JPH10501246A

JPH10501246A - 極度に少量でかつ非常に強く汚染された非常に種々の出発物質から核酸を単離および精製する一般的方法

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Publication number: JPH10501246A
Application number: JP8501476A
Authority: JP
Inventors: ヒレブランド，ティモ; ベンツコ，ペーター; ペータース，ラルス−エリク
Original assignee: インヴィテークゲーエムベーハー
Priority date: 1994-06-14
Filing date: 1995-06-14
Publication date: 1998-02-03
Anticipated expiration: 2021-03-29
Also published as: JP3761573B2; ATE184013T1; EP0765335A1; WO1995034569A1; EP0765335B1; DE59506735D1

Abstract

(57)【要約】本発明は極度に少量かつ高度に不純物で汚染された種々の生物学的および他の出発物質から核酸を単離および精製するための一般的に使用できる方法に関する。適用領域は法医学、医学的診断、分子生物学、生化学、遺伝子工学およびすべての他の学際的分野である。本発明による方法は、核酸を含有する物質を溶解させ、溶解物を非多孔質かつ非構成の高分散性ならびに均質な、化学的に純粋なSiO₂担体とインキュベートし、核酸が結合した担体を分散しそして緩衝溶液で洗いそして次に塩濃度の低い緩衝液を用いて核酸を担体から分離することを特徴とする。物質の溶解および核酸の結合は好ましくは一つの反応容器中で実施される。使用された担体粒子は粒径７〜40nm好ましくは40nm、比表面50〜300g/m²好ましくは50g／m²有する。

Description

【発明の詳細な説明】極度に少量でかつ非常に強く汚染された非常に種々の出発物質から核酸を単離および精製する一般的方法説明本発明は極度に少量で事情によってはまた非常に強く有機および無機成分で汚染された種々の生物学的および他の出発物質からの核酸の単離および精製方法に関する。これは多数の生物学的、分子生物学的、裁判上、医学的、分析的ならびに生化学的仕事をする研究室にとって大へん重要である。従って本発明の適用領域は法医学、医学的診断、分子生物学、生化学、遺伝子工学およびすべての他の学際領域である。通常核酸は細胞および組織から、強い変性性および還元性条件下に、一部はタンパク分解酵素をも使用して出発物質を溶解させ、出てきた核酸フラクションをフェノールー／クロロホルム−抽出工程により精製しそして核酸を透析または水相からのエタノールに沈殿により取得することにより得られる(Sambrook，J.,Fr itsch，E.F．およびManistis，T.，1989，CSH，“Molecular Cloning”)。細胞そして特に組織からの核酸のこの“古典的”単離法は非常に時間がかかり（一部では48時間以上）、多大の装置費用を必要としそしてその上また野外条件下では実現可能でない。その上かかる方法はフェノールおよびクロロホルムのような化学薬品が使用されているゆえ少なからぬ程度に健康に危険がある。種々の生物学的出発物質から核酸を単離するための種々の代替法により、費用がかかり健康を損なう核酸のフェノールー／クロロホルム−抽出を迂回でき、費やす時間の低減も達成できる。これらすべての方法はVogelsteinおよびGillaspie（Proc．Natl．Acad．Sci.U SA，1979，76，615-619）により開発されたもので、アガロースゲルからのＤＮＡフラグメントの調製的および分析的精製のための初めて記載された方法に基づくものである。この方法は単離すべきＤＮＡバンドを含有するアガロースの飽和 NaＩ溶液中への溶解と、このカオトロープ（chaotrope）塩の存在下でのこのＤＮＡのガラス粒子への結合とを組み合せるものである。ガラス粒子に固定されたＤＮＡを次に洗浄溶液（20mM トリスHCl［pH7.2］；200mM NaCl；２mM EDTA；50％ v/vエタノール）で洗いそして終りに担体粒子から分離させる。この方法は今日まで一連の修正を受けておりそして現時点まで種々の起源からの核酸の異なる抽出および精製方法に応用される（Marko，M.A.，Chipperfield, R.およびBirnboim，H.G.，1982，Anal．Biochem.，121，382-387）。その他今日では世界中に多数の試薬系も存在し、とりわけアガロースゲルからのＤＮＡフラグメントの精製のためおよび細菌溶解物からのプラスミドＤＮＡの単離のため、しかしまた血液、組織、または細胞培養物からの長鎖核酸（ゲノムＤＮＡ、細胞性総ＲＮＡ）の単離のための試薬系が存在する。すべてのこれら商業的に入手しうるキットは種々のカオトロープ塩の高分子溶液の存在下での鉱物性担体への核酸の結合というよく知られた原理に基づいておりそして担体物質として微細に粉砕されたガラス末（例えばGlasmilk，BIO 101, La Jolla，CA）、ケイソウ土（Fa．Sigma）またはシリカゲル（Diagen，DE 41 3 9664 Al）の懸濁液を使用するものである。しかしながら古典的なガラスミルク懸濁液またはケイソウ土懸濁液もクロマトグラフィーカラム上に固定されたシリカゲルも、非常に少量の核酸の単離にとって必要な物理的前提条件に関しては何ら指定していない。さらにこれら担体物質の多孔質のまたはたとえ活性が比較的低いにしても構成された表面のような物理特性が汚染夾雑物の除去にさらに不都合に作用する。従って例えばＰＣＲに適するＤＮＡを、ガラスミルクを使用して唾液試料から単離することは可能でない（Ochert，A.S.ら；1993，PCR Methods and Applicat ion，3，6，365-368）。ガラス粒子に結合されたＤＮＡは充分に洗浄できないかまたは恐らくそれ自体例えば低分子糖化合物を結合していて、従ってこの唾液中に含有される汚染夾雑物がまた最終ＤＮＡにも存在しそして後続の酵素反応（例えばＰＣＲ）を阻害する。技術の現況によれば、便試料からのゲノム（または細菌性またはウイルム性）ＤＮＡの単離を可能にする効率的でかつ迅速な方法は何ら存在しない。生物学的出発物質としての便物質は極端に強く汚染されておりそしてＤＮＡ単離システムに非常に高度の要求を必要とする。便試料からＤＮＡを単離するために現時点まで用いられた方法は、一部は数日を要しそして費用のかかるプロティナーゼＫ消化およびフェノール／クロロホルム抽出ならびにエタノール沈殿を包含しそしてすでに単離された核酸をガラス粒子への知られたＤＮＡ結合を用いて付加的にもう一回精製することを必要とする。目下のところゲノム（および従って長鎖の）ＤＮＡの単離に用いられるガラス物質または多孔質シリカゲル含有カラムのもう一つの問題は、高分子ＤＮＡの機械的負荷（剪断）が非常に強いことにある。ガラスミルクまたはケイソウ土懸濁液を用いてもシリカゲル含有ミニカラムを用いても単離されたゲノムＤＮＡはゲル電気泳動でしばしば（とりわけミニカラム系の使用において）明らかに視認できる分解を示す。その際、原因は一つはシリカゲルの細孔をまたは何ら均質な粒子コンシステンシーを示さないガラス末またはケイソウ土を含有する担体懸濁液を通過する際のＤＮＡの機械的負荷にある（例えばケイソウ土は例えば非常に鋭い角のある粒子を含有しそしてその上寸法が均質でもない）。従ってあらゆる洗浄工程または遠心分離工程がＤＮＡの分解を招く。細胞性の完全なＲＮＡの例えばシリカゲルを担持するカラムへの結合も知られておりそして試薬系として入手できるがしかしその際細胞性完全ＲＮＡの完全な単離は実現されない、というのは比較的小さなＲＮＡ種（<200bp）が単離され得ないからである。従って例えばかかるＲＮＡはＤＤＲＴ−ＰＣＲ適用（細胞の完全ｍＲＮＡ種の単離）にはもはやうまくは使用できない、なぜなら初めから小さなＲＮＡ種は存在しないからである。さらにかかる系には極度に少量の出発物質からのＲＮＡ単離の可能性も存在しない。たとえ鉱物性物質への核酸の結合の知られた原理による核酸の単離ならびに精製方法がその間にさらに拡がるとしても、これまでに知られた単離系（および用いられた担体物質）を用いる核酸単離の一連の特別の適用は満足できる解決がされてないかまたは全然解決されていない。これは以下のことに関する：１．極度に少量の出発物質（例えば組織物質0.5mg未満；衣服上の血液または血痕0.5μｌ未満；唾液５μｌ未満；細胞10³未満）からの核酸（ゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡ）の単離、２．非常に広い範囲の種々の出発物質からの核酸の単離への一般的システムの利用可能性（すなわち細胞培養物または全血のような「簡単な出発物質」から、ならびに非常に古い骨または便物質のような極度に困難な出発物質からの核酸の単離）、３．単離された核酸を後続の酵素反応（例えばＰＣＲ）の基質として成功裡に使用可能ならしめる品質での、強く汚染された出発物質からの核酸の単離。今、かかる汚染を負った出発物質は特定の臨床的に重要な問題、診断、裁判上の調査または進化生物学的問題の解明に大へん重要である。その後、とりわけ、骨または衣類材料上の血痕（法医学）、非常に古い骨（進化生物学）、唾液、気管支喀痰物質および便試料（医学的診断）のような「興味のある」出発物質が重要である。既に記載したとおり例えば増幅能のあるＤＮＡを唾液試料からガラスミルクを用いて単離することは可能でない。便試料からＤＮＡを単離すべき場合、この問題はさらに複雑である。現在の技術状況によれば、増幅可能な核酸を単離するための機能性の速やかな単離法は何ら存在しない（商業的に入手できないし刊行もされてない）ことが明らかに確認される必要がある。これまでかかる出発物質からのＤＮＡの単離には極度に作業および時間を食う多数の精製工程が必要である。このような費用のかかる操作は必要である、なぜなら便試料中に含有される多数の汚染夾雑物はすべてのこれまで知られた方法を用いてしか除去できなかったからである。担体物質への核酸の結合による便試料からの増幅可能な核酸の直接的で従って非常に速やかな単離はこれまで知られておらずそしてそれゆえ非常に大きな欠点を意味した、なぜなら単離すべき核酸（とりわけ腸壁からはがれ落ちた上皮細胞からのゲノムＤＮＡ）源としての便試料はルーチンによる遺伝子診断に利用できないからである。本発明の目的はこの特別の使用を可能にする核酸の一般的な単離および精製方法を提供することにある。驚くべきことに、本発明により使用される担体物質を用いそして種々のカオトロープ塩を使用するとすべてのこれらの要求が卓抜した方法で満たされることが見出された。本発明による方法は請求の範囲１〜14項によって実現される。それは核酸を含有する出発物質を溶解させ、溶解物を非多孔質かつ未構成の高分酸性ならびに均質な化学的に純粋なSiO₂担体とインキュベートし、核酸が結合したこの担体を分離しそして緩衝溶液で洗い流して次に核酸を塩濃度の低い緩衝液を用いて担体から遊離させることを特徴とする。核酸は粒径40nmで約50m²/gの活性表面を有するSiO₂粒子の表面にイオン強度の高いカオトロープ塩の存在下に固定されるのが好ましい。それによって、ａ）極端に少量の核酸を含有する出発物質、ｂ）非常に「困難」で、有機および無機不純物で汚染された種々の生物学的およびその他の出発物質例えば便試料、骨、等、から、単離される核酸を用いる後続の酵素による操作を可能ならしめる品質および量で核酸を単離することが可能となる。使用される担体物質と組み合せた用いられるカオトロープ塩の選択によりＤＮＡまたはＲＮＡの選択的結合が実現されることが同じく驚くべきことに示された。従って出発物質の溶解に使用されるカオトロープ塩の選択のみにより、担体物質をＤＮＡの単離にまたはＲＮＡの単離に使用することができ、その場合方法の進行過程において全く何の変更も行われない。核酸の結合に用いられる物質のこのような挙動はこれまで決して記載されていない。核酸のこの単離法は非常に簡単な取扱いでき、わずかな装置を用意する必要しかなく、試料物質の酵素による予備処理（例えばプロティナーゼに消化）を全く必要とせず、有毒なフェノールー／クロロホルム−抽出の使用をせずに済み、エタノール沈殿を何ら必要とせずそしてそれゆえわずかの時間を費やすのみで実現でき、このことにより大なる範囲の試料を調べることができる。その物理特性を備えた本発明により用いられる担体物質は不純物で非常に強く汚染された出発物質のような極度に少量の種々の出発物質からの核酸の単離および精製にとって理想的である。本発明の基礎をなす選択された担体物質の特性は、以下に他の担体物質と比較して示すものであって、それにより核酸の一般的単離システムの開発が初めて可能となるものである（一般的の意味するところは、ＤＮＡならびにＲＮＡの単離、すべての核酸含有生物学的および他の出発物質からの核酸の単離、極度に少量の出発物質からの核酸の単離、ならびに不純物で非常に強く汚染された出発物質からの核酸の単離）。さらに示すとおり、かかる一般的システムは従来用いられたガラス材料（ガラスミルク、ガラス末、など）を用いては実現できない。本発明で用いられる担体物質は核酸の単離に用いられる他の担体物質とはその物理的特性が根本的に相違し、他の担体物質ではi.d R．化学的に純粋なSiO₂ではなく、例えばホウケイ酸ガラスに基づく多孔質または非多孔質ガラス物質（ガラスミルク）または特に核酸精製に使用するためのクロマトグラフィー用材料として商業的に入手でき従って（これも商業的に入手しうる）懸濁液調製のための基礎を形成する植物性、鉱物性細胞壁成分（ケイソウ土）からのものが重要である。これらすべての担体物質は標準的使用に非常に良好に適するがしかしその物理的構造ゆえに前記した出発物質からの核酸の単離に際して多大の欠点または限界を示す。本発明方法で用いられる担体物質はこれまで用いられた物質より著しく小さい。従って核酸の固定化に利用できる活性な担体表面は非常に大きくなる。まさにnm範囲で限定される担体粒子の大きさのみならずそれから生ずる非常に高い比表面により、極度にわずかな量の出発物質からの核酸の単離が可能となる。その際本発明による方法の土台である目標すなわち極度にわずかな量の種々の出発物質からの核酸の単離、はとどのつまりは、すでに存在しそのままなお開発中にあるいわゆる非侵襲性の医学的試料取得法（微量のミクロバイオプシー物質；特別に構成された「吐出空気収集器」を備えた肺上皮細胞の取得、等）と医学的診断法との結合を提供することを可能にすべき新たな戦略に相当する。これまで極度にわずかな核酸を含有する試料（例えばバイオプシー物質、肺流体）からさらなる診断のための核酸を単離することは可能でなかった。本発明方法を用いて実現された、かかる極度に少量の出発物質からの核酸の単離は、医学的試料取得における新規な非侵襲性方法に初めて新規な可能な適用領域を開くものである。本発明方法で使用される担体粒子のさらなる重要な利点は担体表面上への核酸の直接結合従って直接露出にある。これと反対に、多孔質アニオン交換体と鉱物性担体物質の組み合せを用いるクロマトグラフィー系を使用する（例えばDE 41 39 664 A1）場合の単離すべき核酸は表面上にではなくて細孔内部に存在する。かかる局在化により強い洗浄の可能性が非常に強く低下し、それにより種々の混入汚染物の除去が低下する。同様にガラスミルク懸濁液、ケイソウ土から作った懸濁液または特許明細書DE 41 39 664 A1号記載の多孔質または非多孔質マトリックス（寸法範囲１μm〜250μm好ましくは10〜30μm）は、粒径がはるかに大きいゆえ、また一部担体粒子では均質な混合物は重要でないゆえおよびそれゆえ結合担体表面がよりわずかであるゆえに結合された核酸の有効な洗浄が全く可能でない。まさにこのように強い洗浄ができることが次に、例えば粘液物質、色素、低分子糖化合物等のような全く相異する汚染混入物の巨大なる量を包含する出発物質から核酸を単離すべき場合は問題となろう。担体物質の使用を含む本発明による方法は費用のかかるプロティナーゼＫ消化、フェノール／クロロホルム抽出ならびにエタノール沈殿を行うことなく、剥離した腸壁細胞からの直接的ＤＮＡ単離を初めて可能にするものである。便試料からの不溶性成分の分離およびカオトロープ塩を含有する緩衝液の添加後、ＤＮＡは直接担体物質に結合され、洗浄されそして担体から溶離される。この方法は極度に迅速で（約１時間）、そしてＰＣＲ適用に問題なく使用できる優れた品質のゲノムＤＮＡを生ずる。便試料からの増幅可能なＤＮＡのかかる迅速な単離方法はこれまで他のＤＮＡ単離システムを用いては決して達成されなかった。これはプロト腫瘍遺伝子Krasにおける結腸瘤と関連した点突然変異の迅速かつ再現性ある検出の実施を未来の重要な遺伝子診断法として例えば初めて可能にしそしてそれゆえリスクグループの予防措置のためまたは結腸癌または膵臓癌の早期検知においても重要であろう。かかるルーチン形で実施しうる遺伝子診断はこれまでゲノムＤＮＡの好適な単離および精製方法がなかったため不可能であった。本発明方法で使用されそしてかかる観点で選択された担体物質は（他の担体物質またはカラム系と反対に）粒子の純度および物質性ゆえに、または打ち抜かれた（Zerstanzte）ガラス物質またはケイソウ土がまさに重要でないということによってもＤＮＡの機械的負荷を非常に大きく低下させる。従って、およびこれらはゲル電気泳動調製において同様に非常に明白に示すので、単離されたＤＮＡは非常に高い度合いの完全性を示しそしてそれゆえ非常に慎重な古典的フェノール／クロロホルム抽出法で得られたＤＮＡに匹敵する品質を示す。完全性の高いゲノムＤＮＡは、そのＤＮＡをＬＡ／ＸＬ−ＰＣＲ使用のための基質としてまたはＤＮＡフィンガープリント技術のための基質として使用すべき場合にとりわけ必要とされる。本発明による方法のもう一つの利点は、使用された担体物質がリボ核酸（ＲＮＡ）の単離にも理想的な方法で適合しそして目下ＲＮＡの単離に使用されている、シリカゲルマトリックスを充填されたミニカラム系（Fa．Diagen）と反対に細胞性全ＲＮＡの完全な単離、すなわち非常に小さなＲＮＡ種の単離も可能にするということにある。本発明による方法により、ｔＲＮＡおよび５ＳＲＮＡフラクション（およびそれゆえすべての小さなＲＮＡ種も）を含めた細胞性全ＲＮＡの単離、ならびに数百個の細胞従って極度にわずかな量の出発物質からのＲＮＡの単離ができる。従ってこれは非常にわずかな量の細胞の発現調査に卓抜して適合し、ことにこのような出発物質からの全ＲＮＡ単離のための全操作が約20分しかかからない。さらに、また、担体粒子の比表面が非常に大きいことが非常に高い結合効率をもたらし、従って種々の出発物質中に存在するＲＮＡの理論的に100％○が単離されうる。これは、血中のウイルス力価の経過についての示標を得るために例えばＣ型肝炎診断における定量的ＰＣＲ使用を開発すべき場合にはとりわけ重要である。かかる問題に○○を出すための定量的なＰＣＲ使用は、非常に強い度合いで使用ＲＮＡ単離システムの如何に依存する。使用した担体物質へのＲＮＡ分子の結合は、ＤＮＡ分子よりずっと高い親和性を以ってＲＮＡ分子の使用担体への結合を仲介する高モルの塩化リチウムを含有する溶解／結合緩衝液の使用により実現される。すでにあげたように、溶解／結合緩衝液の選択のみにより種々の結合特異性を達成でき、従って同一の担体物質が同様にＲＮＡ分子の単離にも使用されうる。従って存在する理論的考えに比較してカオトロープ条件下での鉱物性物質への核酸結合の物理化学的メカニズムは全く異なった状態にあり、それによれば、核酸の水和物カバーのカオトロープ塩により惹起される破壊後にこれらの鉱物性マトリックスへの吸着が行われる。このことはしかしまた理論的表示によれば、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが鉱物性物質にそのように強く結合されるので、ＲＮＡの溶離は非常に高い温度でしか、そしてそれゆえＲＮＡの損傷の下でしか行われ得ないことを意味する。本発明により記載される担体物質の使用においておよび溶解ならびにＲＮＡの担体物質への結合を実現するための塩化リチウムの使用においては、DEPC処理した水を用いてこれらを再び担体から再び溶離できる。とりわけ長鎖ゲノムＤＮＡならびに細胞性全ＲＮＡの単離と関連した本発明による方法のもう一つの決定的な利点は、この方法が出発物質の酵素による予備処理（プロティナーゼ処理）を全く必要としないことにある。それぞれの単離方法に従って用いられる溶解緩衝液がそれらのタンパク質変性作用（およびこの関連で内因性および外因性ＤＮアーゼまたはＲＮアーゼの不活性も）と並んで核酸の担体物質への結合も仲介する。これにより例えば単層細胞培養物、組織試料または全血からの（例えば細胞１×10⁵個、組織0.5mg、全血100μｌ）ゲノムＤＮＡの単離が30分未満でできる。溶解も核酸の結合も同じ緩衝条件下および同じ反応容器中で行われる。このことは従ってかかる生物学的出発物質からの長鎖核酸の他の単離システムに比較した決定的な時間的利点を意味する。記載された長鎖ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）またはＲＮＡの単離の他に、用いられた担体はまたＴＡＥ−またはＴＢＥ−ゲルからの核酸の単離および精製、反応混合物（存在する鉱物油を含めて）からの直接ＰＣＲフラグメントの単離および精製、ならびに細菌溶解物からのプラスミドＤＮＡの単離に適する。その際、これら可能性にそれ以上立ち入るべきでない。またその際用いられた担体物質はゲルまたはＰＣＲ付着物から寸法範囲60bp〜50kbpのＤＮＡフラグメントの非常に高い回収率または品質的に高い価値のあるプラスミドＤＮＡの非常に高い収率を実現する。すべての記載された適用において、それぞれ使用された溶解緩衝液（適用に応じグアニジンチオシアネート、NaＩ、グアニジン塩酸塩または塩化リチウムおよび相当する洗浄剤添加物から構成される）は核酸の担体への結合をも仲介する。種々の出発物質から本発明方法で単離されそして担体に固定された核酸のすべてを洗浄緩衝液（50mM NaCl；10mM トリスHCl；1mM EDTA；70% v/v）で数回洗う。使用された洗浄緩衝液はVogelsteinおよびGillespieにより記載された出発操作とは塩濃度がより低いことおよびエタノール濃度がより高いことが相違する。かかる洗浄緩衝液組成ゆえに結合した核酸を損失することなくよりはげしい洗浄ができる。核酸の溶離は好ましくは溶離緩衝液（10mM トリスHCl；0.1mM EDTA）またはDE PC処理水中で好ましくは52℃の温度で最高５分以内で行われる。単離された核酸は例えばＰＣＲ／ＲＴ−ＰＣＲおよび特にＰＲ適用（ＬＡＸＬ −ＰＣＲ、ＲＡＰＤＰＣＲフィンガープリンティング等）、制限エンドヌクレアーゼを用いる開裂、クローニング、配列決定、インビトロ転写、放射性標識化、ハイブリッド形成方法等、のような多数の他の分子生物学的または生化学的方法に利用できる。本発明を以下の実施例によりより詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。１．96−ウエルマイクロタイタープレート上で培養された（細胞約５×10³個）真核生物単層細胞培養物からのゲノムＤＮＡの単離細胞培養上清を除去しそして細胞を１×ＰＢＳで２回短時間すすぐ。ウェル上に直接溶解緩衝液（グアニジンチオシアネート；Ｎ−ラウリルサルコシル；ＤＴＴ；クエン酸ナトリウム）500μｌを添加してそして細胞溶解懸濁液を1.5mlのエッペンドルフ遠心容器に移す。使用した担体物質から調製された懸濁液10μｌを細胞溶解懸濁液に加え、短時間かきまぜ、氷浴中５分間インキュベーションしそして次に卓上遠心機で短時間（10秒間）遠心分離することにより担体物質をペレット化する。担体ペレットに結合したゲノムＤＮＡに次に洗浄緩衝液（50mM NaCl；10mM トリスHCl；1mM EDTA；70% v/vエタノール）を加えて２〜３回洗浄しそして次にゲノムＤＮＡを溶離緩衝液（10mM トリス；0.1mM EDTA ）の添加により52℃で担体物質から遊離させ、担体を短時間遠心分離することにより溶離ゲノムＤＮＡと分離しそして後者を新たな反応容器に移す。２．ハイブリドーマ細胞懸濁液（約200μｌ；細胞約10³個）からの細胞性全ＲＮＡの単離細胞懸濁液を1.5mlのエッペンドルフ遠心容器に移しそして溶解緩衝液（10M LiCl，2% トリトンX-100）500μｌを加える。室温で５分間インキュベーションする。この細胞溶解懸濁液に、使用された担体物質から調製した懸濁液10μｌを添加し、短時間かきまぜ、氷浴中５分間インキュベーションしそして次に担体物質を卓上遠心機中短時間（10秒間）遠心分離することによりペレット化する。担体ペレットに結合したＲＮＡに次に洗浄緩衝液（50mM NaCl；10mM トリスHCl；1 mM EDTA；70% v/vエタノール）を加え２〜３回洗浄しそして次にDEPC処理ddH₂O を添加することにより細胞性全ＲＮＡを52℃で担体物質から遊離させ、短時間遠心分離することにより、溶離した細胞性全ＲＮＡを担体と分離しそしてこのものを新たな反応容器に移す。３．紙ハンカチ上の約O.５μｆ血痕からのゲノムＤＮＡの単離紙ハンカチの血痕のついた領域を切断しそして切片を1.5mlのエッペンドルフ遠心容器に移す。 500mμｌの溶解緩衝液（グアニジンチオシアネート；Ｎ−ラウリル−サルコシル；ＤＴＴ；クエン酸ナトリウム）を添加しそして室温で数時間インキュベーションする。不溶成分を分離するために短時間遠心分離し、上清を新たな遠心容器に移しそして使用された担体物質から調製された懸濁液10μｌを加え、短時間かきまぜ、氷浴中５分間インキュベーションしそして次に卓上遠心機で短時間（10秒間）遠心することにより担体物質をペレット化する。担体ペレットに結合した左ゲノムＤＮＡに次に再び洗浄緩衝液（50mM NaCl；10mM トリスHCl;1mM EDTA；70% v/ vエタノール）を加えそして２〜３回洗浄し次にゲノムＤＮＡを溶離緩衝液（10m M トリス； 0.1mM EDTA）の添加により52℃で担体物質から遊離させ、短時間遠心分離することにより担体を溶離したゲノムＤＮＡと分離し、後者を新たな反応容器に移す。４．骨材料からのゲノムＤＮＡの単離微細に粉砕した骨末約100〜250mgを2.0mlエッペンドルフ遠心容器に移す。溶解緩衝液１ml（グアニジンチオシアネート；Ｎ−ラウリル−サルコシル；ＤＴＴ；クエン酸ナトリウム；0.5M EDTA）を添加し、56℃で軽く振盪しながら15 〜20時間インキュベーションする。 12〜14000rpmで遠心分離しそして上清を新たな遠心容器に移す。使用された担体物質から調製された懸濁液15μｌを加え、短時間かきまぜ、氷浴中５分間インキュベーションしそして次に卓上遠心機で短時間（10秒間）遠心分離することにより担体物質をペレット化する。担体ペレットに結合したゲノムＤＮＡに次に再び洗浄緩衝液（50mM NaCl；10mM トリスHCl； 1mM EDTA；70% v/vエタノール）を加え３回洗浄しそして次に溶離緩衝液（10mMトリス；0.1mM E DTA）を加えることにより52℃でゲノムＤＮＡを担体物質から遊離させ、担体を短時間遠心分離することにより溶離したゲノムＤＮＡから分離しそしてこの後者を新たな反応容器に移す。５．便試料からのゲノムＤＮＡの単離約100mgの便試料を2.0mlエッペンドルフ遠心容器に移しそして300mlの洗浄容器（NaCl、EDTA、トリス HCl）を添加する。30秒間かきまぜそして次に10000r pmで２分間遠心分離する。上清を新たな1.5mlエッペンドルフ遠心容器に移しそして１mlの溶解緩衝液（グアニジンチオシアネート；Ｎ−ラウリルサルコシル；、ＤＴＴ；クエン酸ナトリウム）を加える。室温で20〜30分間インキュベーションする。使用された担体物質から調製された懸濁液15μｌを加え、短時間かきまぜ、氷浴中５分間インキュベーションしそして次に卓上遠心機で短時間（10秒間）遠心分離することにより担体物質をペレット化する。担体ペレットに結合したゲノムＤＮＡに次に再び洗浄緩衝液（50mM NaCl；10mM トリスHCl；1mM EDTA；70% v /vエタノール）を加えて３回洗浄しそして次に溶離緩衝液（10mM トリス0.1mM E DTA）を添加することによりゲノムＤＮＡを52℃で担体物質から遊離させ、担体を短時間遠心分離することにより溶離したＤＮＡと分離しそして後者を新たな反応容器に移す。６．ただ１本の毛根からのゲノムＤＮＡの単離１本の毛根を500μｌ容量の溶解緩衝液（グアニジンチオシアネート；Ｎ− ラウリル−サルコシル；ＤＴＴ；クエン酸ナトリウム）中室温で30〜60分間インキュベーションする。使用された担体物質から調製された懸濁液15μｌを添加し、短時間撹拌し、氷浴中５分間インキュベーションしそして次に担体物質を卓上遠心機中短時間（10秒間）遠心分離することによりペレット化する。担体ペレットに結合したゲノムＤＮＡに次に再び洗浄緩衝液（50mM NaCl；10mM トリス H Cl；1mM EDTA；70% v/vエタノール）を加え２〜３回洗浄し次に溶離緩衝液(10mM トリス；0.1mM EDTA）を加えることによりゲノムＤＮＡを52℃で担体から遊離させ、短時間遠心分離することにより担体を溶離したゲノムＤＮＡと分離しそして後者を新たな反応容器に移す。７．ＰＣＲ反応混合物から直接ＰＣＲフラグメントの精製固定化溶液（担体懸濁液を含有する6M NaＩ）150μｌを上層の鉱油被覆を含めたＰＣＲ反応混合物に直接添加する。短時間かきまぜそして氷浴中３分間インキュベーションする。卓上遠心機で短時間（10秒間）遠心分離することにより担体物質をペレット化する。担体ペレットに結合したＰＣＲ生成物に次に再び洗浄緩衝液（50mM NaCl；10mM トリス HCl；1mM EDTA；70% v/vエタノール）を加え２回洗浄しそして次に溶離緩衝液(10mM トリス；0.1mM EDTA)の添加により52℃ で担体物質から遊離させ、短時間遠心分離することにより担体を溶離ＰＣＲフラグメントと分離しそして後者を新たな反応容器に移す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号Ｐ４４４７０１５．０ (32)優先日 1994年12月30日 (33)優先権主張国ドイツ（ＤＥ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＫＲ，ＵＳ (72)発明者ペータース，ラルス−エリクドイツ連邦共和国ディー−10367 ベルリンメレンドルフシュトラーセ 71番地

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ）核酸を含有する物質を、高いイオン強度のカオトロープ塩を含有する緩衝液を用いて溶解させ、ｂ）高分散性の非多孔質および非構成性ならびに均質なSiO₂担体とインキュベーションする、ここでSiO₂粒子は活性表面50〜300m²/gで粒子寸法７〜40nmを有するものであり、ｃ）担体に固定された核酸を溶解物から分離し、ｄ）担体の表面上に固定された核酸を洗浄緩衝液を用いて洗浄し、そしてｅ）塩濃度の低い緩衝液を用いて担体から核酸を遊離させることによる、極度に少量でかつ非常に強く汚染された種々の出発物質から核酸を単離および精製するための一般的方法。２．カオトロープ塩としてイオン強度４Mを超えるグアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアネート、塩化リチウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウムまたは塩化リチウム／尿素混合物が用いられることを特徴とする、請求の範囲１記載の方法。３．担体物質として、比表面50m²/gで粒子寸法40nmを有する高分散性の、非多孔質および非構成性ならびに均質な化学的に純粋なSiO₂が用いられることを特徴とする、請求の範囲１および２記載の方法。４．核酸を含有する出発物質の溶解および担体粒子への核酸の結合が同じ反応容器中で「一工程」方法として行われることを特徴とする、請求の範囲１〜３記載の方法。５．核酸が結合した担体を短時間の遠心分離工程により残りの溶解物から分離することを特徴とする、請求の範囲１〜４記載の方法。６．担体に固定された核酸を、50mM NaCl、10mM トリス-HClおよび１mM EDTAおよび70％エタノールからなる洗浄緩衝液で洗浄することを特徴とする、請求の範囲１〜５記載の方法。７．担体に固定された核酸を、10mM トリス-HCl、0.1mM EDTAからなる低イオン強度の緩衝液、他の低塩緩衝液またはDEPC処理物を用い48〜56℃好ましくは52 ℃の温度で溶離することを特徴とする、請求の範囲１〜６記載の方法。８．バッチ法で実施することを特徴とする、請求の範囲１〜７記載の方法。９．核酸が細菌、細胞培養物、完全なまたは凍結組織試料、組織切片、***、体液、便試料、ウイルス、植物細胞、酵母細胞、博物館の生物学的乾燥標本、例えば衣類上の血痕、樹皮等のような種々の裁判上の出発物質、毛髪、唾液、骨または他の生物学的起源、または例えばＰＣＲまたは類似の反応のような増幅反応に由来するか、または標識された核酸であることを特徴とする、請求の範囲１〜８記載の方法。 10．核酸の結合に特別に使用される担体により、例えば0.5mg未満の組織物質、0 .5μｌ未満の血液または衣類上の血痕、５μｌ未満の唾液、10³個未満の細胞、のような極度に少量の種々の生物学的出発物質から核酸を単離することを特徴とする、請求の範囲１〜９記載の方法。 11．ゲノムデオキシリボ核酸および細胞性全リボ核酸の迅速な単離に使用されることを特徴とする、請求の範囲１〜10記載の方法。 12．ＰＣＲ生成物またはＰＣＲフラグメントの単離および精製に、および水溶液、ＴＡＥ−またはＴＢＥ−アガロースゲルから広い分子量範囲のＤＮＡフラグメントの単離に使用されることを特徴とする、請求の範囲１〜８記載の方法。 13．リボ核酸を単離するために生物学的出発物質の溶解を10モル塩化リチウムを用いて実施しそしてリボ核酸の溶解およびSiO₂担体への結合を同じ反応容器中で行うことを特徴とする、請求の範囲１〜11記載の方法。 14．単離すべきかまたは精製すべき核酸の大きさが50ヌクレオチドから60000ヌクレオチドの範囲を包含することを特徴とする、請求の範囲１〜13記載の方法。