精製カートリッジに、回収液を分注し核酸吸着性多孔性膜に吸着した核酸を脱着して回収液とともに回収する、分離精製動作を自動的に行う核酸分離精製装置であって、前記核酸分離精製カートリッジ、前記試料溶液および洗浄液の排出液を収容する廃液容器および前記核酸を含む回収液を収容する回収容器を保持する搭載機構と、前記核酸分離精製カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄液および回収液を分注する分注機構とを備えてなることを特徴とするものである。
前記搭載機構は、装置本体に搭載されるスタンドと、該スタンドに上下移動可能に支持され前記核酸分離精製カートリッジを保持するカートリッジホルダーと、該カートリッジホルダーの下方で前記核酸分離精製カートリッジに対する位置を交換可能に前記廃液容器および前記回収容器を保持する容器ホルダーとを備えてなるものが好適である。
また、前記加圧エア供給機構は、下端部より加圧エアを噴出するエアノズルと、該エアノズルを支持して前記カートリッジホルダーに保持された前記核酸分離精製カートリッジに対し前記エアノズルを昇降移動させる加圧ヘッドと、該加圧ヘッドに設置され前記搭載機構のラックにおける核酸分離精製カートリッジの位置決めをする位置決め手段とを備えてなるものが好適である。
また、前記分注機構は、前記洗浄液を分注する洗浄液分注ノズルと、前記回収液を分注する回収液分注ノズルと、前記洗浄液分注ノズルおよび前記回収液分注ノズルを保持し前記搭載機構に保持された核酸分離精製カートリッジ上を順に移動可能なノズル移動台と、洗浄液を収容した洗浄液ボトルより洗浄液を吸引し前記洗浄液分注ノズルに供給する洗浄液供給ポンプと、回収液を収容した回収液ボトルより回収液を吸引し前記回収液分注ノズルに供給する回収液供給ポンプとを備えてなるものが好適である。
上記のような自動装置によれば、核酸分離精製カートリッジ、廃液容器および回収容器を保持する搭載機構と、核酸分離精製カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、核酸分離精製カートリッジに洗浄液および回収液を分注する分注機構とを備え、核酸吸着性多孔性膜部材を備えた核酸分離精製カートリッジに核酸を含む試料溶液を注入加圧し核酸を核酸吸着性多孔性膜部材に吸着させた後、洗浄液を分注して不純物を洗浄排出した後、回収液を分注して核酸吸着性多孔性膜部材に吸着した核酸を分離して回収する核酸分離精製工程を自動的に行って短時間で効率よく試料溶液の核酸を自動的に分離精製できる機構をコンパクトに構成することとができる。
また、前記搭載機構を、スタンドと、核酸分離精製カートリッジを保持する上下移動可能なカートリッジホルダーと、廃液容器および回収容器を交換可能に保持する容器ホルダーとを備えて構成すると、核酸分離精製カートリッジおよび両容器のセット並びに廃液容器と回収容器の交換が簡易に行える。
また、前記加圧エア供給機構を、エアノズルと、該エアノズルを昇降移動させる加圧ヘッドと、核酸分離精製カートリッジの位置決めをする位置決め手段とを備えて構成すると、簡易な機構で確実な加圧エアの供給が行える。
また、前記分注機構を、洗浄液分注ノズルと、回収液分注ノズルと、核酸分離精製カートリッジ上を順に移動可能なノズル移動台と、洗浄液ボトルより洗浄液を吸引し洗浄液分注ノズルに供給する洗浄液供給ポンプと、回収液ボトルより回収液を吸引し回収液分注ノズルに供給する回収液供給ポンプとを備えて構成すると、簡易な機構で順次洗浄液および回収液の分注が行える。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
[実施例１]
（１）−１ 添加剤を含む核酸吸着性多孔性膜の作製
セルロースエステルのドープを以下の組成で調製した。ドープ調製における溶解は、先ず、ジアセチルセルロースおよびトリアセチルセルロースをジメチルクロライドに溶解し、続いて可塑剤トリフェニルフォスフェート、紫外線防止剤２、４−ビス−（ｎ−オクチルチオ）−６−（４−ヒドロキシ−３、５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチリルアニリノ）−１、３、５−トリアジン、劣化防止剤ジブチルヒドロキシトルエン、剥離剤４−メチルフタル酸を溶解し、さらに、この溶液にメタノールを少量ずつ添加した。そして、この溶液にさらにグリセリンと純水とを少量ずつ添加して、未溶解物がほとんどない状態のドープを得た。そして、ドープを濾紙で濾過した。
（１）−１ 添加剤を含む核酸吸着性多孔性膜の作製
セルロースエステルのドープを以下の組成で調製した。ドープ調製における溶解は、先ず、ジアセチルセルロースおよびトリアセチルセルロースをジメチルクロライドに溶解し、続いて可塑剤トリフェニルフォスフェート、紫外線防止剤２、４−ビス−（ｎ−オクチルチオ）−６−（４−ヒドロキシ−３、５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチリルアニリノ）−１、３、５−トリアジン、劣化防止剤ジブチルヒドロキシトルエン、剥離剤４−メチルフタル酸を溶解し、さらに、この溶液にメタノールを少量ずつ添加した。そして、この溶液にさらにグリセリンと純水とを少量ずつ添加して、未溶解物がほとんどない状態のドープを得た。そして、ドープを濾紙で濾過した。
（セルロースエステルドープ組成）
ジアセチルセルロース（酢化度５４．５％） ２．４２質量％
トリアセチルセルロース（酢化度６０．８％） ３．４３質量％
グリセリン ０．１８質量％
ジメチルクロライド ５４．１５質量％
メタノール ３３．２２質量％
トリフェニルフォスフェート ０．２０質量％
ジブチルヒドロキシトルエン ０．０２質量％
４−メチルフタル酸 ０．０１質量％
２、４−ビス−（ｎ−オクチルチオ）−６−（４−ヒドロキシ−３、５
−ジ−ｔｅｒｔ−ブチリルアニリノ）−１、３、５−トリアジン
０．０２質量％
純水 ６．３５質量％
ジアセチルセルロース（酢化度５４．５％） ２．４２質量％
トリアセチルセルロース（酢化度６０．８％） ３．４３質量％
グリセリン ０．１８質量％
ジメチルクロライド ５４．１５質量％
メタノール ３３．２２質量％
トリフェニルフォスフェート ０．２０質量％
ジブチルヒドロキシトルエン ０．０２質量％
４−メチルフタル酸 ０．０１質量％
２、４−ビス−（ｎ−オクチルチオ）−６−（４−ヒドロキシ−３、５
−ジ−ｔｅｒｔ−ブチリルアニリノ）−１、３、５−トリアジン
０．０２質量％
純水 ６．３５質量％
次に、ギヤーポンプを用いドープを送液し、さらに濾過を行ってから、エンドレスバンド上に載せて搬送されるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム上に濾過後のドープをダイを使用して流延した。流延して得られた膜を２０〜４０℃の乾燥風により２０分間乾燥した。
エンドレスバンドから、乾燥後の膜をＰＥＴとともに剥ぎ取り、これを１５分間、８０〜１２０℃で熱風乾燥して巻き取り機で巻き取った。ＰＥＴ上には、セルロースアセテート多孔性膜が形成された。
上記で巻き取って得られたロール状のＰＥＴ付きセルロースアセテート多孔性膜をスリッター付きの巻き替え機を用いて４３ｃｍの幅にスリットした。この４３ｃｍ幅のＰＥＴ付きセルロースアセテート多孔性膜を剥離バーを用いて、ＰＥＴとセルロースアセテート多孔性膜とに分けた。得られたセルロースアセテート多孔性膜は、平均孔径が５．０μｍ、平均膜厚１４０μｍであった。
作製されたセルロースアセテート多孔性膜に、メタノール１．５リットルとヌクレアーゼフリー水１３．５リットルとを混合した混合溶液を吸収させてから、鹸化装置を用い、０．４ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ水溶液で２０〜３０℃、６０分の条件で鹸化を行った。中和は、２０〜３０℃の０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸に浸漬することにより実施した。
洗浄は、オートウォッシャを用い、洗浄水はヌクレアーゼフリー水で行った。次に、架橋剤として０．０５％エチレングリコールジグリシジルエーテルを含む０．０５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液で２０〜３０℃で６０分処理した。ヌクレアーゼフリー水にて洗浄を行い、さらに０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＩＣＮ社製）、０．１５％静電防止剤｛平均粒径０．００５μｍの酸化スズ−酸化アンチモン複合物の微粒子粉末、２次凝集粒子径約０．０８μｍ｝分散液で処理し、そして、接触式ドラム乾燥機を用いて乾燥し、目的の核酸吸着性多孔性膜を得た。
エンドレスバンドから、乾燥後の膜をＰＥＴとともに剥ぎ取り、これを１５分間、８０〜１２０℃で熱風乾燥して巻き取り機で巻き取った。ＰＥＴ上には、セルロースアセテート多孔性膜が形成された。
上記で巻き取って得られたロール状のＰＥＴ付きセルロースアセテート多孔性膜をスリッター付きの巻き替え機を用いて４３ｃｍの幅にスリットした。この４３ｃｍ幅のＰＥＴ付きセルロースアセテート多孔性膜を剥離バーを用いて、ＰＥＴとセルロースアセテート多孔性膜とに分けた。得られたセルロースアセテート多孔性膜は、平均孔径が５．０μｍ、平均膜厚１４０μｍであった。
作製されたセルロースアセテート多孔性膜に、メタノール１．５リットルとヌクレアーゼフリー水１３．５リットルとを混合した混合溶液を吸収させてから、鹸化装置を用い、０．４ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ水溶液で２０〜３０℃、６０分の条件で鹸化を行った。中和は、２０〜３０℃の０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸に浸漬することにより実施した。
洗浄は、オートウォッシャを用い、洗浄水はヌクレアーゼフリー水で行った。次に、架橋剤として０．０５％エチレングリコールジグリシジルエーテルを含む０．０５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液で２０〜３０℃で６０分処理した。ヌクレアーゼフリー水にて洗浄を行い、さらに０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＩＣＮ社製）、０．１５％静電防止剤｛平均粒径０．００５μｍの酸化スズ−酸化アンチモン複合物の微粒子粉末、２次凝集粒子径約０．０８μｍ｝分散液で処理し、そして、接触式ドラム乾燥機を用いて乾燥し、目的の核酸吸着性多孔性膜を得た。
（２）−１ 紫外線照射試験
（１）−１で得られた核酸吸着性多孔性膜に１ＫＷ高圧水銀灯を用いて紫外線を１８０分照射した。
（１）−１で得られた核酸吸着性多孔性膜に１ＫＷ高圧水銀灯を用いて紫外線を１８０分照射した。
（３）核酸分離精製カートリッジの作成
内径７ｍｍ、核酸吸着性多孔性膜を収容する部分を持ち、２つの開口を持つ核酸分離精製カートリッジ用容器をハイインパクトポリスチレンで作成した。（２）−１で紫外線を照射した後の核酸吸着性多孔性膜（膜厚＝７０μｍ、平均孔径＝１．２μｍ）を核酸分離精製カートリッジ用容器の核酸吸着性多孔性膜を収容する部分に収容し、核酸分離精製カートリッジに加工した。
内径７ｍｍ、核酸吸着性多孔性膜を収容する部分を持ち、２つの開口を持つ核酸分離精製カートリッジ用容器をハイインパクトポリスチレンで作成した。（２）−１で紫外線を照射した後の核酸吸着性多孔性膜（膜厚＝７０μｍ、平均孔径＝１．２μｍ）を核酸分離精製カートリッジ用容器の核酸吸着性多孔性膜を収容する部分に収容し、核酸分離精製カートリッジに加工した。
（４）核酸可溶化試薬及び洗浄液の調製
以下の処方により核酸可溶化試薬溶液及び洗浄液を調製した。
以下の処方により核酸可溶化試薬溶液及び洗浄液を調製した。
（核酸可溶化試薬溶液処方）
塩酸グアニジン（ライフテクノロジー社製） ３８２ｇ
Ｔｒｉｓ（ライフテクノロジー社製） １２．１ｇ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＩＣＮ製） １０ｇ
蒸留水 １０００ｍｌ
塩酸グアニジン（ライフテクノロジー社製） ３８２ｇ
Ｔｒｉｓ（ライフテクノロジー社製） １２．１ｇ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＩＣＮ製） １０ｇ
蒸留水 １０００ｍｌ
（洗浄液）
１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ
１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
６５％ エタノ−ル
１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ
１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
６５％ エタノ−ル
（５）ＤＮＡ分離精製操作
人全血検体２００μｌに、実施例１で作製した核酸可溶化試薬２００μｌと、プロテアーゼ（ＳＩＧＭＡ社製、”Ｐｒｏｔｅａｓｅ” Ｔｙｐｅ ＸＸＩＶ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ）溶液２０μｌを添加して、６０℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、エタノール２００μｌを加え攪拌して、核酸を含む試料溶液を作製した。得られた核酸を含む試料溶液を、上記（３）で作製した核酸吸着性多孔性膜を備えた核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した該核酸を含む試料溶液を、上記核酸吸着性多孔性膜に通過させることで、上記核酸吸着性多孔性膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、上記一の開口から圧力差発生装置を外し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、（４）で作製した洗浄液を注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、上記核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出した。この操作を３回繰り返した。続いて、上記一の開口から圧力差発生装置を外し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、上記核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。
人全血検体２００μｌに、実施例１で作製した核酸可溶化試薬２００μｌと、プロテアーゼ（ＳＩＧＭＡ社製、”Ｐｒｏｔｅａｓｅ” Ｔｙｐｅ ＸＸＩＶ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ）溶液２０μｌを添加して、６０℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、エタノール２００μｌを加え攪拌して、核酸を含む試料溶液を作製した。得られた核酸を含む試料溶液を、上記（３）で作製した核酸吸着性多孔性膜を備えた核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した該核酸を含む試料溶液を、上記核酸吸着性多孔性膜に通過させることで、上記核酸吸着性多孔性膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、上記一の開口から圧力差発生装置を外し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、（４）で作製した洗浄液を注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、上記核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出した。この操作を３回繰り返した。続いて、上記一の開口から圧力差発生装置を外し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、上記核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。
（６）核酸の分離精製の確認
回収液を用いてアガロースゲル電気泳動を行った。結果を図１に示す。尚、実施例１は同一条件においてｎ＝４で行った。
回収液を用いてアガロースゲル電気泳動を行った。結果を図１に示す。尚、実施例１は同一条件においてｎ＝４で行った。
（７）核酸吸着性多孔性膜の膜強度の測定
（１）−１で作製した核酸吸着性多孔性膜および（２）−１で紫外線を照射した後の核酸吸着性膜について、膜の強度測定を行なった。測定する膜をそれぞれ２ｃｍ×５ｃｍの短冊状に切り取り、該短冊の両端を重ね合わせ、中心に形成されるループ部分に５０、２０、１０ｇの分銅を静かに置き、２〜３秒静置した。続いて、該短冊の中心をループを形成した時とは反対方向に折り曲げ、折った部分に再び上記分銅をのせ、２〜３秒静置した。これらの操作をｎ＝５０行なった後に短冊が切れる頻度（％）を算出した。結果を表１に示す。
（１）−１で作製した核酸吸着性多孔性膜および（２）−１で紫外線を照射した後の核酸吸着性膜について、膜の強度測定を行なった。測定する膜をそれぞれ２ｃｍ×５ｃｍの短冊状に切り取り、該短冊の両端を重ね合わせ、中心に形成されるループ部分に５０、２０、１０ｇの分銅を静かに置き、２〜３秒静置した。続いて、該短冊の中心をループを形成した時とは反対方向に折り曲げ、折った部分に再び上記分銅をのせ、２〜３秒静置した。これらの操作をｎ＝５０行なった後に短冊が切れる頻度（％）を算出した。結果を表１に示す。
[比較例１]
（１）−２ 核酸吸着性多孔性膜の作製
セルロースエステルドープ組成に、トリフェニルフォスフェート、２、４−ビス−（ｎ−オクチルチオ）−６−（４−ヒドロキシ−３、５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチリルアニリノ）−１、３、５−トリアジン、ジブチルヒドロキシトルエン、４−メチルフタル酸を含まないこと、並びにエチレングリコールジグリシジルエーテル処理、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００と静電防止剤による処理を行わないこと以外は、実施例１の（１）−１と同様にして、核酸吸着性多孔性膜を作製した。
（２）−２ 紫外線照射試験
（１）−２で得られた核酸吸着性多孔性膜に、実施例１と同様にして、紫外線を照射した。その後、実施例１と同様にして、（３）〜（６）の操作を行った。電気泳動の結果を図１に示す。尚、比較例１は同一条件においてｎ＝４で行った。
また、実施例１と同様にして（７）の測定を行った。結果を表１に示す。
（１）−２ 核酸吸着性多孔性膜の作製
セルロースエステルドープ組成に、トリフェニルフォスフェート、２、４−ビス−（ｎ−オクチルチオ）−６−（４−ヒドロキシ−３、５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチリルアニリノ）−１、３、５−トリアジン、ジブチルヒドロキシトルエン、４−メチルフタル酸を含まないこと、並びにエチレングリコールジグリシジルエーテル処理、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００と静電防止剤による処理を行わないこと以外は、実施例１の（１）−１と同様にして、核酸吸着性多孔性膜を作製した。
（２）−２ 紫外線照射試験
（１）−２で得られた核酸吸着性多孔性膜に、実施例１と同様にして、紫外線を照射した。その後、実施例１と同様にして、（３）〜（６）の操作を行った。電気泳動の結果を図１に示す。尚、比較例１は同一条件においてｎ＝４で行った。
また、実施例１と同様にして（７）の測定を行った。結果を表１に示す。
*1 実施例１の（１）−１で得られた膜における分銅１０ｇでの試験のみ、サンプルが無くなったためｎ＝４９で測定した。
上記の実施例１の膜は膜強度が４〜７％向上し、加工時における膜破れが改善された。
また、帯電防止性が付与され、加工時の静電気による所望しない箇所への張り付きが無くなった。さらに、柔軟性が改善され、加工適性が向上し、加工時の大幅な得率改善が得られた。
さらにまた、強い紫外線による滅菌工程での膜強度の低下が抑制できることを確認した。
核酸分離精製の性能は、図１に示す通り、実施例１の複数の添加剤が含まれている核酸吸着性多孔性膜は、比較例１の核酸吸着性多孔性膜と同等の性能が得られ、高い収率を維持していることが確認された。
また、帯電防止性が付与され、加工時の静電気による所望しない箇所への張り付きが無くなった。さらに、柔軟性が改善され、加工適性が向上し、加工時の大幅な得率改善が得られた。
さらにまた、強い紫外線による滅菌工程での膜強度の低下が抑制できることを確認した。
核酸分離精製の性能は、図１に示す通り、実施例１の複数の添加剤が含まれている核酸吸着性多孔性膜は、比較例１の核酸吸着性多孔性膜と同等の性能が得られ、高い収率を維持していることが確認された。
１：実施例１の多孔性膜で精製したＤＮＡ
２：比較例１の多孔性膜で精製したＤＮＡ
Ｍ：分子量マーカー １Ｋｂｐ ｌａｄｄｅｒ
２：比較例１の多孔性膜で精製したＤＮＡ
Ｍ：分子量マーカー １Ｋｂｐ ｌａｄｄｅｒ
Claims (14)
- （１）核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
（２）洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程、及び
（３）回収液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させる工程
を含む核酸の分離精製方法であって、該核酸吸着性多孔性膜として添加剤を含んで形成された核酸吸着性多孔性膜を用いることを特徴とする核酸分離精製方法。 - 上記添加剤が、可塑剤、静電防止剤、劣化防止剤、紫外線防止剤、界面活性剤、剥離剤、着色剤、補強剤、架橋剤および湿潤剤から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の核酸分離精製方法。
- 上記添加剤が、上記核酸吸着性多孔性膜に対して１０％以下の質量分率で含まれている請求項１または２に記載の核酸分離精製方法。
- 上記核酸吸着性多孔性膜が、厚さが１０μｍ〜５００μｍである、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分離精製方法。
- 上記核酸吸着性多孔性膜が、孔の最小孔径が０．２２μｍ以上である、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分離精製方法。
- 上記核酸吸着性多孔性膜が、表裏対称性の多孔性膜である、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分離精製方法。
- 上記核酸吸着性多孔性膜が、表裏非対称性の多孔性膜である、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分離精製方法。
- 上記核酸吸着性多孔性膜が、孔の最小孔径に対する最大孔径の比が１：２以上である、請求項７記載の核酸分離精製方法。
- 上記核酸吸着性多孔性膜が、空隙率が５０〜９５％である、請求項１〜８のいずれかに記載の核酸分離精製方法。
- 上記核酸吸着性多孔性膜が、バブルポイントが０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ2である、請求項１〜９のいずれかに記載の核酸分離精製方法。
- 上記核酸吸着性多孔性膜が、圧力損失が０．１〜１００ｋＰａである、請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸分離精製方法。
- 上記核酸吸着性多孔性膜が、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2あたり１分間で１〜５０００ｍＬである、請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸分離精製方法。
- 上記核酸吸着性多孔性膜が、1ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．１μｇ以上である、請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸分離精製方法。
- 請求項１〜１３のいずれかに記載の核酸分離精製方法に用いられる核酸吸着性多孔性膜。
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|---|---|---|---|
| JP2004266911A JP2006081410A (ja) | 2004-09-14 | 2004-09-14 | 核酸の分離精製方法 |
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|---|---|
| JP2006081410A true JP2006081410A (ja) | 2006-03-30 |
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| JP (1) | JP2006081410A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008031440A (ja) * | 2006-06-30 | 2008-02-14 | Weyerhaeuser Co | ビスコースの製造における高ヘミセルロースパルプの処理法、および、それから得られる製品 |
| US20210086139A1 (en) * | 2018-06-15 | 2021-03-25 | Fujifilm Corporation | Hydrophilic porous membrane and method for producing hydrophilic porous membrane |
-
2004
- 2004-09-14 JP JP2004266911A patent/JP2006081410A/ja active Pending
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