JP2006063031A - 核酸の分離精製方法及び核酸吸着性多孔性膜 - Google Patents

Abstract

【課題】 収率が高く、分離性能に優れ、洗浄効率が良く、簡便で、迅速で、自動化および小型化適性に優れ、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産可能である多孔性膜を使用した核酸の分離精製方法を提供する。
【解決手段】 （１）核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、（２）洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び（３）回収液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱離させる工程を含有する核酸の分離精製方法において、該核酸吸着性多孔性膜が、アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体、及びそれらの鹸化物からなる、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であることを特徴とする核酸の分離精製方法。
【選択図】 なし

Description

本発明は、核酸を含む試料溶液から核酸を分離精製する方法に関する。より詳しくは、少なくとも２個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力発生装置とを用いて、核酸を含む試料溶液から核酸を分離精製する方法に関する。また、本発明は、核酸を含む試料溶液から核酸を分離精製可能な核酸吸着性多孔性膜に関する。

従来の核酸抽出法としては、遠心法によるもの、磁気ビーズを用いるもの、フィルターを用いるもの等がある。例えば、核酸を二酸化珪素、シリカポリマー、珪酸マグネシウム等の固相に吸着させ、引き続き洗浄，脱離等の操作をすることによって、核酸を分離精製する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。

特公平７−５１０６５号公報

しかし、前記のような従来の核酸分離精製方法は、分離性能は優れているが、収率の点で未だ充分ではなかった。また、同一性能の吸着媒体を工業的に大量に製造することが困難であり、更なる改良が求められていた。
従って、本発明の目的は、検体中の核酸を核酸吸着性の多孔性膜に吸着させた後、洗浄等を経て脱離させる核酸の分離精製方法において、核酸の分離性能に優れるとともに、核酸を高い収率で分離精製できる方法を提供することである。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、核酸を多孔性膜に吸着及び脱離させる過程を含む核酸の分離精製方法において、該多孔性膜として、アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体、又はその鹸化物からなる、イオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜を用いることによって、核酸を含む検体から核酸を収率よく、高純度で分離精製することができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。即ち、本発明は、下記の通りである。

１． （１）核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
（２）洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程、及び、
（３）回収液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱離させる工程
を含む核酸の分離精製方法であって、
該核酸吸着性多孔性膜を形成する材料が、アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体、又は、アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体の鹸化物からなることを特徴とする核酸の分離精製方法。

２． 前記アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体が、モノエステル誘導体、ジエステル誘導体、トリエステル誘導体、モノエステル誘導体とジエステル誘導体との混合物、モノエステル誘導体とトリエステル誘導体との混合物、ジエステル誘導体とトリエステル誘導体との混合物、又は、モノエステル誘導体とジエステル誘導体とトリエステル誘導体との混合物である、上記１に記載の核酸の分離精製方法。
３． 前記アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体のエステルが、カルボン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、リン酸エステル、及び、ピロリン酸エステルの少なくともいずれか１つを含む上記１又は２に記載の核酸の分離精製方法。
４． 前記核酸吸着性多孔性膜を形成する材料が、前記アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体の鹸化物である上記１〜３のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。

５． 前記核酸吸着性多孔性膜を形成する材料が、２種類以上のポリマー種の混合物である上記１〜４のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
６． 前記核酸吸着性多孔性膜を形成する材料が、２種類以上のポリマー種の混合物の鹸化物である上記１〜５のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
７． 前記アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体の鹸化率が、５％以上である上記１〜６のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
８． 前記核酸吸着性多孔性膜を形成する材料が、セルロースの銅アンモニア溶液、セルロースのアルカリ溶液、又は、ビスコース溶液から形成された再生セルロースのからなる、上記１〜７のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。

９． 前記核酸吸着性多孔性膜の厚さが、１０μｍ〜５００μｍの範囲である、上記１〜８のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
１０． 前記核酸吸着性多孔性膜が、孔の最小孔径が０．２２μｍ以上である、上記１〜９のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
１１． 前記核酸吸着性多孔性膜が、表裏対称性である、上記１〜１０のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
１２． 前記核酸吸着性多孔性膜が、表裏非対称性である、上記１〜１０のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。

１３． 前記核酸吸着性多孔性膜が、孔の最小孔径に対する最大孔径の比が１：２以上である、上記１〜１２のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
１４． 前記核酸吸着性多孔性膜の空隙率が、５０〜９５％である、上記１〜１３のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
１５． 前記核酸吸着性多孔性膜のバブルポイントが、０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ²である、上記１〜１４のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
１６． 前記核酸吸着性多孔性膜の圧力損失が、０．１〜１００ｋＰａである、上記１〜１５のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
１７． 前記核酸吸着性多孔性膜が、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ²の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ²あたり１分間で１〜５０００ｍＬの範囲である、上記１〜１６のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
１８． 前記核酸吸着性多孔性膜が、膜１ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．１μｇ以上である、上記１〜１７のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。

１９． アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体、又は、アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体の鹸化物からなることを特徴とする核酸吸着性多孔性膜。
２０． 前記アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体が、モノエステル誘導体、ジエステル誘導体、トリエステル誘導体、モノエステル誘導体とジエステル誘導体との混合物、モノエステル誘導体とトリエステル誘導体との混合物、ジエステル誘導体とトリエステル誘導体との混合物、又は、モノエステル誘導体とジエステル誘導体とトリエステル誘導体との混合物である、上記１９に記載の核酸吸着性多孔性膜。

本発明によれば、検体中の核酸を核酸吸着性多孔性膜に吸着させた後、洗浄等を経て脱離させることにより、効率良く、高純度かつ高収率で核酸を分離精製することができる。更には、本発明の核酸分離精製方法は、分離性能に優れ、洗浄効率が良く、簡便で、迅速で、自動化および小型化適性に優れている。また、本発明の核酸吸着性多孔性膜は、実質的に同一の分離性能を有する多孔性膜を大量に生産可能なものである。

まず、本発明の核酸の分離精製方法において使用される核酸吸着性多孔性膜について説明する。
本発明に用いる核酸吸着性多孔性膜は、アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体、又は、アセチルセルロース以外の多糖類を有するエステル誘導体の鹸化物から形成される。
このエステル誘導体又はその鹸化物から形成される核酸吸着性多孔性膜は、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であることを特徴とする。この「イオン結合が実質的に関与しない相互作用」とは、多孔性膜側の使用条件で「イオン化」していないことを意味し、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜とが引き合う作用であると推定される。これにより分離性能に優れ、しかも洗浄効率よく、核酸を単離精製することができる。核酸吸着性多孔性膜は、親水基を有することが好ましく、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜の親水基同士が引きあるようになると推定される。

親水基とは、水との相互作用を持つことができる有極性の基（原子団）を指し、核酸の吸着に関与する全ての基（原子団）が当てはまる。親水基としては、水との相互作用の強さが中程度のもの（化学大事典、共立出版株式会社発行、「親水基」の項の「あまり親水性の強くない基」参照）が良く、例えば、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、オキシエチレン基、アミノ基、アミド基などを挙げることができる。好ましくは水酸基である。
以下、多孔性膜を形成する材料について詳細に説明する。

［アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体又はその鹸化物］
前記エステル誘導体又はその鹸化物を構成する多糖類としては、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、アガロース、デキストリン、アミロース、アミロペクチン、デンプン、グリコーゲン、プルラン、マンナン、グルコマンナン、リケナン、イソリケナン、ラミナラン、カラギーナン、キシラン、フルクタン、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、キチン、キトサン等を挙げることができる。本発明における多孔性膜は、前記いずれかの多糖類のエステル誘導体又はその鹸化物からなることが好ましい。

前記エステル誘導体におけるエステルとしては、カルボン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、ホスホン酸エステル、ピロリン酸エステルが挙げられ、エステル誘導体がこれらのエステルから選ばれる少なくともいずれかを有することが好ましい。また、カルボン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、ホスホン酸エステル、ピロリン酸エステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記カルボン酸エステルとしては、アルキルカルボニルエステル、アルケニルカルボニルエステル、芳香族カルボニルエステル、芳香族アルキルカルボニルエステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、アルキルカルボニルエステル、アルケニルカルボニルエステル、芳香族カルボニルエステル、芳香族アルキルカルボニルエステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記アルキルカルボニルエステルのアルキルカルボニル基としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、バレル基、ペプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基のいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、バレル基、ペプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基のいずれか一つ以上から選ばれるエステル基を持つ前記アルキルカルボニルエステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記アルケニルカルボニルエステルのアルケニルカルボニル基は、アクリル基、メタクリル基が挙げられ、カルボン酸エステルとしてアルケニルカルボニルエステルを用いる場合には、これらのアルケニルカルボニル基から選ばれる少なくともいずれかを有することが好ましい。また、アルケニルカルボニルエステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記芳香族カルボニルエステルのエステル基は、ベンゾイル基、ナフタロイル基の少なくとも一つ以上から選ばれることが好ましい。また、ベンゾイル基、ナフタロイル基の少なくとも一つ以上から選ばれるエステル基を持つ前記芳香族カルボニルエステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記硝酸エステルとしては、ニトロセルロース、ニトロヘミセルロース、ニトロデキストラン、ニトロアガロース、ニトロデキストリン、ニトロアミロース、ニトロアミロペクチン、ニトログリコーゲン、ニトロプルラン、ニトロマンナン、ニトログルコマンナン、ニトロリケナン、ニトロイソリケナン、ニトロラミナラン、ニトロカラギーナン、ニトロキシラン、ニトロフルクタン、ニトロアルギン酸、ニトロヒアルロン酸、ニトロコンドロイチン、ニトロキチン、ニトロキトサンなどを好ましく用いることができる。
また、ニトロセルロース、ニトロヘミセルロース、ニトロデキストラン、ニトロアガロース、ニトロデキストリン、ニトロアミロース、ニトロアミロペクチン、ニトログリコーゲン、ニトロプルラン、ニトロマンナン、ニトログルコマンナン、ニトロリケナン、ニトロイソリケナン、ニトロラミナラン、ニトロカラギーナン、ニトロキシラン、ニトロフルクタン、ニトロアルギン酸、ニトロヒアルロン酸、ニトロコンドロイチン、ニトロキチン、ニトロキトサンなどの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記硫酸エステルとしては、セルロース硫酸、ヘミセルロース硫酸、デキストラン硫酸、アガロース硫酸、デキストリン硫酸、アミロース硫酸、アミロペクチン硫酸、グリコーゲン硫酸、プルラン硫酸、マンナン硫酸、グルコマンナン硫酸、リケナン硫酸、イソリケナン硫酸、ラミナラン硫酸、カラギーナン硫酸、キシラン硫酸、フルクタン硫酸、アルギン酸硫酸、ヒアルロン酸硫酸、コンドロイチン硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロース硫酸、ヘミセルロース硫酸、デキストラン硫酸、アガロース硫酸、デキストリン硫酸、アミロース硫酸、アミロペクチン硫酸、グリコーゲン硫酸、プルラン硫酸、マンナン硫酸、グルコマンナン硫酸、リケナン硫酸、イソリケナン硫酸、ラミナラン硫酸、カラギーナン硫酸、キシラン硫酸、フルクタン硫酸、アルギン酸硫酸、ヒアルロン酸硫酸、コンドロイチン硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記スルホン酸エステルとしては、アルキルスルホン酸エステル、アルケニルスルホン酸エステル、芳香族スルホン酸エステル、芳香族アルキルスルホン酸エステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、アルキルスルホン酸エステル、アルケニルスルホン酸エステル、芳香族スルホン酸エステル、芳香族アルキルスルホン酸エステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記リン酸エステルとしては、セルロースリン酸、ヘミセルロースリン酸、デキストランリン酸、アガロースリン酸、デキストリンリン酸、アミロースリン酸、アミロペクチンリン酸、グリコーゲンリン酸、プルランリン酸、マンナンリン酸、グルコマンナンリン酸、リケナンリン酸、イソリケナンリン酸、ラミナランリン酸、カラギーナンリン酸、キシランリン酸、フルクタンリン酸、アルギン酸リン酸、ヒアルロン酸リン酸、コンドロイチンリン酸、キチンリン酸、キトサンリン酸などを好ましく用いることができる。また、セルロースリン酸、ヘミセルロースリン酸、デキストランリン酸、アガロースリン酸、デキストリンリン酸、アミロースリン酸、アミロペクチンリン酸、グリコーゲンリン酸、プルランリン酸、マンナンリン酸、グルコマンナンリン酸、リケナンリン酸、イソリケナンリン酸、ラミナランリン酸、カラギーナンリン酸、キシランリン酸、フルクタンリン酸、アルギン酸リン酸、ヒアルロン酸リン酸、コンドロイチンリン酸、キチンリン酸、キトサンリン酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記ホスホン酸エステルとしては、セルロースホスホン酸、ヘミセルロースホスホン酸、デキストランホスホン酸、アガロースホスホン酸、デキストリンホスホン酸、アミロースホスホン酸、アミロペクチンホスホン酸、グリコーゲンホスホン酸、プルランホスホン酸、マンナンホスホン酸、グルコマンナンホスホン酸、リケナンホスホン酸、イソリケナンホスホン酸、ラミナランホスホン酸、カラギーナンホスホン酸、キシランホスホン酸、フルクタンホスホン酸、アルギン酸ホスホン酸、ヒアルロン酸ホスホン酸、コンドロイチンホスホン酸、キチンホスホン酸、キトサンホスホン酸などを好ましく用いることができる。また、セルロースホスホン酸、ヘミセルロースホスホン酸、デキストランホスホン酸、アガロースホスホン酸、デキストリンホスホン酸、アミロースホスホン酸、アミロペクチンホスホン酸、グリコーゲンホスホン酸、プルランホスホン酸、マンナンホスホン酸、グルコマンナンホスホン酸、リケナンホスホン酸、イソリケナンホスホン酸、ラミナランホスホン酸、カラギーナンホスホン酸、キシランホスホン酸、フルクタンホスホン酸、アルギン酸ホスホン酸、ヒアルロン酸ホスホン酸、コンドロイチンホスホン酸、キチンホスホン酸、キトサンホスホン酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記ピロリン酸エステルとしては、セルロースピロリン酸、ヘミセルロースピロリン酸、デキストランピロリン酸、アガロースピロリン酸、デキストリンピロリン酸、アミロースピロリン酸、アミロペクチンピロリン酸、グリコーゲンピロリン酸、プルランピロリン酸、マンナンピロリン酸、グルコマンナンピロリン酸、リケナンピロリン酸、イソリケナンピロリン酸、ラミナランピロリン酸、カラギーナンピロリン酸、キシランピロリン酸、フルクタンピロリン酸、アルギン酸ピロリン酸、ヒアルロン酸ピロリン酸、コンドロイチンピロリン酸、キチンピロリン酸、キトサンピロリン酸などを好ましく用いることができる。また、セルロースピロリン酸、ヘミセルロースピロリン酸、デキストランピロリン酸、アガロースピロリン酸、デキストリンピロリン酸、アミロースピロリン酸、アミロペクチンピロリン酸、グリコーゲンピロリン酸、プルランピロリン酸、マンナンピロリン酸、グルコマンナンピロリン酸、リケナンピロリン酸、イソリケナンピロリン酸、ラミナランピロリン酸、カラギーナンピロリン酸、キシランピロリン酸、フルクタンピロリン酸、アルギン酸ピロリン酸、ヒアルロン酸ピロリン酸、コンドロイチンピロリン酸、キチンピロリン酸、キトサンピロリン酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記多糖類のエステル誘導体は、モノエステル誘導体、ジエステル誘導体、又はトリエステル誘導体であってもよいが、エステル価の異なるエステル誘導体の混合物であることも好ましい。
エステル価の異なるエステル誘導体の混合物として、トリエステル誘導体とジエステル誘導体との混合物、トリエステル誘導体とモノエステル誘導体との混合物、トリエステル誘導体とジエステル誘導体とモノエステル誘導体との混合物、または、ジエステル誘導体とモノエステル誘導体との混合物が挙げられる。中でも、トリエステル誘導体とジエステル誘導体の混合物が好ましい。トリエステル誘導体とジエステル誘導体の混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９であることが好ましく、９０：１０〜５０：５０であることがより好ましい。

また、多糖類が有する水酸基が任意の置換度でエーテル化したものについても好ましく用いることができる。例えば多糖類としてセルロースを用いた場合、エーテル誘導体としては、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチル−カルバモイルエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、シアノエチルセルロース、カルバモイルエチルセルロース等を用いることができ、好ましくは、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースを用いることができるが、多糖類の種類、エーテルの種類を含めてこれらに限定されることはない。
また、多糖類の水酸基が、任意の置換度でハロゲン化したものについても好ましく用いることができる。

前記アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体として、セルロースエステル誘導体を用いる場合を一例として、以下に説明する。セルロースエステル誘導体原料であるセルロースとしては、綿花リンタや木材パルプ（広葉樹パルプ，針葉樹パルプ）、麻、酢酸菌培養過程で生成するセルロース等の天然セルロース、それらを酸加水分解、機械的に粉砕、爆砕処理、高温下に押出機処理によって重合度を調整したものなどがあり、何れの原料セルロースから得られるセルロースエステル誘導体でも使用でき、場合により混合して使用してもよい。これらの原料セルロースについての詳細は、例えばプラスチック材料講座（１７）繊維素系樹脂（丸澤、宇田著、日刊工業新聞社、１９７０年発行）に記載されている。

それによると、セルロースの分子量は広範囲であり例えば天然セルロースは６０万〜１５０万（重合度概算３５００〜１万）であり、精製リンタは８万〜５０万（重合度概算５００〜３０００）であり、木材パルプは８万〜１３４万（重合度概算５００〜２１００）である。ここで分子量は、セルロースあるいはその誘導体の強度的性質に大きく影響し、分子量が小さくなるとある重合度から急にその力学的強度が低下するが、本発明の核酸吸着性多孔性膜の原料としてはいかなる分子量のものも問題なく使用できる。

前述の原料セルロースがそのままセルロースエステル誘導体原料として利用せずに、リンタやパルプを精製して精製リンタと精製高級木材パルプとしたものを使用することが望ましい。リンタは綿実に綿繊維の中で繊維長が短い短繊維でありα−セルロース含量（例えば８８〜９２質量％）が多く純度が高く、不純物も少ない。この粗リンタはゴミ取り、アルカリ蒸煮、漂白、酸処理、脱水および乾燥によって精製リンタを得ることができる。これらの詳細はプラスチック材料講座（１７）繊維素系樹脂（丸澤、宇田著、日刊工業新聞社、１９７０年発行）の２５〜２８頁に記述され、表２・３にその特性が記載されている。本発明においては、この方法により精製したリンタを用いることが好ましい。

精製パルプについても同著の２８〜３２頁に記述されており、表２・４に特性も記載されている。本発明においては、該手法などで精製されたパルプもセルロースエステル誘導体原料として好ましい。ここで、精製された、綿花リンタとパルプとを混合して用いてもよい。その場合、混合割合は特に限定されないが好ましくは５／９５〜９５／５であり、より好ましくは１０／９０〜９０／１０である。混合することによって、多孔性膜の製造時に、セルロースエステル誘導体の溶解性を向上させることができ、多孔性膜の面状、力学特性を改良することができる。

パルプの純度の指標となるα−セルロース含有量は、８０〜１００質量％程度の範囲から選択できる。木材パルプでは、通常８５〜９８質量％程度である。本発明では低純度パルプ、例えばα−セルロース含有量８０〜９６質量％（特に９２〜９６質量％）程度のパルプも使用できる。これらのパルプのうち、通常木材パルプを使用することができる。

パルプあるいは綿花中の中性構成糖成分はグルコースが主成分であるが、本発明の核酸吸着性多孔性膜には、さらにマンノースとキシロースとが含まれていてもよい。なお、綿花中の中性構成糖成分については、特開平１１−１３０３０１号公報に記載がある。
マンノースとキシロースとを含む場合の比率は特に限定されないが、マンノース／キシロース（モル比）＝０．３５／１〜３．０／１、好ましくは０．３５／１〜２．５／１、さらに好ましくは０．３５／１〜２／１である。さらに、その場合に作製されたセルローストリエステル誘導体において、マンノースおよびキシロースの総含有量は、０．０１〜５モル％が好ましく、０．１〜４モル％がより好ましい。なお、「マンノース」「キシロース」は、パルプ中に含まれるヘミセルロース（キシラン，グルコマンナンなど）の主たる構成糖である。これらの原料パルプおよび得られたセルローストリエステル誘導体の構成糖成分は、具体的には特開平１１−１３０３０１号に記載の方法で分析できる。

本発明の核酸吸着性多孔性膜においては、セルロースエステル誘導体の粘度平均重合度が、２００〜３０００であることが好ましい。また、前記セルロースエステル誘導体の質量平均分子量と数平均分子量の比が０．８〜２であることが好ましい。さらに、前記セルロースエステル誘導体が酸解離指数１．９３〜４．５の酸またはその塩を含有することが好ましい。

前記セルロースエステル誘導体の残存酢酸量あるいは炭素数３〜２２の脂肪酸が、０．５質量％以下であることが好ましい。また、セルロースエステル誘導体が、アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属の少なくとも一種を１ｐｐｂ〜１００００ｐｐｍ含有していることが好ましい。さらに、前記セルロースエステル誘導体が、アルミニウム、ビスマス、ケイ素、重金属（クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、砒素、銀、カドミウム、スズ、アンチモン、金、白金、水銀、鉛など）の少なくとも一種を、１ｐｐｂ〜１０００ｐｐｍ含有することが好ましい。

セルロースの構造の評価手段としてＸ線解析を用いることができる。Ｘ線解析像において、セルロース分子は繊維軸方向に平行に配列し水素結合によって引き合い、５個のセルロース分子のセルビオース単位によって１個の単位胞を形成していることが好ましい。また、Ｘ線法によればその結晶化度は天然セルロースで約７０％であることが示されており、本発明に使用するセルロースエステル誘導体原料に使用するセルロースの結晶化度は、
３０〜７０％であることが好ましい。

ここで、本発明でも利用されるセルロース等の多糖類はその分析については種々行われており、例えば、セルロースについては、ＡＳＴＭ ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐａｒｔ １５、 ＴＡＰＰＩ Ｓｔａｎｄａｒｄ （Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｕｌｐ ａｎｄ Ｐａｐｅｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）やＪＩＳ Ｐ ８１０１などに詳細に掲げられている。測定項目としては、灰分、酸化カルシウムと酸化マグネシウムの含量、α−セルロース、β−セルロース、銅価などである。

多孔性膜は、セルロースエステル誘導体を、溶媒に溶解してドープ溶液を作製し、該ドープ溶液を流延することにより、作製することが好ましい。このような作製方法は、米国特許第3129159号明細書に記載されている。

また、セルロースの多孔性膜としては、再生セルロースの多孔性膜を好ましく使用することができる。再生セルロースとは、セルロースエステル誘導体の固体の表面または全体を、鹸化処理によりセルロース化したもの、セルロースの銅アンモニア溶液から作製したもの、セルロースのビスコース溶液から作製したもの、セルロースのアルカリ溶液から作製したものを挙げることができる。再生セルロースは、前述の綿花リンタや木材パルプ等から得られる本来のセルロースとは、結晶状態等の点で異なっている。なお、セルロースにはI、II、III、IVの結晶型が存在するが（本来のセルロースはIの結晶型である）、本発明においては、どの結晶型でも好ましく使用でき、またI、II、III、IVの結晶型それぞれが任意の割合で含まれていてよい。
以下に、再生セルロース多孔性膜及びその製造方法について記載するが、本発明に使用できる再生セルロース多孔性膜は以下に限定されるものではない。
アセチルセルロース多孔性膜から作製する再生セルロース多孔性膜については、特公昭４５−４６３３号公報、特開昭５６−１００６０４号公報、等に記載の原料、方法で得られるものを使用することができる。
また、セルロースの銅アンモニア溶液から作製する再生セルロース多孔性膜については、特開昭５８−８９６２５号公報、特開昭５８−８９６２６号公報、特開昭５８−８９６２７号公報、特開昭５８−８９６２８号公報、特開昭５９−４５３３３号公報、特開昭５９−４５３３４号公報、特開昭５９−１９９７２８号公報、特開昭６１−２７４７０７号公報、特開昭６２−１４０３号公報、特開昭６３−１６１９７２号公報、特開平７−３３０９４５号公報、等に記載の原料、方法で得られるものを使用することができる。
また、セルロースにアルカリと二硫化炭素を作用させて得られるビスコース溶液からも同様に原液組成や凝固方法を工夫することによって、再生セルロース多孔膜が得られ、本発明に使用することができる。
また、セルロースのアルカリ溶液から作製する再生セルロース多孔性膜は、特開昭６２−２４０３２８号公報、特開昭６２−２４０３２９号公報、特開平１−１８８５３９号公報、等に記載の原料、方法で得られるものを使用することができる。

以上記述したセルロースエステル誘導体については、特開平１０−４５８０３号公報、特開平１１−２６９３０４号公報、特開平８−２３１７６１号公報、特開平８−２３１７６１号公報、特開平１０−６０１７０号公報、特開平９−４０７９２号公報、特開平１１−５８５１号公報、特開平１１−２６９３０４号公報、特開平９−９０１０１号公報、特開昭５７−１８２７３７号公報、特開平４−２７７５３０号公報、特開平１１−２９２９８９号公報、特開平１２−１３１５２４号公報、特開平１２−１３７１１５号公報などに記載のセルロースエステル誘導体を利用することも好ましい。これらの素材も、本発明の核酸吸着性多孔性膜に対しては特に限定されるものではない。

前記したアセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体の鹸化物を得るには、鹸化を行う。鹸化とは、エステル誘導体を鹸化処理液(例えば水酸化ナトリウム水溶液)に接触させることを言う。これにより、鹸化処理液に接触したエステル誘導体のエステル部位が加水分解され、水酸基が導入される。鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度、処理温度、処理時間を変えて鹸化処理を行えば良い。鹸化率は、ＮＭＲ、ＩＲ又はＸＰＳにより、容易に測定することができる（例えば、カルボニル基のピーク減少の程度で定めることができる）。

前記した、エステル誘導体を含んで作製された多孔性膜を表面鹸化することが好ましい。この場合、鹸化処理の程度（鹸化率）で固相表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。核酸の分離効率をあげるためには、水酸基の量（密度）が多い方が好ましい。例えば、エステル誘導体を含んで作製された多孔性膜の鹸化率（表面鹸化率）は、５％以上１００％以下であることが好ましく、１０％以上１００％以下であることが更に好ましい。また、水酸基を有する有機高分子の表面積を大きくするために、セルローストリエステル誘導体の多孔性膜を鹸化することが好ましい。
多孔性膜は、表裏対称性の多孔性膜を使うと膜の表裏を区別することなく製造できるため好ましく、また、表裏非対称性の多孔性膜を使用することで目詰まりのリスクを低減できるため好ましく使用することができる。

本発明の核酸の分離精製方法において、前記エステル誘導体又はその鹸化物からなる多孔性膜と、有機材料又は無機材料等からなる多孔性膜とを併用することができる。併用できる多孔性膜としては、親水性基を有することが好ましく、例えば、親水基を有する有機材料からなる多孔性膜、親水基を持たない有機材料を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない有機材料に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜、親水基を有する無機材料からなる多孔性膜、親水基を持たない無機材料を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない無機材料に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜などを使用することができる。中でも、併用できる多孔性膜を形成する材料の加工容易性から、有機高分子などの有機材料を用いることが好ましい。

親水性基を持たない有機材料に親水性基を導入する方法としては、ポリマー鎖内または側鎖に親水基を有すグラフトポリマー鎖を結合する方法がある。有機材料の多孔性膜にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする２つの方法がある。

まず、有機材料からなる多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる方法においては、ポリマーの末端または側鎖に多孔性膜と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と、多孔性膜の官能基とを化学反応させることでグラフトさせることができる。多孔性膜と反応する官能基としては、多孔性膜の官能基と反応し得るものであれば特に限定はないが、例えば、アルコキシシランのようなシランカップリング基、イソシアネート基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、カルボニル基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、アリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基、アミド基、ヒドラジド基、アルデヒド基、チオール基、スクシイミド基等を挙げることができる。

ポリマーの末端、または側鎖に反応性官能基を有するポリマーとして特に有用な化合物は、トリアルコキシシリル基をポリマー末端に有するポリマー、アミノ基をポリマー末端に有するポリマー、カルボキシル基をポリマー末端に有するポリマー、エポキシ基をポリマー末端に有するポリマー、イソシアネート基をポリマー末端に有するポリマーが挙げられる。この時に使用されるポリマーとしては、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、具体的には、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、ポリ乳酸、ポリケトン、ポリエーテルイミド、ポリアミドイミド、ポリフェニレンスルホン、ポリフェニレンスルフィドスルホン、ナイロン、Ｎ−メチル変性ナイロン、N-アルコキシメチル変性ナイロン、Ｎ−アルキルチオメチル変性ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリアリルアミン、ポリウレタン、フィブロイン、ポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ナイロン４６、ナイロン６６、ナイロン６１０、ナイロン６１２、ナイロン６、ナイロン７、ナイロン１１、ナイロン１２、Ｎ−メチル変性ナイロン、N-アルコキシメチル変性ナイロン、Ｎ−アルキルチオメチル変性ナイロン等の変性ナイロン、多糖類エステル誘導体及びそれらの鹸化物、エステル価の異なる多糖類エステル誘導体混合物及びそれらの鹸化物などを挙げることができる。

多孔性膜を基点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させ、グラフトポリマー鎖を形成させる方法は、一般的には表面グラフト重合と呼ばれる。表面グラフト重合法とは、プラズマ照射、光照射、加熱などの方法で基材表面上に活性種を与え、多孔性膜と接するように配置された重合可能な二重結合を有する化合物を重合によって多孔性膜と結合させる方法を指す。
基材に結合しているグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば、親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。

特に有用な親水基を有するモノマーの具体例としては、次のモノマーを挙げることができる。例えば、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノメタクリレート等の水酸性基含有モノマーを特に好ましく用いることができる。また、アクリル酸、メタアクリル酸等のカルボキシル基含有モノマー、もしくはそのアルカリ金属塩及びアミン塩、アクリルアミド等も好ましく用いることができる。

有機材料に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、ポリ乳酸、ポリケトン、ポリエーテルイミド、ポリアミドイミド、ポリフェニレンスルホン、ポリフェニレンスルフィドスルホン、ナイロン、Ｎ−メチル変性ナイロン、Ｎ−アルコキシメチル変性ナイロン、N-アルキルチオメチル変性ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリアリルアミン、ポリウレタン、フィブロイン、ポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ナイロン４６、ナイロン６６、ナイロン６１０、ナイロン６１２、ナイロン６、ナイロン７、ナイロン１１、ナイロン１２、Ｎ−メチル変性ナイロン、Ｎ−アルコキシメチル変性ナイロン、Ｎ−アルキルチオメチル変性ナイロン等の変性ナイロン、多糖類のエステル誘導体及びそれらの鹸化物、エステル価の異なる多糖類のエステル誘導体混合物及びそれらの鹸化物などを挙げることができる。

また、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上１００％以下であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上１００％以下であることが好ましい。

親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する２つの方法がある。
多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる場合は、グラフトポリマー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。
親水基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、前記、親水基を持たない有機材料の多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法において、記載した親水基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。

親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、ポリ乳酸、ポリケトン、ポリエーテルイミド、ポリアミドイミド、ポリフェニレンスルホン、ポリフェニレンスルフィドスルホン、ナイロン、N-メチル変性ナイロン、N-アルコキシメチル変性ナイロン、N-アルキルチオメチル変性ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリアリルアミン、ポリウレタン、フィブロイン、ポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ナイロン４６、ナイロン６６、ナイロン６１０、ナイロン６１２、ナイロン６、ナイロン７、ナイロン１１、ナイロン１２、N-メチル変性ナイロン、N-アルコキシメチル変性ナイロン、N-アルキルチオメチル変性ナイロン等の変性ナイロン、多糖類エステル誘導体及びそれらの鹸化物、エステル価の異なる多糖類エステル誘導体混合物及びそれらの鹸化物などを挙げることができる。

親水基を持たない無機材料の多孔性膜としては、アルミニウム等の金属、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス、もしくはニューセラミックス、シリコン、活性炭、アルミノケイ酸塩等を加工して作製した多孔性膜を挙げることができる。

また、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に、セルロースエステル誘導体または、エステル価の異なるセルロースエステル誘導体の混合物をコーティングした後に、コーティングしたセルロースエステル誘導体または、エステル価の異なるセルロースエステル誘導体の混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。

［添加剤］
本発明の核酸の分離精製方法において用いる核酸吸着性多孔性膜としては、膜の諸特性を改善するために、用途に応じた種々の添加剤（例えば、可塑剤、静電防止剤、劣化防止剤、紫外線防止剤、界面活性剤、剥離剤、着色剤、補強剤、架橋剤等）を加えることができる。
また、添加剤を添加する時期は、例えば核酸吸着性多孔性膜を溶液流延製膜法によって作製する場合には、ドープ溶液の調製工程中であればいつでも添加することができるが、ドープ溶液の調製工程の最後、すなわちドープ溶液を流延する直前に添加して混合する、いわゆる直前添加方法を採用してもよい。また、製膜後に含浸することにより膜に添加することもできる。

（可塑剤）
可塑剤としては、特開２００２−２６５６３６に記載のリン酸エステル、カルボン酸エステル、また、特開平２−６８２６に記載の多価アルコール、また、特開平５−１９４７８８号、特開昭６０−２５００５３号、特開平４−２２７９４１号、特開平６−１６８６９号、特開平５−２７１４７１号、特開平７−２８６０６８号、特開平５−５０４７号、特開平１１−８０３８１号、特開平７−２０３１７号、特開平８−５７８７９号、特開平１０−１５２５６８号、特開平１０−１２０８２４号、特開平１１−１２４４４５号記載の（ジ）ペンタエリスリトールエステル類、特開平１１−２４６７０４号記載のグリセロールエステル類、特開２０００−６３５６０号記載のジグリセロールエステル類、特開平１１−９２５７４号記載のクエン酸エステル類、特開平１１−９０９４６号記載の置換フェニルリン酸エステル類、特開昭５６−１００６０４号の各公報などに記載されている可塑剤が挙げられる。可塑剤の利用方法及び特性は、これらの各公報に記載されており、本発明に適用することができる。

（静電防止剤）
静電防止剤は、膜の取扱いの際に膜が帯電するのを防ぐ目的で添加することができる。静電防止剤については、イオン導電性物質、導電性微粒子、有機電子導電性有機化合物等が挙げられる。
イオン導電性物質とは、電気伝導性を示し、電気を運ぶ担体であるイオンを含有する物質のことである。具体的には、イオン性高分子化合物を挙げることができる。イオン性高分子化合物としては、特公昭４９−２３８２８号、特公昭４９−２３８２７号、特公昭４７−２８９３７号の各公報に見られるようなアニオン性高分子化合物；特公昭５５−７３４号、特開昭５０−５４６７２号、特公昭５９−１４７３５号、特公昭５７−１８１７５号、特公昭５７−１８１７６号、特公昭５７−５６０５９号の各公報などに見られるような、主鎖中に解離基を持つアイオネン型ポリマー；特公昭５３−１３２２３号、特公昭５７−１５３７６号、特公昭５３−４５２３１号、特公昭５５−１４５７８３号、特公昭５５−６５９５０号、特公昭５５−６７７４６号、特公昭５７−１１３４２号、特公昭５７−１９７３５号、特公昭５８−５６８５８号、特開昭６１−２７８５３号、特公昭６２−９３４６号の各公報に見られるような、側鎖中にカチオン性解離基を持つカチオン性ペンダント型ポリマー；等を挙げることができる。

導電性微粒子は、粒子状の導電性物質のことであり、微分散して添加することにより、核酸吸着性多孔性膜中に粒子状の導電性物質が分散されていることが好ましい。導電性微粒子は、金属酸化物やその複合酸化物からなる導電性微粒子及び分散性粒状ポリマー（例えば、特開平９−２０３８１０号公報に記載のアイオネン導電性ポリマー、或いは、分子間架橋を有する第４級アンモニウムカチオン導電性ポリマー粒子など）から選ばれることが望ましい。好ましい粒径としては５ｎｍ〜１０μｍの範囲であり、更に好ましい範囲は用いられる導電性物質の種類に依存する。
金属酸化物の例としては、ＺｎＯ、ＴｉＯ₂ 、ＳｎＯ₂ 、Ａｌ₂Ｏ₃ 、Ｉｎ₂Ｏ₃ 、ＳｉＯ₂ 、ＭｇＯ、ＢａＯ、ＭｏＯ₂ 、Ｖ₂Ｏ₅ 等、或いはこれらの複合酸化物が好ましく、特にＺｎＯ、ＴｉＯ₂ 及びＳｎＯ₂ が好ましい。異種原子を含む例としては、例えばＺｎＯに対してはＡｌ、Ｉｎ等の添加、ＴｉＯ₂ に対してはＮｂ、Ｔａ等の添加、又ＳｎＯ₂ に対しては、Ｓｂ、Ｎｂ、ハロゲン元素等の添加が効果的である。これら異種原子の添加量は、導電性微粒子中０．０１〜２５ｍｏｌ％の範囲が好ましいが、０．１〜１５ｍｏｌ％の範囲が特に好ましい。
また、これらの金属酸化物やその複合酸化物からなる導電性微粒子の体積抵抗率は１０⁷Ωｃｍ以下が好ましく、特に１０⁵Ωｃｍ以下であることが好ましい。
金属酸化物やその複合酸化物からなる導電性微粒子の１次粒子径は、１００Å以上０．２μｍ以下であることが好ましく、高次構造の長径が３０ｎｍ以上６μｍ以下であることが好ましい。このような粒子径の導電性微粒子は、核酸吸着性多孔性膜中、体積分率で０．０１％以上２０％以下含まれていることが好ましい。

「分散性粒状ポリマー」とは、視覚的観察によって透明又はわずかに濁った溶液に見えるが、電子顕微鏡の下では粒状分散物として見えるポリマーである。分散性粒状ポリマーの体積抵抗率は、１０⁷Ωｃｍ以下が好ましく、特に１０⁵Ωｃｍ以下であることが好ましい。分散粒状ポリマーは、核酸吸着性多孔性膜に体積分率で０．０１％以上２０％以下含まれていることが好ましい。
分散性粒状ポリマーとしては、分子間架橋を有するカチオン導電性ポリマー粒子が好ましい。この分子間架橋を有するカチオン導電性ポリマー粒子の特徴は、粒子内のカチオン成分を高濃度、高密度に持たせることができるため、優れた導電性を有しているばかりでなく、低相対湿度下においても導電性の劣化は見られず、粒子同志も分散状態ではよく分散されているにもかかわらず、膜形状の場合、流延後造膜過程において粒子同志の接着性もよいため膜強度も強く、耐薬品性に優れていることである。また、この分子間架橋を有するカチオン導電性ポリマー粒子は、一般に約１０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲にあり、好ましくは２０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の粒子が用いられる。

有機電子導電性有機化合物としては、例えば、ポリチオフェン、ポリピロール、ポリアニリン、ポリアセチレン、ポリフォスファゼン等が挙げられる。これらは、酸供与材としてポリスチレンスルフォン酸、過塩素酸などとのコンプレックス（錯体）で好ましく用いられる。
有機電子導電性有機化合物の体積抵抗率は、１０⁷Ωｃｍ以下が好ましく、特に１０⁵Ωｃｍ以下であることが好ましい。有機電子導電性有機化合物は、核酸吸着性多孔性膜に体積分率で０．０１％以上２０％以下含まれていることが好ましい。

（劣化防止剤、紫外線防止剤）
劣化防止剤としては、酸化防止剤、過酸化物分解剤、ラジカル禁止剤、金属不活性化剤、酸捕獲剤、アミン類が挙げられる。劣化防止剤や紫外線防止剤については、特開昭６０−２３５８５２号、特開平３−１９９２０１号、特開平５−１９０７０７号、特開平５−１９４７８９号、特開平５−２７１４７１号、特開平６−１０７８５４号、特開平６−１１８２３３号、特開平６−１４８４３０号、特開平７−１１０５６号、特開平７−１１０５５号、特開平７−１１０５６号、特開平８−２９６１９号、特開平８−２３９５０９号、特開平７−１１０５６号、特開２０００−２０４１７３号、特開平５−１９７０７３号、特開平５−１９４７８９号、特開平６−１０７８５４号、特開昭６０−２３５８５２号、特開平１２−１９３８２１号、特開平８−２９６１９号、特開平６−１１８２３３号、特開平６−１４８４３０号、特開２００２−２６５６３６号、特開平５−１９７０７３号の各公報などに記載されているものを好ましく用いることができる。特に好ましい劣化防止剤の例としては、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を挙げることができる。

劣化防止剤及び紫外線防止剤の添加量は、ドープ溶液中の０．０１〜１質量％であることが好ましく、０．０１〜０．０８質量％であることがさらに好ましい。添加量が上記の範囲内であれば、多孔性膜表面に劣化防止剤または紫外線防止剤のブリードアウト（滲み出し）が起こらずに、劣化防止剤または紫外線防止剤の効果が認められ、好ましい。なお、劣化防止剤及び紫外線防止剤を併用することも可能である。
劣化防止剤又は紫外線防止剤は、沸点が２００℃以上であり２５℃で液体であるか、又は、融点が２５〜２５０℃であり標準温度２０℃で固体であることが好ましい。更に好ましくは、沸点が２５０℃以上であり２５℃で液体であるか、又は、融点が２５〜２００℃であり標準温度２０℃で固体のものである。劣化防止剤や紫外線防止剤が液体の場合は、その精製は通常減圧蒸留によって実施されるが高真空であるほど好ましく、例えば１００Ｐａ以下であることが好ましい。また、分子蒸留装置などを用いて精製することも好ましい。また、劣化防止剤や紫外線防止剤が固体の場合は、溶媒を用いて再結晶させてろ過し、洗浄して乾燥することで実施することが一般的である。

（界面活性剤）
界面活性剤については、特開２００２−２６５６３６号公報、特公昭５５−３１４１８号公報、界面活性剤等一覧表２００１年度版（日本界面活性剤工業会）、界面活性剤の応用（幸書房、刈米孝夫著、昭和５５年９月１日発行）等に記載されているものが好ましく用いられるが、これらに限定されるものではない。本発明においては、好ましい界面活性剤はその種類、使用量において特に限定されず、目的とする界面活性特性が得られる量であればよい。

（剥離剤）
剥離剤は、核酸吸着性多孔性膜の製造時に、支持体から多孔性膜を剥離するときの荷重を小さくする目的で使用できる。剥離剤としては、界面活性剤が有効であり、剥離剤として用いることができる界面活性剤としては、リン酸系、スルフォン酸系、カルボン酸系、ノニオン系、カチオン系など特に限定されない。これらは、例えば特開昭６１−２４３８３７号、特開２０００−９９８４７号公報などに記載されている。
また、剥離剤として、特開平１０−３１６７０１号公報に記載の、酸解離指数ｐＫａ１．９３〜４．５０［好ましくは２．０〜４．４、さらに好ましくは２．２〜４．３（例えば、２．５〜４．０）、特に２．６〜４．３（例えば、２．６〜４．０）程度］の酸またはその塩が好ましい。これらは、無機酸または有機酸のいずれでもよい。酸のｐＫａについては「改訂３版 化学便覧，基礎編II」（（財）日本化学会編，丸善（株）発行）を参照できる。
また、特開２００２−２６５６３６号公報に記載の剥離剤についても好ましく用いることができる。
上記の各文献に記載されている剥離剤の利用方法あるいはその特性を、本発明に係る核酸吸着性多孔性膜に同様に適用することができる。

（着色剤）
着色剤としては、公知の色素、染料、顔料、酸化発色色素、還元発色色素、pH指示薬、蛍光色素、カップリング色素、紫外線吸色素、赤外線吸色素、近赤外線吸収色素、感圧色素、フォトクロミック色素、サーモクロミック色素、エレクトロクロミック色素、有機発光色素、光電変換色素、増感色素、２色性色素、エレクトロルミネッセンス色素、食品用色素、有機非線形光学色素、化学発光用色素、医薬品用色素、医療診断用色素、化粧品用色素、半導体レーザー用色素、昇華転写用色素、溶融転写用色素、感熱色素、ロイコ色素、電磁波吸収色素、光導電性色素、帯電性色素等の有機、または無機、または有機無機複合の着色剤を単独または複数種類を所望の濃度で使用することができるが、これらに限定されるものではない。また、着色剤を界面活性剤や保護ポリマー等の分散剤と併用することができ、その場合は所望の割合で使用することができる。

（補強剤）
補強剤は、膜強度を向上させる目的で添加することができる。補強剤としては、ガラス繊維、炭素繊維、ケイ素繊維、セルロース繊維、パルプ繊維、チタン酸カリウム繊維、炭化ケイ素ウィスカー、窒化ケイ素ウィスカー、酸化亜鉛ウィスカー、ホウ酸アルミニウムウィスカー、塩基性硫酸マグネシウムおよび繊維状ゾノトライト、チタン酸カリウムウィスカー、シリコンカーバイト(ＳｉＣ)ウィスカー、ウィスカー状炭酸カルシウムなどが好ましく用いられるが、これらに限定されるものではなく、繊維状または針状結晶状のものであればいずれのものでも使用することができる。また、耐折性を向上させるために合成ポリマーを添加することもでき、特開昭５４−１１０８１号公報に記載されているポリウレタン等を好ましく使用することができるが、これらに限定されるものではない。

（架橋剤）
架橋剤としては、公知のものが使用できるが、核酸吸着性多孔性膜の持つ官能基により適切な種類を選ぶことが好ましい。官能基が水酸基の場合、特開平７−２５６０６６号公報、特開平３−６８４３１号公報などに記載された架橋剤が好ましく使用できるが、これらに限定されるものではない。

（湿潤剤）
湿潤剤としては、特開昭６３−２６２５５０号公報、特開昭６３−２６２５４９号公報、特公昭５５−３１４１８号公報に記載のものが好ましく使用できるが、これらに限定されるものではない。

［核酸吸着性多孔性膜の性状］
本発明に係る核酸吸着性多孔性膜は、溶液が内部を通過可能であり、厚さが１０μｍ〜５００μｍの範囲であることがより好ましい。さらに好ましくは、厚さが５０μｍ〜２５０μｍの範囲である。この範囲内にあることで洗浄効率に優れるため、好ましい。

また、核酸吸着性多孔性膜は、孔の最小孔径が０．２２μｍ以上であることが好ましく、最小孔径が０．５μｍ以上であることがより好ましい。また、核酸吸着性多孔性膜は、孔の最小孔径に対する最大孔径の比が１：２以上であることが好ましい。この範囲にあれば、核酸が吸着するのに十分な表面積が得られるとともに、目詰まりし難いため、好ましい。さらに好ましくは、孔の最小孔径に対する最大孔径の比が１：５以上である。

核酸吸着性多孔性膜の空隙率は、５０〜９５％であることが好ましく、さらに好ましくは、空隙率が６５〜８０％である。
また、核酸吸着性多孔性膜のバブルポイントは、０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ²であることが好ましく、さらに好ましくは、０．２〜４ｋｇｆ／ｃｍ²である。

核酸吸着性多孔性膜の圧力損失は、０．１〜１００ｋＰａである多孔性膜を用いることが好ましい。これにより、過圧時に均一な圧力が得られる。さらに好ましくは、圧力損失が、０．５〜５０ｋＰａである多孔性膜を用いることができる。ここで、圧力損失とは、膜の厚さ１００μｍあたり、水を通過させるのに必要な最低圧力である。

核酸吸着性多孔性膜は、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ²の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ²あたり１分間で１〜５０００ｍＬであることが好ましい。さらに好ましくは、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ²の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ²あたり１分間で５〜１０００ｍＬである。

核酸吸着性多孔性膜は、多孔性膜１ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．１μｇ以上である多孔性膜を使用することが好ましい。さらに好ましくは、多孔性膜１ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．９μｇ以上である多孔性膜を用いることができる。

核酸吸着性多孔性膜は、一辺が５ｍｍの正方形の多孔性膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに、１時間以内では溶解しないが４８時間以内に溶解するセルロース誘導体からなる多孔性膜を好ましく使用することができる。また、一辺が５ｍｍの正方形の多孔質膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに１時間以内に溶解するが、ジクロロメタン５ｍＬに浸漬したときには２４時間以内に溶解しないセルロース誘導体からなる多孔性膜を好ましく使用することができる。

［核酸分離精製カートリッジ］
上記核酸吸着性多孔性膜を、少なくとも二個の開口を有する容器内に収容して用することができる。以下、この容器を「核酸分離精製カートリッジ」という。
この核酸分離精製カートリッジには、核酸吸着性多孔性膜を１枚収容しても複数枚収容してもよい。この場合、複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。

また、核酸分離精製カートリッジには、上記で説明した核酸吸着性多孔性膜とともに、他の有機材料からなる多孔性膜や無機材料からなる多孔性膜とを組み合わせて収容することができる。このような組み合わせとしては、例えば、再生セルロースとガラスフィルターとの多孔性膜との組合せを挙げることができる。この有機材料からなる多孔性膜や無機材料からなる多孔性膜は、核酸吸着性でも核酸非吸着性でもよい。核酸非吸着性の有機材料としては、例えば、ナイロン、ポリスルホン等を挙げることができる。
上記で説明した核酸吸着性多孔性膜は、収容されるカートリッジの形状に応じて、膜状以外の形態にすることも可能である。例えば、チップ状やブロック状等とすることができる。

核酸分離精製カートリッジは、少なくとも二個の開口を有する容器内に、核酸吸着性多孔性膜を収容する以外、その他の部材を収容していないことが好ましい。前記の容器の材料としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルなどのプラスチックを使用することができる。また、生分解性の材料も好ましく使用することができる。また、前記の容器は透明であっても、着色してあっても良い。

核酸分離精製カートリッジとして、個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段を備えている核酸分離精製カートリッジを使用することができる。個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段としては、バーコード、磁気テープなどが挙げられる。
また、少なくとも二個の開口を有する容器内から核酸吸着性多孔性膜を容易に取り出すことが可能になっている構造を有した核酸分離精製カートリッジを使用することもできる。

次に、核酸分離精製方法の各工程について説明する。
本発明の核酸分離精製方法は、
（１）核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程（以下、「吸着工程」とも称する）、
（２）洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程、及び（以下、「洗浄工程」とも称する）、
（３）回収液を、該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱離させる工程（以下、「回収工程」とも称する）
を少なくとも含むものである。

好ましくは、前記(１)、(２)及び(３)の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させるものであり、より好ましくは、前記(１)、(２)及び(３)の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させるものである。核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を加圧状態で前記多孔性膜に通過させることにより、装置をコンパクトに自動化することができ、好ましい。加圧は、好ましくは１０〜２００ｋｐａ、より好ましくは４０〜１００ｋｐａの程度で行われる。

前記工程において、圧力差発生装置としては、注射器、ピペッタ、あるいはペリスタポンプのような加圧が可能なポンプ等、或いは、エバポレーター等の減圧可能なものが挙げられる。これらの内、手動操作には注射器が、自動操作にはポンプが適している。また、ピペッタは片手操作が容易にできるという利点を有する。好ましくは、圧力差発生装置は、核酸分離精製カートリッジの一の開口に着脱可能に結合されている。

前記の核酸吸着性多孔性膜を収容する核酸分離精製カートリッジを用いる場合は、以下の工程で核酸を分離精製することができる。すなわち、
(a)核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、
(b)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジト内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
(c)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に洗浄液を注入する工程、
(d)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、
(e)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に回収液を注入する工程、
(f)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱離させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程
を挙げることができる。

本発明の核酸分離精製方法は、最初の核酸を含む試料溶液を注入してから核酸分離精製カートリッジ外に核酸を得るまでの工程を１０分以内、好適な状況では２分以内で迅速に終了することが可能である。また、前記の核酸分精製の工程では核酸を検体中に含まれる全量に対して５０質量％以上、好適な状況では９０質量％以上の収率で得る事が可能である。

本発明の核酸分離精製方法は、１ｋｂｐ〜３００ｋｂｐ、特に２０ｋｂｐ〜３００ｋｂｐと広範囲に及ぶ分子量の核酸を回収することができる。すなわち、従来行なわれているガラスフィルターを用いたスピンカラム法に比べて、長鎖の核酸を回収できる。

本発明の核酸分離精製方法は、紫外可視分光光度計での測定値(２６０ｎｍ／２８０ｎｍ)が、ＤＮＡの場合は１．６〜２．０、ＲＮＡの場合は１．８〜２．２となる純度を持つ核酸を回収することができ、不純物混入量の少ない高純度の核酸を定常的に得ることができる。さらには、紫外可視分光光度計での測定値(２６０ｎｍ／２８０ｎｍ)がＤＮＡの場合は１．８付近、ＲＮＡの場合は２．０付近となる純度を持つ核酸を回収することができる。

以下、本発明の核酸の分離精製方法における（１）吸着工程、（２）洗浄工程、及び（３）回収工程について詳細に説明する。
［吸着工程］
本発明の核酸の分離精製方法は、前述の通り、（１）の吸着工程において、核酸吸着性多孔性膜に、核酸を含む試料を通過させる。
核酸吸着性多孔性膜中を、核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を一方の面から他方の面へと通過させることが、液を多孔性膜へ均一に接触させることができる点で、好ましい。核酸吸着性多孔性膜中を、核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を核酸吸着性多孔性膜の孔径が大きい側から小さい側に通過させることが、目詰まりし難い点で、好ましい。

核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させる場合の流速は、液の多孔性膜への適切な接触時間を得るために、膜の面積１ｃｍ²あたり、２〜１５００μＬ/secであることが好ましい。液の多孔性膜への接触時間が短すぎると十分な分離精製効果が得られず、長すぎると操作性の点から好ましくない。さらに、前記流速は、膜の面積１ｃｍ²あたり、５〜７００μＬ/secであることが好ましい。
核酸吸着性多孔性膜は１枚でも複数枚を使用することもできる。複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。

（核酸を含む試料溶液）
本発明において使用できる検体は、核酸を含むものであれば特に制限はなく、例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、***、唾液等の体液、あるいは植物（又はその一部）、動物（またはその一部）、細菌、ウイルスなど、あるいはそれらの溶解物およびホモジネートなどの生物材料が対象となる。

核酸を含む検体は、単一の核酸を含む検体でもよいし、異なる複数種類の核酸を含む検体でもよい。また、検体の数は一つでも複数であってもよい。すなわち、複数の容器を用いて複数の検体を並列処理してもよい。前記核酸分離精製方法に供される回収する核酸の長さは特に限定されず、例えば、数ｂｐ〜数Ｍｂｐの任意の長さの核酸であってもよい。取扱い上の観点からは、回収に供される核酸の長さは一般的には、数ｂｐ〜数百ｋｂｐ程度であることが好ましい。前記核酸分離精製方法は、従来の核酸分離精製方法、すなわち簡易的な核酸分離精製方法に対し、比較的長い核酸を迅速に取り出すことができる。好ましくは２０〜３００ｋｂｐ、より好ましくは５０〜２００ｋｂｐ、更に好ましくは７０〜１４０ｋｂｐの核酸を回収することに用いることができる。後述する検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、撹拌及びピペッティングを穏やかにすることが、より長いＤＮＡやＲＮＡを回収する点で好ましい。回収する核酸の種類は、ＤＮＡやＲＮＡ等、特に制限されない。

検体は、細胞膜および核膜等を溶解して核酸を水溶液内に分散し、核酸を含む試料溶液を得ることが好ましい。

例えば、対象となる試料が全血の場合、Ａ．赤血球の除去、Ｂ．各種タンパク質の除去、及びＣ．白血球の溶解及び核膜の溶解を行うことが好ましい。Ａ．赤血球の除去およびＢ．各種タンパク質の除去は、膜への非特異吸着および多孔性膜の目詰まりを防ぐために、Ｃ．白血球の溶解及び核膜の溶解は、抽出の対象である核酸を可溶化させるためにそれぞれ行うことが好ましい。特に、本発明の核酸分離精製方法では、Ｃ．白血球の溶解及び核膜の溶解を行うことが好ましい。本発明の核酸分離精製方法は、試料が全血の場合には、これらの工程を行うことにより核酸を可溶化することが好ましい。

本発明で、細胞膜および核膜を溶解して核酸を可溶化するには、核酸可溶化試薬を用いることが好ましい。更に好ましくは、細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る方法として、
(Ｉ)検体を容器に注入する工程、
(ＩＩ)前記容器に、核酸可溶化試薬溶液を添加し、検体と核酸可溶化試薬溶液を混合し、混合液を得る工程、
(ＩＩＩ)前記で得られた混合液をインキュベートする工程、
(ＩＶ)インキュベート後の混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程
を含む方法を挙げることができる。

検体は、上記（Ｉ）の工程前または（Ｉ）の工程後（ＩＩ）の工程前にホモジナイズ処理することが好ましい。これにより、自動化処理適正を向上することができる。ホモジナイズ処理としては、例えば、超音波処理、鋭利な突起物を用いる、高速攪拌処理を用いる、微細空隙から押し出す処理、ガラスビーズを用いる処理等で行うことができる。

前記（ＩＩ）の工程において、核酸可溶化試薬としては、タンパク質分解酵素、カオトロピック塩、界面活性剤、消泡剤および核酸安定化剤の中から選ばれる化合物を含む溶液が挙げられる。

また、特にタンパク質分解酵素を含む核酸可溶化試薬を使用することにより、核酸の回収量及び回収効率が向上し、必要な核酸を含む検体の微量化及び迅速化が可能となり好ましい。

タンパク質分解酵素としては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼが挙げられ、少なくとも１つのタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、タンパク質分解酵素は、複数種以上のタンパク質分解酵素の混合物も好ましく用いることができる。
セリンプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばプロテアーゼＫなどを好ましく用いることができる。システインプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばパパイン、カテプシン類などを好ましく用いることができる。金属プロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばカルボキシペプチターゼ等を好ましく用いることができる。
タンパク質分解酵素の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、添加時の全容積１ｍｌあたり好ましくは０．００１ＩＵ〜１０ＩＵ、より好ましくは０．０１ＩＵ〜１ＩＵで用いることができる。

また、タンパク質分解酵素は、核酸分解酵素を含まないタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、安定化剤を含んだタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。安定化剤としては、金属イオンを好ましく用いることができる。具体的には、マグネシウムイオンが好ましく、例えば塩化マグネシウムなどの形で添加することができる。タンパク質分解酵素の安定化剤を含ませることにより、核酸の回収に必要なタンパク質分解酵素の微量化が可能となり、核酸の回収に必要なコストを低減することができる。
タンパク質分解酵素の安定化剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、好ましくは１〜１０００ｍＭ、より好ましくは１０〜１００ｍＭで含有することが好ましい。

タンパク質分解酵素は、予めカオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とともに混合されて１つの核酸可溶化試薬溶液として核酸の回収に供されても良い。
また、タンパク質分解酵素は、カオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とは個別の２つ以上の核酸可溶化試薬溶液として供されても良い。タンパク質分解酵素を別にする場合、タンパク質分解酵素を含む核酸可溶化試薬溶液を先に検体と混合した後に、カオトロピック塩、界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液と混合される。また、カオトロピック塩、界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液を先に混合した後に、タンパク分解酵素を含む核酸可溶化試薬溶液を混合してもよい。
また、タンパク質分解酵素を、検体または、検体とカオトロピック塩、界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液との混合液に、タンパク質分解酵素保存容器から直接目薬状に滴下させることもできる。この場合、操作を簡便にすることができる。

カオトロピック塩としては、グアニジン塩（例えば、イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン）、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム等を使用することができる。中でも、グアニジン塩が好ましく、塩酸グアニジンがさらに好ましい。また、これらの塩は単独または複数組み合わせて用いてもよい。なお、カオトロピック物質としては、他に尿素等も使用することができる。
カオトロピック塩の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、０．５Ｍ以上であることが好ましく、より好ましくは０．５Ｍ〜４Ｍ、さらに好ましくは１Ｍ〜３Ｍである。

界面活性剤としては、例えば、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤を挙げることができる。本発明においてはノニオン界面活性剤及びカチオン界面活性剤を好ましく用いることができる。
ノニオン界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドを用いることができるが、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤を用いることができる。ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤としては、ＰＯＥデシルエーテル、ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥトリデシルエーテル、ＰＯＥアルキレンデシルエーテル、ＰＯＥソルビタンモノラウレート、ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソルビタンモノステアレート、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングリコールから選択されることが好ましい。これらの界面活性剤は、単独で用いてもまたは複数組み合わせて用いてもよい。

カチオン界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムプロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリド等が好ましい。これらの界面活性剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。これら界面活性剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましい。

消泡剤としては、シリコン系消泡剤（例えば、シリコーンオイル、ジメチルポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、変性ポリシロキサン、シリコーンコンパウンドなど）、アルコール系消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルエキサノール、高級アルコール、ポリオキシアルキレングリコールなど）、エーテル系消泡剤（例えば、ヘプチルセロソルブ、ノニルセロソルブ−３−ヘプチルコルビトールなど）、油脂系消泡剤（例えば、動植物油など）、脂肪酸系消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属セッケン系消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミ、ステアリン酸カルシウムなど）、脂肪酸エステル系消泡剤（例えば、天然ワックス、トリブチルホスフェートなど）、リン燐酸エステル系消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウムなど）、アミン系消泡剤（例えば、ジアミルアミンなど）、アミド系消泡剤（例えば、ステアリン酸アミドなど）、その他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄、ボーキサイトなど）などが挙げられる。
中でも、消泡剤としては、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤が好ましい。特に好ましくは、消泡剤として、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分を組み合わせて使用することである。また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤を使用することが好ましい。

核酸安定化剤としては、ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有するものが挙げられる。検体によっては、核酸を分解するヌクレアーゼ等が含まれていることがあり、核酸をホモジナイズするとこのヌクレアーゼが核酸に作用し、収量が激減することがある。前記核酸安定化剤は、検体中の核酸を安定に存在させることができ、これにより、核酸の回収量及び回収効率が向上し、検体の微量化及び迅速化が可能となり、好ましい。

ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有する核酸安定化剤としては、一般的に還元剤として使用される化合物を用いることができる。還元剤としては、水素、ヨウ化水素、硫化水素、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウム等の水素化化合物、アルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、亜鉛等の電気的陽性の大きい金属、またはそれのアマルガム、アルデヒド類、糖類、ギ酸、シュウ酸などの有機酸化物、メルカプト化合物等が挙げられる。中でもメルカプト化合物が好ましい。メルカプト化合物としては、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、メルカプトエタノールや、アルキルメルカプタン等が挙げられる。特に、β−メルカプトエタノールが好ましい。メルカプト化合物は単独または複数組み合わせて用いてもよい。
核酸安定化剤は、核酸可溶化試薬溶液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましく、０．３〜１５質量％であることがより好ましい。核酸安定化剤としてメルカプト化合物を用いる場合は、前処理液における濃度は０．１〜１０質量％であることが好ましく、０．５〜５質量％であることがより好ましい。

ＤＮＡなどＲＮＡ以外の核酸を回収する場合、核酸可溶化試薬溶液にＲＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。核酸可溶化試薬溶液にＲＮＡ分解酵素を加えると、回収された核酸と共存するＲＮＡによる干渉を軽減することができる。また、核酸可溶化試薬溶液にＤＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。
一方、ＲＮＡなどＤＮＡ以外の核酸を回収する場合、核酸可溶化試薬溶液にＤＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＤＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。ＲＮＡ分解酵素阻害剤としては、ＲＮＡ分解酵素を特異的に阻害するものが好ましい。
ＲＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、リボヌクレアーゼ Ｈ（ＲＮａｓｅ Ｈ）等のＲＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。
ＤＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、ＤＮａｓｅ Ｉ等のＤＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。
核酸分解酵素および核酸分解酵素阻害剤は、通常用いられる濃度で用いることができる。また、通常どおり加温処理することができる。加温処理は、タンパク質分解酵素による処理と同時に行うことが好ましい。この加温処理については、後述の［インキュベート］の項においても説明する。

（核酸可溶化試薬の形態）
核酸可溶化試薬は、乾燥された状態で供給されることが好ましい。また、凍結乾燥のように乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器を用いることができる。前記の、乾燥された状態で供給される核酸可溶化試薬、および乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器の両方を用いて、核酸を含む試料溶液を得ることもできる。この方法で核酸を含む試料溶液を得る場合、核酸可溶化試薬およびタンパク質分解酵素の保存安定性が良く、核酸収量を変えずに操作を簡便にすることができる。

（検体との混合）
上記（ＩＩ）の工程において、検体と核酸可溶化試薬溶液とを混合する方法は、特に限定されない。混合する際、攪拌装置により３０から３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、分離精製される核酸収量を増加させることができる。または、転倒混和を５から３０回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、１０から５０回行うことによっても混合することができる、この場合、簡便な操作で分離精製される核酸収量を増加させることができる。

（インキュベート）
上記（ＩＩＩ）の工程において、タンパク質分解酵素を含む核酸可溶化試薬溶液を用いる場合、検体と核酸可溶化試薬溶液との混合液を、タンパク質分解酵素の至適温度および反応時間でインキュベートすることにより、分離精製される核酸の収量を増加させることがきる。インキュベーション温度は、通常２０℃〜７０℃、好ましくはタンパク分解酵素の至適温度であり、インキュベーション時間は通常１分〜１８時間、好ましくはタンパク分解酵素の至適反応時間である。インキュベーション方法は特に限定されず、湯浴や加温器に入れることで行うことができる。

（水溶性有機溶媒）
上記（ＩＶ）の工程において、インキュベート後の混合液に添加する水溶性有機溶媒としては、アルコール類、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等挙げられる。特にアルコールを好ましく用いることができる。
アルコールは、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。中でも、メタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、又は、ブタノール及びその異性体を好ましく用いることができる。より好ましくは、エタノールを用いることができる。これらの水溶性有機溶媒は単独または複数組み合わせて用いてもよい。
水溶性有機溶媒は、核酸可溶化試薬溶液に添加してもよく、核酸可溶化試薬溶液における濃度は、１〜２０質量％であることが好ましい。また、水溶性有機溶媒の核酸を含む試料溶液における最終濃度は、５〜９０質量％であることが好ましい。

得られる試料溶液のＰＨは、ｐＨ５〜１０が好ましく、ｐＨ６〜９がより好ましく、ｐＨ７〜８がさらに好ましい。
また、得られる試料溶液の表面張力は、０．０５Ｊ／ｍ²以下であることが好ましく、粘度は、１〜１００００ｍＰａであることが好ましく、比重は、０．８〜１．２であることが好ましい。

［洗浄工程］
以下、（２）の洗浄工程について説明する。洗浄を行うことにより、核酸の回収量及び純度が向上し、必要な核酸を含む検体の量を微量とすることができる。洗浄工程は、迅速化のためには１回の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰り返すことが好ましい。

洗浄工程において、洗浄液は、自動注入装置もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジへ供給される。供給された洗浄液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。
また、洗浄液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より洗浄液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法は洗浄効率が優れてより好ましい。
洗浄工程における洗浄液の液量は、２μｌ/ｍｍ²以上が好ましい。洗浄液量が多量であれば洗浄効果は向上する。洗浄液の液量の上限は、２００μｌ/ｍｍ²以下が好ましく、この範囲であれば、操作性を保ち、試料の流出を抑止することができる。

洗浄工程において、洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させる時の流速は、膜の単位面積（ｃｍ²）あたり、２〜１５００μＬ／ｓｅｃであることが好ましく、５〜７００μＬ／ｓｅｃであることがより好ましい。通過速度を下げて時間を掛ければ洗浄がそれだけ十分に行なわれることになるが、流速を前記の範囲とすることで、核酸の分離精製操作を迅速化することができる。

洗浄工程において、洗浄液の液温は４〜７０℃であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。洗浄工程において、その核酸分離精製カートリッジを機械的な振動や超音波による攪拌を与えながら洗浄を行うことができる。また、遠心分離を行うことにより洗浄してもよい。

洗浄工程において、洗浄液には、一般的には核酸分解酵素のような酵素を含ませないが、タンパク質等の夾雑物質を分解する酵素を含ませることができる。また、場合によってはＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素などを含ませることもできる。ＤＮＡ分解酵素を含む洗浄液を使用することにより、検体中のＲＮＡのみを選択的に回収することができる。逆に、ＲＮＡ分解酵素を含む洗浄液を使用することにより、検体中のＤＮＡのみを選択的に回収することができる。

洗浄工程において、洗浄液は、水溶性有機溶媒及び/または水溶性塩を含んでいる溶液であることが好ましい。洗浄液は、核酸吸着性多孔性膜に核酸と共に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、核酸吸着性多孔性膜から核酸は脱離させないが不純物は脱離させる組成であることが必要である。この目的には、例えばアルコール等の水溶性有機溶媒は、核酸が難溶性であるため、核酸を保持したまま核酸以外の成分を脱離させるのに適している。また、水溶性塩を添加することにより、核酸の吸着効果が高まるので、不純物及び不要成分の選択的除去作用が向上する。

洗浄液に用いることができる水溶性有機溶媒としては、アルコール、アセトン等を用いることができ、アルコールが好ましい。アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブタノール等を挙げることができ、中でもエタノールを用いることが好ましい。洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、２０〜１００質量％であることが好ましく、４０〜８０質量％であることがより好ましい。

一方、洗浄液に含まれる水溶性塩は、ハロゲン化物の塩であることが好ましく、中でも塩化物が好ましい。また、水溶性塩は、一価または二価のカチオンであることが好ましく、特にアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が好ましく、中でもナトリウム塩及びカリウム塩が好ましくナトリウム塩が最も好ましい。水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍＭ／Ｌ以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１Ｍ／Ｌ以下であることが好ましく、０．１Ｍ／Ｌ以下であることがより好ましい。とりわけ、水溶性塩が塩化ナトリウムであることが好ましく、さらには、塩化ナトリウムが２０ｍＭ／Ｌ以上含まれていることが特に好ましい。

洗浄液は、カオトロッピク物質を含んでいないことが好ましい。それによって、洗浄工程に引き続く回収工程にカオトロピック物質が混入する可能性を減らすことができる。回収工程時に、カオトロピック物質が混入すると、しばしばＰＣＲ反応等の酵素反応を阻害するので、後の酵素反応等を考慮すると洗浄液にカオトロッピク物質を含まないことが理想的である。また、カオトロピック物質は、腐食性で有害であるので、この点でもカオトロピック物質を用いないで済むことは、実験者にとっても試験操作の安全上極めて有利である。ここで、カオトロピック物質とは、前記した尿素、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどである。

従来、核酸分離精製工程における洗浄工程の際、洗浄液がカートリリッジなどの容器に対する濡れ性が高いため、しばしば洗浄液が容器中に残留することになり、洗浄工程に続く回収工程への洗浄液の混入して核酸の純度の低下や次工程における反応性の低下などの原因となっている。したがって、カートリッジなどの容器を用いて核酸の吸着及び脱離を行う場合、吸着、洗浄時に用いる液、特に洗浄液が、次の工程に影響を及ぼさないように、カートリッジ内に洗浄残液が残留しないことは重要である。

したがって、洗浄工程における洗浄液が次工程の回収液に混入することを防止して、洗浄液のカートリッジ内への残留を最小限に留めるため、洗浄液の表面張力を０．０３５Ｊ／ｍ²未満にすることが好ましい。表面張力を低くすれば洗浄液とカートリッジの濡れ性が向上し、残留する液量を抑えることができる。

逆に、洗浄工程における洗浄液のカートリッジへの残留を減少させる目的で、洗浄液の表面張力を０．０３５Ｊ／ｍ²以上にして、カートリッジに対する撥水性を高めて液滴を形成させ、その液滴が流れ落ちることによって残留する液量を抑えることもできる。核酸を吸着した多孔性膜、回収液、洗浄液の組合せなどによっていずれかの表面張力が選択される。

本発明に係る核酸吸着性多孔性膜を利用して洗浄工程を簡素化することができる。また、（１）洗浄液が核酸吸着性多孔性膜を通過する回数を１回でよい、（２）洗浄工程を室温でできる、（３）洗浄後、直ちに回収液をカートリッジに注入することができる、（４）前記（１）、（２）、（３）のいずれか１つもしくは２つ以上組み合わせることも可能である。従来法においては、洗浄液中に含まれる有機溶媒を迅速に取り除くため、しばしば乾燥工程を必要としたが、本発明に係る核酸吸着性多孔性膜は薄膜であるために、乾燥工程を省略できる。

従来、核酸分離精製工程において、洗浄工程の際、しばしば洗浄液が飛散し他に付着することによって、試料のコンタミネーション（汚染）が起きることが問題となっている。洗浄工程におけるこの種のコンタミネーションは、核酸吸着性多性孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジと廃液容器の形状とを工夫することによって抑止することができる。

［回収工程］
以下に核酸吸着性多性孔膜から核酸を脱離させて回収する工程について示す。回収工程において、回収液は、自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を装着した核酸分離精製カートリッジへ供給される。回収液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が、回収効率が優れ、より好ましい。

検体から調整した核酸を含む試料溶液の体積に対して、回収液の体積を調整して核酸の脱離を行うことができる。分離精製された核酸を含む回収液量は、そのとき使用する検体量による。一般的によく使われる回収液量は数１０から数１００μｌであるが、検体量が極微量である時や、逆に大量の核酸を分離精製したい場合には回収液量は１μｌから数１０ｍｌの範囲で変更可能である。

回収液としては好ましくは精製蒸留水、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファー等が使用できる。

回収工程においては、核酸の回収液をその後の後工程に使用できる組成にしておくことが可能である。分離精製された核酸は、しばしばＰＣＲ(ポリメラーゼチェインリアクション)法により増幅される。この場合、分離精製された核酸溶液はＰＣＲ法に適したバッファー液で希釈する必要がある。本方法による回収工程において、回収液にＰＣＲ法に適したバッファー液を用いることで、その後のＰＣＲ工程へ簡便、迅速に移行することができる。この場合、回収液として、ＰＣＲ反応において用いる緩衝溶液 (例えば、ＫＣｌ ５０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ １０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ₂ １．５ｍｍｏｌ／Ｌを最終濃度とする水溶液)を用いることもできる。

回収液のｐＨは、ｐＨ２〜１１であることが好ましい。さらには、ｐＨ５〜９であることが好ましい。また特にイオン強度と塩濃度は吸着核酸の溶出に効果を及ぼす。回収液は、２９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のイオン強度であることが好ましく、さらには、９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩濃度であることが好ましい。こうすることで、核酸の回収率が向上し、より多くの核酸を回収できることができる。回収される核酸は１本鎖でもよく、２本鎖でも良い。

回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液の体積と比較して少なくすることによって、濃縮された核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１００〜９９：１００、更に好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１０〜９：１０にすることができる。これにより核酸分離精製後工程において濃縮のための操作をすることなく、簡単に核酸を濃縮できる。これらの方法により検体よりも核酸が濃縮されている核酸溶液を得る方法を提供できる。

また、別の方法としては、回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液よりも多い条件で核酸の脱離を行うことにより、希望の濃度の核酸を含む回収液を得ることができ、次工程（ＰＣＲなど）に適した濃度の核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１〜５０：１、更に好ましくは、 (回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１〜５：１にすることができる。これにより核酸分離精製後に濃度調整をする煩雑さがなくなるというメリットを得られる。更に、十分量の回収液を使用することにより、多孔性膜からの核酸回収率の増加を図ることができる。

回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便に核酸を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量の核酸を回収する場合等複数回にわたり回収液を注入してもよい。

また、回収工程において、核酸の回収液に回収した核酸の分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。安定化剤としては、抗菌剤、抗カビ剤や核酸分解抑制剤などを添加することができる。核酸分解酵素の阻害剤としてはＥＤＴＡなどが上げられる。また別の実施態様として、回収容器にあらかじめ安定化剤を添加しておくこともできる。

回収工程で用いられる回収容器には特に限定はないが、２６０ｎｍの吸収が無い素材で作製された回収容器を用いることができる。この場合、回収した核酸溶液の濃度を、他の容器に移し替えずに測定できる。２６０ｎｍに吸収のない素材は、例えば石英ガラス等が挙げられるが、これに限定されるものではない。

前記の核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力発生装置を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する工程は、工程を自動で行う自動装置を用いて行うことができる。自動装置を用いることにより、操作が簡便化および迅速化するだけでなく、作業者の技能によらず一定の水準の、核酸を得ることが可能になる。

［自動装置］
以下に、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力発生装置を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する工程を自動で行う自動で行う自動装置の例を示すが、自動装置はこれに限定されるものではない。

自動装置は、前記核酸分離精製カートリッジ、前記試料液および洗浄液の排出液を収容する廃液容器および前記核酸を含む回収液を収容する回収容器を保持する搭載機構と、前記核酸分離精製カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄液および回収液を分注する分注機構とを備えている。
この自動装置は、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを用い、該核酸分離精製カートリッジに核酸を含む試料液を注入し加圧して、該試料液中の核酸を前記核酸吸着性多孔性膜に吸着させた後、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄液を分注し加圧して不純物を除去した後、前記核酸分離精製カートリッジに、回収液を分注し核酸吸着性多孔性膜に吸着した核酸を脱離して回収液とともに回収する、分離精製動作を自動的に行う核酸分離精製装置である。

前記搭載機構は、装置本体に搭載されるスタンドと、該スタンドに上下移動可能に支持され前記核酸分離精製カートリッジを保持するカートリッジホルダーと、該カートリッジホルダーの下方で前記核酸分離精製カートリッジに対する位置を交換可能に前記廃液容器および前記回収容器を保持する容器ホルダーとを備えてなるものが好適である。

また、前記加圧エア供給機構は、下端部より加圧エアを噴出するエアノズルと、該エアノズルを支持して前記カートリッジホルダーに保持された前記核酸分離精製カートリッジに対し前記エアノズルを昇降移動させる加圧ヘッドと、該加圧ヘッドに設置され前記搭載機構のラックにおける核酸分離精製カートリッジの位置決めをする位置決め手段とを備えてなるものが好適である。

また、前記分注機構は、前記洗浄液を分注する洗浄液分注ノズルと、前記回収液を分注する回収液分注ノズルと、前記洗浄液分注ノズルおよび前記回収液分注ノズルを保持し前記搭載機構に保持された核酸分離精製カートリッジ上を順に移動可能なノズル移動台と、洗浄液を収容した洗浄液ボトルより洗浄液を吸引し前記洗浄液分注ノズルに供給する洗浄液供給ポンプと、回収液を収容した回収液ボトルより回収液を吸引し前記回収液分注ノズルに供給する回収液供給ポンプとを備えてなるものが好適である。

上記のような自動装置によれば、核酸分離精製カートリッジ、廃液容器および回収容器を保持する搭載機構と、核酸分離精製カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、核酸分離精製カートリッジに洗浄液および回収液を分注する分注機構とを備え、核酸吸着性多孔性膜部材を備えた核酸分離精製カートリッジに核酸を含む試料溶液を注入加圧し核酸を核酸吸着性多孔性膜部材に吸着させた後、洗浄液を分注して不純物を洗浄排出した後、回収液を分注して核酸吸着性多孔性膜部材に吸着した核酸を分離して回収する核酸分離精製工程を自動的に行って短時間で効率よく試料液の核酸を自動的に分離精製できる機構をコンパクトに構成することとができる。

また、前記搭載機構を、スタンドと、核酸分離精製カートリッジを保持する上下移動可能なカートリッジホルダーと、廃液容器および回収容器を交換可能に保持する容器ホルダーとを備えて構成すると、核酸分離精製カートリッジおよび両容器のセット並びに廃液容器と回収容器の交換が簡易に行える。

また、前記加圧エア供給機構を、エアノズルと、該エアノズルを昇降移動させる加圧ヘッドと、核酸分離精製カートリッジの位置決めをする位置決め手段とを備えて構成すると、簡易な機構で確実な加圧エアの供給が行える。

また、前記分注機構を、洗浄液分注ノズルと、回収液分注ノズルと、核酸分離精製カートリッジ上を順に移動可能なノズル移動台と、洗浄液ボトルより洗浄液を吸引し洗浄液分注ノズルに供給する洗浄液供給ポンプと、回収液ボトルより回収液を吸引し回収液分注ノズルに供給する回収液供給ポンプとを備えて構成すると、簡易な機構で順次洗浄液および回収液の分注を行うことができる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
[実施例１]
（１）核酸精製カートリッジの作製
核酸吸着性多孔膜を収容する部分を持つ、内径７ｍｍの核酸分離精製カートリッジ用容器をハイインパクトポリスチレンで作製する。硝酸セルロース（セルロースの硝酸エステル）の多孔性膜（膜厚＝７０μｍ、平均孔径＝１．２μｍ）を１．０Ｎ ＮａＯＨで２時間鹸化処理して得られた核酸吸着性多孔膜を、上記の、核酸分離精製カートリッジ用容器の核酸吸着性多孔膜を収容する部分に収容し、核酸分離精製カートリッジを作製する。

（２）核酸可溶化試薬及び洗浄液の調製
表１に示す処方の核酸可溶化試薬溶液、及び洗浄液を調製する。

（３）ＤＮＡ分離精製操作
人全血検体２００μｌに、上記（２）で作製した核酸可溶化試薬２００μlと、プロテアーゼ（ＳＩＧＭＡ社製、"Protease" Type XXIV Bacterial）溶液２０μlを添加して、６０℃で１０分間インキュベートする。インキュベート後、エタノール２００μｌを加え攪拌することで、核酸を含む試料溶液を作製する。該核酸を含む試料溶液を、上記（１）で作製した核酸吸着性多孔性膜を備えた、核酸分離精製カートリッジの一方の開口に注入する。続いて、この開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した該核酸を含む試料溶液を、上記核酸吸着性多孔膜に通過させることで、上記核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他方の開口より排出する。続いて、核酸を含む試料溶液を注入した開口に、（２）で作製した洗浄液を注入し、この開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、上記核酸吸着性多孔膜に通過させ、他方の開口より排出する。この操作を３回繰り返す。続いて、核酸を含む試料溶液を注入した開口に回収液を注入し、この開口に圧力発生装置を結合して、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、上記核酸吸着性多孔膜に通過させ、他方の開口より排出し、この液を回収する。

（４）核酸の分離精製の確認
回収液を用いてアガロースゲル電気泳動を行った。

[比較例１]
核酸吸着性多孔質膜としてＡＤＶＡＮＴＥＣ社製のガラスフィルターＧＡ１００を用いる以外は、実施例１と同じ条件で、操作を行う。

上記、実施例１、比較例１のアガロースゲル電気泳動の結果を図１に示す。図１の結果からわかるように、本発明のセルロース硝酸エステルの鹸化物からなる核酸吸着性多孔膜は、従来のガラスフィルターからなる核酸吸着性多孔膜と比較し、高い収率で効率よく核酸を分離精製できることが確認できた。

本発明の実施に従って核酸を含む試料溶液から分離精製した核酸の電気泳動の結果を示す。

Claims (20)

1. （１）核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
   （２）洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程、及び、
   （３）回収液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱離させる工程
   を含む核酸の分離精製方法であって、
   該核酸吸着性多孔性膜を形成する材料が、アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体、又は、アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体の鹸化物からなることを特徴とする核酸の分離精製方法。
2. 前記アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体が、モノエステル誘導体、ジエステル誘導体、トリエステル誘導体、モノエステル誘導体とジエステル誘導体との混合物、モノエステル誘導体とトリエステル誘導体との混合物、ジエステル誘導体とトリエステル誘導体との混合物、又は、モノエステル誘導体とジエステル誘導体とトリエステル誘導体との混合物である、請求項１に記載の核酸の分離精製方法。
3. 前記アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体のエステルが、カルボン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、リン酸エステル、及びピロリン酸エステルの少なくともいずれか１つを含む請求項１又は２に記載の核酸の分離精製方法。
4. 前記核酸吸着性多孔性膜を形成する材料が、前記アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体の鹸化物である請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
5. 前記核酸吸着性多孔性膜を形成する材料が、２種類以上のポリマー種の混合物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
6. 前記核酸吸着性多孔性膜を形成する材料が、２種類以上のポリマー種の混合物の鹸化物である請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
7. 前記アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体の鹸化率が、５％以上である請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
8. 前記核酸吸着性多孔性膜を形成する材料が、セルロースの銅アンモニア溶液、セルロースのアルカリ溶液、又は、ビスコース溶液から形成された再生セルロースからなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
9. 前記核酸吸着性多孔性膜の厚さが、１０μｍ〜５００μｍの範囲である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
10. 前記核酸吸着性多孔性膜が、孔の最小孔径が０．２２μｍ以上である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
11. 前記核酸吸着性多孔性膜が、表裏対称性である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
12. 前記核酸吸着性多孔性膜が、表裏非対称性である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
13. 前記核酸吸着性多孔性膜が、孔の最小孔径に対する最大孔径の比が１：２以上である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
14. 前記核酸吸着性多孔性膜の空隙率が、５０〜９５％である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
15. 前記核酸吸着性多孔性膜のバブルポイントが、０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ²である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
16. 前記核酸吸着性多孔性膜の圧力損失が、０．１〜１００ｋＰａである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
17. 前記核酸吸着性多孔性膜が、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ²の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ²あたり１分間で１〜５０００ｍＬの範囲である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
18. 前記核酸吸着性多孔性膜が、膜１ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．１μｇ以上である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸の分離精製方法。
19. アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体、又は、アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体の鹸化物からなることを特徴とする核酸吸着性多孔性膜。
20. 前記アセチルセルロース以外の多糖類のエステル誘導体が、モノエステル誘導体、ジエステル誘導体、トリエステル誘導体、モノエステル誘導体とジエステル誘導体との混合物、モノエステル誘導体とトリエステル誘導体との混合物、ジエステル誘導体とトリエステル誘導体との混合物、又は、モノエステル誘導体とジエステル誘導体とトリエステル誘導体との混合物である、請求項１９に記載の核酸吸着性多孔性膜。